Grupa Radiobiologii Molekularnej - Centrum Badań Translacyjnych i

Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów
Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie, Oddział w Gliwicach
Grupa Radiobiologii Molekularnej
Poszukiwanie markerów
molekularnych oraz nowych
możliwości metodologicznych w
badaniu chorób nowotworowych
Grupa Radiobiologii Molekularnej
Agnieszka Mazurek
Zespół badawczy
•
•
•
•
dr Ewa Małusecka
dr Anna Fiszer-Kierzkowska
dr Agnieszka Mazurek
Urszula Bojko
Kształcenie studentów
•
Prace Magisterskie
▼ Uniwersytet Śl. (2012) (Pierzyna Magdalena) – opiekun A. Mazurek
▼ Uniwersytet Śl. (2012) (Agata Gacioch) - opiekun A. Mazurek
•
Obowiązkowe praktyki zawodowe studentów
▼ Biotechnologia, Politechnika Śląska; 2013 (Paulina Kowalska, Anna Daniłowicz)
opiekun A. Mazurek
▼ Biotechnologia, Śląski Uniwersytet Medyczny; 2014 (Nikola Drożdż)
opiekun A. Mazurek
▼ Biotechnologia, Śląski Uniwersytet Medyczny; 2014 (Magdalena Niemczyńska i
Karolina Jandura)
opiekun A. Fiszer-Kierzkowska
▼ Inżynieria Biomedyczna, Akademia Górniczo-Hutnicza; 2014 (Piotr Ciążyński) –
opiekun A. Mazurek
•
Wolontariat
▼ Politechnika Śląska; 2014-2015 (Paulina Kowalska) – opiekun A. Mazurek
Cel badań
• Poszukiwanie nowych markerów molekularnych
predykcyjnych/prognostycznych chorób
nowotworowych
• Poszukiwanie nowych rozwiązań
metodologicznych
– badanie cfDNA – zastosowanie w diagnostyce
onkologicznej
cfDNA – (circulating) cell-free DNA
Materiał do badań
•
Bioptaty: pobrane w czasie diagnostycznej biopsji gruboigłowej
–
chorzy z podejrzeniem raka prostaty - Zakład Radiologii i Diagnostyki Obrazowej
Zabezpieczenie materiału biopsyjnego – U. Bojko
•
Osocze:
–
–
chorzy na raka RGiSz - I Klinika Radioterapii i Chemioterapii
chorzy na raka płuca - II Klinika Radioterapii i Chemioterapii, Zakład Radioterapii
Izolacja osocza i zabezpieczenie materiału biologicznego: U. Bojko, I. Domińczyk, L. Ponge, K. Klyszcz,
I. Matuszczyk
Izolacja cfDNA z osocza: Urszula Bojko
•
Krew do diagnostyki Zespółu Lyncha:
–
Chorzy z podejrzeniem ZL - Krew pobrana w Punkcie Pobierania Krwi i Mat. Tkank.
Zabezpieczenie krwi i izolacja genomowego DNA: U. Bojko, L. Ponge
•
Bloczki parafinowe do diagnostyki mutacji w BRAF i EGFR:
–
–
Chorzy z rakiem płuca
Chorzy z czerniakiem
8 biopsji diagnostycznych
(badanie histopatologiczne)
Iz o
lac
ja
QRT-PCR
(mRNA)
e
ani
wal
Utr eriału
t
ma
RN
A
4 biopsje (po 2 z każdego płata bocznego)
- badania naukowe
IHC
Analiza białka
Krew
4-5 ml
wirowanie
iz
ol
ac
j
a
D
N
A
Osocze
cfDNA
elementy morfotyczne
izo
la
cja
DN
A
gDNA
Tematyka badawcza
• Poszukiwanie genów, których ekspresja jest markerem
predykcyjnym odpowiedzi na leczenie, ze szczególnym
uwzględnieniem radioterapii
• Badanie genów podścieliska, jako markerów diagnostycznych
raka prostaty
• Badanie mutacji somatycznych w KRAS i EGFR w krążącym
wolnym DNA (cfDNA) w osoczu
• Analiza DNA pochodzenia wirusowego w osoczu (HPV, EBV)
• Detekcja mutacji u chorych z klinicznym rozpoznaniem
Zespołu Lyncha
Poszukiwanie genów, których ekspresja jest
markerem predykcyjnym odpowiedzi na
leczenie, ze szczególnym uwzględnieniem
radioterapii
grant KBN (2007-2010)„Weryfikacja markerów odpowiedzi na
radioterapię w raku gruczołu krokowego z zastosowaniem
mikrodyssekcji laserowej i metody Q-PCR”,
kierownik projektu Ewa Małusecka
grant wewnętrzny IO-Gliwice (2008) „Zastosowanie markerów
molekularnych w raku gruczołu krokowego”
Szczegółowy opis projektu
•
Podział chorych na podstawie oceny histopatologicznej bioptatów: chorzy z
nowotworem złośliwym vs chorzy z nowotworem łagodnym
•
Badane geny: RGS19 (G-protein signaling regulator 19), RbAp48 (Retinoblastoma binding protein), R5PIA (ribose 5-phosphate
isomerase A), AMACR (α-MethylAcyl-CoA-racemase), hepsyna, MTA1 (metastasis associated protein 1), TRPM8 (transient receptor
potential cation channel, subfamily M, member 8, PIM1 (serine/threonine-protein kinase Pim-1), HSP27 (heat shock 27), EZH2 (enhancer
of zeste homolog 2), AZGP1 (zinc-alpha-2-glycoprotein), MUC1 (mucin 1 transmembrane protein).
¾ Geny wskazane w pracach dotyczących prognozowania w przebiegu leczenia promieniami
jako geny radiooporności (↑ RGS19, ↑ RbAp48, ↑ R5PIA)
¾ Geny wskazane w literaturze jako markery niepowodzenia leczenia chirurgicznego
(↑hepsyna, ↑ MTA, ↓ TRPM8, ↑ PIM1, ↑ EZH2, ↓AZGP1, ↑ MUC1, ↓HSP27)
ƒ metody: QRT-PCR oraz IHC
Wyniki: Zaobserwowano różnice w ekspresji genów: RGS19, hepsyna, TRPM8,
HSPB1 pomiędzy bioptatami w/w grup chorych, ale analiza immunohistochemiczna
nie potwierdziła tych obserwacji.
Badanie genów podścieliska, jako markerów
diagnostycznych raka prostaty
grant zamawiany „Poszukiwanie sygnatury raka w
ujemnych histopatologicznie bioptatach pacjentów z
rakiem gruczołu krokowego”;
grant wewnętrzny IO-Gliwice; „Poszukiwanie sygnatury
raka w ujemnych histopatologicznie bioptatach
pacjentów z rakiem gruczołu krokowego”;
Szczegółowy opis projektu
• Podział chorych na podstawie oceny histopatologicznej bioptatów: chorzy z
nowotworem złośliwym w 1 płacie, w 2 płatach i chorzy z nowotworem łagodnym
• I etap mikromacierze – wyselekcjonowanie genów
Geny: LSAMP (limbic system-associated membrane protein), LSS (lanosterol synthase (2,3-oxidosqualenelanosterol cyclase)), ATG5 (ATG5 autophagy related 5 homolog (S. cerevisiae)), MAF (v-maf musculoaponeurotic
fibrosarcoma oncogene homolog (avian)), ALOX15B (arachidonate 15-lipoxygenase, type B), PALMD
(palmdelphin), BEX1 (brain expressed, X-linked 1), USP36 (ubiquitin specific peptidase 36), SSP1 (secreted
phosphoprotein 1 (osteopontin, bone sialoprotein I, early T-lymphocyte activation 1).
• Weryfikacja w/w genów:
–za pomocą QRT-PCR
–IHC
Wyniki:
• geny ↑ATG, ↑MAF, ↑PALMD, ↑ LSAMP, ↓SPP1 - weryfikacja ilościowym RT-PCR
różnic pomiędzy grupami, znalezionych w badaniu mikromacierzowym. Różnice
znalezione na poziomie ekspresji genów nie zostały potwierdzone
immunohistochemicznie;
• geny ↑ ALOX, ↑ LSS, ↓ USP36 - brak statystycznie znamiennych różnic pomiędzy
grupami zarówno na poziomie ekspresji genu jak i białka.
Praca w trakcie recenzji
Współpraca
•
II Klinika Radioterapii
– dr Marzena Gawkowska-Suwińska
– dr Beata Smolska-Ciszewska
•
Zakład Radiologii i Diagnostyki Obrazowej
– prof. Barbara Bobek-Billewicz
– dr Justyna Rembak-Szynkiewicz
•
Zakład Medycyny Nuklearnej i Endokrynologii Onkologicznej
– prof. Barbara Jarząb
– mgr Małgorzata Kowalska
– mgr Tomasz Tyszkiewicz
– dr Michał Jarząb (obecnie III Klinika Radioterapii i Chemioterapii)
•
Zakład Radioterapii
Badania nowotworowego
krążącego DNA we krwi
Grant Nr N N402 450039
(22.09.2010 –
21.09.2013); „Ocena przydatności oznaczania
krążącego DNA i poszukiwania w nim mutacji
somatycznych genów EGFR i KRAS w rakach płuc oraz
głowy i szyi”.
Kierownik projektu Agnieszka Mazurek
Detekcja mutacji za
w cfDNA osocza
• 160 chorych na raka płuca:
–
–
–
–
–
•
rak płaskonabłonkowy (51),
gruczolakorak (41),
rak niedrobnokomórkowy bez podziału na podtypy (39),
rak drobnokomórkowy (16),
w 13 przypadkach nie określono podtypu.
metoda detekcji TaqMan/PCR
Badania mutacji w genie KRAS
A. Fiszer Kierzkowska
KRASmut
Badania mutacji w genie EGFR
A. Mazurek
EGFR
EGFR
mut. 2235-49del EGFR
(p.E746—A750del)
#127 (squamous carcinoma)
#164 (adenocarcinoma)
Współpraca
II Klinika Radioterapii:
prof. Rafał Suwiński
lek. med. Monika Giglok
lek. med. Urszula Dworzecka
Zakład Radioterapii:
dr Grzegorz Głowacki
dr Grzegorz Woźniak
lek. med. Rafał Kawczyński
Detekcja HPV w cfDNA chorych
na raka regionu głowy i szyi
A. Mazurek
• 200 chorych z nowotworem regionu głowy i szyi (gardło
środkowe, nosogardło, krtań)
• oznaczanie HPV16 i HPV18
– specyficzna sonda do HPV16
– specyficzna sonda do HPV18
• metoda detekcji TaqMan PCR
Współpraca
I Klinika Radioterapii:
dr Tomasz Rutkowski
dr hab. Andrzej Wygoda
prof. Krzysztof Składowski
Badanie mutacji - Zespół Lyncha
A. Mazurek, A. Fiszer-Kierzkowska
• Dziedziczny rak jelita grubego niezwiązany z
polipowatością, (ang. hereditary non-polyposis colorectal
cancer, HNPCC)
• Dziedziczenie autosomalne dominujące
Charakterystyka badanej grupy
• Pacjenci zakwalifikowani na podstawie danych
rodowodowo-klinicznych
• Poradnia Genetyki Onkologicznej i Diagnostyki
Molekularnej, IO-Gliwice
Współpraca
Zakład Patologii Nowotworów
•
dr Ewa Chmielik
Poradnia Genetyki Onkologicznej i Diagnostyki Molekularnej
•
dr Magdalena Budryk
Badanie immunohistochemiczne
(IHC) – 14 pacjentów
MLH1 (+)
MSH2 (-)
MLH1(+)
MSH2(+)
60%
23%
zdegradowana tk.
6%
12%
MLH1(+)
MSH2(-)
MLH1(-)
MSH2(+)
Zastosowanie HRM do wykrywania
mutacji w genach MSH2 i MLH1
c.1668-19 G/G
c.1668-19 A/G
c.1668-19 A/A
Ryc. Wykrywanie częstych polimorfizmów w intronie 14 MLH1
Próbki są grupowane na 3 klastry na podstawie różnic w temperaturach topnienia
powstałych z powodu obecności SNP - c.1668-19 (A/A, A/G, G/G). W badaniu
amplikonu eksonu 15 wymagane są zatem 3 kontrole.
Perspektywiczny kierunek badań
•
nowych możliwości
metodologicznych takich jak
oznaczania
– KRAS
– HPV16
Badania mikroRNA
Mikromacierze SNP
Badanie ekspresji
(mRNA ???)
Perspektywiczny kierunek badań
c.d.
•
Badanie HPV16 w osoczu
Weryfikacja wybranych
przypadków
na skrawkach bipsyjnych
Jaki jest cel badania,
poza monitorowaniem
efektów leczenia?
Perspektywiczny kierunek
badań c.d.
•
•
•
nieinwazyjna metoda,
materiał łatwo dostępny
umożliwiającego wielokrotną analizę
jakim jest krew
Obecność krążących komórek
nowotworowych (CTC) w
diagnostyce i prognozowaniu
nowotworów.