Nr 2 483 ZMIANY W OBRĘBIE SUBPOPULACJI KRWINEK BIA

PRZEGL
Przewlek³e wzw typu C u dzieci
Nr 2 EPIDEMIOL 2005; 59:483–489
483
Iwona Mozer-Lisewska, Grzegorz Dworacki, El¿bieta Kaczmarek,
Wojciech S³u¿ewski, Arleta Kowala-Piaskowska, Magdalena Figlerowicz,
Mariusz Kaczmarek, Jan ¯eromski
ZMIANY W OBRÊBIE SUBPOPULACJI KRWINEK BIA£YCH KRWI
OBWODOWEJ U DZIECI Z PRZEWLEK£YM ZAPALENIEM W¥TROBY
TYPU C PRZED LECZENIEM PEGYLOWANYM INTEREFERONEM
I RYBAWIRYN¥*
Akademia Medyczna im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Klinika Chorób ZakaŸnych i Neurologii Dzieciêcej III Katedry Pediatrii
Kierownik Kliniki: Wojciech S³u¿ewski
Katedra Immunologii Klinicznej
Kierownik: Jan ¯eromski
Pracownia Morfometrii i Przetwarzania Obrazów Medycznych
Katedry Patomorfologii Klinicznej
Kierownik: Przemys³aw Majewski
W pracy przedstawiono wyniki oceny poszerzonego immunofenotypu krwinek bia³ych krwi obwodowej u dzieci z przewlek³ym wirusowym
zapaleniem w¹troby typu C przy pomocy cytofluorymetrii przep³ywowej.
S³owa kluczowe: wzw C, HCV, limfocyty krwi obwodowej, immunofenotyp
Key words: hepatitis C, HCV, blood lymphocytes, immunophenotype
WSTÊP
Przewlek³e wirusowe zapalenie typu C jest istotnym problemem zdrowotnym nie tylko
u doros³ych ale tak¿e u dzieci. Pocz¹tkowy przebieg kliniczny choroby w tej grupie wieku
jest zwykle bezobjawowy. O rozpoznaniu decyduje wykrycie przeciwcia³ przeciwko bia³kom wirusa C i wiremia (HCV RNA) we krwi. Wspó³czesne standardy leczenia przeciwwirusowego obejmuj¹ce stosowanie interferonu alfa z analogami nukleozydowymi takimi
jak rybawiryna pozwalaj¹ na wyleczenie tylko czêœci pacjentów, oceniane na podstawie
eliminacji z krwioobiegu wirusowego RNA. Wirus charakteryzuje siê bardzo du¿¹ zmiennoœci¹, powstawaniem. tzw. pseudogatunków (quasispecies) opornych na stosowan¹ terapiê. Ocenia siê, ¿e jedynie ok. 30-40% chorych eliminuje wirusa po zakoñczeniu leczenia
(1).W populacji dzieciêcej odsetek ten jest zwykle wy¿szy i ponadto u niektóych dzieci
dochodzi do eliminacji wirusa nawet bez leczenia (2). Przyczyny ró¿nic w odpowiedzi na
* Praca wykonana w ramach grantu Komitetu Badañ Naukowych nt 2PO5A 069 27.
484
I Mozer-Lisewska, G Dworacki i inni
Nr 2
leczenie u poszczególnych chorych s¹ niejasne. Przypuszcza siê, ¿e mo¿e to byæ spowodowane ró¿nym stanem odpornoœci chorego. Patogeneza zaka¿enia wirusem zapalenia w¹troby typu C jest bowiem œciœle zwi¹zana z odpowiedzi¹ immunologiczn¹ na antygeny
wirusa. Peptydy antygenowe wirusa prezentowane limfocytom T CD4+ przez komórki prezentuj¹ce antygen, powoduj¹ stymulacjê uk³adu immunologicznego, co mo¿e zarówno
sprzyjaæ eliminacji zaka¿onych hepatocytów, jak i powodowaæ degradacjê niezajêtego mi¹¿szu w¹troby. Pobudzenie uk³adu immunologicznego bêd¹ce nastêpstwem zaka¿enia wirusowego powoduje zmiany sk³adu subpopulacji krwinek bia³ych a zw³aszcza limfocytów,
co znajduje odbicie w sk³adzie komórkowym krwi obwodowej (3).
Celem tej pracy by³a próba odpowiedzi na pytanie, czy istniej¹ ró¿nice w obrêbie
ró¿nych subpopulacji kwinek bia³ych krwi obwodowej u dzieci zaka¿onych wirusem C
w porównaniu z grup¹ dzieci niezaka¿onych. Wyjaœnienie tego mog³oby pomóc w znalezieniu czynników predykcyjnych, okreœlaj¹cych charakter odpowiedzi na leczenie przeciwwirusowe w populacji dzieciêcej.
MATERIA£ I METODY
Dzieci: Materia³ kliniczny obejmowa³ 52 dzieci, w tym 27 ch³opców i 25 dziewczynek w wieku od 10 do 17 lat, œrednia wieku 13,7 roku. Rozpoznanie przewlek³ego zapalenia w¹troby zosta³o potwierdzone w oparciu o przyjête kryteria serologiczne, okreœlenie
wiremii a tak¿e na podstawie wyniku patomorfologicznego biopsji w¹troby. Wszyscy chorzy zakwalifikowano do terapii przeciwwirusowej interferonem alfa i rybawiryn¹.
Grupê kontroln¹ stanowi³o 21 dzieci aktualnie hospitalizowanych w tutejszej Klinice
z powodu innej patologii jak: padaczka, zapalenie p³uc, zaka¿enia dróg moczowych i inne.
W grupie tej wykluczono zaka¿enie wirusem zapalenia w¹troby typu C oraz nadka¿enie
innymi wirusami hepatotropowymi.
Ocena immunofenotypu krwinek bia³ych: Próbki krwi w objêtoœci 2 ml, uzyskane przy
okazji pobrañ do rutynowych badañ hematologicznych i biochemicznych, mieszano z roztworem EDTA i niezw³ocznie transportowano do Katedry Immunologii Klinicznej AM.
Nastêpnie krew mieszano z p³ynem lizuj¹cym dla eliminacji krwinek czerwonych. Uzyskane po dok³adnym p³ukaniu ¿ywe krwinki bia³e inkubowano z zestawem przeciwcia³ monoklonalnych przeciwko ró¿nym antygenom ró¿nicowania, znakowanych fluorochromami o
ró¿nych kolorach fluorescencji. Obejmowa³y one nastêpuj¹ce swoistoœci w ró¿nych kombinacjach: CD14/ CD45, CD3, CD2, CD4, CD8, CD28, CD16, CD56, CD19, HLA-DR.
Po reakcji komórki p³ukano i poddawano akwizycji (10-4 komórek) w cytometrze przep³ywowym FACScan (Becton Dickinson), jak opisano uprzednio (4).
Ocena reakcji: Ocena, przy pomocy programu Cellquest, obejmowa³a wzajemne stosunki procentowe, a tak¿e bezwzglêdne wartoœci iloœciowe subpopulacji komórek obliczone w oparciu o ca³kowit¹ liczbê leukocytów (WBC). Ponadto dla niektórych subpopulacji
okreœlano tzw. Œredni¹ Intensywnoœæ Fluorescencji (MFI). Wszystkie dane liczbowe poddano analizie statystycznej, stosuj¹c nieparametryczny test Manna-Whitneya, a tak¿e test
dla wspó³czynnika korelacji rang Spearmana (rs) dla znalezienia wzajemnych zale¿noœci
pomiêdzy subpopulacjami komórek, przyjmuj¹c graniczny poziom istotnoœci p=0,05.
Przewlek³e wzw typu C u dzieci
Nr 2
485
WYNIKI
Zestawienie badanych subpopulacji komórek, w których stwierdzono ró¿nice miêdzy
obu grupami dzieci w wartoœciach wzglêdnych (odsetkowych) przedstawiono w tabeli I.
Z ogólnej liczby 16 ocenianych subpopulacji co najmniej cztery : limfocyty T CD8+, limfocyty NKT, limfocyty T CD8+CD28- (cytotoksyczne) i komórki CD8- CD28+ (aktywowane) wykazywa³y istotnie wy¿sze wartoœci odsetkowe w grupie dzieci zaka¿onych wirusem
C w porównaniu z grup¹ kontroln¹. Natomiast trzy inne – monocyty, komórki NK i limfocyty T CD4+ by³y równie¿ podwy¿szone w grupie HCV+ ale na granicy istotnoœci (p=0,05).
W bezwzglêdnych wartoœciach liczbowych jedynie limfocyty T CD8 +CD28- by³y statystycznie liczniejsze w grupie dzieci zaka¿onych HCV w porównaniu z grup¹ kontroln¹
(p<0,05). Natomiast populacja limfocytów TCD8-CD28+ (aktywowane), a tak¿e stosunek
limfocytów T CD4+:CD8+ by³y istotnie obni¿one w grupie dzieci zaka¿onych wirusem C
w porównaniu z grup¹ kontroln¹ (tabela II). Rycina 1 ilustruje reprezentatywny przyk³ad
Ta b e l a I .
Istotne ró¿nice immunofenotypu komórek pomiêdzy grup¹ dzieci HCV+ i HCVw wartoœciach wzglêdnych (odsetkowych)
Significant differences in immunophenotype between HCV+ and HCV- children in
relative values
Ta b l e I .
6XESRSXODFMD
NRPyUNRZD
0RQRF\W\
/LPIRF\W\7&'
/LPIRF\W\7&'
.RPyUNL1.
/LPIRF\W\1.7
/LPI7&'&'
/LPI7&'&'
+&9
UHGQLD
6'
Q
UHGQLD
+&9
6'
3R]LRP
LVWRWQR
FL
Q
S S S
S S
S
S
Ta b e l a I I . Istotne ró¿nice immunofenotypu limfocytów pomiêdzy grup¹ dzieci HCV+ i HCVw wartoœciach bezwzglêdnych
Ta b l e I I .
Significant differences in immunophenotype between HCV+ and HCV- children in
total values
6XESRSXODFMD
NRPyUNRZD
&'
&' &' &' &' &'&'
+&9
UHGQLD
6'
Q
.RQWUROH
UHGQLD
6'
3R]LRP
FL
LVWRWQR
Q
S
S
S
S
486
I Mozer-Lisewska, G Dworacki i inni
Nr 2
Ryc. 1. Reprezentatywne ró¿nice w immunofenotypie pomiêdzy chorym z przewlek³ym zapaleniem w¹troby typu C a dzieckiem HCV ujemnym
Fig. 1. Representative differences in immunophenotype between patient with chronic hepatitis C
and HCV-negative child
Nr 2
Przewlek³e wzw typu C u dzieci
487
ró¿nic w immunofenotypie u chorego dziecka zaka¿onego HCV w porównaniu z chorym
HCV RNA – w tej samej grupie wiekowej.
Ponadto wykryto kilka korelacji pomiêdzy poszczególnymi subpopulacjami w grupie
dzieci zaka¿onych, przy pomocy wspó³czynnika korelacji rang Spearmana (r s).
W wartoœciach bezwzglêdnych wszystkie g³ówne subpopulacje komórek jak limfocyty B CD19+, komórki NK (CD56+), komórki CD4+, CD8+ korelowa³y z liczb¹ limfocytów T
(CD3+). Liczba komórek NK korelowa³a z liczb¹ aktywowanych limfocytów T (CD28+)
ale tak¿e z liczb¹ komórek T cytotoksycznych (CD28-). W wartoœciach wzglêdnych (odsetkowych) limfocyty (ca³kowite) wykazywa³y odwrotn¹ korelacjê z limfocytami NKT (-0,51).
Natomiast œrednia intensywnoœæ fluorescencji (MFI) monocytów (CD16+) wykazywa³a
wysok¹ korelacjê z odsetkiem limfocytów T CD3+ (0,9).
DYSKUSJA
Wirusowe zapalenia w¹troby typu C s¹ czêst¹ chorob¹ zakaŸn¹ w populacji dzieciêcej. Ich przebieg nagminnie przechodzi w stan przewlek³y, co prawdopodobnie mo¿na
t³umaczyæ zaburzeniami odpornoœci komórkowej, zarówno naturalnej jak i nabytej (5).
Wskazuje to na koniecznoœæ szczegó³owej oceny subpopulacji komórek opartej na ewaluacji ekspresji antygenów ró¿nicowania. Metod¹ z wyboru jest tu cytofluorymetria przep³ywowa (4).
Okaza³o siê, ¿e obie grupy dzieci tzn. zaka¿onych wirusem zapalenia w¹troby typu C
(HCV+) jak i niezaka¿onych (HCV-) ró¿ni¹ siê istotnie pod wzglêdem co najmniej trzech
do piêciu parametrów i to zarówno w wartoœciach odsetkowych jak i ca³kowitych. W grupie dzieci HCV+ wzrasta³ odsetek limfocytów efektorowych, potencjalnie cytotoksycznych. Obejmowa³ on cytotoksyczne komórki CD8+, a zw³aszcza CD8+CD28-, komórki NK
(CD56+) i limfocyty NKT (CD3+CD56+). Sugeruje to, ¿e infekcja wirusowa, choæ zwykle
niema klinicznie, zostaje jednak rozpoznana przez uk³ad odpornoœciowy dziecka i indukuje efektorow¹ odpowiedŸ komórkow¹. Wzrost subpopulacji limfocytów CD8 + u dzieci
HCV+ znalaz³ ponadto odbicie w obni¿eniu stosunku limfocytów T (CD4:CD8) w porównaniu do grupy kontrolnej. Znaczenie tego parametru w hepatitis C jest nieznane ale
w wirusowym zapaleniu w¹troby typu B opisano jego znaczenie predykcyjne sugeruj¹ce
pomyœlny wynik leczenia przeciwwirusowego u dzieci (6).
Inn¹ stwierdzan¹ zmian¹, jednak bez znamiennoœci statystycznej, by³y zaburzenia odpornoœci humoralnej, manifestuj¹ce siê spadkiem iloœciowym limfocytów B (CD19+, CD2DR+) u chorych dzieci. Obserwacja ta ró¿ni siê od wyników wykazanych u doros³ych
pacjentów HCV+, u których wystêpuje czêœciej wzrost limfocytów B „naiwnych” i bez
cech aktywacji (7). Przyczyn¹ tych ró¿nic mo¿e byæ brak pomocy ze strony limfocytów T
CD4+ koniecznej dla wzrostu i ró¿nicowania limfocytów B. U badanych dzieci HCV+
mo¿na by³o bowiem zauwa¿yæ spadek liczby limfocytów T CD4+ a tak¿e populacji CD8CD28+ odpowiadaj¹cej komórkom aktywowanym. Wydaje siê wiêc, ¿e aktywacja limfocytów pomocniczych T CD4+ jest zjawiskiem przejœciowym w HCV, przynajmniej u dzieci,
wystarczaj¹cym jednak do indukcji komórek efektorowych o potencjale cytotoksycznym,
ale póŸniej zanikaj¹cym, byæ mo¿e w wyniku supresyjnego dzia³ania wirusa. Wykazano
bowiem, ¿e niestrukturalne bia³ko NS3 wirusa C indukuje uwalnianie rodników tlenowych
z fagocytów, co prowadzi do zaburzeñ czynnoœciowych a nawet apoptozy limfocytów (8).
488
I Mozer-Lisewska, G Dworacki i inni
Nr 2
Pewne interesuj¹ce spostrze¿enia w grupie dzieci HCV+ poczyniono oceniaj¹c zale¿noœci miêdzy badanymi parametrami przy pomocy wspó³czynnika korelacji rang Spearmana (rs). I tak np. wzrost wszystkich subpopulacji limfocytów, w³¹cznie z limfocytami B
i komórkami NK kojarzy³ siê ze wzrostem limfocytów T CD3+. Jest to oczywiste dla subpopulacji CD4+ i CD8+, ale w odniesieniu do pozosta³ych sugeruje wspólny bodziec stymuluj¹cy produkcjê lub wyrzut z miejsc powstawania komórek. Stwierdzana korelacja
pomiêdzy limfocytami CD2+DR+ a CD8+CD28- mo¿e sugerowaæ, ¿e limfocyty potencjalnie cytotoksyczne s¹ aktywowane. Ekspresja antygenów HLA DR jest bowiem markerem
aktywacji limfocytów T .
PODSUMOWANIE I WNIOSKI
Przedstawione dane wskazuj¹, ¿e uk³ad odpornoœci komórkowej dziecka zaka¿onego
wirusem C reaguje na istnienie zaka¿enia. Zmiany sk³adu subpopulacji limfocytów krwi
obwodowej u chorych dzieci s¹ mo¿liwe do wykrycia. Do istotnych nale¿y wzrost efektorowych komórek o potencjale cytotoksycznym i spadek stosunku limfocytów T CD4:CD8.
Pozostaje spraw¹ otwart¹, które z opisanych zaburzeñ maj¹ znaczenie predykcyjne.
I Mozer-Lisewska, G Dworacki, E Kaczmarek, W S³u¿ewski, A Kowala-Piaskowska,
M Figlerowicz, M Kaczmarek, J ¯eromski
ALTERATIONS WITHIN WHITE BLOOD CELL SUBSETS IN CHILDREN
WITH CHRONIC VIRAL HEPATITIS C BEFORE TREATMENT WITH PEGYLATED
INTERFERON AND RIBAVIRINE
SUMMARY
Objective: Detection of differences in white blood cell subsets I children with chronic viral
hepatitis type C before antiviral treatment.
Methods: A cohort of children (n=52) with proven HCV infection were subjected to flow
cytometric analysis of their white blood cells and compared to non-infected control group.
Main observations: It has been found that the hepatitis group has higher number of cells with
cytotoxic potential, decreased CD4/CD8 ratio than the other one.
Results: Significant rise of CD8+, CD28- cells, NK cells and NKT lymphocytes was demonstrated in hepatitis group. Several correlations were noticed between various cell subsets studied in
virus C infected children.
Conclusions: This data show that HCV infection affects child immunity at systemic level.
Cellular alterations are detectable by means of flow cytometry. Evaluation of its parameters might
have predictive value in antiviral treatment.
PIŒMIENNICTWO
1. Lauer GM, Walker BD. Hepatitis C virus infection. N Engl J Med 2001;345:41-50.
2. Jonas MM. Children with hepatitis C. Hepatology 2002;36:S173-8.
3. Freeman AJ, Marinos G, Ffrench RA, i in. Immunopathogenesis of hepatitis C virus infection.
Immunol Cell Biol 2001;79:515-36.
Nr 2
Przewlek³e wzw typu C u dzieci
489
4. Mozer-Lisewska I, S³u¿ewski W, Figlerowicz M, i in. Ocena immunofenotypu limfocytów krwi
obwodowej u dzieci z przewlek³ym wirusowym zapaleniem w¹troby typu B leczonych rekombinowanym preparatem interferonu alfa. Alergia, Astma, Immunol Klin 2002;7:44-8.
5. Mozer-Lisewska I. Odpornoœæ naturalna (wrodzona) w wirusowych zapaleniach w¹troby. Alergia Astma Immunol 2004;9:45-7.
6. Genel F, Unal F, Ozgenc F, i in. Decreased ratio of CD4/CD8 lymphocytes might be predictive
for successful interferon alpha and lamivudine combined therapy in childhood chronic hepatitis
B infection:a preliminary study. J Gastroenterol Hepatol 2003;18:645-50.
7. Ni J, Hembrador E, Di Bisceglie AM, i in. Accumulation of B lymphocytes with a naïve, resting
phenotype in a subset of hepatitis C patients. J Immunol 2003;170:3429-39.
8. Thoren F, Romey A, Lindh M, i in. A hepatic C virus-encoded nonstructural protein (NS3)
triggers dysfunction and apoptosis in lymphocytes. Role of NADPH oxidase-derived oxygen
radicals. J Leukoc Biol 2004;76:1180-6.
Adres autora:
Iwona Mozer-Lisewska
III Katedra Pediatrii
Klinika Chorób ZakaŸnych i Neurologii Dzieciêcej AM
ul. Szpitalna 27/33, 60-572 Poznañ