Sposób oczyszczania dwuniciowego kolistego DNA i sposób

(12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11) 184430
(13) B1
(21) Numer zgłoszenia:
320697
RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(22) Data zgłoszenia:
08.11.1995
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
08.11.1995, PCT/FR95/01468
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
( 5 4 )
20.06.1996, WO96/18744,
PCT Gazette nr 28/96
Sposób oczyszczania dwuniciowego kolistego DNA
i sposób oczyszczania dwuniciowego RNA
(73) Uprawniony z patentu:
RHONE-POULENC RORER S.A.,
Antony Cédex, FR
16.12.1994,FR,94/15162
Zgłoszenie ogłoszono:
(72)
O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.10.2002 WUP 10/02
PL
184430
B1
(57)
Twórcy wynalazku:
Joël Crouzet, Paryż, FR
Daniel Scherman, Paryż, FR
Pierre Wils, Paryż, FR
27.10.1997 BUP 22/97
(45)
C12Q 1/68
(87) Data i numer publikacji zgłoszenia
międzynarodowego:
(30) Pierwszeństwo:
(43)
(51) IntCl7
(74)
Pełnomocnik:
Bartnik Urszula, POLSERVICE
1. Sposób oczyszczania dwuniciowego kolistego DNA, znamienny tym, że oczyszcza się w co najmniej jednym etapie roztwór zawierający w mieszaninie z innymi składnikami wymieniony DNA, przepuszczając tę mieszaninę przez nośnik, do którego kowalencyjnie przyłączony jest oligonukleotyd zdolny do tworzenia, drogą hybrydyzacji, potrójnej
helisy z homopurynowo-homopirymidynową sekwencją DNA.
Sposób oczyszczania dwuniciowego kolistego DNA
i sposób oczyszczania dwuniciowego RNA
Zastrzeżenia
patentowe
1. Sposób oczyszczania dwuniciowego kolistego DNA, znamienny tym, że oczyszcza
się w co najmniej jednym etapie roztwór zawierający w mieszaninie z innymi składnikami
wymieniony DNA, przepuszczając tę mieszaninę przez nośnik, do którego kowalencyjnie
przyłączony jest oligonukleotyd zdolny do tworzenia, drogą hybrydyzacji, potrójnej helisy
z homopurynowo-homopirymidynową sekwencją DNA.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór zawierający DNA jest lizatem
komórkowym.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że lizat komórkowy jest lizatem czystym.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dwuniciowy DNA jest wstępnie
oczyszczony.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oligonukleotyd obejmuje sekwencję,
tworzącą potrójną helisę z sekwencją homopurynowo-homopirymidynową.
6. Sposób według jednego z zastrz. 1, znamienny tym, że homopurynowo-homopirymidynową sekwencję DNA wprowadzono sztucznie do dwuniciowego DNA.
7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że oligonukleotyd obejmuje sekwencje
poli-CTT, a homopurynowo-homopirymidynową sekwencja DNA jest sekwencją poli-GAA.
8. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że oligonukleotyd posiada sekwencję
GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (SEQ ID nr 1).
9. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że oligonukleotyd posiada sekwencję
(CTT)7 (SEQ ID nr 26).
10. Sposób według zastrz. 8 lub 9, znamienny tym, że homopurynowo-homopirymidynowa sekwencja DNA obejmuje sekwencję (GAA)7, (GAA)14 lub (GAA)17.
11. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że obecna w DNA homopurynowo-homopirymidynowa sekwencja DNA obejmuje sekwencję SEQ ID nr 5, a oligonukleotyd
obejmuje sekwencję SEQ ID nr 6 lub SEQ ID nr 7.
12. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że homopurynowo-homopirymidynową
sekwencja DNA obejmuje sekwencję SEQ ID nr 17, a oligonukleotyd obejmuje sekwencję
S E Q ID nr 18.
13. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że homopurynowo-homopirymidynową sekwencja DNA obejmuje sekwencję (GA)25, a oligonukleotyd obejmuje sekwencję SEQ ID nr 19.
14. Sposób według jednego z zastrz. 5, znamienny tym, że homopurynowo-homopirymidynową sekwencją DNA jest sekwencja naturalnie obecna w dwuniciowym DNA.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że sekwencja homopurynowa-homopirymidynowa naturalnie obecna w DNA, jest obecna na początku replikacji plazmidu.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że homopurynowo-homopirymidynową
sekwencja DNA obejmuje całość lub część sekwencji SEQ ID nr 2 zawartą na początku replikacji C o1E 1 z E.coli.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że oligonukleotyd obejmuje sekwencję
SEQ ID nr 3.
18. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że homopurynowo-homopirymidynową
sekwencja DNA obejmuje całość lub część sekwencji SEQ ID nr 4 lub sekwencji SEQ ID nr 8,
zawartych w genie β-laktamazy plazmidu pBR322.
19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oligonukleotyd jest połączony z nośnikiem wiązaniem disiarczkowym, tioeterowym, estrowym, amidowym lub aminowym.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że oligonukleotyd połączony jest z zawartością kolumny za pośrednictwem łańcucha bocznego utworzonego z łańcucha węglowego
(CH 2)n, w którym n oznacza liczbę całkowitą, wynoszącą 1-18 włącznie, przy czym łańcuch
184 430
3
boczny wiąże się z oligonukleotydem przez grupę fosforanową, a z zawartością kolumny wiązaniem amidowym,
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że łańcuch boczny jest utworzony z liniowego łańcucha węglowego, zawierającego 6 atomów węgla.
22. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że łańcuch boczny jest utworzony z liniowego łańcucha węglowego, zawierającego 12 atomów węgla.
23. Sposób według jednego z zastrz. 1, znamienny tym, że oligonukleotyd wykazuje co
najmniej jedną modyfikację chemiczną, która czyni go odpornym lub zabezpieczonym przed
nukleazami lub zwiększa jego powinowactwo do homopurynowo-homopirymidynowej sekwencji DNA.
24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że oligonukleotyd obejmuje sekwencję
homopirymidynową, w której co najmniej jedna z cytozyn jest metylowana.
25. Sposób według jednego z zastrz. 1, znamienny tym, że DNA obejmuje ponadto
jedną lub kilka sekwencji korzystnych terapeutycznie.
26. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że homopurynowo-homopirymidynową
sekwencja DNA obecna w dwuniciowym DNA obejmuje kilka pozycji hybrydyzacji z oligonukleotydem.
27. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nośnik wybiera się spośród nośników
chromatograficznych, powierzchni plastikowych, i kulek z lateksu, które zawierają grupy
funkcyjne.
28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że nośnikiem jest nośnik chromatograficzny.
29. Sposób oczyszczania dwuniciowego RNA, znamienny tym, że w co najmniej jednym etapie przepuszcza się roztwór, zawierający RNA w mieszaninie z innymi składnikami
przez nośnik, do którego kowalencyjnie przyłączony jest oligonukleotyd zdolny do tworzenia,
drogą hybrydyzacji, potrójnej helisy z homopurynowo-homopirymidynową sekwencją RNA
obecną w wymienionym RNA.
*
*
*
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania dwuniciowego kolistego DNA
i sposób oczyszczania dwuniciowego RNA. Sposób według wynalazku pozwała na szybkie
oczyszczanie dwuniciowego kolistego plazmidowego DNA, nadającego się do użytku farmakologicznego. W sposobie oczyszczania według wynalazku przeprowadza się w szczególności
hybrydyzację specyficzną między sekwencją DNA i oligonukleotydem.
Techniki terapii genowej i komórkowej wykazują obecnie niezwykły rozwój. Niemniej
te techniki pociągają za sobą możliwość produkowania dużych ilości DNA o czystości farmaceutycznej. Istotnie w tych nowych terapiach, lekiem jest często sam DNA i zasadniczą rzeczą
jest możliwość produkowania go w stosownych ilościach, wyodrębniania i oczyszczania go
odpowiednio do użytku leczniczego u człowieka.
Niniejszy wynalazek opisuje nowy prosty i szczególnie skuteczny sposób oczyszczania DNA.
Pozwala on zwłaszcza na uzyskanie bardzo wysokiej czystości z podwyższoną wydajnością
Sposób według wynalazku opiera się zasadniczo na specyficznej interakcji między sekwencją wstawioną do oczyszczanego DNA i oligonukleotydem utworzonym z zasad naturalnych lub modyfikowanych.
Ostatnio wykazano, że pewne oligonukleotydy są zdolne do specyficznej interakcji
w większej bruździe podwójnej helisy w celu miejscowego utworzenia potrójnej helisy, co
prowadzi do hamowania transkrypcji genów docelowych (genescible) (Hélene i Toulmé, Biochim. Biophys.Acta, 1049 (1990) 99). Te oligonukleotydy rozpoznają selektywnie podwójną
helisę DNA na poziomie sekwencji oligopuryna-oligopirymidyna, to znaczy na poziomie regionów, posiadających sekwencję oligopurynową na jednej nici i sekwencję oligopirymidyn o w ąn a nici komplementarnej, tworząc tam miejscowo potrójną helisę. Zasady trzeciej nici
(oligonukleotyd) tworzą wiązania wodorowe (wiązania Hoogsteena lub odwrotne Hoogsteena) z purynami par zasad Watsona-Cricka.
4
184 430
Zastosowanie tego typu interakcji do izolowania plazmidu opisano w dotychczasowym
stanie techniki. Tak więc Ito i in., (PNAS, 89 (1992) 495) opisują stosowanie oligonukleotydów biotynylowych zdolnych do rozpoznawania określonej sekwencji plazmidu i utworzenia
z nią potrójnej helisy. Tak utworzone kompleksy kontaktuje się następnie z kulkami magnetycznymi pokrytymi streptawidyną (streptavidine). Interakcja między biotyną i streptawidyną
umożliwia więc wyodrębnienie plazmidu przez rozdzielenie magnetyczne kulek i potem elucję. Jednakże ten sposób wykazuje pewne niedogodności. W szczególności potrzebne są dwie
kolejne interakcje specyficzne, pierwsza między oligonukleotydem i plazmidem, druga między kompleksem biotynylowym i kuleczkami ze streptawidyną. Poza tym końcowy roztwór
może być zanieczyszczony oligonukleotydem biotynylowym, którego nie można używać
w kompozycji farmaceutycznej.
Niniejszy wynalazek opisuje nowy ulepszony sposób oczyszczania DNA odnoszący się
do tego typu interakcji. Szczególniej sposób według wynalazku stosuje oligonukleotydy związane kowalencyjnie z nośnikiem. Sposób ten jest szczególnie szybki i prowadzi do wydajności i stopni czystości szczególnie wysokich. Poza tym pozwala on na oczyszczenie DNA
z kompleksowych mieszanin, zawierających zwłaszcza inne kwasy nukleinowe, białka, endotoksyny (jak lipopolisacharydy), nukleazy itd. Używane nośniki można ponadto łatwo zawracać do obiegu, a otrzymane DNA wykazują polepszone właściwości bezpieczeństwa farmaceutycznego. Na koniec proces ten zawiera jeden etap w przeciwieństwie do dotychczasowego stanu wiedzy.
Przedmiotem wynalazku jest zatem sposób oczyszczania dwuniciowego kolistego DNA,
polegający na tym, że oczyszcza się w co najmniej jednym etapie roztwór zawierający w mieszaninie z innymi składnikami wspomniany DNA, przepuszczając przez tą mieszaninę przez
nośnik, do którego kowalencyjnie przyłączony jest oligonukleotyd zdolny do tworzenia, drogą
hybrydyzacji, potrójnej helisy z homopurynowo-homopirymidynową sekwencją DNA.
Korzystnie, roztwór zawierający DNA jest lizatem komórkowym, a bardziej korzystnie,
lizat komórkowy jest lizatem czystym. W korzystnej odmianie sposobu według wynalazku
dwuniciowy DNA jest wstępnie oczyszczony.
Również korzystnie oligonukleotyd obejmuje sekwencję, tworzącą potrójną helisę z tą
sekwencją homopurynowo-homopirymidynową.
T ą sekwencję homopurynowo-homopirymidynową można wprowadzać sztucznie do
dwuniciowego DNA.
Sposób według wynalazku może być również zrealizowany gdy oligonukleotyd obejmuje sekwencje poli-CTT, a sekwencja homopurynowo-homopirymidynową obecna w DNA
jest sekwencją poli-GAA. Korzystnie oligonukleotyd posiada sekwencję GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (SEQ ID nr 1). Również korzystnie, oligonukleotyd może posiadać
sekwencję (CTT )7 (SEQ ID nr 26). Najbardziej korzystnie sekwencja homopurynowo-homopirymidynowa obecna w DNA obejmuje sekwencję (GAA)7, (GAA) 14 lub (GAA)17.
Obecna w DNA sekwencja homopurynowo-homopirymidynową może obejmować także
sekwencję SEQ ID nr 5, a oligonukleotyd obejmuje sekwencję SEQ ID nr 6 lub SEQ ID nr 7.
Innymi sekwencjami homopurynowo-homopirymidynowymi obecnymi w DNA mogą
być sekwencje SEQ ID nr 17, a oligonukleotyd może obejmować sekwencję SEQ ID nr 18.
Sekwencja homopurynowo-homopirymidynową obecna w DNA może obejmować także
korzystnie sekwencję (GA) 25, a oligonukleotyd może obejmować sekwencję SEQ ID nr 19.
Sposób według wynalazku można zrealizować także jeśli sekwencją homopurynowo-homopirymidynową jest sekwencja naturalnie obecna w dwuniciowym DNA a także gdy
sekwencją homopurynowo-homopirymidynową naturalnie obecną w DNA jest sekwencja
homopurynowa-homopirymidynowa obecna na początku replikacji plazmidu.
Taka sekwencja homopurynowo-homopirymidynową DNA obejmuje całość lub część
sekwencji SEQ ID nr 2 zawartą na początku replikacji C o1E 1 z E. coli, a oligonukleotyd korzystnie obejmuje sekwencję SEQ ID nr 3.
Również korzystnie homopurynowo-homopirymidynową sekwencja DNA obejmuje
całość lub część sekwencji SEQ ID nr 4 lub sekwencji SEQ ID nr 8 , zawartych w genie
β-laktamazy plazmidu pBR322.
184 430
5
W sposobie według wynalazku oligonukleotyd może być korzystnie połączony z nośnikiem wiązaniem disiarczkowym, tioeterowym, estrowym, amidowym lub aminowym.
Oligonukleotyd połączony jest z zawartością kolumny za pośrednictwem łańcucha
bocznego utworzonego z łańcucha węglowego (CH 2)n, w którym n oznacza liczbę całkowitą,
wynoszącą 1-18 włącznie, przy czym łańcuch boczny wiąże się z oligonukleotydem przez
grupę fosforanową, a z zawartością kolumny wiązaniem amidowym. Korzystnie łańcuch
boczny jest utworzony z liniowego łańcucha węglowego, zawierającego 6 atomów węgla,
a bardziej korzystnie łańcuch boczny jest utworzony z liniowego łańcucha węglowego, zawierającego 12 atomów węgla.
W celu uodpornienia lub zabezpieczonym przed nukleazami lub zwiększenia jego powinowactwo do sekwencji specyficznej stosuje się oligonukleotyd wykazujący co najmniej
jedną modyfikację chemiczną. W takim przypadku oligonukleotyd obejmuje sekwencję homopirymidynową, w której co najmniej jedna z cytozyn jest metylowana.
Ponadto w sposobie według wynalazku można korzystnie stosować DNA obejmujące
dodatkowo jedną lub kilka sekwencji korzystnych terapeutycznie.
Korzystnie sekwencja homopurynowo-homopirymidynową obecna w dwuniciowym
DNA obejmuje kilka pozycji hybrydyzacji z oligonukleotydem.
Nośnik w sposobie według wynalazku wybiera się spośród nośników chromatograficznych, powierzchni plastikowych, i kulek z lateksu, które zawierają grupy funkcyjne, bardziej
korzystnie, nośnikiem jest nośnik chromatograficzny.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób oczyszczania dwuniciowego RNA polegający
na tym, że w co najmniej jednym etapie przepuszcza się roztwór, zawierający RNA w m ieszaninie z innymi składnikami przez nośnik, do którego kowalencyjnie przyłączony jest oligonukleotyd zdolny do tworzenia, drogą hybrydyzacji, potrójnej helisy z sekwencją hom opurynowo-homopirymidynową obecną w wymienionym RNA.
Oligonukleotydy stosowane w niniejszym wynalazku są oligonukleotydarni hybrydyzującymi bezpośrednio z dwuniciowym DNA. Oligonukleotydy te mogą zawierać następujące
zasady:
- tymidynę (T), która jest zdolna do tworzenia tripletów z dubletami A.T dwuniciowego
DNA (Rajagopal i in., Biochem. 28 (1989) 7859);
- adeninę (A), która jest zdolna do tworzenia tripletów z dubletami A.T dwuniciowego
DNA;
- guaninę (G), która jest zdolna do tworzenia tripletów z dubletami G.C dwuniciowego
DNA;
- cytozynę protonowaną (C+), która jest zdolna do tworzenia tripletów z dubletami G.C
dwuniciowego DNA (Rajagopal i in., cytowany wyżej);
- uracyl (U), który jest zdolny do tworzenia tripletów z parami zasad A.U lub A.T.
Korzystnie, stosowany w sposobie według wynalazku oligonukleotyd zawiera sekwencję homopirymidynową bogatą w cytozyny, a sekwencja specyficzna obecna w DNA jest sekwencją homopurynowo-homopirymidynową. Obecność cytozyn pozwala na stabilność potrójnej helisy przy pH kwasowym, przy którym cytozyny są protonowane, a staje się nietrwała
przy pH alkalicznym, przy którym cytozyny są zobojętniane.
Aby umożliwić tworzenie potrójnej helisy przez hybrydyzację, ważne jest, żeby oligonukleotyd i sekwencja specyficzna czyli homopurynowo-homopirymidynową w DNA były
komplementarne. Z tego względu dla uzyskania najlepszych wydajności i najlepszej selektywności, w sposobie według wynalazku stosuje się oligonukleotyd i sekwencję homopurynowo-homopirymidynową całkowicie komplementarne. W szczególności chodzi o oligonukleotyd poli-CTT i sekwencję specyficzną poli-GAA. Przykładowo można wymienić oligonukleotyd o sekwencji 5'-GAGG CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3' (GAGG (CTT)7; (SEQ
ID nr 1), w której zasady GAGG nie tworzą potrójnej helisy, ale pozwalają na rozsunięcie
oligonukleotydowego łańcucha bocznego; można również wymienić sekwencję (CTT)7 (SEQ
ID nr 26). Oligonukleotydy te są zdolne do utworzenia potrójnej helisy z sekwencją specyficzną, zawierającą jednostki komplementarne (GAA). Chodzi w szczególności o region, zawierający 7, 14 lub 17 jednostek GAA jak opisuje się w przykładach.
6
184 430
Jak wspomniano wcześniej inną korzystną sekwencją specyficzną jest sekwencja:
5 '-A AGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (SEQ ID nr 5).
Sekwencja ta tworzy potrójną helisę z oligonukleotydam i
5 '-A AGGAGAGGAGGGAGGGAA-3'
(SEQ ID nr 6)
lub 5 '-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3'
(SEQ ID nr 7).
W tym wypadku oligonukleotyd przytwierdza się w orientacji antyrównoległej do nici
polipurynowej. Te potrójne helisy są stale tylko w obecności Mg2+ (Vasquez i in., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal i Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).
Jak wskazano powyżej, sekwencja homopurynowo-homopirymidynową może być sekwencją obecną naturalnie w dwuniciowym DNA lub sekwencją syntetyczną wprowadzoną
do niego sztucznie. Szczególnie godne uwagi jest użycie oligonukleotydu zdolnego do utworzenia potrójnej helisy z sekwencją naturalnie obecną w dwuniciowym DNA np. na początku
replikacji plazmidu lub w genie markerze. Z tego względu Zgłaszający przeprowadził analizę
sekwencji plazmidów i mógł wykazać, że pewne regiony tych DNA zwłaszcza na początku
replikacji, mogą posiadać regiony homopurynowo-homopirymidynowe. Synteza oligonukleotydów zdolnych do tworzenia potrójnej helisy z tymi naturalnymi regionami homopurynowo-homopirymidynowymi umożliwia korzystne stosowanie sposobu według wynalazku do plazmidów niemodyfikowanych zwłaszcza plazmidów handlowych typu pUC, pBR322, pSV itd.
Spośród sekwencji homopurynowo-homopirymidynowych naturalnie obecnych w dwuniciowym DNA można wymienić sekwencję, zawierającą całość lub część sekwencji
5’-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ ID nr 2) obecną na początku replikacji C o1E 1
z E. coli. W tym wypadku oligonukleotyd, tworzący potrójną helisę zawiera sekwencję
5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' (SEQ ID nr 3) i przyłącza się na przemian do obu nici
podwójnej helisy jak opisuje Beal i Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) oraz
Jayasena i Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). Można wymienić też sekwencję 5'-GAAAAAGGAAGAG-3' (SEQ ID nr 4) genu β-laktamazy plazmidu pBR322 (DuvalValentin i in., Proc.Natl.Acad.Sci USA, 1992, 89, 504-508). Użycie oligonukleotydu zdolnego do tworzenia potrójnej helisy z sekwencją obecną na początku replikacji lub w markerze
jest szczególnie korzystne, ponieważ pozwala, z tym samym oligonukleotydem, na oczyszczenie całego DNA, zawierającego wspomniany początek replikacji lub wspomniany marker.
Nie jest więc konieczne modyfikowanie plazmidu lub dwuniciowego DNA w celu włączenia
do niego sztucznej sekwencji specyficznej.
Chociaż zaleca się sekwencje całkowicie komplementarne, jest jednak oczywiste, że
można tolerować pewne braki w komplementarności między sekwencją oligonukleotydu
i sekwencją obecną w DNA, o ile nie prowadzą do zbyt dużej utraty powinowactwa. Można
wymienić sekwencję 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEQ ID nr 8) obecną w genie
β-laktamazy w E.coli. W tym wypadku tymina, przerywając sekwencję polipurynową może
być rozpoznana przez guaninę trzeciej nici, tworząc w ten sposób triplet ATG, który jest
trwały, gdy jest obramowany przez dwatriplety TAT (Kiessling i in., Biochemistry, 1992, 31,
2829-2834).
Zgodnie ze szczególną postacią realizacji sposobu według wynalazku oligonukleotydy
zawierają sekwencję (CCT)n, sekwencję (CT)n lub sekwencję (CTT)n, w której n jest liczbą
całkowitą, wynoszącą od 1 do 15 włącznie. Szczególnie korzystne jest użycie sekwencji typu
(CT)n lub (CTT)n.
Zgłaszający istotnie wykazał, że na wydajność oczyszczania wpływa ilość C w oligonukleotydzie. W szczególności jak podano w przykładzie 7, wydajność oczyszczania zwiększa
się, gdy oligonukleotyd zawiera mniej cytozyn. Oczywiste jest, że oligonukleotydy według
wynalazku mogą również łączyć jednostki (CCT), (CT) lub (CTT).
Zastosowany w sposobie według wynalazku oligonukleotyd może być naturalny (połączenie naturalnych zasad, niemodyfikowanych) lub modyfikowany chemicznie. W szczególności oligonukleotyd może wykazywać korzystnie pewne modyfikacje chemiczne, pozwalają-
184 430
7
ce na zwiększenie jego odporności lub zabezpieczenia wobec nukleaz, lub jego powinowactwa do sekwencji specyficznej.
Tak jak stosuje się w niniejszym opisie wynalazku, przez oligonukleotyd rozumie się
też każdy łańcuch nukleozydów poddany modyfikacji szkieletu, aby uczynić go bardziej odpornym na nukleazy. Spośród możliwych modyfikacji można wymienić oligonukleotydotiofosforany, które są zdolne do tworzenia potrójnych helis z DNA (Xodo i in., Nucleic Acids R
Res.,1994, 22, 3322-3330), jak również oligonukleotydy, posiadające szkielety formacetalowe
lub metylofosfonianowe (Matteucci i in., J. Am. Chem. Soc.,1991, 113, 7767-7768). Można
również używać oligonukleotydów syntetyzowanych z α -anomerami nukleotydów, które tw orzą również potrójne helisy z DNA (Le Doan i in., Nucleic Acids Res.,1987,15, 7749-7760).
Inną modyfikacją szkieletu jest wiązanie amidofosforanowe. Można wymienić np. wiązanie
międzynukleotydowe N3'-P5' amidofosforanowe opisane przez Gryaznova i Chena, które daje
oligonukleotydy, tworzące z DNA szczególnie stabilne potrójne helisy (J. Am. Chem. Soc.
1994, 116, 3143-3144). Wśród innych modyfikacji szkieletu można wymienić również użycie
rybonukleotydów,, 2'-O-metylorybozy, fosfodiestrów, (Sun i Helene, Curr. Opinion Struct.
Biol., 116, 3143-3144). Szkielet fosforowy można wreszcie zastąpić szkieletem poliamidowym jak w PNA (Peptid Nucleic Acids), które również m ogą tworzyć potrójne helisy (Nielsen i in., Science, 1991, 254,1497-1500; Kim i in., J. Am. Chem. Soc. 1993, 11 5, 6477-6481)
lub szkieletem na osnowie guanidyny jak w DNG (deoxyribonucleic guanidine, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), analogami polikationowymi DNA, które tw orzą również potrójne helisy.
Tyminę trzeciej nici można także zastąpić 5-bromouracylem, co zwiększa powinowactwo oligonukleotydu do DNA (Povsic i Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061).
Trzecia nić może też zawierać zasady, które nie są naturalne; wśród nich można wymienić
7-deaza-2'-deoksyksantozynę (Milligan i in., Nucleic Acid Res., 1993, 21, 327-333), l-(2-deoksy-β-D-rybofuranozylo)-3-metylo-5-amino-1H-pirazolo[4,3-d]pirymidyno-7-on
(Koh
i Dervan, J. Ajn. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-oksoadeninę, 2-aminopurynę, 2'-O -metylopseudoizocytydynę lub każdą inną modyfikację znaną fachowcowi (patrz przegląd
Suna i Helene'a, Curr.Opinion Struct.Biol.,1993, 3, 345-356).
Inny typ modyfikacji oligonukleotydu ma zwłaszcza na celu polepszenie interakcji i/lub
powinowactwa między oligonukleotydem i sekwencją specyficzną. W szczególności całkiem
korzystna modyfikacja według wynalazku polega na metylowaniu cytozyn oligonukleotydu
(porównaj przykład 5). Tak metylowany oligonukleotyd wykazuje godną uwagi zdolność tworzenia stabilnej potrójnej helisy z sekwencją specyficzną w zakresie pH bliższym zobojętnienia (≥ 5). Pozwala więc pracować przy pH wyższym, niż oligonukleotydy z dotychczasowego
stanu wiedzy, to znaczy przy pH, gdzie zagrożenie degradacji plazmidowego DNA jest dużo
mniejsze.
Długość oligonukleotydu stosowanego w sposobie według wynalazku wynosi co najmniej 3 zasady, a korzystnie 5-30. Korzystnie stosuje się oligonukleotyd o długości większej
niż 10 zasad. Fachowiec może przystosować długość w danym przypadku w zależności od
poszukiwanej selektywności i stabilności interakcji.
Oligonukleotydy można syntetyzować każdą znaną metodą. W szczególności można je
wytwarzać przy użyciu syntetyzera kwasów nukleinowych. Oczywiście można stosować każdą inną metodę znaną fachowcowi.
Aby umożliwić kowalencyjne przyłączenie się do nośnika, do oligonukleotydu wprowadza się grupy funkcyjne. Tak więc można go modyfikować terminalną grupą tiolową, aminow ą lub karboksylową w pozycji 5' lub 3'. W szczególności dodanie grupy tiolowej, aminowej
lub karboksylowej pozwala np. na związanie oligonukleotydu z nośnikiem, zawierającym
funkcyjne grupy disiarczkowe, maleinoimidowe, aminowe, karboksylowe, estrowe, epoksydowe, bromocyjanowe lub aldehydowe. Te połączenia tworzą się przez powstanie wiązań
disiarczkowych, tioeterowych, estrowych, amidowych lub aminowych między oligonukleotydem i nośnikiem. Można stosować każdą inną metodę znaną fachowcowi, taką jak np. dwufunkcyjne reagenty wiążące.
8
184 430
Ponadto dla polepszenia hybrydyzacji z przyłączonym oligonukleotydem może być korzystne, aby oligonukleotyd zawierał „łańcuch boczny” i sekwencję zasad „czynnik rozsuwający” . Użycie łańcucha bocznego pozwala istotnie na przytwierdzenie oligonukleotydu
w wybranym odstępie od nośnika, co umożliwia polepszenie warunków interakcji z DNA.
Łańcuch boczny jest korzystnie utworzony z liniowego łańcucha węglowego, zawierającego
1-18, a korzystnie 6 łub 12 grup (CH 2) i aminę, co pozwala na wiązanie z zawartością kolumny. Łańcuch boczny wiąże się z grupą fosforanową oligonukleotydu lub „czynnikiem rozsuwającym”, złożonym z zasad, nie wpływających na hybrydyzację. Tak więc „czynnik rozsuwający” może zawierać zasady purynowe. Przykładowo „czynnik rozsuwający” może zawierać sekwencję GAGG. Łańcuch boczny jest korzystnie utworzony z liniowego łańcucha węglowego, zawierającego 6 lub 12 atomów węgla.
W niniejszym wynalazku można zastosować różne rodzaje nośników. M ogą to być nośniki chromatograficzne z grupami funkcyjnymi, luzem lub wstępnie konfekcjonowane
w postaci kolumny, o powierzchni plastikowej z grupami funkcyjnymi lub w postaci kulek
z lateksu z grupami funkcyjnymi, magnetycznych lub nie. Korzystnie będą to nośniki chromatograficzne. Przykładami nośników do chromatografii, które można stosować, są agaroza,
akrylamid lub dekstran, jak również ich pochodne (takie jak Sephadex, Sepharose, Superose...), polimery, takie jak poli(styrenodiwinylobenzen) lub np. krzemionka szczepiona lub nie
szczepiona. Kolumny chromatograficzne mogą działać na drodze dyfuzji lub perfuzji.
W celu uzyskania lepszej wydajności oczyszczania, szczególnie korzystne jest zastosowanie w plazmidzie sekwencji, zawierającej kilka miejsc hybrydyzacji z oligonukleotydem.
Obecność kilku miejsc hybrydyzacji istotnie sprzyja interakcjom między wymienioną sekwencją i nukleotydem, co prowadzi do poprawienia wydajności oczyszczania.
Tak więc dla oligonukleotydu, zawierającego n powtórzeń jednostki (CCT), (CT) lub
(CTT) lepiej stosować sekwencję DNA, zawierającą co najmniej n jednostek komplementarnych, a korzystnie n+1 jednostek komplementarnych. Sekwencja, zawierająca n+1 jednostek
komplementarnych oferuje więc 2 miejsca hybrydyzacji oligonukleotydu. Korzystnie sekwencja DNA zawiera do 11 miejsc hybrydyzacji, to znaczy n+10 jednostek komplementarnych.
Sposób według niniejszego wynalazku można stosować do oczyszczania każdego rodzaju dwuniciowego DNA. Chodzi np. o kolisty DNA taki jak plazmid, zawierający generalnie jeden lub kilka genów korzystnych terapeutycznie. Plazmid ten może zawierać również
początek replikacji, marker itd. Sposób według wynalazku można stosować bezpośrednio do
lizatu komórkowego. W tej postaci realizacji plazmid powielony przez transformację i następnie hodowlę komórkową oczyszcza się bezpośrednio po lizie komórek. Sposób według
wynalazku można również stosować do lizatu czystego, to znaczy do supematantu otrzymanego po zobojętnieniu i odwirowaniu lizatu komórkowego. Można go oczywiście stosować
również do roztworu wstępnie oczyszczonego znanymi metodami. Sposób ten pozwała
zwłaszcza na oczyszczenie DNA liniowego lub kolistego, zawierającego korzystną sekwencję,
z mieszaniny DNA o różnych sekwencjach. Sposób według wynalazku można również stosować do oczyszczania dwuniciowego RNA.
Lizat komórkowy może być lizatem komórek prokariotycznych lub eukariotycznych.
W przypadku komórek prokariotycznych, można wymienić np. bakterie E.coli,
B.subtilis, S.typhimurium lub Streptomyces. Co do komórek eukariotycznych można wymienić komórki zwierzęce, drożdże, grzyby itd., a zwłaszcza drożdże Kluyveromyces lub Saccharomyces albo komórki COS, CHO, C127, NIH3T3, itd.
Sposób według wynalazku jest szczególnie korzystny, ponieważ pozwala na otrzymanie
plazmidowego DNA o bardzo wysokiej czystości metodą szybką i prostą. W szczególności,
jak objaśniono w przykładach, sposób ten umożliwia skuteczne oddzielenie plazmidowego
DNA od zanieczyszczonych składników, takich jak fragmentowany DNA chromosomowy,
endotoksyny, białka, nukleazy itd. Sposób według wynalazku pozwala zwłaszcza na otrzymanie preparatów dwuniciowego plazmidowego DNA, o zawartości DNA chromosomowego,
równej lub niższej od 0,5%. Jeszcze bardziej korzystnie otrzymane preparaty DNA m ają zawartość chromosomowego DNA równą lub niższą od 0,2%. Niniejszy wynalazek opisuje
więc kompozycje, zawierające plazmidowy DNA, nadające się do użytku farmaceutycznego,
184 430
9
zwłaszcza w terapii genowej lub komórkowej. W oparciu o sposób według wynalazku, z tak
oczyszczonego DNA i z powyżej wspomnianą wydajnością otrzymywania DNA można uzyskać kompozycję farmaceutyczną, zawierającą dwuniciowy DNA, liniowy lub plazmidowy,
wytworzony zgodnie ze sposobem opisanym poprzednio. Można także wytworzyć preparaty
plazmidowego DNA, mające zawartość chromosomowego DNA równą lub niższą od 0,5%,
a korzystnie od 0,2%, a jeszcze korzystniej od 0,1%.
Kompozycje takie mogą zawierać plazmidowy DNA „nagi” lub połączony z wektorami
transportującymi, takimi jak liposomy, nośniki drobnocząsteczkowe, lipidy kationowe, polimery, białka lub rekombinanty wirusowe itd.
Wynalazek zostanie zilustrowany następującymi przykładami.
Podstawowe techniki klonowania i biologii molekularnej
Klasyczne metody biologii molekularnej, takie jak trawienie enzymami restrykcyjnymi,
elektroforeza na żelu, transformacja w E.coli, strącanie kwasów nukleinowych itd. opisano
w literaturze (T.Maniatis i in., E.F.Frisch and J.Sambrook, 1989. Molecular cloning; a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; F.M.Ausubel, R.Brent, R.E.Kinston, D.D.Moore, J.A.Smith,
J.G.Seidman and K.Struhl. 1987.Current protocols in molecular biology 1987-1988. John
Willey and Sons, New York). Sekwencje nukleotydowe określono metodą terminacji łańcuchów według protokołu już przedstawionego (Ausubel i in., 1987).
Enzymy restrykcyjne dostarczył New-England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs).
Dla wykonania wiązania fragmenty DNA inkubowano w 50 mM buforze Tris-HCl pH
7,4, 10 mM MgCl , 10 Mm DTT, 2 mM ATP, w obecności ligazy DNA faga T4 (Biolabs).
Oligonukleotydy syntetyzuje się, wykorzystując chemię fosforoamidynianów (phosphoramidites) zabezpieczonych w pozycji β grupą cyjanoetylową (N.D.Sinha , J.Biernat,
J.Mc.Manus and H. Koster. 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of
P-cyanoethyl-N,N-dialkilamino-/N-morpholinophosphoramidite o f deoxynucleotides for the
synthesis o f DNA fragments, simplifying deprotection and isolation o f the final product. Nucl.
Acids R es.,12, 4539-4557; J.W.Giles.1985. Advances in automated DNA synthesis. Am.
Biotechnol., Nov./Dec/) i automatyczny syntetyzer DNA Biosearch 8600, stosując zalecenia
producenta.
DNA związane, dla przetestowania skuteczności ich transformacji, używa się do transformacji szczepu uczynionego kompetentnym: E.coli DH5α [F'/end.A1, hsdR17, sup.E44, thi-1,
recA1. gyrA96. relA 1. Δ (lacZYA-argF) U 169, deoR, Φ80 dla c(lacZΔM15)].
Minipreparaty plazmidowego DNA sporządzono według protokołu Kleina i in., 1980.
Pożywka do hodowli LB stosuje się do wzrostu szczepów E.coli (Maniatis i in., 1982).
Szczepy inkubuje się w temperaturze 37°C. Bakterie rozmazuje się na płytkach z pożywką LB
uzupełnioną odpowiednimi antybiotykami.
Przykład 1
1.1. Wykonanie kolumny
Materiały:
Stosowana kolumna jest kolumną HiTrap aktywowaną 1 ml NHS (N-hydroksybursztynoimid, Pharmacia), połączoną z pompąperystaltyczną (przepływ < 1 ml/min). Stosowany oligonukleotyd specyficzny posiada grupę NH 2 w 5'. Jego sekwencja jest następująca:
5'-GAGG CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3’ (SEQ ID nr 1)
Bufory stosowane w tym przykładzie są następujące:
Bufor do przyłączania: 0,2 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3.
Bufor A: 0,5 M etanoloamina, 0,5 M NaCl, pH 8,3.
Bufor B: 0,1 M octan, 0,5 M NaCl, pH 4.
Metoda:
Kolumnę przemywa się 6 ml 1 mM HCl, potem oligonukleotyd rozcieńczony buforem
do przyłączania (50 nmoli w 1 ml) wprowadza się na kolumnę i pozostawia się 30 minut
w temperaturze pokojowej. Kolumnę przemywa się trzy razy kolejno 6 ml buforu A, potem 6 ml
buforu B. Oligonukleotyd w ten sposób wiąże się kowalencyjnie wiązaniem CONH z zawar-
10
184 430
tością kolumny. Kolumnę przechowuje się w temperaturze 4°C w PBS 0,1% NaN 3 i można ją
używać co najmniej cztery razy.
1.2. Konstruowanie plazmidów
Zsyntetyzowano dwa następujące oligonukleotydy:
Oligonukleotyd 4817:
5'GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGA
AGAAGG-3' (SEQ ID nr 10).
Oligonukleotyd 4818:
5'-AATTC CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT
CTT CTT CTT CG-3' (SEQ ID nr 10).
Te oligonukleotydy jednocześnie hybrydyzowane i klonowane na plazmidzie wprowadzają do plazmidu odpowiednią sekwencję homopurynową-homopirymidynową (GAA) 17 jak
opisano powyżej.
Sekwencję, odpowiadającą tym dwóm zhybrydyzowanym oligonukleotydom sklonowano na miejscu wielokrotnego klonowania plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning System, La
Jolla, CA), który zawiera gen odporności na ampicylinę. Aby tego dokonać oligonukleotydy
zhybrydyzowano w następujący sposób: jeden µg tych dwóch oligonukleotydów wprowadzono razem do 40 ml końcowego buforu 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl2. Mieszaninę tę
ogrzano do temperatury 95°C, po czym umieszczono ją w temperaturze pokojowej tak, aby
temperatura obniżała się wolno. Dziesięć ng mieszaniny zhybrydyzowanych oligonukleotydów związano z 200 ng plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla, CA) trawionego przez BamHI i EcoRI w 30 µl końcowych. Po związaniu porcję transformowano do
DH5a. Mieszaniny z transformacji naniesiono na pożywkę L uzupełnioną ampicyliną
(50 mg/l) i X-gal (20 mg/l). Klonowane rekombinanty powinny wykazywać brak zabarwienia
niebieskiego w tym środowisku w przeciwieństwie do plazmidu pierwotnego (pBKS+), co
pozwala na α -komplementację fragmentu co ß-galaktozydazy E.coli. Po wytworzeniu minipreparatów DNA plazmidowego z 6 klonów, wszystkie one wykazują zanik miejsca PstI,
znajdującego się między miejscami EcoRI i BamHI w pBKS+, oraz zwiększenie ciężaru cząsteczkowego wstęgi PvuII o 448 pb, zawierającej miejsce wielokrotnego klonowania. Klon
utrzymano i odpowiadający plazmid nazwano pXL2563. Sekwencję klonowaną sprawdzono
przez sekwencjonowanie z zastosowaniem primera-20 (5'-TGACCGGCAGCAAAATG-3'
(SEQ ID nr 11)) (J.Viera and J.Messing.1982.The pUC plasmids, an M13 mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19,
259-268) plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla, CA). Plazmid pXL2563
oczyszczono za pomocą zestawu Wizard Megaprep (Promega Corp.,Madison,WI) według
zaleceń dostawcy. Ten preparat plazmidowego DNA używano następnie w przykładach opisanych poniżej.
1.3. Oczyszczanie plazmidu
Materiały:
Plazmid pXL2563 (opisany w 1.2) oczyszczono na kolumnie HiTrap, połączonej
z oligonukleotydem opisanym w 1. 1, wychodząc z roztworu, zawierającego również plazmid
pBKS+. Stosowano następujące bufory w czasie tego oczyszczania:
Bufor F: 2 M NaCl, 0,2 M octan pH 4,5-5.
Bufor E: 1 M Tris, HCl pH 9, 0,5 mM EDTA.
Metoda:
Kolumnę przemywa się 6 ml buforu F, potem wprowadza się na kolumnę plazmidy
(20 µg pXL2563 i 20 µg pBKS+ w 400 µl buforu F) i inkubuje się dwie godziny
w temperaturze pokojowej. Kolumnę przemywa się 10 ml buforu F, po czym prowadzi się
elucję buforem E. Plazmidy wykrywa się po elektroforezie na 1% żelu agarozowym i zabarwieniu bromkiem 5 -etylo- 3 , 8 -diamino-6 -fenylo-fenantrydyninowym (bromkiem homidyniowym). Zawartość plazmidów w roztworach ocenia się przez pomiar ich aktywności transformacji na E.coli.
184 430
11
Wynik:
Wychodząc z mieszaniny, zawierającej 30% pXL2563 i 70% pBKS+, odzyskuje się
przy wyjściu z kolumny roztwór o 100% pXL2563. Czystość oceniana stosunkiem D.O. gęstości optycznej) w 260 i 280 nm zmienia się od 1,9 do 2,5, co znaczy, że tą m etodą usuwa się
zanieczyszczające białka.
Przykład 2
2.1. Przykład ten opisuje doświadczenie oczyszczania plazmidowego DNA. Przyłączanie oligonukleotydu (5'-GAGG CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3' (SEQ ID nr 1)) do
kolumny zachodzi, jak wskazano w przykładzie 1. W celu przyłączenia, oligonukleotyd modyfikuje się na końcu 5' grupą aminową związaną z fosforanem czynnika rozsuwającego poprzez łańcuch boczny, zawierający 6 atomów węgla (oligonukleotyd modyfikowany Eurogentec SA Belgique). Plazmid pXL2563 oczyszczono za pomocą zestawu W izard Megaprep
(Promega Corp. Madison, WI) zgodnie z zaleceniami dostawcy. W tym przykładzie stosuje
się następujące bufory:
Bufor F: 0-2 M NaCl, 0,2 M octan, pH 4,5-5.
Bufor E: 1 M Tris, HCl pH 9, 0,5 mM EDTA.
Kolumnę przemywa się 6 ml buforu F, potem wprowadza się na kolumnę 100 µg plazmidu pXL2563 rozcieńczonego 400 µl buforu F i inkubuje się dwie godziny w temperaturze
pokojowej. Kolumnę przemywa się 10 ml buforu F, po czym przeprowadza się elucję buforem E. Plazmid kwantyfikuje się przez pomiar gęstości optycznej w 260 nm. W tym przykładzie związanie wykonuje się w buforze, w którym molarność NaCl zmienia się od 0 do 2 M
(bufor F). Wydajność oczyszczania zmniejsza się, gdy molarność NaCl maleje. pH buforu do
wiązania może zmieniać się od 4,5 do 5, wydajność oczyszczania jest lepsza w 4,5. Można
również stosować inny bufor do elucji o zasadowym pH: w ten sposób elucję wykonuje się
buforem 50 mM boran, pH 9, 0,5 mM EDTA.
2.2. Prowadzenie przyłączania oligonukleotydu:
(5'-GAGG CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3' (SEQ ID nr 1)) na kolumnie jak
wskazano w przykładzie 1. Plazmid pXL2563 oczyszczono za pom ocą zestawu W izard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI) zgodnie z zaleceniami dostawcy. W tym przykładzie
stosuje się następujące bufory:
Bufor F: 0,1 M NaCl, 0,2 M octan, pH 5.
Bufor E: 1 M Tris, HCl pH 9, 0,5 mM EDTA.
Kolumnę przemywa się 6 ml buforu F, potem wprowadza się 100 µg plazmidu
pXL2563 rozcieńczonego 400 µl buforu i inkubuje jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
Kolumnę przemywa się 10 ml buforu F, po czym przeprowadza elucję buforem E. Mierzy się
wskaźnik DNA genomowego lub chromosomowego E.coli obecnego w próbkach plazmidu
przed i po przejściu przez kolumnę z oligonukleotydem. Ten genomowy DNA kwantyfikuje
się przez PCR, stosując startery (amorces) w genie galK E.coli. Według następującego protokołu: sekwencję tych starterów opisuje Debouck i in., (Nucleic Acids Res. 1985, 13, 18411853);
5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3' (SEQ ID nr 24) i 5’-CCA AGC
TTC ACT GTT CAC GAĆ GGG TGT-3' (SEQ ID nr 25). Środowisko reakcyjne zawiera
w 25 µl buforu PCR (Promega France, Charbonnières): 1,5 mM M gCl2; 0,2 mM dXTP
(Pharmacia, Orsay); 0,5 µM startera; 20 jednostek/ml Taq polimerazy (Promega). Reakcja
zachodzi w następującej kolejności:
- 5 minut w temperaturze 95°C
- 30 cykli po
10 sek w temperaturze 95°C
30 sek w temperaturze 60°C
1 minutę w temperaturze 78 °C
- 10 minut w temperaturze 78°C.
Powielony fragment DNA o długości 124 par zasad oddziela się przez elektroforezę na
3% żelu agarozowym w obecności SybrGreen i (Molecular Probes, Eugene, USA), po czym
kwantyfikuje się przez odniesienie do serii DNA genomowego Ultrapur z E.coli, szczep B
12
184 430
(Sigma, ref.D4889). W próbce osadzonej na kolumnie było 1% DNA chromosomowego
i 0,2% w próbce oczyszczonej na kolumnie z oligonukleotydem.
Przykład 3
Doświadczenie z czystym lizatem
Przykład ten opisuje oczyszczanie DNA plazmidowego, wychodząc z czystego lizatu
hodowli bakteryjnej w skali zwanej „miniprep” : 1,5 ml hodowli z nocy szczepów D H 5a, zawierającej plazmid pXL2563, odwirowuje się i osad zawiesza się w 100 µl 50 mM glukozy,
25 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA. Dodaje się 200 µl 0,2 M NaOH, 1% SDS, zawartość
rurek miesza się przez odwracanie, po czym dodaje się 150 µl 3 M octanu potasu, pH 5
i zawartość rurek miesza się przez odwracanie. Po odwirowaniu odbiera się supematant
i wprowadza na kolumnę z oligonukleotydem otrzymaną jak opisano w przykładzie 1. Przyłączanie, przemywania i elucja są takie same jak opisane w przykładzie 1. Odzyskuje się
1 µg plazmidu, wychodząc z 1,5 ml hodowli. Otrzymany plazmid, analizowany przez elektroforezę na żelu agarozowym i zabarwienie bromkiem 5-etylo-3,8-diamino-6-fenylo-fenantrydyninowym (bromkiem homidyniowym), występuje w postaci pojedynczego prążka DNA
kolistego „super zwiniętego”. Żaden ślad DNA o wysokim ciężarze cząsteczkowym (chromosomowego) ani RNA nie jest wykrywalny w plazmidzie oczyszczonym tą metodą. Stosunek
gęstości optycznych w 260 nm i 280 nm jest wyższy od 2.
Przykład 4
4.1. Przykład ten opisuje doświadczenie oczyszczania DNA plazmidowego wykonane
w tych samych warunkach jak w przykładzie 3, wychodząc z 20 ml hodowli bakteryjnej
szczepów DH5a, zawierającej plazmid pXL2563. Osad komórek dodano do 1,5 ml 50 mM
glukozy, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA. Lizę prowadzi się przy użyciu 2 ml 0,2 M
NaOH, 1% SDS, a zobojętnienie 1,5 ml 3 M octanu potasu, pH 5. Następnie DNA wytrąca się
3 ml 2-propranololu, osad dodaje się do 0,5 ml 0,2 M octanu sodu pH 5, 0,1 M NaCl
i wprowadza się na kolumnę z oligonukleotydem otrzymaną jak opisano w przykładzie 1.
Przyłączenie, przemywanie kolumny i elucję wykonano jak opisano w przykładzie 1, z wyjątkiem buforu do przemywania, w którym molarność NaCl wynosiła 0,1 M. Otrzymuje się
około 16 µg plazmidowego DNA. Otrzymany plazmid, analizowany przez elektroforezę na
żelu agarozowym i zabarwienie bromkiem 5-etylo-3,8-diamino-6-fenylo-fenantrydyninowym
(bromkiem homidyniowym), występuje w postaci pojedynczego prążka DNA kolistego „super
zwiniętego”. Żaden ślad DNA o wysokim ciężarze cząsteczkowym (chromosomowego) ani
RNA nie jest wykrywalny w oczyszczonym plazmidzie. Trawienie plazmidu enzymem restrykcyjnym daje pojedynczą wstęgę o ciężarze cząsteczkowym, sięgającym 3 kilozasad. Stężenie białek w próbkach przekracza 125 µg/ml w czystym lizacie i mniej niż 1 µg/ml
w oczyszczonym plazmidzie (oznaczenie Micro-BCA, Pierce). Stężenie endotoksyn określane
przez oznaczenie LAL (Biosepra) dzieli się przez współczynnik wyższy od 10 w plazmidzie
oczyszczonym w porównaniu z czystym lizatem wyjściowym.
4.2. Stosowany plazmid obejmuje kasetę, zawierającą promotora Cytomegalowirusa,
gen, kodujący lucyferazę, oraz sekwencję homopurynowo-homopirymidynową (GAA)17, pochodzącą z plazmidu pXL2563. Szczep DH1 (Maniatis i in., 1989), zawierający ten plazmid
hoduje się w fermentorze o objętości 7 litrów. Czysty lizat wytwarza się z 200 gramów komórek: osad komórkowy wprowadza się do 2 litrów 25 mM Tris, pH 6,8, 50 mM glukozy,
10 mM EDTA, do komórek dodaje się 2 litry 0,2 M NaOH, 1% SDS. Lizat zobojętnia się
przez dodanie jednego litra 3 M octanu potasu. Po diafiltracji 4 ml lizatu osadza się na kolumnie HiTrap-NHS 5 ml, której zawartość jest połączona z oligonukleotydem o sekwencji
5'-GAGG CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3' (SEQ ID nr 1) zgodnie z metodą opisaną w przykładzie 1.1. Przemywanie i elucję wykonuje się jak opisano w przykładzie 1. Odzyskuje się około 400 mikrogramów plazmidu. Współczynnik genomowego DNA w tej próbce mierzony techniką opisaną w przykładzie 2.2, wynosi 0,1%.
Przykład 5
Stosowanie zmodyfikowanego oligonukleotydu
Przykład ten opisuje stosowanie oligonukleotydu, zawierającego metylowane cytozyny.
Stosuje się następującą sekwencję oligonukleotydu:
184 430
13
5'-GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTT-3' (SEQ ID nr 12)
Oligonukleotyd ten posiada grupę NH2 w 5'. MEC= 5 metylocytozyna. Ten oligonukleotyd pozwala na oczyszczenie plazmidu pXL2563 w warunkach przykładu 1 z buforem do
przyłączania o pH 5 (zmniejsza się w ten sposób ryzyko degradacji plazmidu).
Przykład 6
W przykładach poprzednich stosowany oligonukleotyd modyfikuje się na końcu
5-terminalnym grupą aminową związaną z grupą fosforanową poprzez ramię, zawierające
6 atomów węgla: NH 2-(CH 2)6- W tym przykładzie grupa aminowa jest związana z grupą fosforanową końca 5'-terminalnego poprzez ramię o 12 atomach węgla: NH2-(CH2) 12. Przyłączenie oligonukleotydu i przejście przez kolumnę wykonuje się jak wskazano w przykładzie 2
z buforem F: 2 M NaCl, 0,2 M octan, pH 4,5. Ten oligonukleotyd pozwala na lepsze wydajności oczyszczania: uzyskuje się wydajność 53%, podczas gdy z nukleotydem o 6 atomach
węgla w tych samych warunkach wydajność ta jest rzędu 45%.
Przykład 7
Postępując zgodnie ze strategią klonowania opisaną w przykładzie 1.2 skonstruowano
dwa inne plazmidy, zawierające sekwencje homopurynowo-homopirymidynowe: plazmid
pXL2725, który zawiera sekwencję (GGA)15 i plazmid pXL2726, który zawiera sekwencję (GA)25P r z y k ł a d 7.1. Konstruowanie plazmidów
Plazmidy pXL2725 i pXL2726 analogiczne do plazmidu B pXL2563 skonstruowano
zgodnie ze strategią klonowania opisaną w przykładzie 1.2, stosując pary następujących oligonukleotydów:
5986: 5'-GATCC(GA)25GGG-3' (SEQ ID nr 13)
5987: 5'-AATTCCC (TC)25G-3' (SEQ ID nr 14)
5981: 5'-GATCC(GGA)17GG-3' (SEQ ID nr 15)
5982: 5’-AATT(CCT)17CCG-3' (SEQ ID nr 16)
Parę oligonukleotydów 5986 i 5987 użyto do konstruowania plazmidu pXL2726, klonując oligonukleotydy na miejscach BamHI i EcoRI w pBKS+ (Stratagene Cloning System,
La Jolla, CA), podczas gdy oligonukleotydy 5981 i 5982 użyto do konstruowania plazmidu
pXL2725. Stosowano takie same warunki doświadczalne jak dla konstrukcji plazmidu
pXL2563 i zmieniono jedynie pary oligonukleotydów. Ponadto sekwencje klonowane zweryfikowano przez sekwencjonowanie na plazmidach. To pozwoliło stwierdzić, że plazmid
pXL2725 posiada modyfikację w stosunku do sekwencji oczekiwanej, zamiast sekwencji
GGA powtórzonej 17 razy jest GGAGA(GGA)15 (SEQ ID nr 17).
P r z y k ł a d 7.2. Wykonanie kolumn i oczyszczanie
Oligonukleotydy, tworzące potrójne helisy z tymi sekwencjami homopurynowymi połączono z zawartością kolumn HiTrap zgodnie z metodą opisaną w przykładzie 1.1. Chodzi tu
o oligonukleotyd o sekwencji 5'-AATG CCT CCT CCT CCT CCT CCT CCT-3' (SEQ ID nr 18)
dla oczyszczenia plazmidu pXL2725 i oligonukleotyd o sekwencji 5'-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (SEQ ID nr 19) dla oczyszczenia plazmidu pXL2726.
Obie kolumny tak otrzymane umożliwiły oczyszczenie odpowiednich plazmidów metodą opisaną w przykładzie 2 z następującymi buforami:
Bufor F: 2 M NaCl, 0,2 M octan, pH 4,5.
Bufor E: 1 M Tris, HCl pH 9, 0,5 mM EDTA.
Uzyskane wydajności wynoszą 23% i 31% odpowiednio dla plazmidu pXL2725 i pXL2726.
Przykład 8
Przykład ten ilustruje wpływ długości sekwencji specyficznej obecnej w plazmidzie na
wydajność oczyszczania.
P r z y k ł a d 8.1. Konstruowanie plazmidów
Gen przenoszący stosowany w tych doświadczeniach dla ukazania aktywności kompozycji według wynalazku jest genem, kodującym lucyferazę (Luc).
Plazmid pXL2621 obejmuje kasetę, zawierającą promotora Cytomegalowirusa (CMV)
o 661 bp ekstrahowaną z pcDNA3 (Invitrogen, Corp., San Diego, CA) przez wycięcie enzymami restrykcyjnymi Mlul i HindIII, klonowaną powyżej genu, kodującego lucyferazę, na
14
184 430
miejscach Mlul i HindIII, do wektora pGL zasadowego Vector (Promega Corp., Madison,WI).
Plazmid ten skonstruowano, stosując standardowe metody biologii molekularnej.
Plazmidy pXL2727-1 i pXL2727-2 skonstruowano w następujący sposób:
Dwa mikrogramy plazmidu pXL2621 linearyzuje się przez działanie BamHI; enzym
dezaktywuje się przez traktowanie 10 minut w temperaturze 65°C; równolegle oligonukleotydy 6006 i 6008 hybrydyzuje się jak to opisano dla konstrukcji plazmidu pXL2663.
6006 5'-GATCT(GAA)17CTGCAGATCT-3' (SEQ ID nr 20)
6008 5'-GATCAGATCTGCAG(TTC)17A-3' (SEQ ID nr 21)
Ta mieszanina z hybrydyzacji została sklonowana na końcach BamHI plazmidu
pXL2621 i po przekształceniu w DH5α rekombinanty klonów oznacza się drogą analizy przez
restrykcję enzymatyczną przy użyciu PstI, ponieważ oligonukleotydy wprowadzają miejsce
PstI. Dwa klony zachowano i sekwencję nukleotydową fragmentu klonowanego zweryfikowano, używając primera (6282, 5'-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3' (SEQ ID nr 22) jako
startera reakcji sekwencjonowania (J.Viera i J.Messing, 1982. The pUC plasmids an
M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and seguencing with synthetic universal
primers. Gene, 19, 259-268).
Pierwszy klon (pXL2727-1) zawiera sekwencję GAA powtórzoną 10 razy. Drugi klon
(pXL2727-2) zawiera sekwencję 5'-GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGAGAA-3' (SEQ ID nr 23).
P r z y k ł a d 8.2. Wykonanie kolumn i oczyszczanie
Stosuje się kolumnę, taką jak opisaną w przykładzie 1, której zawartość połączono
z oligonukleotydem 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID nr 1).
Plazmid pXL2727-1 zawiera 14 powtórzeń sekwencji GAA. Oligonukleotyd opisany
wyżej, który liczy tylko 7 powtórzeń sekwencji hybrydyzacji, odpowiadającej CTT, może
więc hybrydyzować z plazmidem w 8 różnych pozycjach. Plazmid pXL2727-2 przeciwnie ma
sekwencję hybrydyzującą (GAA)7 o tej samej długości co sekwencja nukleotydu przyłączonego w kolumnie. Ten oligonukleotyd może więc hybrydyzować tylko w jednej pozycji na
pXL2727-2.
Doświadczenie jest takie samo jak opisane w przykładzie 2 z następującymi buforami:
Bufor F: 2 M NaCl, 0,2 M octan, pH 4,5.
Bufor E: 1 M Tris, HCl pH 9, 0,5 mM EDTA.
Wydajność oczyszczania wynosi 29% dla plazmidu pXL2727-1 i 19% dla plazmidu
pXL2727-2.
P r z y k ł a d 8.3. Transfekcja in vitro komórek ssaka
Stosowanymi komórkami są komórki NIH3T3 wysiane w przeddzień doświadczenia na
płytki do hodowli o 24 studzienkach, w ilości 50 000 komórek/studzienkę. Plazmid rozcieńczono w 150 mM NaCl i zmieszano z lipofektantem (lipofectant) RPR 115335. Używa się
stosunku ładunki dodatnie lipofektanta/ładunki ujemne DNA, równego 6. Mieszaninę wiruje
się, pozostawia dziesięć minut w temperaturze pokojowej, rozcieńcza pożywką pozbawioną
surowicy z płodu cielęcego, potem dodaje się do komórek, w ilości 1 µg DNA na studzienkę
hodowli. Po dwóch godzinach w temperaturze 37°C, dodaje się 10% objętości na objętość
surowicy z płodu cielęcego i komórki inkubuje się 48 godzin w temperaturze 37°C w obecności 5% CO 2. Komórki przemywa się dwa razy PBS i mierzy się aktywność lucyferazy według
opisanego protokołu (zestaw Promega, Promega Corp., Madison, WI), na luminometrze Lumat LB 9501 (EG i G Berthold, Evry). Plazmid pXL2727-1 oczyszczony, jak opisano w przykładzie 8.2 daje wydajności transfekcji dwa razy większe, niż otrzymane z tym samym plazmidem oczyszczonym za pomocą zestawu Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI).
184 430
15
LISTA SEKWENCJI
(1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY
(A) NAZWA: RHONE POULENC RORER
(B) ULICA: 20 AVENUE RAYMOND ARON
(C) MIASTO: ANTONY CEDEX
(E) KRAJ: FRANCJA
(F) KOD POCZTOWY : 92165
(G) TELEFON: 40.91.69.22
(H) TELEFAX: 40.91.72.91
(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: OCZYSZCZANIE DNA PRZEZ TWORZENIE
POTRÓJNEJ HELISY Z UNIERUCHOMIONYM OLIGONUKLEOTYDEM
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 25
(iv) POSTAĆ CZYTELNA DLA KOMPUTERA:
(A) TYP NOŚNIKA: Taśma
(B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC
(C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS
(D) PROGRAM: Patentln Release #1.0, Version #1.30
(OEB)
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 1:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 1:
16
184 430
GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT
25
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 2:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad
(B) TYP:
nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 2:
CTTCCCGAAG GGAGAAAGG
19
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 3:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad
(B) TYP:
nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 3:
GAAGGGTTCT TCCCTCTTC C
21
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 4:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 4:
GAAAAAGGAA GAG
13
184 430
17
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 5:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad
(B)
TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 5:
AAGGGAGGGA GGAGAGGAA
19
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 6:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 6:
AAGGAGAGGA GGGAGGGAA
19
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 7:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 7:
TTGGTGTGGT GGGTGGGTT
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 8:
19
18
184 430
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 8:
AAAAAAGGGA ATAAGGG
17
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 9:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 58 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 9:
GATCCGAAGA AGAAGAAGAA
GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA
AGAAGAAGAA GAAGAAGG
40
58
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 10:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 58 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 10:
AATTCCTTCT TCTTCTTCTT
TCTTCTTCTT CTTCTTCG
CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT
40
58
184 430
19
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 11:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 11:
TGACCGGCAG CAAAATG
17
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 12:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(ix) WŁAŚCIWOŚĆ:
(D)
INNE
INFORMACJE:
wszystkie
cytozyny
sekwencji są metylowane
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 12:
GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 13:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 58 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
25
C
20
184 430
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 13:
GATCCGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG
40
AGAGAGAGAG AGAGAGGG
58
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 14:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 58 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 14:
AATTCCCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT
40
CTCTCTCTCT CTCTCTCG
58
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 15:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 58 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 15:
GATCCGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAGGAGGAGGAGG
40
AGGAGGAGGA GGAGGAGG
58
(2) INFORMACJE 0 SEQ ID Nr: 16:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 58 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
184 430
21
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 16:
AATTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCTCC TCCTCCTCCT
40
CCTCCTCCTC CTCCTCCG
58
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 17:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 50 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 17:
GGAGAGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG AGGAGGAGGA
50
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 18:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 18:
AATGCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCT
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 19:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
25
22
184 430
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 19:
AGTGCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCT
26
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 20:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 66 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 20:
GATCTGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA
40
AGAAGAAGAA GAAGAACTGC AGATCT
66
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 21:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 66 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 21:
GATCAGATCT GCAGTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT
40
CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCA
66
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 22:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
184 430
23
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 22:
ACAGTCATAA GTGCGGCGAC G
21
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 23:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 23:
GAAGAAGAGG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GGAAGAGAA
39
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 24:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 24:
CCGAATTCTG GGGACCAAAG- CAGTTTC
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 25:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad
(B) TYP: nukleotyd
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
27
24
184 430
(D) KONFIGURACJA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 25:
CCAAGCTTCA CTGTTCACGA CGGGTGT
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.
Cena 4,00 zł.
27