Badanie wpływu stałego pola magnetycznego na apoptozę komórek

Dariusz SZTAFROWSKI(1), Kazimierz KULICZKOWSKI(2),Bożena JAŹWIEC(2),
Magdalena DEC(2), Jacek GUMIELA(1)
Politechnika Wrocławska, Katedra Energoelektryki (1)
Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku (2)
doi:10.15199/48.2016.12.43
Badanie wpływu stałego pola magnetycznego na apoptozę
komórek białaczki ludzkiej HL-60
Streszczenie. W artykule przedstawiono wyniki badań in vitro przeprowadzone na stanowisku badawczym zaprojektowanym i zbudowanym na
Politechnice Wrocławskiej w Laboratorium Badania Zagrożeń Elektromagnetycznych i Bioelektromagnetyzmu mające na celu ustalenie wpływu
stałego pola magnetycznego na poziom apoptozy komórek białaczki ludzkiej HL-60. W artykule zaprezentowano uzyskane dotychczas wyniki
z badań medycznych przeprowadzonych na Uniwersytecie Medycznym we Wrocławiu w Katedrze i Klinice Hematologii, Nowotworów Krwi
i Transplantacji Szpiku.
Abstract. This article provides the outcomes of in vitro tests which were aimed at finding the impact of constant magnetic field on apoptosis of
human leukemia cell line HL60. The tests were carried out with the use of a test bed that was designed and built in the Laboratory for Research of
EMF Hazards and Bioelectromagnetism of Wroclaw University of Technology. The results of medical tests were obtained in cooperation with the
medical staff of the Chair & Clinics of Hematology, Blood Cancer and Bone Marrow Transplantation of Wroclaw Medical University. Examination of
constant DC magnetic field influence on apoptosis of human leukemia cell line HL60
Słowa kluczowe: Stałe pole magnetyczne, in vitro, komórki białaczki ludzkiej HL-60, apoptoza.
Keywords: constant DC magnetic field, in vitro, HL-60 cell, apoptosis.
Wstęp
Ziemskie pole magnetyczne
Organizm człowieka w środowisku, w którym żyje
eksponowany jest na stałe pola (DC) elektryczne,
magnetyczne oraz fale elektromagnetyczne. Zarówno pole
elektryczne (magnetyczne) są stanami przestrzeni, w której
mają miejsce złożone zjawiska (nawet w próżni – stąd, jak
widzimy, próżnia nie zawsze jest „pusta”).
Pola elektryczne (magnetyczne) możemy postrzegać,
jako jedną z najbardziej prostych form znanej człowiekowi
energii. Życie na ziemi ewoluowało od początku swego
istnienia w stałym polu magnetycznym i elektrycznym.
Pole magnetyczne Ziemi występuje zarówno wewnątrz
jak i wokół niej, rozciągając się na wiele tysięcy kilometrów
od
jej
powierzchni,
tworząc
obszar
nazywany
magnetosferą. Sfera ta jest rodzajem „ochronnego
płaszcza” przed promieniowaniem kosmicznym i ma
zasadnicze
znaczenie
dla
większości
procesów
zachodzących na planecie na której żyjemy w tym
najprawdopodobniej na wiele procesów zachodzących
w organizmach żywych.
Na
ziemi
wartości
otaczającego
nas
pola
magnetycznego uzależnione są w dużej mierze od
szerokości geograficznej oraz warunków związanych
z terenem na którym występuje. Na szerokościach
geograficznych odpowiadających położeniu Polski jego
wartość wynosi ok. 40A/m i w przeciwieństwie do pola
elektrycznego nie jest bezpośrednio zależne od pogody
[1,2,3]. Ziemskie pole magnetyczne cechują licznie
występujące anomalia magnetyczne. Są to lokalne różnice
wartości
rzeczywistych
natężeń
ziemskiego
pola
magnetycznego występującego w danym miejscu na ziemi
a jego wartością teoretyczną, wyliczoną na podstawie
położenia biegunów magnetycznych naszej planety.
Jedną z bardziej znanych tego typu anomalii
magnetycznych w Polsce jest zlokalizowana na terenie
masywu góry Ślęży oraz położonej obok niej góry Radunia.
Jej powodem jest fakt że góra Radunia zbudowana jest
między innymi z serpentynitu z domieszką magnetytu. Taki
układ geologiczny jest odpowiedzialny za występowanie tak
wysokich anomalii magnetycznych w tym rejonie.
Wpływ pól elektromagnetycznych na komórki HL-60
W badaniach przeprowadzonych w 2011 roku na
Uniwersytecie Wrocławskim autorzy pracy pt.: „Magnetic
field 50 Hz: its influence on living cells HL-60” wykazali
wpływ pola magnetycznego o częstotliwości 50 Hz na
komórki białaczki ludzkiej [4]. Eksponując komórki białaczki
ludzkiej HL-60 w polu magnetycznym 50 Hz o indukcji 7 mT
pokazali wpływ tego pola na delokalizację spektryn. Białka
te tworzące błonę komórkową komórek HL-60 przemieściły
się w głąb jądra komórkowego co w konsekwencji
doprowadziło do śmierci badanych komórek. Wykazano że
oddziałując na komórki HL-60 wolnozmiennym polem
magnetycznym można wywołać w nich procesy
apoptotyczne.
Ponieważ coraz częściej stałe pole magnetyczne
znajduje zastosowania w medycynie powstaje pytanie: Jaki
wpływ mogą mieć silne pola magnetyczne DC na komórki
HL-60? Przykładem może być wykorzystanie silnych pól
magnetycznych w diagnostyce medycznej Magnetic
Resonance Imaging (MRI). W celu zwiększenia dokładności
w obrazowaniu MRI stosuje się coraz silniejsze pola tego
typu których wartość może osiągać 8T. Z tego powodu
ważnym staje się prowadzenie badań mających na celu
określenie ich potencjalnego wpływu na organizm człowieka
oraz pozostałą materię ożywioną.
Do najważniejszych ośrodków zajmujących się tego
typu problematyką zaliczyć możemy ośrodki zlokalizowanie
w Stanach Zjednoczonych oraz Japonii [5,6]. Stan wiedzy
z zakresu występowania efektów sprzężenia pól
magnetycznych mających wpływ na przebieg procesów
biologicznych w komórkach pozostaje nadal enigmatyczny
i w porównaniu do oddziaływań stałych pól elektrycznych
których siły występują na powierzchni cząsteczek, błonie
komórkowej, a nawet na całym ciele człowieka. Pola
magnetyczne wnikają głębiej ponieważ ciało człowieka jest
zbudowane z materii słabo oddziałujących z tym polem.
Ciało człowieka jest jakby ”półprzezroczyste„ dla pól
magnetycznych dlatego może ono penetrować komórki
człowieka wewnątrz i potencjalnie może wpływać na
reakcje chemiczne i biochemiczne zachodzące wewnątrz
nich, dlatego procesy zachodzące pod wpływem tego
rodzaju pól w komórce mogą podlegać zmianom [7].
W przypadku pól elektrycznych oddziaływanie ich na
PRZEGLĄD ELEKTROTECHNICZNY, ISSN 0033-2097, R. 92 NR 12/2016
169
materię ożywioną ma inny charakter. Własności
dielektryczne błon komórkowych powodują, że pola tego
typu są zatrzymywane na powierzchni komórki i praktycznie
nie wnikają do jej wnętrza [8]. Jednocześnie niewykluczone
że sama błona komórkowa w niektórych przypadkach
oddziałując z polami magnetycznymi oraz elektrycznymi
może działać jak swego rodzaju antena [9].
Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem (IARC International
Agency
For
Research
of
Cancer)
zakwalifikowała stałe pola magnetyczne oraz elektryczne
jako czynniki nie rakotwórcze [10]. Jednocześnie należy
zauważyć, że pomimo przeprowadzenia dotychczas wielu
badań z tego zakresu nauki, niewyjaśniony nadal pozostaje
wpływ tego rodzaju pól na komórki białaczki ludzkiej HL-60.
Należy zwrócić uwagę, że pacjenci chorujący na białaczkę
podlegają niejednokrotnie ekspozycji na tego typu pola
podczas badań MRI dlatego ważnym zagadnieniem
naukowym staje się ocena wpływu tego typu pól na komórki
HL-60.
W niniejszej pracy podjęto próbę dokonania oceny
wpływu stałego pola magnetycznego na proliferację
komórek HL-60 w badaniach in vitro. Przedstawiony
materiał
stanowi
pierwszą
część
prowadzonych
interdyscyplinarnych badań biomedycznych.
Materiały i metody zastosowane w badaniach
Ekspozycja w polu magnetycznym
Ekspozycja polegała na umieszczeniu komórek HL-60
w probówce w stałym polu magnetycznym o indukcji 0.5T.
Stanowisko badawcze zostało zaprojektowane i zbudowane
na Politechnice Wrocławskiej w Laboratorium Badań
Zagrożeń Elektromagnetycznych i Bioelektromagnetyzmu.
Stanowisko zbudowane zostało w oparciu o neodymowy
element magnetyczny który jest źródłem stałego pola
magnetycznego. Źródło pola magnetycznego wykonane jest
z materiału N48 o wymiarach: długość: 60 mm, szerokość:
60 mm, wysokość: 25 mm, kierunek magnesowania: wzdłuż
wymiaru 25 mm. Ciężar elementu magnetycznego wynosi
674 [g]. Własności magnetyczne z którego wykonano źródło
pola magnetycznego przedstawiają się następująco:
indukcja remanencji Br 1,38-1,42 [T], koercja HcB min. 835
[kA/m], koercja HcJ min. 875 [kA/m], gęstość energii
magnetycznej (BH)max 366-390 [kJ/m3]. Kierunek
magnesowania wzdłuż wysokości oznacza, że prostopadła
do wysokości powierzchnia elementu magnetycznego
stanowi biegun "N" a druga przeciwległa prostopadła do
wysokości powierzchnia magnesu stanowi biegun "S".
Indukcja magnetyczna blisko krawędzi powierzchni bieguna
magnetycznego (maksymalna) przy dystansie 0,7 [mm]
wynosi ~0,520 [T] [11].
Próbki były podzielone na dwie grupy, z czego pierwsza
z nich poddana była działaniu pola magnetycznego przez
okres 72 godzin, zaś druga stanowiła grupę kontrolną
odizolowaną od działania pola magnetycznego.
Pomiar indukcji pola magnetycznego
Do identyfikacji oraz monitorowania stałego pola
magnetycznego podczas prowadzonych badań użyto
miernika Miernik F.W.Bell 4048.
Miernik F.W.Bell 4048 ze względu na zastosowany
w nim rodzaj sondy umożliwia pomiar tylko jednej składowej
indukcji pola magnetycznego. Przyrząd ten posiada dwie
wymienne sondy do pomiaru pola magnetycznego
wykorzystujące w swym działaniu efekt Halla.
Na najczulszym zakresie pomiarowym zapewnia on
dokładność rzędu 0,01 mT. W celu określenia wartości
indukcji magnetycznej w danym punkcie należy tym
miernikiem dokonać trzech pomiarów dla poszczególnych
składowych: Bx, By oraz Bz a następnie obliczyć wartość
skuteczną indukcji Bsk korzystając z zależności (1):
170
(1)
B sk 
2
2
Bx  B y  Bz
Sonda pomiarowa miernika F.W.Bell 4048 ze względu
na małe rozmiary umożliwia pomiar wartości pola
magnetycznego (indukcji magnetycznej) w bardzo bliskiej
odległości od jego źródła.
Hodowle komórkowe
Eksperymenty prowadzono na komórkach ludzkiej linii
białaczkowej mieloblastycznej
HL-60, hodowanych w
zawiesinie w inkubatorze (Nuaire),
w standardowych
warunkach (37⁰C, 5% CO2, 100% wilgotność) w pożywce
RPMI 1640 (IITD PAN, Wrocław) zawierającej 10%
surowicy płodowej cielęcej (Invitrogen, Warszawa) i 100
µg/ml gentamycyny (KRKA-Polska, Warszawa) – podłoże
hodowlane.
Komórki używane w badaniach dokarmiano w dniu
poprzedzającym eksperyment dodając świeże podłoże i
ustalając stężenie na 3-4x105/ml.
Dwieście tysięcy komórek HL60 w objętości 1 ml
podłoża hodowlanego poddawano przez 72 H ekspozycji na
pole magnetyczne w 5 ml polistyrenowych probówkach
hodowlanych (75x12 mm) dostarczonych przez Sarstedt
(Warszawa).
Ocena apoptozy
Apoptozę komórek HL60 poddanych działaniu pola
magnetycznego mierzono metodą cytometrii przepływowej
w oparciu o test wiązania anneksyny V i barwienia
propidylkiem jodowym (PI). Test wykorzystuje zjawisko
obserwowane już we wczesnych etapach apoptozy
polegające na utracie asymetrii błony cytoplazmatycznej, w
wyniku czego ujemnie naładowane reszty fosfatydyloseryny
eksponowane są z wnętrza do zewnętrznych warstw
cytoplazmy. Anneksyna V jest z kolei białkiem o silnym
powinowactwie do fosfatydyloseryny. Wyznakowana
fluorochromem (FITC, izotiocyjanian fluoresceiny) łączy się
w obecności jonów wapnia z błonami komórek
apoptotycznych, nie reaguje natomiast z komórkami
żywymi. Z kolei jodek propidyny jest barwnikiem tworzącym
fluoryzujące addukty z dwuniciowym DNA – nie wybarwia
żywych komórek (o zachowanej integralności błony
cytoplazmatycznej), wnika natomiast do jąder komórek
martwych. Do testu użyto zestawu Annexin V-FITC
Apoptosis Detection Kit I (Becton Dickinson-Pharmingen,
San Diego, USA) postępując zgodnie z protokołem
producenta. W skrócie, komórki po ekspozycji na pole
magnetyczne i komórki kontrolne z równolegle prowadzonej
hodowli kontrolnej wirowano, zawieszano w buforze
wiążącym o podwyższonym stężeniu jonów wapnia i
inkubowano przez 15 min z roztworem Anneksyny V-FITC i
propidylku jodowego (PI). Apoptozę mierzono w cytometrze
przepływowym (PAS, Partec, Niemcy), osobno oceniając
odsetkek komórek wiążących tylko anneksynę V (apoptoza
wczesna) oraz jednocześnie anneksynę V i PI (apoptoza
późna). Każdorazowo analizie poddawano 15000 komórek.
Dyskusja wyników z przeprowadzonych badań
Celem
przeprowadzonych
eksperymentów
było
sprawdzenie czy stałe pole magnetyczne o indukcji 0.5 T
powoduje wzrost poziomu apoptozy mierzonej metodą
cytometrii przepływowej w oparciu o test wiązania
anneksyny V i barwienia propidylkiem jodowym (PI) w
komórkach białaczki ludzkiej HL-60.
Czasy ekspozycji dla każdego z eksperymentów wynosił
72 godziny. W normalnych warunkach (komórki kontrolne)
poziom apoptozy był stosunkowo niski i tylko pojedyncze
komórki wykazywały właściwości apoptotyczne (Rys. 1,
pole A2).
PRZEGLĄD ELEKTROTECHNICZNY, ISSN 0033-2097, R. 92 NR 12/2016
Rys.1. Przykładowy zestaw cytogramów ilustrujących analizę apoptozy komórek linii HL60 mierzoną cytofluorymetrycznie testem wiązania
aneksyny V i jodku propidyny.Cytogramy hodowli kontrolnej (górny panel), wykazującej niewielką apoptozę spontaniczną i hodowli
z wyindukowaną apoptozą (dół). Widoczne zmiany morfologii komórek (A1 vs B1) oraz wzrost odsetka komórek wykazujących apoptozę
wczesną (dolne prawe kwadranty) jak i zaawansowaną (kwadranty prawe, górne), A2 przeciwko B2.
Tabela 1. Histogram ilustrujący rozkład wyników apoptozy w grupie
kontrolnej (GK). Czarne prostokąty ilustrują ilość wyników
w poszczególnych przedziałach rejestrowanych wartości.
6
5
4
3
2
1
GK (%)
<10
10-20
20-30
>30
Tabela 2. Histogram ilustrujący rozkład wyników apoptozy w grupie
badanej (GB). Czarne prostokąty ilustrują ilość wyników
w poszczególnych przedziałach rejestrowanych wartości
6
5
4
3
2
1
GB (%)
<10
10-20
20-30
>30
Eksperymenty
wykonano
dziewięciokrotnie.
Z opracowania statystycznego odrzucono wyniki skrajne.
Ostatecznie
uwzględniono
wyniki
z
siedmiu
przeprowadzonych eksperymentów.
Za każdym razem dokonano pomiaru poziomu apoptozy
w komórkach kontrolnych jak i poddanych ekspozycji przez
okres 72 godzin w stałym polu magnetycznym. Przed
każdym pobraniem zawiesina komórek została dokładnie
wymieszana. Tabela 1 zawiera histogram ilustrujący
w sposób graficzny zestawienie rozkładu empirycznego
przedziałów wartości dla poszczególnych poziomów
apoptozy w komórkach HL-60 występujących w grupie
kontrolnej (GK), natomiast w tabeli 2 zestawiono rozkład
przedziałów wartości poziomów apoptozy w komórkach
HL-60 występujących w grupie badanej (GB) poddanej
działaniu stałego pola magnetycznego. Poszczególne
kolumny tabel ilustrują częstość występowania wartości
apoptozy dla poszczególnych przedziałów procentowych:
0-10%, 10-20%, 20-30% oraz powyżej 30%. Opracowanie
statystyczne uzyskanych wyników z badań oparto na
estymacji przedziałowej, polegającej na konstrukcji
przedziału liczbowego (przedział ufności dla średniej
arytmetycznej), który z prawdopodobieństwem 95% będzie
zawierał nieznaną, prawdziwą wartość szacowanego
parametru z populacji generalnej.
W tabeli 3 zestawiono wyniki statystycznego
opracowania analizowanych badań eksperymentalnych.
Zastosowano następujące oznaczenia parametrów rozkładu
statystycznego: α=0,05 – poziom istotności, m - wartości
średnie, SD - odchylenie standardowe, P – przedział
ufności.
PRZEGLĄD ELEKTROTECHNICZNY, ISSN 0033-2097, R. 92 NR 12/2016
171
Tabela 3. Wyniki opracowania statystycznego z badań poziomu
apoptozy w badanej populacji komórek HL-60 przed i po ekspozycji
w stałym polu magnetycznym 0,5T
12,76
Poziom apoptozy
w grupie poddanej
działaniu pola
(GB)
13,67
8,07
6,78
5,0
4,2
Poziom apoptozy
w grupie
kontrolnej (GK)
M - średnia
SD -odchylenie
standardowe
P – przedział
ufności _+/-
Rysunek 2 ilustruje poziom apoptozy pod wpływem
stałego pola magnetycznego 0,5T. Wykres przedstawia
wartości średnie, kolumna GK odpowiadająca grupie
kontrolnej oraz kolumna GB odpowiadająca grupie badanej
poddanej wpływowi pola magnetycznego. Wyliczone
przedziały ufności dla α= 0,05 zaznaczono pionowymi
czarnymi odcinkami.
te mogą pozwolić na wyjaśnienie mechanizmów
oddziaływań stałych pól magnetycznych na organizmy
żywe, w tym na organizm człowieka, co może przyczynić
się między innymi do oceny reakcji organizmów żywych
w funkcji rosnącej indukcji oraz czasu działania stałego pola
magnetycznego.
Autorzy: dr Dariusz Sztafrowski, Politechnika Wrocławska, Katedra
Energoelektryki, ul. Wybrzeże Wyspiańskiego 27, 50-370 Wrocław,
E-mail:
[email protected], Prof. dr hab. med.
Kazimierz Kuliczkowski, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu,
Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji
Szpiku, E-mail: [email protected], mgr inż.
Bożena Jaźwiec, Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i
Transplantacji Szpiku, Pracownia Biologii Molekularnej, E-mail:
[email protected], Magdalena Dec, Katedra i Klinika
Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku, Pracownia
Biologii Molekularnej, E-mail mgr inż. Jacek Gumiela, Politechnika
Wrocławska,
Katedra
Energoelektryki,
ul.
Wybrzeże
Wyspiańskiego
27,
50-370
Wrocław,
E-mail:
[email protected];.
LITERATURA
Rys.2. Ilustracja poziomu apoptozy mierzonej metodą cytometrii
przepływowej pod wpływem stałego pola magnetycznego 0,5T.
Wykres przedstawia wartości średnie oraz przedziały ufności dla
grupy kontrolnej GK oraz grupy badanej GB poddanej działaniu
pola magnetycznego.
Analiza wyników z obserwacji poziomu apoptozy nie
wykazała statystycznie istotnych różnic pomiędzy grupą
kontrolną a badaną. Nie zaobserwowano wpływu stałego
pola magnetycznego o indukcji 0,5 T na poziom apoptozy
w badanej populacji.
Jednocześnie analiza literatury z zakresu wpływu
stałych pól magnetycznych sugeruje, że może ono mieć
wpływ na procesy wewnątrzkomórkowe [12].
Analiza wyników z przeprowadzonych badań oraz
literatury
wskazują
na
potrzebę
kontynuowania
i rozszerzenia zakresu badawczego z rozwinięciem badań
o kolejne wyższe wartości stałych pól magnetycznych do
wartości powyżej 8 Tesli takich, na jakie narażeni są ludzie
między innymi podczas obrazowania w najnowszych
generacjach aparatów rezonansu magnetycznego. Badania
172
[1] Kudowski J., Ludyn D., Przekwas M. Energetyka a ochrona
środowiska. Wyd. Nauk.-Techniczne, Warszawa 1997.
[2] Siemiński M. Fizyka zagrożeń środowiska. Wyd. Naukowe
PWN, Warszawa 1994.
[3] Koreleski, Krzysztof. "Oddziaływanie napowietrznych linii
energetycznych na środowisko człowieka." Infrastruktura i
ekologia terenów wiejskich 2005.s. 47-60.
[4] Sztafrowski D., Wróblewski Z., Łukaszewicz M., Sikorski A.,
Majkowski M.: Magnetic field 50 Hz: its influence on living cells
HL-60. W: 2011 10th International Conference on Environment
and Electrical Engineering [Dokument elektroniczny], Rome,
Italy, 8-11 May 2011 / eds. M. Caciotta, Z. Leonowicz.
[Piscataway, NJ] : IEEE, cop. 2011. s. 774-777
[5] Yamaguchi-Sekino S., Sekino M., Ueno S.: Biological effects of
electromagnetic fields and recently updated safety guidelines
for strong static magnetic fields. Magn Reson Med Sci. 2011;
10(1): 1-10.
[6] Marko S., Markov T.: What need to be known abort the therapy
with static magnetic fields? Environmentalist. 2009; 29: 169176.
[7] Funk, Richard HW; Monsees, Thomas; Özkucur, Nurdan.
Electromagnetic effects–From cell biology to medicine.
Progress in histochemistry and cytochemistry, 2009, 43.4: 177264.
[8] Markov MS. Magnetic field therapy: a review. Electromagn Biol
Med 2007;26:1–23 IARC,
[9] Sztafrowski, Dariusz, Zbigniew Wroblewski, and Marcin
Łukaszewicz. "Evaluation of how low frequency magnetic field
50 Hz affect living cells." Przegląd Elektrotechniczny 87.2
(2011): 250-254.
[10] Non-Ionizing Radiation, Part 1: Static and Extremely LowFrequency (ELF) Electric and Magnetic Fields, IARC
Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to
Humans 80 (2002).
[11]http://www.magnesy.eu/mpl_60_x_60_x_25__n48__magnes_neodymowy-t-4058.html
[12] Miyakoshi, Junji. Effects of static magnetic fields at the cellular
level. Progress in biophysics and molecular biology, 2005,
87.2: 213-223
PRZEGLĄD ELEKTROTECHNICZNY, ISSN 0033-2097, R. 92 NR 12/2016