Antoni Zwiefka, Beata Weber−Dąbrowska, Andrzej Górski

PRACE POGLĄDOWE
Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 1, 105–109
ISSN 1230−025X
ANTONI ZWIEFKA, BEATA WEBER−DĄBROWSKA, ANDRZEJ GÓRSKI
Symulacje komputerowe terapii fagowej*
Computer simulations of phage therapy
Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, Centrum Doskonałości: IMMUNE
Streszczenie
Terapia fagowa jest jedną z form terapii antybakteryjnej, stosowaną wówczas, gdy zawodzą antybiotyki. W terapii
bakteriofagowej są wykorzystywane fagi, które w wyniku procesu namnażania się we wrażliwej komórce bakte−
ryjnej powodują jej całkowite zniszczenie i uwolnienie nowo powstałych cząstek fagowych zdolnych do niszcze−
nia następnych komórek bakteryjnych. Samoreplikujące się fagi potraktowano jak konwencjonalne leki i wprowa−
dzono nowe metody określające ich antybakteryjną aktywność. Zastosowanie symulacji komputerowych opartych
na równaniach matematycznych pozwala przewidzieć przebieg terapii fagowej. Do rozwoju takiego modelu tera−
pii fagowej przyczynia się znajomość kinetycznych zależności gęstości bakterii i bakteriofagów, a także oddziały−
wań bakteriofagi–bakterie. Od tego typu badań może również zależeć kliniczna skuteczność terapii bakteriofago−
wej. Analiza odpowiednio dobranego modelu powinna umożliwić określenie skutecznej dawki i czasu podania fa−
ga (Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 1, 105–109).
Słowa kluczowe: bakteriofag, terapia fagowa, farmakokinetyka, model kinetyczny, samoreplikacja.
Abstract
Phage therapy is one of the forms of antibacterial therapy. It is often applied in cases when antibiotics fail. Pha−
ges used in bacteriophage therapy as a result of the multiplication process in sensitive bacterial cell cause its
destruction and liberation of newly created phage particles capable of destruction of next bacterial cells. Self−
−replicating phages may be compared to conventional drugs and they demand new methods of defining their
antibacterial activity. The use of computer simulations, based on mathematical equations, permits to foresee
the course of phages therapy. Development of such a model of phage therapy is supported by the knowledge
of kinetic dependence of bacteria and bacteriophage density as well as the interactions bacteriophages−bacte−
ria. That kind of studies may also have an effect on the clinical efficiency of bacteriophage therapy. Analysis
of the chosen model should make it possible to define the dose and time of phage application (Adv. Clin. Exp.
Med. 2003, 12, 1, 105–109).
Key words: bacteriophage, phage therapy, pharmacokinetics, kinetic model, self−replication.
Jedną z najskuteczniejszych metod opisywa−
nia i analizy złożonych systemów biologicznych
są symulacje komputerowe. Oparte na modelu
matematycznym doskonale nadają się do badań
związanych ze zwalczaniem zakażeń bakteryj−
nych. Do pełnego poznania zjawisk związanych
z terapią antybakteryjną celowe jest zastosowa−
nie nowych metod pozwalających opisać je
w sposób matematyczny. Do badań tych włączy−
ły się ośrodki badawcze zajmujące się do tej po−
ry różnymi formami zwalczania lekoopornych
* Praca subsydiowana z grantu KBN nr 4 P05B 012 18.
bakterii. Na podstawie wcześniejszych doświad−
czeń proponują one na przykład nowe metody
interpretacji zachodzących zjawisk, w tym sy−
mulacji komputerowej terapii fagowej [1] opar−
tych na modelu zaproponowanym przez Pay−
ne’a [2–4]. Bazując na terapii konwencjonalny−
mi lekami (np. antybiotykami) przyjmuje on, że
zasadniczymi czynnikami różniącymi fagi od an−
tybiotyków są: samopowielanie się, swoistość
działania oraz brak istotnych działań ubocznych
podczas fagoterapii.
106
A. ZWIEFKA, B. WEBER−DĄBROWSKA, A. GÓRSKI
Zakażenia bakteryjne wywołane przez leko−
oporne formy bakterii stwarzają w praktyce me−
dycznej coraz większe problemy terapeutyczne.
Wiążą się one ze stałym pojawianiem się szczepów
bakteryjnych opornych na wszystkie antybiotyki,
w tym na wankomycynę – antybiotyk tak zwanej
ostatniej szansy [5]. Pojawienie się gronkowców
opornych na wszelkie dostępne antybiotyki [6] jest
jednym z najpoważniejszych wyzwań medycyny
naszych czasów. Wobec bezspornego zagrożenia ze
strony lekoopornych bakterii, także w obecnej sytu−
acji realnego niebezpieczeństwa, jakie niesie ze so−
bą bioterroryzm [7, 8], a jednocześnie na podstawie
pozytywnych wyników fagoterapii uzyskanych
przez nasz Instytut (wyniki prezentowane są na
stronie Instytutu – http://surfer.iitd.pan.wroc.pl/pha−
ges/phages.html) oraz przez Instytut Mikrobiologii
i Wirusologii w Gruzji [9], w różnych ośrodkach [1,
10, 16] są podejmowane ponowne próby wykorzy−
stania bakteriofagów w leczeniu zakażeń bakteryj−
nych u ludzi i zwierząt. W terapii bakteriofagowej
są wykorzystywane fagi, które w wyniku procesu
namnażania się we wrażliwej komórce bakteryjnej
powodują jej całkowite zniszczenie (lizę) i uwolnie−
nie nowo powstałych cząstek fagowych zdolnych
do niszczenia następnych komórek bakteryjnych.
Proces namnażania fagów zachodzi zarówno
w warunkach in vitro, jak i in vivo. Uzyskane do−
tychczas wyniki wykazały, że fagoterapia jest wy−
soce efektywna w leczeniu zakażeń wywołanych
przez różne gatunki lekoopornych bakterii [11,
12]. Końcowy wynik terapii fagowej jest jednak
uzależniony od wielu czynników, m.in. od szczepu
bakteryjnego wywołującego zakażenie, jego wraż−
liwości na swoiste bakteriofagi, siły litycznej faga,
koncentracji faga i bakterii, dostępności faga do
miejsca zakażenia, rodzaju zakażenia, czasu poda−
wania fagów, a także od prowadzonej jednocze−
śnie antybiotykoterapii [11].
Według Ackermanna [14] bakteriofagi po−
winny być testowane podobnie jak antybiotyki
i należy pełniej poznać ich farmakokinetykę, far−
makodynamikę, biologiczną dostępność, właści−
wości antybakteryjne i tolerancję przez orga−
nizm ludzki.
Kinetyczna teoria
terapii fagowej
Podstawowy matematyczny model kinetyki
terapii bakteriofagowej został zaprojektowany
przez Payne’a [2–4]. Zawiera podstawowe para−
metry dotyczące terapii i opisuje reprezentatywne
cechy oddziaływań fagi–bakterie. Jako model do
komputerowej symulacji fagoterapii zostały użyte
następujące równania kinetyczne [4]:
niezakażone
dx/dt = ax – bvx – Hx – cAr,
bakterie
zakażone
dy/dt = ay +bvx – ky – Hy – cAy,
bakterie
wolny
dv/dt = kLy – bvx – mv – hv,
bakteriofag
antybiotyki
dA/dt = – dAx – dAy – nA.
(jeśli stosowane)
Przedstawiają one zmiany gęstości (stężeń) nie−
zakażonych fagiem bakterii (dx/dt = x(t)), bakterii
zakażonych przez faga (dy/dt = y(t)), gęstość wol−
nych fagów na zewnątrz komórek (dv/dt = v(t))
w czasie. Zależności te są też funkcjami odpowiedzi
gospodarza na obecność bakterii i fagów – H(t), h(t),
oraz początkowej gęstości bakterii – XQ.
Model ten uwzględnia również takie parame−
try, jak: szybkość replikacji – a, współczynnik
wniknięcia faga do wnętrza komórki – b, szybkość
lizy zakażonych komórek – k i liczbę fagów uwol−
nionych podczas lizy – L. Poza tym określa wpływ
czasu (Tinoc) i dawki (Vinoc) oraz utratę wolnego fa−
ga (m). W przypadku użycia w terapii również an−
tybiotyku, uwzględnia zmianę jego stężenia
w czasie – dA/dt = A(t), współczynniki efektyw−
ności (c, d) oraz metabolizm antybiotyku (n) [4].
Na podstawie wyników badań eksperymental−
nych (in vitro) stwierdzono, że po wprowadzeniu
bakteriofaga do hodowli bakteryjnej (TF) jej gę−
stość gwałtownie maleje. Głównymi elementami
opisywanego modelu są: próg gęstości namnażania
faga (Xp) i krytyczny punkt czasu (Tp) (ryc. 1) [2].
Są one oparte na stwierdzeniu, że wzrost populacji
faga jest krytycznie zależny od gęstości (stężenia)
bakterii. Xp jest progiem gęstości bakterii, w którym
następuje wzrost liczby fagów i poniżej którego
maleje. Ten punkt jest też nazywany progiem gę−
stości namnażania i określa gęstość, przy której ist−
nieje prawdopodobieństwo spotkania wolnego
bakteriofaga i podatnej na zakażenie komórki bak−
teryjnej. Czas Tp, w którym gęstość bakterii osiąga
Xp jest nazywany często początkiem czasu namna−
żania faga. Przed tym punktem czasowym gęstość
bakterii jest zbyt mała, aby podtrzymać populację
fagów i następuje spadek ich liczby.
Zgodnie z założeniami tego modelu liczba fa−
gów wzrasta, gdy tylko gęstość komórek bakteryj−
nych jest wystarczająco wysoka, dlatego też pro−
ces ich namnażania nie jest określany tylko przez
rodzaj faga i bakterii, ale też przez zmianę faktycz−
nej gęstości bakterii w czasie. Przewidywane dla
takiego prostego modelu wartości krytyczne pro−
gów gęstości i krytyczne punkty czasu są funkcją
niezależnie ocenianych parametrów biologicz−
nych. Ustalenie matematycznego modelu terapii
fagowej zasadza się na analizie podstawowej wła−
ściwości, jaką jest jej skuteczność. Obecny model
107
Symulacje komputerowe terapii fagowej
stosowanie połączeń faga i antybiotyku w fago−
terapii sugeruje, że wypadkowy efekt takiej tera−
pii jest słabszy niż w przypadku użycia samego
bakteriofaga. Z danych doświadczalnych wyni−
ka, że antybiotyk może zmniejszać skuteczność
terapii fagowej. Należy także dodać, że jedno−
czesne dodanie antybiotyków i fagów powoduje
wydłużenie czasu namnażania faga. Zgodnie
z teorią kinetyczną Payne’a [4] należałoby się
więc spodziewać, że w przypadku użycia faga po
czasie Tp użycie antybiotyku powinno raczej
zwiększać skuteczność terapii fagowej. Wyniki
te wskazują na złożoność interakcji faga, anty−
biotyku i bakterii.
Ryc. 1. Znaczenie mierzenia czasu w terapii fagowej
oparte na symulacjach kinetyki uogólnionego systemu
fag/bakteria – według Payne'a
Fig. 1. Importance of timing in phage therapy based
on simulations of the kinetics of a global phage/bacte−
ria system – according to Payne
jest oparty na wcześniejszych modelach biokon−
troli [15, 16] i opisuje skuteczność jako funkcję
wielkości „dawki” faga i czasu. Pozwala rozważać
znaczenie różnych czynników związanych z repli−
kacją fagów podczas terapii. Inną ważną cechą,
która odróżnia terapię bakteriofagową od innych
form biokontroli jest fakt, że fagi same namnażają
się podczas trwania terapii [2]. Zanim dojdzie do
replikacji aktywnego faga, dochodzi do wzrostu
gęstości bakterii. Fakt ten stał się podstawą mode−
lu kinetycznego zasugerowanego przez Pay−
ne’a [2], który zakłada, że wzrost populacji faga
jest krytycznie zależny od gęstości (stężenia) bak−
terii. Aby terapia bakteriofagowa była skuteczna,
wymagane jest więc uwzględnienie różnych czyn−
ników niespotykanych w przypadku użycia kon−
wencjonalnych leków. Poza tym teoria kinetyczna
sugeruje możliwość takiego wyboru czasu poda−
wania faga, który może okazać się krytyczny dla
sukcesu leczenia. Na przykład, sugeruje się możli−
wość niepowodzenia przy zbyt wczesnym podaniu
antybiotyku. Inny niekorzystny przebieg fagotera−
pii może być spowodowany jednoczesnym uży−
ciem faga i antybiotyku [18, 19].
Wpływ antybiotyków
na terapię fagową
Wzrost antybiotykooporności bakterii uzasa−
dnia celowość przeprowadzenia badań nad jed−
noczesnym użyciem fagów i antybiotyków. Uni−
kalność fagoterapii polega między innymi na
wzroście stężenia „leku” w czasie jego stosowa−
nia. Jak wynika z badań przeprowadzonych
przez Ślopka et al. [18] oraz Sakandelidze [19],
Pasywny i aktywny
charakter terapii fagowej
W wyniku przeprowadzonych symulacji kom−
puterowych model zaproponowany przez Pay−
ne’a [2] sprawdzono w warunkach in vivo oraz in
vitro. W przypadku stosowania małych dawek fa−
ga efekt samoreplikacji porównano z ponownym
dodaniem leku konwencjonalnego i uznano, że te−
rapia ma wówczas charakter aktywny. W przypad−
ku zastosowania dużych dawek początkowych we−
dług kinetycznej terminologii Payne’a terapia ma
charakter pasywny. Na podstawie modelu zapro−
ponowanego przez Payne’a analizowano skutecz−
ność terapii jako funkcję wielkości dawki dodane−
go faga i wyboru czasu podania. Użycie tego ma−
tematycznego modelu pozwala na porównanie
skuteczności terapii dla konwencjonalnego leku
i bakteriofaga. Analizując zależność skuteczności
terapii od wielkości dawki i czasu podania fagów
(ryc. 2) [4], stwierdzono różne wyniki w zależno−
ści od wyżej wymienionych parametrów. Następ−
stwem takiego modelu jest to, że przy odpowie−
dnio zbliżonym stosunku ilościowym bakterii do
fagów przebieg terapii ma charakter aktywny. Zo−
stało to dobrze zilustrowane w przeprowadzonych
przez Soothilla [17] eksperymentach fagoterapii
zwierząt. Według autorów tego modelu, w proce−
sie namnażania faga, początek terapii jest opóźnia−
ny z uwagi na jej pasywny charakter. Jak wynika
w przeprowadzonych symulacji tego modelu terapii,
w tym czasie zmniejsza się liczba bakterii. Świadczy
o tym zgodność powierzchni skuteczności w zakre−
sie dużych dawek dla konwencjonalnego leku i dla
faga (ryc. 2) [4]. Dla pozostałych dawek faga stwier−
dzono przebieg powierzchni charakteryzujący się
brakiem jej ciągłości. Przyjmowanie zerowych war−
tości skuteczności terapii dla mniejszych i początko−
wych dawek sugeruje (w tym modelu), że terapia za−
wiedzie, jeśli dokona się takiego wyboru dawko−
wania i wyboru czasu podania faga.
108
A. ZWIEFKA, B. WEBER−DĄBROWSKA, A. GÓRSKI
Ryc. 2. Powierzchnie skuteczności pokazane jako funkcja czasu i wielkości dawki, dla: (A) – typowego leku kon−
wencjonalnego, (B) – bakteriofaga jako samoreplikującego się leku – według Payne'a [4]
Fig. 2. Efficacy surfaces displayed as a function of the time and size of dose, for: (A) – a typical conventional−style
drug, (B) – bacteriophage as a self−replicating drug – according to Payne [4]
Koloidalny model
terapii fagowej
Inny model terapii fagowej [20] przewiduje,
że spotkanie fagów z komórkami bakterii, jako
ich gospodarzami, jest całkowicie przypadkowe.
Wzajemne oddziaływanie fagów i bakterii jest tu
opisywane przez ruchy Browna oraz łączenie się
(koagulację) bezwładnych koloidalnych cząstek.
Model ten został zaproponowany przez Kasman
et al. [21]. Przeprowadzone symulacje kompute−
rowe tego modelu przyczyniły się do alternatyw−
nego wytłumaczenia zjawiska replikacji fagów.
Zostało ono zinterpretowane poprzez próg gęsto−
ści replikacji na podstawie matematycznego mo−
delu Schlesingera [22]. Podstawowym elemen−
tem tego modelu jest MOI (multiplicity of infec−
tion) – definiowany jako średnia liczba zakażania
każdej komórki, obliczana jako stosunek liczby
cząstek wirusa i komórek bakterii. Istotą tego
modelu jest założenie, że wszystkie cząstki wiru−
sa znajdą i zakażą komórkę. Również w tym przy−
padku ważnym wymogiem efektywnej terapii
jest, aby komórki bakterii były obecne w gęsto−
ściach równych lub znacznie większych niż faga.
Wnioski
Terapeutyczne zastosowanie bakteriofagów,
uważanych za samoreplikujące się leki wynika
z ich zdolności do namnażania się [13]. Wskazu−
je to na teoretyczną możliwość stosowania bardzo
małych ilości fagów. Symulacja odpowiednio do−
branego modelu terapii fagowej powinna umożli−
wić przewidywanie dawki i czasu podania faga.
Ostatnio ukazała się kolejna praca sugerująca, że
symulacja komputerowa wzrostu liczby fagów
może ułatwić ocenę stopnia ich namnażania [24].
Wymogi te może spełnić w przyszłości dalszy
rozwój modelu kinetycznego. Przyczyni się do te−
go znajomość zachodzących kinetycznych zja−
wisk zależności gęstości bakterii i bakteriofagów,
a także oddziaływań bakteriofagi–bakterie.
Jednym z głównych czynników wpływających
na przebieg terapii fagowej jest fakt opóźnienia
wzrostu liczby fagów w hodowli od czasu, gdy
bakteriofag jest mieszany z podatnymi nań bakte−
riami. W kulturze bakteryjnej (in vitro) liczba fa−
gów wzrasta dopiero po okresie 30–40 minut.
Czas ten jest określany jako czas potrzebny, aby
osiągnąć „próg replikacji” lub „próg namnażania”
fagów [23]. Matematyczny model takiego opóź−
nienia w replikacji fagów nie był jeszcze szeroko
badany lub dyskutowany. Dlatego też należy
w najbliższym czasie podjąć takie badania.
Wiadomo, że z punktu widzenia kinetyki naj−
wolniejszy etap określa dynamikę całego procesu.
To, co jest dlań decydujące, powinno więc być
analizowane również na poziomie molekularnym.
Należy założyć, że kliniczna skuteczność tera−
pii bakteriofagowej może zależeć również od tego
typu badań. Wyniki badań nad fagami otrzymywa−
ne z zastosowaniem metod biologii molekularnej
i genetyki mogą być również interpretowane
w kontekście kinetyki fagów. Uzupełniony w ten
sposób matematyczny model terapii fagowej po−
zwoli dokładniej przeanalizować procesy zacho−
dzące podczas jej prowadzenia.
Innym rozszerzeniem tego modelu powinno być
zastosowanie symulacji komputerowej opartej na me−
todach dynamiki molekularnej. Umożliwi to zapropo−
nowanie modelu potrafiącego przewidzieć i analizo−
wać oddziaływania fagów i bakterii zarówno na po−
ziomie molekularnym, jak i makromolekularnym.
Symulacje komputerowe terapii fagowej
109
Piśmiennictwo
[1] Pirisi A.: Phage therapy – advantages over antibiotics? Lancet 2000, 356, 1418.
[2] Payne R. J. H, Jansen V. A. A.: Phage therapy: The peculiar kinetics of self−replicating pharmaceuticals. Clin.
Pharmacol. Ther. 2000, 68, 225–230.
[3] Payne R. J. H., Jansen V. A. A.: Understanding bacteriophage therapy as a density−dependent kinetic process.
J. Ther. Biol. 2001, 208, 37–48.
[4] Payne R. J. H., Jansen V. A. A.: Pharmacokinetic principles of bacteriophage therapy. Clin. Pharmacokinetics.
(in press).
[5] Smith T. L., Pearson M. L., Wilcox K. R., Cruz C., Lancaster M. V., Robinson−Dunn B., Tenover F. C., Ze−
rvos M. J., Band J. D., White E., Jarvis W. R.: Emergence of vancomycin resistance in Staphylococcus, N. Engl.
J. Med. 1999, 340, 493–501.
[6] Hryniewicz W., Trzciński K.: Oporność na metycylinę Staphylococcus aureus. Mikrob. Ed. 1995, 2/3, 12–19.
[7] Annas G. J.: Bioterrorism, public health, and civil liberties, N. Engl. J. Med. 2002, 346, 1337–1342.
[8] Schuch R., Nelson D., Fischetti V. A.: A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis, Nature 2002,
418, 884–889.
[9] Sulakvelidze A., Alavidze Z., Morris J. G. Jr.: Bacteriophage therapy, Antimicrob. Agents Chemother. 2001,
45, 649–59.
[10] Smith H. W., Huggins M. B., Shaw K. M.: The control of experimental Escherichia coli diarrhoea in calves by
means of bacteriophages, J. Gen. Microbiol. 1987, 133, 1111–1126.
[11] Ślopek S., Weber−Dąbrowska B., Dąbrowski M., Kucharewicz−Krukowska A.: Results of bacteriophage tre−
atment of suppurative bacterial infections in the years 1981–1986, Arch. Immunol. Ther. Exp. 1987, 35, 569–583.
[12] Weber−Dąbrowska B., Mulczyk M., Górski A.: Bacteriophage therapy of bacterial infections: an update of our
institute's experience, Arch. Immunol. Ther. Exp. 2000, 48, 547–551.
[13] Sharp R.: Bacteriophages: biology and history. J. Chem. Tech. Biotech. 2001, 76, 667–672.
[14] Ackermann H. W., DuBow M.: Viruses of Prokaryotes I: General Properties of Bacteriophages. Chap. 7. In:
Practical Applications of Bacteriophages. CRC Press, Boca Raton, Floryda 1987.
[15] Barrow P. A., Soothil J. S.: Bacteriophage therapy and prophylaxis: rediscovery and renewed assessment of po−
tential. Trends Microbiol.1997, 5, 268−271.
[16] Alisky J., Iczkowski K., Rapaport A., Troitsky N.: Bacteriophage show promise as antimicrobial agents. J. In−
fect. 1998, 36, 5–15.
[17] Soothill J. S.: Treatment of experimental infection of mice with bacteriophages. J. Med. Microbiol., 1992, 37,
258–261.
[18] Ślopek S., Durlakowa I., Weber−Dąbrowska B., Kucharewicz−Krukowska A., Dąbrowski M., Bisikiewicz R.:
Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections I. General evaluation of the results. Arch.
Immunol. Ther. Exp. 1983, 31, 267–291.
[19] Sakandelidze V. M.: The combined use of specific phages and antibiotics in different infectious allergoses. Vrach.
Delo 1991, 3, 60–63 (in Russian).
[20] Stent G. S.: Molecular biology of bacterial viruses. p. W. H. Freeman and Company, San Francisco 1963, 88–96.
[21] Kasman L. M., Kasman A., Westwater C., Dolan J., Michael G., Schmidt I., James S., Norris I.: Overcoming
the Phage Replication Threshold: a Mathematical Model with Implications for Phage Therapy. J. Virol. 2002,76,
5557–5564.
[22] Schlesinger M.: Adsorption of phages to homologous bacteria. II. Quantitative investigations of adsorption velocity
and saturation. Estimation of the particle size of the bacteriophage, Z. Hyg. Immunitaetsforsch. 1932, 114, 49–160.
[23] Wiggins B. A., Alexander M.: Minimum bacterial density for bacteriophage replication: implications for signi−
ficance of bacteriophages in natural ecosystems, Appl. Environ. Microbiol. 1985, 49, 19–23.
[24] Abedon S. T., Herschler T. D., Stopar D.: Bacteriophage latent−period evolution as a response to resource ava−
ilability. Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, 4233–4241.
Adres do korespondencji:
Antoni Zwiefka
Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN
ul. Rudolfa Weigla 12
53−114 Wrocław
Praca wpłynęła do Redakcji: 9.10.2002 r.
Po recenzji: 15.10.2002 r.
Zaakceptowano do druku: 14.11.2002 r.
Received: 9.10.2002
Revised: 15.10.2002
Accepted: 14.11.2002