fag T4 - Wydział Biologii

Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii
Biologia i Biologia Medyczna II rok
Katedra Genetyki Molekularnej Bakterii
Katedra Biologii i Genetyki Medycznej
Katedra Biologii Molekularnej
Przedmiot:
Biologia Molekularna z Biotechnologią
=================================================================
Ćwiczenie 5
Regulacja ekspresji genów na przykładzie rozwoju bakteriofaga T4
Bakteriofag T4 należy do grupy fagów zjadliwych. Fagi zjadliwe są zdolne tylko do cyklu
litycznego, kończącego się zawsze lizą komórki gospodarza i uwolnieniem potomstwa fagowego. Drugą
grupę bakteriofagów stanowią fagi łagodne, które w zależności od warunków wzrostu komórek gospodarza,
mogą wybrać pomiędzy cyklem litycznym a cyklem lizogenicznym, podczas którego dochodzi do integracji
genomu faga z chromosomem bakteryjnym w formie profaga. Profag jest przekazywany do komórek
potomnych i w określonych warunkach może rozpocząć cykl lityczny, prowadzący do lizy komórki
gospodarza.
Typowy cykl infekcyjny bakteriofaga T4 kończy się tzw. lizą od wewnątrz (LI, ang. lysis from
within), która prowadzi do uwolnienia od 100 do 200 fagów potomnych w 25-30 min po infekcji, jeśli
bakterie są hodowane w 37°C w bogatej pożywce. W procesie tym biorą udział dwa główne białka: holina T
i endolizyna E o aktywności lizozymu. Endolizyna E akumuluje się w cytoplazmie, natomiast holina T jest
umiejscowiona w błonie wewnętrznej. W odpowiednim momencie holina T oligomeryzuje, tworząc pory,
przez które endolizyna E przedostaje się do periplazmy i trawi ścianę komórkową. Powoduje to lizę komórki
gospodarza i uwolnienie potomstwa fagowego. Jeśli bakteriofag T4 zakazi bakterie, które rosną bardzo
wolno albo wcale, to hamuje swój cykl rozwojowy do momentu, aż komórki bakteryjne zaczną się dzielić.
Dopiero wtedy kontynuuje swój rozwój i następuje liza komórek gospodarza. Mechanizm ten nazwano
pseudolizogenią. Jest to jeden z procesów umożliwiających opóźnienie i dostosowanie czasu lizy do
warunków wzrostu komórek gospodarza.
Kolejnym przystosowaniem jest inhibicja lizy (LIN, lysis inhibition). Polega ona na tym, że jeśli po
3 minutach (lub więcej) od rozpoczęcia cyklu rozwojowego faga T4, dojdzie do adsorpcji kolejnych fagów
T4 do tej samej bakterii, następuje przesunięcie momentu lizy nawet o kilka godzin. W tym czasie tworzą
się potomne cząstki fagowe, co powoduje, oprócz opóźnienia lizy w czasie również wzrost plonu fagowego
z 100-200 wirionów do nawet 1000. Do indukcji LIN niezbędne jest funkcjonalne białko RI, będące
antyholiną, które oddziaływuje bezpośrednio z holiną T, uniemożliwiając otwarcie porów w błonie
wewnętrznej i przejście endolizyny E z cytoplazmy do periplazmy, dzięki czemu chroni ścianę komórkową
przed trawieniem i blokuje lizę. Białko RI zbudowane jest z 97 aminokwasów, a jego masa wynosi 11,1
kDa. Uważa się, ze domena N-końcowa zawiera 16 aminokwasowy peptyd sygnałowy, odpowiadający za
transport RI do periplazmy, który prawdopodobnie ulega odcięciu między 24 a 25 aminokwasem. Domena
C-końcowa pełni funkcję antyholiny. Kolejnym białkiem biorącym udział w LIN jest białko RIII o masie
9,3 kDa, zbudowane z 82 aminokwasów. Występuje w cytoplazmie i prawdopodobnie stabilizuje
oddziaływania białka RI z holiną T przez oddziaływanie z cytoplazmatyczną N-końcową domeną holiny T.
Transkrypcja genów rI (koduje białko RI) oraz rIII (koduje białko RIII) zachodzi z wczesnych i późnych
promotorów, genu t (koduje holinę T) z promotora późnego, a genu e (koduje endolizynę E)- mimo
obecności promotora wczesnego i późnego- efektywna translacja zachodzi tylko na bazie transkryptu z
promotora późnego. Z wczesnego transkryptu nie dochodzi do translacji, ponieważ jest zablokowana przez
strukturę szpilki, powstającą na końcu 5’ tego transkryptu.
Nadal nieznany jest sygnał powodujący inhibicję lizy, jak i sygnał powodujący synchroniczny zanik
LIN (LIN collapse), co prowadzi do równoczesnej lizy zakażonych komórek bakteryjnych.
Mechanizm LIN chroni potomstwo fagowe przed zakażeniem bakterii już zainfekowanych innym
fagiem T4. Adsorpcja nowego bakteriofaga T4 do powierzchni zainfekowanej komórki jest dla niego
samobójstwem, ponieważ jego DNA jest uwalniany do przestrzeni periplazmatycznej i tam degradowany
przez nukleazy.
Jest to strategia ekologiczna, przypominająca „zmysł zagęszczenia” bakterii, która daje
najkorzystniejszy efekt dla całej populacji bakteriofagów T4, szczególnie w warunkach naturalnego
1
występowania, tj. w jelicie ssaków, gdzie prawdopodobieństwo adsorpcji do już zakażonej bakterii jest
duże.
Doświadczenie będzie polegało na porównaniu profilu lizy i określeniu czasu lizy hodowli
bakteryjnej szczepu E. coli MG1655 po zakażeniu fagiem T4D (wt) lub T4rI (fag T4 z mutacja w genie rI).
Część praktyczna
Materiały:
- szczep E. coli MG1655, - hodowla nocna
- lizat faga T4D (wt) i T4rI (mutacja w genie rI) ( przygotowany wcześniej),
- pożywka LB,
Wyposażenie:
- wytrząsarka
- spektrofotometr
- stoper
Wykonanie:
1. Odmłodzić hodowlę nocną szczepu MG1655 w 50 ml pożywki LB (1:50)
2. Hodować z wytrząsaniem w 37°C do OD600=0,1
3. Dodać do hodowli bakteryjnej lizat faga T4D lub T4rI do m.o.i.=0,1 i włączyć stoper.
4. Co 10 min przez 2h pobierać 1ml hodowli i mierzyć gęstość optyczną bakterii przy OD600. Uzyskane
wartości zapisać i umieścić na wykresie.
Zagadnienia do samodzielnego przygotowania:
1. Budowa faga T4 i funkcje poszczególnych elementów budowy.
2. Cechy charakterystyczne genomu faga T4 i jego replikacji.
3. Gospodarze faga T4.
4. Rodzaje transkryptów faga T4 i modyfikacje polimerazy RNA E. coli.
5. Etapy infekcji bakterii przez faga T4.
6. Przebieg cyklu litycznego.
7. Definicje pojęć: inhibicja lizy, liza od wewnątrz, liza z zewnątrz, pseudolizogenia, lizogenia.
8. Liczenia miana faga (PFU- plague forming units) oraz M.O.I (multiplicity of infection).
9. Zadania obliczeniowe, np. ile komórek bakteryjnych znajduje się w hodowli o OD600=0,1 w
objętości 1ml?
Literatura obowiązkowa:
1. Figura Grzegorz, Budynek Paulina, Dąbrowska Krystyna, Bakteriofag T4: molekularne aspekty
infekcji komórki bakteryjnej, rola białek kapsydowych.
Publikacja jest dostępna na stronie: http://www.phmd.pl/fulltxt.php?ICID=910880
Prosimy o przyniesienie kalkulatorów oraz papieru milimetrowego. Korzystanie z kalkulatorów w
telefonie komórkowym będzie zabronione. Przypominamy również o konieczności posiadania
fartucha.
2