Streszczenie

Streszczenie
ZMIANY W PROTEOMIE I ZWIĄZKACH FENOLOWYCH LIŚCI ORAZ KORZENI WINOROŚLI
(VITIS VINIFERA L.) POD WPŁYWEM DŁUGOTRWAŁYCH STRESÓWCH CHŁODU I SUSZY
mgr Angelika Król
Praca doktorska wykonana pod kierunkiem prof. dr. hab. Stanisława Weidnera, prof. zw.
Katedra Biochemii, Wydział Biologii i Biotechnologii Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie
Rośliny pochodzące z chłodnych stref klimatycznych, na drodze ewolucji, wykształciły szereg
mechanizmów tolerowania chłodu oraz suszy. Winorośl, jako roślina o dużych wymaganiach termicznych
i hydrologicznych, we wczesnych stadiach rozwojowych jest wrażliwa na działanie niskich temperatur oraz
suszy. Istotą poznania i zrozumienia mechanizmów adaptacji roślin do stresów środowiskowych jest
wyznaczenie wzorów ekspresji białek, identyfikacja białek stresowych oraz powiązanie ich specyficznych
funkcji w szlakach metabolicznych. Jednym z celów niniejszej pracy była analiza zmian wybranych
elementów metabolizmu wtórnego (zawartości związków fenolowych, kompozycji kwasów fenolowych
i funkcjonowania układów antyoksydacyjnych) w liściach sadzonek winorośli poddawanych długotrwałemu
działaniu chłodu oraz w liściach i korzeniach sadzonek winorośli w czasie działania długotrwałego stresu
suszy.
Oznaczenia
wybranych elementów metabolizmu wtórnego wykonywano stosując metody
kolorymetryczne. Ilościowych i jakościowych oznaczeń kwasów fenolowych dokonywano stosując
wysokosprawną chromatografię cieczową w układzie odwróconych faz (RP-HPLC). Analizy biochemiczne
wybranych elementów metabolizmu wtórnego pozwoliły stwierdzić, że długotrwałe działanie stresu chłodu
i suszy powodowało zmniejszenie ogólnej zawartości związków fenolowych oraz zidentyfikowanych kwasów
fenolowych: kwasu kawowego, p-kumarowego i
ferulowego. Zaobserwowano również zmniejszenie
potencjału antyoksydacyjnego ekstraktów wszystkich prób poddawanych stresom. W toku prowadzonych prac
wykazano, że długotrwałe działanie chłodu silniej wpływało na zmniejszenie wartości badanych elementów
metabolizmu wtórnego w liściach wrażliwych na chłód odmian winorośli niż odmian tolerujących ten stres.
Wykazane obniżenie potencjału antyoksydacyjnego oraz zawartości związków fenolowych i kwasów
fenolowych może świadczyć o negatywnym wpływie długotrwałego działania chłodu i suszy na metabolizm
wtórny winorośli. Główny cel niniejszej pracy stanowiła analiza i porównanie zmian zachodzących
w proteomie liści sadzonek winorośli w czasie długotrwałego działania stresu chłodu oraz stresu suszy.
Wyizolowane białka z liści winorośli rozdzielano techniką elektroforezy dwukierunkowej (2 DE). Białka,
których akumulacja zmieniała się w sposób istotny w warunkach doświadczalnych identyfikowano, stosując
tandemową spektrometrię masową typu MALDI TOF/TOF. Analiza proteomu liści winorośli pozwoliła na
wykrycie wielu białek, których synteza zmieniała się pod wpływem zastosowanych czynników stresowych.
Stwierdzono, że długotrwałe działanie niskiej temperatury w liściach winorośli odmian wrażliwych na
działanie chłodu powodowało zwiększenie akumulacji ponad połowy zidentyfikowanych białek. Z kolei
w liściach winorośli odmian tolerujących chłód, działanie niskiej temperatury hamowało gromadzenie ponad
połowy zidentyfikowanych białek. Wykazano również, że długotrwałe poddawanie sadzonek winorośli
stresowi suszy powodowało zmniejszenie poziomu akumulacji ponad połowy zidentyfikowanych białek
w liściach. Zaobserwowano, że zastosowane różne warunki stresowe w największym stopniu wpływały na
zwiększenie akumulacji białek związanych z przemianami energii i metabolizmem węglowodanowym, białek
związanych z bezpośrednią ochroną przed stresem oraz białek związanych z ekspresją informacji genetycznej
(białko bogate w glicynę). Stwierdzono również, że długotrwałe działanie chłodu i suszy powodowało
zmniejszenie syntezy kluczowych enzymów szklaku glikolizy oraz białek stanowiących kluczowy składnik
fotoukładu II. Wykazane zmiany poziomu akumulacji białek świadczą o zmianie realizowanego programu
genetycznego w komórkach winorośli w czasie działania stresu chłodu i suszy. Na podstawie uzyskanych
w pracy wyników dotyczących zmian poziomu gromadzenia białek w liściach winorośli w warunkach stresu
chłodu i suszy zaproponowano wykaz potencjalnych markerów białkowych dotyczących (ogólnie) stresów
abiotycznych winorośli, który obejmuje następujące białka: białko taumatynopodobne, białko HSP 18,2 kDa,
peroksydazę L-askorbinianową, karboksylazę fosfoenolopirogronianu, aldolazę fruktozo-1,6-bisfosforanu,
peroksyredoksynę Q,
cytoplazmatyczną
chloroplastową
izoformę
2
dehydrogenazy aldehydu
izomerazę triozofosforanową, podjednostkę X1 kompleksu
3-fosfoglicerynowego,
żelazowo-siarkowego
cytochromu b6-f, małą podjednostkę karboksylazy/oksygenazy rybulozo-1,5-bisfosforanu, formamidazę
kinureninową, białko bogate w glicynę, kinazę nukleozydodifosforanową, aktynę, białko At2g37660 oraz
białko o nieznanej funkcji. Potencjalne specyficzne biomarkery stresu chłodu to: białko Rieske FeS,
dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego oraz hipotetyczne białko VITIS_027630. Z kolei do grupy
potencjalnych specyficznych markerów białkowych stresu suszy zakwalifikowano następujące białka: 1,3-β
glukanazę, białko Rieske FeS, dehydrogenazę aldehydu 3-fosfoglicerynowego oraz syntetazę ATP (łańcuch
beta). Zaproponowano również potencjalne biomarkery wrażliwości roślin na stres chłodu. Do tej grupy
zostały zaliczone następujące białka: chloroplastowe białko chaperonowe 20 kDa, peroksyredoksyna E typu II,
aminometylotransferaza, mitochondrialna izoforma 1 białka CBS z domeną X3, białko rybosomowe L12,
reduktaza izoflawonowa, białko LOC100381605 oraz białko At1g09340. Otrzymane dane wskazują, że
pomimo występowania wielu wspólnych mechanizmów aklimatyzacji do warunków abiotycznych, winorośl
wykształciła wiele mechanizmów obronnych specyficznych dla stresu chłodu i stresu suszy. Wytypowane
białka mogą potencjalnie odgrywać rolę biomarkerów różnych stresów abiotycznych, ale część z nich może
również stanowić molekulare wyznaczniki tolerancji różnych odmian winorośli na stres chłodu. Pogłębienie
tego typu badań proteomicznych może wytyczyć nowe kierunki poszukiwania molekularnego podłoża
odporności roślin na różne czynniki stresowe oraz przyczynić się do powstania nowych odmian winorośli
przystosowanych do warunków klimatycznych północno-wschodniej Europy.