Toksyny bakteryjne jako czynniki wirulencji

laboratorium 11-12 /2010
|diagnost yka
l a b o r ato r yj n a
Toksyny bakteryjne
jako czynniki wirulencji
Część III. Wykorzystanie toksyn w medycynie
i w celach militarnych
Streszczenie
Toksyny
produkowane przez bakterie należą
do grupy substancji biorących udział
w procesach patogenezy. Liczne badania
wskazują, że stosowanie preparatów
zawierających toksynę botulinową
w odpowiednich dawkach przynosi
pozytywny skutek terapeutyczny
w przypadku wielu schorzeń, jak np. zez,
przykurcz powiek, kurcz karku, migrenowy
ból głowy, porażenie mózgowe, nadmierna
potliwość. Ponadto botulina znalazła
szerokie zastosowanie w kosmetologii
przy usuwania zmarszczek mimicznych.
Słowa kluczowe
botulina, Botox, toksyna tężcowa,
anatoksyna, atak bioterrorystyczny
Summary
Many pathogenic microbes
synthesise toxins that serve as primary
virulence factors. Many investigations
confirm the effective therapy with
botulin toxin preparations against squint,
contracture, nape cramp, migraine, and
cerebral palsy. Moreover, botulinum
toxin is used for cosmetic purposes.
Key words
botulinum toxin, Botox,
tetanus toxin, anatoxin, bioterrorist attack
dr Bożena Futoma-Kołoch
dr Gabriela Bugla-Płoskońska
dr Kamila Korzekwa
Z akład Mikrobiologii, Instytut Genetyki i Mikrobiologii
Uniwersytet Wrocławski
24
Chorobotwórczość
lostridium
C
botulinum
Bakterię Clostridium botulinum odkrył
i nazwał w 1897 roku belgijski bakteriolog Emile Pierre van Ermengen [1].
C. botulinum to beztlenowe, Gramdodatnie, przetrwalnikujące laseczki.
Charakterystyczną cechą tego gatunku
jest wytwarzanie siedmiu antygenowo
różnych typów toksyny BoNT, zwanej
także jadem kiełbasianym: A, B, C (Cα;
Cβ), D, E, F oraz G. Toksyny typu
C i D są chorobotwórcze dla różnych
gatunków zwierząt, natomiast system
nerwowy człowieka jest wrażliwy na pięć
z nich: A, B, E, F i G [2, 3]. Działanie
egzotoksyny na organizm ludzki wywołuje botulizm pokarmowy, przyranny
i dziecięcy (jelitowy). Najwcześniejsze
doniesienia dotyczące obecności jadu
kiełbasianego w pożywieniu dotyczą
rozkazów cesarza Leona VI, jednego
z władców Bizancjum zabraniające spożywania krwistych kiełbas ze względu
na ich szkodliwość dla zdrowia. Natomiast pierwszy odnotowany przez historyków przypadek botulizmu, nazwanego
później „epidemią zatrutych kiełbas”,
miał miejsce w Niemczech w 1793 roku.
Przyczyną był sposób produkcji kiełbasy,
który polegał na wypełnianiu świńskich
jelit krwią i mięsem, a następnie ich
wędzeniu. W latach 1820-1822 Justinus
Kerner zbadał 230 przypadków botulizmu i stwierdził, że do zachorowań nie
dochodzi, kiedy w kiełbasie zostawi się
trochę powietrza [3]. Biorąc pod uwagę
zapiski historyczne zakażenia C. botulinum kojarzą się ze spożywaniem nieświeżych mięs czy konserw mięsnych,
ale należy pamiętać, iż odnotowuje się
występowanie C. botulinum w przetworach warzywnych, takich jak: konserwy
z kukurydzą, fasolą, papryką, marchewką
czy w puszkach zawierających orzeszki
ziemne. Notowano obecność tej bakterii nawet w jogurtach, i bardzo często
w wypatroszonych rybach [4]. W Polsce
najwięcej zatruć wywołanych jest toksyną
typu B, zatrucia te mają jednak łagodny
przebieg. Według danych PZH, Polska
zajmuje pierwsze miejsce w Unii Europejskiej pod względem liczby zachorowań
na botulizm! Najwięcej zatruć jadem
kiełbasianym notuje się w suwalskiem,
poznańskiem i bydgoskiem [5].
Mechanizm działania
toksyny botulinowej
(BoNT)
Działanie BoNT polega na blokowaniu uwalniania acetylocholiny z presynaptycznych zakończeń płytki nerwowo-mięśniowej [2]. Wszystkie toksyny
botulinowe są metaloproteinami i zawierają w swoim składzie cynk [5]. Toksyna A jest polipeptydem zbudowanym
z łańcuchów L oraz H połączonych
wiązaniami dwusiarczkowymi. Poprzez
łańcuch H toksyna łączy się z białkiem
synaptogaminą (białko części presynaptycznej płytki nerwowo-mięśniowej)
i gangliozydami (rys. 1). Po połączeniu
tworzy się endosom, w którym następuje rozpad wiązań dwusiarczkowych
obecnych w BoNT. Łańcuch L zostaje uwolniony do cytoplazmy w części
presynaptycznej synapsy cholinergicznej. W synapsie tej istnieje kompleks
3 białek: synaptobrewina, SNAP-25,
syntaksyna, których obecność jest niezbędna w procesie endocytozy pęcherzyków synaptycznych zawierających
acetylocholinę. Łańcuch L zawiera endopeptydazę cynkową, która katalizuje
reakcje rozpadu białek wchodzących
w skład kompleksu [4, 5, 6]. Tak więc
mechanizm działania toksyny botulinowej polega na zahamowaniu wydzielania
d i ag n o s t y k a l a b o r ato r yj n a
neurotransmitera zakończeń nerwowych, czyli acetylocholiny, w obrębie
połączeń nerwowo-mięśniowych, czego
rezultatem jest rozkurcz i rozluźnienie
mięśnia, a więc jego relaksacja.
w usuwaniu przerosłych blizn. BTX jest
także skuteczny w walce z bólem u chorych cierpiących na zespół stopy cukrzycowej [1, 2]. Efekt działania preparatu
na organizm pacjenta jest przemijający
i wynosi od 3 do 18 miesięcy. Dawka
Botoksu toksyczna dla ludzi to 40 jed Medyczny aspekt
wykorzystania
nostek BTX/kg masy ciała (co dla 70-kibotuliny
logramowego człowieka daje 2500-3000
i toksyny tężcowej
jednostek) [2], tj.
Przeprowadzając rozważania na temat
– 0,09-0,15 μg toksyny podanej dożylnie
toksycznego działania jadu kiełbasianego
lub domięśniowo,
– 0,7-0,9 μg w postaci aerozolu,
na organizm człowieka, należy pamiętać
– 70 μg w dawce doustnej [4].
również o kosmetycznych i terapeutycznych aspektach jej wykorzystania. ObecInaczej mówiąc, 1 gram botuliny
nie zastosowanie medyczne, głównie
to 14 tys. śmiertelnych dawek doustnych
w okulistyce i neurologii oraz kosmetololub 1,25 mln śmiertelnych dawek wziewgii, mają toksyny typu A oraz B. Preparat
nych. Przeciętne dawki stosowane w derBotox (BTX) używany jest w zabiegach
matologii to 20-200 jednostek, tj. około
0,005% śmiertelnej doustnej dawki.
medycznych od ponad 20 lat, natomiast
w dermatologii kosmetycznej od ponad
Przeciwwskazaniami do stosowania
10 lat. Jako pierwszy w medycynie BTX
preparatów zawierających neurotoksyzastosował amerykański okulista Alan
nę botulinową są wszelkie schorzenia
Scott w 1977 roku do leczenie zeza.
płytki nerwowo-mięśniowej. Zabiegów,
w których używa się BoNT, nie należy
W kwietniu 2002 r. Amerykańska Agenstosować także u kobiet w ciąży, gdyż
cja ds. Żywności i Leków zaakceptowała
brak jest obecnie danych dotyczących
stosowanie toksyny botulinowej typu A
do usuwania zmarszczek [3]. Oprócz
wpływu tej neurotoksyny na przebieg
usuwania zmarszczek BoNT jest obecciąży. Również okres karmienia piersią
nie wykorzystywana do leczenia: zeza,
predysponuje do zaniechania korzystania z zabiegów opartych na BTX. Naoczopląsu, nadmiernego łzawienia i kur10-3378_AcroDisc_Polish_Ad.qxd:Layout 1 1/13/10 7:47 AM Page 1
10-3378_AcroDisc_Polish_Ad.qxd:Layout
1 1/13/10
7:47
AM Page iż 1 przeciwwskazaniem
czu powiek, zaburzeń połykania, kręczu
leży
pamiętać,
karku, migreny, dziecięcego porażenia
jest także przyjmowanie antybiotyków:
aminoglikozydów, penicylin oraz leków
mózgowego, porażenia nerwu twarzowego, drżenia
podniebiennego, nadmiernej
przeciwmalarycznych [7]. Botox modyfiTo
To
potliwości, skutków przerostu prostaty,
kuje działanie szeregu leków, wchodząc
dystonii szyjki macicy, trądziku; podejmuz nimi w interakcje. Stosowanie BTX
je się także próby wykorzystania Botoksu
może powodować mniejsze lub więk-
Zabezpiecza
|laboratorium
11-12/2010
sze skutki uboczne, takie jak: opadanie
powiek, wywinięcie powiek, bóle głowy
czy opadanie kącików ust [2].
Najnowsze badania wskazują na możliwość zastosowania toksyny tężcowej
(TeNT) w transferze różnorodnych substancji biologicznych do wybranych obszarów centralnego układu nerwowego.
TeNT produkowana przez szczepy Clostridium tetani jest testowana w badaniach
nad degradacją zwierzęcych komórek
nerwowych oraz w wywoływaniu eksperymentalnej padaczki. Przeprowadzano
doświadczenia, w których fragment
łańcucha ciężkiego toksyny tężcowej
został użyty jako nośnik dla enzymów:
hydrolazy lizosomowej i dysmutazy ponadtlenkowej do wnętrza komórek w hodowlach tkankowych lub β-galaktozydazy
w embrionach mysich [8].
Ważnym aspektem wykorzystania toksyn bakteryjnych w profilaktyce chorób
bakteryjnych jest użycie ich – najczęściej
w postaci toksoidów (anatoksyn) – jako
składników w szczepionkach. Anatoksyna tężcowa stanowi monokomponent
w szczepionce przeciw tężcowi, ale jest
także jednym ze składników w szczepionkach koniugatowych, m.in.: błoniczo-tężcowej (DT), błoniczo-tężcowokrztuścowej (DPT), przeciw Streptococcus
pneumoniae czy Haemophilus influenzae
typu b. Toksoid błoniczy znajduje zastosowanie jako składnik szczepionek
pojedynczych (przeciw błonicy) i koniugatowych zapobiegających zakażeniom
wywoływanym przez Streptococcus pneumoniae i Neisseria meningitidis [9].
reklama
Przedłuża
użytkowania
czas użytkowania
Przedłuża czas
kolumn
razy!
46 razy!
do 46
HPLC do
kolumn HPLC
W razie pytań skontaktuj się z nami:
W razie pytań skontaktuj się z nami:
[email protected] (email)
[email protected] (email)
www.pall.com/lab (strona www)
www.pall.com/lab (strona www)
25
laboratorium 11-12 /2010
|diagnost yka
l a b o r ato r yj n a
Przemysłowe
otrzymywanie
toksyn bakteryjnych
Preparaty zawierające w swoim składzie toksynę botulinową rozprowadzane są w postaci lioflizatu, który przed
użyciem wystarczy jedynie rozpuścić
w płynie fizjologicznym [3]. Procedura
produkcji toksyn bakteryjnych oparta
jest na standardowych technikach mikrobiologicznych, zwłaszcza jeśli chodzi o hodowlę bakterii wytwarzających
pożądany produkt. Pierwszym etapem
w procesie otrzymywania toksyny jest
wstępna hodowla toksynotwórczego
szczepu bakteryjnego w płynnym podłożu (tzw. prekultura), którą po upływie 3-4 dni przenosi się do znacznie
większej ilości podłoża znajdującego
się w zbiornikach przemysłowych. Hodowlę prowadzi się przez kilka tygodni
przy ściśle ustalonych parametrach, m.in.
napowietrzania, temperatury. Po osiągnięciu odpowiednio wysokiego miana
toksyny, oddziela się bakterie od frakcji
płynnej. Z przesączu hodowli pozyskuje
się toksynę, którą następnie poddaje się
detoksyfikacji formaldehydem lub formaliną (jeśli jest przeznaczona do produkcji szczepionek). Przemysł farmaceutyczny stosuje dodatkowe procedury
oczyszczające w celu zapewnienia odpowiedniej jakości i stabilności finalnemu
produktowi. Obecność substancji tzw.
balastowych (np. składników podłoża)
obniża aktywność preparatu i zwiększa
prawdopodobieństwo wystąpienia odczynów poszczepiennych [10]. Poszczególne
etapy w procesie otrzymywania toksyn
bakteryjnych w celach profilaktycznych
są następujące:
– pozyskanie szczepu intensywnie
produkującego toksynę, np. C. tetani nr 49205, szczep przechowywany
w narodowych bankach komórek
i szczepów,
– tzw. odmładzanie hodowli, prekultura, inkubacja w 37°C przez okres
24-30 h,
– zaszczepienie większych objętości
podłoża znajdującego się w fermentatorach (dla bakterii beztlenowych)
(brak białka w składzie pożywki –
otrzymuje się bardziej oczyszczony
produkt),
– właściwa hodowla toksynotwórczego
szczepu,
– oddzielenie podłoża od komórek
bakteryjnych,
26
BoNT typu B, D, F
oraz G
degradują białko:
synaprobrewinę
BoNT typu A
oraz E degradują
białko:
SNAP-25
Rys. 1. Oddziaływania różnych typów
BoNT na białka obecne w synapsie
cholinergicznej
BoNT typu C
degraduje białko:
syntaksynę
degradacja nawet
jednego z wymienionych
wyżej białek powoduje
zahamowanie uwalniania
acetylocholiny
– określenie miana toksyny w przesączu,
– detoksyfikacja toksyny formaliną
(0,5%) lub formaldehydem (0,3-0,4%),
kilkutygodniowa inkubacja najpierw
w temperaturze pokojowej, a następnie w 37-40°C,
– oczyszczanie i zagęszczanie produktu,
– „dojrzewanie” szczepionki – inkubacja
w 35°C przez 72 h i przez kolejne
3 miesiące w 4-8°C,
– przeprowadzenie testów jakościowych,
m.in. test na sterylność, ustalanie maksymalnej dawki toksycznej, minimalnej
dawki letalnej, stopień detoksyfikacji,
testy na zwierzętach [11, 12].
Zagrożenia wynikające
z niekontrolowanego
użycia toksyn
bakteryjnych
Botulinę zalicza się do grupy potencjalnie
najgroźniejszych substancji, mogących
stanowić źródło do konstruowania broni biologicznej. Do grupy czynników
o podobnym stopniu zagrożenia należą:
wirus ospy prawdziwej, laseczka wąglika
i pałeczka dżumy. Popyt na produkty
zawierające neurotoksynę botulinową
napędza powstawanie jej nielegalnej produkcji, a uzyskane w ten sposób preparaty są konkurencyjne pod względem ceny
w stosunku do wysoce oczyszczonych
produktów farmacetycznych [10]. Szczepy
C. botulinum używane w produkcji przemysłowej produkują dużo więcej toksyny
niż ich dzikie odmiany. Po dostaniu się
w niepowołane ręce mogą stać się realnym
zagrożeniem w razie ich użycia w atakach
terrorystycznych. Najniebezpieczniejsze
wydaje się skażenie żywności, co może
spowodować wybuch epidemii botulizmu
[3, 10]. Cechą, która w pewien sposób
ogranicza wykorzystanie botuliny jako
środka masowego rażenia, jest jej szybki
rozkład w kontakcie ze środowiskiem.
Pierwsze przypadki zastosowania botuliny jako broni biologicznej miały
prawdopodobnie miejsce około 70 lat
temu podczas okupacji Mandżurii przez
wojska japońskie. Udokumentowanym
przypadkiem jest również użycie botuliny na początku lat 90. XX w. przez
wyznawców Aum Shinrikyo (Najwyższa Prawda), którzy zastosowali toksynę
C. botulinum w postaci aerozolu, który
został rozproszony na przedmieściach
Tokio, a także na obszarach jednostek
armii amerykańskiej. Co ciekawe, ale
dla mikrobiologów niezaskakujące,
terroryści pozyskali komórki bakterii
z gleby [3, 13].
Sygnałami zagrożenia użycia jadu
kiełbasianego w atakach bioterrorystycznych są:
– jednoczesne lub w krótkich odstępach czasu wystąpienie potwierdzonych klinicznie i (lub) laboratoryjnie
zatruć jadem kiełbasianym w ilości
przekraczającej średnią z ostatnich
trzech miesięcy,
– jednoczesne lub w krótkich odstępach
czasu wystąpienie zespołów klinicznych (niepotwierdzonych etiologicznie) z objawami przypominającymi
zatrucie jadem kiełbasianym.
Kolejnym gatunkiem toksynotwórczych bakterii mogących być źródłem
dla produkcji broni biologicznej jest
laseczka wąglika. Bacillus anthracis stał
d i ag n o s t y k a l a b o r ato r yj n a
się potencjalnym elementem broni biologicznej, z uwagi na dużą infekcyjność,
stabilność spor i zdolność do szybkiego
wywoływania zapalenia płuc o charakterze letalnym [14]. W 1970 roku eksperci
Światowej Organizacji Zdrowia (WHO)
oszacowali, że rozpylenie z samolotu
50 kg przetrwalników nad miastem
zamieszkanym przez 5 mln ludzi spowodowałoby śmierć 250 000 osób. Jednak laseczki wąglika mają ograniczone
zastosowanie jako broń biologiczna,
z uwagi na:
– trudność namnożenia zjadliwych
szczepów B. anthracis, które byłyby
zdolne do intensywnego tworzenia
przetrwalników,
– trudność uzyskania wystarczającej
ilości spor w procesie hodowli,
– sklejenie spor użytych w postaci aerozolu, co powoduje szybkie ich opadanie na ziemię,
– zmniejszanie zagęszczenia spor w powietrzu lub danym pomieszczeniu
w wyniku działania warunków atmosferycznych, np. wiatru,
– ograniczona możliwość rozwoju epidemii, gdyż wąglik nie jest chorobą
zakaźną [15].
Sygnałami zagrożenia użycia laseczki
wąglika jako broni biologicznej są:
– wystąpienie zidentyfikowanych przypadków postaci płucnej lub jelitowej
wąglika,
– wystąpienie niezidentyfikowanych
bakteriologicznie i nieuzasadnionych
epidemiologicznie przypadków zachorowań o obrazie klinicznym sugerującym postać płucną lub jelitową
wąglika,
– pojawienie się zachorowań na wąglik
wśród zwierząt gospodarskich na obszarach nieendemicznych,
– pojawienie się zidentyfikowanych przez
bakteriologów zarodników wąglika
na terenie, gdzie wąglik nie występuje
endemicznie,
– użycie wąglika do ataku bioterrorystycznego w innych krajach, szczególnie ościennych,
– groźba (jawna lub pochodząca z danych wywiadu) dokonania ataku bioterrorystycznego ze strony organizacji
ekstremistycznych (w tym państw),
– pojawienie się sytuacji potencjalnego, ale jeszcze niezidentyfikowanego
zagrożenia w postaci np. przesyłek
pocztowych niewiadomego pochodzenia o niezwykłej zawartości,
– charakterystyczne objawy zapowiadające (prodromalne) pod postacią
zespołu grypopodobnego trwającego
2-4 dni,
– wystąpienie objawów ostrej niewydolności oddechowej i niewydolności
krążenia z poszerzeniem śródpiersia
na zdjęciu rentgenowskim płuc sugerujące limfadenopatię śródpiersia
i krwotoczne zapalenie śródpiersia
w 2-4 dni po objawach wstępnych
[16, 17].
Prawidłowo przeprowadzone dochodzenie epidemiologiczne w przypadku
podejrzenia ataku bioterrorystycznego
obejmuje następujące etapy:
– potwierdzenie epidemiologicznego
przebiegu choroby,
– weryfikacja rozpoznania na podstawie danych klinicznych, laboratoryjnych,
– definicja przypadku wzorcowego,
– ustalenie powiązań między przypadkami,
– powstanie hipotezy wyjaśniającej,
jak i dlaczego powstała epidemia
na podstawie dostępnych danych demograficznych, profilu lekooporności
drobnoustrojów, określenia czynników
ryzyka,
– sprawdzenie hipotezy, czy chorują ci,
którzy wg niej powinni chorować,
– dostosowanie środków prewencji,
– potwierdzenie, czy środki zapobiegawcze zmieniają korzystnie przebieg
epidemii wg Centers for Disease Control and Prevention z modyfikacją
do polskich realiów [17].
Wykaz sytuacji stanowiących epidemiologiczne oznaki ukrytego ataku bioterrorystycznego:
– duża liczba niewyjaśnionych zachorowań,
– występowanie zespołów chorobowych
lub zgonów zdarzających się w zbliżonym czasie, o podobnym obrazie
klinicznym, z charakterystycznymi
zmianami na skórze i/lub błonach
śluzowych, objawów uszkodzenia układu nerwowego, układu oddechowego,
przewodu pokarmowego, uszkodzeń
wieloukładowych, pojawienie się
wśród ludności niezwykłych chorób,
stwierdzenie nagłego, nieoczekiwanego wzrostu zachorowalności i umieralności z powodu znanych chorób,
nieskuteczności rutynowej terapii, wystąpienie zachorowań w nietypowym
dla nich sezonie i terenie geograficz-
|laboratorium
11-12/2010
nym, wykazanie podobnych genetycznie typów czynników etiologicznych
wyizolowanych z odległych w czasie
i przestrzeni źródeł [16].
q
Piśmiennictwo
1. www.kosmetologia.com.pl
2. Wojas-Pelc A., Jaworek A.K.: Toksyna botulinowa – zastosowanie we współczesnej terapii
dermatologicznej. „Lekarz Wojskowy”, 2003,
79, 5-8.
3. Satora P.: Toksyna botulinowa przyjaciel czy
wróg? „Laboratorium – Przegląd Ogolnopolski„, 2007, 5, 24-27.
4. www.strony.univ.gda.pl
5. Bielec D., Smeczuk G., Lis J., Firych J.,
Modrzewska R., Janowski R.: Epidemiologia
i klinika zatruć jadem kiełbasianym chorych
leczonych w klinice chorób zakaźnych akademii
medycznej w Lublinie w latach 1990-2000.
„Przegl. Epidemiol.”, 2002, 56, 435-42.
6. Rinaldi A.: Healing beauty. „EMBO reports”, 2008, 9, 1073-1077.
7. Dębicka A.: Zastosowanie toksyny botulinowej w medycynie. „Eskulap Świętokrzyski”,
2007, 1-3.
8. Parasion S., Bartoszcze M., Gryko R.:
Struktura i mechanizm działania neurotoksyn bakterii rodzaju Clostridium. „Przegl.
Epidem.”, 2007, 61, 519-527.
9. Schmitt C.K., Meysick K.C., O’Brien A.D.:
Bacterial toxins: friends or foes? „Emerging
Infectious Diseases”, 1999, 224-234.
10.Coleman K., Zilinskas R.A.: Fałszowany
botoks realne zagrożenie. „Świat Nauki”,
2010, 61-65.
11.Kumar Shukla D., Kumar G., Sharma S.,
Chandrasekaran N., Rao K.V.B.: Production of safe and potent tetanus toxoid (TT).
„J Pharmacy Res”, 2010, 3, 458-461.
12.Nielsen P.A.: Large-scale production of tetanus toxoid. „Appl Microb.”, 1967, 15,
453-454.
13.Reiss J., Mierzejewski J.: Toksyna botulinowa – aspekty zagrożenia biologicznego. „Mikrobiologia medycyna”, 2004, 2, 24-35.
14.Zarzecka A.: Toksyny wąglikowe. „Post
Mikr.” 2005, 44, 137-143.
15.Futoma-Kołoch B., Bugla-Płoskońska
G.: Bacillus anthracis. Potencjalny kandydat
na broń biologiczną? „Ekonatura”, 2008,
13, 10-12.
16.Mierzejewski J.: Bioterroryzm. „Postępy
mikrobiologii”, 2001, 40, 279-285
17.Mierzejewski J., Francuz D.R., Zajtuch R.:
Bioterroryzm, zarys zagrożeń i przeciwdziałań.
„Skalpel”, 2001, 4, 41-85.
27