DRUK -04- Ilnicki str. 311-323
advertisement
Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 3, str. 311–323 PRACA ORYGINALNA – Original Article KRZYSZTOF ILNICKI, ELśBIETA URBANOWSKA* Wpływ przechowywania komórek jądrowych krwi pępowinowej w naczyniach z róŜnych tworzyw sztucznych na ich przeŜycie i potencjał proliferacyjny The effect of storage of the nuclear cells suspension from cord blood in different plastic materials on their survival and proliferative potential Z Zakładu Genetyki, Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Małgorzata Krajewska-Walasek *Z Katedry i Kliniki Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych A.M. w Warszawie Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Wiesław Wiktor Jędrzejczak STRESZCZENIE Tematem przedstawionej pracy była ocena wpływu dwóch rodzajów tworzyw sztucznych, w których dokonywane jest preparowanie komórek jądrowych krwi pępowinowej przeznaczonej do przeszczepienia, na jakość zawartych w niej komórek krwiotwórczych. Preparatykę krwi pępowinowej oraz jej przechowywanie przez okres 14 dni, prowadzono równolegle w wykonanych z polipropylenu i polistyrenu naczyniach przeznaczonych do preparatyki materiału biologicznego. Stwierdzono, Ŝe jakkolwiek Ŝadne z tych tworzyw nie wpływało wybiórczo na Ŝywotność komórek jądrowych, to jednak preparatyce i przechowywaniu w naczyniach wykonanych z polistyrenu towarzyszyły duŜo wyŜsze straty liczby komórek jądrowych, w tym komórek tworzących kolonie krwiotwórcze. SŁOWA KLUCZOWE: Krew pępowinowa – Komórki jądrowe – Naczynia z polistyrenu – Naczynia z polipropylenu SUMMARY The aim of this work was to evaluate the effect of two plastic materials destinated for the processing of the nuclear cells on the quality of the cord blood hematopoietic cells. Processing and a 14 day storage of these cells was performed simultaneously in the dishes made of coated polystyrene and polypropylene. It was found that although neither of these materials influenced directly the viability of the nuclear cells, processing in the dishes made of coated polystyrene caused marked reduction in the number of these cells. KEY WORDS: Cord blood – Nuclear cells – polystyrene dishes – Polypropylene dishes 312 K. ILNICKI, E. URBANOWSKA WSTĘP Przeszczepianie szpiku kostnego allogenicznego jest szeroko stosowaną metodą leczenia nienowotworowych i nowotworowych chorób układu krwiotwórczego. Czynniki takie, jak wyŜsza od komórek szpiku aktywność proliferacyjna komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej, ich odpornościowa niedojrzałość ułatwiająca dobranie dawcy i biorcy (9, 11, 16, 20, 26), oraz praktycznie nieograniczony dostęp do niej spowodowały wzrost zainteresowania tym źródłem komórek krwiotwórczych (1, 6). Problemy techniczne związane z pobraniem krwi pępowinowej to jednorazowość jej pobrania i na ogół niewielka jej objętość. Uzupełnić krew pępowinową moŜna tylko szpikiem pobranym od tego samego dawcy, co nie zawsze jest moŜliwe. Dlatego teŜ spośród rozwaŜanych technik preparowania krwi pępowinowej stosuje się takie, które gwarantują największą wydajność jej pozyskania i najmniejsze straty komórek krwiotwórczych w czasie dalszej obróbki. Przez cały czas, od pobrania krwi pępowinowej do jej ewentualnego przeszczepienia znajduje się ona w naczyniach, które mogą być wykonane z róŜnych materiałów. ChociaŜ, materiały te są bez wyjątku dopuszczone do stosowania w hodowli tkankowej, to jednak mogą one wpływać w zróŜnicowany sposób na róŜne rodzaje komórek krwi i brakuje danych dotyczących oddziaływania poszczególnych tworzyw sztucznych na komórki krwiotwórcze krwi pępowinowej. Takie komórki mogą mieć kontakt z tego typu materiałami przez dłuŜszy lub krótszy okres czasu. Z reguły, komórki krwiotwórcze nie są preparowane bezpośrednio po pobraniu (które często odbywa się w nocy) a dopiero po kilku godzinach przechowywania w lodówce i przekazaniu ich do banku komórek krwiotwórczych. Ponadto, komórki są preparowane (a więc wirowane, sedymentowanie itp.) i to równieŜ obejmuje czas, kiedy kontaktują się z róŜnymi materiałami naczyń. Po trzecie, istnieje moŜliwość przetrzymania przez pewien okres czasu zawiesiny komórek jądrowych krwi pępowinowej w temperaturze +4°C (3, 13 , 19) bez zamraŜania, jeśli przeszczepienie będzie się mogło odbyć w krótkim czasie (do 72 godz.). UŜywane dawniej do procedur laboratoryjnych szkło borokrzemowe – nie modyfikowane, sprzyjające adhezji komórek oraz silikonowane – nie sprzyjające adhezji, wyszło juŜ całkowicie z uŜycia. Zamiast niego, zastosowanie znalazło szereg róŜnych tworzyw sztucznych o róŜnorodnych właściwościach fizykochemicznych, spełniających lepiej swoje zadanie niŜ szkło (14). Do najczęściej stosowanych naleŜą: – polietylen (PE) – wytwarzane są z niego pipety, kapilary do krioprezerwacji zarodków, wyściółka worka do krioprezerwacji krwi i produktów krwiopochodnych. – polipropylen (PP) – słuŜy do produkcji pipet, końcówek do pipet jednomiarowych, probówek (w tym probówek do krioprezerwacji) oraz jako wyściółka worka do krioprezerwacji krwi i produktów krwiopochodnych. – polichlorek winylu (PVC) – słuŜy przede wszystkim do produkcji worków do obróbki krwi i jej przechowywania w temperaturach nie niŜszych niŜ 0°C (igielit) oraz do produkcji kapilar do krioprezerwacji zarodków (odmiana winiduru). Wpływ przechowywania komórek jądrowych krwi pępowinowej 313 – polistyren (PS) – to tworzywo, ze zmodyfikowaną (uszlachetnioną) warstwą powierzchniową, jest szczególnie przydatne do produkcji jednorazowych naczyń słuŜących do hodowli tkankowych ze względu na dobre powinowactwo do adhezji komórek; produkowane są z niego równieŜ probówki. – poliwęglan (PC) – ze względu na wysoką wytrzymałość mechaniczną szczególnie dobrze nadaje się do produkcji probówek do ultrawirowania. Najczęściej naczynia wykorzystywane podczas preparowania i krótkoterminowego przechowywania krwi pępowinowej wykonane są z polistyrenu lub z polipropylenu. Inne tworzywa są wykorzystywane jedynie sporadycznie. Jest rzeczą oczywistą, Ŝe wszystkie te tworzywa muszą być w najwyŜszym stopniu oczyszczone od śladów monomeru, plastyfikatora czy antyutleniacza. Powierzchnia polistyrenu zostaje uszlachetniona metodami będącymi tajemnicą producenta. JednakŜe nawet nieuszlachetniony powierzchniowo, lecz dobrze oczyszczony polistyren (klasa – opakowania Ŝywności i leków) (17) nadaje się do hodowli komórek krwiotwórczych (7). Większość dostępnego piśmiennictwa opisuje wpływ kontaktu tworzywa, z którego wykonane jest naczynie na krwinki płytkowe (24), ich degradację i tworzenie skrzepów (10). Przedmiotem pracy było porównanie oddziaływania róŜnych tworzyw sztucznych tj. polistyrenu i polipropylenu na komórki jądrowe krwi pępowinowej: ich przeŜycie i zdolność do tworzenia kolonii krwiotwórczych. MATERIAŁ I METODY Pracę wykonano na 80 porcjach krwi pępowinowej pobranej w trakcie porodów rozwiązywanych siłami natury. Wiek rodzących wahał się w przedziale od 18 do 34 lat, były zdrowe, a porody odbywały się bez komplikacji. Określano objętość pobranej krwi, liczono bezwzględną liczbę komórek jądrowych (za pomocą analizatora hematologicznego Cell Dyna 1700 firmy Abbott) w populacji, której występują komórki krwiotwórcze oraz określano Ŝywotność tych komórek metodą wchłaniania błękitu trypanu obliczając odsetek martwych komórek, które pochłonęły barwnik. Cała objętość krwi pępowinowej była dzielona na 2 części, z których jedna słuŜyła do badania pełnej krwi, a druga do wyizolowania frakcji komórek jądrowych. Próbki pełnej krwi pępowinowej o objętości 5 ml przechowywano w naczyniach polistyrenowych i polipropylenowych w temp. +4ºC. W celu uzyskania frakcji leukocytarnej krew dzielono na 3 części – jedna część była poddawana separacji na Gradisolu-L (Polfa Kutno), druga na roztworze Ŝelatyny (Fluka Biochemika AG), a trzecia na 6% roztworze Skrobi Hydroksyetylowanej (Fresenius AG). Do preparowania i przechowywania krwi pępowinowej uŜywano produktów firmy Nalgae-Nunc Roskilde tj. probówek polistyrenowych z płaskim dnem o pojemności 10 ml oraz probówek polipropylenowych o pojemności 10 ml. W celu określenia liczby komórek krwiotwórczych i ich zdolności do tworzenia kolonii hematopoetycznych zakładano hodowlę w podłoŜu z metylcelulozą (Stem Cell Tech.). Odczytywano liczbę wyrośniętych kolonii krwiotwórczych na 50 000 nasadzo- 314 K. ILNICKI, E. URBANOWSKA nych komórek. Kolonie krwiotwórcze klasyfikowano według kryteriów opracowanych przez Sutherland i wsp. (23). Wynik był średnią z odczytu z 2 płytek. Otrzymane wartości przedstawiano jako średnie ± odchylenie standardowe. Porównania między grupami były przeprowadzane z uŜyciem testu t Studenta, a wartości p poniŜej 0,05 uznawano za znamienne statystycznie. . WYNIKI Wpływ dwóch rodzajów tworzyw sztucznych na komórki jądrowe krwi pępowinowej przechowywanej w +4°C przez 14 dni. a. Wpływ przechowywania w naczyniach z polistyrenu i polipropylenu pełnej krwi pępowinowej oraz wyizolowanej frakcji komórek jądrowych na odzysk tych komórek. Wpływ przechowywania komórek jądrowych w naczyniach z polistyrenu i polipropylenu na odzysk tych komórek przedstawia Rycina 1. Podczas przechowywania pełnej krwi w naczyniach polistyrenowych, po 7 dniach liczba komórek jądrowych zmniejszała się do 22 ± 13% liczby wyjściowej a po 14 dniach do 14 ± 7%. Podobne wyniki obserwowano, gdy przechowywano wyizolowane komórki jądrowe (odpowiednio 28 ± 15% i 17 ± 12%). 110 Krew pełna 100 Izolowane komórki jądrowe 90 80 70 60 50 40 p<0,05 30 p<0,05 20 p<0,05 10 0 czas przechowywania p<0,05 p<0,05 PP PS 7 dni PP PS 14 dni PP PS 7 dni p<0,05 - róŜnica statystycznie znamienna PP Polipropylen-PP PS 14 dni Polistyren-PS 0 Ryc. 1. Wpływ przechowywania w temp. +4 C przez 14 dni pełnej krwi pępowinowej oraz izolowanych komórek jądrowych w naczyniach z polistyrenu i polipropylenu na odzysk tych komórek Fig.1. Influence of the 14 days storage in +40C of nonprocessed cord blood and leucocytic fraction in the polystyrene and polypropylene dishes on the cells recovery Natomiast w naczyniach z polipropylenu, po 7 dniach następowało nieznaczne zmniejszenie liczby komórek jądrowych (do 88 ± 14% wartości wyjściowej w krwi pełnej i 79 ± 20% w materiale izolowanym), które pogłębiało się w czasie kolejnych dni przechowywania osiągając wartość 52 ± 16% w stosunku do wyjściowej liczby komórek jądrowych krwi pełnej i 30 ± 14% izolowanych komórek jądrowych. Wydaje się, Ŝe przechowywanie krwi pępowinowej pełnej, jak teŜ zawiesiny izolowanych z niej komórek jądrowych w naczyniach wykonanych z powierzchniowo modyfikowa- Wpływ przechowywania komórek jądrowych krwi pępowinowej 315 nego polistyrenu wpływa niekorzystnie na odzysk tych komórek. Preparatyka i przechowywanie w naczyniach wykonanych z polipropylenu powoduje znacząco mniejsze straty. Na Rycinie 1 przedstawiono ponadto znamienność róŜnic w odniesieniu do poszczególnych par wartości. Fot. 1 a Fot. 1 b Fot. 2 316 K. ILNICKI, E. URBANOWSKA Komórki, których ubywa z zawiesiny tworzą wielokomórkowe płatowate skupienia na ściankach naczynia (Fot. 1, 2). Stwierdzono znacznie intensywniejsze tworzenie takich struktur na ściankach naczynia wykonanego z polistyrenu niŜ z polipropylenu. Tabela 1. Porównanie odzysku liczby komórek jądrowych z 1 ml frakcji leukocytarnej krwi pepowinowej izolowanej na Gradisolu - L (G-L), skrobi hydroksyetylowanej (HES), Ŝelatynie (śel) oraz z 1 ml krwi pełnej przechowywanych w temp. +4° C w naczyniach polistyrenowych i polipropylenowych. Table 1. Comparison of the number of nuclear cell recovery from 1 ml leucocytic fraction of cord blood isolated on Gradisol L (G-L), hydoxyethyl starch (HES), gelatine (Gel) and from 1 ml of nonprocessed cord blood stored in polystyrene and polypropylene dishes in +4° C. Rodzaj przechowywanego preparatu komórkowego (po izolacji na:) Gradisol-L HES śelatyna Krew pełna Wyjściowa liczba komórek w 1 ml 7,4 x 106 9,7 x 106 10,9 x 106 14,1 x 106 Liczba komórek w preparacie przechowywanym w polistyrenie (na 1 ml) 7 dni 2,1 x 106 2,7 x 106 3,1 x 106 3,1 x 106 14 dni 1,3 x 106 1,6 x 106 1,9 x 106 2,0 x 106 Liczba komórek w preparacie przechowywanym w polipropylenie (na 1 ml) 7 dni 5,8 x 106 7,7 x 106 8,6 x 106 12,4 x 106 14 dni 2,2 x 106 2,9 x 106 3,3 x 106 7,3 x 106 W Tabeli 1 przedstawiono wyniki odzysku liczby komórek jądrowych frakcji leukocytarnej uzyskanej po izolowaniu na Gradisolu-L, Skrobi Hydroksyetylowanej i śelatynie oraz komórek jądrowych pełnej krwi, przechowywanych w naczyniach z polistyrenu i polipropylenu przez 14 dni. Uzyskane wyniki wskazują na gwałtowne zmniejszenie liczby komórek jądrowych przechowywanych w naczyniach polistyrenowych, szczególnie nasilone po 7 dniach. W tym samym czasie zmniejszenie liczby komórek jądrowych przechowywanych w naczyniach polipropylenowych było niewielkie. b. Wpływ przechowywania w naczyniach z polistyrenu i polipropylenu komórek jądrowych pełnej krwi pępowinowej oraz wyizolowanej frakcji komórek jądrowych na ich Ŝywotność. śywotność komórek jądrowych krwi pełnej oraz komórek jądrowych izolowanych z krwi pępowinowej przechowywanych w naczyniach z polistyrenu i polipropylenu przedstawiono na Rycinie 2. śywotność komórek jądrowych w materiale izolowanym oraz w krwi pełnej nie zmieniała się przez 7 dni przechowywania w temperaturze +4°C, niezaleŜnie od tego z jakiego rodzaju tworzywa były wykonane naczynia, dla uproszczenia nie zaznaczono więc rodzaju tworzywa na Rycinie 2. Jednak, zarówno w krwi pełnej, jak i we frakcji izolowanych komórek jądrowych obserwowano słabą, statystycznie nieznamienną tendencję do zmniejszenia się Ŝywotności po 14 dniach przechowywania, równieŜ niezaleŜnie od rodzaju tworzywa, z którego sporządzone były naczynia. Nie zaobserwowano równieŜ wpływu metody separacji krwinek jądrowych na ich przeŜycie w trakcie przechowywania. Odzysk liczby Ŝywych komórek jądrowych frakcji leukocytarnej uzyskanej po izolowaniu na Gradisolu-L, Skrobi Hydroksyetylowanej i śelatynie oraz komórek jądro- Wpływ przechowywania komórek jądrowych krwi pępowinowej 317 110 Krew pełna Izolowane komórki jądrowe 105 100 śywotność (%) 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 14 dni 7 dni czas przechowywania Ryc. 2. Wpływ przechowywania w temp. +40C przez 14 dni pełnej krwi pępowinowej oraz izolowanych komórek jądrowych na ich Ŝywotność. Fig. 2. Influence of the 14 days storage in +40C of nonprocessed cord blood and leucocytic fraction on their viability. Tabela 2. Porównanie odzysku liczby Ŝywych komórek jądrowych z 1 ml frakcji leukocytarnej krwi pepowinowej izolowanej na Gradisolu – L (G-L), 1,2% skrobi hydroksyetylowanej (HES) i 1,5% Ŝelatynie (śel) oraz z 1 ml krwi pełnej przechowywanych w temp. 4°C w naczyniach polistyrenowych i polipropylenowych. Table 2. Comparison of the number of viable nuclear cells recovery from 1 ml leucocytic fraction of cord blood isolated on Gradisol L (G-L), hydoxyethyl starch (HES), gelatine (Gel) and from 1 ml of nonprocessed cord blood stored in polystyrene and polypropylene dishes in +4° C. Rodzaj przechowywanego preparatu komórkowego (po izolacji na: ) Wyjściowa liczba komórek w 1 ml Gradisol-L HES śelatyna Krew pełna 7,4 x 106 9,7 x 106 10,9 x 106 14,1 x 106 Liczba komórek w preparacie przechowywanym w polistyrenie (na 1 ml) Liczba komórek w preparacie przechowywanym w polipropylenie (na 1 ml) 7 dni 2,0 x 106 2,5 x 106 2,9 x 106 2,9 x 106 7 dni 5,5 x 106 7,2 x 106 8,1 x 106 11,7 x 106 14 dni 1,1 x 106 1,4 x 106 1,7 x 106 1,9 x 106 14 dni 1,9 x 106 2,6 x 106 2,9 x 106 6,8 x 106 wych pełnej krwi pepowinowej podczas przechowywania w naczyniach z polistyrenu i polipropylenu przedstawia Tabela 2. Na wyniki zmniejszenia się liczby komórek jądrowych pozostających w zawiesinie nakłada się statystycznie nieznamienny, aczkolwiek niewielki spadek Ŝywotności tych komórek po 7 i 14 dniach przechowywania w naczyniach z polistyrenu i polipropylenu. Wynosił on odpowiednio 6% dla izolowanych komórek jądrowych krwi pełnej oraz izolowanych komórek jądrowych po 7 dniach, a 7% dla krwi pełnej i 12% dla izolowanych komórek jądrowych po 14 dniach przechowywania (Rycina 2). Przechowywanie w naczyniach polistyrenowych i polipropylenowych dopuszczonych do preparowania materiału biologicznego, wydaje się nie mieć znaczącego wpływu na Ŝywotność komórek jądrowych krwi pępowinowej 318 K. ILNICKI, E. URBANOWSKA odsetek odzysku liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze przechowywanych przez okres 14 dni, a statystycznie nieznamienne zmniejszenie Ŝywotności komórek jest rezultatem normalnych procesów katabolicznych zachodzących w komórkach przebywających w warunkach sztucznych, poza organizmem. c. Wpływ przechowywania w naczyniach z polistyrenu i polipropylenu komórek jądrowych pełnej krwi i frakcji komórek izolowanych na odzysk komórek tworzących kolonie krwiotwórcze 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 p<0,05 p<0,05 p<0,05 10 0 czas przechowywania 7 dni 14 dni Gradisol-L 7 dni 14 dni HES p<0,05 - róŜnica statystycznie znamienna 7 dni 14 dni śelatyna Ryc. 3. Wpływ przechowywania w temp. +40C przez 14 dni komórek jądrowych krwi pępowinowej izolowanych róŜnymi metodami na odzysk liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze. Fig. 3. Influence of the 14 days storage in +40C of the cord blood nuclear cells isolated by different methods, on the recovery of the hematopoietic colony forming cells. Na Rycinie 3 przedstawiono wpływ 14-dniowego przechowywania w naczyniach polistyrenowych i polipropylenowych w temp. +4ºC wyizolowanych z krwi pępowinowej komórek jądrowych na odzysk liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze. W przypadku kaŜdej metody separacji komórek jądrowych liczba komórek tworzących kolonie krwiotwórcze na 105 hodowanych komórek, które pozostały w zawiesinie, zmniejszała się po 7 dniach od 7% do 21% w stosunku do liczby wyjściowej. Ze względu na duŜy rozrzut wyników, róŜnice pomiędzy wartościami dla poszczególnych metod izolacji nie były znamienne. Nie obserwowano równieŜ statystycznie znamiennych róŜnic w liczbie komórek tworzących kolonie krwiotwórcze na 105 hodowanych komórek które pozostały w zawiesinie w zaleŜności od rodzaju tworzywa sztucznego. Dla uproszczenia, nie zaznaczono więc rodzaju tworzywa na Rycinie 3. Po 14 dniach przechowywania dochodziło do dalszego, statystycznie znamiennego zmniejszenia liczby komórek w porównaniu zarówno do wartości wyjściowej, jak i do wartości z dnia 7-ego. Odzysk liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze z 1 ml zawiesiny frakcji komórek izolowanych na Gradisolu – L, Skrobi Hydroksyetylowanej i śelatynie, przechowywanych w temperaturze +4°C w naczyniach polistyre- Wpływ przechowywania komórek jądrowych krwi pępowinowej 319 nowych przedstawia Tabela 3. Natomiast w Tabeli 4 pokazano odzysk liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze z 1 ml frakcji izolowanych na Gradisolu – L, Skrobi Hydroksyetylowanej i śelatynie, przechowywanych w temperaturze +4°C w naczyniach z polipropylenu. Jak wynika z Tabel 3 i 4, zarówno w trakcie przechowywania w temperaturze +4ºC w naczyniach polistyrenowych jak i polipropylenowych liczba komórek tworzących kolonie krwiotwórcze zmniejszała się wraz z wydłuŜeniem czasu przechowywania. JednakŜe, to zmniejszenie się było 2–3 krotnie mniejsze w odniesieniu do komórek przechowywanych w naczyniach z polipropylenu, w porównaniu do komórek przechowywanych w naczyniach z polistyrenu. Tabela 3. Odzysk liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze z 1 ml frakcji krwi pępowinowej izolowanej na Gradisolu-L oraz roztworach skrobi hydroksyetylowanej i Ŝelatyny, przechowywanych w temp. +4°C w naczyniach z polistyrenu. Table 3. Recovery of the number of the hematopoietic colony forming cells from 1 ml fraction of cord blood isolated on Gradisol-L, HES and gelatine solutions stored in polystyrene dishes in +4°C Czas przechowywania 0 dni 7 dni 14 dni Frakcja leukocytarna uzyskana po rozdziale krwi na: Gradisolu - L HES śelatynie 9398 ± 5994 13580 ± 7857 15587 ± 7848 2000 ± 1280 396 ± 256 3300 ± 1900 504 ± 294 3451 ± 1740 1088 ± 544 Tabela 4. Odzysk liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze z 1 ml frakcji leukocytarnej krwi pepowinowej izolowanych na Gradisolu-L oraz roztworach skrobi hydroksyetylowanej i Ŝelatyny, przechowywanych w temperaturze 4°C w naczyniach z polipropylenu. Table 4. Recovery of the number of hematopoietic colony forming cells from 1 ml fraction of cord blood isolated on Gradisol-L, HES and gelatine solutions stored in polypropylene dishes in +4°C Czas przechowywania 0 dni 7 dni 14 dni Frakcja leukocytarna uzyskana po rozdziale krwi na: Gradisolu – L HES śelatynie 9398 ± 5994 13580 ± 7857 15587 ± 7848 5500 ± 3520 684 ± 437 9504 ± 5472 936 ± 546 9639 ± 4860 1856 ± 928 OMÓWIENIE WYNIKÓW Krew pępowinowa zawiera komórki macierzyste układu krwiotwórczego, które odtwarzają hematopoezę u biorcy przeszczepu. Krew ta po pobraniu, podlega preparowaniu, które polega na usuwaniu niepotrzebnych dla celów transplantacyjnych elementów komórkowych (erytrocyty, granulocyty, pytki krwi), a pozostawiana jest frakcja komórek jądrowych zawierająca komórki krwiotwórcze. Czas trwania wszystkich wykonywanych czynności to kilka do kilkunastu godzin. Na poszczególnych etapach preparowania zachodzi potrzeba krótkoterminowego, bezpiecznego przechowywania zawiesiny komórek krwiotwórczych, w taki sposób, aby zapewnić najwyŜszy odsetek 320 K. ILNICKI, E. URBANOWSKA ich przeŜycia oraz zachowanie potencjału proliferacyjnego. Do kilkudniowego przechowywania krwi pępowinowej w temp. +4ºC. wykorzystywane są naczynia wykonane z dwóch najpowszechniej uŜywanych tworzyw sztucznych tj polistyrenu i polipropylenu, które mogą oddziaływać na parametry liczbowe i jakościowe preparowanych komórek jądrowych. Preti i wsp. (18) obserwowali straty komórek w zawiesinie nie rozdzielanego szpiku przechowywanego w +4°C w workach z polichlorku winylu. Simon i wsp. (22) stwierdzili niŜsze straty liczby oraz nieco wyŜszy odsetek przeŜycia limfocytów izolowanych z krwi obwodowej krioprezerwowanych w workach poliolefinowych, w stosunku do odzysku tych komórek krioprezerwowanych w polistyrenowych probówkach. W obecnej pracy porównywano przechowywanie materiału komórkowego w naczyniach z polistyrenu i polipropylenu. Istnieją zasadnicze róŜnice między składem chemicznym i właściwościami fizycznymi polipropylenu i polistyrenu. Polipropylen jest polimerem propylenu, od głównego łańcucha polimeru odchodzą grupy metylowe nie wykazujące cząstkowego ładunku elektrycznego. Cząsteczka polistyrenu (dwuosiowo orientowany poliwinylobenzen) róŜni się od cząsteczki polipropylenu obecnością pierścienia benzenowego w miejscu grupy metylowej polipropylenu. Adsorpcja wody przez polistyren osiąga wartość 0,2% masy w temp. +23°C podczas, gdy dla polipropylenu ta wartość jest 10-krotnie niŜsza (17). McCarthy (12) twierdzi, Ŝe zwilŜalność mierzona kątem przylegania kropli jest wypadkową zjawisk występujących równolegle – napięcia powierzchniowego i energii powierzchniowej. Cząstkowy ładunek powierzchniowy orientuje cząsteczki wody i przez to umoŜliwia lub nie jej kontakt z tworzywem. MoŜna przyjąć, Ŝe ułatwiony kontakt tworzywa z wodą jest warunkiem osadzenia się komórek na powierzchni takiego tworzywa . Gritskova i wsp. (5) stwierdzili wzmoŜoną adsorbcję białka na polistyrenie szczepionym kwasem metakrylowym (Pst/MAA). Łowkis i wsp.(10), Tchepurov i wsp.(25), Badian i wsp.(2) oraz Shumakov i wsp. (21) donoszą o wpływie ładunku elektrycznego i jego rozkładu na adhezję krwinek płytkowych. Wykazali oni, Ŝe tworzywa obdarzone ładunkiem ujemnym obniŜają adhezję spolaryzowanych ujemnie trombocytów, natomiast tworzywa mające na swojej powierzchni ładunek dodatni zwiększają adhezję tych komórek. Kotschy i wsp. (8) stwierdzili występowanie wzmoŜonej adsorbcji krwinek płytkowych i komórek jądrowych na powierzchniowo sulfonowanych sorbentach polimerowych o strukturze styrenowo – dwuwinylobenzenowej, modyfikowanych aminokwasami (Vinylsorb). Fehr i wsp. (4) zaobserwowali, Ŝe komórki jądrowe adsorbują się spontanicznie na powierzchniach plastikowych i włóknach nylonowych. O’Flaherty i wsp.(15) twierdzą, Ŝe czynniki chemotaktyczne wzmagają ten proces powodując zjawisko nadprzylegalności (hyperadherence) błony komórkowej, a jony Ca++ są niezbędne do uruchomienia tego mechanizmu. Nie moŜe ono być jednak mylone ze spontaniczną agregacją. Indukowana czynnikami chemotaktycznymi adhezja komórek jądrowych do powierzchni plastikowych i włókien nylonowych jest procesem równoległym do agregacji. Często obydwa te procesy występują jednocześnie, nie jest to jednak regułą. Wpływ przechowywania komórek jądrowych krwi pępowinowej 321 W obecnej pracy wykazano, Ŝe przechowywanie materiału komórkowego w naczyniach z polistyrenu i polipropylenu, powoduje występowanie znacznych róŜnic w odzysku komórek jądrowych w zaleŜności od rodzaju tworzywa, z jakiego wykonane były naczynia, ale niezaleŜne od tego, czy przechowywana była pełna krew czy wyizolowana frakcja leukocytarna. Szczególnie zaznaczone były straty komórek po 7 dniach przechowywania, które pogłębiały się po następnych 7 dniach. śywotność komórek pozostających w zawiesinie zmniejszała się bardzo nieznacznie, statystycznie niezamiennie, w czasie przechowywania w temperaturze +4°C. MoŜna wnioskować, Ŝe Ŝadne z uŜytych tworzyw, pomimo zasadniczych róŜnic w ich budowie, nie wprowadzało do podłoŜa hodowlanego substancji wpływających na Ŝywotność przechowywanych w nich komórek. Wynik ten był zgodny z oczekiwaniami, gdyŜ świadomie uŜyto do badań naczyń powszechnie uŜywanych w praktyce bio-medycznej, a więc wykonanych z tworzyw spełniających najostrzejsze kryteria. Zmniejszenie się liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze w izolatach przechowywanych w naczyniach z polistyrenu i polipropylenu, a co za tym idzie – potencjału proliferacyjnego, jest więc raczej wynikiem ogólnego zmniejszenia się liczby odzyskanych po wielodniowym przechowywaniu komórek jądrowych, niŜ wpływem tworzyw na potencjał proliferacyjny tych komórek. Komórki, których ubywało z zawiesiny tworzyły na ściankach naczyń wielokomórkowe płatowe struktury o powierzchni liczącej od kilku do kilkunastu mm². Badanie Ŝywotności metodą wchłaniania błękitu trypanu wskazywało, Ŝe komórki zawarte w tych strukturach pozostawały Ŝywe. JednakŜe rozbicie mechaniczne czy enzymatyczne tych struktur bez uszkodzenia zawartych w nich komórek nie spowodowało dyspersji, a postać agregatów, w jakiej się znajdowały, eliminowało całkowicie ich uŜyteczność do celów transplantacyjnych. Z danych przedstawionych w tej pracy, jak i przez innych autorów, moŜna wnioskować, Ŝe preparatyka krwi pępowinowej nie powinna być prowadzona w naczyniach wykonanych z polistyrenu modyfikowanego powierzchniowo (8), przeznaczonych do hodowli komórkowej, gdyŜ jakkolwiek nie wpływa to na przeŜycie komórek jądrowych pozostających w zawiesinie, to jednak znacznie zmniejsza ich liczbę. DuŜo mniejsze straty liczby komórek jądrowych obserwuje się po ich preparowaniu w naczyniach z polipropylenu i właśnie one powinny być uŜywane do tych celów. PIŚMIENNICTWO 1. Almici C, Carlo-Stella C, Wagner JE, Mangoni L, Garau D, Giachetti R, Cesana C, Rizzoli. Clonogenic capacity and ex vivo expansion potential of umbilical cord blood progenitor cells are not impaired by cryopreservation. Bone Marrow Transplantation 1997; 19: 1079-1084. 2. Badian L, Kus H, Kedra H, Knasiak D, Lowkis B, Rutowski R. Fizyczne i biologiczne badania elektretowej folii poliestrowej. Polimery w Medycynie 1978; 8: 44-55. 3. Ende N, Lu S, Mack R, Ponzio NM. The feasibility of using blood bank-stored (4°C) cord blood, unmatched for HLA for marrow transplantation. American Journal of Clinical Pathology 1999; 111: 773781. 322 K. ILNICKI, E. URBANOWSKA 4. Fehr J, Jacob HS. In vitro granulocyte adherence and in vivo margination – two associated Cdependent functions. Journal of Experimental Medicine 1977; 146: 614-622. 5. Gritskova A, Nuss PV, Krasheninnkova IG, Grzywa-Niksińska I, Dorokhova YA, Gusev SA, Grzywa E. Studies of the adsorption of proteins on the surface of polystyrene-co-(methacrylic acid)] (PSt/MAA) suspension particles. Polimery - Tworzywa Wielkocząsteczkowe 1995; 40: 346-350. 6. Ilnicki K, Jędrzejczak WW. Przeszczepianie komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej u człowieka - alternatywa dla przeszczepień szpiku kostnego. Postępy Biologii Komórki. 1994; 21: 461-478. 7. Jaskulski D, Jędrzejczak WW. Hodowla komórek krwiotwórczych in vitro w tłoczonej folii z PCV. Diagnostyka Laboratoryjna 1983; 19: 279-284. 8. Kotschy M, Jurkowski P, Zekanowska E. Sorbenty polimerowe do hemoperfuzji: 2)Wpływ modyfikacji powierzchniowej na morfologię, krzepliwość, fibrynolizę i kalikreinogenezę. Polimery w Medycynie 1989; 19: 37-47. 9. Kurtzberg J, Graham M, Casey J, Olson J, Stevens C, Rubinstein P. The use of umbilical cord blood in mismatched related and unrelated hematopoietic stem cell transplantation. Blood Cells 1994; 20: 275-284. 10. Łowkis B, Szymanowicz M. Does the liquid method of electret forming influence the adhesion of blood platelets? Polymers in Medidine 1995; 25: 3-13. 11. Madrigal JA, Cohen SBA, Gluckman E, Charron DJ. Does cord blood transplantation result in lower Graft-versus-host disease? Human Immunology 1997; 56: 1–5. 12. McCarthy S. Dynamic contact angle analysis and its application to paste PCV products. Polimery. 1998; 43: 314-319. 13. Ma DDF, Biggs JC. Comparison of two methods for concentrating stem cells for cryopreservation and transplantation. Transfuzjon 1982; 22: 217-219. 14. Nowicki P. Konserwowanie mroŜonych krwinek i osocza w pojemnikach z tworzyw sztucznych. Polymers in Medicine 1975; 5: 83-89. 15. O’Flaherty JT, Ward PA. Leukocyte aggregation induced by chemotactic factors. Inflammation 1978; 3: 177-194. 16. Papadogiannakis N, Johnsen SA. Distinct mitogens reveal different mechanisms of suppressor activity in human cord blood. Journal of Clinical and Laboratory Immunology 1988; 26: 37-41. 17. Polymeric Materials Encyclopedia Wyd: JC Salamone, CRC Press. 18. Preti RA, Razis R, Ciavarella D, Fan Y, Kuhns RE, Cook P, Wong G, Wuest DL, Ahmed T. Clinical and laboratory comparison study of refrigerated and cryopreserved bone marrow for transplantation. Bone Marrow Transplantation 1994; 13: 253-260. 19. Ratajczak MZ, Skórski T, Kuczyński W, Ratajczak J. The influence of 4°C storage on proliferative potential of human bone marrow CD34+ cells. Transplantological implications. Folia Histochemica et Cytobiologica 1993; 31: 109-112. 20. Reen DJ, Early E. Cord blood “naive” Tcells demonstrate distinct immunological properties compared with their adult counterpartners. Bone Marrow Transplantation 1998; 22 Suppl.1: S35. 21. Shumakov VI, Chepurov AK, Kozlov WK, Kazakova TI. Adhesion of blood platelets to electret featuring polymers. Polymers in Medicine 1975; 5: 247-251. 22. Simon JD, Flinton LJ, Albala MM. A simple method for the cryopreservation of human lymphocytes at -80°C. Transfusion 1977; 17: 23-28. 23. Sutherland HJ, Eaves AC, Eaves CJ. Quantitative assays for human hematopoietic progenitor cella. Bone Marrow Processing and Purging. A Practical Guide Wyd: A.P.Gee, CRC Press Inc. 1991; 155171. 24. Szymonowicz M, Lowkis B. In vitro testing method of polymers candidate destined for contact with blood. Polymers in Medicine 1990; 20: 43-55. Wpływ przechowywania komórek jądrowych krwi pępowinowej 323 25. Tcherpunov AK, Machortov NS, Zimin NK, Judin AA, Jeremin NW. Thrombogenic resistant properties of polyelectrolyte composition on the basis of weak polyelectrolytes. Polymers in Medicine 1980; 10: 244-256. 26. Ziegner UH, Ochs HD, Schanen C, Feig SA, Seyama K, Futatani T. Unrelated umbilical cord blood stem cell transplantation for X-linked immunodeficiences. Journal of Pediatry 2001; 138: 570– 573. Praca wpłynęła do Redakcji 13.11.2007 r. i została zakwalifikowana do druku 26.07.2007 r. Adres Autora Krzysztof Ilnicki 03-982 Warszawa ul. Bukowskiego 7 m 23
