b-galaktozydaza z dodaną metką histydynową (sześć histydyn) na N
advertisement
Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 IZOLACJA REKOMBINOWANEGO ENZYMU Z KOMÓREK BAKTERII ESCHERICHIA COLI Celem ćwiczenia jest oczyszczenie rekombinowanego enzymu z bakterii Escherichia coli – β-galaktozydazy (EC 3.2.1.23), produktu genu lacZ z operonu laktozowego (lac). Enzym ten został zmodyfikowany przez dodanie na N-końcu jego cząsteczki peptydu składającego się z sześciu histydyn oraz epitopu HA (fragment białka hemaglutyniny wirusa grypy), rozpoznawanego przez przeciwciała anty-HA i składającego się z dziewięciu aminokwasów (YPYDVPDYA), na jego C-końcu (Rys. 1). Teoretyczna masa cząsteczkowa tego rekombinowanego białka wyliczona na podstawie znajomości jego sekwencji aminokwasowej wynosi 120980 Da (przy założeniu, że żaden z jego 1066 aminokwasów nie jest usunięty, ani też białko nie ulega modyfikacjom, polegającym na przyłączeniu jakiejkolwiek dodatkowej reszty, np. cukrowej, fosforanowej, acylowej lub prenylowej). Rysunek 1. Schemat rekombinowanej β-galaktozydazy. CHARAKTERYSTYKA SYSTEMU EKSPRESYJNEGO Sekwencja nukleotydowa DNA kodująca czyszczone białko znajduje się na plazmidzie pET-28a (Novagen, Rys. 2), który został wprowadzony do komórek bakterii E. coli, szczepu BL21(DE3)1. Plazmidy z serii pET zawierają sekwencję ori typu ColE1 (pochodzącą z pBR322) i stąd występują w liczbie ok. 40 kopii na pojedynczą komórkę. Gen kodujący białko znajduje się w nich pod kontrolą promotora dla polimerazy RNA z faga T7. Użyty szczep bakterii posiada, wbudowany do swojego 1 Bakterie szczepu BL21 są pochodną dzikiego izolata E. coli typu B. Szczepy wywodzące się z typu B, w porównaniu ze szczepami pochodzącymi od dzikiego izolata K-12 (przeważająca większość szczepów laboratoryjnych), są dorodniejsze/zdrowsze, przez co wykazują się mocniejszym wzrostem i możliwością osiągnięcia zwiększonego poziomu ekspresji interesującego białka. 1/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 Rysunek 2. Schemat systemu ekspresji opartego na plazmidzie pET-28a w bakteriach BL21(DE3) (wg Novagen). 2/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 chromosomu, genom faga (forma profaga), zawierający dodatkowo gen kodujący polimerazę RNA z faga T7, pod kontrolą negatywną promotora z operatorem wiążącym represor laktozowy (tzw. lizogen DE3)2. Dodatkowo, użyte bakterie są pozbawione dwóch endogennych proteaz (posiadają mutacje w genach lon i ompT), co sprzyja osiągnięciu wyższej wydajności przy produkcji i oczyszczaniu białka.Ten wysokowydajny i ściśle kontrolowany system ekspresji uruchamiany jest przez dodanie do pożywki syntetycznego induktora - izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG, Rys. 3) do końcowego stężenia 1 mM, kiedy bakterie osiągną fazę wzrostu wykładniczego (wartość pomiaru zmętnienia zawiesiny bakterii techniką turbidometrii przy długości fali świetlnej 600 nm - A600nm ok. 0.8). IPTG, po dostaniu się do środka komórek bakterii, wiąże się do represora laktozowego, powodując jego inaktywację (regulacja allosteryczna represora). W efekcie, uruchomiona jest produkcja polimerazy RNA z faga T7, a następnie β-galaktozydazy, jako jedynego białka, którego gen w tych komórkach jest pod kontrolą promotora dla tej polimerazy. IPTG, choć należy do grupy β-galaktozydów, jest analogiem substratu nie hydrolizowanym przez β-galaktozydazę, ani przez żaden inny enzym w komórce, ze względu na obecność atomu siarki w miejsce atomu tlenu w wiązaniu glikozydowym. W wektorach serii pET znajduje się także sekwencja RBS (z ang.: ribosomal binding site) zapewniająca efektywny start translacji. Rysunek 3. Wzór strukturalny izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Szczep bakterii E. coli będący lizogenem λ (lizogenny dla faga λ) zawiera w swoim chromosomie wbudowany DNA tego faga, tzw. profag (lizogenia czyli włączanie fagowego DNA do chromosomu bakteryjnego jest możliwa w przypadku bakteriofagów łagodnych (umiarkowanych, lizogennych), do których należy λ). Profag λDE3 jest rekombinowaną wersją genomu λ, w której wstawiony gen 1 faga T7 (kodujący polimerazę RNA faga T7, pod kontrolą promotora lacUV5) ukraca ekspresję genu kodującego integrazę faga λ, niezbędną do wycięcia DNA faga (indukcja lub aktywacja profaga), wejścia faga w formę autonomiczną (stan wegetatywny) i cykl lityczny (wegetatywny), a w konsekwencji, lizy komórki gospodarza. W lizogenie DE3 profag λ jest zatem trwale zintegrowany z chromosomem, a jego komórki nie ulegają lizie (wynikłej z cyklu życiowego faga λ). 2 3/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 OTRZYMYWANIE LIZATU. PROBLEM ROZPUSZCZALNOŚCI BIAŁKA Po czterech godzinach indukcji, bakterie odwirowuje się i ich osad zawiesza w buforze lizującym (50 mM NaH2PO4, pH 8.0; 300 mM NaCl; 10 mM imidazol). Fosforan w tym roztworze zapewnia utrzymanie odpowiedniego pH, zaś chlorek sodu, a także w pewnym stopniu fosforan, odpowiedniej siły jonowej. Imidazol w stężeniu 10 mM zwiększa specyficznośc wiązania białek do złoża Ni—NTA agaroza w czasie chromatografii (zob. niżej). Zawiesinę bakterii poddaje się sonikacji (rozbijaniu ultradźwiękami), a następnie odwirowuje się resztki posonikacyjne, otrzymując klarowny lizat bakteryjny, zawierający wszystkie rozpuszczalne białka z komórek bakterii. Inna stosowana łagodna (natywna) metoda otrzymywania białek z komórek bakteryjnych wykorzystuje trawienie otoczki bakteryjnej lizozymem i dalej lizę komórek przy pomocy szoku osmotycznego (w buforze hipotonicznym). Teoretycznie, wysokowydajne systemy bakteryjne pozwalają uzyskać ekspresję rekombinowanego białka na poziomie nawet 50% wszystkich białek komórkowych. W praktyce jednak, poziom syntezy zależy od cech biologicznych i fizykochemicznych białka, np. niektóre białka mogą być toksyczne dla bakterii, hamując wzrost hodowli. W przypadku ekspresji w systemach hetereologicznych problemem może być także różna częstość wykorzystywania poszczególnych kodonów w komórkach różnych organizmów. Osobnym problemem jest rozpuszczalność białka. W wielu przypadkach produkowane białko ulega akumulacji w formie nierozpuszczalnej, w postaci agregatów nazywanych ciałami inkluzyjnymi. Takie "wytrącone" białko, po otwarciu bakterii w łagodnych (natywnych) warunkach pozostanie we frakcji nierozpuszczalnej. Zarówno poziom ekspresji jak i rozpuszczalność produkowanego białka można modyfikować zmieniając wektor, szczep bakteryjny lub warunki hodowli. Wektor może zwiększać rozpuszczalność białka przez umożliwienie dołączenia polipeptydu, który jest sam łatwo rozpuszczalny lub sekwencji kierującej białko do przestrzeni peryplazmatycznej, gdzie panują bardziej sprzyjające warunki do fałdowania białek. Rozpuszczalność białek można także czasami zwiększyć stosując szczepy bakteryjne pozbawione aktywności reduktazy tioredoksynowej i/lub reduktazy glutationowej (posiadające mutacje w genach, odpowiednio, trxB i/lub gor), co ułatwia powstawanie w ich cytoplazmie wiązań dwusiarczkowych w produkowanych białkach, które wymagają takich wiązań do prawidłowego fałdowania. Nawet jeśli są formowane ciała inkluzyjne, to zwykle część białka pozostaje w formie rozpuszczalnej. Dobierając odpowiednio warunki hodowli można próbować zmieniać proporcje frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej białka. Ogólna zasada jest taka, że wraz ze spadkiem szybkości syntezy rekombinowanego białka zwiększa się udział jego formy rozpuszczalnej w ogólnej puli. Szybkość syntezy można zmniejszyć poprzez: a) obniżenie stężenia IPTG, b) obniżenie temperatury hodowli i/lub c) hodowlę na podłożu minimalnym w przeciwieństwie do standardowo używanego podłoża pełnego. Zwiększenie napowietrzania hodowli bakteryjnej w czasie indukcji ekspresji może także zapobiegać tworzeniu ciał inkluzyjnych. W celu zoptymalizowania poziomu ekspresji i rozpuszczalności białka można także zmieniać czas indukcji oraz fazę hodowli bakteryjnej, w której dodawany jest induktor ekspresji. W sytuacji kiedy produkowane białko, po otwarciu komórek w warunkach natywnych, nadal pozostaje we frakcji nierozpuszczalnej, to można zastosować procedurę jego izolacji w warunkach denaturujących. Najczęściej stosuje się w tym celu roztwory do lizy, zawierające 2 - 8 M mocznik lub 3 - 6 M chlorowodorek guanidyny. Jednak, z założenia, przy zastosowaniu czynników denaturujących, otrzymuje się białko pozbawione swej natywnej struktury przestrzennej. Aby przywrócić aktywność biologiczną można próbować renaturować białko in vitro, ale wydajność renaturacji zależy od indywidualnych cech białka i może być bardzo niska. Z tego powodu ekstrakcję w warunkach 4/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 denaturujących stosuje się zwykle do pozyskiwania białek do takich celów, które nie wymagają zachowania struktury przestrzennej, np. przy izolacji antygenów używanych następnie do otrzymania przeciwciał, zaś unika się jej w przypadku, np. białek enzymatycznych. Z drugiej strony, formowanie ciał inkluzyjnych może nawet ułatwiać izolację, ponieważ zagregowane białko: a) występuje w wysokim stężeniu i łatwo można je oczyścić, b) jest chronione przed ewentualną proteolizą oraz c) występując w formie nieaktywnej, nawet jeśli jest potencjalnie toksyczne, nie hamuje wzrostu bakterii. Obecność białka we frakcji nierozpuszczalnej nie zawsze oznacza, że tworzone są ciała inkluzyjne. Hydrofobowe białka mogą wiązać się silnie z błonami bakteryjnymi, a białka obdarzone silnym ładunkiem elektrycznym – z kwasami nukleinowymi. Zwiększenie rozpuszczalności można wówczas osiągnąć przez dodanie do buforu lizującego detergentów niejonowych, np. Triton X-100 (w pierwszym przypadku) lub przez trawienie kwasów nukleinowych nukleazami, np. DNazą I i RNazą A (w drugim przypadku). INHIBITORY PROTEAZ W trakcie izolacji w warunkach natywnych, zarówno bufor, w którym prowadzona jest liza komórek bakteryjnych, jak i bufory używane na dalszych etapach oczyszczania, powinny być uzupełnione inhibitorem/ami proteaz, aby zminimalizować degradację izolowanego białka. W czasie izolacji, prowadzonej na ćwiczeniach, stosowany jest PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu). PMSF jest inhibitorem proteaz (zalecana nazwa peptydaz) serynowych (np. trypsyny, chymotrypsyny, trombiny) oraz proteaz cysteinowych (np. papainy). Jest także inhibitorem acetylocholinoesterazy i z tego względu uznany za substancję silnie toksyczną dla człowieka ! PMSF jest bardzo niestabilny w obecności wody (rozkłada się), dlatego należy go przechowywać w postaci bezwodnych roztworów (bezwodny etanol lub izopropanol [propanol-2]), w których, jeśli przetrzymywany w lodówce, zachowuje trwałość przez kilka miesięcy. PMSF należy więc dodawać do wodnych roztworów tuż przed ich użyciem – okres półrozpadu w temp. 25ºC i pH 8.0 wynosi bowiem tylko 35 min. W przypadku izolacji białek ze źródeł bogatszych w proteazy, np. komórek czy tkanek ssaczych stosuje się tzw. koktajle inhibitorów. Taki przykładowy koktajl może zawierać: AEBSF [fluorek 4-(2-aminoetylo)benzenosulfonylu będący inhibitorem proteaz serynowych, np. trypsyny, chymotrypsyny, trombiny, plasminy, kalikreiny z surowicy, związek pod względem budowy podobny do PMSF i stosowany jest zamiast niego ze względu na większą rozpuszczalność i stabilność w roztworach wodnych oraz niższą toksyczność], aprotyninę (58aminokwasowy peptyd, inhibitor proteaz serynowych, np. trypsyny, chymotrypsyny, plazminy, urokinazy, kalikreiny z surowicy), bestatynę (analog dipeptydu, inhibitor niektórych aminopeptydaz – aminopeptydazy leucynowej, aminopeptydazy B), pepstatynę A (analog heksapeptydu, inhibitor proteaz asparaginianowych, np. pepsyny, reniny, katepsyny D), leupeptynę (analog tetrapeptydu, inhibitor proteaz serynowych, np. plazminy i trypsyny, ale nie chymotrypsyny i trombiny, oraz inhibitorem proteaz cysteinowych, np. kalpainy, papainy, katepsyny B i L), E-64 (analog tripeptydu, inhibitor proteaz cysteinowych, np. kalpainy, papainy, katepsyny B i L) oraz EDTA-Na2 (sól dwusodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego, inhibitor metaloproteaz, np. karboksypeptydazy A). Koktajle inhibitorów stosuje się także przy izolacji białka z lizatów bakteryjnych, np. taki typowy dla tych celów koktajl zawiera: inhibitor proteaz serynowych – AEBSF lub PMSF, inhibitor proteaz cysteinowych – E-64, inhibitor proteaz asparaginianowych – pepstatynę A, inhibitor aminopeptydaz – bestatynę oraz inhibitor metaloproteinaz – EDTA-Na2. Także, w celu ochrony izolowanego białka przed proteazami, białka zwykle oczyszcza się w chłodni lub na lodzie (2 - 5ºC). W tej temperaturze większość białek zachowuje swoją natywną strukturę (są stabilizowane), co dotyczy także proteaz. Z reguły jednak aktywność enzymów (a więc i proteaz) jest w 4ºC ograniczona i dopiero w temp. 25 - 37ºC osiągają one swoją pełną aktywność. 5/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 CHROMATOGRAFIA Chromatografia to grupa technik rozdziału składników mieszaniny (np. białek) przy wykorzystaniu ich różnic w podziale między dwie nie mieszające się ze sobą fazy, ruchomą i stacjonarną albo różnic w ich wiązaniu się do odpowiednio dobranego złoża. Przykładem jest stosowana w tym ćwiczeniu chromatografia powinowactwa do immobilizowanego metalu (immobilized metal affinity chromatography - IMAC). Sekwencja aminokwasowa bogata w histydyny, w szczególności zawierająca sześć histydyn pod rząd, ma zdolność do silnego wiązania kationów metali kolorowych typu Ni2+, Co2+, Zn2+, Cu2+. Wykorzystując obecność w białku, naturalnie występującego lub dodanego metodami inżynierii genetycznej, rejonu bogatego w histydyny, można je wybiórczo związać ze złożem mającym unieruchomione tego typu kationy na swojej powierzchni. W ćwiczeniu wykorzystywana jest Ni-NTA agaroza (kompleks jonów Ni2+ z kwasem nitrylotrioctowym, związany kowalencyjnie z agarozą, Rys. 4). Rysunek 4. Budowa złoża Ni-NTA agarozowego (wg Qiagen). W celu zwiększenia wydajności wiązania, lizat zawierający czyszczone białko jest mieszany cały czas ze złożem. Po przepłukaniu złoża, w celu usunięcia białek związanych z nim niespecyficznie, białko z rejonem bogatym w histydyny można z niego uwolnić wysokim stężeniem imidazolu (100 - 250 mM), związku aromatycznego o budowie podobnej do histydyny (Rys. 5, pierścień imidazolu jest tą częścią struktury histydyny, która wiąże immobilizowany jon Ni2+). Imidazol konkuruje z białkiem o wiązanie do Ni-NTA, wypiera je ze złoża, dzięki swojemu wysokiemu stężeniu, pozostawiając na złożu jony Ni2+ w kompleksie z imidazolem (imidazol jest także obecny w preparacie uwolnionego białka, z którego można się go pozbyć, np. przez dializę). Obecność imidazolu w niskim stężeniu (10 mM) w buforze lizującym, ma przeciwdziałać ewentualnemu wiązaniu się ze złożem endogennych białek, np. naturalnie zawierających w swej cząsteczce liczne reszty histydyny. W celu usunięcia ze złoża białek słabo z nim związanych (nie posiadających sześciu reszt histydyn pod rząd), do jego płukania stosuje się pośrednie stężenia imidazolu (20 - 50 mM). Do związania białka zawierającego ciąg reszt histydynowych ze złożem typu Ni-NTA agaroza, dojdzie także w sytuacji, kiedy białko to nie będzie miało swojej natywnej struktury przestrzennej. Umożliwia to czyszczenie na tym złożu białek otrzymanych z bakterii w warunkach denaturujących. Co 6/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 więcej, w interakcji tej nie przeszkadza wysokie stężenie chlorowodorku guanidyny czy mocznika używane przy uwalnianiu białka w tych warunkach z komórki bakteryjnej. W efekcie białka te można oczyszczać na złożu bezpośrednio po otrzymaniu lizatu, tzn. bez uprzedniego usunięcia czynnika denaturującego i ich renaturacji. Samą renaturację białka można wykonać już na jego oczyszczonym preparacie, poprzez kontrolowane usunięcie czynnika denaturującego, np. poprzez dializę. Rysunek 5. Wzory strukturalne (A) histydyny i (B) imidazolu. AKTYWNOŚĆ ENZYMATYCZNA Próbki z poszczególnych etapów izolacji można poddać kontroli na obecność oczyszczanego białka, sprawdzając w nich aktywność enzymatyczną β-galaktozydazy. Aktywność ta może być także miernikiem prawidłowości fałdowania białka i/lub braku kompletnej degradacji lub denaturacji białka. β-galaktozydaza, oprócz hydrolizy wiązania glikozydowego w swoim naturalnym substracie – disacharydzie laktozie (4-O-β-D-galaktopiranozylo-D-glukopiranozie, Rys. 6), hydrolizuje także syntetyczne chromogenne substraty: (a) bezbarwny 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozyd (X-Gal), dając 5-bromo-4-chloro-3-hydroksyindol i galaktozę (Rys. 7), z których ten pierwszy, ulega dalej przekształceniom w niebieski barwnik będący pochodną indygo oraz (b) bezbarwny o-nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd (ONPG), uwalniając żółty o-nitrofenol i galaktozę (Rys. 8). X-Gal na ogół używany jest przy badaniach aktywności β-galaktozydazy in vivo (np. niebieskie kolonie bakteryjne rosnące na pożywce stałej), zaś ONPG przy badaniach in vitro i ten substrat będzie używany w tym ćwiczeniu. Reakcja będzie zatrzymywana poprzez dodanie węglanu sodu, który ze względu na swoje alkaliczne pH, pogłębi żółty kolor produktu (to anion barwnika wykazuje jaskrawożółte zabarwienie – zjawisko wykorzystywane także przy wskaźnikach pH). 7/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 Rysunek 6. Wzór strukturalny laktozy (4-O-β-D-galaktopiranozylo-D-glukopiranozy). Rysunek 7. Wzór strukturalny 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozydu (X-Gal) i powstających z niego produktów w reakcji katalizowanej przez β-galaktozydazę. 8/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 Rysunek 8. Wzór strukturalny o-nitrofenylo-β-D-galaktopiranozydu (ONPG) ) i powstających z niego produktów w reakcji katalizowanej przez β-galaktozydazę. W trakcie ćwiczenia w oparciu o te reakcję będzie jedynie stwierdzana aktywność β-galaktozydazy w próbkach, poprzez porównanie ich koloru po reakcji, między sobą i z kontrolą negatywną – lizatem z bakterii, w których enzym ten w ogóle nie jest produkowany. Jest to przykład klasycznej kolorymetrii, polegającej na wizualnym porównaniu lub ocenie intensywności barwy roztworu. Zastosowana metoda badania aktywności enzymatycznej β-galaktozydazy może mieć także zastosowanie do wyznaczania pewnych parametrów tego enzymu, np. stałej Michaelisa-Menten (KM) i szybkości maksymalnej (Vmax). W takim przypadku jednak, reakcja powinna być prowadzona przy określonej temperaturze, np. 37C, zaś powstały produkt - o-nitrofenol, oznaczany ilościowo, np. spektrofotometrycznie przy długości fali świetlnej 420 nm (A420nm), przy której związek ten wykazuje największą absorbancję. ELEKTROFOREZA Stopień oczyszczenia i ewentualna degradacja β-galaktozydazy będą kontrolowane poprzez analizę próbek z poszczególnych etapów izolacji, poddanych elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis – SDS-PAGE) według modyfikacji Laemmli’ego. Elektroforeza to ruch cząstek obdarzonych ładunkiem (jonów) w roztworze (tutaj wodnym) pod wpływem przyłożonego prądu, w tym przypadku, stałego. Białka w roztworze wodnym, w pH różnym od ich punktu izoelektrycznego (pI), są cząsteczkami wykazującymi ładunek wypadkowy różny od zera, czyli są jonami o przewadze któregoś z ładunków (w pH powyżej pI są anionami, w pH poniżej pI są kationami). Na kierunek migracji ma wpływ znak jonu, zaś na tempo migracji, wielkość ładunku oraz wielkość i kształt cząstki. Jeśli pominiemy efekt kształtu cząstki (np. wszystkie one będą liniowymi 9/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 anionami), zaś stosunek wielkości ładunku do wielkości cząstek, dla nich wszystkich będzie stały, to tempo migracji będzie zależeć jedynie od wielkości cząstek. W celu rozdzielenia między sobą dość podobnych cząstek, np. białek lub kwasów nukleinowych, uwypukla się różnice w ich wielkości i/lub kształcie poprzez zastosowanie na ich drodze usieciowania - żelu, utrudniającego migrację. Do rozdziału białek najczęściej stosuje się żel poliakrylamidowy otrzymywany w reakcji polimeryzacji monomerów akrylamidu i N,N’-metylenobisakrylamidu (Rys. 9, ten ostatni jako czynnik sieciujący), zmieszanych w proporcji ok. 37.5 : 1. Katalizatorem w tej reakcji jest N,N,N’,N’tetrametyloetylenodiamina (TEMED), inicjatorem nadsiarczan amonu – (NH4)2S2O8, który ulega rozbiciu na dwa stabilne wolne rodniki, atakujące podwójne wiązanie w cząsteczce akrylamidu; reakcja jest hamowana tlenem z powietrza, którego dostęp do polimeryzującego żelu, odcina się warstwą wody. Rysunek 9. Wzory strukturalne (A) akrylamidu i (B) N,N’-metylenobisakrylamidu. Żel przygotowuje się między dwiema szybkami szklanymi i standardowo składa się on z dwóch części, przygotowanych kolejno po sobie. Wpierw przeprowadza się polimeryzację głównej części - żelu "rozdzielającego", o stężeniu 8 - 20% (do rozdziału większych białek stosuje się niskoprocentowe żele, do rozdziału mniejszych białek, wysokoprocentowe żele; stężenie procentowe liczone jest w stosunku do monomeru akrylamidu). Po jego polimeryzacji, nad nim przeprowadza się polimeryzację mniejszej części - żelu "zagęszczającego", o stężeniu 4%, w którym znajdować się będą kieszonki na próbki. W przeciwieństwie do typowej elektroforezy DNA i niektórych typów elektroforezy białek, w których stosuje się bufor o tym samym składzie przy elektrodach i w żelu (tzw. ciągły system), w elektroforezie białek według modyfikacji Laemmli’ego, stosowany jest tzw. nieciągły system, polegający na użyciu buforów różniących się rodzajem jonów, siłą jonową i pH (Tab. 1). Celem użycia nieciągłego systemu jest zwiększenie pojemności żelu (objętości próbki rozcieńczonego białka, którą można nanieść do kieszonki) i jego rozdzielczości, w stosunku do żelu w ciągłym systemie. 10/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 Tabela 1. Skład i pH buforów używanych w SDS-PAGE wg Laemmli’ego. Typ buforu Bufor do elektroforezy (przy elektrodach) Bufor do przygotowania żelu zagęszczającego Bufor do przygotowania żelu rozdzielającego Bufor do nanoszenia próbek białek pH Stężenie SDS 0.0250 M Tris 0.192 M glicyna ~8.3 0.1% 0.1250 M Tris HCl 6.8 0.1% 0.3750 M Tris HCl 8.8 0.1% 0.0625 M Tris HCl 6.8 2% Kation Anion Białka, które mają być poddane rozdziałowi elektroforetycznemu, przed naniesieniem na żel są ogrzewane przez 3 - 5 minut w 100C, w obecności czynnika redukującego - β-merkaptoetanolu lub ditiotreitolu (DTT) (obydwa w stężeniu 0.1 mM) oraz SDS (2%). W takich warunkach białka na ogół ulegają całkowitej denaturacji – zredukowane zostają międzyłańcuchowe i wewnątrzłańcuchowe wiązania dwusiarczkowe, a uwolnione łańcuchy ulegają kompletnemu rozwinięciu. SDS (Rys. 10), będący mocnym anionowym detergentem, dysocjuje w wodzie na kation sodowy i amfipatyczny anion dodecylosiarczanowy, który łączy się z łańcuchami polipeptydowymi w określonej proporcji wagowej (1.4 g SDS na 1 g białka), nadając wszystkim białkom mocny ładunek ujemny (swoją częścią siarczanową), niezależnie od ich własnego pierwotnego ładunku wypadkowego. W tej postaci wszystkie białka mają ten sam kształt (są liniowymi cząsteczkami) i migrują do dodatniej anody, przy czym białka najmniejsze migrują najszybciej, zaś białka największe najwolniej (tylko wielkość białka ma znaczenie – różnice w kształcie i ładunku białek zostały zniwelowane). SDS obecny we wszystkich buforach ma za zadanie utrzymać białka podczas całej elektroforezy w stanie zdenaturowanym, jako aniony. Rysunek 10. Wzór strukturalny dodecylosiarczanu sodu (SDS). 11/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 Oprócz wymienionych składników, bufor do nanoszenia próbek, zawiera jeszcze 10% glicerol, służący do obciążenia próbki tak, aby opadła na dno kieszonki przy nanoszeniu na żel oraz barwnik błękit bromofenolowy (0.01%), będącym małym anionem, migrującym szybciej niż najmniejsze białka i umożliwiającym śledzenie postępów elektroforezy (dopóki barwnik jest w żelu, wszystkie białka znajdują się w żelu między barwnikiem a kieszonką, do której zostały one naniesione przed rozpoczęciem elektroforezy). Oczywiście, denaturacja białek enzymatycznych oznacza utratę ich aktywności (w większości przypadków nieodwracalną, choć zdarzają się wyjątki, np. RNaza może po renaturacji odzyskać swoją aktywność). Natomiast, denaturacja białek nie zawsze oznacza, że przestają być one rozpoznawane przez przeciwciała. Jeśli przeciwciała rozpoznają epitop liniowy, będący ciągłą sekwencją kilku lub kilkunastu reszt aminokwasowych, to w zdenaturowanym białku, jest on obecny, w przeciwieństwie do epitopu przestrzennego, zbudowanego z nieciągłej sekwencji aminokwasów, ułożonych w przestrzeni w sposób określony przez natywną konformację białka. Dysponując zatem odpowiednimi przeciwciałami można identyfikować białka rozdzielone elektroforetycznie w warunkach denaturujących (patrz rozdział "Immunoidentyfikacja"). W celu otrzymania jak najlepszego rozdziału białek, oprócz dobrania odpowiedniego usieciowania czyli stężenia akrylamidu, należy doprowadzić do sytuacji, w której wszystkie białka w momencie rozpoczęcia rozdziału będą zagęszczone w jednym miejscu - na początku żelu (wszystkie białka rozproszone w całej naniesionej objętości do kieszonki, rozpoczną właściwą migrację w tym samym czasie z tego samego punktu). W przypadku żeli w systemie ciągłym (z jednym buforem), po nałożeniu próbki do kieszonki i podłączeniu prądu, białka migrują bardzo szybko przez roztwór w kieszonce i zwalniają na granicy z żelem. W efekcie, ulegają tam koncentracji. Ten sposób zagęszczenia nie sprawdza się jednak najlepiej przy rozdziale populacji białek o zróżnicowanej wielkości – dla małych białek różnica w tempie migracji w wolnym roztworze i w żelu nie jest tak znaczna jak dla białek dużych, co powoduje, że nie są one tak efektywnie zagęszczone jak te duże. W celu rozwiązania tego problemu wprowadzono elektroforezę w systemie nieciągłym (z różnymi buforami). W systemie nieciągłym wg Laemmli’ego, białka ulegają koncentracji w żelu o bardzo rzadkim usieciowaniu (dużych porach), nazywanym żelem zagęszczającym. Jest to osiągane dzięki obecności w buforach glicyny i anionu chlorkowego, które różnią się tempem migracji. Ruchliwość elektroforetyczna glicyny zależy od pH zastosowanego buforu. Glicyna posiada pI 6.7 i w pH 6.8 (patrz Tab. 1) w przeważającej części jest ona uprotonowana na grupie aminowej (NH3CH2COO), przez co staje się neutralna elektrycznie i tempo jej migracji jest wolne. W pH 8.3 i tym bardziej w pH 8.8 (patrz Tab. 1) występuje ona w postaci szybko migrującego anionu glicynianowego (NH2CH2COO). Takim zmianom w tym przedziale pH nie podlega drugi z anionów – chlorkowy, który jest najszybciej migrującym anionem w trakcie elektroforezy. Tempo migracji białek (wszystkie dzięki SDS są anionami) jest pośrednie. W żelu zagęszczajacym o pH 6.8, najszybciej migrujący anion chlorkowy pozostawia za sobą strefę o niskiej przewodności, wysokim gradiencie napięcia i wysokim pH. W tej strefie wzrasta jonizacja glicyny i w efekcie szybkość jej migracji (sama glicyna przy tym pH żelu migrowałyby znacznie wolniej). Kiedy przesuwające się pasmo, prowadzącego anionu chlorkowego i ciągniętej za nim glicyny, napotka anion białka, jest on wyprzedzany przez prowadzący anion chlorkowy, ale pozostaje przed glicyną. W efekcie, białka są zagęszczane w postaci cieniutkich warstw (w kolejności od ich największej do najmniejszej ruchliwości) między jonami chlorkowymi a glicyną. Białka pozostają w tych cienkich warstwach (nie rozdzielone), ponieważ żel jest nisko (rzadko) usieciowany. Właściwy cel elektroforezy czyli rozdzielanie białek, może się rozpocząć, kiedy nastąpi odwrócenie tempa migracji glicyny i białek, co możliwe jest poprzez: (a) wzrost pH, tak że glicyna występować będzie w postaci anionu glicynianowego, migrującego szybciej niż aniony białka lub (b) wzrost usieciowania żelu, powodujący zwolnienie migracji anionów białkowych, tak że migrują one wolniej od glicyny. W efekcie, białka przestają być "upychane" przez glicynę i mogą zacząć się 12/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 rozdzielać. W systemie nieciągłym wg Laemmli’ego, stosowane są oba te czynniki razem, w postaci żelu rozdzielającego o pH 8.8 i wysokim stopniu usieciowania. Po rozdziale, białka uwięzione w żelu, wizualizowane (uwidocznione) będą poprzez tworzenie przez nie dość trwałego ciemnoniebieskiego kompleksu ze swobodnie penetrującym żel barwnikiem, błękitem brylantowym Coomassie R-250 (CBB R-250, Rys. 11), a następnie, odpłukanie z żelu nadmiaru (nie związanego z białkami) barwnika. Kwas octowy obecny w roztworach do barwienia ma za zadanie utrwalić położenie białka w żelu (przeciwdziałać rozdyfundowaniu białka w trakcie barwienia, poprzez jego wytrącenie) oraz zapewnić kwaśne środowisko potrzebne do wytworzenia kompleksów barwnika z białkiem, zaś metanol lub czasami stosowany izopropanol, oprócz wytrącania białka, potrzebny jest do rozpuszczenia barwnika. Mieszanie oraz podgrzewanie roztworów ma na celu skrócenie czasu całej procedury, poprzez przyspieszenie dyfuzji cząsteczek barwnika. Przy prawidłowym wykonaniu procedury barwienia i odbarwiania, barwnikiem CBB R-250 można wykryć już mniej niż 50 ng białka w postaci prążka. Znacznie czulszymi metodami barwienia białek są: metoda barwienia srebrem oraz metody stosujące barwniki fluorescencyjne (fluorochromy), np. SYPRO Orange (patrz Tab. 2). SYPRO Orange wiąże się do białek opłaszczonych SDS. Barwienie białek tą metodą przypomina barwienie DNA w żelach za pomocą bromku etydyny. Żel po elektroforezie mieszany jest w roztworze kwasu octowego zawierającym SYPRO orange przez kilkadziesiąt minut, a następnie, kompleksy białka z barwnikiem wizualizowane są przy pomocy transiluminatora UV, o długości fali świetlnej 302 nm. W celu otrzymania maksymalnej czułości, pomarańczowe kompleksy białka z SYPRO orange powinny być fotografowane (oko ludzkie pod tym względem jest mniej czułe niż błona fotograficzna lub kamera CCD). Metoda barwienia srebrowego jest najczulszą metodą barwienia białek i kwasów nukleinowych w żelach poliakrylamidowych. Polega na nasączeniu żelu jonami srebra Ag + a następnie użyciu substancji redukującej jony srebrowe do metalicznego srebra, które jest nierozpuszczalne i widoczne. Makrocząsteczki obecne w żelu ułatwiają redukcję Ag+ do Ag0, a początkowe zredukowane atomy srebra rozpoczynają dalszy autokatalityczny proces redukcji dający w efekcie znaczną ilość zredukowanego srebra, co decyduje o wysokiej czułości metody. Barwienie srebrowe składa się z kilku etapów: utrwalania, uczulania, nasączania jonami srebra, wywołania i zatrzymania wywoływania. W etapie utrwalania żel jest traktowany kwasem (octowym, trójchlorooctowym), co zapobiega dyfuzji białek z żelu w czasie dalszej preparatyki. Roztwory użyte w czasie uczulania zawierają tiosiarczan sodu NaS2O3, który ma podwójne działanie – stanowi źródło anionu siarczkowego S2-, który reagując ze srebrem przyspiesza wywołanie ale także jon tiosiarczanowy tworzy kompleks z Ag + zapobiegając redukcji do metalicznego srebra i tym samym obniżając nieswoiste tło reakcji. W tym etapie są też używane substancje modyfikujące chemicznie białka i czyniące je bardziej podatnymi na reakcję ze jonami srebrowymi (np glutaraldehyd dostaczający grup aldehydowych). W przypadku barwienia srebrowego dostosowanego do analizy białek metodą spektrometrii mas nie używa się substancji modyfikujących białka. Nasączanie jonami srebra polega na inkubacji żelu w roztworze AgNO 3. Wywołanie wymaga dodania czynnika redukującego (formaldehyd) i zmiany środowiska na silnie zasadowe (Na2CO3 podnosi pH do około 12), co ułatwia autokatalityczną redukcję. Zatrzymanie wywołania polega na zakwaszeniu roztworu. Barwienie srebrowe jest metodą czułą, ale nie ilościową, ponieważ różne białka wiążą jony srebra z różną wydajnością. 13/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 Rysunek 11. Wzór strukturalny błękitu brylantowego Coomassie R-250 (CBB R-250). W systemie Laemmli’ego, droga migracji białka (pojedynczego łańcucha polipeptydowego) w żelu rozdzielającym jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego z jego masy cząsteczkowej (małe białka migrują najdalej). W żelu o prawidłowo dobranym usieciowaniu ta zależność jest prostoliniowa. Używając mieszaniny białek o znanych masach cząsteczkowych, tzw. wzorców masy cząsteczkowej, można, w oparciu o ich drogi migracji w żelu, wykreślić krzywą wzorcową (krzywą kalibracyjną dla danego żelu) i na jej podstawie, wyznaczyć masę badanego białka (pojedynczego łańcucha polipeptydowego), o migracji mieszczącej się w jej prostoliniowym odcinku (Rys. 12). Rysunek 12. Wyznaczanie masy cząsteczkowej białka w oparciu o krzywą kalibracyjną żelu SDS-PAGE wg Laemmli’ego. 14/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 W przypadku, między innymi, niektórych białek z dołączoną resztą fosforanową (fosfoprotein), białek z dołączonymi resztami cukrowymi (glikoprotein) lub białek o wyjątkowo stabilnej strukturze przestrzennej (trudnej do denaturacji, np. kolageny lub histony), masa cząsteczkowa wyliczona na podstawie ich migracji w żelu, może być niepoprawna, np. pepsyna z żołądka świni, będąca fosfoproteiną, używana niekiedy jako wzorzec masy, mimo posiadania teoretycznej masy cząsteczkowej 34.7 kDa, wyliczonej na podstawie jej sekwencji aminokwasowej, w trakcie SDS-PAGE wg Laemmli’ego migruje jak białko o masie ok. 45 kDa (w innych układach buforów pepsyna może jednak migrować zgodnie ze swoją masą). Obecność w ścieżce pojedynczego, "tłustego" prążka, na wysokości odpowiadającej masie cząsteczkowej ok. 121 kDa, świadczy o otrzymaniu czystego i nie zdegradowanego preparatu naszego białka. Obecność dodatkowych prążków świadczy o zanieczyszczeniu preparatu, przy czym prążki o mniejszej masie, mogą być nie tylko innymi białkami, lecz także produktami degradacji oczyszczanego białka. IMMUNOIDENTYFIKACJA W celu stwierdzenia w mieszaninie białek obecności izolowanego białka (np. w lizacie bakteryjnym) lub potwierdzenia tożsamości otrzymanego białka można wykorzystać fakt, że jest ono rozpoznawane przez przeciwciała, skierowane przeciwko sekwencji własnej tego białka lub dodanemu do niego epitopowi. Ta właściwość leży u podstaw techniki nazywanej immunoblottingiem lub westernblottingiem. Rozdzielone elektroforetycznie białka (nie barwione trwale, gdyż barwnik mógłby przeszkadzać w rozpoznaniu białka przez przeciwciała, ani też nie wytrącone w nim) przenosi się z żelu, w którym są one niedostępne dla przeciwciał, na jedną ze stron membrany, mającej zdolność niespecyficznego wiązania białka, np. w procesie elektrotransferu, będącego odmianą elektroforezy. W celu sprawdzenia prawidłowości transferu, białka na membranie można wizualizować poprzez tworzenie ich nietrwałych kompleksów z ciemnoróżowym barwnikiem Ponceau S, który później można całkowicie odpłukać wodą. Istnieje modyfikacja procedury immunoblottingu, tzw. dot-blotting, który polega na nanoszeniu (nakraplaniu) preparatów białek bezpośrednio na membranę (związanie białka z membraną nie wymaga przepływu prądu). W celu przeciwdziałania niespecyficznemu wiązaniu się przeciwciał z membraną (same przeciwciała też są białkami), wolne miejsca wiązania (nie zajęte przez białka przeniesione z żelu), po obu stronach membrany blokuje się poprzez inkubację membrany z nie rozpoznawanym przez przeciwciała białkiem, np. albuminą z surowicy cielęcej, kazeiną z mleka krowiego lub żelatyną. Po inkubacji membrany z przeciwciałami i odpłukaniu nie związanych przeciwciał, na membranie powinny pozostać przeciwciała jedynie w kompleksie z rozpoznawanym białkiem. Kompleks ten jest nie widoczny (bezbarwny) i w celu jego wizualizacji należy użyć kolejnych przeciwciał, rozpoznających już użyte przeciwciała i sprzężonych ze znacznikiem (np. barwnikiem) lub enzymem, katalizującym reakcję, w wyniku której taki znacznik powstanie. W kolejności użycia wiązania, przeciwciała nazywane są zatem, odpowiednio, pierwszorzędowymi i drugorzędowymi lub pierwotnymi i wtórnymi. Optymalizacja procedury w celu jednoczesnego otrzymania maksymalnej czułości i minimalnego tła (niespecyficznego wiązania się), polega na eksperymentalnym dobraniu odpowiednich rozcieńczeń obu typów przeciwciał. Po inkubacji membrany z drugorzędowymi przeciwciałami i odpłukaniu niezwiązanej ich części, znacznik z nimi sprzężony, pośrednio wskaże położenie na membranie badanego białka. W przypadku, kiedy przeciwciała sprzężone są z enzymem, należy przeprowadzić dodatkowo reakcję, podając na stronę membrany na którą przeniesiono białka, roztwór zawierający bezbarwny i rozpuszczalny substrat, który będzie przekształcony w nierozpuszczalny produkt (wytrąci się w miejscu reakcji), 15/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 wykazujący własne zabarwienie lub zdolność do chemiluminescencji i stąd do zaczernienia błony fotograficznej (tak jak fotony ze światła widzialnego). Typowymi enzymami używanymi w tej procedurze są alkaliczna fosfataza z jelita cielęcia (AP) i peroksydaza z chrzanu (HRP). Alkaliczna fosfataza katalizuje rozpad 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (BCIP) na 5-bromo4-chloro-3-hydroksyindol i fosforan (Rys. 13). Ten pierwszy ulega dalej tautomeryzacji i w obecności błękitu nitrotetrazolowego (NBT), odwodornieniu i dimeryzacji (te przemiany nie wymagają już aktywności enzymatycznej). W efekcie powstaje niebieski barwnik - pochodna indygo i purpurowy – pochodna formazanu, będąca produktem redukcji NBT. Reakcje przerywa się poprzez odpłukanie substratów. Czułość tej metody pozwala wykryć 100 pg białka w postaci prążka. Rysunek 13. Wzory strukturalne 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (BCIP) i powstającego z niego 5-bromo-4-chloro-3-hydroksyindolu w reakcji katalizowanej przez alkaliczna fosfatazę. Peroksydaza katalizuje utlenianie luminolu (3-aminoftalohydrazydu) w obecności nadtlenku wodoru do 3-aminoftalanu (Rys. 14), czemu towarzyszy emisja światła o długości fali 425 nm. W celu zwiększenia intensywności światła oraz czasu jego emisji, stosuje się substancje wzmacniające z grupy fenoli [tzw. wzmocniona chemiluminescencja, enhanced chemiluminescence – ECL, np. kwas p-kumarowy (kwas 3-(4-hydroksyfenylo)-2-propenowy), Rys. 15]. Zaletą tej reakcji jest znacznie większa czułość niż tej katalizowanej przez alkaliczna fosfatazę (patrz Tab. 2) oraz możliwość kilkakrotnej rejestracji w trakcie emisji światła (trwania reakcji), w celu dobrania optymalnego obrazu. Możliwe jest też użycie substratów dla peroksydazy, które dają barwny produkt, np. 3,3’-diaminobenzydyny (DAB, Rys. 16), jednak kosztem czułości (patrz Tab. 2). Rysunek 14. Wzory strukturalne luminolu (3-aminoftalohydrazydu) i powstającego z niego 3-aminoftalanu w reakcji katalizowanej przez peroksydazę. 16/17 Zakład Biologii Molekularnej UW BIOLOGIA MOLEKULARNA wersja 5.0 Rysunek 15. Wzór strukturalny kwasu p-kumarowego [kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)-2-propenowego]. Rysunek 16. Wzór strukturalny 3,3’-diaminobenzydyny (DAB). Tabela 2. Porównanie czułości różnych metod detekcji białek. Przybliżona czułość Uwagi (ilość białka w prążku) 50 ng niespecyficzna Metoda detekcji białka Błękit brylantowy Coomassie R-250 Ponceau S 250 ng niespecyficzna Srebro 1 ng niespecyficzna Fluorochrom SYPRO Orange 5 ng niespecyficzna Przeciwciała z AP z substratem BCIP/NBT 100 pg specyficzna Przeciwciała z HRP z substratem DAB 50 pg specyficzna Przeciwciała z HRP z substratem luminolem (ECL) 1 pg specyficzna 17/17
