Autoreferat_Micha³ Usarek - Wydział Biologii UW
advertisement
Michał Usarek „Działanie insuliny i proinsulinowego peptydu C na metabolizm glukozy w kulturach pierwotnych kanalików nerkowych oraz komórkach Hepa 1-6” Autoreferat rozprawy doktorskiej wykonanej w Zakładzie Regulacji Metabolizmu Instytutu Biochemii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski Promotor: Profesor dr hab. Jadwiga Bryła Recenzenci: Profesor dr hab. Krystyna Skwarło-Sońta Profesor dr hab. Andrzej DŜugaj Proinsulinowy peptyd C, wydzielany w równomolowych ilościach z insuliną przez komórki B trzustki, od chwili odkrycia w 1967 r. był uwaŜany za cząsteczkę pozbawioną funkcji biologicznych z wyjątkiem umoŜliwienia tworzenia wiązań disiarczkowych pomiędzy łańcuchami A i B w procesie syntezy aktywnej cząsteczki insuliny. Badania ostatnich dwóch dekad wykazały, Ŝe proinsulinowy peptyd C pełni istotną rolę w regulacji procesów fizjologicznych, a skutki jego niedoboru są szczególnie dobrze widoczne w czasie rozwoju cukrzycy typu 1, charakteryzującej się uszkodzeniem wysp Langerhansa w trzustce, co powoduje upośledzenie wydzielania insuliny i peptydu C. Wykazano równieŜ, Ŝe peptyd C podawany wraz z insuliną pacjentom z cukrzycą typu 1 powoduje wzrost o 66% ilości glukozy wykorzystywanej przez organizm, prawdopodobnie na skutek zwiększenia biodostępności insuliny na skutek degradacji form oligomerycznych tego hormonu. Ze względu na to, Ŝe wątroba i nerki są głównymi organami odpowiadającymi za utrzymanie homeostazy glukozy we krwi, na skutek jej syntezy z niecukrowych metabolitów oraz moŜliwości magazynowania tego cukru w postaci glikogenu w wątrobie, a dotychczas nie było doniesień dotyczących działania peptydu C na metabolizm glukozy w tych organach, celem niniejszej pracy było: 1) Zbadanie wpływu peptydu C na szybkość syntezy glukozy i mleczanu w kanalikach kory nerki królika, rosnących w hodowli pierwotnej w warunkach glukoneogennych bez lub/i w obecności insuliny, 2) Wyznaczenie etapów szlaków glukoneogenezy i glikolizy kontrolowanych przez insulinę i peptyd C (dodanych oddzielnie lub łącznie) oraz wyjaśnienie mechanizmu działania tych peptydów na metabolizm glukozy w kanalikach nerkowych oraz 3) Określenie wpływu insuliny i peptydu C (dodanych oddzielnie lub łącznie) na szybkość wytwarzania glikogenu i mleczanu w komórkach Hepa 1-6 oraz wyjaśnienie mechanizmu działania tych peptydów na te procesy. Przeprowadzone doświadczenia wykazały, Ŝe: 1) W przeciwieństwie do insuliny, która w stęŜeniu 100 nM hamuje syntezę glukozy w kanalikach nerkowych oraz stymuluje syntezę mleczanu o około 20%, peptyd C nie wpływa na szybkość tych procesów. Wzmacnia jednak hamujące działanie insuliny na glukoneogenezę do około 40%. Efekt ten nie jest wynikiem zwiększenia biodostępności insuliny, poniewaŜ hormon ten występuje we wszystkich badanych warunkach doświadczalnych w formie monomerycznej; 2) Na podstawie pomiarów zawartości wewnątrzkomórkowych metabolitów procesu glukoneogenezy bez i w obecności badanych peptydów moŜna wnioskować, Ŝe insulina w obecności peptydu C szczególnie znacząco hamuje syntezę glukozy na skutek zmniejszenia aktywności izomerazy glukozo-6-fosforanowej (PGI) i/lub glukozo-6-fosfatazy (G6P-azy); 3) Inhibicja aktywności PGI moŜe być wynikiem zwiększenia wewnątrzkomórkowej zawartości fruktozo-1-fosforanu i fruktozo-1,6-bisfosforanu, inhibitorów tego enzymu oraz zmniejszenia w obecności peptydu C stopnia fosforylacji PGI (określonego na podstawie pomiarów zawartości PGI we frakcji ufosforylowanych białek homogenatu komórek kanalików nerkowych), charakteryzującego się po fosforylacji zwiększoną aktywnością enzymatyczną; 4) Hamowanie aktywności G6P-azy w obecności insuliny i peptydu C jest prawdopodobnie wynikiem ograniczenia szybkości transportu glukozo-6-fosforanu (G6P) przez transporter G6PT z cytoplazmy do światła siateczki śródplazmatycznej, gdzie lokalizuje się centrum aktywne enzymu; 5) W komórkach linii Hepa 1-6 rosnących w warunkach normoglikemii (5,5 mM glukoza) lub hiperglikemii (25 mM glukoza), insulina zwiększa syntezę glikogenu około 2-krotnie, podczas gdy peptyd C stymuluje szybkość tego procesu o około 30% oraz wzmaga działanie insuliny jedynie w komórkach rosnących w warunkach hiperglikemii; 6) Stymulujące działanie peptydu C na syntezę glikogenu w komórkach Hepa 1-6 moŜe być wynikiem: a) zwiększenia o około 30% aktywności glukokinazy (GK), prawdopodobnie na skutek zmniejszenia zawartości wewnątrzkomórkowego fruktozo-6-fosforanu (F6P), wpływającego na uwolnienie enzymu z kompleksu białko regulatorowe (GKRP) - GK oraz b) obniŜenia wewnątrzkomórkowej zawartości G6P, inhibitora heksokinazy, przyczyniając się do zwiększonego wytwarzania G6P, wykorzystywanego następnie do produkcji G1P i w konsekwencji stymulacji syntezy glikogenu. Reasumując, wyniki przedstawione w niniejszej pracy wykazały po raz pierwszy, Ŝe zarówno w hodowlach pierwotnych komórek kanalików kory nerek rosnących w warunkach glukoneogennych, jak i w komórkach linii Hepa 1-6 rosnących w warunkach hiperglikemii proinsulinowy peptyd C wzmaga działanie insuliny odpowiednio na procesy glukoneogenezy i syntezy glikogenu. W obecności insuliny i peptydu C PGI obok G6P-azy jest enzymem regulatorowym glukoneogenezy w kanalikach nerkowych, wskazując na złoŜoność mechanizmu kontrolującego szybkość tej drogi metabolicznej. Wyniki dotyczące działania insuliny i peptydu C w komórkach kanalików kory nerek są przedmiotem publikacji (Biochem Cell Biol 91, 2013, dx.doi.org/10.1139/bcb-2013-0074).
