Gleba jako źródło mikroorganizmów o znaczeniu biotechnologicznym

Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2016/17
Udział drobnoustrojów glebowych w obiegu węgla, azotu i siarki w przyrodzie
Drobnoustroje prowadzące fotosyntezę
W glebie występuje co najmniej 13 tysięcy gatunków bakterii, jednak większość z nich
jest nie opisana (klucz Bergey’a podaje około 2000 gatunków bakterii ogółem). Bakterie
glebowe mogą mieć charakter autotrofów lub heterotrofów. Bakterie autotroficzne
wykorzystujące energię słoneczną (fotoautotrofy) występują w glebach rzadko; częściej spotka
się je w wodach powierzchniowych czy też na wyrobiskach górnictwa węgla, gdzie spełniają
bardzo ważną rolę rekultywacyjną, a także na terenach wysokogórskich – biorą tam udział w
przyspieszaniu wietrzenia skał (charakter organizmów pionierskich). Do tej grupy zalicza się
głównie bakterie z rodzin: Athiorhodaceae (syn. Rhodospirillaceae) (bezsiarkowe bakterie
purpurowe), Thiorhodaceae (syn. Chromatiaceae) (siarkowe bakterie purpurowe) oraz zielone
bakterie siarkowe (rodziny: Chlorobiaceae i Chloroflexaceae). Komórki bakterii purpurowych
mają różne odcienie koloru czerwonego – od głębokiej czerwoni do oranżowego – pochodzące
od pigmentów karotenoidowych maskujących obecność bakteriochlorofili. Bakterie zielone
mogą mieć kolory od jasnozielonego, aż po ciemnobrązowe – jeśli obok chlorofili (gł. c i d oraz
bakteriochlorofil e) występują w ich komórkach także karotenoidy (gł. chlorobakten).
Zarówno bakterie purpurowe, jak i zielone są uważane za jedne z najstarszych organizmów,
jakie pojawiły się w toku ewolucji Ziemi. W przeciwieństwie do roślin zielonych bakterie te
nie są zdolne do wykorzystywania wody jako donora wodoru, stąd proces fotosyntezy
prowadzony przy ich udziale nazywamy fotosyntezą anoksygenową (w jej wyniku nie jest
uwalniany tlen – donorami wodoru są bowiem zredukowane związki siarki – siarkowodór,
siarka, tiosiarczany – a także czysty wodór lub związki organiczne gł. kwasy organiczne).
Bakterie fotosyntetyzujące występują zazwyczaj w głębszych warstwach wód słonych lub
słodkich powodując często zakwity, w osadach dennych, a w glebach ich występowanie jest
ograniczone do miejsc o wyjątkowo nasilonych procesach gnilnych. Większość z nich jest
także zdolna do wiązania azotu atmosferycznego. Zasiedlanie tych specyficznych nisz
ekologicznych, tj. środowisk o słabszym naświetleniu oraz obecności dużych ilości wodoru i
zredukowanych związków siarki, wynika z ich specyficznych cech biochemicznych:
odmienna, w porównaniu z roślinami i sinicami, budowa chlorofilu i aparatu
fotosyntetyzującego oraz zależność od obecności w środowisku specyficznych donorów
elektronów (wodór, zredukowane związki siarki). Bakterie purpurowe z rodziny
Thiorhodaceae charakteryzują się zdolnością do odkładania złogów czystej siarki wewnątrz
1
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2016/17
komórek, w postaci kropelek, co łatwo uwidacznia się w obrazie mikroskopowym (np. u
Chromatium). Ponadto ich komórki mają ogromne rozmiary jak na bakterie: dochodzą do 2050 µm długości. Niektóre bakterie z tej rodziny są także zdolne do gromadzenia złóż siarki
pozakomórkowo (np. rodzaj Ectothiorhodospira). Odkładanie siarki jest głównie wynikiem
niepełnego utleniania siarkowodoru w środowiskach, gdzie występuje on w dużych ilościach.
Po wyczerpaniu zapasów siarkowodoru, bakterie wykorzystują zgromadzoną siarkę. Bakterie
purpurowe bezsiarkowe (Athiorhodaceae) nie są ścisłymi autotrofami, ponieważ do wzrostu
wymagają dodatkowo związków organicznych. Również pozostałe grupy bakterii
fotosyntetyzujących są zdolne do asymilacji związków organicznych, nawet jeżeli są zaliczane
do bezwzględnych autotrofów. Drugą grupą drobnoustrojów glebowych zdolnych do
fotosyntezy są sinice, które przeprowadzają typową fotosyntezę oksygenową o mechanizmie
biochemicznym bardzo podobnym do roślin zielonych.
Bakterie chemolitotroficzne
Bakterie chemosyntetyzujące mają duże znaczenie w życiu gleby. Zalicza się do nich
wiele istotnych i ciekawych grup bakterii – są to m.in. bakterie nitryfikacyjne, siarkowe,
żelazowe, wodorowe, karboksydowe. Bakterie te nie są, w odróżnieniu od fototrofów, zależne
od dostępu światła, wymagają natomiast dostępu do odpowiedniej puli zredukowanych
związków mineralnych (są zatem chemolitotrofami, a w przeważającej większości także
chemolitoautotrofami). Ich fizjologia jest natomiast bardzo różnorodna stąd wymagania
2
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2016/17
siedliskowe są również bardzo zróżnicowane i specyficzne dla danej grupy. Z uwagi na
biochemię procesu chemosyntezy, większość bakterii chemosyntetyzujących należy do
bezwzględnych tlenowców.
A
B
Rys. Typy oddychania (A) oraz chemosyntezy (B) mikroorganizmów glebowych.
Z punktu widzenia człowieka, ale także biorąc pod uwagę równowagę ekosystemów
glebowych, największe znaczenie mają bakterie nitryfikacyjne czyli utleniające jony amonowe
do azotanowych. Są one bardzo rozpowszechnione w glebach na całym świecie, zwłaszcza w
glebach żyznych, obfitujących w amoniak. Już w XIX wieku Winogradski opisał proces
nitryfikacji przeprowadzany przez bakterie glebowe. Nitryfikacja ułatwia asymilację azotu
przez rośliny wyższe, gdyż jest on znacznie bardziej przyswajalny w postaci azotanów (forma
saletrzana) niż jonu amonowego. Dzięki bakteriom nitryfikacyjnym powstają również
naturalne złoża saletry będącej doskonałym nawozem. Bakterie nitryfikacyjne uczestniczą w
najwcześniejszych etapach procesu glebotwórczego będąc jednymi z pionierów życia na
wietrzejących skałach. Nitryfikacja jest procesem dwuetapowym – nie są znane gatunki
utleniające amoniak bezpośrednio do jonów azotanowych. W pierwszym etapie zachodzi
nitrosofikacja polegająca na utlenianiu amoniaku do azotynów, a następnie w etapie właściwej
nitryfikacji azotyny są utlenianie do azotanów. Oba etapy są przeprowadzane przez różne
grupy bakterii (gł. Nitrosomonas i Nitrobacter) posiadających odpowiednie układy
enzymatyczne. Do bakterii z grupy Nitroso- zaliczane są, oprócz Nitrosomonas (najczęściej N.
3
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2016/17
europaea), także rodzaje Nitrosospira, Nitrosolobus, Nitrosovibrio i Nitrosococcus. Wszystkie
bakterie z tej grupy są bezwzględnymi tlenowcami i nie wytwarzają form przetrwalnikowych,
chociaż mają wykazują oporność na wysuszenie i mogą przetrwać w stanie anabiozy wiele lat.
Charakterystyczną cechą bakterii Nitroso- jest wzrost na granicy faz np. na powierzchni
grudek gleby lub piasku, a w warunkach laboratoryjnych ich kolonie mogą przylegać do
ścianek naczyń hodowlanych oraz grudek kredy. Dodatek kredy stosuje się w celu alkalizacji
środowiska, gdyż w trakcie nitrosofikacji powstają duże ilości kwasu azotawego silnie
zakwaszającego środowiska, co hamuje wzrost bakterii i samą chemosyntezę. Do drugiej
grupy (tzw. Nitro-) należą rodzaje Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus. Podobnie jak bakterie z
grupy Nitroso- wykazują charakterystyczny typ wzrostu na powierzchni grudek gleby bądź
ścianek naczyń hodowlanych.
Bakterie siarkowe o zdolnościach chemosyntetycznych wykorzystują do uzyskania
energii utlenianie siarki i jej prostych pochodnych – siarkowodoru, tiosiarczanów. Produktem
utleniania związków siarki jest kwas siarkowy. Bakterie te należą do różnych grup
systematycznych, a ich występowanie jest powszechne w środowiskach bogatych w siarkę
(okolice kraterów wulkanicznych lub gejzerów) oraz siarkowodór (wody powierzchniowe,
bagna, gleby). Bakterie te są czasami określane jako bakterie tionowe (są zdolne do utleniania
kwasów tionowych oraz tiosiarczanów). Nie gromadzą one siarki wewnątrz komórek, lecz
wydzielają ją do środowiska; ich komórki są bezbarwne. Powszechnie spotykaną siarkową
bakterią glebową jest Thiobacillus thiooxidans. Bakteria ta spotykana jest często w glebach
uprawnych, łąkowych, kompostach oraz w złożach fosforytów. Utlenia siarkę, siarkowodór
oraz tiosiarczany. Inne gatunki często spotykane w środowisku naturalnym to T. thioparus, T.
denitrificans, T. neapolitanus. Większość glebowych i wodnych bakterii siarkowych należy do
obligatoryjnych chemolitoautotrofów i toleruje silnie kwaśny odczyn środowiska (T.
thiooxidans jest zdolna do przeżycia w 1M kwasie siarkowym). Wynika to głównie ze specyfiki
katalizowanych przez te bakterie reakcji biochemicznych, których produktem jest kwas
siarkowy:
H2S + 2 O2 → H2SO4
S + H2O + 1,5 O2 → H2SO4
H2S2O3 + H2O + 2 O2 → 2 H2SO4
4
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2016/17
Podobne właściwości wykazują także niektóre, zaliczane do bakterii siarkowych,
ekstremofilne archeony (Sulfolobus acidocaldarius, Caldariella acidophila). Występują w gorących
źródłach o optimum temperaturowym w granicach 75°C i pH około 2.
Do bakterii siarkowych o zdolności do chemosyntezy zaliczane są także bakterie
charakterystyczne dla wód stojących, kałuż, bagien oraz osadów dennych z rodzajów:
Beggiatoa, Thiotrix, Thioploca, Thiovola, Achromatium (np. A. oxaliferum). Utleniają one zarówno
czystą siarkę (Thiotrix), jak i siarkowodór (Beggiatoa).
Znaczenie bakterii siarkowych jest bardzo duże z uwagi na umożliwienie asymilacji
końcowych produktów obiegu siarki w przyrodzie – zwłaszcza siarkowodoru – roślinom
wyższym. Siarka w postaci siarkowodoru jest dla roślin całkowicie nieprzyswajalna i
toksyczna. Bakterie te pełnią zatem ważną rolę detoksykacyjną w środowisku oraz powodują
powstawanie złogów wolnej siarki. Ma to również znaczenie w gospodarce człowieka –
praktycznie wszystkie eksploatowane złoża siarki mają pochodzenie biogenne.
Rys. Przemiany siarki w cyklu biogeochemicznym.
Rys. Stopnie utlenienia różnych form siarki występujących w przyrodzie.
5
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2016/17
Bakterie sulfidogenne
Bakterie mogą wykorzystywać związki siarki także do oddychania beztlenowego.
Bakterie sulfidogenne (zwane także bakteriami desulfuryzacyjnymi) wykorzystują jako
akceptory elektronów jony siarczanowe (oddychanie siarczanowe czyli dysymilacyjna
redukcja siarczanów) lub czystą siarkę (oddychanie siarkowe). Produktem tego procesu jest
siarkowodór lub siarczki. Wszystkie bakterie u których wykryto proces oddychania
siarczanowego są obligatoryjnymi anaerobami. Bakterie te są bardzo zróżnicowane
morfologicznie oraz biochemicznie i należą do kilku różnych niespokrewnionych ze sobą grup
taksonomicznych. Zalicza się do nich m. in. rodzaje Desulfovibrio, Desulfotomaculum,
Desulfococcus, Desulfobacillus, Desulfomonas, Desulfosarcina, a także archeony (np. termofilny
Archaeoglobus sp.). Występowanie tych bakterii ograniczone jest do wyjątkowo beztlenowych
środowisk, w których intensywnie zachodzą procesy gnilne – przede wszystkim w osadach
tzw. „czarnego błota” (stanowią na przykład główną przyczynę intensywnej barwy dna
Morza Czarnego), w sąsiedztwie złóż ropy naftowej, a także w przewodzie pokarmowym
wyższych zwierząt. Bakterie te wykorzystują jako substraty oddechowe nie cukry, lecz
produkty niepełnej degradacji lipidów, węglowodanów i białek: kwasy tłuszczowe, kwas
mlekowy, alkohole (w przypadku bakterii autotroficznych substratem oddechowym może
być gazowy wodór). Hodowla selekcyjna tych mikroorganizmów prowadzona jest w
warunkach beztlenowych, w obecności łatwo przyswajalnych form węgla oraz źródeł jonów
siarczanowych.
Zupełnie niszowymi mikroorganizmami są bakterie zdolne do beztlenowego
oddychania z wykorzystaniem czystej siarki jako akceptora elektronów (oddychanie
siarkowe). Zalicza się do nich wyizolowany z wody morskiej gatunek Desulfuromonas
acetoxidans (obligatoryjny beztlenowiec), bakterie z gatunku Desulfomonas pigra (obecnie:
Desulfovibrio piger) oraz nieliczne ekstremofilne archeony (rodzaje Pyrodictium, Acidianus)
wzrastające w temperaturze około 110°C. Są to miksotrofy.
Proces oddychania siarkowego prowadzony przez D. acetoxidans jest szczególnie
skomplikowanym przykładem oddziaływania ekologicznego o charakterze syntrofii. Bakteria
ta wyizolowana z wody morskiej ma zdolność prawidłowego wzrostu i rozwoju in vitro tylko
w kokulturze z innym gatunkiem – fototroficzną bakterią zieloną z rodziny Chlorobiaceae.
Bakteria ta wykorzystuje powstający podczas oddychania siarkowego (prowadzonego przez
D. acetoxidans) siarkowodór jako akceptor wodoru w fotosyntezie anoksygenowej. Wynikiem
6
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2016/17
tej reakcji jest powstawanie siarki ponownie wykorzystywanej przez D. acetoxidans. Ponadto
D. acetoxidans ma zdolność do utleniania octanów i etanolu do dwutlenku węgla – drugiego
produktu wykorzystywanego w fotosyntezie przez syntroficzną bakterię zieloną.
Bakterie denitryfikacyjne i diazotrofy
W procesie denitryfikacji jony azotanowe w warunkach beztlenowych zostają
zredukowane i przekształcone ostatecznie do gazowych produktów: podtlenku azotu i azotu
atmosferycznego (usuwanych z komórki). Należy podkreślić, że denitryfikacja (rodzaj
oddychania azotanowego czyli dysymilacyjnej redukcji azotanów) nie jest procesem
odwrotnym do nitryfikacji. Denitryfikacja jest najczęściej spotykaną u bakterii formą
oddychania beztlenowego. Typowe gatunki denitryfikatorów glebowych to: Pseudomonas
denitrificans, P. aeruginosa, Bacillus licheniformis, Thiobacillus denitrificans, Paracoccus denitrificans.
Większość denitryfikatorów to bakterie względnie tlenowe wykorzystujące głównie tlen jako
ostateczny akceptor elektronów, a jedynie w warunkach niedoboru tlenu prowadzą
denitryfikację (wówczas ostatecznym akceptorem są jony azotanowe). W pierwszym etapie
jony azotanowe są redukowane do jonów azotynowych – jest to wspólny etap wszystkich
rodzajów oddychania azotanowego. W przypadku denitryfikacji jony azotynowe ulegają
dalszej redukcji, tak więc produktami końcowymi denitryfikacji są zredukowane formy azotu
w postaci gazowej (tlenek azotu, podtlenek azotu, wolny azot atmosferyczny – w zależności
7
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2016/17
od obecności odpowiednich enzymów). Selekcję bakterii o zdolnościach do denitryfikacji
prowadzi się w warunkach beztlenowych na podłożach zawierających jony azotanowe
(najczęściej w postaci KNO3) i organicznymi źródłami węgla – peptonem, bulionem, glukozą,
kwasami organicznymi itp. (np. podłoże Giltay’a). Konieczny jest także dodatek źródła jonów
amonowych, ponieważ bakterie denitryfikacyjne, w odróżnieniu od amonifikacyjnych, nie są
zdolne do redukcji jonów azotanowych do amoniaku w celu wykorzystania go w biosyntezie
aminokwasów. Jony azotanowe wykorzystywane są jedynie jako alternatywa dla oddychania
tlenowego. Istnieją jednak, choć bardzo nieliczne, gatunki bakterii mające zdolność do
amonifikacji, czyli redukcji azotanów nie do wolnego azotu, lecz do amoniaku (np. Escherichia
coli, Enterobacter aerogenes – bakterie jelitowe), choć niekonieczne są zdolne do asymilacji azotu
w takiej formie.
Asymilacja azotu atmosferycznego (diazotrofia) może być przeprowadzana przez
bakterie symbiotyczne lub przez wolno żyjące bakterie glebowe. Wszystkie diazotrofy są
zdolne do przyswajania azotu atmosferycznego dzięki obecności kompleksu enzymatycznego
nitrogenazy (właściwa nitrogenaza i reduktaza nitrogenazowa) kodowanego przez odrębne
geny. Wszystkie zbadane kompleksy nitrogenaz bakteryjnych są do siebie bardzo zbliżone.
Charakteryzują się bardzo wysoką wrażliwością na obecność tlenu, stąd ich aktywność u
tlenowców przebiega albo w wyspecjalizowanych komórkach (heterocystach) u sinic, albo jest
chroniona przez specjalne barwniki leghemoglobinowe (u bakterii brodawkowych).
Pierwotnym produktem reakcji wiązania azotu jest amoniak. Do bakterii symbiotycznych
wiążących azot atmosferyczny należą przede wszystkim tzw. bakterie brodawkowe wnikające
do korzeni roślin z rodziny motylkowatych. Są to gatunki endosymbiotyczne dla określonych
gatunków roślin z tej rodziny (fasola, nostrzyk, koniczyna, łubin, groch, soja). Zalicza się do
nich sześć gatunków w obrębie rodzaju Rhizobium sp. (R. leguminosarum, R. phaseoli, R. trifolii,
R. lupini, R. meliloti, R. japonicum syn. Bradyrhizobium japonicum) oraz gatunki z rodzajów
Sinorhizobium i Mesorhizobium. Endosymbiontami roślin z krajów tropikalnych są
Bradyrhizobium japonicum (symbioza z soją i ryżem), Azorhizobium caulinodans (tworzy
brodawki łodygowe u rośliny motylkowej Sesbania caulinodans). Również niektóre gatunki
roślin spoza rodziny motylkowatych mają zdolność do wchodzenia w układy symbiotyczne z
bakteriami diazotroficznymi. Przykładem bakterii wykazującej takie cechy jest promieniowiec
z rodzaju Frankia (symbioza z korzeniami olszy i wielu innych drzew liściastych) oraz sinice z
rodzajów Anabaena i Nostoc (symbioza np. z paprotką wodną, przylaszczkami). Bakterie z
rodzaju Rhizobium są wykorzystywane praktycznie w tzw. szczepionkach glebowych
stosowanych w rolnictwie do podwyższania żyzności gleb (np. Nitragina wyprodukowana
8
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2016/17
już w 1901 roku). Zdolność wiązania azotu atmosferycznego wykazują także liczne gatunki
glebowych nie tworzących endosymbiozy z roślinami wyższymi. Do wolno żyjących
diazotrofów zaliczane są przede wszystkim bakterie z rodzajów Clostridium (laseczki
beztlenowe – głównie C. pasteurianum, C. butyricum) i bakterie tlenowe Azotobacter (A.
vinelandii, A. chroococcum) – w Polsce najczęściej spotykanym gatunkiem jest A. chroococcum.
Inne bakterie zdolne do asymilacji dość dużych ilości azotu to Alcaligenes latus, Bacillus
polymyxa, Xanthobacter autotrophicus, Azomonas agilis, Derxia gummosa, a także niektóre bakterie
z rodzajów Arthrobacter, Achromobacter, Pseudomonas. Zdolność wiązania azotu stwierdzono
także u większości bakterii fototroficznych (np. Chromatium sp., Allochromatium sp., Chlorobium
sp.), sinic (około 40 gatunków – mają ogromną rolę ekologiczną jako organizmy pionierskie) i
niektórych promieniowców (np. Actinomyces spinae).
Drobnoustroje heterotroficzne
Bardzo liczną grupę drobnoustrojów glebowych stanowią heterotrofy mające zdolność
do rozkładu wszelkich połączeń organicznych węgla i tym samym pełniące podstawową rolę
w mineralizacji materii. Zaliczana jest tu większość bakterii, w tym promieniowce, oraz
wszystkie grzyby. Rozkładają zarówno proste związki organiczne, jak i trudne do rozkładu
związki pochodzenia roślinnego (celuloza, hemiceluloza, pektyny, ligniny) oraz wiele bardzo
toksycznych ksenobiotyków – zwłaszcza o budowie aromatycznej – dostających się do gleb w
dużych
ilościach
w
wyniku
działalności
człowieka.
Najważniejszą
rolą
tych
mikroorganizmów jest tworzenie humusu, czyli próchnicy glebowej decydującej o żyzności
gleb. Humus stanowią głównie substancje pochodzenia naturalnego o bardzo trudnej do
degradacji strukturze – zazwyczaj woski, ligniny, celuloza. Nadają one humusowi ciemne
zabarwienie. Bardzo ważne jest w tym przypadku rozkładanie białek – procesy proteolizy
(rozkład do aminokwasów) oraz dalszy rozkład aminokwasów i amonifikacja. Typowymi
drobnoustrojami proteolitycznymi są bakterie z rodzajów Bacillus i Pseudomonas. Niektóre
heterotrofy wzbogacają gleby w azot pochodzenia atmosferycznego. Wiele z nich wytwarza
także substancje wzrostowe lub antybiotyczne istotnie wpływając na równowagę biotyczną
gleb. Istnieją także drobnoustroje żyjące w symbiozie z wyższymi roślinami ułatwiając im
odżywianie.
9