SESJA 2

Sesja sponsorowana przez
Polską Sieć Biologii Molekularnej
Applied Biosystems
Amersham Pharmacia Biotech
SESJA 2
REPLIKACJA I NAPRAWA DNA
PLAKATY
36
SESJA 2 PLAKATY
P02-01
BIAŁKA JĄDROWE ROZPOZNAJĄCE DNA USZKODZONY PRZEZ
N-ACETOKSY-ACETYLAMINOFLUOREN
A
A
B
A
A
Monika Pietrowska , Joanna Łanuszewska , Zofia Walter , Joanna Rzeszowska-Wolny , Piotr Widłak
A: Zakład Radiobiologii Doświadczalnej i Klinicznej, Gliwice
B: Katedra Genetyki Molekularnej Uniwersytet Łódzki
W komórkach organizmów wykrywa się obecność bialek swoiście rozpoznających i wiążących się z uszkodzonym
DNA. Część tych białek bierze udział w naprawie DNA, inne wydają się współzawodniczyć z białkami naprawczymi i spowalniać proces naprawy. W naszych badaniach analizowaliśmy obecność białek rozpoznających DNA
uszkodzone przez kancerogen N-acetoksy-acetylaminofluoren (AAAF) w ekstraktach jądrowych z tkanek szczura.
Obecność kompleksu białko – uszkodzony DNA wykrywaliśmy za pomocą testu spowolnienia migracji w żelu
(ang. electroforetic mobility shift assay, EMSA), jako sondy używaliśmy oligonukleotydu o długości 36 pz. Stosując technikę EMSA wykryliśmy dwa kompleksy swoiste dla uszkodzonego DNA. Kompleks o mniejszej ruchliwości elektroforetycznej zawierał białko słabo związane z komponentmi jądrowymi, które było ekstrahowane z
jąder 0.1 M NaCl. Białko to występuje w około 104 kopii na jądro komórki wątroby. Wielkość tego białka oszacowana za pomocą metody „Southwestern blot” wynosiła 42 kDa. Powinowactwo tego białka do DNA uszkodzonego przez AAAF było ~10 razy większe niż do DNA nieuszkodzonego. Analogiczne kompleksy AAAF-DDB były
wykrywane w ekstraktach jądrowych z innych tkanek: mózgu, jąder i nerki. kompleks o większej ruchliwości elektroforetycznej zawierał białka chromatyny ekstrahowane z jąder komórkowych 0.4 M NaCl. Ilość tego białka wynosi w przybliżeniu 10 5 kopii na jądro komórki wątroby, a jego wielkość jest szacowana na 25 kDa. Powinowactwo tego białka do DNA uszkodzonego przez AAAF było 70 razy większe niż do DNA nieuszkodzonego. Białko to
wykazuje również wysokie powinowactwo do DNA uszkodzonego przez cis-diamino-dichloroplatynę. Obecność
analogicznego kompleksu stwierdzono w mózgu, śledzionie i nerce, ale nie jądrach szczura.
P02-02
POWINOWACTWO BIAŁEK HMG DO USZKODZONEGO DNA
Joanna Łanuszewska, Joanna Rzeszowska-Wolny, Piotr Widłak
Centrum Onkologii, Zakład Radiobiologii Doświadczalnej i Klinicznej, Gliwice
Białka z rodziny HMG (ang. high mobility group) są powszechnie występującymi niehistonowymi białkami chromatyny, mającymi udział w regulacji struktury i ekspresji materiału genetycznego. Wiązanie białek HMG-1/2 do
DNA indukuje lokalne zmiany struktury: rozkręcanie (ang. unwinding) i wyginanie (ang. bending) heliksu DNA.
Dodatkowo, białka HMG-1/2 wiążą się preferencyjnie do DNA zawierającego takie zaburzenia struktury. Stwierdzono, że białka HMG-1/2 wiążą się z DNA zawierającym wewnątrzniciowe wiązania sieciowe indukowane przez
cis-platynę 100–1000 razy silniej niż z nieuszkodzonym DNA. Wiązanie białek HMG do DNA uszkodzonego przez
cis-platynę spowalnia naprawę uszkodzeń i ma istotne znaczenie dla wrażliwości komórek na ten lek antynowotworowy. Celem niniejszej pracy było zbadanie czy inne uszkodzenia zaburzające strukturę DNA rozpoznawane
są z podwyższonym powinowactwem przez białka HMG-1/2. Stosując metodę EMSA (ang. electrophoretic mobility shift assay) badaliśmy powinowactwo białek HMG wyizolowanych z wątroby szczura oraz ludzkiego białka
HMG-1 do oligonukleotydu zawierającego uszkodzenia indukowane przez promieniowanie UV, N-acetoksy-acetyloaminofluorenem (AAAF), diolepoksydem benzo(a)pyrenu (BPDE) i siarczanem dwumetylu (DMS). Stwierdziliśmy, że białka HMG-1/2 wiążą się z DNA uszkodzonym przez promieniowanie UV, AAAF i BPDE około 10-krotnie
silniej niż z nieuszkodzonym DNA. Wszystkie te typy uszkodzeń DNA indukują lokalne zaburzenia struktury heliksu. Nasze wyniki sugerują, że wiązanie białek HMG może mieć istotne znaczenie dla regulacji wydajności naprawy różnych typów uszkodzeń DNA.
REPLIKACJA I NAPRAWA DNA
37
P02-03
WIERNOŚĆ REPLIKACJI DNA W WARUNKACH INDUKCJI SYSTEMU SOS W KOMÓRKACH
E.COLI
A
A
A
B
Magdalena Maliszewska-Tkaczyk , Piotr Jonczyk , Małgorzata Białoskórska , Roel Schaaper , Iwona
A
Fijałkowska
A: Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa
B: National Institute of Environmental Health Sciences, USA
Jedną z odpowiedzi komórki E. coli na uszkodzenie DNA, jest indukcja systemu SOS. Głównym fenotypem indukcji systemu SOS jest podwyższony poziom mutacji. Uważa się, że wzrost poziomu mutacji jest związany z formowaniem mutasomu i ze zmniejszeniem wierności replikacji DNA. Celem naszej pracy było sprawdzenie czy mutasom jest formowany z tą samą częstością na nici prowadzącej i opóźnionej w trakcie replikacji DNA. W pracy tej
przeprowadziliśmy badania poziomu mutagenezy w szczepie recA730 .Obecność mutacji recA730 powoduje fenotyp mutatorowy szczepu bez traktowania czynnikami uszkadzającymi. Różny mechanizmem replikacji obu nici
DNA, może powodować różnice w częstości powstawania mutacji na obu replikowanych niciach.[ I.J.Fijałkowska i
współ. (1998) PNAS USA 95:10020–10025]. W naszej pracowni opracowano system doświadczalny który pozwala
obserwować różnice w częstości powstawania mutacji w trakcie replikacji obu nici DNA. Skonstruowaliśmy pary
szczepów, które różniły się orientacją operonu laktozowego na chromosomie w stosunku do miejsca startu replikacji DNA. Badana sekwencja genu lacZ, w jednym szczepie jest raz replikowana jako nić prowadząca, zaś w drugim jako nić opóźniona. Otrzymane wyniki badań wykazują, że w szczepach recA730 obserwowane są znaczące
różnice w częstości powstawania mutacji na obu replikowanych niciach DNA. Na podstawie otrzymanych wyników zaproponowaliśmy model tłumaczący fenotyp mutatorowy obserwowany w warunkach indukcji systemu
SOS. Zakłada on że, w warunkach indukcji systemu SOS następuje preferencyjne formowanie mutasomu na nici
opóźnionej.
P02-04
ZWIĄZANIE DnaB W KOMPLEKSIE REPLIKACYJNYM CHRONI TO BIAŁKO PRZED
HAMOWANIEM JEGO AKTYWNOŚCI PRZEZ TOKSYNĘ Kid PLAZMIDU R1
A
AB
Katarzyna Potrykus , Grzegorz Węgrzyn
A: Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, Gdańsk
B: Centrum Biologii Morza PAN, Gdynia
Toksyna Kid, razem z antytoksyną Kis, tworzy system ParD plazmidu R1. Dokładny mechanizm działania toksyny
Kid nie jest znany aczkolwiek przypuszcza się, iż białko to oddziaływuje z helikazą DnaB i hamuje jej aktywność.
Aby zweryfikować hipotezę, iż Kid oddziaływuje tylko z wolną formą helikazy DnaB, przeprowadzono badania
nad replikacją plazmidów lambda w obecności toksyny. Plazmidy te podczas głodzenia aminokwasowego w komórkach relA Escherichia coli, ulegają replikacji tylko dzięki dziedziczonemu kompleksowi replikacyjnemu. Uważa się, iż w skład tego kompleksu wchodzą białka LambdaO, LambdaP i DnaB. Po indukcji syntezy Kid w komórkach relA poddanych głodzeniu aminokwasowemu nie zaobserwowano zmiany w replikacji plazmidów lambda.
Sugeruje to ochronę helikazy przez składniki kompleksu replikacyjnego. Zbadano również kinetykę replikacji plazmidów przez pulsowe piętnowanie nowosyntetyzowanego DNA [H3]tymidyną. Podobne doświadczenia wykonano także dla plazmidów p15A . Ulegają one replikacji podczas głodzenia aminokwasowego, ale nie występuje
tam dziedziczenie kompleksu replikacyjnego a więc i ochrona helikazy DnaB. Uzyskane wyniki pozwalają przypuszczać, iż związanie helikazy DnaB w kompleksie replikacyjneym chroni to białko przed hamowaniem jej aktywności przez toksynę Kid.
P02-05
MECHANIZM AKTYWACJI TRANSKRYPCJI PRZEZ BIAŁKO DnaA
Monika Glinkowska, Grzegorz Węgrzyn
Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, Gdańsk
Nasze wcześniejsze badania wykazały, że białko DnaA reguluje poziom transkrypcji z promotora pR bakteriofaga 8. Stymulacja aktywności tego promotora wydaje się być kluczowym procesem w regulacji inicjacji replikacji
38
SESJA 2 PLAKATY
plazmidów lambdowych. Dalsze badania koncentrowały się na wyjaśnieniu mechanizmu aktywacji promotora
pR: identyfikacji miejsc wiązania białka DnaA w tym rejonie oraz oddziaływania pomiędzy DnaA a polimerazą
RNA, a także stwierdzeniu, który etap transkrypcji jest stymulowany przez DnaA.
P02-06
N-TERMINALNA CZĘŚĆ REPLIKACYJNEGO BIAŁKA LAMBDA O JEST ODPOWIEDZIALNA ZA
ROZPOZNAWANIE I PROTEOLIZĘ PRZEZ PROTEAZĘ ClpXP
A
A
B
B
Małgorzata Gonciarz-Świątek , Kornelia Wiśniewska , Maciej Żylicz , Alicja Wawrzynów
A: Katedra Biologii Molekularnej i Komórkowej, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG/AMG, Gdańsk
B: International Institute of Molecular and Cell Biology, UNESCO, Warsaw, Poland
ATPaza ClpX została wyizolowana z bakterii Escherichia coli jako czynnik nadający specyficzność substratową
proteazie ClpP zależnej od ATP, która specyficznie trawi replikacyjne białko lambda O (Wojtkowiak i wsp., 1993).
Bakteryjne białko ClpX jest odpowiedzialne za doprowadzenie substratu białkowego lambda O do podjednostki
ClpP. Ponadto, ClpX może działać niezależnie od podjednostki zawierającej miejsce aktywne proteolitycznie.
Spełnia wówczas rolę białka opiekuńczego reaktywującego termicznie zinaktywowane białko lambda O, umożliwiając mu wiązanie do sekwencji ori , od której rozpoczyna się replikacja DNA. W celu określenia specyficzności
substratowej proteazy ClpXP jako substraty zastosowano pochodne delecyjne białka lambda O oraz białka fuzyjne zawierające N-końcowe fragmenty lambda O przyłączone do stabilnej i aktywnej tzw. domeny „J” obejmującej 108 aminokwasów N-terminalnej części białka opiekuńczego DnaJ, nie będącej substratem proteazy ClpXP. Stosując reakcję proteolizy oraz zmodyfikowany test ELISA, pozwalający badać oddziaływania pomiędzy
białkami, określono charakterystyczne miejsca substratu rozpoznawane przez ClpX oraz motywy niezbędne do
hydrolizy substratu przez proteazę ClpXP. Wykazano, iż w przypadku białka lambda O główne miejsce specyficzności substratowej ATPazy ClpX, które jest również wymagane do efektywnej hydrolizy przez proteazę ClpXP,
stanowi N-końcowa część białka lambda O.
P02-07
OKSYDACYJNE USZKODZENIA DNA WYWOŁYWANE PRZEZ INSEKTYCYDY
FOSFOROORGANICZNE – OCHRONNA ROLA WITAMINY C
J. Błasiak, J. Kowalik, D. Stańkowska
Katedra Genetyki Molekularnej Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź
Pestycydy fosforoorganiczne mogą być genotoksyczne, lecz mechanizm leżący u podstaw takiego działania nie
został w pełni poznany. Malation i metyloparation są jednymi z najczęściej stosowanych insektycydów fosforoorganicznych. Ich główne i pierwotne metabolity, malaokson i metyloparaokson o stężeniach 25, 75 i 200 M, powodowały uszkodzenia DNA limfocytów izolowanych z ludzkiej krwi obwodowej, oceniane alkaliczną wersją testu kometkowego. Witamina C o stężeniu 10 M zmniejszała zakres uszkodzeń DNA. Poddane działaniu obydwu
związków fosforoorganicznych komórki były zdolne do naprawy uszkodzonego DNA w okresie nie przekraczającym 30 min, za wyjątkiem limfocytów eksponowanych na malaokson o stężeniu 200 M, które nie okazywały naprawy DNA nawet po 2 h. Sugeruje to na cytotoksyczne działanie malaoksonu o stężeniu 200 M;
działanie to było znoszone przez witaminę C. Limfocyty poddane działaniu enzymów rozpoznających oksydacyjne uszkodzenia DNA: endonukleazy III i glikozylazy formamidopirymidynowej okazywały większy poziom uszkodzeń DNA niż komórki kontrolne. Wskazuje to, że uszkodzenia DNA powodowane przez malaokson i metyloparaokson mogą mieć, przynajmniej w części, charakter oksydacyjny.
Praca wykonana przy wsparciu finansowym Uniwersytetu Łódzkiego (grant 505/718).
REPLIKACJA I NAPRAWA DNA
39
P02-08
BASE PAIRING OF 2-HYDROXYADENINE
Agnieszka M. Maciejewska, Katarzyna D. Lichota, Jarosław T. Kuśmierek
Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, Warsaw, Poland
2-Hydroxyadenine (A*) is formed from adenine during reaction of DNA with oxygen radicals. The enol form of A*
pairs with T whereas the keto form with 5-methylisocytosine (iCM). We studied the influence of neighbouring
bases in template, temperature and kind of polymerase on base-pairing of A* by comparison of relative efficiency of incorporation of dTTP and diCMTP (calculated as the ratio of appropriate Vmax/Km) opposite A* site-specifically located in oligodeoxynucleotide templates. We have revealed that the base-pairing of A* is significantly
influenced by template neighbours but not by temperature (37–80°C) when studied in taq polymerase system.
The ratios diCMTP/dTTP at 37°C was found: 17.5, 12.0, 8.5 and 9.5 for sequences: TA*T, GA*G, CA*C and CA*T
respectively, however the only differences between TA*T and CA*C or CA*T were statistically significant. The taq
polymerase is more efficient in incorporation of diCMTP over dTTP than AMV reverse transciptase. The initial results of studies on incorporation of non-complementary dNTPs by taq polymerase show that efficiency of incorporation of dCTP opposite unmodified A is higher than opposite A*. In contrast, the incorporation of dATP and
dGTP is the same or higher opposite A* than A, depending on bases flanking the targeted base. Our results indicate that the presence of A* in DNA can lead to transversions, however the mutagenic effect of this oxidized base
can be sequence dependent.
P02-09
FIZJOLOGICZNA ODPOWIEDŹ KOMÓREK E. COLI NA OBECNOŚĆ TRÓJNUKLEOTYDOWYCH
SEKWENCJI POWTÓRZONYCH (CTG×CAG)N.
AB
AC
AB
A
Marta Majchrzak , Paweł Stączek , Adam Jaworski , Paweł Parniewski
A: Pracownia Struktury i Funkcji DNA, Centrum Mikrobiologii i Wirusologii PAN w Łodzi, Łódź
B: Instytut Biochemii Technicznej, Politechnika Łódzka, Łódź
C: Zakład Genetyki Drobnoustrojów, Uniwersytet Łódzki, Łódź
Obecne w genomie ludzkim trójnukleotydowe sekwencje powtórzone TRS (Trinucleotide Repeat Seqences) są
niestabilne i ulegają mutacjom dynamicznym (ekspansje i delecje). Wiadomo obecnie, że na skutek takich mutacji, ekspansje TRS są przyczyną szeregu dziedzicznych chorób genetycznych człowieka takich, jak dystrofia miotoniczna, pląsawica Huntingtona, choroba Kenedy’ego, zespół łamliwego chromosomu X, czy ataksja Friedreicha. Badania prowadzone na modelu bakteryjnym z wykorzystaniem rekombinowanych wektorów plazmidowych wykazały, że na niestabilność TRS mają wpływ: sposób replikacji, transkrypcja, mechanizmy naprawy
uszkodzeń DNA (MMR, NER), rekombinacja, a także warunki hodowli bakteryjnej.W pracy założono, że powstające in vivo w trakcie replikacji plazmidów noszących długie trakty (CTG×CAG)n drugorzędowe struktury
DNA typu szpilki do włosów (hairpin) mogą powodować barierę dla replikacji plazmidowego DNA. Zahamowanie replikacji prowadzi do indukcji systemu SOS. W wyniku indukcji odpowiedzi SOS komórki obserwuje się zwielokrotnioną ekspresję ponad dwudziestu genów będących pod kontrolą regulonu SOS (min. uvrB, uvrC, sulA).
Ekspresja genu sulA powoduje zahamowanie podziałów komórkowych i filamentacją komórek, co może mieć także istotny wpływ na charakterystykę wzrostu komórek E. coli. Filamentacja komórek była obserwowana we
wcześniejszych eksperymentach prowadzonych na podobnym modelu badawczym. W prowadzonych przez nas
badaniach wykorzystano szczepy E. coli z funkcjonalnym systemem naprawy DNA przez wycinanie nukleotydów
– NER (Nucleotide Excision Repair), zestaw mutantów: uvrA, uvrB, uvrC i uvrD, jak również szczepy: JJC523 – z
systemem SOS indukowanym konstytutywnie, oraz JJC123, gdzie indukcja systemu SOS została zablokowana.
Uzyskane wyniki wskazują, że obecne w komórkach wszystkich szczepów długie trakty (CTG×CAG)n zmieniają
charakterystykę wzrostu hodowli. Obserwowane zjawisko zależy od długości TRS. W pracy analizowano także
wpływ mutacji w systemach naprawy DNA – NER i SOS – na stabilność badanych traktów (CTG×CAG)n.
40
SESJA 2 PLAKATY
P02-10
ENZYMATIC EXCISION OF HYDRATED AND DEHYDRATED FORMS OF ETHENOCYTOSINE
FROM DNA
Ewa Borys-Brzywczy, Jarosław T. Kuśmierek
Institute of Biochemistry and Biophysics PAN, Warsaw, Poland
Exocyclic DNA ethenoadducts are formed by exogenous agents such as vinyl chloride or chloroacetaldehyde
(CAA) and also by endogenous products of lipid peroxidation. The etheno derivatives of DNA bases: N2,
3-ethenoguanine, 1, N2-ethenoguanine, 1, N6-ethenoadenine are excised from DNA by 3-methyladenine-DNA
glycosylase from E. coli (Alk) and by analogous eucariotic enzymes (Anpg, Adpg). Cytosine reacts with CAA in
DNA to form 3, N4-hydroxyethanocytosine (eCH) and 3, N4-ethenocytosine (eC). Both of them are mutagenic. The
half-time of transformation of hydrated to dehydrated form at pH 7 and 37oC is about 18 hrs. It is known that eC
is removed from DNA by double strand uracil-DNA glycosylase (dsUDG, Mug) [Saparbaev and Laval, Proc. Natl. Sci.
USA, 95, 8508-8513, 1998.].The aim of our work was to find whether dsUDG glycosylase excise also eCH. As a substrate we have used 32P- 5’-labeled T6CT5CT5CT6 oligonucleotide reacted with CAA under conditions giving various
proportions of eCH and eC and then annealed to the complementary strand. The excision of modified base from
the duplex by glycosylase produces abasic site which can be cleaved by an endonuclease. The products of such
specific cleavage are separated by PAGE and detected by autoradiography. Our preliminary experiments with
partially purified dsUDG glycosylase indicate that both forms of ethenocytosine, hydrated and dehydrated, are
excised from the duplex.
P02-11
DnaA-BOX SEQUENCES AS A SITE FOR HELICASE DELIVERY DURING PLASMID RK2
REPLICATION INITIATION IN ESCHERICHIA COLI
A
B
C
A
Marcin Pacek , Grażyna Konopa , Donald R. Helinski , Igor Konieczny
A: Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biotechnology, University of Gdansk, Gdansk, Poland
B: Department of Molecular Biology, Faculty of Biology, University of Gdansk, Gdansk, Poland
C: Department of Biology, Center for Molecular Genetics, University of California San Diego
The initiation of DNA replication of prokaryotic and eukaryotic replicons requires delivering and loading of a
helicase at the replication origin. Helicases unwind dsDNA, however, for this activity the enzyme has to be placed
on to separated DNA strands. The mechanism of these events still remains unsolved. Broad-host-range plasmid
RK2 minimal replication origin (oriV) consists of typical plasmid structural elements i.e. multiple repeat sequences (iterons), DnaA box sequences and an A+T-rich region. The one or more clusters of direct repeats are
specific binding sites for the plasmid replication initiation protein (Rep). Iteron binding of Rep protein causes helix destabilization and produces ssDNA within the A+T-rich region. This is a potential site for bacterial helicase
loading. The DnaA box sequences are organized with cluster and are binding sites for DnaA a host replication initiation protein. This binding itself does not provoke plasmid origin opening at A+T-rich region. Previous results
show that specific DnaA-DnaB interaction is critical for the delivery of DnaB helicase complexed with accessory
protein DnaC. The RK2 plasmid initiation protein TrfA activates the helicase complex formed at oriV. In this work,
using SPR, EM and ELISA techniques, we investigate E. coli DnaB helicase delivery during RK2 DNA replication initiation. Our results show that the DnaA box cluster serves as a site for the formation of a helicase complex. This
does not require ssDNA generated during origin opening. Results clearly demonstrated that during the initial
step DnaB helicase is delivered at DnaA box sequences localized approximately 200-bp upstream from the region
of origin opening. Helicase complex via DnaB may interact physically with the TrfA protein.
REPLIKACJA I NAPRAWA DNA
41
P02-12
ODPOWIEDŹ ADAPTACYJNA A NAPRAWA PODWÓJNONICIOWYCH PĘKNIĘĆ DNA
W LIMFOCYTACH LUDZKICH
Iwona Grądzka, Maria Wojewódzka, Iwona Buraczewska, Irena Szumiel
A:Instytut Chemii i Techniki Jądrowej, Zakład Radiobiologii i Ochrony Zdrowia, Warszawa
Wielokrotnie obserwowano, że limfocyty poddane działaniu bardzo niskich (adaptacyjnych) dawek czynnika
uszkadzającego DNA (promieniowanie jonizujące, H2O2, radiomimetyki – np. bleomycyna) mogą stać się bardziej
odporne na wyższe (wyzwalające) dawki tego samego lub innego czynnika. Wyraża się to w mniejszej liczbie
aberracji chromosomowych i mikrojąder oraz obniżonej częstości mutacji i związane jest ze wzrostem przeżywalności komórek. Hipoteza zakładająca, że odpowiedź adaptacyjna polega na usprawnieniu mechanizmów naprawy – zwłaszcza tych odpowiedzialnych za łączenie pęknięć DNA – wciąż nie została udowodniona. Stosując promieniowanie jonizujące jako czynnik adaptacyjny (dawka 5 cGy) i wyzwalający (dawki 5 i 10 Gy), badano
początkową (do 120 min) szybkość naprawy DNA w limfocytach ludzkich. Poprzednio pokazano, że szybkość naprawy pojedynczo- i podwójnoniciowych pęknięć DNA, mierzona za pomocą testu kometowego w pH zasadowym i testu ELISA dla jednoniciowego DNA, nie zmienia się w limfocytach adaptowanych – wykazujących o 30%
niższą częstość występowania mikrojąder niż spodziewana w przypadku zsumowania dawek adaptacyjnej i wyzwalającej. Obecnie przedstawiono wyniki badania związku między adaptacją a naprawą wyłącznie podwójnoniciowych pęknięć DNA (dsb). Do pomiarów zastosowano test kometowy w pH obojętnym oraz elektroforezę
pulsową DNA (PFGE) – powszechnie uznaną za najbardziej swoistą metodę oceny poziomu dsb. Limfocyty otrzymano z krwi 5 zdrowych mężczyzn (niepalący, śr.wieku 24,8±3, 5 lat). Test kometowy nie wykazał różnic w
początkowej szybkości naprawy DNA między limfocytami zdolnymi i niezdolnymi do adaptacji, niezależnie od
tego, czy komórki otrzymały dawkę adaptacyjną czy nie. Analiza wyników PFGE potwierdziła brak różnic w
początkowej szybkości naprawy dsb między limfocytami wykazującymi i nie wykazującymi adaptacji. Natomiast
we wszystkich próbach poddanych działaniu dawki adaptacyjnej zaobserwowano zniesienie opóźnienia w naprawie dsb w porównaniu z próbami nieadaptowanymi. Tak więc, niska dawka promieniowania ma wpływ na
początkowy przebieg naprawy dsb, choć nie jest to czynnik decydujący o nabyciu odporności na promieniowanie
P02-13
WPŁYW MUTACJI dnaQ49 NA SPECYFICZNOŚĆ REWERSJI W GENIE lacZ W SZCZEPACH
dnaQ49 E. COLI
Aneta Nowosielska, Natalia Mieczkowska, Elżbieta Grzesiuk
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Zakład Biologii Molekularnej, Warszawa
Mutacja dnaQ49 w genie dnaQ kodującym podjednostkę e pol III DNA prowadzi do podwyższenia poziomu mutacji w szczepach E. coli. Zjawisko to dotyczy zarówno mutacji spontanicznych jak i indukowanych UV i wynika z
zaburzenia funkcji korektorskiej 3’–>5’ egzonukleazy jaką spełnia prawidłowa podjednostka e, a także z destabilizacji całego holoenzymu (głównie podjednostki a) w mutancie dnaQ49 w temperaturze niepermisywnej 37°C.
Wykorzystując zestaw szczepów E. coli niosących szerokie spektrum mutacji w genie lacZ (CC101-111) oznaczono specyficzność mutacji dla pochodnych tych szczepów z mutacją dnaQ49.I tak wśród mutacji typu podstawienia zasad dominowały: GC->TA i AT->TA co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami. Natomiast zupełnie nowym odkryciem jest stwierdzenie, że w szczepach dnaQ49 głównie powstają mutacje typu zmiany ramki odczytu, a wspomniane powyżej typy mutacji stanowią jedynie niewielki pocent całkowitej liczby mutacji. Podobne
wyniki uzyskano dla mutacji indukowanych UV. Interesującym jest stwierdzenie, że w szczepach dnaQ49 obecność plazmidu nadprodukującego białka UmuD’ i UmuC, które w formie kompleksu UmuD’2C stanowią pol V,
prowadzi do znacznego obniżenia poziomu większości mutacji zarówno tych spontanicznych jak i indukowanych UV.
42
SESJA 2 PLAKATY
P02-14
NAPRAWA OKSYDACYJNYCH USZKODZEŃ ZASAD DNA W RAKU PŁUCA
A
A
A
B
B
Barbara Tudek , Marianna Grąziewicz , Elżbieta Speina , Tomasz Zastawny , Ryszard Oliński , Janina
C
Słodkowska
A: IBB PAN, Warszawa
B: AM Bydgoszcz, Zakład i Katedra Biochemii Klinicznej
C: Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc ul.Płocka 26 Warszawa
Reaktywne formy tlenu reagują zarówno ze składnikami DNA jak i z lipidami, powodując fragmentację wielonienasyconych kwasów tłuszczowych i tworzenia egzocyklicznych adduktów, np.: 1, N6-etenoadenina (eA) i 3,
N4-etenocytozyna (eC). Obecność tych pochodnych w DNA prowadzi do powstawania mutacji. Stosując metodę
opartą na cięciu oligodeoksynukleotydów z pojedynczym uszkodzeniem przez ekstrakty białkowe, badano aktywności glikozylaz eliminujących z DNA eA, eC i 8OHG w guzach płuca i fragmentach obrzeża nie wykazującym
zmian patologicznych. Zanalizowano tkanki 20 pacjentów: 13 mężczyzn, 7 kobiet; 12 palaczy, 5 eks-palaczy informacji na temat zwyczaju palenia; u 9 osób wykryto raka gruczołowego, u 9 raka płaskonabłonkowego, a u 2
inny typ nowotworu. Obserwowano duże (do 2 rzędów wielkości), różnice indywidualne w aktywnościach naprawczych. Średnio, naprawa wszystkich 3 uszkodzeń była wydajniejsza w guzie niż w zdrowym obrzeżu, chociaż statystycznie istotne różnice obserwowano jedynie dla eA. W zdrowym obrzeżu, najbardziej efektywna była
naprawa eC, następnie eA, a najmniej wydajna 8OHG. Nie znaleziono istotnych różnic w naprawie wszystkich 3
uszkodzeń w zależności od płci i typu nowotworu. Palenie tytoniu, znacząco podnosiło aktywność glikozylazy eC
w zdrowym obrzeżu płuca, nieznacznie podnosiło aktywność naprawiającą 8OHG (P=0,069), ale nie miało
wpływu na naprawę eA. Podjęto również próbę porównania szybkości naprawy z poziomem uszkodzeń DNA na
przykładzie 8OHG, które oznaczono metodą chromatografii gazowej połączonej ze spektrometrią masową
(GC/MS). Pomimo wyższej aktywności naprawczej w guzie, poziom 8OHG w DNA guza był wyższy niż w obrzeżu,
co sugerowało że ilość powstającej w guzie 8OHG przekracza pojemność naprawczą tkanki.
P02-15
POWSTAWANIE FORMAMIDOPIRYMIDYN W DNA
Tomasz Obtułowicz, Marianna Grąziewicz
IBB PAN, Warszawa
Podjęto badania nad powstawaniem puryn z otwartym pierścieniem imidazolowym w następstwie metylacji lub
utleniania DNA. Wiadomo było, że główny produkt metylacji zasad DNA – 7-metyloguanina (7MeG) w środowisku zasadowym ulega przekształceniu do 2,6-diamino-4-hydroksy-5N-metylo-formamidopirymidyny (Fapy-7MeG),
która jest wycinana z DNA przez formamidopirymidyno-DNA-glikozylazę (białko Fpg). Obecnie wykazaliśmy, że
7MeA w oligonukleotydach ulega spontanicznemu rozpadowi do Fapy-7MeA. Dwie rotameryczne formy
Fapy-7MeA można rozdzielić za pomocą HPLC. Półokres rozpadu 7MeA do Fapy-7MeA w poliA wynosi 24h w
37C, pH7.0 i jest dwukrotnie dłuższy niż w nukleozydzie. Otwieranie pierścieni imidazolowych ulega przyspieszeniu w środowisku zasadowym, ale oddziaływanie metylowanych zasad z reaktywnymi formami tlenu wytwarzanymi przez układ hipoksantyna/oksydaza ksantynowa/Fe+3/EDTA, nie ma wpływu na szybkość rozpadu 7MeA.
Otwieranie pierścienia imidazolowego 7MeA zachodzi również spontanicznie w DNA, o czym świadczy rozpoznawanie przez białko Fpg uszkodzeń w polidA metylowanym metylonitrozomocznikiem, ale nie poddanym
działaniu zasady. Ostatnio wykazano, że Fapy-7MeA jest uszkodzeniem mutagennym u E.coli. Możliwość spontanicznego powstawania Fapy-7MeA z 7MeA, w DNA, rzuca nowe światło na wiedzę o właściwościach mutagennych związków alkilujących. Badając wpływ warunków utleniania na powstawanie Fapy w DNA zaobserwowano, że uszkodzenia DNA rozpoznawane przez białko Fpg (8OHG, FapyG, FapyA) powstają w innych loci genu lacZ
faga M13, gdy DNA jest utleniane układami generującymi rodniki hydroksylowe w obecności lub nieobecności
EDTA, być może wskutek chelatowania jonów przez zasady DNA.
REPLIKACJA I NAPRAWA DNA
43
P02-16
USZKODZENIA DNA A MUTACJE W GENIE p53
Paweł Kowalczyk, Jarosław Cieśla, Barbara Tudek
IBB PAN, Warszawa
Połowa wszystkich nowotworów człowieka powstaje w wyniku uszkodzenia genu p53. Podjęto badania nad mechanizmem powstawania mutacji w tym genie badając korelację pomiędzy miejscami uszkodzenia genu p53 a
miejscami powstawania mutacji. Jako związek modelowy wybrano aldehyd chlorooctowy (CAA), metabolit znanego kancerogenu – chlorku winylu (VC). Spektrum uszkodzeń w cDNA ludzkiego genu p53 badano metodą odcisku palca polimerazy DNA, gdzie uszkodzone zasady, lub ich pochodne – miejsca apurynowe lub przerwy nici
powstałe na skutek aktywności glikozylaz naprawczych, przedwcześnie kończą syntezę w miejscu uszkodzenia.
Liczba zidentyfikowanych uszkodzonych miejsc wzrastała wraz ze steżeniem kancerogenu. Przy najwyższym stężeniu CAA, całkowita liczba loci, które przereagowały z CAA wynosiła ok. 30% całkowitej długości genu, co sugeruje że nie wszystkie zasady są modyfikowane równocennie. Wśród zmodyfikowanych zasad znaleziono jednakową liczbę miejsc adeniny, cytozyny i guaniny. Znaleziono niewielką liczbę loci, których uszkodzenie widoczne
było przy wszystkich badanych stężeniach CAA i uznano je za miejsca szczególnie wrażliwe na modyfikację. Niektóre z nich pokrywały się z miescami mutacji odnajdowanych w angiosarkomach wątroby ludzi i gryzoni
związanych z ekspozycją na chlorek winylu, jednak występowały one również w innych miejscach, w których do
tej pory mutacji nie znaleziono. Tak więc, preferencyjna modyfikacja niektórych zasad genu p53 może leżeć u
podstaw powstawania mutacji częściej w jednym loci niż w innych.
P02-17
TEST KOMETKOWY W BADANIU USZKODZEŃ DNA INDUKOWANYCH PRZEZ POCHODNE
TRIAZOLOAKRYDONU
Małgorzata Natali, Przemysław Bożko, Krzysztof Lemke, Andrzej M. Składanowski
Katedra Technologii Leków i Biochemii, Politechnika Gdańska, Gdańsk
Triazoloakrydony są nową grupą związków przeciwnowotworowych o wysokiej aktywności w stosunku do
białaczek i nowotworow litych. Badania nad mechanizmem działania triazoloakrydonów wykazały, że aktywne
biologicznie pochodne hamują aktywność katalityczną DNA topoizomerazy II zarówno wobec izolowanego enzymu jak i w komórkach nowotworowych. W prezentowanych badaniach zastosowaliśmy test kometkowy, w
wersji alkalicznej i neutralnej, do wykrywania różnego typu uszkodzeń DNA indukowanych przez pochodne triazoloakrydonu w komórkach HL-60. Do badań użyliśmy dwóch pochodnych: najaktywniejszego biologicznie triazoloakrydonu, związku C-1305, i analogu strukturalnego, związku C-1533, pozbawionego aktywności przeciwnowotworowej i o niskiej aktywności cytotoksycznej. Nasze badania wykazały, że obie badane pochodne triazoloakrydonu indukują uszkodzenia pojedynczo i podwójnoniciowe w DNA komórek HL-60 traktowanych różnymi
dawkami tych związków (od 0.1 do 100 M). Stężenia potrzebne do wywołania podobnego poziomu uszkodzeń
DNA były jednak dużo niższe dla aktywnej pochodnej niż dla związku nieaktywnego biologicznie. Przy niższych
stężeniach obu związków obserwowaliśmy początkowy wzrost poziomu uszkodzeń DNA, a przy czasach inkubacji dłuższych niż 24 h jego spadek. Wyższe stężenia związków wywoływały trwałe uszkodzenia DNA, którym,
przy dłuższych czasach inkubacji towarzyszył wzrost częstości występowania komet apoptotycznych, wskazujących na indukcję śmierci komórkowej przez badane triazoloakrydony. Przeprowadzona równolegle analiza
zmian w dystrybucji cyklu komórkowego wywoływanych przez badane związki sugeruje, że przy badanych stężeniach związków śmierci komórkowej podlegają selektywnie komórki w fazie S cyklu komórkowego.
44
SESJA 2 PLAKATY
P02-18
ANALIZA SEKWENCYJNA, INDUKOWANYCH MMS I PROMIENIOWANIEM UV, REWERSJI
+
FAGA LAMBDA susO8 DO sus POWSTAŁYCH W WARUNKACH PERMISYWNYCH I
NIEPERMISYWNYCH DLA REPLIKACJI FAGOWEGO DNA
Joanna Krwawicz, Irena Pietrzykowska
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa
Bakterie w fazie stacjonarnej i komórki somatyczne nie dzielą się lub dzielą się bardzo rzadko. Mimo tego powstają mutacje, które mogą prowadzić do zmian fenotypowych lub nawet do nowotworzenia. Aby uzyskać prosty model, w którym mutacje powstają na drodze innej niż podczas replikacji wykorzystaliśmy faga lambda
susO8. Mutant ten ma też mutację typu amber w genie O kodującym białko O niezbędne do inicjacji replikacji genomu faga. Fag lambda susO8 może rosnąć w szczepie E. coli 594 supE, który ma represorowe tRNA dla mutacji
typu amber, nie namnaża się zaś w szczepie E.coli 594 su-, który nie ma takiego tRNA. Z naszych badań wynika, że
MMS oraz promieniowanie UV w znacznym stopniu podwyższają mutagenezę w szczepie niepermisywnym, co
pozwala na stwierdzenie, że istnieje także mechanizm(y) powstawania mutacji niezależnie od replikacji. Ten sposób powstawania mutacji zależny jest od obecności mutagennych białek: UmuC i UmuD’, a nadprodukcja białka
UmuD’ z plazmidu pGW2122 przy niezaindukowanym poziomie UmuC w znacznym stopniu podwyższa mutagenezę w szczepie niepermisywnym. Sugeruje to, że białko UmuD’ odgrywa znaczną rolę w mutagenezie niezależnej od replikacji. Analiza sekwencyjna powstałych po działaniu MMS lub UV, mutantów faga lambda susO8,
przy zaindukowanym systemie SOS bakteryjnym, wykazała, że w szczepie permisywnym C600 supE powstaje
więcej tranzycji (70%), zaś w szczepie niepermisywnym 594 su- przeważają (60%) transwersje, niezależnie od
czynnika inaktywującego faga lambda susO8.