PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy technika amplifikacji

advertisement
•PCR - ang. polymerase chain reaction
łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy
•Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii
specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację –
zwielokrotnienie fragmentu DNA)
•Jest to reakcja powielania (replikacji) DNA w próbówce
•Częściowo uniezależnia nas od klonowania molekularnego
Metoda PCR naśladuje replikację DNA in vivo:
replikacja in vivo
1. powstają widełki replikacyjne (przy
udziale białek następuje lokalne
rozplecenie DNA)
2. polimeraza DNA wymaga wolnych
końców 3’, aby zapoczątkować
syntezę nowej nici w kierunku 5'  3
3. startery RNA wiążą się specyficznie
na zasadzie komplementarności z
określonymi miejscami na obydwu
niciach
4. polimeraza DNA wydłuża końce
starterów syntetyzując jedną nić w
sposób ciągły, a drugą jako tzw.
pasmo opóźnione
cykliczne powielanie DNA w
próbówce
1. ssDNA uzyskuje się ogrzewając DNA
dwuniciowe (dsDNA) matrycowe do
temperatury ok. 94-100C
2. polimeraza DNA wymaga wolnych
końców 3’, aby zapoczątkować syntezę
nowej nici w kierunku 5'  3’, które są
dostarczanie w postaci z syntetycznych
oligonukleotydowych fragmentów DNA.
Ponieważ są syntetyczne dobiera się je
tak, aby otaczały odcinek DNA, który ma
być powielony. To oznacza że musimy
częściowo znać sekwencję (kolejność
nt) w powielanym fragmencie DNA)
3. Startery przyłączają się do ss DNA na
zasadzie komplementarności pod
wpływem obniżenia temperatury.
4. Termostabilna polimeraza DNA wydłuża
startery na końcach 3’ w sposób ciągły
W każdym cyklu liczba cząsteczek syntetyzowanego DNA jest
podwajana – uzyskane kopie stanowią matrycę w kolejnych rundach
amplifikacji. Efektem replikacji DNA techniką PCR jest więc
amplifikacja (zwielokrotnienie) specyficznego obszaru DNA.
Pierwsze zamierzone produkty amplifikacji powstają w trzecim cyklu reakcji
Typowy schemat reakcji PCR jest więc szeregiem powtarzanych cykli
złożonych z następujących etapów:
•denaturacji DNA (30 sek.-5 min.; 94-96C)
•przyłączania - hybrydyzacji (annealing) starterów
(15 sek.-1 min.; 50-65C)
Temperatura ( C)
•wydłużania (elongacji) starterów (syntezy DNA) (68-75C)
95 3-5’
60’’
72
45
30’’
30’’
30’’
5-7’
60’’
30’’
4
30’’
20-40x
Czas
Reakcję przeprowadza się w specjalnym aparacie zwanym termocyklerem (ang.
thermal cycler), w którym programuje się temperaturę i czas trwania
poszczególnych etapów reakcji oraz liczbę cykli
Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego
doboru szeregu parametrów:
•dobór warunków samej reakcji PCR (temperatury, czas trwania
cykli, ilości cykli itp.) – czynniki fizyczne
•dobór odpowiednich starterów do reakcji amplifikacji
•dobór właściwych ilości składników mieszaniny reakcyjnej tj.:
stężenia dNTP, polimerazy, starterów, magnezu – czynniki
chemiczne
Warunki temperaturowe reakcji
Denaturacja
•Temperatura i czas trwania etapu denaturacji zależy od
rodzaju matrycowego DNA używanego do reakcji
•Dodatkowa denaturacja (wstępna – czyli przed pierwszym
cyklem reakcji PCR) - ogrzewanie DNA przez okres 3-5 min w
temp. 94-96C jest wystarczające do skutecznej denaturacji
genomowego DNA
Temperatura etapu przyłączania - hybrydyzacji
(annealingu) starterów
•jest najważniejszym czynnikiem wpływającym na
skuteczność i specyficzność reakcji PCR
•czas trwania tego etapu jest zależny od wielkości
starterów, ale zwykle nie przekracza 1 min
•temperatura przyłączania starterów powinna być o 5C
niższa niż obliczona temperatura topnienia starterów (Tm).
Zbyt niska temperatura powoduje, że startery przyłączają
się w niespecyficznych miejscach (na zasadzie niepełnej
komplementarności
Istnieje wiele wzorów na obliczenie temperatury topnienia starterów.
Do najprostszych, a zarazem najczęściej używanych należy wzór:
Tm = [4(G + C) + 2(A + T)] (C)
Temperatura i czas trwania wydłużania - elongacji
startera
•zależy od używanej polimerazy - zwykle optymalna
temperatura wynosi 72-75C (teoretyczna szybkość
przyłączania nukleotydów – syntezy DNA wynosi 100 nt/s)
•przyjmuje się jednak, że do syntezy fragmentów o
wielkości 1 kpz wymagany czas elongacji wynosi 1 min.
Temperatura elongacji startera c. d.
•obniżenie temperatury elongacji wpływa znacznie na szybkość
syntezy np. już przy 70C ilość wstawianych nukleotydów wynosi ok.
60 nt/s.
•obniżenie temperatury elongacji kosztem wydłużenia czasu jej trwania
jest korzystne np. wtedy, gdy wymagana jest większa dokładność w
syntezie nowej nici np. w reakcji cyklicznego sekwencjonowania lub
wówczas gdy amplifikowany fragment będzie klonowany do wektorów
ekspresyjnych. W takich przypadkach stosowane są temperatury 6068C i wydłużamy czas elongacji.
•Przy wysokiej temperaturze przyłączania starterów możliwe jest ograniczenie
etapów reakcji PCR do denaturacji i wspólnego etapu przyłączania i
wydłużania starterów.
Jest to tzw. dwustopniowy PCR
Ilość cykli w reakcji PCR
•wynosi od 20 do 50 i zależy głównie od początkowej ilości matrycowego DNA.
Dla małej ilości docelowego DNA (ok. 50 cząsteczek) sugeruje się 40- 50 cykli
•teoretyczna wydajność reakcji po “n” cyklach wynosi 2n dwuniciowych,
specyficznych cząsteczek DNA
•rzeczywista wydajność jest niższa (mniejsza wydajność reakcji np. przez spadek
ilości dNTP, zmniejszenie aktywności polimerazy).
Składniki reakcji PCR
•matrycowe DNA
•startery
•termostabilna polimeraza DNA
•odpowiedni bufor reakcyjny
•jony magnezu
•mieszanina czterech
dezoksyrybonukleotydów (dNTP)
Parametry dobrego startera
•powinien być wysoko specyficzny dla danej sekwencji
Przy amplifikacji z użyciem całkowitego DNA nietrudno sobie wyobrazić, że
starter przyłączy się tylko do jednego miejsca. Prawdopodobieństwo
wystąpienia dwóch identycznych 20 nt starterów wynosi
420 czyli 1099511627776.
Oznacza to, że sekwencja danego startera występuje raz na 1012
nukleotydów.
Ze względu na wielkość genomów teoretycznie niemożliwe jest
występowanie dwóch takich starterów w genomie.
•obecność na 3’ końcu startera nieunikalnych sekwencji o długości 6-7 nt
objawia się występowaniem niespecyficznych produktów w reakcji PCR.
Pracując z DNA ssaków trzeba zawsze sprawdzać czy projektowany starter
nie wykazuje homologii z sekwencjami powtórzonymi typu Alu lub innymi
sekwencjami repetetywnymi. Należy również unikać homooligomerów (jak –
AAAAAA-) i dwunukleotydowych powtórzeń typu np. –ATATAT-.
Parametry dobrego startera
•długość primerów powinna wynosić około 20-30 zasad, a temp. ich
topnienia, która zależy od rodzaju i ilości nukleotydów od 45-65C
•opcjonalnie: jeśli amplifikowane produkty mają wielkość kilkuset pz
startery mogą być nieco krótsze (16-18 nt), dla fragmentów rzędu kilku
kpz startery powinny być dłuższe (24 i więcej nt)
•startery mogą zawierać zmodyfikowane nukleotydy, najczęstsze
modyfikacje to: znakowanie fluorochromami, biotyną, digoksgeniną czy
wbudowywanie tionukleotydów
Parametry dobrego startera
starter powinien zawierać około 50% par GC. Ilość GC wpływa na
temperaturę topnienia starterów, która nie może być większa niż
optymalna temperatura działania polimerazy
• wymóg co do proporcji GC/AT nie jest bezwarunkowy, gdyż np. dla
genomów o dużej zawartości par GC, czy miejsc bogatych w AT
niemożliwe jest jego spełnienie
• przyjmuje się że startery powinny zawierać ilość GC/AT podobną lub
wyższą niż amplifikowana matryca
•nie powinny tworzyć struktur typu szpilki do włosów
•nie powinny zawierać w części 3’ końcowej sekwencji
komplementarnych do samych siebie oraz do drugiego startera
Startery c. d.
•robocze stężenie każdego z primerów w mieszaninie reakcyjnej
wynosi od 0,2 - 0,4 M i stanowi
stosunku do ilości moli matrycy!
molowy nadmiar w
•stężenie 1M odpowiada ilości 1pmola startera w 1l roztworu
Bufor reakcyjny
•bufor reakcji PCR jest specyficzny dla danej polimerazy i zwykle jest
dostarczany razem z polimerazą
•stabilizuje pH mieszaniny reakcyjnej
•w buforze obecne są również jednowartościowe jony w postaci KCl,
ich standardowe stężenie wynosi ok. 50mM i umożliwia amplifikację
fragmentów o wielkości powyżej 500pz. Większe stężenie soli (70-
100mM) poprawia amplifikację fragmentów poniżej 500pz
Jony dwuwartościowe
•wszystkie polimerazy wymagają do działania dwuwartościowych
kationów, zwykle są to jony Mg+2, ale niektóre polimerazy działają
również po dodaniu jonów Mn+2
•ilość cząsteczek Mg+2 musi przewyższać ilość grup
fosforanowych obecnych w mieszaninie reakcyjnej ponieważ
zarówno wolne nukleotydy jak i startery wiążą jony Mg+2
•końcowe stężenie Mg+2 wynosi zwykle od 0,5 do 5 mM
Deoksynukleotydy (dNTP)
•stosowany mix dNTP powinien zawierać
nukleotydów dATP, dTTP, dCTP i dGTP
równe
ilości
czterech
•końcowe stężenie poszczególnych nukleotydów w mieszaninie
reakcyjnej wynosi zwykle od 200 do 250M (w objętości 50l jest to ilość
dNTP wystarczająca do syntezy ok. 6-6,5 g DNA)
•Wysokie stężenie dNTP (>4 mM) hamuje reakcję PCR prawdopodobnie
poprzez wiązanie jonów Mg+2.
•Przy amplifikacji krótkich fragmentów DNA (do 1 kpz) można używać
mniejszych ilości nukleotydów (0,5 pM-20 M)
Polimerazy DNA
Pierwszym enzymem używanym w reakcji PCR był
fragment Klenowa DNA Polimerazy I E. coli.
Nie jest to jednak enzym odporny na działanie wysokiej
temperatury i w każdym cyklu reakcji zdenaturowane
cząsteczki enzymu musiały być zastępowane nowymi.
Termostabilne Polimerazy DNA
•termostabilna polimeraza Taq
wyizolowana z Thermus aquaticus
(obecnie powszechenie dostępna jako
rekombinowana)
•polimeraza Taq i jej pochodne nie
posiadają aktywności egzonukleazy
3’5’ (tzw. sprawdzającej) - ilość
błędnie wstawianych nukleotydów jest
dość wysoka (większa niż w procesie
replikacji DNA) i wynosi 2 x 10-4 do 2 x
10-5.
•Produkty amplifikacji z użyciem
polimerazy Taq mają charakterystyczne
zakończenia
•Polimeraza Pfu (Pyrococcus
furiosus)
•charakteryzuje się bardzo niską
częstość wstawiania błędnych
nukleotydów (1.6x10-6-7x10-7)
•ze względu na aktywność sprawdzającą
wymaga ona dłuższego czasu działania
(ok. 1.5-2 min/kpz). Optymalna
temperatura działania to ok. 75C.
Polimeraza Pfu zachowuje 95%
aktywności po godzinnej inkubacji w
98C
•produkt PCR amplifikowany polimerazą
Pfu posiada tępe końce
•Polimeraza Tth (Thermus thermophilus)
•posiada zdolność odwrotnej transkrypcji tj. przepisywania
cząsteczek RNA o długości do 1000 nukleotydów na DNA, w
obecności jonów Mn+2. W obecności jonów Mg+2 jest
polimerazą DNA i amplifikuje cząsteczki DNA w reakcji PCR.
•Aktywność odwrotnej transkryptazy (RT) w podwyższonej
temperaturze jest bardzo pożyteczna, gdyż pozwala uniknąć
problemów związanych ze skomplikowaną budową przestrzenną
cząsteczek np. RNA
•Obecnie dostępna w postaci rTth (rekombinowanej) oraz rTth
DNA Polymerase, XL [XL (eXtra Long) PCR], która może
przepisywać DNA lub RNA długości powyżej 5 kpz
•Polimeraza Deep Vent (Pyrococcus species GB-D)
Deep Vent jest wyjątkowo stabilnym enzymem zarówno w
wysokiej (480 min. w temp. 100C) jak i niskiej temperaturze. Ma
zdolność do amplifikowania długich fragmentów DNA (do 14 kpz)
– dużą procesywność
Posiada aktywność sprawdzającą egzonukleazy. Amplifikacja
fragmentów o długości powyżej 2 kpz wymaga zawsze większej
ilości jonów magnezowych (powyżej 2mM).
•Long PCR Enzyme Mix
Mieszanki różnych polimeraz, np. Taq i Deep Vent, w
różnych proporcjach, tak aby zoptymalizować
amplifikację długich fragmentów (do 200 kpz!!!)
1 - 40 kb PCR fragment
2 - 35 kb PCR fragment
3 - 30 kb PCR fragment
4 - 25 kb PCR fragment
5 - 20 kb PCR fragment
Czułość reakcji PCR
•ilość matrycowego DNA potrzebna do PCR jest stosunkowo mała
(teoretycznie wystarczy jedna cząsteczka DNA).
Unikanie zanieczyszczeń w reakcji PCR
•Główną zasadą jaka powinna być spełniona to fizyczne
rozdzielenie etapów procedury przygotowania próbki i
reakcji PCR
•Zestaw plastików (końcówki pipet, próbówki) pipety
automatyczne powinny być używane tylko do
określonego przeznaczenia (izolacja lub PCR)
Podstawowe zastosowania
Biologia molekularna:
•uzyskiwanie dużych ilości DNA np. do klonowania
•znakowanie fragmentów DNA
•cykliczne sekwencjonowanie
•analizy ekspresji genów (transkryptomu komórki)
Medycyna
•diagnostyka np. chorób, polimorfizmu
Kryminalistyka i paleobiologia
•powielanie DNA ze śladowych ilości materiału będącego matrycą do badań ze
•identyfikacja organizmów – genotypowanie
Wiele innych ..........................
Wybrane odmiany techniki PCR
•Hot Start PCR – poprawia specyficzność amplifikacji
fragmentu DNA
•w reakcji PCR tempreatura jest głównym czynnikiem warunkującym
specyficzność reakcji. W reakcji HotStart PCR przynajmniej jeden z substratów
(Polimeraza, Mg+2, lub dNTP) jest nieobecny w mieszaninie reakcyjnej i dopiero po
osiągnięciu wysokiej temperatury brak ten jest uzupełniany.
•Opóźnienie reakcji można osiągnąć różnymi drogami. np. przez
polimerazy do reakcji pod koniec początkowej denaturacji
dodanie
• inaktywacji polimerazy przez blokowanie jej centrum aktywnego przeciwciałami
lub innymi ligandami. Ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej w czasie wstępnej
denaturacji powoduje denaturację termolabilnych substancji (przeciwciał,
ligandów) i uwolnienie polimerazy.
Asymetryczny PCR
•w reakcji używany jest jeden starter lub dwa w nierównych
stężeniach
•amplifikacji ulega tylko jedna nić
•Stosowany np. w reakcji cyklicznego sekwencjonowania
DNA
•Multipleksowy PCR
Metoda ta polega na amplifikacji kilku regionów DNA w czasie jednej
reakcji PCR. Reakcja ta wymaga użycia kilku par starterów o podobnej
temperaturze topnienia tak by można było użyć jeden profil
temperaturowy reakcji.
Multipleksowy PCR jest wykorzystywany np. do identyfikacji osobników,
gatunków czy diagnostyki chorób genetycznych.
•qPCR (ilościowy PCR, Real-Time PCR)
Reakcja PCR z wykrywaniem produktów w czasie rzeczywistym.
Intensywność świecenia jest skorelowana z ilością odłączanego
znacznika a zatem ilością powstającego produktu.
•Direct PCR (bezpośredni PCR) – matrycowe DNA pochodzi
bezpośrednio z kolonii bakteryjnej (kolonijny PCR), tkanki, gleby, (bez
etapu izolacji DNA)
Download
Random flashcards
123

2 Cards oauth2_google_0a87d737-559d-4799-9194-d76e8d2e5390

ALICJA

4 Cards oauth2_google_3d22cb2e-d639-45de-a1f9-1584cfd7eea2

Motywacja w zzl

3 Cards ypy

Pomiary elektr

2 Cards m.duchnowski

słowka

2 Cards kksenia.kot1997

Create flashcards