Determinacja płci zwierząt

advertisement
Dr Marta Polańska
Dr hab. Piotr Bębas
Jak determinowana jest płeć?
Zwierzęta są organizmami rozdzielnopłciowymi lub obojnakami. W pierwszym przypadku
poszczególne osobniki danego gatunku najczęściej są albo samicami, produkujacymi komórki
jajowe na terenie jajników, albo samcami wytwarzającymi plemniki w jądrach. Omawiane
różnice fenotypu między płcią żeńską i męską określamy jako dymorfizm płciowy. Obojnaki
posiadają oba typy gonad i dzięki temu produkują zarówno plemniki jak i jaja. U niektórych
gatunków dymorfizm płciowy może mieć inny charakter i jak w przypadku C. elegans obok
samców występują obojnaki. Płeć osobnika u gatnków wykazujących dymorfizm płciowy
ustala się w procesie zwanym determinacją płci. Jego przebieg może zostać określony w
czasie zapłodnienia i być konsekwencją odziedziczenia przez zygotę określonej kombinacji
genów. W takim przypadku mówimy o genotypowej determinacji płci. W sytuacji gdy płeć
osobnika ustala się po zapłodnieniu i jest konsekwencją wpływu czynników z otoczenia
(temperatury, obecności osobników określonej płci, czy zagęszczenia populacji) mamy do
czynienia ze środowiskową determinacją płci.
Genotypowa determinacja płci może odbywać się na kilka różnych sposobów. U ssaków,
związana jest z obecnościa chromosomu Y, który do zygoty zostaje wprowadzony przez
plemnika. Samce ssaków wytwarzają bowiem dwa rodzaje gamet, które obok haploidalnego
zestawu autosomów (identycznego u obu płci, zaznaczanego skrótowo A) zawierają jeden z
chromosomów płci: Y lub X. Ze względu na możliwość wytwarzania dwóch rodzajów
plemników, a więc XA i YA, płeć męską u ssaków określa sie mianem heterogametycznej. Z
kolei samice produkują tylko jeden rodzaj jaj, które zawierają zestaw chromosomów XA, stąd
płeć żeńska ssaków zwana jest homogametyczną. Powstająca w wyniku zapłodnienia zygota
może posiąść jedną z dwóch kombinacji chromosomów: XXAA, co determinuje żeńską płeć
rozwijającego się z niej organizmu lub XYAA, co z kolei określa męski typ zarodka.
Obserwacje anomalii związanych z nietypową liczbą i różnymi kombinacjami w
występowaniu chromosomów płci u ssaków wykazały, że obecność chromosomu Y zawsze
determinuje rozwój organizmu męskiego, a jego brak jest wystarczający do rozwoju samicy.
U ptaków determinacja płci ma bardzo podobny charakter z tym, że heterogametyczną jest w
tym przypadku płeć żeńska (zestaw chromosomów płci samca oznacza się ZZ, a samicy ZW).
Inne mechanizmy genotypowej determinacji płci spotykamy u owadów. Przykładowo u.
muchy domowej, nie stwierdza się typowych różnic morfologicznych między autosomami, a
chromosomami płci. U tych zwierząt płeć osobnika określana jest jakością alleli jednego z
genów. Samice są mianowicie homozygotami (m/m), a samce heterozygotami (M/m). Jednak
u najważniejszego z punktu widzenia badań molekularnych gatunku owada – D.
melanogaster, determinacja płci ma zupełnie inny charakter. Występowanie chromosomu Y
jest niezbędne u samca do przebiegu spermatogenezy, jednak jego obecność nie jest
czynnikiem determinującym płeć. To czy osobnik rozwinie się w samca czy samicę zależy od
stosunku liczbowego zespołu autosomów (A) do chromosomów X w komórkach ciała (należy
zaznaczyć, że w haploidalnym zespole oznaczanym A znajdują się 3 autosomy). Jeżeli
wartość parametru X:A jest równa 0,5 (XY:AA) to mamy do czynienia z samcem, natomiast
gdy osiąga wartość 1,0 (XX:AA) osobnik jest samicą. Ze względu na fakt, iż osobniki
triploidalne D. melanogaster są płodne, możliwe są także inne kombinacje zespołu
chromosomów u ich potomstwa. Prawdopodobny jest więc układ, gdzie X:A ma wartość
niższą od 0,5, pomiędzy 0,5 a 1,0 i powyżej 1,0. Owady, u których stosunek X:A ma wartość
równą 0,67 zwane są interseksualnymi. Są to zwierzęta mozaikowe tzn. ich ciała budują
tkanki charakterystyczne dla samców i samic. Zjawisko to jest niepodważalnym dowodem na
autonomię przebiegu determinacji płci na poziomie pojedynczych komórek,
charakterystyczną dla D. melanogaster, jak i wielu innych gatunków owadów.
Kolejny mechanizm determinacji płci spotykamy u błonkówek np. pszczół i os. Polega on na
rozwoju samic z zapłodnionych jaj, natomiast samców z niezapłodnionych, co określamy jako
arrhenotokię. W efekcie komórki linii somatycznej, jak i płciowej męskiego osobnika takich
owadów mają haploidalny zestaw chromosomów, co z kolei diametralnie zmienia przebieg u
nich spermatogenezy.
Jeszcze inny model oparty o wpływ liczby chromosomów na determinację płci spotykamy w
przypadku C. elegans. Jest on niemal identyczny z obserwowanym u D. melanogaster,
niemniej wykazuje sobie tylko właściwe cechy. Rozwój osobnika męskiego bądź
hermafrodyty zależy od stosunku liczby chromosomów X do zespołów autosomów. U
samców wartość X:A jest równa, bądź mniejsza od 0,5. Z kolei u osobników
hermafrodytycznych stosunek ten zawiera się między 0,75 i 1,5. Inaczej niż w przypadku D.
melanogaster osobniki u których X:A jest równy 0,67 są samcami, a nie postaciami
interseksualnymi. Sytuacja ta jest spowodowana omawianym wcześniej zjawiskiem efektu
grupy. Inaczej więc niż w przypadku D. melanogaster u C. elegans nie obserwujemy daleko
posunietej autonomii w determinacji płci poszczególnych komórek. U nicienia brak jest także
chromosomu Y, a haploidalny zespół chromosomów w plemnikach ma postać XA lub OA
(gdzie O oznacza brak chromosomu płci).
W procesie determinacji, a następnie rozwoju płci podstawową rolę pełni początkowy sygnał,
który wpływa na aktywność genów regulatorowych, co z kolei określa przebieg różnicowania
płciowego. Badania prowadzone na modelowych organizmach, pozwoliły ustalić, że geny
zaangażowane w ten proces tworzą rodzaj hierarchicznego systemu w którym wyróżnia się
trzy równolegle aktywowane szlaki odpowiedzi znane jako: mechanizm kompensacyjny,
różnicowanie płci somatycznej i różnicowanie płci komórek rozrodczych.
Mechanizm kompensacyjny odpowiada za regulację poziomu transkrypcji
genów położonych na chromosomach X.
Wiadomo, że na chromosomie X zlokalizowanych jest szereg genów, które nie mają związku
z determinacją płci, a ich produkty pełnia istotną rolę w metabolizmie. Należy się
spodziewać, że liczba kopii tych genów będzie inna u samicy (lub osobnika
hermafrodytycznego) niż u samca, co jest spowodowane różną liczbą posiadanych
chromosomów X. Problem tych dysproporcji może wydawać się szczególnie poważny gdy
uświadomimy sobie, że w DNA chromosomu X u D. melanogaster zapisana jest 1/5
informacji jaka znajduje się w całym genomie tego owada. Analizy efektów jakie wywołują
utraty lub duplikacje fragmentów chromosomów u osobników diploidalnych wykazały, że
haploidalość lub triploidia obejmująca zaledwie kilka procent spośród wszystkich genów
organizmu, powoduje jego poważne uszkodzenia lub jest letalna. Rodzi się więc pytanie jak
organizmy radzą sobie z nierównocenną dystrybucją informacji genetycznej u osobników obu
płci? Okazuje się, że różne grupy zwierząt znalazły odmienne sposoby, które pozwalają im na
zmniejszenie tych dysproporcji. Zostały one wspólnie nazwane mechanizmem
kompensacyjnym.
Saaki osiągneły ten cel poprzez inaktywację jednego z chromosomów X (oznacznego jako
Xi) w niemal wszytkich komórkach u samic. W jądrze interfazowym chromosom taki
widoczny jest on jako skupisko heterochromatyny, zwane ciałkiem Barra lub chromatyną
płciową. Mimo silnej kondensacji DNA chromosomu Xi ulega replikacji podczas mitozy,
niemniej stan jego inaktywacji przenosi się na komóeki potomne. U osobników
aneuploidalnych wszystkie z chromosomów X, poza jednym są inaktywowane, natomiast u
XO żaden. Proces ten odbywa się na bardzo wczesnym etapie rozwoju (stadium blastocysty) i
wydaje się przypadkowo dotyczyć chromosomu pochodzącego od ojca lub matki.
Udowodniły to badania przeprowadzone na myszach będących heterozygotami względem
alleli genu kodującego ubarwienie sierści, który jest zlokalizowany na chromosomie X.
Osobniki takie są łaciate, co świdczy o aktywności genów pochodzenia tylko ojcowskiego lub
tylko matczynego w różnych obszarach skóry. Nieliczne odstępstwa od tej reguły pochodzą z
obserwacji komórek wchodzących w skład endodermy u gryzoni i komórek somatycznych u
torbaczy, w których inaktywacji ulega głównie chromosom X pochodzenia ojcowskiego.
Inaktywacja chromosomu X związana jest z obecnością tnaskryptu oznaczanego Xist, który
wykazuje cechy charakterystyczne dla mRNA, ale nie ulega translacji. Kodujący go gen
zlokalizowany jest na chromosomie X, w jego środkowej części zwanej centrum
inaktywacyjnym chromosomu X, albo w skrócie Xic (ang. X-inactivation center). W
początkowym okresie rozwoju transkrycja Xist zachodzi na terenia obu chromosomów X
jednak wkrótce ulega ona wyciszeniu na Xa (aktywny chromosom X) utrzymując się na
wysokim poziomie w przypadku Xi. Powstające w jej wyniku cząsteczki RNA nie opuszczają
jądra komórkowego tylko rozchodzą się wzdłuż całego inaktywowanego chromosomu i
pokrywają go. Przemieszczaniu się transkryptów od centrum inaktywacyjnego towarzyszy
wyciszanie aktywności prawie wszystkich genów Xi z wyjątkiem tych, które w liczbie dwóch
kopii konieczne są do prawidłowego funkcjonowania samicy. Regulacja ekspresji Xist
zarówno na Xi jak i Xa związana jest z obecnością antysensownego transkryptu Tsix, który
jest kodowany w obszarze Xic obejmującym także całą sekwencję genu Xist. Wysoki poziom
ekspresji Tsix na tym chromosomie, który ma zostać aktywny, powoduje represję Xist, a
odwrotnie w przypadku chromosomu, który ma ulec inaktywacji, wyciszenie transkrypcji Tsix
powoduje gromadzenie się transkryptu Xist, co prowadzi do sukcesywnego wyłączania
ekspresji genów na Xi. Procesowi temu towarzyszy postępująca metylacja DNA, która
aktywuje ekspresję Xist.
Istnieje conajmniej kilka hipotez tłumaczących sposób w jaki Xist i Tsix oddziałują na siebie
prowadząc do wykształcenia fenotypu komórek, w których aktywny jest tylko jeden
chromosom X. Najbardziej trafną wydaje się być ta, która zakłada możliwość tworzenia
kompleksów Xist/Tsix dzięki wystepowaniu obszarów komplementarnych miedzy oboma
cząsteczkami. Jak się wydaje, może to powodować degradację powstającego dwuniciowego
RNA lub prowadzi do zakrycia obszarów Xist, które są szczególnie istotne w inaktywacji
chromosomu. Podobnie molekularny mechanizm działania transkryptu Xist nie jest znany,
istnieją jednak przypuszczenia, że jego wpływ na tworzenie heterochromatyny może odbywać
się poprzez aktywację metylacji histonów oraz zwiększenie aktywności deacetylaz w Xi.
Mechanizm kompensacyjny u D. melanogaster zwany jako samcza hipertranskrypcja (ang.
male hypertranscription) inaczej niż u ssaków związany jest z dwukrotnym zwiększeniem
aktywności transkrypcyjnej genów zlokalizowanych na chromosomie X. Jest to możliwe
dzięki dużej liczbie wzmacniaczy działających w pozycji cis na położone blisko geny oraz
wiąże się z wpływem czynników transkrypcyjnych działających w układzie trans. Spośród
nich majważniejsze są kodowane przez grupę kilku autosomalnych genów określanych jako
male-specific lethal. Mutacje powodujące utratę funkcji tych genów, zawsze kończą się
śmiercią osobników XY. Dzieje się tak w konsekwencji niewystarczającej aktywności
transkrypcyjnej na terenie chromosomu X. Białka MSL (MSL1, MSL2, MSL3, MOF i MLE)
w bardzo dużej ilości łączą się bezpośrednio z sekwencjami wspomnianych wzmacniaczy,
działających w pozycji cis, aktywując ekspresję położonych tam genów. Jedno z nich,
oznaczane jako MLE (ang. maleless), wykazuje właściwości helikazy, która ma zdolność
rozkręcania spiral DNA i RNA. Dzięki niemu struktura męskiego chromosomu X jest
zdecydowanie luźniejsza od tej jaką stwiedza się w przypadku żeńskiego X. Dodatkowo u
samców obserwuje się bardzo bogatą acetylację histonów H4 w pozycji 16 (położenie lizyny),
na obszarze calego chromosomu X, za sprawą acetylotransferazy MOF, co jak wiadomo
zmniejsza siłę oddziaływań między histonami oraz stabilność struktury nukleosomu. Każda ze
wspomnianych zmian struktury chromatyny zwiększa dostępność obszarów regulatorowych
dla czynników transkrypcyjnych, tym samym może zwiększać poziom ekspresji genów.
Zrozumienie mechanizmu hipertranskrypcji obserwowanej u samców wymaga także
prześledzenia aktywności genów w obrębie chromosomów X u samic. Wiadomo bowiem, że
w proces ten zaangażowany jest produkt genu regulatorowego zwanego Sxl (ang. Sex-lethal),
który jest usytuowany bardzo wysoko w hierarchii systemu odpowiadającego za determinację
płci u D. melanogaster. Jego rola w mechanizmie kompensacyjnym nie jest w pełni jasna.
Wydaje się, że obecność białka SXL u samic zmienia przebieg składania transkryptu msl2 –
produktu jednego z genów male-specific lethal. Powstające w efekcie mRNA nie ulega
translacji, a przy braku białka MSL-2 niemożliwa jest aktywacja transkrypcji genów na
poziomie obserwowanym u samców. Istnieją również dowody, że sexlethal nie działa na premRNA lecz dojrzały transkrypt mls2, przyłączając się do jego 5’UTR oraz 3’UTR i w ten
sposób powoduje represję jego translacji. Niezależnie od sposobu w jaki u samic realizowana
jest funkcja genu Sxl wiadomo, że ma ona postać regulacji negatywnej. Z kolei u samców
gdzie nie stwierdza się obecności SXL, białko MSL-2 jest produkowane bez przeszkód i wraz
z pokrewnymi czynnikami aktywuje ekspresję genów chromosomu X. W mechanizmie
kompensacyjnym D. melanogaster kluczowa rolę odgrywaja także swoiste transkrypty,
podobnie jak ma to miejsce w przypadku Xist u ssaków. U muchy na chromosomie X
położone są dwa bardzo charakterystyczne geny – rox1 i rox2. Kodują one duże cząsteczki
RNA, które podlegają składaniu, a na ich terenie nie stwierdza się otwartych ramek odczytu,
tak więc nie ulegaja one translacji. Transkrypty rox1 i rox2 nie opuszczaja jądra, tylko wiążą
się z białkami MSL, co ochrania je przed degradacją. Oddziaływanie to ma także charakter
pozytywnej regulacji w przypadku stabilizowania kompleksów MSL, które nie powstają i nie
mogą pełnić swej funkcji przy braku przynajmniej jednego rodzaju RNA rox. Powszechnie
akceptowany model mechanizmu kompensacyjnego zakłada, że białka grupy MSL associują
na chromosomie X w obszarze genów roX, wychwytując powstające tam transkrypty.
Następnie przemieszczają się do innych obszarów chrmosomu, a podczas tej wedrówki
dojrzewają, co ponownie wiąże się z wychwytywaniem transkryptów rox. Wreszcie osiagają
swe przeznaczenie, w miejscach regulatorowych genów, gdzie powodują przemodelowanie
chromatyny wpływające na zwiększenie jej aktywności transkrypcyjnej.
Mechanizm kompensacyjny przybiera jeszcze inny charakter u C. elegans. Zmniejszeniu do
połowy ulega poziom ekspresji genów zlokalizowanych na chromosomach X u osobników
hermafrodytycznych tego gatunku. W proces zaangażowana są dwie grupy genów. Pierwsza z
nich sdc (ang. sex determination and dose compensation) obejmuje geny (sdc-1, sdc-2 i sdc-3)
kodujące białka odpowiedzialne za koordynację przebiegu różnicowania płci oraz regulację
mechanizmu kompensacyjnego, druga grupa dcd (ang. dosage compensation dumpies) jest
jedynie zaangażowana w mechanizm kompensacyjny (dpy-21, dpy-26, dpy-27, dpy-28 i dpy30). Mutacje w każdym z tych genów powodują podwyższenie poziomu transkrypcji w
obrębie chromosomów X u hermafrodytów, a z wyjątkiem dpy-21 i sdc-1, także bardzo
wysoką śmiertelność mutantów. Wspomnianych efektów (z wyjątkiem mutacji w dpy-30)
nigdy nie stwierdza się u samców (XO), które mimo mutacji we wspomnianych genach
zawsze charakteryzuje dziki fenotyp. W omawiany proces zaangażowane są jeszcze produkty
dwóch innych genów, mix-1 (ang. mitosis and X-associated) oraz xol-1 (ang. XO lethal).
Białko MIX-1 ma istotne znaczenie w procesie segregacji chromosomów podczas podziałów
komórkowych, natomiast XOL-1 odgrywa nadrzędną rolę w determinacji i różnicowaniu się
męskiej płci. Działanie mechanizmu kompensacyjnego polega na tworzeniu wielobiałkowych
kompleksów, które wchodzą w fizyczny związek z chromosomami X. Spośród nich kluczową
rolę odgrywa białko SDC-2, które jak się sądzi odpowiada za rozpoznawanie chromosomu,
do którego mają przyłaczyć się elekemty kompleksu oraz odpowiada za samą ich asocjację.
SDC-2 także jako jedyne może wiązać się z chromosomem bez obecności innych czynników.
Po jego przyłaczeniu i stworzeniu pary z SDC-3 do powstałego kompleksu dołączają jego
pozostałe elementy: DPY-26, DPY-27, DPY-28, MIX-1 oraz SDC-1. Należy zaznaczyć, że
bez SDC-2, określanego także osiowym czynnikiem inicjującym, żadne z białek DPY nie
łączą się ze sobą, nie są w stanie tworzyć kompleksu, ani wejść w jakiekolwiek interakcje z
chromatyną. Pomiędzy poszczególnymi białkami istnieją ścisłe zależności, które wyrażają się
koniecznością występowania jednych, aby inne z nich mogły spełnić swe funkcje.
Przykładowo, do tego, aby z chromosomem mogło związać się MIX-1, w realizacji procesu
kompensacyjnego, niezbędna jest obecność DPY-27. Z kolei asocjacja DPY-27 z
chromosomem wymaga białka DPY-30, które samo nie wchodzi w skład omawianego
kompleksu, natomiast wydaje się wpływać także na zwiększenie metylacji histonu H3 w
nukleosomach, co wpływa na wyciszenie ekspresji genów. Szczególną pozycję w
charakteryzowanych relacjach odgrywa produkt genu xol-1, który w odpowiedzi na sygnał
jakim jest stosunek X:A, reguluje poziom ekspresji genów znajdujących się na chromosomie
X. Białko XOL-1 odpowiada za inicjację rozwoju samców poprzez represję aktywności
wszystkich trzech genów sdc oraz genów z grupy dcd. Z kolei bardzo niska ekspresja xol-1 u
osobników hermafrodytycznych, umożliwia realizację programu kompensacji.
Różnicowanie płci somatycznej u ssaków
Rozwój ssaków zaczyna się od stadium, które nie jest zróżnicowane płciowo i można go
podzielić na dwa etapy. Pierwszy dotyczy czasu, gdy z zawiązków gonad zaczną rozwijać się
jądra bądź jajniki i określany jest jako pierwotne różnicowanie płci, albo inaczej
różnicowanie się pierwszorzędowych cech płciowych. Drugim etapem natomiast jest
różnicowanie się drugorzędowytch cech płciowych, które zależy od aktywności
hormonalnej powstających gonad. Rozwój normalnego zarodka męskiego u ssaków zależy od
sygnału pochodzącego z chromosomu Y. Wstępne badania wykazały, że wspomnianym
elementem sygnałowym u myszy jest czynnik Tdy (ang. testis determining gene on the Y), a u
człowieka TDF (ang. testis determining factor) – często stosuje się dla nich wspólne
oznaczenie TDF/Tdy. Zlokalizowano je na chromosomach Y, jednak dla uściślenia
używanych w literaturze sformułowań, Tdy i TDF nie są genami, ani ich produktami, lecz
określeniami stosowanym dla opisu źródła sygnału, który determinuje rozwój męskiej
gonady. Jak udowodniły badania prowadzone na osobnikach mozaikowych myszy tzw.
chimerach, które składają się z dwóch typów komórek zawierających w zespole
chromosomów XX, jak i XY, Tdy nie ma wpływu na przebieg gametogenezy, a więc nie
określa tego czy osobnik będzie produkował plemniki czy jaja. Stwierdzono bowiem, że u
chimer mogą rozwijać się żeńskie komórki płciowe, w których kariotypie stwierdzamy XY.
Wynik ten jednoznacznie wskazuje brak związku Tdy z różnicowaniem się męskich komórek
płciowych. Z kolei stwierdzenie, iż spermatogonia mogą powstawać u osobników
pozbawionych chromosomu Y podkreśliły brak jakiejkolwiek roli Tdy, także w determinacji
męskiego kierunku rozwoju komórek płciowych. W związku z tym uznano, że jedynym
potencjalnym obiektem oddziaływania omawianego czynnika muszą być komórki
somatyczne. Jak się okazało są nimi płodowe komórki podporowe jąder (w przyszłości
komórki Sertoliego), a do ich różnicowania niezbędny jest chromosom Y niosący ze sobą
Tdy. W czasie rozwoju wpływają one na inne komórki z najbliższego otoczenia, poprzez
opisany wcześniej mechanizm zwany efektem grupy i kierują je na szlak różnicowania
konieczny do wykształcenia jądra. W ten sposób, niezależnie od posiadanego zespołu
chromosomów, powstają dodatkowe dwie linie komórkowe – dająca początek komórkom
śródmiąższowym, produkującym męskie hormony steroidowe oraz komórkom tkanek
łącznych, które formują zrąb jądra.
Ostateczne ustalenie lokalizacji TDF/Tdy na chromosomie Y oraz określenie czy jest on
pojedynczym genem czy może ich grupą, a także jaki jest mechanizm jego działania stało się
możliwe dzięki badaniom osobników wykazujących anomalie chromosomowe.
Prawdopodobne jest bowiem, że podczas rekombinacji, która ma miejsce w czasie mejozy, u
samców może dojsć do przeniesienia fragmentu chromosomu Y, zawierającego TDF/Tdy, na
chromosom X. W efekcie gdy plemnik, który odziedziczy w wyniku segregacji
chromosomów taki X i zapłodni komórkę jajową, to rozwijający się osobnik, mimo żeńskiego
zespołu chromosomów płci będzie rozwijał się w osobnika męskiego. Z kolei osobnik męski
powstający z zygoty, do której plemnik wprowadził chromosom Y bez TDF/Tdy, będzie miał
fenotyp żeński. Zjawisko takie spotykamy znacznie częściej u ludzi niż u myszy, co z kolei
tłumaczy położenie locus omawianego czynnika na chromosomach Y u obu gatunków. Na
chromosomach płci znajduje się obszar pseudoautosomalny (ang. pseudoautosomal region –
PAR) w obrębie którego X i Y są homologiczne, a co za tym idzie podczas mejozy ulega on
procesowi crossing-over. U ludzi strefa obejmująca TDF znajduje się tuż przy obszarze PAR,
co w sporadycznych przypadkach nieprawidłowego przebiegu rekombinajcji, może
spowodować przeniesienie omawianego czynnika na chromosom X. Przedstawiony przebieg
zdarzeń początkowo uznawany za hipotetyczny, został jednak szybko poparty dowodami
pochodzącymi z analiz miejsc podlegających crossing-over u ludzi z anomaliami
chromosomowymi. Wykazano, że TDF zlokalizowany jest na krótkim ramieniu chromosomu
Y i znajduje się na odcinku DNA o długości ok. 35 kb. W przypadku myszy, zjawiska
przeniesienia fragmentów chrmosomu Y z Tdy na X praktycznie nie spotykamy, gdyż u tego
gatunku Tdy oraz PAR zajmują się w bardzo dużej odległości od siebie. Niemniej znane są
przypadki osobników myszy z aberacjami chromosomowymi, których efekt jest analogiczny z
opisanym u człowieka, jednak zmiany te mają przynajmniej częściowo inne podłoże. Opisano
bowiem osobnika męskiego posiadającego normalny zestaw chromosomów płci, a więc XY,
który przekazywał swemu potomstwu czynnik określany jako Sxr, powodujący zamianę płci
(ang. Sex-reversed). Jak się okazało, u samca takiego nastąpiła duplikacja fragmentu
obejmującego Tdy i w ten sposób powstał Sxr, który usytuował się tuż przy obszarze PAR.
Produktami spermatogenezy u takiego samca były między innymi plemniki posiadające
chromosom X z Sxr (czyli funkcjonalnym Tdy). Translokacja tego czynnika na X odbywała
się w sposób analogiczny z opisanym wcześniej dla TDF u człowieka. Osobnik powstały po
zapłodnieniu jaja plemnikiem z chromosomem X, niosącym Srx, był pod względem fenotypu
samcem, jednak o kariotypie XX.
Na początku lat 90 zeszłego wieku wykazano, że na opisanym wczesniej fragmencie
chromosomu Y o długości 35 kb, niosącym czynnik TDF, znajduje się tylko jeden gen.
Wkrótce potwierdzono jego duże podobieństwo do sekwencji lokalizowanej na obszarze
mysiego Tdy. Od tego momentu locus TDF/Tdy opisywał położenie genu nazwanego u
człwieka SRY, a u myszy Sry (ang. sex-determining region of Y).
Sry determinuje płeć męską komórek somatycznych jąder oraz odpowiada
za przebieg różnicowania się pierwszorzędowych cech płciowych u ssaków
Ostatecznym dowodem na udział Sry w determinacji płci somatycznej było doświadczenie
jakie wykonano z wykorzystaniem myszy transgenicznych. Do zapłodnionych jaj
wprowadzono fragment genomowego DNA o długości 14 kb, który zawierał tylko
funkcjonalny gen Sry. Następnie analizowano rozwój tych zarodków, biorąc pod uwagę
osobniki o kariotypie XX. Okazało się, że u części z nich rozwinęły się jądra z typowo
wykształconymi kanalikami nasiennymi oraz wszystkimi charakterystycznymi komórkami –
Sertoliego, Leydiga i budującymi zrąb gonady. Wynik opisanego eksperymentu stał się
argumentem jednoznacznie potwierdzającym tezę o nardzędnej roli Sry, a co za tym idzie
chromosomu Y, w determinacji i rozwoju płci męskiej u ssaków.
Powstaje jednak pytanie, w jaki sposób Sry pełni swą funkcję wpływając na powstawanie
pierwszorzędowych cech płciowych? Jak przekonamy się za chwilę, odpowiedź na to pytanie
nie jest prosta, gdyż charakterystyka współzależności między ekspresją Sry i innych genów w
wielu przypadkach jest wynikiem dedukcji prowadzonych w oparciu o faragmentaryczne
dane eksperymentalne.
Analiza molekularna białka Sry wykazała, że jest ono czynnikiem regulującym transkrypcję,
zawierającym w swej strukturze domenę HMG, która określa jego przynależność do grupy
HMG (ang. high mobility group), obejmującą szereg białek niehistonowych wiążących DNA.
Sry rozpoznaje i przyłącza się do obszarów o ściśle określonych sekwencjach
(A/TAACAAT/A) i co bardzo istotne, poprzez domenę HMG wpływa na zagięcie nici
chromatynowej powodując, że zbliżają się do siebie znacznie oddalone elementy
regulatorowe działające w pozycji cis. Aktywność transkrypcyjna Sry jest ograniczona
zaledwie do dwóch dni w okresie wczesnego rozwoju zarodkowego myszy. Już na tej
podstawie łatwo wywnioskować, że białko Sry jest czynnikem sygnałowym, indukującym
cykl zdarzeń, których realizacja w postaci wykształcenia męskiej gonady, wymaga znacznie
dłuższego czasu. Faktycznie Sry lokalizuje się na szczycie hierarchicznego systemu, w
którym ekspresja kolejnych genów zależy od obecności białek regulatorowych. Te z kolei są
produktami genów aktywnych na wyższych pietrach wspomnianego systemu. Pierwszym
elementem szlaku, na którym działa Sry jest Dax1 (ang. dosage sensitive sex-reversal-adrenal
hypoplasia congenita-critical region of the X chromosome, gene 1), gen zlokalizowany na
chromosomie X. U myszy, niezależnie od płci, moment rozpoczęcia jego ekspresji zbiega się
w czasie z aktywnością Sry u samców, która ma miejsce począwszy od 11 doby po
zapłodnieniu. Wtedy też ujawnia się rola białka Sry, które działa jako represor transkrypcji
Dax1, szybko wyłączając jego ekspresję. Oczywiście u samic, ze względu na brak Sry,
aktywność Dax1 nie jest hamowana i utrzymuje się na wysokim poziomie, co prowadzi do
włączenia szlaku rowojowego jajników. Wkrótce po zainicjowaniu aktywności
transkrypcyjnej Sry, u samców myszy obserwuje się wzrost aktywności kilku genów
autosomalnych, na początku Sox9 (ang. Sry-related HMG box, 9), a w dalszej kolejności Wt1
(ang. Wilm’s-tumor-associated gene 1), Sf1 (ang. steroidogenic factor 1) i Amh (ang. antiMüllerian hormone). Należy jednak pamiętać, że zarówno Wt1, Sf1, jak i Sox9 są
eksprymowane na niskim poziomie jeszcze w niezróżnicowanych komórkach gonad, zarówno
u samców jak i samic. W oparciu o analizy budowy promotorów każdego z tych genów oraz
ich aktywność transkrypcyjną w tkankach hodowanych in vitro, storzono model, który
obrazuje schemat zdarzeń, które jak się sądzi, mają miejsce w czasie determinacji płci
komórek somatycznych gonad u ssaków. Wczesna ekspresja Sf1 i Wt1 prawdopodobnie
wpływa na aktywację Sry, co w konsekwencji prowadzi do zwiększenia poziomu transkrypcji
samego Sf1, jak i Sox9 w płodowych komórkach podporowych, aż do poziomu wymaganego
dla rozwoju jąder. Rola Sf1 w omawianym systemie jest dość złożona. Koduje on sierocy
receptor jądrowy, który pełni kluczową rolę w regulacji szlaku rozwojowego gonad i
nadnerczy oraz reguluje biosyntezę steroidów u samców. Istnieją dowody świadczace o
bezpośredniej, pozytywnej regulacji ekspresji Sry przez Sf1. Informacje te pochodzą z badań
prowadzonych na komórkach owadzich z wprowadzonym konstruktem, w którym promotor
Sry podłączono do genu reporterowego. Następnie komórki te kotransfekowano wektorem z
genem Sf1 i jak się okazało, powstające w tym układzie białko Sf1, aktywowało transkrypcję
genu reporterowego. Niestey zależności tej nie potwierdzono w warunkach in vivo, a więc na
terenie komórek różnicujacych się jąder. Troche inne światło na rolę Sf1 w determinacji płci
rzucają analizy prowadzone na myszach z mutacją w tym genie. U osobników
homozygotycznych posiadających niefunkcjonalne allele Sf1, najwcześniejsze etapy rozwoju
niezróżnicowanych zawiązków gonad (tzw. grzebieni płciowych) przebiegają bez
jakichkolwiek zakłóceń. Dopiero od momentu gdy incjowany jest proces tworzenia jąder bądź
jajników, ulegają one całkowitej degeneracji. Obserwacja ta sprawiła, że Sf1 uznany został za
jeden z elementów niezbędnych do wytworzenia środowiska, w którym wyrazi się rola Sry.
Podobne znaczenie wydaje się mieć WT1, czynnik transkrypcyjny, z zaopatrzoną w palce
cynkowe domeną wiążącą DNA, który obok swej funkcji na terenie grzebieni płciowych
odgrywa też kluczową role w czasie rozwoju nerek. Sf1 i Wt1 nie są więc bezpośrednio
zaagażowane w determiację płci, ale ich udział jest konieczny w kształtowaniu
biochemicznego podłoża, warunkujacego określenie przeznaczenia komórek somatycznych.
Dość silnym argumentem przemawiającym za słusznością tej koncepcji jest opisanie
zdolności WT1 do wiązania RNA. Bezpośrednim efektem tej interakcji może być stabilizacja
transkryptu oraz pozytywna regulacja odczytu zawartej w nim informacji. Zgodnie z tą
koncepcją WT1 może wpływać na efektywność Sry we wczesnych etapach determinacji płci.
Do grupy charakteryzowanych genów dołącza jeszcze jeden – Sox9, którego ekspresja
uznawana jest za kolejny krok w różnicowaniu płci, po wcześniejszym zainicjowaniu procesu
przez Sry. Niewielkie ilości mRNA Sox9 obecne są w komórkach jeszcze przed momentem
rozpoczęcia ekspresji Sry. Niemniej ze względu na bardzo znaczny wzrost transkrypcji Sox9
w zarodkowych komórkach podporowych, co ma miejsce wkrótce po aktywacji Sry, wydaje
się, że procesy te są ze sobą powiązane. W układzie tym, Sox9 uznawany jest za element
podległy Sry, który reguluje jego ekspresję w sposób bezpośredni, bądź pośredni, niemniej
wyjaśnienie tej kwestii wymaga dalszych badań. Omawiane zjawisko jest złożone,
szczególnie gdy powtórnie uzmysłowimy sobie, iż Sry jest aktywny transkrypcyjnie bardzo
krótko w czasie ontogenezy, natomiast ekspresja Sox9 utrzymuje się znacznie dłużej podczas
rozwoju jąder. W związku z tym Sry może być czynnkiem sprawczym wysokiej aktywności
transkrypcyjnej Sox9, ale napewno nie jest wymagany do jej utrzymania w późniejszych
okresach morfogenezy. Rola Sox9 w determinacji płci stała się ewidentna przy analizach
osobników z wyraźną nadekspresją tego genu, która jest efektem duplikacji jego locus lub
mutacji w rejonie regulatorowym, zwiększającej poziom transkrypcji. Osobniki takie, przy
kariotypie XX, są pod względem fenotypu samcami. Wynika z tego jednoznaczna konkluzja,
że wysoki poziom SOX9 jest wystarczającym sygnałem do osiągnięcia przez zarodkowe
komórki stanu zdeterminowania wymaganego przy tworzeniu jąder, nawet w sytuacji braku
Sry. Analogiczna sytuacja występuje u mutanta myszy zwanego Odsex, który otrzymano w
czasie manipulacji mających na celu stworzenie zwierząt transgenicznych. U osobników
żeńskich takich myszy (XX Ods/+) swierdzono insercję w obszarze regulatorowym Sox9,
która spowodowała derepresję tego genu, który u samic normalnie nie jest aktywny.
Ostatecznym efektem omawianego eksperymentu było uzyskanie zwierząt o fenotypie
męskim z kariotypem XX. Zależność przebiegu determinacji płci od aktywności Sox9 jest
szczególnie ewidentna, gdy spojrzymy na jego pozycję w historii rozwoju tego procesu u
zwierząt kręgowych. W odróżnieniu od Sry, który jest reprezentowany w genomie tylko
ssaków, Sox9 pozostaje głównym elementem sprawczym rozwoju jąder u ptaków, gadów, a
nawet ryb. Wyłania się z tego obraz, w którym właśnie Sox9 kieruje bardzo stabilnym pod
względem zmian ewolucyjnych szlakiem rozwojowym, natomiast Sry zajął pierwszą pozycję
w systemie hierarchicznym determinacji płci stosunkowo niedawno. W związku z
powyższym nie dziwi także fakt, że budowa aminokwasowa białka SOX9 jest wysoce
konserwatywna ewolucyjnie u wszystkich kręgowców. W jego strukturze wyróżniono między
innymi 3 ważne domeny określanące funkcję i przynależnośc do grupy czynników
regulujacych transkrypcję. Są nimi domena HMG odpowiedzialna za wiązanie DNA i
zaginanie nici chromatynowej, która jest podstawowym kryterium klasyfikowania Sox9 do tej
samej co Sry rodziny genów zwanej Sox (ang. Sry-related HMG box genes). Z kolei dwie
domeny aktywujące transkrypcję jednoznacznie określają jego funkcję jako typowego
czynnika transkrypcyjnego. W tym momencie samoistnie nasuwa się pytanie o elementy w
systemie determinacji płci, które podlegają wpływom Sox9. Najlepiej udokumentowaną w
literaturze zależnością tego typu jest pozytywna regulacja ekspresji Amh przez SOX9. Jej
efektem jest wzrost poziomu glikoproteiny AMH (zwanej także MIS – ang. Müllerianinhibiting substance) w zarodkowych komórkach podporowych, która wydzielana do
nabliższego otoczenia determinuje kierunek rozwoju przewodów rozrodczych u powstającego
osobnika. Innymi słowy AMH działa jako hormon, który wywołuje regresję przewodów
Müllera (rozwijających się u samic w jajowody, macice i górny odcinek pochwy)
jednocześnie stwarzając odpowiednie środowisko do działania androgenów uwalnianych
przez różnicujące się komórki Leydiga. Te z kolei kierują rozwojem kanałów Wolffa, co w
ostatecznym rozrachunku prowadzi do utworzenia męskich przewodów rozrodczych. W
omawianym procesie SOX9 łączy się z promotorem Amh i przy współudziale Sf1, WT1,
białka szoku cieplnego – HSP70 oraz dodatkowego czynnika zwanego GATA4, bezpośrednio
reguluje jego ekspresję. Białka SOX9 i Sf1 pełnią w tym systemie kluczową rolę, gdyż od
pierwszego z nich zależy sama inicjacja transkrypcji, natomiast drugie pozwala utrzymać ją
na wysokim poziomie. Pozostałe elementy pełnią rolę wspomagającą w tym procesie.
GATA4 poprzez swą domenę z palcami cynkowymi wzmacnia efekt jaki wywiera białko
Sf1na promotor Amh. Z kolei HSP70 wiąże się zarówno z SOX9, jak i WT1 i tym samym
inicjuje tworzenie wielobiałkowego kompleksu. Wspóldziałanie każdego z tych elementów
wygląda następująco: białko SOX9 dzięki domenie HMG powoduje zagięcie DNA zbliżając
zasocjowany Sf1 do wzmacniającego jego aktywność GATA4, jednocześnie pozostaje w
zwiazku z WT1, a za pośrednictwem HSP70 wpływa na tworzenie wielobiałkowej struktury
regulującej transkrypcję genu Amh.
Wróćmy jeszcze na chwilę do przedstawienia zależności, które leżą u podstaw determinacji i
różnicowania się płci somatycznej u samic. Oczywiście jak to już wspomniano powyżej,
głównym czynnikiem sprawczym w tym procesie jest brak Sry oraz działanie Dax1, genu
którego ekspresja wywiera hamujący wpływ na rozwój męskich cech zarodka. Kodowane
przez niego białko DAX1, należy do nadrodziny receptorów jądrowych, z wysoce
konserwatywną domeną wiążącą ligand, ale nietypowo zbudowanym N-terminalnym końcem,
gdzie brak charakterystycznej struktury palców cynkowych odpowiadających za wiązanie
DNA. Informacja ta, wraz z brakiem jakichkolwiek dowodów na bezposrednie łączenie się
DAX1 z sekwencjami regulatorowymi genów, skłaniają do wniosku, że omawiany czynnik
wpływa na ich ekspresję poprzez interakcje z innymi białkami. Pomimo braku w chwili
obecnej jednoznacznych dowodów, które tłumaczyły by jak działa DAX1 w zarodkowych
komórkach gonad samic, wydaje się, iż najprawdopodobniej jego funkcja polega na znoszeniu
efektu generowanego przez SF1 oraz represji transkrypcji Sf1 i Sox9, które jak wiadomo
ulegają ekspresji na terenie grzebieni płciowych, które nie osiągnęły jeszcze stanu
zdeterminowania do rozwoju w jądra lub jajniki. Niemniej w sferze domysłów pozostaje
mechanizm tych wpływów, które mogą mieć charakter interakcji białko-białko (np. tworzenie
heterodimeru DAX1:SF1) lub aktywacji nieznanych korepresorów oraz co mało
prawdopodone, jak już wspomniano, interakcji DAX1 z DNA. Bardzo możliwe, że każdy z
opisanych wariantów oddziaływań ma miejsce i zależy od aktualniego stanu fizjologicznego
oraz etapu rozwoju komórek. W systemie różnicowani płci u samic ssaków ogromne
znaczenie ma ekspresja jeszcze jednego genu – Wnt4, kodującego działającą miejscowo
glikoproteinę. Jej funkcja przejawia się promowaniem rozwoju przewodów Müllera oraz
supresją różnicowania komórek Leydiga. Jak wykazały badania prowadzone na osobnikach z
duplikacjami Wnt4 i Dax1, ich efektem jest nadekspresja tych genów, prowdząca do rozwoju
fenotypu żenskiego u osobników o kariotypie XY. Wynik ten świdczy o zaangażowaniu obu
genów w proces determinacji płci somatycznej u samic. Przy realizacji omawianego
programu rozwojowego, ewidentny jest wpływ białka WNT4, które pozytywnie reguluje
ekspresję Dax1 w czym wspomaga go SF1, powodując tym samym zmniejszenie poziomu
transkrypcji własnego genu.
Charakteryzowane powyżej zależności między ekspresją genów zaangażowanych w
determinację, a następnie różnicowanie płci somatycznej u ssaków, coraz częściej skłaniają
do wniosku, że w procesie tym mamy raczej do czynienia z wielopoziomową siecią
zależności, a nie klasycznym układem hierarchicznym. Jak to wynika z treści niniejszego
rozdziału, pełne wyjaśnienie omawianych zagadnień wymaga przeprowadzenia wielu
szczegółowych badań, które co należy szczególnie podkreslić, mogą zrewolucjonizować nasz
podląd na przebieg rozwoju płci somatycznej u ssaków.
Potranskrypcyjna regulacja ekspresji genów jest głównym elementem
szlaku różnicowania się płci somatycznej u D. melanogaster
Pierwszym sygnałem określającym przebieg determinacji płci somatycznej u D. melanogaster
jest stosunek liczbowy X:A. Od niego w dalszej kolejności zależy ekspresja opisanego w
jednym z poprzednich podrozdziałów genu Slx (ang. Sex-lethal), który jest aktywny tylko u
samic. Decyzja o jego ekspresji podejmowana jest na bardzo wczesnym etapie rozwoju tzn.
jeszcze przed tworzeniem się blastodermy i zależy od trzech klas czynników: numeratorów,
denominatora i elementów matczynych.
Numeratorami określamy grupę genów, które lokują się na chromosomie X. Zaliczamy do
nich sisA, sisB, sisC (ang. sisterless) oraz run (ang. runt). Kryterium służącym do klasyfikacji
genu do grupy numeratorów jest efekt, jaki powoduje jego duplikacja u zarodka o kariotypie
XY oraz delecja u osobników XX. Rezultatem pierwszej aberacji jest śmiertelność samców
wynikająca z ekspresji normalnie nieaktywnego u tej płci genu Sxl. Drugi z przypadków
wyraża się przez letalny fenotyp samic, wynikający z braku ekspresji Sxl.
Mianem denominatora określamy autosomalny gen dpn (ang. deadpan), kodujący czynnik,
pełniący funkcję negatywnego regulatora ekspresji Sxl. Produkty sis jak i dpn są czynnikami
transkrypcyjnymi z nadrodziny HLH (ang. helix-loop-helix), które mogą tworzyć
homodimery, jak i łaczyć sie z innymi białkami tworząc heterodimery. Ostatnią grupę spośród
omawianych elementów stanowią czynniki matczyne. Grupujemy je w dwie klasy, pierwszą,
która obejmuje produkty genu da (ang. daughterless) i her (ang. hermaphrodite) pozytywnie
regulujące transkrypcję Sxl oraz drugą, tworzoną przez czynniki hamujące ten proces –
produkty emc (ang. extramacrochaetae) i gro (ang. groucho). Podczas determinacji płci
główną rolę odgrywają numeratory, natomiast geny matczyne oraz denominator są
elementami wspomagającymi, ułatwiającymi interpretację sygnału, który stanowi stosunek
X:A. Jest to oczywiste, gdy uświadomimy sobie, że ilość produktów powstających w wyniku
ekspresji sis jest dwukrotnie wyższa u samic niż samców, co oczywiście jest podyktowane
różną liczbą chromosomów X u osobników każdej z płci. Jedynym problemem w realizacji
omawianego procesu mógłby być mechanizm kompensacyjny u samców, niemniej jak się
sądzi jest on uruchamiany później w czasie rozwoju, a więc po tym gdy komórki oszacują
wartość X:A.
Białka SIS, kodowane przez geny numeratory łączą się z produktem denominatora – DPN,
czego konsekwencją jest wytworzenie heterodimerów, działających jako negatywne
regulatory transkrypcji Sxl. W sytuacji dużej ilości SIS, co ma miejsce u samic, tylko część z
nich ulega heterodimeryzacji z DPN, natomiast pozostałe mogą wiązać się z produktami
matczynego genu da i tym samym aktywować ekspresję Sxl. Rola dwóch pozostałych białek
tego systemu, a więc GRO i EMC, jest nadal niejasna. GRO wydaje się pełnić funkcję
korepresora wiążącego się z DPN, natomiast EMC prawdopodobnie inaktywuje DA i SISB
tworząc z nimi nieaktywne heterodimery.
Przebieg poszczególnych etapów determinacji płci u D. melanogaster jest niezwykły, gdyż
opiera się głównie na regulacji potranskrypcyjnej. Jeszcze przed powstaniem blastodermy, w
żeńskim zarodku obserwujemy wzrost transkrypcji Sxl po aktywacji jednego z dwóch
promotorów tego genu, oznaczanego jako SxlPe, co z kolei zależy od opisanego powyżej
sygnału generowanego stosunkiem X:A. Wkrótce jednak ekspresja ta jest wyciszana na
korzyść aktywacji drugiego z promotorów Sxl, oznaczanego SxlPm. Transkrypcja ta, zwana
późną, ma miejsce u obu płci. Białko SXL, które u samic powstało we wczesnym etapie, a
więc podczas aktywności SxlPe, reguluje proces składania mRNA powstającego w czasie
późnej ekspresji Sxl. Ma to na celu usunięcie trzeciego egzonu, a co za tym idzie utworzenia
otwartej ramki oddczytu. Podobnej regulacji nie obserwujemy jednak u samców, co jest
oczywiste z powodu braku wczesnej ekspresji Sxl rozpoczynającej sięz promotora SxlPe. W
efekcie powstający późny transkrypt nie jest składany i zawiera trzeci egzon, w którego
sekwencji znajduje się kodon stop, co z kolei prowadzi do przedwczesnej terminacji translacji
i powstania niefunkcjonalnego białka. SXL może wiązać RNA dzięki dwum
konserwatywnym ewolucyjnie domenom, oznaczanym RPM (ang. RNA recognition motif).
Białko to łączy się nie tylko z transkryptem własnego genu. Wiadomo bowiem, że w podobny
sposób reguluje ekspresję omówionego wcześniej msl-2, zaangażowanego w mechanizm
kompensacyjny, jak również genu tra (ang. transformer), który jest kolejnym po Sxl
elementem w hierarchicznym systemie determinacji płci somatycznej. Powstanie dojrzałego
transkryptu tra z otwartą ramką odczytu, także wymaga funkcjonalnego SXL, co może zostać
zrealizowane tylko u samic. Do wyrażenia swej funkcji, białko TRA wymaga partnera,
którym jest produkt konstytutywnie eksprymowanego genu tra-2 (ang. transformer-2). TRA i
TRA-2 powodują, że spliceosom łączy się w strefie poprzedzającej 4 egzon na terenie
transkryptu dsx (ang. doublesex) – produktu kolejnego genu. W ostatecznym rozrachunku
mRNA dsx, jak i tworzone na jego bazie białko u samic mają inną sekwencję, niż analogiczne
produkty dsx, które u samców powstają przy braku TRA. Różnice te dotyczą przede
wszystkim końca C-terminalnego białek, co określa charakter realizowanych przez nie
funkcji. DSXM (występujące u samców) i DSXF (wystepujące u samic) są bowiem
regulatorami transkrypcji wiążącymi się z DNA, które wpływaja na ekspresję genów
wykonawczych, aktywnych podczas różnicowania płciowego. DSXM aktywuje geny
wymagane do rozwoju męskich cech zarodka, jednoczesnie działając jako represor w
stosunku do genów promujących powstanie cech żeńskich, natomiast DSXF odwrotnie,
zapobiega męskiemu charakterowi różnicowania realizując program wymagany dla rozwoju
samic. Do wyrażenia swej funkcji, DSXF wymaga matczynego czynnika her, o którym
wspomniano już wcześniej, niemniej mechanizm tej interakcji nie został dotychczas w pełni
opisany. Nleży także wspomnieć o trzech dodatkowych genach: snf (ang. sans fille lub
splicing necessary factor), fl(2)d (ang. female-lethal(2)d) i vir (ang. virilizer). Pierwszy z nich
koduje białko SNF, współdziałające z SXL w maskowaniu miejsc składania 3 egzonu
transkryptu Sxl, co powoduje, iż jest on traktowany jak intron i wycinany. Rola pozostałych
genów jest niejasna, sądzi się, że one również uczestniczą w regulacji obróbki potranslacyjnej
Sxl.
Należy także wspomnieć o conajmniej dwóch odstępstwach od reguły zakładającej
determinację cech somatycznych zarodka przez dsx. Wiadomo bowiem, że rozwój unerwienia
mięśni odwłokowych u samców, podobnie jak i płeć ośrodkowego układu nerwowego (CNS)
oraz związana z nim indukcja charakterystycznych dla danej płci zachowań seksualnych, są
kontrolowane przez tra. W omawianych procesach białko TRA reguluje ekspresję genów fru
(ang. fruitless) i dsf (ang. dissatisfaction), kodujących czynniki transkrypcyjne, bezpośrednio
regulujące aktywność genów wykonawczych, w rozwijającym się CNS.
W determinacji płci somatycznej C. elegans szczególną rolę odgrywa efekt
grupy
U C. elegans w determinację płci somatycznej zaangażowanych jest jeszcze więcej genów niż
u D. melanogaster, niemniej opiszemy tu funkcję tylko kilku z nich. Podstawowym
elementem, który odpowiada za etap wykonawczy procesu, jest czynnik transkrypcyjny TRA1, z palcami cynkowymi w domenie wiążącej DNA. Stan aktywności genu, który go koduje,
tra-1 (ang. transformer-1), zależy z kolei od ekspresji szeregu czynników odbierających
informację o stosunku X:A. Spośród nich najlepiej scharakteryzowanymi są geny her-1 (ang.
hermaphroditization) i tra-2. Kodowane przez niego białko TRA-2 jest receptorem
błonowym, który w dużej liczbie kopii występuje na terenie komórek o kariotypie XX, a
niewielkiej o XO. Z kolei białko HER-1, którego produkcja jest domeną przyszłych męskich
komórek, może łaczyć się z receptorem TRA-2, co prowadzi do jego inaktywaji. W sytuacji
gdy komórka niezdeterminowana znajdzie się w otoczeniu, gdzie występuje duże stężenie
HER-1, jej receptory TRA-2 zostają zablokowane. To wyznacza jej przeznaczenie do stania
się komórką męską, co wiąże się bezpośrednio z mobilizacją trzech białek: FEM-1, FEM-2 i
FEM-3 – kodowanych przez geny fem (ang. feminization), które działaja jako represowy
funkcji wykonawczej TRA-1. Z kolei komórka charakteryzująca się wysoką aktywnością
HER-1, w sytuacji gdy znajdzie się w otoczeniu komórek posiadających dużą liczbę
receptorów TRA-2 ulegnie feminizacji. Jest to oczywiste, gdy wyobrazimy sobie, że nie jest
ona w stanie wytworzyć dostatecznej ilości białka HER-1, które blokując receptory TRA-2
doprowadziłoby do maskulinizacji komórek z otoczenia, jak i niej samej. Występujące w
dużej liczbie receptory TRA-2 za pomocą swej domeny cytoplazmatycznej, znajdującej się na
końcu C-terminalnym białka, wiążą pulę FEM-3, tym samym znosząc hamujący wpływ
białek FEM na aktywność TRA-1. Podczas determinacji płci komórek o kariotypie XX, duże
znacznie ma także kalpaina TRA-3, która odcina fragment receptora TRA-2 (oznaczany jako
TRA-2c), a ten z kolei przemieszcza się do jądra komórkowego, gdzie wzmacnia
feminizujący efekt białka TRA-1. Jak wynika z powyższej charakterystyki, w mechanizmie
determinacji płci u C. elegans szczególną role odgrywają sygnały molekularne przekazywane
między sąsiadujacymi ze sobą komórkami. Mamy tu bowiem do czynienia z klasycznych
efektem grupy, który zdefiniowaliśmy na początku rozdziału.
Osiąganie stanu przeznaczenia i determinacja płci komórek rozrodczych
To czy komórki linii płciowej rozpoczną spermatogenezę, czy oogenezę, zależy od ich
genotypu, jak również w bardzo znacznym stopniu od środowiska, które stwarza rozwijająca
się gonada. Zasada ta dotyczy wszystkich charakteryzowanych w tym rozdziale gatunków
zwierząt. U myszy, pierwotne komórki płciowe (PGC) powstają w epiblaście, a czynnikiem,
biorącym udział w ustalaniu ich przeznaczenia jest białko BMP-4 (ang. bone morfogenetic
protein 4), wydzielane z pozazarodkowej ektodermy. Około 7 dnia rozwoju, na podstawie
wysokiej aktywności alkalicznej fosfatazy, PGC są identyfikowane w pozazarodkowej
mezodermie. Stąd migrują do omoczni, a dalej przez endodermę i wzdłuż jelita na teren
formujących się grzebieni płciowych. Podczas wędrówki, jak i po osiagnięciu miejsca
docelowego, dzielą się mitotycznie. Wtedy też, w PGC o kariotypie XX, dochodzi od
reaktywacji wyciszonego chromosomu X oraz wyłączenia ekspresji genu Xist. Dalszy etap, to
przygotowanie do mejozy, czego wyrazem jest np. wzrost ekspresji genu Scp3, którego
aktywność warunkuje tworzenie kompleksów synaptonemalnych podczas mejozy. Właśnie na
tym etapie zachodzi determinacja płci komórek rozrodczych. Jeżeli PGC znajdą się w
otoczeniu zarodkowych komórek podporowych jąder, nie rozpoczynają podziału
redukcyjnego, pozostając w fazie G1 cyklu komórkowego. Natomiast gdy otoczeniem PGC są
tkanki różnicujących się jajników, to wchodzą one w profazę mejotyczną, charakterystyczną
dla oogenezy i po osiągnięciu stadium diplotenu, przechodzą w stan spoczynku
podziałowego. Zjawisko to nie zależy od zespołu chromosomów płci, jakie niosą ze sobą
komórki, co wykazano doświadczalnie w badaniach chimer oraz przeszczepiając komórki
linii płciowej samców do rozwijających się jajników, bądź komórki płciowe samic do jąder.
Stwierdzono, że PGC stają się oocytami w środowisku jajników, a spermatocytami w jądrach.
Z kolei, jeśli PGC zostaną przeniesione w otoczenie komórek somatycznych, np. nadnerczy,
to niezależnie od ich genotypu stają się oocytami, gdyż nie otrzymują swoistego sygnału o
zatrzymaniu podziałów. Obserwacje te pozwalają na wyciągnięcie dwóch wniosków, po
pierwsze, komórki somatyczne gonad determinują sposób różnicowania się PGC, po drugie,
decyzja o rozpoczęciu podziałów należy do samych komórek płciowych.
W determinacji płci PGC u D. melanogaster mamy do czynienia z kompilacją wpływu
otoczenia oraz sygnałów o charakterze autonomicznym, pochodzącym tylko z komórek
rozrodczych. PGC u tego gatunku są pierwszymi komórkami jakie powstają podczas rozwoju.
Tworzone są w tylnej części bruzdkującego zarodka, a ich cytoplazma, zawiera między
innymi tzw. ziarna biegunowe, zbudowane z RNA i białek. Składniki te są głównie
produktami genów aktywnych w trofocytach, skąd są transportowane do oocytu podczas jego
dojrzewania (stąd nazywane są czynnikami matczynymi). Jednym z nich jest transkrypt genu
osc (ang. oscar). Przy udziale białka Staufen (także produkt genu matczynego), transkrypty
osc są transportowane do tylnego bieguna jaja, gdzie podlegają translacji. Powstające biłako
Oscar, wiąże się ze Staufen oraz Vasa (produkt ekspresji kolejnego genu matczynego - vas).
Efektem tych interakcji jest zakotwiczenie cząsteczek mRNA osc na elemetach cytoszkieletu
plazmy biegunowej (płciowej), a do powstałego kompleksu nukloproteinowego dołączają
pozostałe elementy ziaren biegunowych. W rezultacie powstające na tym obszarze komórki
dziedziczą charakterystyczne tylko dla nich komponenty, co ostatecznie determinuje ich
przeznaczenie jako PGC. Warto zaznaczyć, że liczba powstających PGC zależy od ilości
transkryptu oscar, który jest dostarczany do plazmy biegunowej. Wykazano, że
przeszczepienie tych komórek z zarodka męskiego do żeńskiego nie zmienia radykalnie
charakteru ich różnicowania i rozpoczynają one spermatogenezę. Podobnie zachowują się
PGC o kariotypie XX, które zostaną przeniesione do organizmu samca. Na tej podstawie
łatwo wywnioskować, że podjęcie decyzji o rozpoczęciu oogenezy wymaga sygnału
pochodzącego ze środowiska, natomiast inicjacja spermatogenezy w męskich komórkach, ma
charakter autonomiczny. Łatwo też zauważyć, że wpływ sygnałów z męskiego zarodka jest
bodźcem o większej sile sprawczej przy określaniu przeznaczenia, niż genotyp jaki niosą ze
sobą komórki PGC o kariotypie XX. Mimo intensywnych badań, podłoże molekularne
omawianych zjawisk jest wyjątkowo słabo poznane. Istnieje kilka dowodów na udział w
omawianym procesie genu Sxl, jednak tutaj nie pełni on roli nadrzędnego czynnika, jak to ma
miejsce przy determinacji płci somatycznej, a jego udział jest znacznie silniej zaznaczony
podczas rozwoju komórek płciowych u samic niż samców. Aktywność Sxl u osobników XX
jest utrzymywana na drodze autoregulacji, tak jak to ma miejsce w komórkach somatycznych,
dzięki funkcji snf, fl(2)d i vir, a także dwóch genów aktywnych specyficznie w PGC – ovo i
out (ang. ovarian tumor). Mechanizm ten jest bardzo słabo poznany. Sxl wydaje się
regulować podziały mitotyczne komórek płciowych w germarium (szczytowa część jajnika),
zamianę mitozy na mejozę w czasie gametogenezy oraz przebieg crossig-over.
Hermafrodytyzm u C. elegans jest zjawiskiem wtórnym, a osobniki obupłciowe
wyewoluowały z samic. Dlatego omawiając determinację płci PGC u tego gatunku, trzeba
przede wszystkim zwrócić uwagę na mechanizm, który prowadzi do ustalenia męskiego
charakteru komórek w ciele osobnika o żeńskich cechach, którego organizm, jak wiadomo
stanowi kompetentne środowisko do produkcji jaj. Realizacja tego procesu wymaga
aktywności grupy genów zwanej tgf (ang. terminal germ line fems & fogs) obejmująca
wcześniej opisane fem-1, -2 i -3 oraz dwa zwane fog-1 i fog-3 (ang. feminization of the germ
line), które w odróżnieniu od fem, nie mają związku z determinacją płci somatycznej. Do
wyrażenia swej funkcji tgf, przede wszystkim wymagają inaktywacji tra-2. W jego represji
bierze udział trzeci z genów fog, oznaczany fog-2, który dodatkowo pozytywnie reguluje
aktywność tgf. Efektem tych oddziaływań jest aktywacja spermatogenezy, w wyniku której
powstaje niewiele więcej niż 300 plemników. Dalszy etap gametogenezy to zmiana jej
programu, na tworzenie oocytów. Do tego konieczne jest zniesienie efektu jaki wywierają tgf,
a przede wszystkim fem-3. Wymóg ten jest realizowany poprzez represję translacji mRNA
fem-3, dzięki wiązaniu się do jego 3’UTR białkek FBF-1 i FBF-2 (ang. fem-3 binding factors
1 & 2). W procesie tym dodatkowa rolę odgrywa 6 genów mog-1 – 6 (ang. masculinization of
the germ line), których aktywność jest dodatkowym warunkiem prawidłowego przebiegu
represji fem-3. Determinasja płci PGC u samców, wymaga białka HER-1, które łącząc się z
TRA-2 znosi jego represyjny wpływ na ekspresję genów tgf, co warunkuje inicjację, a
następnie przebieg spermatogenezy. Aktywność każdego z tgf jest niezbędna do realizacji
tego procesu i jak się sądzi kodowane przez nie białka są ostatnimi (terminalnymi)
elementami wykonawczymi w kontroli gametogenezy samców. W regulację produkcji
komórek rozrodczych, ale nie determinację płci zaangażowany jest także gen tra-1. Jego
aktywność jest niezbędna to inicjacji oogenezy u osobników hermafrodytycznych i
utrzymania spermatogenezy u samców. Podobnie jak w przypadku D. melanogaster, u C.
elegans określenie, które z komórek staną się PGC, wyznaczają determinanty
cytoplazmatyczne nazywane u nicienia granulami P. W ciągu pierwszych podziałów
bruzdkowania przemieszczają się one tak w blastomerach, że zawsze występują tylko na
terenie jednego z nich. Po czwartym podziale lokalizowane są w komórce oznaczanej P4,
która daje początek wszystkim PGC. Analizy molekularne wykazały, że bardzo istotnymi
składnikami granul P są białka wpływające na syntezę i funkcję RNA. Dwa z nich, znane jako
ghl-1 i ghl-2 (ang. germ line helicases), wykazują zdolność wiązania i rozkręcania cząsteczek
RNA. Z kolei inne białko pie-1, przemieszczające się po 4 podziale bruzdkowania do jądra,
działa jako represor polimerazy RNA II, hamując transkrypcję, a tym samym zapobiega
różnicowaniu się PGC w komórki somatyczne. Do elementów determinujących przeznaczenie
PGC dołączają białka kodowane przez mes-1 i mes-2, które wpływając na strukturę
chromatyny, powodują wyciszanie ekspresji genów.
Download
Random flashcards
ALICJA

4 Cards oauth2_google_3d22cb2e-d639-45de-a1f9-1584cfd7eea2

Create flashcards