Powiązanie glikolizy z regulacją replikacji DNA w komórkach
advertisement
Powiązanie glikolizy z regulacją replikacji DNA w komórkach eukariotycznych Aleksandra Konieczna Robert Łyżeń Grzegorz Węgrzyn Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, Gdańsk Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, ul. Wita Stwosza 59, 80-308 Gdańsk; tel.: (58) 523 60 24, faks: (58) 523 55 01, e-mail: [email protected] Artykuł otrzymano 24 października 2015 r. Artykuł zaakceptowano 29 października 2015 r. Słowa kluczowe: glikoliza, cykl komórkowy, replikacja DNA Wykaz skrótów: ALDO — aldolaza; ATP — adenozynotrójforsforan; CCM — Centralny metabolizm węgla; CDK — kinazy cyklino zależne; CKI — inhibitory kinaz zależnych od cyklin; CMG — kompleks Cdc45-MCM-GINS; DDK — zależna od Dbf4 kinaza Cdc7; ENO — enolaza; Fru-2,6-BP — fruktozo-2,6-bisfosforan; GAPDH — dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego; GPI — izomeraza glukozo-6-fosforanowa; HIF — czynnik indukowany hipoksją; HK — heksokinaza; MCM — białka licencjonujące replikację; NADH — dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy; NADPH — forma zredukowana NADP+; ORC — kompleks naznaczający miejsca inicjacji replikacji; PCNA — antygen jądrowy proliferujących komórek; PEP — fosfoenolopirogronian; PFK — fosfofruktokinaza; PFKFB3 — 6-fosfofrukto-2-kinaza; PGAM — fosfogliceromutaza; PGK — kinaza fosfoglicerynianowa; PK — kinaza pirogronianowa; PPP — szlak pentozo fosforanowy; Pre-IC — kompleks reinicjujący; pre-RC — kompleks przedreplikacyjny; R5p — rybozo-5-fosforan; RFC — replikacyjny czynnik C; TPI — izomeraza triozo fosforanowa; VDAC — zależny od potencjału kanał o selektywności anionowej. STRESZCZENIE R ozwój komórki eukariotycznej odbywa się poprzez kolejne, zachodzące po sobie etapy cyklu komórkowego, podczas którego dochodzi do jej wzrostu, powielenia materiału genetycznego oraz podziału na dwie komórki potomne. Wiele czynników środowiskowych, jak również wewnątrzkomórkowych decyduje o tym, czy komórka przejdzie przez kolejne fazy cyklu komórkowego, czy też wejdzie w stan spoczynku. Przebieg cyklu zależy również od prawidłowego funkcjonowania procesów metabolicznych, w tym centralnego metabolizmu węgla oraz replikacji DNA. Jednym z podstawowych procesów centralnego metabolizmu węgla jest glikoliza. Stanowi ona główną drogę przemian glukozy w komórkach, prowadzącą do jej przekształcenia w pirogronian. Do niedawna uważano, że metabolizm węgla oraz replikacja DNA są ze sobą powiązane tylko w sposób pośredni, głównie poprzez dostarczaną energię, niezbędną do powielenia materiału genetycznego, jak i wytwarzanie prekursorów substratów w postaci deoksyrybonukleotydów. Jednak najnowsze wyniki badań, opisane i dyskutowane w tym artykule, sugerują istnienie dużo bardziej złożonych zależności, być może także bezpośrednich, pomiędzy tymi dwoma procesami. WPROWADZENIE — CYKL KOMÓRKOWY Cyklem komórkowym określa się szereg procesów oraz zmian biochemicznych zachodzących wewnątrz komórki pomiędzy kolejnymi jej podziałami. Jest on podstawą wzrostu, rozwoju, dziedziczenia i ewolucji organizmów. Klasyczny cykl komórkowy u organizmów eukariotycznych składa się z czterech faz: faza G1 określana mianem fazy wzrostu, faza S, podczas której chromosomowy DNA ulega replikacji, faza G2, w trakcie której komórka przygotowuje się do mitozy oraz faza M, podczas której dochodzi do kondensacji i segregacji chromosomów. Cytokineza jest ostatnim etapem cyklu komórkowego, w wyniku którego powstają dwie komórki potomne [1]. Cykl komórkowy hodowanych w kulturze komórek eukariotycznych trwa zwykle od 16 do 24 godzin [2]. Występowanie różnic w długości cyklu komórkowego w większości przypadków wynika z długości czasu trwania fazy G1. W warunkach in vivo niektóre komórki całkowicie zaprzestają podziałów i wchodzą w stan spoczynkowy, zwany zablokowaniem w fazie G0. Do takich komórek należą na przykład neurony, których maszyneria białkowa biorąca udział w replikacji w dorosłych komórkach nerwowych pełni inne, niezwiązane z replikacją DNA funkcje [3]. Wiele czynników środowiskowych, jak również wewnątrzkomórkowych decyduje o tym, czy komórka przejdzie przez kolejne etapy cyklu komórkowego, czy też nie będzie się dzielić [4]. Głównym molekularnym mechanizmem odpowiedzialnym za przeprowadzenie komórki przez poszczególne fazy cyklu komórkowego, a także decyzję czy komórka podzieli się, zróżnicuje, czy też ulegnie starzeniu komórkowemu lub umrze, są białka cyklinozależnych kinaz Cdk (ang. cyclin dependent kinases) aktywowanych zarówno przez wewnętrzne, jak i zewnętrzne sygnały. Obecnie znanych jest ponad 20 białek zaliczanych do rodziny Cdk [5]. Kinazy Cdk działają razem z cyklinami będącymi regulatorowymi podjednostkami odpowiedzialnymi za ich aktywność oraz specyficzność substratową. Uważa się, że kinazy Cdk odpowiadają za progresję cyklu komórkowego, natomiast cykliny biorą udział w przejściu pomiędzy jego poszczególnymi fazami. Aktywność kompleksów Cdk/cyklina jest ściśle regulowana przez inhibitory Cdk (CKI), które wpływają na zatrzymanie cyklu w momencie pojawienia się niekorzystnych warunków [5]. Schemat cyklu komórkowego wraz z jego podstawowymi elementami regulatorowymi przedstawiono na rycinie 1. Działanie czynników chemicznych oraz fizycznych zagrażających integralności genomu powoduje aktywację szlaków sygnalizacyjnych organizujących punkty kontrolne cyklu komórkowego. Ich rolą jest zatrzymanie cyklu komórkowego oraz regulacja ekspresji genów i rekrutacja czynników biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA. Punkty kontrolne występują najczęściej na granicy pomiędzy fazami cyklu komórkowego. Przejście przez kolejne punkty 444www.postepybiochemii.pl Na poziomie komórkowym za taką regulację odpowiadają geny kodujące enzymatyczne izoformy o różnej katalitycznej aktywności oraz czynniki regulacyjne. Dostępność tych białek kontrolowana jest na poziomie transkrypcji, splicingu, stabilności mRNA oraz translacji. Wpływ na regulację metabolizmu mają również potranslacyjne modyfikacje oraz małe cząsteczki wywierające allosteryczny efekt na enzymy, jak fenyloalanina, ATP czy AMP [10]. GLIKOLIZA ROLA PROCESU GLIKOLIZY W KOMÓRCE Rycina 1. Schemat cyklu komórkowego wraz z jego podstawowymi elementami regulatorowymi: CDK — kinazy cyklinozależne, CKI — inhibitory kinaz zależnych od cyklin, w tym białka należące do rodziny CIP/KIP (p21, p27, p57) oraz INK (p19, p18, p16, p15) (na podstawie [6], zmodyfikowane). kontrolne bez zatrzymania zależne jest między innymi od wielkości komórki, dostępności składników odżywczych czy integralności DNA, a także od samego typu komórek czy też organizmu [7]. Dla przykładu zatrzymanie widełek replikacyjnych aktywuje punkt kontrolny podczas fazy S, zaś uszkodzenia DNA podczas fazy G2. Odpowiedzi te są kluczowe dla stabilności genomu oraz przetrwania komórki. Zaburzenia w ich funkcjonowaniu prowadzą do nagromadzenia nieprawidłowości genetycznych, bardzo często związanych z procesem nowotworzenia [8]. CENTRALNY METABOLIZM WĘGLA (CCM) Centralny metabolizm węgla (CCM, ang. central carbon metabolism) ogólnie uznany jest jako zbiór szlaków biochemicznych odpowiadających za transport i utlenianie głównych źródeł węgla w komórce [9]. Podstawę szlaków metabolizmu węgla stanowią: glikoliza, glukoneogeneza, cykl kwasów trikarboksylowych (cykl Krebsa) oraz szlak pentozofosforanowy. Zwykle funkcjonowanie jednego ze szlaków metabolicznych jest uzależnione od pozostałych. Biochemiczne reakcje zachodzące w tych szlakach mają na celu zapewnienie komórce stanu równowagi poprzez optymalną produkcję pochodzącej ze składników odżywczych energii oraz jej wykorzystanie w zależności od warunków wzrostu. Centralny metabolizm węgla obejmuje skomplikowany szereg reakcji enzymatycznych prowadzący do przemiany cukrów do metabolicznych prekursorów. Prekursory te są następnie używane do wygenerowania całej biomasy w komórce [10]. Niemniej jednak kluczową rolą CCM jest wytworzenie energii, w większości w postaci adenozynotrójfosranu (ATP) oraz czynników redukujących. Głównym źródłem energii jest glukoza, metabolizowana w procesie glikolizy do pirogronianu. W warunkach tlenowych pirogronian przekształcany jest do acetylo-koenzymu A (acetylo-CoA), który włączany jest do cyklu Krebsa generującego ATP oraz NADH. Natomiast powstające NADH stanowi źródło elektronów niezbędnych do wytworzenia energii w szeregu reakcji łańcucha oddechowego [11]. Ponieważ potrzeby metaboliczne poszczególnych typów komórek różnią się w zależności od ich funkcji oraz środowiska, organizmy wykształciły systemy odpowiadające za regulację metabolizmu zarówno na krótki, jak i długi okres. Postępy Biochemii 61 (4) 2015 Kompletny szlak glikolizy został opisany w latach trzydziestych XX wieku i nazywany jest również szlakiem Embden-Meyerhof-Parnasa na cześć biochemików mających ogromny wkład w wyjaśnienie tego procesu [12]. Głównym substratem szeregu tych reakcji jest glukoza, cukier będący podstawowym źródłem węgla oraz energii. Glikoliza zachodzi we wszystkich komórkach, a enzymy tego szlaku są obecne w cytosolu. W samym szlaku glikolizy można wyróżnić trzy fazy [13]. Pierwsza to faza wymagająca energii, nazywana fazą rozpoczynającą (ang. priming phase), podczas której dochodzi do fosforylacji glukozy do glukozo-6-fosfornau przez enzym heksokinazę lub glukokinazę. Reakcja ta jest nieodwracalna i wymaga ATP oraz Mg2+, podobnie jak wymagająca kolejnej cząsteczki ATP fosforylacja fruktozo-6-fosforanu przez fosfofruktokinazę. Druga to faza rozdziału, dekompozycji (ang. splitting phase), podczas której w wyniku kilku reakcji enzymatycznych dochodzi do wytworzenia dwóch cząsteczek aldehydu 3-fosfoglicerynowego. Trzecia to faza wytwarzania energii (ang. energy-generation phase) prowadząca do wytworzenia czterech cząsteczek ATP oraz dwóch NADH. Glikoliza może przebiegać zarówno w obecności tlenu, jak i jego braku (beztlenowo), przy czym końcowym produktem beztlenowej glikolizy jest mleczan. Natomiast w warunkach dostępu tlenu powstaje pirogronian, który następnie w cyklu Krebsa utleniany jest do CO2 i H2O [14]. W reakcjach szlaku glikolitycznego bezpośrednio powstają tylko dwie cząsteczki ATP na jedną cząsteczkę glukozy. Sumaryczna reakcja przekształcenia glukozy w pirogronian wygląda następująco: glukoza + 2Pi + 2ADP + 2NAD+ → 2 cząsteczki pirogronianu + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O Enzymy glikolityczne są zachowywane w procesie ewolucji, a sam szlak należy do najstarszych procesów przemian metabolicznych. Metabolizm glukozy z udziałem glikolizy, mający służyć produkcji energii, rozwinął się już u archaicznych beztlenowych form życia. Nawet po pojawieniu się tlenu atmosferycznego, który umożliwił dalsze utlenianie pirogronianu, sam szlak oraz enzymy biorące w nim udział niewiele się zmieniły [15]. Glikoliza w odniesieniu do samej produkcji ATP jest nieefektywna, ponieważ generuje powstanie tylko dwóch cząsteczek ATP na jedną cząsteczkę glukozy. Natomiast cał- 445 kowite utlenienie jednej cząsteczki glukozy w oksydacyjnej fosforylacji umożliwia wytworzenie aż 36 cząsteczek ATP [14]. W przypadku braku tlenu, NAD+ regenerowany jest ze zredukowanego NADH przez konwersję pirogronianu do mleczanu. Alternatywnie glukoza może ulec przekształceniu do jej polimerycznych postaci (glikogen, skrobia), które w wielu organizmach są formami magazynowania tego węglowodanu. Pomimo niskiej wydajności w produkcji energii, dzięki tlenowej glikolizie oraz zwiększeniu tempa reakcji komórka może wyprodukować więcej ATP niż podczas fosforylacji oksydacyjnej [16]. U ssaków względne znaczenie glikolizy i innych szlaków zależne jest od rodzaju tkanki lub typu komórki w tkance. W większości komórek ssaczych istnieje możliwość metabolizmu glukozy poprzez alternatywne ścieżki, jak szlak pentozofosforanowy czy biosyntezy heksozaminy [17]. W fizjologicznych warunkach dostępności i metabolizmu glukozy, ok. 30% energii w postaci ATP pochodzi z glikolizy, natomiast reszta wytwarzana jest w procesie fosforylacji oksydacyjnej [16]. Jednak w komórkach, w których nie występują mitochondria, glikoliza jest głównym szlakiem odpowiadającym za wytwarzanie ATP, np. w erytrocytach czy rogówce. Również mózg, siatkówka, skóra, rdzeń nerek i nabłonki przewodu pokarmowego czerpią większość swojej energii właśnie z tego procesu [13]. W komórkach zachodzi stała ekspresja genów kodujących enzymy glikolityczne niezbędne do przemiany glukozy. Co ciekawe, skoordynowane zwiększenie ich ekspresji może nastąpić na przykład w warunkach niedotlenienia. Istotną rolę w tym procesie odgrywa czynnik indukowany hipoksją (HIF, ang. hypoxia inducible factor) [18]. W przeciwieństwie do zdrowych komórek, większość komórek nowotworowych używa glikolizy jako głównego mechanizmu wytwarzania energii niezależnie od obecności tlenu [19]. Zjawisko beztlenowej glikolizy w komórkach nowotworowych określane jest efektem Warburga od imienia uczonego, który jako pierwszy opisał je w 1926 roku. W normalnych komórkach produkcja energii zachodzi głównie poprzez utlenianie pirogronianu w mitochondriach. Natomiast komórki nowotworowe preferują, nawet w obecności dostatecznie dużych ilości tlenu, oddychanie beztlenowe. Metabolizują one do dziesięciu razy więcej glukozy do mleczanu niż normalne tkanki [19]. Dzięki temu, w zależności od rodzaju komórek/tkanki oraz warunków doświadczalnych, udział glikolizy w produkcji ATP wynosi 0,3–64% [20]. Ma to związek z nadekspresją genów szlaku glikolizy, która zachodzi co najmniej w 24 klasach nowotworów reprezentujących ponad 70% przypadków raka na świecie [21]. Ponadto komórki nowotworowe jako źródło węgla, poza glukozą, mogą także wykorzystywać glutaminę. Wynika to z ich zwiększonego zapotrzebowania na związki pośrednie dla cyklu Krebsa, które w normalnych komórkach zapewnia glukoza [16]. Należy również pamiętać, że metabolizm mleczanowy bywa preferowany także w niektórych zdrowych tkankach, takich jak mięsień sercowy czy mózg, którego astrocyty są zasadniczo glikolityczne [22]. Proces ten wykorzystywany jest również przez wiele szybko rosnących organizmów jednokomórkowych, takich jak drożdże Saccharomyces cerevisiae, które nawet w warunkach tlenowych preferują fermentowanie glukozy do etano- Rycina 2. Schemat szlaku glikolizy wraz z enzymami katalizującymi ten proces: heksokinaza (HK), izomeraza glukozo-6-fosforanowa (GPI), fosfofruktokinaza (PFK1), aldolaza (ALDO), izomeraza triozofosforanowa (TPI), dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAPDH), kinaza fosfoglicerynianowa (PGK), fosfogliceromutaza (PGAM), enolaza (ENO) oraz kinaza pirogronianowa (PK) (na podstawie [14]). lu. To z kolei przekłada się na ich znacznie szybszy wzrost [23]. Innym przykładem są intensywnie dzielące się mysie fibroblasty, w których poziom wychwytu glukozy oraz wytwarzania mleczanu jest najwyższy podczas wykładniczej fazy wzrostu [24]. ENZYMY SZLAKU GLIKOLIZY Glikoliza stanowi główną drogę przemian glukozy w komórkach, prowadząc do przekształcenia jej w pirogronian. Szlak ten jest źródłem energii komórkowej, a także związków pośrednich wykorzystywanych w pozostałych szlakach metabolicznych. Dziesięć enzymów katalizuje reakcje biochemiczne tego szlaku (Ryc. 2). Trzy spośród nich mają charakter nieodwracalny. W dalszej części artykułu przed- 446www.postepybiochemii.pl stawione zostały poszczególne enzymy biorące udział w glikolizie oraz przeprowadzane przez nie reakcje. Heksokinaza (HK) Pierwszą, a przy tym nieodwracalną, reakcją szlaku glikolizy jest fosforylacja glukozy do glukozo-6-fosforanu katalizowana przez heksokinazę. W tkankach ssaków występują aż cztery jej izoenzymy HK 1, 2, 3 i 4 (glukokinaza) [25]. Różnice między nimi dotyczą zarówno subkomórkowej lokalizacji, sposobu ekspresji, jak i samych właściwości. HK1 jest powszechnie występującym enzymem, szczególnie w erytrocytach oraz jedyną heksokinazą występującą w mózgu [25,26]. HK2 jest dominującą formą w tkance mięśniowej, ulega również syntezie w tkankach wrażliwych na insulinę oraz zaobserwowano znacznie podwyższony jej poziom w komórkach nowotworowych [25,27] W odróżnieniu od pozostałych dwóch izoenzymów, HK1 oraz HK2, dzięki hydrofobowej α-helisie, związane są z błoną mitochondrialną a poprzez oddziaływanie z kanałem VDAC odgrywają istotną rolę w hamowaniu apoptozy zachodzącej ścieżką mitochondrialną [28]. Aktywność pozostałych dwóch izoenzymów ograniczona jest do specyficznych tkanek. HK3 funkcjonuje w wątrobie, płucach i nerkach [29]. Natomiast HK4, mająca niskie powinowactwo do glukozy, aktywna jest jedynie w wątrobie i trzustkowych komórkach B [27]. Izomeraza glukozo-6-fosforanowa (GPI) Izomeraza glukozo-6-fosforanowa jest cytosolowym enzymem metabolizmu podstawowego (ang. housekeeping enzyme). W cytoplazmie dimeryczna forma tego białka katalizuje odwracalną izomeryzację glukozo-6-fosforanu (aldoza) do fruktozo-6-fosforanu (ketoza) [30]. Enzym ten może również prowadzić do przekierowania glukozy do szlaku pentozofosforanowego w celu wytworzenia NADPH i pentozy [14]. GPI jest białkiem wielofunkcyjnym (ang. moonlighting protein), które na drodze ewolucji nabyło również inne dodatkowe funkcje [15]. Na zewnątrz komórki, monomeryczne białko kodowane przez gen GPI może pełnić trzy różne funkcje: neuroleukiny działającej jako czynnik neurotroficzny (NLK, ang. neuroleukin) dla komórek rdzenia kręgowego oraz neuronów czuciowych, cytokiny wzmagającej mobilność komórek nowotworowych (AMF, ang. autocrine motility factor) oraz czynnika dojrzewania (MF, ang. maturation factor) [31]. 6-fosfofruktokinaza 1 (PFK1) W komórkach ssaków obecne są trzy izoenzymy fosfofruktokinazy: wątrobowy (PFK-L), mięśniowy (PFK-M) oraz płytkowy (PFK-P) [32], występujące specyficznie w różnych tkankach i organach w formie tetramerów. Enzym ten przeprowadza nieodwracalną reakcję fosforylacji fruktozo-6-fosforanu do fruktozo-1,6-bisfosforanu. Jest to reakcja zależna od ATP i ma ona kluczowe znaczenie w regulacji szybkości glikolizy. Dzięki allosterycznym właściwościom PFK1 podlega aktywacji przez 2,6-bisfosforan fruktozy (Fru-2,6-BP), metabolit zdolny do zniesienia hamującego działania ATP na jego aktywność [33]. Postępy Biochemii 61 (4) 2015 Aldolaza (ALDO) W tkankach ssaków istnieją trzy różne rodzaje aldolazy fruktozobisfosforanu (ALDO), nazywane aldolazą A, B i C. Wszystkie występują w cytosolu w formie homotetrameru. Aldolaza A jest aktywna w mięśniach oraz w czerwonych krwinkach. Wątrobowa aldolaza B obecna jest również w jelicie cienkim oraz nerkach. Natomiast aldolaza C jest specyficzna dla mózgu, tkanki nerwowej oraz mięsni gładkich [34]. Enzym ten rozszczepia cząsteczkę fruktozo-1,6-bisfosforanu na dwie cząsteczki: fosfodihydroksyaceton i aldehyd 3-fosfoglicerynowy. Przy czym tylko aldehyd 3-fosfoglicerynowy jest wykorzystywany w dalszych etapach glikolizy. Poza cytosolem, aldolaza A obecna jest również w jądrze komórkowym. Dotyczy to zarówno komórek nowotworowych, jak i proliferujących zdrowych komórek [35]. Izomeraza triozofosforanowa (TPI1) Produkt genu TPI1 człowieka jest enzymem metabolizmu podstawowego obecnym we wszystkich tkankach. W aktywnej postaci występuje jako homodimer. Jego sekwencja aminokwasowa jest najlepiej zachowaną ewolucyjnie pośród wszystkich znanych białek TPI. TPI katalizuje odwracalną reakcję przekształcania fosfodihydroksyacetonu do aldehydu 3-fosfoglicerynowego [36]. Dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAPDH) Dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAPDH) katalizuje fosforylację oksydacyjną aldehydu 3-fosfoglicerynowego do 1,3-bisfosfoglicerynianu z użyciem fosforanu nieorganicznego i NAD+. W cytoplazmie enzym ten występuje w formie tetrameru zbudowanego z identycznych podjednostek. Może być także w niewielkiej ilości umiejscowiony w jądrze komórkowym w formie monomeru oraz w mitochondriach w postaci dimeru [37]. Gen GAPDH zaliczany jest do genów metabolizmu podstawowego, a kodowane przez niego białko GAPDH stanowi ponad 15% wszystkich rozpuszczalnych białek komórkowych [38]. Dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego jest białkiem wielofunkcyjnym (ang. moonlighting protein), bezpośrednio zaangażowanym w wiele procesów zachodzących w komórce, jak na przykład regulacja ekspresji genów, naprawa DNA, odpowiedź na stres oksydacyjny czy apoptoza [37,39]. W ludzkim genomie odkryto wiele homologicznych do GAPDH genów, które w większości uważane są za pseudogeny. Dotychczas opisano ich aż 67 [40]. Kinaza fosfoglicerynianowa (PGK) Kinaza fosfoglicerynianowa katalizuje konwersję 1,3-bisfosfoglicerynianu do 3-fosfoglicerynianu. W komórkach ludzkich obecne są dwa izoenzymy: PGK1 i PGK2. PGK1 jest powszechnie występującą formą produkowaną w większości komórek, podczas gdy PGK2 jest unikalną tylko dla mejotycznych i postmejotycznych komórek spermatogenezy [41]. Kinaza fosfoglicerynianowa jest enzymem wielofunkcyjnym, będącym między innymi kofaktorem polimerazy DNA α i mogącym mieć udział w syntezie opóźnionej nici DNA podczas replikacji [42]. 447 Fosfogliceromutaza (PGAM) U ludzi istnieją trzy formy fosfogliceromutazy aktywne w postaci homodimerów: mutaza bisfosfoglicerynianu w erytrocytach (BPGM), PGAM2 (typ M) występująca w tkance mięśniowej oraz PGAM1 (typ B) aktywna w pozostałych tkankach [43]. Enzym ten katalizuje przekształcenie 3-fosfoglicerynianu do 2-fosfoglicerynianu. Enolaza (ENO) Enolaza w komórkach eukariotycznych występuje w postaci homo- lub heterodimerów kodowanych przez geny ENO1, ENO2 oraz ENO3, którym odpowiadają podjednostki α, γ oraz β. Najbardziej powszechnym izoenzymem jest nieneuronalna α-enolaza (ENO1) występująca w prawie wszystkich tkankach. β-enolaza (ENO3) obecna jest w komórkach o dużym zapotrzebowaniu na energię, głównie w tkankach mięśni szkieletowych i mięśniu sercowym. Natomiast γ-enolaza (ENO2) znajduje się jedynie w tkankach nerwowych i neuroendokrynnych [44]. Enolaza katalizuje odwodnienie 2-fosfoglicerynianu i powstanie mającego wysokoenergetyczne wiązanie fosfoenolopirogronianu. Poza podstawową rolą w glikolizie, pełni ona wiele niekatalitycznych funkcji [15]. Może nawet występować na powierzchni komórek, jako receptor plazminogenu ludzkiego, przez co bierze udział w procesie inwazyjności patogenów, biogenezie czy też migracji komórek nowotworowych oraz przerzutach [45]. Kinaza pirogronianowa (PK) U człowieka i innych ssaków obecne są cztery izoenzymy kinazy pirogronianowej PKM1, PKM2, PKL i PKR, których produkcja jest tkankowo specyficzna [46]. Gen PKLR dzięki alternatywnym promotorom oraz różnemu składaniu (ang. splicing) koduje transkrypty zarówno dla PKL, jak i PKR. PKR funkcjonuje jedynie w erytrocytach, natomiast produkcja PKL zachodzi w wątrobie, nerkach oraz jelicie cienkim [46]. Glikolityczne enzymy kinazy pirogronianowej M1 i M2 (PKM1 i PKM2) powstają w wyniku alternatywnego składania transkryptów genu PKM, którego eksony 9 i 10 kodują sekwencje specyficzne odpowiednio dla izoformy M1 i M2. Obie te formy różnią się jedynie 22 aminokwasami [47]. Poza mięśniami szkieletowymi ekspresja genu PKM1 zachodzi również w sercu, mózgu oraz większości pozostałych tkanek. PKM2 jest natomiast embrionalną izoformą obecną we wszystkich tkankach na wczesnych etapach życia, a także w komórkach proliferujących. W trakcie rozwoju w wybranych tkankach jest ona zastępowana przez pozostałe formy tego enzymu [48]. Podwyższony poziom PKM2 związany jest z rozwojem nowotworów. Kinaza pirogronianowa katalizuje ostatni etap glikolizy, nieodwracalne przeniesienie grupy fosforylowej z fosfoenolopirogronianu na ADP z wytworzeniem pirogronianu. PKM2 występuje w dwóch formach, aktywnego tetrameru oraz nieaktywnego dimeru, przy czym przejście pomiędzy tymi dwiema formami jest dynamiczne [49]. Dimer PKM2 w komórkach nowotworowych przekierowuje metabolizm węgla z produkcji pirogronianu i komórkowej energii na procesy anaboliczne niezbędne do szybkiego wzrostu. Co ciekawe, w komórkach z formą M2 kinazy pirogronianowej ilość piro- gronianu jest większa niż w komórkach z formą M1 mającą wysoką aktywność [48]. Przyczyna wyższego stężenia tego metabolitu pozostaje niewyjaśniona [49]. Poza cytosolem kinaza pirogronianowa może występować także w jądrze komórkowym, gdzie bezpośrednio fosforyluje czynnik transkrypcyjny STAT3 (ang. signal transducer and activator of transcription) [50]. STAT3 reguluje ekspresję genów, których produkty występują w wielu szlakach metabolicznych i biosyntezy, integrując sygnały prowadzące do globalnych zmian transkrypcji i onkogenezy [51]. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) U większości żywych organizmów dehydrogenaza mleczanowa jest tetramerem występującym w pięciu formach, które są kombinacją dwóch rodzajów podjednostek: M (mięśniowej, kodowanej przez gen LDHA) i H (sercowej, kodowanej przez gen LDHB), tj. LDH-1 (HHHH), LDH-2 (HHHM), LDH-3 (HHMM), LDH-4 (HMMM) i LDH-5 (MMMM). W komórkach ssaczych najbardziej powszechne są głównie dwie izoformy dehydrogenazy mleczanowej. Pierwszą z nich jest LDHA (LDMM lub LDH5) dominująca w mięśniach szkieletowych, a drugą LDHB (LDHH lub LDH1) będąca główną formą występującą w sercu. Forma A katalizuje przekształcanie pirogronianu do mleczanu, natomiast forma B powoduje wsteczną konwersję [52]. Opisano jeszcze dwa izoenzymy: LDHC obecny jedynie w jądrach [53] oraz LDHD zidentyfikowany na podstawie sekwencji kodującej i będący homologiczny do drożdżowej dehydrogenazy D-mleczanowej. Analiza transkryptu odpowiadającego LDHD wykazała jego obecność w sercu, mięśniach szkieletowych oraz wątrobie i nerkach [54]. Dehydrogenaza mleczanowa katalizuje wzajemne przekształcanie pirogronianu i mleczanu z jednoczesną przemianą NADH i NAD+. Przekształca pirogronian będący końcowym produktem glikolizy do mleczanu w warunkach braku tlenu lub przy jego niskim poziomie. LDH jest bardzo istotnym enzymem w metabolizmie komórkowym, w szczególności w mięśniach szkieletowych, gdzie podczas intensywnego wysiłku produkcja ATP w procesie oksydacyjnej fosforylacji jest niewystarczająca, aby zapewnić energię do skurczu mięśni. ROLA METABOLITÓW GLIKOLIZY W większości tkanek 80–90% glukozy utleniane jest w procesie glikolizy, a pozostałe 10–20% w szlaku pentozofosforanowym [55]. Produkty pośrednie (metabolity) powstające podczas kolejnych etapów glikolizy mogą także zostać wykorzystane jako substraty w innych szlakach metabolicznych zachodzących w komórce. Na przykład fruktozo-6-fosforan i aldehyd 3-fosfoglicerynowy mogą być przekierowane do szlaku pentozofosforanowego (PPP), gdzie podczas fazy nieoksydacyjnej dochodzi do wytworzenia rybozo-5-fosforanu (R5p), będącego produktem pośrednim niezbędnym w biosyntezie nukleotydów [55]. Alternatywnie, włączenie glukozo-6-fosforanu do fazy oksydacyjnej szlaku pentozofosforanowego (PPP) prowadzi do powstania R5p oraz NADPH, co z kolei przyczynia się do obrony komórki w warunkach stresu oksydacyjnego [56]. 448www.postepybiochemii.pl Glikolityczny związek pośredni 3-fosfoglicerynian (3PG) jest prekursorem do syntezy endogennych aminokwasów: cysteiny, glicyny i seryny, które są istotne do syntezy białek, lipidów i kwasów nukleinowych. Ponadto redukcja fosfodihydroksyacetonu do glicero-3-fosforanu dostarcza komórkom substratu do biosyntezy zarówno fosfolipidów, jak i triacylogliceroli będących ważnymi składnikami błony komórkowej [57]. Fosfoenolopirogronian (PEP) jest metabolitem istotnym w fosforylacji mutazy fosfoglicerynianowej (PGAM1), podczas której powstaje pirogronian, ale bez wytworzenia ATP. Wytworzenie pirogronianiu bez generowania ATP zapobiega negatywnej allosterycznej regulacji glikolizy na poziomie fosfofruktokinazy (PFK1), którą może powodować wysokie stężenie ATP. Natomiast fosforylacja PGAM1 zwiększa aktywność tego enzymu prowadząc do wzrostu poziomu 3-fosfoglicerynianu (3PG) [58]. Może to prowadzić do przekierowania metabolitów glikolizy do szlaków biosyntezy glicyny i seryny [49]. 3-fosfoglicerynian (3PG) oraz 2-fosfoglicerynian (2PG) modulują tlenową fazę szlaku pentozofosforanowego oraz biosyntezy seryny. 3PG stanowi substrat, natomiast 2PG pobudza ten szlak poprzez pozytywną regulację dehydrogenazy fosfoglicerynianowej, katalizującej pierwszy jego etap [58]. W komórkach z obniżoną aktywnością PGAM1 zaobserwowano zmniejszoną syntezę nukleotydów. Powodem tego było hamowanie wejścia glukozo-6-fosforanu do szlaku pentozofosforanowego (PPP). Mechanizm tego hamowania opiera się na inaktywacji enzymu dehydrogenazy 6-fosfoglukonianowej (6PGD) przez gromadzący się 3-fosfoglicerynian. Co więcej, obniżona aktywność PGAM1 prowadziła do obniżenia ilości 2-fosfoglicerynianu, będącego produktem reakcji katalizowanej przez ten enzym, a w efekcie powodowało to zmniejszoną biosyntezę seryny [59]. Badania przeprowadzone na drożdżach wykazały, że fosfoenolopirogronian (PEP) może być kompetycyjnym inhibitorem izomerazy triozofosforanowej (TPI1), wpływającym na adaptację do warunków stresu oksydacyjnego poprzez regulację glikolizy oraz szlaku pentozofosforanowego. Niedawno wykazano również antyoksydacyjny potencjał fosfoenolopirogronianu oraz jego cytoprotekcyjne właściwości [60]. Jednak dokładny mechanizm działania PEP nie został dotychczas wyjaśniony. Pirogronian jest związkiem odgrywającym kluczową rolę w metabolizmie. Dzieje się tak głównie przez przemianę do acetylokoenzymu A (acetyl-CoA), który włącza się do cyklu Krebsa stanowiąc źródło energii komórkowej (oksydacyjna fosforylacja), a także metabolitów do syntezy makrocząsteczek. Pirogronian może być również przekształcany do aminokwasu alaniny, albo poprzez konwersję do mleczanu umożliwiać regenerację NAD+ konieczną do kontynuacji glikolizy w warunkach beztlenowych [11]. W ssaczych liniach komórkowych, enzym PFKFB3 (odpowiadający za syntezę 2,6-bisfosforanu fruktozy; Fru-2,6-BP), zaangażowany w regulację glikolizy oraz glukoneogenezy, degradowany jest przez kompleks ligazy ubikwityny APC/C-Cdh1, który bierze udział w kontrolowaniu przejścia z fazy G1 do fazy replikacji [61]. Glikoliza aktywowana jest w Postępy Biochemii 61 (4) 2015 odpowiedzi na zwiększony poziom Fru-2,6-BP w cytoplazmie, a jego podwyższone ilości w jądrze mogą dostarczyć sygnał do bardziej efektywnego wykorzystania glukozy w celu ułatwienia proliferacji komórek [62]. Spadek aktywności enzymu PFKFB3 w fazie S prawdopodobnie ma na celu zahamowanie szlaku glikolizy i przekierowanie glukozy do szlaku pentozofosforanowego w celu przekształcenia w rybozo-5-fosforan, konieczny do syntezy nukleotydów [63]. REGULACJA PROCESU GLIKOLIZY Większość reakcji szlaku glikolizy jest odwracalna, z wyjątkiem etapów katalizowanych przez heksokinazę (HK), fosfofruktokinazę 1 (PFK1) oraz kinazę pirogronianową (PK). Precyzyjna regulacja aktywności tych enzymów umożliwia dostosowanie wydajności całego procesu do aktualnego zapotrzebowania komórki na energię. Negatywna regulacja glikolizy Głównym etapem glikolizy podlegającym regulacji jest reakcja fosforylacji fruktozo-6-fosforanu przeprowadzana przez fosfofruktokinazę 1. Enzym ten podlega allosterycznemu hamowaniu w obecności wysokiego poziomu ATP i aktywacji w momencie pojawienia się dużych ilości AMP. Dzięki temu szybko zmieniające się zapotrzebowanie komórki na energię może być w łatwy i wydajny sposób regulowane poprzez zmiany tempa samej glikolizy [14]. Podobnej regulacji podlega również kinaza pirogronianowa [64]. Poza tym PFK1 może być hamowana przez cytrynian, będący pierwszym produktem kompletnego cyklu Krebsa. Wysoki jego poziom sygnalizuje bardzo dużą ilość intermediatów cyklu Krebsa, a tym samym zmniejszone zapotrzebowanie na dalsze rozkładanie glukozy [65]. Również znaczne obniżenie pH skutkuje hamowaniem aktywności fosfofruktokinazy 1 przez jony H+. Taka regulacja ma na celu zapobieganie w warunkach beztlenowych nadmiernemu tworzeniu kwasu mlekowego, którego kumulacja mogłaby prowadzić do kwasicy [100]. Wykazano również, że potranslacyjna glikozylacja PFK1 w miejscu Ser529 w warunkach niedotlenienia prowadzi do zahamowania aktywności tego enzymu i przekierowania metabolizmu na szlak pentozofosforanowy [66]. Innymi negatywnymi regulatorami enzymów szlaku glikolizy są glukozo-6-fosforan hamujący aktywność heksokinazy, a także acetylo-CoA oraz alanina w przypadku kinazy pirogronianowej [13]. Glukozo-6-fosforan będący produktem rekacji katalizowanej przez heksokinazę może allosterycznie hamować ten enzym. W przypadku formy mózgowej HK1 efekt ten może zostać zniesiony przez nieorganiczny fosforan (Pi) [26]. Acetylo-CoA może hamować aktywność kinazy pirogornianowej oraz obecnej w wątrobie glukokinazy [14]. Natomiast alanina, będąc aminokwasem mogącym powstać w wyniku transaminacji pirogronianu, jest wyznacznikiem ilości prekursorów do biosyntezy składników komórkowych [67]. W przypadku ich nadmiernego nagromadzenia, aminokwas ten poprzez allosteryczne hamowanie kinazy pirogronianowej, znacznie obniża tempo glikolizy. 449 Negatywna regulacja metabolizmu glukozy może również wynikać z obniżonej aktywności kinazy pirogronianowej (PKM2) w komórce (szczegóły powyżej — opis PK). W wyniku tego dochodzi do akumulacji fosfoenolopirogronianu (PEP), który przez kompetycyjne hamowanie prowadzi do obniżenia aktywności izomerazy triozofosforanowej (TPI1), a tym samym zahamowania glikolizy na wczesnym jej etapie. Ma to szczególnie istotne znaczenie dla tempa proliferacji komórek nowotworowych oraz ich adaptacji do stresu oksydacyjnego [60]. Pozytywna regulacja glikolizy Fosfofruktokinaza 1 może być allosterycznie aktywowana przez AMP przez co w komórce wraz ze spadkiem stosunku ATP/AMP wzrasta aktywność tego enzymu [68]. Innym allosterycznym aktywatorem PFK1 jest fruktozo-2,6-bifosforan (F-2,6-BP) syntetyzowany przez 6-fosfofrukto-2-kinazę (PFKFB3). Metabolit ten silnie aktywuje PFK1 powodując stymulację glikolizy nawet w warunkach wysokiego stężenia ATP, co z kolei sprzyja między innymi zwiększeniu wykorzystania glukozy do proliferacji [69]. Pozytywnej regulacji podlega również kinaza pirogronianowa, jednak została ona zaobserwowana tylko w przypadku form M2, L oraz R. Fruktozo-1,6-bisfosforan będący produktem reakcji fosfofruktokinazy 1 może aktywować kinazę pirogoronianową [70]. Wykazano również pozytywną regulację PKM2 przez aminokwas serynę. W warunkach niedoboru składników do procesów biosyntezy, np. aminokwasów, aktywność PKM2 spada [71]. REPLIKACJA DNA Dokładne kopiowanie informacji genetycznej zawartej w podwójnej helisie DNA jest niezbędne do dziedziczenia cech określających fenotyp komórek oraz całych organizmów. Dlatego, nie jest zaskoczeniem, że w tak złożony proces zaangażowany jest szereg białek, których położenie i działanie musi być dokładnie kontrolowane w celu zapewnienia zarówno odpowiedniej jego wydajności, jak i precyzji. W badaniach przeprowadzonych nad inicjacją replikacji pokazano, że podstawowe mechanizmy powielania DNA, nawet u tak odległych ewolucyjnie organizmów, jak bakterie i ssaki, przebiegają w podobny sposób. Sugeruje się, że proces replikacji istniał już u ostatniego uniwersalnego przodka (LUA, ang. last universal ancestor) [72]. W komórkach eukariotycznych replikacja DNA zachodzi tylko podczas fazy S cyklu komórkowego i podobnie jak w przypadku bakterii jest ona semikonserwatywna. Proces powielania materiału genetycznego można podzielić na trzy etapy: inicjacji, wydłużania i terminacji [73]. Replikacja chromosomów rozpoczyna się w określonych rejonach DNA, w których wyznaczone białko lub białka inicjatorowe wiążąc się z DNA tworzą kompleks nukleoproteinowy. Następnie helikaza przez miejscowe rozplecenie helisy DNA tworzy parę widełek replikacyjnych, umożliwiając polimerazom dostęp do pojedynczych nici DNA i rozpoczęcie syntezy potomnych nici [74]. Około 50 lat temu opisano pierwszy mechanizm regulujący syntezę DNA [75]. Przedstawiał on proces wiązania białka inicjatorowego, kodowanego na chromosomie, do specyficznych regionów DNA zwanych regionami inicjacji replikacji (ang. origin) oraz wskazywał na kluczowe znaczenie tego etapu w powstawaniu nowych widełek replikacyjnych. Liczba miejsc inicjacji replikacji w genomie jest w przeważającej części zależna od rozmiaru chromosomu. Genomy bakteryjne i archeonów zwykle składają się z małego kolistego chromosomu, najczęściej z pojedynczym origin replikacji [72]. U najbardziej złożonych organizmów wielkość genomu oraz około 20 razy wolniejsze tempo poruszania się widełek replikacyjnych niż u bakterii [72] wymusiło istnienie wielu miejsc inicjacji replikacji, od ok. 400 u drożdży do aż 30000–50000 u ludzi [76]. Powielenie materiału genetycznego może nastąpić tylko raz na cykl komórkowy i aby to zapewnić, konieczne było wykształcenie odpowiednich mechanizmów ściśle regulujących ten proces. Zaburzenia w regulacji inicjacji replikacji mogą prowadzić do wytworzenia wielu kopii jednego regionu genomowego w pojedynczej komórce. Sprzyja to niestabilności genomu i często wiąże się z występowaniem nowotworów i innych chorób [77]. Również pominięcie pewnej części DNA podczas replikacji (na przykład wybranego genu supresorowego) może być niebezpieczne dla komórki. Podobnie jak w przypadku amplifikacji genów, taki błąd również może być przyczyną zapoczątkowania procesu transformacji nowotworowej komórek [78]. MIEJSCA INICJACJI REPLIKACJI U drożdży Saccharomyces cerevisiae na podstawie sekwencji zidentyfikowano miejsca inicjacji replikacji i określono je jako ARS (ang. Autonomously replicating sequences) [73]. Natomiast z badań przeprowadzonych na ludzkich komórkach wykazano, że eukariotyczne miejsca inicjacji replikacji są prawdopodobnie w większym stopniu definiowane organizacją chromatyny niż sekwencją DNA. Jednak nie są one całkowicie przypadkowe, na co wskazywałby fakt ich występowania w sekwencjach zachowanych w ewolucji [79]. Ponadto wiele origin odpowiada aktywnym transkrypcyjnie regionom DNA lub innym rejonom umożliwiającym dostęp do białek wiążących się do origin (OBP, ang. origin binding proteins). Zalicza się do nich sekwencje bogate w pary AT, powtórzenia dwunukleotydowe czy asymetryczne sekwencje puryna-pirymidyna [79]. W chromosomach eukariotycznych istnieje wiele potencjalnych miejsc inicjacji replikacji, jednak nie wszystkie funkcjonują w każdej komórce. Również nie wszystkie origin są aktywne w tym samym momencie, przy czym kolejność ich uruchamiania podlega ścisłej kontroli [76]. Ponieważ mogą one być aktywowane w różnych momentach fazy S, często klasyfikuje się je jako origin aktywowane we wczesnej, w połowie lub pod koniec tej fazy. Poza tym, tylko część wszystkich potencjalnych miejsc inicjacji replikacji jest używana w każdym cyklu komórkowym, natomiast inne są aktywowane i wykorzystywane w warunkach, które istotnie wpływają na przebieg fazy S, takich jak uszkodzenie DNA lub zmiany warunków wzrostu [76,79]. 450www.postepybiochemii.pl Wydajność „uruchamiania” origin u drożdży Saccharomyces cerevisiae i Saccharomyces pombe wynosi poniżej 50% [80]. Z kolei u zwierząt tkankowych jest ona jeszcze mniejsza i osiąga w określonych domenach replikacji tylko 5–20% [81]. INICJACJA REPLIKACJI Wiele danych dotyczących inicjacji replikacji uzyskano z badań przeprowadzonych w komórkach drożdży. Wskazują one, że inicjacja replikacji rozpoczyna się od przyłączenia heksametrycznego kompleksu ORC (ang. Origin Recognition Complex) do origin replikacji [72]. Budowę kompleksu replikacyjnego oraz poszczególne etapy jego powstawania przedstawia rycina 3. Spośród wszystkich podjednostek ORC, pięć należy do rodziny ATPaz związanych z różnymi aktywnościami komórkowymi (AAA+, ang. ATPases associated with diverse cellular activities). Białka wchodzące w skład kompleksu ORC wraz z dodatkowymi białkami Cdc6 i Cdt1 (czynniki licencjonujące) odpowiadają za rekrutację białek MCM (ang. Minichromosome Maintenance), pełniących funkcję helikazy. U wyższych eukariota do inicjacji replikacji również wymagana jest obecność ORC, Cdc6 oraz Cdt1. U ssaków kompleks ORC składa się z podjednostek ORC2-ORC5, które mogą słabo oddziaływać z ORC1 oraz ORC5 [82]. Ponadto u wyższych eukariota ORC przyłącza się nie tylko do miejsc inicjacji replikacji, ale także do centrosomów, centromerów, heterochromatyny czy sekwencji telomerowych [82,83]. Dodatkowo badania na ludzkich komórkach wykazały udział białka ORCA w przyłączaniu się kompleksu ORC do chromatyny, białko to oddziałuje również z Cdt1 oraz gemininą [83]. U wyższych eukariota, helikaza jest kompleksem zbudowanym z sześciu podjednostek (białka MCM 2-7) należących do białkowych ATPaz AAA+, z których każda z nich kodowana jest przez oddzielny, homologiczny gen [84]. Pomimo, iż białka MCM po raz pierwszy zostały wyizolowane z mutantów drożdży Saccharomyces cerevisiae [85], to ich homologi występują u wszystkich organizmów eukariotycznych. U drożdży, podczas inicjacji replikacji, białka MCM 2-7 łączą się z białkiem Cdt1, tworząc kompleks, który zostaje zrekrutowany do powstałego kompleksu DNA-ORC-Cdc6. Następnie w wyniku hydrolizy ATP przez białko Cdc6 dochodzi do zmian konformacyjnych w kompleksie ORC i uwolnienia Cdt1 [86]. Jednocześnie ma miejsce umieszczenie helikazy, która po otoczeniu jednej z nici rodzicielskich i pozyskaniu energii z hydrolizy ATP, przesuwa się wzdłuż pojedynczej nici DNA w kierunku 3’-5’. Ładowanie białek helikazy MCM 2-7 zachodzi pod koniec mitozy oraz w fazie G1 i stanowi potwierdzenie gotowości do replikacji [79]. Wszystkie te białka razem tworzą kompleks prereplikacyjny (pre-RC) [73,79,87]. Po umieszczeniu helikazy MCM 2-7 w miejscu inicjacji replikacji białko Cdt1 odłącza się od kompleksu pre-RC i w komórkach drożdży eksportowane jest do cytoplazmy [79]. W ludzkich komórkach Cdt1 podczas fazy S częściowo ulega proteolizie przy udziale jednego z dwóch kompleksów mających właściwości ligazy ubikwityny, SCFSkp2 lub Ddb1-Cu14-Roc-1 [88]. Jednak, aby możliwe było szybkie montowanie kompleksu pre-RC u wyższych eukariontów część wolnego białka Cdt1 pozoPostępy Biochemii 61 (4) 2015 staje jedynie inaktywowana przez związanie z gemininą występującą w fazach S-G2-M. Za degradację gemininy w czasie mitozy odpowiada kompleks APC/C (ang. anaphase promoting complex/cyclosome) [87]. Ścisła kontrola poziomu oraz przyłączania białek pre-RC do rejonu origin replikacji, uniemożliwia ponowne utworzenie kompleksu replikacyjnego i rozpoczęcie replikacji genomowego DNA w kolejnych fazach tego samego cyklu komórkowego. Ufosforylowanie białek Orc1, Cdt1 oraz Cdc6 prowadzi do zahamowania ich aktywności. W komórkach ludzkich białko ORC1, podobnie jak wspomniane wcześniej białko Cdt1, po ubikwitylacji ulega degradacji podczas fazy S. Natomiast fosforylacja Cdc6 chroni to białko przed degradacją. Wiadomo, że część Cdc6 białka eksportowana jest do cytoplazmy [89]. Taki dynamicznie zmieniający się układ gwarantuje, że pre-RC powstaje tylko w fazie G1 i jest ściśle hamowany poza nią, służąc, jako jeden z mechanizmów licencjonowania replikacji, który jest istotny dla utrzymania stabilności genomu [73]. Aby uformować aktywną helikazę wymagana jest obecność dodatkowych białek Cdc45 oraz GINS, które zarówno u drożdży, jak i u wyższych eukariota tworzą razem kompleks CMG (Cdc45-MCM 2-7-GINS) [79,87]. Bez tych dodatkowych białek MCM 2-7 nie ma aktywności helikazy i nie ma możliwości przesuwania się wzdłuż nici DNA [90]. Do zmiany konformacji oraz aktywacji MCM 2-7 dochodzi w fazie S pod wpływem połączonego działania kinazy DDK (zależna od Dbf4 kinaza Cdc7) oraz kinazy CDK [79,87]. U ssaków aktywność kinaz Cdc7 oraz Cdk2 zależy od białek będących pod kontrolą czynników transkrypcyjnych E2F: Dbf4 w przypadku Cdc7 oraz cyklin A i E dla Cdk2 [72,79,91]. Kinazy te u drożdży promują wiązanie Cdc45, GINS, Sld3, Sld2 oraz Dpb11 do miejsc origin replikacji. Wszystkie one są istotne do aktywacji origin [73,92]. U kręgowców zidentyfikowano homologi drożdżowych białek niezbędnych do rekrutacji białka Cdc45 oraz inicjacji replikacji, są to: RecQL4 (Sld2), TICRR (Sld3) oraz TopBP1 (Dbp11) [83]. Po aktywacji kompleks helikazy MCM 2-7 przechodzi z podwójnego heksameru otaczającego podwójną nić DNA do pojedynczego heksameru CMG otaczającego ssDNA. Mechanizm tego przejścia nie został dotąd poznany. Kompleks CMG ma aktywność helikazową i porusza się wzdłuż widełek replikacyjnych rozwijając DNA [92]. U wyższych eukariota do załadowania MCM 2-7 mogą być wymagane dodatkowe białka, jak na przykład Mcm9 i Hbo1 u żab z rodzaju Xenopus oraz ludzi (szczegółowy opis [93]). Budowa kompleksu replikacyjnego oraz poszczególne etapy jego powstawania u Metazoa przedstawione są na rycinie 3. Po utworzeniu pojedynczych nici DNA swoją aktywność rozpoczynają polimerazy DNA. Za przyłączenie polimeraz do miejsc początku replikacji odpowiadają białka związane z kompleksem pre-RC, tworzące wraz z nim tzw. widełki replikacyjne. Za rekrutację polimerazy α do kompleksu u wszystkich eukariota odpowiada białko Mcm10 łączące się z MCM 2-7 [94]. Natomiast za przyłączenie polimeraz δ i ε odpowiada Cdc45, wpływający także na przejście kompleksu pre-RC w pre-IC (kompleks pre-inicjacyjny) [95]. 451 synteza odbywa się w formie krótkich fragmentów Okazaki wymagających oddzielnych starterów. Gdy polimeraza δ napotka starter poprzedniego fragmentu Okazaki, następuje jego usunięcie. W proces ten zaangażowane są białka o aktywności nukleazy: RNaza H, Dna2 (DNA helikaza/endonukleaza 2) oraz endonukleaza Fen-1 (ang. Flap endonuclease) [98]. Powstała po usunięciu starteru luka zostaje wypełniona przez polimerazę δ. Natomiast za połączenie powstałych fragmentów Okazaki odpowiada zależna od ATP ligaza DNA I. Istotny dla tego procesu jest również udział antygenu PCNA oraz czynnika RFC [97]. Terminacja następuje w miejscach określanych jako TER (ang. termination regions), w których spotykają się nowo syntetyzowane nici DNA powstałe z dwóch sąsiadujących miejsc origin. Badania na drożdżach Saccharomyces cerevisiae wskazują na istotny udział w tym procesie białka helikazy Rrm3 oraz topoizomerazy Top2 [99]. Ponieważ ruch polimerazy odbywa się tylko w jednym kierunku, usunięcie terminalnego startera Rycina 3. Budowa kompleksu replikacyjnego oraz poszczególne etapy jego powstawania u Metazoa (na podstawie [93], zmienione). Formowanie kompleksu prereplikacyjnego (pre-RC) zachodzi w fazie G1 i rozpoczyna się od wiąRNA z nici opóźnionej prowadzi zania kompleksu ORC do miejsca inicjacji replikacji. Następnie dołącza się białko Cdc6 konieczne do załadowania do powstania cząsteczki potombiałek helikazy MCM przy pomocy Cdt1. Do aktywacji helikazy w fazie S cyklu komórkowego niezbędna jest obecnej z niekompletnym końcem 5’. ność białek Cdc45 oraz GINS. Następnie po utworzeniu widełek replikacyjnych rozpoczyna się synteza nowych nici DNA- ciągłej przez polimerazę ε oraz opóźnionej przez polimerazę δ. Dodatkowo w regulacji tego procesu biorą Skutkuje to skróceniem sekwencji udział kinazy CDK2 oraz Cdc7 fosforylujące białka kompleksu pre-RC w celu skierowania ich do degradacji oraz DNA po każdym cyklu replikaprzyłączające grupę fosforanową do czynników biorących udział w aktywacji helikazy oraz wiązaniu polimeraz do miejsca inicjacji replikacji. Pierścieniom odpowiadają: niebieski — replikacyjny czynnik C (RFC), różowy — antygen cyjnym, wyznaczając tym samym PCNA. Szczegółowy opis w tekście. limit liczby podziałów komórki, który u człowieka wynosi około 80 [100]. Strukturalne elementy na ELONGACJA I TERMINACJA końcu chromosomu ulegające skróceniu zwane są telomeWieloenzymatyczny kompleks zawierający polimerarami. Osiągnięcie krytycznej długości telomerów prowadzi zę DNA katalizuje przyłączanie deoksyrybonukleotydów do indukcji replikacyjnego stanu spoczynkowego, różnicodo 3’ końca DNA. Za syntezę starterów koniecznych do wania lub apoptozy [101]. DNA intensywnie dzielących się inicjacji syntezy DNA odpowiada polimeraza α, w skład, komórek, a także komórek zarodkowych, macierzystych której wchodzi podjednostka o aktywności prymazy [96]. czy skóry chronione jest przed skracaniem po każdym koAby zapobiec ponownej asocjacji nici DNA, po rozplelejnym cyklu replikacyjnym dzięki aktywności odwrotnej ceniu helisy do jednoniciowego DNA dzięki aktywności transkryptazy, zwanej telomerazą [101]. Natomiast w koGINS przyłączają się białka A (RPA, ang. replication protein mórkach somatycznych nie stwierdza się obecności tego enA) [90]. Dodatkowo, aby zwiększyć kontakt polimerazy z zymu [100]. Reaktywacja aktywności telomerazy związana DNA i wpłynąć na jej procesywność, konieczny jest udział jest z procesem nowotworzenia [102]. antygenu jądrowego proliferujących komórek PCNA (ang. CENTRALNY METABOLIZM WĘGLA proliferating cell nuclear antigen). Za regulację oddziaływania A REPLIKACJA DNA antygenu PCNA z kompleksem polimerazy i DNA odpowiada replikacyjny czynnik C — RFC (ang. replication factor C) [97]. Ponieważ nici DNA są antyrównoległe, a sama reDwa główne procesy, metabolizm oraz replikacja DNA, plikacja może zachodzić tylko w jednym kierunku, widełki odpowiedzialne za utrzymanie oraz powielenie materiału replikacyjne są asymetryczne. Na jednej nici (wiodącej) dogenetycznego komórki dotychczas badane były oddzielnie, dawanie nukleotydów odbywa się w sposób ciągły dzięki z nielicznymi wyjątkami dotyczącymi organizmów prokaaktywności polimerazy ε [97]. Natomiast na nici opóźnionej riotycznych [103]. Replikacja DNA, jako proces wymagający 452www.postepybiochemii.pl dużej ilości energii w sposób oczywisty musi być zależna od metabolizmu komórkowego. Jednak przez długi czas uważano, że zależność ta jest jedynie pośrednia i potencjalnie może wynikać z różnej dostępności energii komórkowej lub prekursorów makrocząsteczek [104]. Jako potwierdzenie tej tezy prezentowano wyniki badań przeprowadzonych w warunkach niedoboru składników odżywczych i związanej z nim produkcji w komórkach bakterii specyficznych alarmonów, takich jak czterofosforan guanozyny (ppGpp) oraz cykliczny AMP (cAMP) [103]. Również analiza metabolicznego cyklu drożdży (YMC, ang. yeast metabolic cycles) ujawniła, że każda jego faza może być utożsamiana z równoważną fazą klasycznego cyklu komórkowego. Późniejsze badania dodatkowo wykazały, że stężenie wewnątrzkomórkowych metabolitów będących składnikami biosyntezy, w tym aminokwasów, nukleotydów oraz energetycznych związków pośrednich jak NADP(H) czy acetylo-CoA zmieniało się okresowo wraz z cyklami metabolicznymi [105]. CENTRALNY METABOLIZM WĘGLA A REPLIKACJA DNA U PROKARIOTA Przeprowadzone przed kilkoma laty badania wykazały, że replikacja DNA może być bezpośrednio powiązana z centralnym metabolizmem węgla, a w szczególności z glikolizą u Gram-dodatnich bakterii Bacillus subtilis [106]. Zaobserwowano specyficzną supresję warunkowo letalnych (temperaturo-wrażliwych) mutacji w genach kodujących białka biorące udział w procesie replikacji DNA (DnaE – polimeraza DNA zaangażowana w syntezę nici opóźnionej, DnaC — helikaza, homolog białka DnaB u Escherichia coli oraz DnaG — prymaza) poprzez wprowadzenie mutacji w genach kodujących enzymy zaangażowane w reakcje w późnych etapach glikolizy i glukoneogenezy. Na podstawie uzyskanych danych zasugerowano istnienie domniemanego metabolicznego łącznika mogącego powodować zmiany w konformacji białek replikacyjnych, aby modulować właściwości replisomu [106]. Podobne analizy przeprowadzono w Gram-ujemnych komórkach bakterii Escherichia coli [107]. Uzyskane wyniki potwierdziły wcześniej obserwowane zależności w przypadku genów dnaE, dnaB oraz dnaG (Ryc. 4). Wykazano również efekt niwelowania temperaturo-wrażliwości w przypadku mutacji w genach dnaN (gen kodujący podjednostkę beta polimerazy DNA III) i dnaA (gen kodujący białko inicjatorowe). Ponadto zaobserwowano wzrost bakterii w subletalnych dla tych mutantów temperaturach nie tylko w przypadku braku enzymów zaangażowanych w szlak glikolizy i glukoneogenezy (geny: pgi — izomerazy glukozofosforanowej i gpmA — fosfogliceromutazy I), ale również w innych szlakach CCM, takich jak szlak pentozofosforanowy (gen tktB — transketolazy II) oraz octanowy (geny pta — acetylotransferazy fosforanowej i ackA — kinazy octanowej). Sugeruje to istnienie u Escherichia coli szerszego niż u Bacillus subtilis powiązania pomiędzy replikacją DNA a CCM [107]. U Bacillus subtilis mutacje w genach związanych z metabolizmem komórkowym wpływały głównie na etap elongacji [106], natomiast u Escherichia coli wykazano powiązanie między CCM a replikacją zarówno na etapie inicjacji, jak i elongacji [107]. Ponadto Maciąg i wsp. [108] wykazali, że wpływ enzymów CCM na replikację DNA dotyczy nie tylko kontroli inicjacji i wydajności syntezy DNA, ale również wierności tego procesu. Dysfunkcje odpowiednich enzymów CCM zaangażowanych w reakcje szlaku pentozofosforanowego (produkt genu zwf — 1-dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu), metabolizmu pirogronianu (produkty genów pta oraz ackA) oraz cyklu Krebsa (produkty genów acnB — hydratazy akonitynianowej B, icd — dehydrogenazy izocytrynianowej specyficznej dla NADP+) prowadziły do zniesienia, bądź wzmocnienia zaburzeń w wierności powielania DNA, powodowanych przez mutacje dnaQ49 oraz dnaX36 (odpowiednio geny kodujące podjednostki ε i τ polimerazy DNA III). Dla przykładu, mutacje w genach pta i ackA powodowały efekt supresji w szczepie dnaQ49, natomiast w szczepie dnaX36 wzmacniały obserwowane negatywne efekty fenotypowe [108]. Wyniki te sugerują istnienie bardziej skomplikowanego niż wcześniej zapropoRycina 4. Wpływ mutacji w wybranych genach kodujących białka zaangażowane w reakcje centralnego metabolizmu węgla nowany przez Janniere i na mutacje w genach odpowiadających wybranym białkom biorącym udział w replikacji DNA w komórkach Bacillus subtilis wsp. [106] mechanizmu oraz Escherichia coli ([103], zmienione). Kolor pomarańczowy dotyczy danych uzyskanych dla B. subtilis, niebieski dla E.coli. łączącego centralny meObecność kropki świadczy o zaobserwowanym efekcie niwelowania temperaturo-wrażliwości powodowanej mutacją w danym genie związanym z replikacją DNA przez mutację w odpowiednim genie szlaku metabolicznego. Geny i kodowane przez nie tabolizm węgla z replibiałka: pgm — mutaza fosfoglicerynianowa, pgk — kinaza fosfoglicerynianowa, eno — enolaza, pyk — kinaza pirogronianowa, pgi kacją DNA. — izomeraza glukozofosforanowa i gpmA — fosfogliceromutaza I, tktB- transketolaza II, pta — acetylotransferaza fosforanowa, ackA — kinaza octanowa, dnaE — polimeraza DNA zaangażowana w syntezę opóźnionej nici, dnaG — prymaza, dnaN — beta podjednostka polimerazy DNA III, dnaA — białko inicjatorowe. Postępy Biochemii 61 (4) 2015 453 Ponadto wyniki badań mikroskopowych przeprowadzonych na mutantach Escherichia coli, w wybranych genach zaangażowanych w replikację, wykazały wpływ mutacji w genach CCM na fizjologię komórek. Komórki bakteryjne niosące mutacje w genach kodujących białka replikacyjne cechują się powolnym wzrostem i problemami z podziałem komórkowym, a także nitkowatym kształtem i zmienionym położeniem materiału jądrowego. Wprowadzenie odpowiednich mutacji w genach CCM skutkowało odzyskaniem prawidłowego kształtu oraz położenia nukleoidu [109]. ROLA ENZYMÓW SZLAKU GLIKOLIZY W REGULACJI CYKLU KOMÓRKOWEGO I REPLIKACJI DNA U EUKARIOTA Już wiele lat temu wykazano obecność enzymów glikolitycznych w jądrze komórkowym. Należą do nich: aldolaza (ALDO), dehydrogenaza mleczanowa (LDH), kinaza fosfoglicerynianowa (PGK) i dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAPDH) [110]. Niemniej jednak, pomimo upływu wielu lat od publikacji tych danych oraz prowadzenia intensywnych badań, wiedza na temat możliwej ich roli w regulacji cyklu komórkowego, a tym bardziej replikacji, nadal jest niezbyt rozległa. W jądrze komórkowym aldolaza A wiąże się głównie z regionami DNA bogatymi w sekwencje AT [110], prawdopodobnie uczestnicząc w aktywacji transkrypcji genów kodujących białka zaangażowane w przebieg fazy S, a także w samą replikację DNA [35,111]. Wskazywać na to może również istnienie pewnej korelacji pomiędzy ilością ALDOA w jądrze a proliferacją komórek. Poza tym aldolaza może wpływać na cykl komórkowy poprzez oddziaływanie z F-aktyną, szczególnie podczas cytokinezy. Wyciszenie ekspresji genu aldolazy w komórkach fibroblastów mysich powodowało zaburzenia w procesie cytokinezy, prowadząc do powstawania komórek zawierających co najmniej dwa jądra [111]. Pośród licznych funkcji pełnionych przez GAPDH w komórce [39] na uwagę zasługuje fakt jego udziału, razem z dehydrogenazą mleczanową p36/LDHA, w kompleksie OCA-S, w aktywacji promotora genu kodującego histon H2B. Obecne w jądrze białko p38/GAPDH jest niezbędne do transkrypcji genu H2B, co potwierdziły badania polegające na wyciszeniu ekspresji genu kodującego to białko. Ponieważ powstałe po przejściu widełek replikacyjnych potomne helisy DNA muszą zostać upakowane w strukturę nukleosomową, konieczna jest synteza histonów rdzeniowych (H2A, H2B, H3, H4). W komórkach z wyciszoną ekspresją GAPDH na skutek braku aktywacji promotora genu H2B doszło do zablokowania przejścia cyklu komórkowego przez fazę S [112]. Wykazano również, że GAPDH może być zaangażowane w regulację cyklu komórkowego przez modulowanie aktywności kompleksu cyklina B-CDK1. Modulacja ta może polegać nie tylko na zniesieniu hamującego działania białka SET na ten kompleks, ale także na bezpośrednim oddziaływaniu GAPDH z cykliną B-CDK1. Nadprodukcji białka GAPDH w komórkach towarzyszyła zwiększona aktywność kompleksu cykliny B-CDK1 oraz zwiększona liczba mitoz [113]. Natomiast wyciszenie ekspresji genu GAPDH w komórkach nowotworowych prowadziło do stabilizacji białka p53 i zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G1. Działo się tak, ponieważ doszło do nagromadzenia indukowanego przez p53 białka p21, a w konsekwencji do zahamowania CDK2 oraz CDK4 [114]. GAPDH oddziałuje również z Ap4A, specyficznym nukleotydem, uczestniczącym w modulowaniu replikacji i naprawy DNA [115]. Kinaza pirogronianowa PKM2 w jądrze komórkowym bezpośrednio fosforyluje histon H3, natomiast PKM1 nie ma tej aktywności [116]. Ponadto monomeryczna forma PKM2 prowadzi do aktywacji ekspresji genów kodujących związaną z cyklem komórkowym cyklinę D oraz czynnik transkrypcyjny c-Myc, promując tym samym progresję cyklu komórkowego oraz efekt Warburga [117]. Ponadto PKM2 może być zaangażowana w zależny od receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR, ang. epidermal growth factor) postęp cyklu komórkowego [118]. W zależności od stanu fosforylacji dehydrogenazy mleczanowej (LDH) może ona znajdować się w cytoplazmie albo jądrach komórek ssaczych. Wchodząc w skład kompleksu OCA-S odgrywa rolę w regulacji transkrypcji genu H2B [112]. Prawdopodobnie bierze również udział w replikacji DNA przez wpływ na aktywność polimeraz. W zależności od stanu fosforylacji białka LDH obserwowano wzrost bądź spadek aktywności polimeraz α, δ lub ε [42]. Obniżenie aktywności LDHA w komórkach nowotworowych drastycznie zatrzymywało wzrost komórek i prowadziło do aktywacji apoptozy [119]. Najnowsze badania wskazują również na udział heksokinazy 2 w regulacji cyklu komórkowego poprzez fosforylację cyklino-zależnej kinazy 2 (CDK2). Obniżenie poziomu ekspresji genu HK2 powodowało zatrzymanie cyklu komórkowego w zmienionych nowotworowo fibroblastach w fazie G1 [120]. Ponadto podobny efekt obserwowano także w przypadku innych komórek nowotworowych LSCC (ang. laryngeal squamous cell carcinoma) z wyciszoną ekspresją tego genu [121]. Poza tym wyciszenie ekspresji genu ENO1 kodującego α-enolazę powodowało spadek wydajności proliferacji w komórkach nowotworowych, czemu towarzyszył obniżony poziom cykliny D1, cykliny E1 oraz pRB (ang. retinoblastoma protein) [122]. Białko pRB wiąże się z czynnikami transkrypcyjnymi, między innymi z E2F, który ma krytyczne znaczenie w przejściu komórki przez punkt kontrolny na granicy faz G1/S oraz wpływa na aktywację genów fazy S. W oparciu o otrzymane wyniki zasugerowano istnienie wpływu obniżonej wydajności ekspresji ENO1 na unieczynnienie szlaku PI3K/Akt [122]. Pomimo prowadzenia rozległych badań nad procesami glikolizy oraz replikacji DNA u Prokariota oraz Eukariota, nadal nie udało się uzyskać odpowiedzi na wiele nurtujących pytań. Między innymi nie zostały zidentyfikowane mechanizmy bezpośredniego powiązania pomiędzy tymi dwoma procesami. Co prawda, ukazało się kilka prac wskazujących na istnienie takich zależności u bakterii B. subtilis i E. coli [106-109], u których wprowadzenie dodatkowych mutacji w niektórych genach kodujących enzymy central- 454www.postepybiochemii.pl nego metabolizmu węgla znosiło negatywne efekty mutacji w genach kodujących białka replikacyjne, ale w przypadku organizmów eukariotycznych, dane te są nadal nieliczne. Do tego bardzo często pochodzą one z badań nad komórkami nowotworowymi [123,124] charakteryzującymi się obecnością zaburzeń w funkcjonowaniu zarówno procesów związanych z metabolizmem, jak i replikacją DNA. Stąd też często pojawiało się pytanie o rzeczywiste zależności występujące pomiędzy tymi dwoma procesami. Ostatnie badania, przeprowadzone z wykorzystaniem ludzkich fibroblastów, wskazały na istotne zmiany w przebiegu cyklu komórkowego w warunkach częściowego wyciszenia ekspresji genów kodujących enzymy szlaku glikolizy [125,126]. Obniżenie wydajności ekspresji genów HK2, PFKM, TPI, GAPDH i LDHA skutkowałoznacznym spadkiem ilości komórek w fazie S w stosunku do kontroli. Wyciszenie ekspresji genu ENO1 powodowało opóźnienie wejścia w fazę S o około 2 h w stosunku do komórek nietraktowanych czynnikiem wyciszającym (siRNA). Z kolei obniżenie poziomu mRNA genu GPI powodowało wzrost ilości komórek wchodzących w fazę S w stosunku do komórek kontrolnych. Natomiast zamiany wydajności ekspresji genów ALDOA, PGK1, PGAM1 i PKM2 nie wpływały istotnie na przebieg cyklu komórkowego ludzkich fibroblastów. MOŻLIWE MECHANIZMY FUNKCJONALNEGO POWIĄZANIA CENTRALNEGO METABOLIZMU WĘGLA, W TYM GLIKOLIZY, Z REPLIKACJĄ DNA I CYKLEM KOMÓRKOWYM Jak wspomniano powyżej, do niedawna uważano, że procesy CCM i replikacji DNA powiązane są ze sobą raczej w sposób pośredni, głównie poprzez dostarczaną energię, niezbędną do powielenia materiału genetycznego, jak i substraty w postaci deoksyrybonukleotydów [104]. Niemniej jednak, najnowsze wyniki badań przeprowadzonych nad organizmami prokariotycznymi sugerują istnienie dużo bardziej złożonych powiązań pomiędzy tymi dwoma procesami [106-109] Zaproponowano kilka możliwych mechanizmów, które mogłyby za nie odpowiadać [106,127] Pierwszy z nich zakłada rolę metabolitów pośrednich jako cząsteczek sygnałowych, których nagromadzenie mogłoby prowadzić do dużych zmian w fizjologii komórki. Drugi wskazuje na bezpośredni wpływ niezrównoważonego poziomu metabolitów, bądź braku aktywności określonych enzymów na zmiany w potranslacyjnych modyfikacjach, a w konsekwencji na aktywność maszynerii replikacyjnej. Trzecią możliwością mogą być bezpośrednie oddziaływania białko-białko pomiędzy enzymami CCM a białkami replikacyjnymi. Wyjaśnienie funkcjonowania tego mechanizmu z pewnością dostarczyłoby nowych informacji o regulacji cyklu komórkowego, czy procesu nowotworzenia. Tym bardziej, że komórki nowotworowe cechuje zarówno zwiększone tempo glikolizy i związany z tym podwyższony poziom enzymów zaangażowanych w reakcje zachodzące w tym szlaku, jak i zmniejszona dokładność samego procesu replikacji DNA [128]. Pomimo, iż glikoliza jest procesem mało efektywnym pod względem produkcji ATP, w stosunku do fosforylacji oksydacyjnej [14] to bywa ona preferowana w przypadku Postępy Biochemii 61 (4) 2015 niektórych organizmów czy tkanek [16]. Zaburzenia w jej funkcjonowaniu mogą skutkować zmianą przebiegu całego cyklu komórkowego, w tym syntezy DNA [103,126]. W zależności od etapu, na którym dojdzie do zakłócenia procesu replikacji, komórka nie powieli materiału genetycznego, ewentualnie nie uruchomi wszystkich mechanizmów odpowiedzialnych za sprawdzenie wierności syntezy podczas wydłużania nici potomnej DNA. Pomimo wielu lat badań nad rolą enzymów glikolitycznych w komórkach ludzkich, a przede wszystkim skutkach ich niedoboru lub całkowitego braku, obecna wiedza na ten temat jest nadal niewielka [123,124]. W większości dane pochodzą z prac nad komórkami nowotworowymi lub pojedynczymi enzymami glikolitycznymi. W tym świetle dokładniej przedyskutowane zostaną poniżej rezultaty ostatnich badań, w których wpływ wyciszenia ekspresji genów (za pomocą siRNA) kodujących enzymy przeprowadzające poszczególne reakcje glikolizy na przebieg cyklu komórkowego badano w hodowlach ludzkich fibroblastów nie wykazujących cech transformacji nowotworowej [125,126]. Badane geny można było podzielić na cztery grupy w zależności od obserwowanych efektów. Pierwszą, a zarazem najliczniejszą grupę stanowiły geny HK2, PFKM, TPI, GAPDH i LDHA, których wyciszenie skutkowało spadkiem ilości komórek w fazie S w stosunku do kontroli nawet o ponad 50%. Potwierdziły to także analizy poziomu syntezy DNA oparte o pomiar inkorporacji BrdU do nowo powstających nici DNA. Wyciszenie ekspresji genów kodujących heksokinazę 2 oraz dehydrogenazę aldehydu 3-fosfoglicerynowego powodowało około 40% spadek wcielania BrdU. W przypadku pozostałych genów efekt ten był znacznie mniejszy, na poziomie kilkunastu procent. Wyniki te są zgodne z innymi danymi literaturowymi. Wyciszenie ekspresji genu HK2 w komórkach nowotworowych jelita czy krtani także skutkowało opóźnieniem, a nawet zatrzymaniem cyklu komórkowego w fazie G0/G1 [121,129]. Wyciszenie ekspresji genu GAPDH prowadziło do zahamowania proliferacji i zatrzymania w fazie G1 komórek nowotworowych płuca i nerki, czy też zahamowania przejścia przez fazę S w komórkach kostniakomięsaka [112,114]. Obniżenie efektywności proliferacji zaobserwowano także w przypadku mniej wydajnej transkrypcji genu LDHA w nowotworze trzustki [119] czy w komórkach HeLa po wyciszeniu ekspresji genu PFKFB3, którego produkt reakcji jest aktywatorem fosfofruktokinazy 1 [130]. Do drugiej grupy zaliczono gen ENO1, którego wyciszenie powodowało opóźnienie wejścia w fazę S o około 2 h w stosunku do komórek kontrolnych nietraktowanych siRNA. Wyniki te są zgodne z innymi danymi literaturowymi, ponieważ podobną sytuację obserwowano także w przypadku badań nad rakiem wątrobowokomórkowym, gdzie spadek poziomu ekspresji ENO1 powodował zmniejszenie ilości komórek w fazie replikacji [131]. Trzecią grupę stanowiły geny, których wyciszenie nie wywierało istotnego wpływu na wchodzenie komórek w fazę S oraz poziom syntezy DNA. Do tej grupy należą ALDOA, PGK1, PGAM1, PKM2. Wśród nich, brak efektów wyciszenia ekspresji genów PKM2 oraz PGAM1 znajduje potwierdzenie w innych pracach. Pomimo, iż specyficzne 455 wyciszanie ekspresji genu kodującego izoformę PKM2 kinazy pirogronianowej zmniejszało żywotność oraz zaburzało wzrost komórek nowotworowych [132], to jednak w przypadku zdrowych nietransformowanych komórek (w tym fibroblastów) wpływ ten był znikomy [132]. Może to wynikać z obecnej w zdrowych komórkach formy PKM1 na poziomie umożliwiającym normalne funkcjonowanie komórek, bądź też z dodatkowych funkcji PKM2, jak na przykład udział w aktywacji VEGF czy większej wrażliwości komórek nowotworowych na różne zaburzenia [132]. Wytłumaczeniem tego zjawiska może też być fakt, że niektóre dzielące się komórki wykorzystują niezależny od kinazy pirogronianowej metabolizm glukozy [49]. Podobnie wyciszenie ekspresji genu PGAM1, kodującego mutazę fosfoglicerynianową prowadziło do obniżenia wydajności proliferacji komórek białaczkowych, ale nie miało wpływu na zdrowe komórki fibroblastów czy keratynocytów [59]. Natomiast w przypadku pozostałych dwóch genów dane literaturowe wskazują na przeciwny efekt ich wyciszenia do ostatnio obserwowanego [126]. Spadek poziomu ekspresji genu ALDO powodował obniżenie efektywności proliferacji o 80% w mysich fibroblastach NIH-3T3, prawdopodobnie w wyniku zaburzenia cytokinezy [111]. Również obniżenie wydajności proliferacji nastąpiło po wyciszeniu ekspresji genu PGK1 w komórkach rakowych żołądka [133]. Ostatnią grupę stanowił gen GPI, którego wyciszenie powodowało wzrost ilości komórek wchodzących w fazę S w stosunku do komórek kontrolnych. Efekt ten potwierdzają także wyniki badań poziomu syntezy DNA, ponieważ wyciszenie ekspresji GPI powodowało wzrost poziomu syntezy DNA. Wyniki te są przeciwne do danych otrzymanych z badań na komórkach nowotworowych czy zarodkowych [134,135]. Jednak z uwagi na to, że białko kodowane przez gen GPI pełni również rolę cytokiny wzmagającej mobilność komórek nowotworowych oraz czynnika dojrzewania [31] być może dlatego w fibroblastach HDFa nie zaobserwowano obniżenia wydajności proliferacji ani zmian w przejściu przez fazę replikacji [126]. Kinetyka replikacji DNA, jak przez długi czas uważano, może pośrednio zależeć od dostępności energii komórkowej lub prekursorów makrocząsteczek [104]. Fakt ten potwierdzały także analizy metabolicznego cyklu drożdży (YMC, ang. yeast metabolic cycles) sugerujące, że każda jego faza może być utożsamiana z równoważną fazą klasycznego cyklu komórkowego [105]. Najnowsze badania wskazują na jeszcze jedną możliwość regulacji procesu replikacji poprzez bezpośrednie oddziaływanie białko-białko [106,127] pomiędzy enzymami glikolitycznymi a białkami replikacyjnymi. Wykazano, że efekty fenotypowe mutacji w genach replikacyjnych dnaC/dnaB, dnaE i dnaG są znoszone między innymi przez mutacje w genach glikolitycznych pgm, pgk, eno i pyk u Bacillus subtilis [106] oraz pgi i gpmA u Escherichia coli [107]. Natomiast w przypadku organizmów eukariotycznych również istnieje kilka przesłanek wskazujących na podobny sposób regulacji procesu replikacji przez enzymy glikolityczne. Były one przedstawione w poprzednich rozdziałach, niemniej jednak podsumujemy je tutaj krótko. Po pierwsze, GAPDH będący genem metabolizmu podstawowego koduje wielofunkcyjne białko bezpośrednio zaangażowane w wiele procesów zachodzących w ko- mórce, jak na przykład regulacja ekspresji genów, naprawa DNA, odpowiedź na stres oksydacyjny czy apoptoza [37,39] Nie bez znaczenia na funkcjonowanie komórki pozostaje fakt, że GAPDH stanowi ponad 15% wszystkich rozpuszczalnych białek komórkowych i jest jednym z najbardziej obficie występujących w komórkach białek [38]. Enzym ten może wpływać na replikację DNA w komórkach poprzez udział w regulacji transkrypcji genu kodującego histon H2B [112], oddziaływanie z Ap4A, specyficznym nukleotydem uczestniczącym w modulowaniu replikacji i naprawy DNA [115] czy pośrednie hamowanie kinaz CDK2 oraz CDK4 [114]. Po drugie, w fosforylacji kinazy CDK2 odgrywającej istotną rolę w zmianie konformacji oraz aktywacji helikazy MCM 2-7 bierze również udział heksokinaza [120]. Dokładny mechanizm wpływu HK2 na metabolizm glukozy, hamowanie apoptozy oraz wspomaganie proliferacji komórkowej nie jest jednak do końca poznany. Zarówno fosforylacja glukozy, jak i silniejsze oddziaływanie HK2 z błoną mitochondrialną mogą mieć wpływ na te funkcje [121]. Po trzecie, białko LDHA, podobnie jak GAPDH, stanowi część kompleksu OCA-S oraz może wpływać na aktywność polimeraz α, δ i ε [42]. Po czwarte, enolaza poza katalizą i regulacją glikolizy, poprzez przekierowanie metabolitów do szlaków biosyntezy białek, lipidów i kwasów nukleinowych [49], może regulować poziom cykliny D1, cykliny E1 i białka pRB (ang. retinoblastoma protein) [122], które wiąże się z czynnikami transkrypcyjnymi mającymi istotne znaczenie w przejściu przez punkt kontrolny na granicy faz G1/S oraz wpływającymi na aktywację genów fazy S. Pośród proponowanych mechanizmów powiązania centralnego metabolizmu węgla z replikacją DNA wskazuje się na możliwą rolę metabolitów, których zaburzony poziom spowodowany zmianami w aktywności enzymów metabolizmu węgla mógłby prowadzić do zmian w przebiegu syntezy DNA [106,127]. Ponieważ wyciszenie ekspresji poszczególnych genów kodujących enzymy zaangażowane w szlak glikolizy najprawdopodobniej prowadzi do zaburzeń w ilości powstających metabolitów, przeprowadzono eksperymenty mogące dać odpowiedź na pytanie czy ich dodatnie do pożywi spowoduje odwrócenie negatywnych efektów spowodowanych działaniem siRNA [125]. Interesujące dane uzyskano dla komórek z obniżonym poziomem ekspresji genu ENO1, w których po dodaniu fosfoenolopirogoronianu (PEP) do pożywki, wzrosła ilość komórek w fazie replikacji i osiągnęła wartości zbliżone do komórek rosnących w samej pożywce DMEM. Wynik ten wydaje się być o tyle godny uwagi, że samo dodanie PEP do komórek nietraktowanych siRNA powodowało około 10–20% obniżenie ilości komórek w fazie replikacji [125]. Fosfoenolopirogronian poza tym, że w komórce stanowi substrat do powstania pirogronianu, pełni istotną rolę w regulacji glikolizy oraz szlaku pentozofosforanowego [93]. Wpływając na aktywność izomerazy triozofosforanowej (TPI), kieruje reakcje do odpowiedniego szlaku metabolicznego [55]. Być może wyjaśniałoby to dlaczego w komórkach z wyciszoną ekspresją genu kodującego α-enolazę uzupełnienie pożywki o PEP prowadziło do wzrostu w ilości komórek w fazie replikacji. Natomiast dodanie pirogronianu do pożywki powodowało znaczne obniżenie ilości komórek w fazie replikacji, 456www.postepybiochemii.pl zarówno komórek kontrolnych, jak i z wyciszoną ekspresją wybranych genów [125]. Wyjątek stanowiły komórki z obniżonym poziomem GAPDH, w przypadku których obecność pirogronianu nie miała większego wpływu na ich tempo wchodzenia w fazę S w stosunku do komórek z wyciszoną ekspresją genu GAPDH, ale bez wysokiego stężenia pirogronianu. Podobne efekty wywoływało dodanie fosfoenolopirogronianu [125]. Być może spowodowane było to znacznym spadkiem ilości komórek w fazie S, przez co ewentualne negatywne skutki zastosowania wyżej wspomnianych związków mogły nie być widoczne. Ponadto brak negatywnego wpływu wyższych stężeń PEP w hodowli, a nawet tak jak w przypadku enolazy, wzrost ilości komórek w fazie S, prawdopodobnie może wynikać z faktu, iż metabolit ten bierze udział w regulacji glikolizy oraz szlaku pentozofosforanowego [60]. Hamowanie aktywności izomerazy triozofosforanowej (TPI) oraz podwyższone stężenie PEP prowadzi do przekierowania metabolitów pomiędzy tymi dwoma procesami [55] i w efekcie obniżenia stężenia PEP w komórce. Natomiast obecność pirogronianu w hodowli w wyższych stężeniach być może prowadzi do zaburzeń w funkcjonowaniu cyklu kwasów trikarboksylowych i zachwiania równowagi pomiędzy ilością powstających w nim produktów. Pirogronian jest kluczowym metabolitem na etapie decyzji o zajściu cyklu Krebsa, glukoneogenezy bądź jego przekształcenia w mleczan [136]. Można przypuszczać, że nadmiar pirogronianu, szczególnie przy niedoborze aktywności enolazy, a zwłaszcza kinazy pirogronianowej, może skutkować nagromadzeniem się różnych metabolitów biorących udział w cyklu Krebsa. Z kolei wiadomo, że nagromadzenie fumaranu i bursztynianu hamuje aktywności demetylaz histonów oraz DNA, co z kolei prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G1/G0 [137,138]. PODSUMOWANIE Wyniki badań z ostatnich lat wskazują na istotne zmiany w regulacji cyklu komórkowego, w szczególności wejścia w fazę S, w wyniku zaburzeń w przebiegu glikolizy. Sugeruje to istnienie dużo bardziej skomplikowanych zależności pomiędzy glikolizą a replikacją DNA w komórkach eukariotycznych, aniżeli dotychczas sądzono. Wyjaśnienie molekularnych mechanizmów tych procesów powinno doprowadzić do znacznie lepszego zrozumienia kontroli replikcji DNA, a także przyczyn i przebiegu nowotworzenia. PIŚMIENNICTWO 1. Norbury C, Nurse P (1992) Animal cell cycles and their control. Annu Rev Biochem 61: 441-470 2. Alberts B, Johnson A, Lewis J (2002) Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science 3. Herrup K (2013) Post-mitotic role of cell cycle machinery. Curr Opin Cell Biol 25: 711-716 4. Lee IH, Finkel T (2013) Metabolic regulation of the cell cycle. Curr Opin Cell Biol 25: 724-729 5. Lim S, Kaldis P (2013) Cdks, cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation. Development 140: 3079-3093 6. Herrup K, Yang Y (2007) Cell cycle regulation in the postmitotic neuron: oxymoron or new biology? Nature Rev Neurosci 8: 368-378 7. Yasutis KM, Kozminski KG (2013) Cell cycle checkpoint regulators reach a zillion. Cell Cycle 12: 1501-1509 8. de Bruin RA, Wittenberg C (2009) All eukaryotes: before turning off G1-S transcription, please check your DNA. Cell Cycle 8: 214-217 Postępy Biochemii 61 (4) 2015 9. Gottschalk (1986) Bacterial Metabolism. Springer, Berlin-Heidelberg 10.Metallo CM, Vander Heiden MG (2013) Understanding metabolic regulation and its influence on cell physiology. Mol Cell 49: 388-398 11.Gray LR, Tompkins SC, Taylor EB (2014) Regulation of pyruvate metabolism and human disease. Cell Mol Life Sci 71: 2577-2604 12.Cori CF (1983) Embden and the glycolytic pathway. Trends Biochem Sci 8: 257-259 13.Akram M (2013) Mini-review on Glycolysis and Cancer. J Canc Educ 28: 454-457 14.Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L (2007) Biochemistry. New York: Freeman 15.Kim JW, Dang CV (2005) Multifaceted roles of glycolytic enzymes. Trends Biochem Sci 30: 142-150 16.Jang M, Kim SS, Lee J (2013) Cancer cell metabolism: implications for therapeutic targets. Exp Mol Med 45: e45 17.Duda MK, Chess DJ, Mączewski M, Mackiewicz U, Stanley WC (2009) Wpływ kompozycji diety i nadmiaru substratów energetycznych na rozwój niewydolności serca. Kardiologia Polska 67: 10 18.Łuczak MW, Drzewiecka H, Jagodziński PP (2009) Czynnik indukowany hipoksją – HIF. Nowiny Lekarskie 78: 237-248 19.Koppenol WH, Bounds PL, Dang CV (2011) Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancer metabolism. Nat Rev Cancer 11: 325-337 20.Zu XL, Guppy M (2004) Cancer metabolism: facts, fantasy, and fiction. Biochem Biophys Res Commun 313: 459-465 21.Altenberg B, Greulich KO (2004) Genes of glycolysis are ubiquitously overexpressed in 24 cancer classes. Genomics 84: 1014-1020 22.Amoêdo ND, Valencia JP, Rodrigues MF, Galina A, Rumjanek FD (2013) How does the metabolism of tumour cells differ from that of normal cells. Biosci Rep 15: 33 23.Rolland F, Winderickx J, Thevelein JM (2002) Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast. FEMS Yeast Res 2: 183-201 24.Munyon WH, Merchant DJ (1959) The relation between glucose utilization, lactic acid production and utilization and the growth cycle of L strain fibroblasts. Exp Cell Res 17: 490-498 25.Wilson JE (2003) Isozymes of mammalian hexokinase: structure, subcellular localization and metabolic function. J Exp Biol 206: 2049-2057 26.Aleshin AE, Zeng C, Bourenkov GP, Bartunik HD, Fromm HJ, Honzatko RB (1998) The mechanism of regulation of hexokinase: new insights from the crystal structure of recombinant human brain hexokinase complexed with glucose and glucose-6-phosphate. Structure 6: 39-50 27.Cardenas ML, Cornish-Bowden A, Ureta T (1998) Evolution and regulatory role of the hexokinases. Biochim Biophys Acta 1401: 242-264 28.Shoshan-Barmatz V, Zakar M, Rosenthal K, Abu-Hamad S (2009) Key regions of VDAC1 functioning in apoptosis induction and regulation by hexokinase. Biochim Biophys Acta 1787: 421-430 29.Sebastian S, Edassery S, Wilson JE (2001) The human gene for the type III isozyme of hexokinase: structure, basal promoter, and evolution. Arch Biochem Biophys 395: 113-120 30.Cordeiro AT, Godoi PH, Silva CH, Garratt RC, Oliva G, Thiemann OH (2003) Crystal structure of human phosphoglucose isomerase and analysis of the initial catalytic steps. Biochim Biophys Acta 1645: 117122 31.Niinaka Y, Paku S, Haga A, Watanabe H, Raz A (1998) Expression and secretion of neuroleukin/phosphohexose isomerase/maturation factor as autocrine motility factor by tumor cells. Cancer Res 58: 26672674 32.Raben N, Exelbert R, Spiegel R, Sherman JB, Nakajima H, Plotz P, Heinisch J (1995) Functional expression of human mutant phosphofructokinase in yeast: genetic defects in French Canadian and Swiss patients with phosphofructokinase deficiency. Am J Hum Genet 56: 131-141 33.Van Schaftingen E, Jett M, Hue L, Hers HG (1981) Control of liver 6-phosphofructokinase by fructose 2,6-bisphosphate and other effectors. Proc Natl Acad Sci USA 78: 3483-3486 457 34.Penhoet EE, Kochman M, Rutter WJ (1969) Isolation of fructose diphosphate aldolases A, B, and C. Biochemistry 8: 4391-4395 35.Mamczur P, Gamian A, Kolodziej J, Dziegiel P, Rakus D (2013) Nuclear localization of aldolase A correlates with cell proliferation. Biochim Biophys Acta 1833: 2812-2822 36.Schneider AS (2000) Triosephosphate isomerase deficiency: historical perspectives and molecular aspects. Baillieres Best Pract Res Clin Haematol 13: 119-140 37.Butterfield DA, Hardas SS, Bader Lange ML (2010) Oxidatively Modified Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH) and Alzheimer Disease: Many Pathways to Neurodegeneration. J Alzheimers Dis 20: 369-393 38.Scopes RK, Stoter A (1982) Purification of all glycolytic enzymes from one muscle extract. Methods Enzymol 90: 479-490 39.Sirover MA (2014) Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. Int J Biochem Cell Biol 57: 20-26 40.Sun Y, Li Y, Luo D, Liao JD (2012) Pseudogenes as weaknesses of ACTB (Actb) and GAPDH (Gapdh) used as reference genes in reverse transcription and polymerase chain reactions. PLoS One 7: e41659 41.McCarrey JR, Thomas K (1987) Human testis-specific PGK gene lacks introns and possesses characteristics of a processed gene. Nature 326: 501-505 42.Popanda O, Fox G , Thielmann HW (1998) Modulation of DNA polymerases α, δ and ε by lactate dehydrogenase and 3-phosphoglycerate kinase. Biochim Biophys Acta 1397: 102-117 43.DiMauro S, Miranda AF, Khan S, Gitlin K, Friedman R (1981) Human muscle phosphoglycerate mutase deficiency: newly discovered metabolic myopathy. Science 212: 1277-1279 44.Piast M, Kustrzeba-Wojcicka I, Matusiewicz M, Banas T (2005) Molecular evolution of enolase. Acta Biochim Pol 52: 507–513 45.Diaz-Ramos A, Roig-Borrellas A, Garcıa-Melero A, Lopez-Alemany R (2012) α-Enolase, a multifunctional protein: its role on pathophysiological situations. J Biomed Biotechnol 2012: 156795 46.Tsutsumi H, Tani K, Fujii H, Miwa S (1988) Expression of L- and M-type pyruvate kinase in human tissues. Genomics 2: 86-89 47.Takenaka M, Yamada K, Lu T, Kang R, Tanaka T, Noguchi T (1996) Alternative splicing of the pyruvate kinase M gene in a minigene system. Eur J Biochem. 235: 366-371 48.Christofk HR, Vander Heiden MG, Harris MH, Ramanathan A, Gerszten RE, Wei R, Fleming MD, Schreiber SL, Cantley LC (2008) The M2 splice isoform of pyruvate kinase is important for cancer metabolism and tumour growth. Nature 452: 230-233 49.Vander Heiden MG, Lunt SY, Dayton TL, Fiske BP, Israelsen WJ, Mattaini KR, Vokes NI, Stephanopoulos G, Cantley LC, Metallo CM, Locasale JW (2011) Metabolic pathway alterations that support cell proliferation. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 76: 325-334 50.Gao X, Wang H, Yang JJ, Liu X, Liu ZR (2012) Pyruvate kinase M2 regulates gene transcription by acting as a protein kinase. Mol Cell 45: 598-609 51.Poczęta M, Bednarek I (2013) STAT3 — ukryty czynnik transkrypcyjny celem terapii przeciwnowotworowych. Ann Acad Med Siles 67: 133-141 52.Granchi C, Bertini S, Macchia M, Minutolo F (2010) Inhibitors of lactate dehydrogenase isoforms and their therapeutic potentials. Curr Med Chem 17: 672-697 53.Goldberg E, Eddy EM, Duan C, Odet F (2010) LDHC: the ultimate testis-specific gene. J Androl 31: 86-94 54.Flick MJ, Konieczny SF (2002) Identification of putative mammalian D-lactate dehydrogenase enzymes.Biochem Biophys Res Commun 295: 910-916 55.Wamelink MM, Struys EA, Jakobs C (2009) The biochemistry, metabolism and inherited defects of the pentose phosphate pathway: a review. J Inherit Metab Dis 31: 703-717 56.Cantor JR, Sabatini DM (2012) Cancer cell metabolism: one hallmark, many faces. Cancer Discov 2: 881-898 57.Lunt SY, Vander Heiden MG (2011) Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation. Annu Rev Cell Dev Biol 27: 441-464 58.Vander Heiden MG, Locasale JW, Swanson KD, Sharfi H, Heffron GJ, Amador-Noguez D, Christofk HR, Wagner G, Rabinowitz JD, Asara JM (2010). Evidence for an alternative glycolytic pathway in rapidly proliferating cells. Science 329: 1492-1499 59.Hitosugi T, Zhou L, Elf S, Fan J, Kang HB, Ho Seo J, Shan C, Dai Q, Zhang L, Xie J, Gu TL, Jin P, Aleckovic M, LeRoy G, Kang Y, Sudderth JA, DeBerardinis RJ, Luan CH, Chen GZ, Muller S, Shin DM, Owonikoko TK, Lonial S, Arellano ML, Khoury HJ, Khuri FR, Lee BH, Ye K, Boggon TJ, Kang S, He C, Chen J (2012) Phosphoglycerate mutase 1 coordinates glycolysis and biosynthesis to promote tumor growth. Cancer Cell 22: 585-600 60.Grüning NM, Du D, Keller MA, Luisi BF, Ralser M (2014) Inhibition of triosephosphate isomerase by phosphoenolpyruvate in the feedback-regulation of glycolysis. Open Biol 4: 130232 61.Moncada S, Higgs EA, Colombo SL (2012) Fulfilling the metabolic requirements for cell proliferation. Biochem J 446: 1-7 62.Yalcin A, Clem BF, Simmons A, Lane A, Nelson K, Clem AL, Brock E, Siow D, Wattenberg B, Telang S, Chesney J (2009) Nuclear targeting of 6-phosphofructo-2-kinase (PFKFB3) increases proliferation via cyclin-dependent kinases. J Biol Chem 284: 24223-24232 63.Colombo SL, Palacios-Callender M, Frakich N, Carcamo S, Kovacs I, Tudzarova S, Moncada S (2011) Molecular basis for the differential use of glucose and glutamine in cell proliferation as revealed by synchronized HeLa cells. Proc Natl Acad Sci USA 108: 21069-21074 64.Duglebby RG, Dennis DT (1973) The characterization and regulatory properties of pyruvate kinase from cotton seeds. Arch Biochem Biophys 166: 270-277 65.Lenzen S (2014) A fresh view of glycolysis and glucokinase regulation: history and current status. J Biol Chem 289: 12189-12194 66.Yi W, Clark PM, Mason DE, Keenan MC, Hill C, Goddard III WA, Peters EC, Driggers EM, Hsieh-Wilson LC (2012) PFK1 glycosylation is a key regulator of cancer cell growth and central metabolic pathways. Science 337: 975-980 67.Palmer TN, Caldecourt MA, Slavin JP (1982) Pyruvate kinase and alanine synthesis in skeletal muscle. Biosci Rep 2: 941-948 68.Alves GG, Marinho-Carvalho MM, Atella GC, Silva-Neto MA, Sola-Penna M (2007) Allosteric regulation of 6-phosphofructo-1-kinase activity of fat body and flight muscle from the bloodsucking bug Rhodnius prolixus. An Acad Bras Cienc 79: 53-62 69.Yalcin A, Telang S, Clem B, Chesney J (2009) Regulation of glucose metabolism by 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatases in cancer. Exp Mol Pathol 86: 174-179 70.Jurica MS, Mesecar A, Heath PJ, Shi W, Nowak T, Stoddard BL (1998) The allosteric regulation of pyruvate kinase by fructose-1,6-bisphosphate. Structure 6: 195-210 71.Chaneton B, Hillmann P, Zheng L, Martin AC, Maddocks OD, Chokkathukalam A, Coyle JE, Jankevics A, Holding FP, Vousden KH, Frezza C, O’Reilly M, Gottlieb E (2012) Serine is a natural ligand and allosteric activator of pyruvate kinase M2. Nature 491: 458-462 72.O’Donnell M, Langston L, Stillman B (2013) Principles and Concepts of DNA Replication in Bacteria, Archaea, and Eukarya. Cold Spring Harb Perspect Biol 5: a010108 73.Bell SP, Dutta A (2002) DNA replication in eukaryotic cells. Annu Rev Biochem 71: 333-374 74.Leman AR, Noguchi E (2013) The replication fork: understanding the eukaryotic replication machinery and the challenges to genome duplication. Genes 4: 1-32 75.Jacob F, Brenner J, Cuzin F (1963) On the regulation of DNA replication in bacteria. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 28: 329-348 76.Méchali M (2010) Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Rev Mol Cell Biol 11: 728-738 77.Green BM, Finn KJ, Li JJ (2010) Loss of DNA replication control is a potent inducer of gene amplification. Science 329: 943-946 458www.postepybiochemii.pl 78.Nowińska K, Dzięgiel P (2010) Białka MCM i ich rola w proliferacji komórek i procesie nowotworowym. Postepy Hig Med Dosw 64: 627-635 79.Masai H, Matsumoto S, You Z, Yoshizawa-Sugata N, Oda M (2010) Eukaryotic chromosome DNA replication: Where, when, and how? Annu Rev Biochem 79: 89-130 80.Heichinger C, Penkett CJ, Bähler J, Nurse P (2006) Genome-wide characterization of fission yeast DNA replication origins. EMBO J 25: 5171-5179 81.Hamlin JL, Mesner LD, Lar O, Torres R, Chodaparambil SV, Wang L (2008) A revisionist replicon model for higher eukaryotic genomes. J Cell Biochem 105: 321-329 82.Leonard AC, Méchali M (2013) DNA replication origins. Cold Spring Harb Perspect Biol 5: a010116 83.Siddiqui K, On KF, Diffley JF (2013) RegulatingDNA replication in eukarya. Cold Spring Harb Perspect Biol 5: a012930 84.Costa A, Onesti S (2008) The MCM complex: (just) a replicative helicase? Biochem Soc Trans 36: 136-140 85.Maine GT, Sinha P, Tye BK (1984) Mutants of S. cerevisiae defective in the maintenance of minichromosomes. Genetics 106: 365-385 86.Fernández-Cid A, Riera A, Tognetti S, Herrera MC, Samel S, Evrin C, Winkler C, Gardenal E, Uhle S, Speck C (2013) An ORC/Cdc6/ MCM2-7 complex is formed in a multistep reaction to serve as a platform for MCM double-hexamer assembly. Mol Cell 50: 577-588 87.Diffley JF (2011) Quality control in the initiation of eukaryotic DNA replication. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 366: 3545-3553 88.Nishitani H, Sugimoto N, Roukos V, Nakanishi Y, Saijo M, Obuse C, Tsurimoto T, Nakayama KI, Nakayama K, Fujita M, Lygerou Z, Nishimoto T (2006) Two E3 ubiquitin ligases, SCF-Skp2 and DDB1-Cul4, target human Cdt1 for proteolysis. EMBO J 25: 1126-1136 89.Cook JG (2009) Replication licensing and the DNA damaga checkpoint. Front Biosci 14: 5013-5030 90.Kanemaki M, Labib K (2006) Distinct roles for Sld3 and GINS during establishment and progression of eukaryotic DNA replication forks. EMBO J 25: 1753-1763 91.Pawlik A, Grzanka A (2010) Molekularne podłoże replikacji i endoreduplikacji. Postepy Biol Kom 37: 363-380 92.Labib K, Gambus A (2007) A key role for the GINS complex at DNA replication forks. Trends Cell Biol 17: 271-278 93.Barlow JH, Nussenzweig A (2014) Replication initiation and genome instability: a crossroads for DNA and RNA synthesis. Cell Moll Life Sci 71: 4545-4559 94.Shen Z, Prasanth SG (2012) Emerging players in the initiation of eukaryotic DNA replication. Cell Div 17: 7-22 95.Bauerschmidt C, Pollok S, Kremmer E, Nasheuer HP, Grosse F (2007) Interactions of human Cdc45 with the MCM 2-7 complex, the GINS complex, and DNA polymerases delta and epsilon during S phase. Genes Cells 12: 745-758 96.Pellegrini L (2012) The Pol α-primase complex. Subcell Biochem 62: 157-169 97.Howes TR, Tomkinson AE (2012) DNA ligase I, the replicative DNA ligase. Subcell Biochem 62: 327-341 98.Kao HI, Bambara RA (2003) The protein components and mechanism of eukaryotic Okazaki fragment maturation. Crit Rev Biochem Mol Biol 38: 433-452 99.Fachinetti D, Bermejo R, Cocito A, Minardi S, Katou Y, Kanoh Y, Shirahige K, Azvolinsky A, Zakian VA, Foiani M (2010) Replication termination at eukaryotic chromosomes is mediated by Top2 and occurs at genomic loci containing pausing elements. Mol Cell 39: 595-605 100. Hayflick L (1965) The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp Cell Res 37: 614-636 101. Podlevsky JD, Chen JJ (2012) It all comes together at the ends: telomerase structure, function, and biogenesis. Mutat Res 730: 3-11 102. Wysoczańska B (2013) Zachowanie długości telomerów. Postepy Hig Med Dosw 67: 1319-1330 103. Barańska S, Glinkowska M, Herman-Antosiewicz A, Maciąg-Dorszyńska M, Nowicki D, Szalewska-Pałasz A, Węgrzyn Postępy Biochemii 61 (4) 2015 A, Węgrzyn G (2013) Replicating DNA by cell factories: roles of central carbon metabolism and transcription in the control of DNA replication in microbes, and implications for understanding this process in human cells. Microb Cell Fact 12: 55 104. Zyskind JW, Smith DW (1992) DNA replication, the bacterial cell cycle, and cell growth. Cell 69: 5-8 105. Tu BP, Mohler RE, Liu JC, Dombek KM, Young ET, Synovec RE, McKnight SL (2007) Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proc Natl Acad Sci USA 104: 16886-16891 106. Jannière L, Canceill D, Suski C, Kanga S, Dalmais B, Lestini R, Monnier AF, Chapuis J, Bolotin A, Titok M, Le Chatelier E, Ehrlich SD (2007) Genetic evidence for a link between glycolysis and DNA replication. PLoS ONE 2: e447 107. Maciąg M, Nowicki D, Janniere L, Szalewska-Pałasz A, Węgrzyn G (2011) Genetic response to metabolic fluctuations: correlation between central carbon metabolism and DNA replication in Escherichia coli. Microb Cell Fact 10: 19 108. Maciąg M, Nowicki D, Szalewska-Pałasz A, Węgrzyn G (2012) Central carbon metabolism influences fidelity of DNA replication in Escherichia coli. Mutat Res 731: 99-106 109. Maciąg-Dorszyńska M, Ignatowska M, Jannière L, Węgrzyn G, Szalewska-Pałasz A (2012) Mutations in central carbon metabolism genes suppress defects in nucleoid position and cell division of replication mutants in Escherichia coli. Gene 503: 31-35 110. Ronai Z (1993) Glycolytic enzymes as DNA binding proteins. Int J Biochem 25: 1073-1076 111. Ritterson Lew C, Tolan DR (2012) Targeting of several glycolytic enzymes using RNA interference reveals aldolase affects cancer cell proliferation through a non-glycolytic mechanism. J Biol Chem 287: 42554-42563 112. He H, Lee MC, Zheng LL, Zheng L, Luo Y (2013) Integration of the metabolic/redox state, histone gene switching, DNA replication and S-phase progression by moonlighting metabolic enzymes. Biosci Rep 33: e00018 113. Carujo S, Estanyol JM, Ejarque A, Agell N, Bachs O, Pujol MJ (2006) Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase is a SET-binding protein and regulates cyclin B-cdk1 activity. Oncogene 25: 4033-4042 114. Phadke MS, Krynetskaia NF, Mishra AK, Krynetskiy E (2009) Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase depletion induces cell cycle arrest and resistance to antimetabolites in human carcinoma cell lines. J Pharmacol Exp Ther 331: 77-86 115. Baxi MD, Vishwanatha JK (1995) Uracil DNAglycosylase/ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is an Ap4A binding protein. Biochemistry 34: 9700-9707 116. Lu Z (2012) PKM2 functions as a histone kinase. Cell Cycle 11: 41014102 117. Yang W, Zheng Y, Xia Y, Ji H, Chen X, Guo F, Lyssiotis CA, Aldape K, Cantley LC, Lu Z (2012) ERK1/2-dependent phosphorylation and nuclear translocation of PKM2 promotes the Warburg effect. Nat Cell Biol 14: 1295-1304 118. Yang W, Xia Y, Ji H, Zheng Y, Liang J, Huang W, Gao X, Aldape K, Lu Z (2011) Nuclear PKM2 regulates β-catenin transactivation upon EGFR activation. Nature 480: 118-122 119. Rong Y, Wu W, Ni X, Kuang T, Jin D, Wang D, Lou W (2013) Lactate dehydrogenase A is overexpressed in pancreatic cancer and promotes the growth of pancreatic cancer cells. Tumor Biol 34: 1523-1530 120. Hu JW, Sun P, Zhang DX, Xiong WJ, Mi J (2014) Hexokinase 2 regulates G1/S checkpoint through CDK2 in cancer-associated fibroblasts. Cell Signal 26: 2210-2216 121. Chen J, Zhang S, Li Y, Tang Z, Kong W (2014) Hexokinase 2 overexpression promotes the proliferation and survival of laryngeal squamous cell carcinoma. Tumor Biology 35: 3743-3753 122. Song Y, Luo Q, Long H, Hu Z, Que T, Zhang X, Li Z, Wang G, Yi L, Liu Z1, Fang W, Qi S (2014) Alpha-enolase as a potential cancer prognostic marker promotes cell growth, migration, and invasion in glioma. Mol Cancer 13: 65 459 123. Lincet H, Icard P (2014) How do glycolytic enzymes favour cancer cell proliferation by nonmetabolic functions? Oncogene 34: 37513759 (2008) Glycolysis module activated by hypoxia-inducible factor 1α is related to the aggressive phenotype of hepatocellular carcinoma. Int J Oncol 33: 725-731 124. Konieczna A, Szczepańska A, Sawiuk K, Łyżeń R, Węgrzyn G (2015a) Enzymes of the central carbon metabolism: Are they linkers between transcription, DNA replication, and carcinogenesis? Med Hypotheses 84: 58-67 132. Goldberg MS, Sharp PA (2012) Pyruvate kinase M2 specific siRNA induces apoptosis and tumor regression. J Exp Med 209: 217-224 125. Konieczna A (2015) Wpływ wyciszenia ekspresji genów kodujących enzymy glikolityczne na regulację replikacji DNA w ludzkich fibroblastach. Rozprawa doktorska, Uniwersytet Gdański (Wydział Biologii), Gdańsk 126. Konieczna A, Szczepańska A, Sawiuk K, Węgrzyn G, Łyżeń R (2015) Effects of partial silencing of genes coding for enzymes involved in glycolysis and tricarboxylic acid cycle on the enterance of human fibroblasts to the S phase. BMC Cell Biol 16: 16. 133. Zieker D, Königsrainer I, Tritschler I, Löffler M, Beckert S, Traub F, Nieselt K, Bühler S, Weller M, Gaedcke J, Taichman RS, Northoff H, Brücher BL, Königsrainer A (2010) Phosphoglycerate kinase 1 a promoting enzyme for peritoneal dissemination in gastric cancer. Int J Cancer 126: 1513-1520 134. Funasaka T, Hu H, Yanagawa T, Hogan V, Raz A (2007) Down-regulation of phosphoglucose isomerase/autocrine motility factor results in mesenchymal-to-epithelial transition of human lung fibrosarcoma cells. Cancer Res 67: 4236-4238 127. Glinkowska M, Boss L, Węgrzyn G (2015) DNA replication control in microbial cell factories. SpringerBriefs in Microbiology. Springer 135. Rengaraj D, Lee SI, Yoo M, Kim TH, Song G, Han JY (2012) Expression and knockdown analysis of glucose phosphate isomerase in chicken primordial germ cells. Biol Reprod 57: 1-12 128. Soga T (2013) Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming. Cancer Sci 104: 275–281 136. Roudier E, Perrin A (2009) Considering the role of pyruvate in tumor cells during hypoxia. Biochim Biophys Acta 1796: 55-62 129. Peng Q, Zhou Q, Zhou J, Zhong D, Pan F, Liang H (2008) Stable RNA interefernce of hexsokinase II gene inhibits human colon cancer LoVo cell growth in vitro and in vivo. Cancer Biol Ther 7: 1128-1135 137. Xiao M, Yang H, Xu W, Ma S, Lin H, Zhu H, Liu L, Liu Y, Yang C, Xu Y, Zhao S, Ye D, Xiong Y, Guan KL (2012) Inhibition of α-KGdependent histone and DNAdemethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes Dev 26: 1326-1338 130. Calvo MN, Bartronsa R, Castanoc E, Peralesb JC, Navarro-Sabatea A, Manzanoa A (2006) PFKFB3 gene silencing decreases glycolysis, induces cell-cycle delay and inhibits anchorage-independent growth in HeLa cells. FEBS Letters 580: 3308-3314 131. Hamaguchi T, Iizuka N, Tsunedomi R, Hamamoto Y, Miyamoto T, Iida M, Tokuhisa Y, Sakamoto K, Takashima M, Tamesa T, Oka M 138. Zhang X, Lu F, Wang J, Yin F, Xu Z, Qi D, Wu X, Cao Y, Liang W, Liu Y, Sun H, Ye T, Zhang H (2013) Pluripotent stem cell protein Sox2 confers sensitivity to LSD1 inhibition in cancer cells. Cell Rep 5: 445-457 Links between glycolysis and DNA replication in eukaryotic cells Aleksandra Konieczna, Robert Łyżeń, Grzegorz Węgrzyn Department of Molecular Biology, University of Gdańsk, Wita Stwosza 59, 80-308 Gdańsk, Poland e-mail: [email protected] Key words: glycolysis, cell cycle, DNA replication ABSTRACT Development of the eukaryotic cell proceeds through sequentional stages of the cell cycle, in which there are growth, replication of the genetic material, and cell division processes. Many environmental and intracellular factor decides if the cell proceeds throughout all stages of the cell cycle or enters the G0 silencing phase. The cell cycle depends also on metabolic processes, including central carbon metabolism and DNA replication. One cof major processes of the central carbon metabolism is glycolysis. This is the main pathway of glucose metabolism in cells, leading to conversion of this molecule to puryvare. Until recently, it was supposed that carbon metabolism and DNA replication are linked only indirectly, mostly through energy input, necessary for synthesis of nucleic acids, and production of precursors of deoxyribonucleotides. Nevertheless, recent studies, described and discussed in this article, suggested that there are much more complicated links, perhaps also direct, between these two processes. 460www.postepybiochemii.pl
