Genetyka roślin
advertisement
Plazmid - mała kolista cząsteczka DNA występująca poza nukleoidem. Plasmid pBR322 Map Cykl komórkowy – cykl życia komórki Interfaza Posttelofaza – segregacja i dekondensacja chromosomów, degradacja wrzeciona i reorganizacja otoczki jądrowej. Liczne procesy transkrypcyjne i translacyjne mające na celu zwiększenie rozmiarów komórki i Preprofaza – przygotowanie odbudowanie wszystkich jej komórki do podziałów przez struktur syntezę niezbędnych białek, głównie mikrotubul wrzeciona podziałowego Replikacja DNA Mitoza Faza G0 Endopoliploidyzacja Różnicowanie G0 G1 Apoptoza Regulacja cyklu komórkowego Podstawowe mechanizmy regulacji cyklu komórkowego są wysoce konserwatywne U wszystkich eukariontów cykl komórkowy obejmuje dwa najważniejsze zdarzenia: 1. Replikacja DNA 2. Segregacja chromosomów Wyznaczają one dwa krytyczne punkty kontrolne: 1. Przejście z fazy G1 do S 2. Przejście z fazy G2 do podziału (M) Czy replikacja DNA jest zakończona? G2 Czy uszkodzenia DNA są naprawione? Wejście w mitozę S M Rozpoczęcie fazy S G1 Czy segregacja chromosomów zakończona? Wyjście z mitozy Czy poprzednia mitoza jest jest zakończona? Czy warunki środowiska są odpowiednie? Czy komórka jest dostatecznie duża? Podstawą kontroli cyklu komórkowego są reakcje fosforylacji, w których kinazy białkowe przenoszą grupy fosforanowe z ATP na odpowiedni aminokwas białka docelowego! System kontroli cyklu komórkowego oparty jest na dwóch grupach białek: 1. Kinazy zależne od cykliny (CDK – ang. cyclin-dependent kinases) – białka katalityczne obecne w komórkach podczas całego cyklu, ale aktywne tylko w określonej fazie 2. Cykliny (CYC – ang. cyclin) – kontrolują zdolność CDK do fosforylacji poprzez przyłączanie się do nich. Różne kompleksy cyklina-CDK włączają różne etapy cyklu komórkowego 1. Kompleks cykliny G1 połączonej z CDK jest konieczny przy przejściu z fazy G1 do S. 2. Kompleks cykliny mitotycznej połączonej z CDK jest konieczny przy przejściu z fazy G2 do M. Aktywacja i inaktywacja kompleksu cyklinaCDK jest istotnym procesem w regulacji cyklu komórkowego. CDK + Cyklina G2 CDK Cyklina A CDK Cyklina B S M G1 CDK Cyklina E Replikacja DNA • Semikonserwatywny proces, polegający na odtworzeniu nowych cząsteczek DNA na matrycy starych cząsteczek. • Z jednej cząsteczki starego DNA powstają dwie nowe cząsteczki, z których każda zawiera jedną nić starą i jedną nowo dobudowaną. • Replikacja zawsze zaczyna się w tym samym punkcie wzdłuż łańcucha DNA nazywanym miejscem inicjacji replikacji: U Procaryota jest jedno miejsce inicjacji replikacji U Eucaryota jest wiele miejsc inicjacji replikacji Oczko replikacyjne Nowo syntetyzowany DNA Macierzyste nici DNA Enzymy zaangażowane w syntezę DNA Widełki replikacyjne przemieszczają się w dwóch przeciwnych kierunkach Replikon • Odcinek DNA znajdujący się pod kontrolą jednego oczka replikacyjnego Kompleks enzymów replikacyjnych 1. Helikazy i białka wiążące jednoniciowy DNA • • • Destabilizują podwójny heliks Otwierają widełki replikacyjne przez rozrywanie mostków wodorowych Przygotowują matrycę do kopiowania 2. Topoizomerazy • Likwidują skręcenie heliksu na skutek otwierania widełek 3. Prymazy • Katalizują proces tworzenia starterów Kompleks enzymów replikacyjnych 4. Polimeraza DNA • Katalizuje przyłączanie nukleotydów – kluczowy enzym replikacyjny Polimerazy DNA bakteryjne Enzymy Podjednostki Aktywność egzonukleazy 3` 5` Funkcje 5` 3` Polimeraza DNA I 1 Tak Tak Polimeraza DNA II 1 Tak Nie Polimeraza DNA III ok. 10 Tak Nie Replikacja i naprawa DNA Naprawa DNA Główny enzym replik. Polimerazy DNA eukariotyczne Enzymy Podjednostk i Aktywność egzonukleazy 3` 5` 5` 3` Polimeraza DNA δ 4 1 2 2 lub 3 Nie Nie Tak Tak Nie Nie Nie Nie Polimeraza DNA ε 1 lub więcej Tak Nie Polimeraza DNA Polimeraza DNA β Polimeraza DNA γ Funkcje Synteza starterów Naprawa DNA Replikacja mtDNA Główny enzym replik. Replikacja DNA (dokładna funkcja nie jest znana) Kompleks enzymów replikacyjnych 4. RNA-azy • Degradują starterowe RNA 5. Ligazy • Łączą powstałe luki w jedną ciągłą nić Helikazy Białka wiążące jednoniciowy DNA Polimeraza DNA Nić prowadząca Topoizomerazy Starter Macierzysty DNA Fragmenty Okazaki RNA prymazy Polimeraza DNA Ligaza Kierunek replikacji Nić opóźniona Wierność kopiowania • 1 błąd na 109 włączonych nukleotydów System zabezpieczający chromosomy przed skracaniem • Zapobiega skracaniu się heliksu DNA po replikacji. • Systemem tym są sekwencje telomerowe znajdujące się na końcach każdej cząstki DNA. • Są to krótkie powtarzające się sekwencje nukleotydów, np. TTGGGG, syntetyzowane przez enzym telomerazę i dodawane do końcowych odcinków DNA niezależnie od zwykłej replikacji DNA. PCR (Polymerase Chain Reaction) – reakcja łańcuchowa polimerazy • Polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z wykorzystaniem starterów flankujących określony odcinek DNA, w warunkach in vitro. • Warunek – znajomość sekwencji otaczających określony fragment, tak aby można było dobrać komplementarne startery. Etapy PCR 1. Termiczna denaturacja powielanego DNA – temp. 94ºC 2. Asocjacja starterów z matrycą – temp. ok. 60 ºC w zależności od starterów (długość i skład nukleotydowy) 3. Polimeryzacja DNA – temp. 72 ºC Przebieg PCR 5` 3` 5` 3` Denaturacja DNA – 1 min. 5` 3` Synteza nowych nici DNA – 2 min. 5` 3` 5` Asocjacja starterów – 2 min. 5` 3` 3` 5` 3` 3` 5` 5` 3` 3` 5` Liczba syntetyzowanych fragmentów wzrasta wykładniczo jak 2n, gdzie n oznacza liczbę cykli. Skład mieszaniny reakcyjnej 1. Polimeraza DNA termostabilna (Taq Polimeraza) 2. Deoksynukleotydy (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 3. Startery 4. Bufor reakcyjny 5. Jony Mg 2+ 6. DNA 7. Sterylna woda destylowana
