Genetyka sądowa

advertisement
GENETYKA SĄDOWA
GENETYKA SĄDOWA
Pobieranie materiału do badań DNA
Krew
Nasienie
Ślina
Mocz
Włosy
Zęby
Kości
Tkanki miękkie
Rodzaje śladów krwi
nałożone
(smugi)
pasywne
(kapane)
natryskowe
Testy wstępne - wykrywanie krwi ludzkiej
Testy wstępne - wykrywanie śladów nasienia

Lampa UV

Test na kwaśną fosfatazę
(Phosphatesmo KM)

Test PSA (antygen
specyficzny dla prostaty)

Badanie obecności
plemników pod
mikroskopem
Testy wstępne - wykrywanie śladów śliny


Lampa UV, Crimescope
alfa-amylaza (RSID), test skrobiowy (SALIgAE®)
Materiał porównawczy





krew lub wymaz z jamy ustnej
włosy
rzeczy użytku osobistego, odzież
osobista
materiał szpitalny (preparaty
histologiczne)
znaczki i koperty
Próbka materiału biologicznego
otrzymana z miejsca przestępstwa lub w
do badania spornego ojcostwa
Etapy badań DNA
Biologia
Izolacja DNA
Obliczenie ilości DNA i
jego jakości
PCR dla wielu markerów STR
Technologia
Separacja i detekcja produktów
PCR
(Allele STR)
Wyznaczenie genotypu DNA
w próbce
Genetyka
Generacja raportu z
prawdopodobieństwem
przypadkowej zgodności
Porównanie genotypu a
próbki z rezultatami z innych
próbek
Jeśli istnieje zgodność to
przeprowadza się porównanie
profilu DNA z bazą danych
Figure 1.2, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
mieszanina
dowodów
biologicznych
Metoda lizy preferencyjnej
SDS, EDTA i
proteinaza K
(bufor lizujący)
Inkubacja
37 oC
Perpetrator’s sperm
mixed with victim’s
epithelial cells
sperma
SDS, EDTA i
proteinaza K + DTT
“Frakcja męska”
Odciągnąć
nadsącz
DTT liza
główki
plemnika
sperma
„Frakcja żeńska”
Termocyklery
Automatyczne analizatory DNA - elektroforeza kapilarna
Profil
genetyczny
Identyfikacja genetyczna - w badaniach sądowych, odnosi się
do procesu zmierzającego do pozytywnej odpowiedzi na
pytania:
„Czy dwa otrzymane profile DNA są identyczne?”
„Czy istnieje wystarczający dowód, pozwalający ustalić, że dwa
profile DNA pochodzą z jednego źródła (od jednej osoby)?”
Interpretacja wyników analizy genetycznej
Układ
polimorficzny
B
Dowód 2
D3S1358
14, 17
14, 15
VWA
15, 17
16, 19
D16S539
11
9, 13
D2S1338
19, 23
17, 20
Amelogenina
X, Y
X, Y
D8S1179
10, 15
13, 14
D21S11
28, 30
28, 30
D18S51
14, 17
18, 19
D19S433
12, 18.2
14, 15
TH01
6, 8
8, 9.3
FGA
19
22
WYKLUCZENIE
Porównanie wykazało brak
zgodności oznaczonego w
próbce dowodowej profilu
DNA z profilem genetycznym
oznaczonym w nadesłanym
materiale porównawczym.
Należy wykluczyć możliwość
pochodzenia próbki
dowodowej od podejrzanego.
OPINIA
KATEGORYCZNA
Interpretacja wyników analizy genetycznej
Układ
polimorficzny
A
Dowód 1
D3S1358
16, 17
16, 17
VWA
14, 19
14, 19
D16S539
11, 12
11, 12
D2S1338
19, 24
19, 24
Amelogenina
X, Y
X, Y
D8S1179
14
14
D21S11
28
28
D18S51
14, 15
14, 15
D19S433
12, 13
12, 13
TH01
6, 9.3
6, 9.3
FGA
23, 24
23, 24
BRAK
WYKLUCZENIA
Profil DNA oznaczony w
próbce dowodowej jest
zgodny z profilem DNA
charakterystycznym dla
podejrzanego A.
OPINIA
PROBABILISTYCZNA
Wykazanie zbieżności profili
genetycznych bez oszacowania
przypadkowej zgodności nie ma
znaczenia dla sądu.
Ocena statystyczna dowodu !
Interpretacja wyników analizy genetycznej
Układ
B
Dowód 3
polimorficzny
D3S1358
14, 17
VWA
15, 17
D16S539
11
D2S1338
19, 23
Amelogenina
X, Y
X, Y
D8S1179
10, 15
10
D21S11
28, 30
D18S51
14, 17
D19S433
12, 18.2
TH01
6, 8
FGA
19
14
BRAK
ROZSTRZYGNIĘCIA
Częściowy profil genetyczny,
który oznaczono w próbce
dowodowej nie pozwala na
przeprowadzenie
wnioskowania odnośnie
zgodności profili DNA.
OPINIA
NIEROZSTRZYGAJĄCA
12
Trudności w profilowaniu i brak
pozytywnych wyników w analizie
kontaminacja obcym materiałem
 mała ilość DNA/degradacja DNA
 działanie inhibitorów
 fizyczne i chemiczne czynniki degradujące
 monozygotyczne bliźniaki
 chimeryzm/heteroplazmia
 materiał biologiczny z tkanek nowotworowych
(LOH-onkogeny/MSI-geny naprawcze)
 bloczki histologiczne
 złe przechowywanie próbek
 błąd człowieka/zawodność aparatury
 pochodzeniu odzwierzęcym badanego materiału biologicznego

stwierdzenie, czy wynik jest „dobry” czy „zły” zależy od wiedzy i doświadczenia eksperta
zasadniczym elementem oceny jest morfologia „pików”
Problemy z determinacją płci
błędna interpretacja wyników genotypowania





delecja genu amelogeniny
przemieszczenie odcinka z genem SRY z
chromosomu Y do X (niepłodni mężczyźni XX z
genem SRY i kobiety XY – Y bez genu SRY)
chimeryzm zupełny po przeszczepie (biorca kobieta
a dawca mężczyzna)
aberracje chromosomowe (XXY, XXX, XYY, X0,
CAIS – fenotypowo kobieta XY)
inaktywacja 5-alfa-reduktazy (XY- kobieta)
Wymagania i standardy współczesnej
opinii genetycznej

Atestacje dotyczące testów biegłości w badaniach genetycznych w zakresie
śladów biologicznych i ustalania ojcostwa, zgodne z aktualnymi zaleceniami
Międzynarodowego Towarzystwa Genetyki Sądowej (ISFG), Komisji
Genetyki Sądowej PTMSiK* oraz Europejskiej Sieci Instytutów
Kryminalistycznych (ENFSI)

Badania dla potrzeb atestacji laboratoriów w zakresie badań śladów
biologicznych, muszą być przeprowadzane w zakresie minimum 10 loci oraz
markera płci*

Badania dla potrzeb atestacji laboratoriów w zakresie ustalania
pokrewieństwa, w tym ojcostwa, muszą być przeprowadzane w zakresie
minimum 13 loci oraz markera płci systemu CODIS*

Wartość szansy ojcostwa (PI) wymagana, aby wyniki atestacji zostały uznane
za prawidłowe, w przypadku potwierdzenia ojcostwa musi wynosić co
najmniej 1 000 000, a wykluczenie ojcostwa musi być wykazane co najmniej
w 4 loci genowych*

Akredytacja laboratoriów wg normy PN-EN ISO/IEC 17025
Ustalanie tożsamości zwłok nieznanych
Rozpoznanie zwłok opiera się na:
dowodach pozamedycznych
(daktyloskopia, odzież, przedmioty)
dowodach medycznych
oględziny zewnętrzne
oględziny wewnętrzne
badania genetyczne
Identyfikacją zajmują się medycy sądowi i antropolodzy
Ustalanie tożsamości zwłok nieznanych
Oględziny zewnętrzne
Oględziny zewnętrzne zwłok, w zależności od stanu zwłok
pozwalają na ustalenie:
-
-
wieku, płci, wzrostu, wagi ciała, rozmiaru „obuwia”
owłosienie głowy
koloru tęczówek
cech twarzy, rąk, stóp, budowy ciała, co powinno być
zarejestrowane na zdjęciach lub filmie
znaki szczególne (znamiona, blizny, zniekształcenia)
uzębienie (w Polsce bardzo rzadko ludzie leczą się u
jednego stomatologa i posiadają kartę stomatologiczną)
superprojekcja i metoda Gerasimowa - do odtworzenia
wyglądu twarzy
Ustalanie tożsamości zwłok nieznanych
Oględziny wewnętrzne
Oględziny wewnętrzne czyli sekcja zwłok pozwala na ustalenie
stanu zdrowia tj. schorzeń narządów wewnętrznych, przebytych
operacji, zmian pourazowych, np. wygojonych złamań kości.
Najlepszy materiał sekcyjny do badań DNA
krew (zwłoki bez widocznego rozkładu gnilnego)
 nienaruszone stomatologicznie zęby
 trzon kości piszczelowej lub udowej
 guzowatość kości potylicznej
 chrząstka żebrowa
 wątroba lub śledziona (w wyjątkowych przypadkach)

Identyfikacja zwłok rozkawałkowanych
Należy odpowiedzieć na pytania:

jak długo od śmierci i w jakich warunkach
pozostawały poszczególne fragmenty ciała

czy poszczególne fragmenty należą do tego samego
osobnika (dopasowanie anatomiczne, zgodność
serologiczna lub testy DNA)

czy poszczególne części ciała należą do osobnika tej
samej płci

jaki wzrost i wagę ciała miała ofiara
Metody identyfikacji zwłok*

porównanie profilu genetycznego DNA

porównanie odcisków palców

badanie uzębienia i innych danych odontologicznych

badania radiologiczne

porównanie danych medycznych (przebyte zabiegi lecznicze i
chirurgiczne)

porównanie znaków szczególnych (blizny, tatuaże)

porównanie danych rysopisowych

identyfikacja rzeczy osobistych

identyfikacja na podstawie dokumentów ujawnionych przy
zwłokach lub szczątkach

rozpoznanie przez świadków, członków rodziny lub znajomych
*opracowane podczas V Konferencji Komisji Interpolu do spraw Identyfikacji Ofiar Katastrof Masowych i Klęsk Żywiołowych, która odbyła się w Lyonie w 1993r
Bezpośrednie porównanie
D5S818
D13S317 D7S820
D16S539
CSF1PO
Penta D
Profil DNA ofiary
z katastrofy
Profil DNA z
dowodowego materiału
(szczoteczka do zębów
należąca do ofiary)
Analiza pokrewieństwa
ofiara
D5S818
?
żona
D13S317
D7S820
D16S539
CSF1PO
Penta D
11,13
8,12
8,12
8,9
10,12
8,10
żona
11,13
8,14
8,9
9,13
10,10
9,10
syn
domniemany
profil ofiary
11,? or
?,13
?,14
9,?
?,13
?,10
9,?
profil ofiary z
katastrofy
12,13
11,14
9,9
11,13
10,10
9,12
syn
Figure 24.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
ofiara
(ojciec)
uzyskany
profil
Barkoding DNA – narzędzie do opisu bioróżnorodności
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Opis i ewidencja bioróżnorodności
Analizy ekologiczne i fitogeograficzne
Analizy kryminalistyczne
Ustalanie składu żywności oraz leków
Kontrola „bezpieczeństwa biologicznego”
Zapobieganie i identyfikacja nielegalnego handlu zwierzętami lub roślinami będącymi pod ochroną
Klasyfikacja i opisywanie nowych gatunków
Sprawy kryminalne
Proces analizy mitochondrialnego DNA

oczyszczenie i pobranie materiału do badania

izolacja mtDNA

amplifikacja regionu HV1/HV2 metodą PCR

sekwencjonowanie amplikonów regionu
HV1/HV2

porównanie sekwencji badanych

porównanie sekwencji badanych z referencyjną
sekwencją Andersona

sprawdzenie z bazą danych częstości
haplotypowej danej sekwencji
Interpretacja wyników sekwencjonowania mtDNA
wykluczenie – różnica dwóch lub
więcej nukleotydów pomiędzy
badanymi próbkami
 brak rozstrzygnięcia – różnica w
jednym nukleotydzie pomiędzy
badanymi próbkami
 brak wykluczenia – brak różnicy w
sekwencji nukleotydów pomiędzy
badanymi próbkami

Analiza klasycznych cech grupowych w
badaniach o ustalenie ojcostwa





układ AB0
antygeny erytrocytarne: MNSs, Rh, Kell, Jk(a,b), Fy(a,b)
specyficzne białka surowicy krwi: układ GM,
haptoglobiny (HP)
izoenzymy zawarte w krwinkach czerwonych: APC
(kwaśna fosfataza krwinkowa), PGM
(fosfoglukomutaza), ESD (esteraza D), GLO
(glioksolaza), GPT (aminotransferaza), PGP (fosfataza
fosfoglikolanowa)
antygeny układu zgodności tkankowej HLA
Badanie ojcostwa testami genetycznymi DNA
?
Pobranie krwi lub wymazu z jamy
ustnej do badania
Izolacja DNA
Amplifikacja 15 polimorficznych
markerów genetycznych techniką
PCR (Identifiler)
Rozdział produktów amplifikacji techniką
zautomatyzowanej elektroforezy – sekwenator ABI
Prism 377
Interpretacja 5-kolorowego cyfrowego obrazu
elektroforezy
• w teście tym tylko 1 mężczyzna nie będący ojcem, na milion nie będących ojcami pozostanie
niewykluczony
• wykluczenie ojcostwa stwierdzane jest średnio w 9 spośród 15 układów
• brak wykluczenia ojcostwa jest praktycznie równoznaczny z jego udowodnieniem
• prawdopodobieństwo napotkania innego mężczyzny, którego ojcostwo nie zostałoby wykluczone w
teście wynosi średnio 1 na 9 miliardów
Test na ojcostwo
Mężczyzna nie
będący ojcem
biologicznym
?
Mężczyzna będący
ojcem
biologicznym
Matka
?
Dziecko
Odwrotny test na ojcostwo
(identyfikacja zaginionego dziecka)
Domniemana
matka
Domniemany
ojciec
?
Zaginione
dziecko
Zasady dziedziczenia
1)
dziecko ma dwa allele dla każdego markera
autosomalnego (jeden od matki i jeden od
biologicznego ojca)
2)
dziecko dziedziczy mitochondrialny haplotyp
DNA po matce (wyłączając mutacje)
3)
dziecko płci męskiej dziedziczy haplotyp
chromosomu Y po ojcu (wyłączając mutacje)
Parametry biostatystyczne
Prawdopodobieństwo wykluczenia ojcostwa (PE)
definiuje się jako prawdopodobieństwo, z jakim zastosowany zestaw markerów
genetycznych pozwala na wykluczenie niesłusznie pozwanego mężczyzny; czyli
określa procent mężczyzn w populacji, którzy nie mogą być biologicznymi ojcami
dziecka ze względu na brak wspólnego allela
Szansa ojcostwa (PI)
interpretując wyniki badań genetycznych rozważamy dwie hipotezy - jedną
potwierdzającą ojcostwo, a drugą zaprzeczającą ojcostwu badanego mężczyzny.
Wielkość współczynnika PI informuje nas o tym, dla której hipotezy otrzymane
wyniki badań genetycznych są bardziej prawdopodobne. Przykładowo, wartość PI
= 1 000 000 oznacza, że otrzymany wynik badań genetycznych jest 1 000 000 razy
bardziej prawdopodobny przy założeniu, że badany mężczyzna jest biologicznym
ojcem, niż przy założeniu, że ojcem dziecka jest inny mężczyzna
Prawdopodobieństwo ojcostwa (P)
obliczane na podstawie szansy ojcostwa (PI) oraz tzw. prawdopodobieństwa a
priori, którego wartość przyjmuje się najczęściej jako 0.5. Gdy wartość P
przekracza 99.999999%, szansa ojcostwa (PI) wynosi przynajmniej 1 000 000
Katedra i Zakład Medycyny Sądowej UJCM
Download