Biomedyczny przegląd naukowy. Tom 2
advertisement
Biomedyczny przegląd naukowy. Tom 2 Biomedyczny przegląd naukowy. Tom 2 Redakcja: Beata Zdunek Agata Pietraszek Lublin 2016 Recenzenci: prof. dr hab. Marta Misiuk-Hojło prof. dr hab. Małgorzata Sobieszczańska dr hab. n. farm. inż. Monika Anna Olszewska, prof. nadzw. UM dr hab. n. med. Barbara Mackiewicz dr hab. n. med. Katarzyna Nowomiejska dr hab. Anna Rymuszka dr Agnieszka Kuźniar dr Anna Pytlak dr Ewa Rojczyk dr Stanisław Adamiak dr Michał Dzik dr inż. Beata Świeczko-Żurek dr inż. Jarosław Zubrzycki dr n. o zdr. Mariola Janiszewska dr n. med. Dorota Żołnierczuk-Kieliszek dr n. med. Barbara Rajtar Wszystkie opublikowane rozdziały otrzymały pozytywne recenzje. Skład i łamanie: Ilona Żuchowska Projekt okładki: Marcin Szklarczyk © Copyright by Wydawnictwo Naukowe TYGIEL sp. z o. o. ISBN 978-83-65598-09-7 Wydawca: Wydawnictwo Naukowe TYGIEL sp. z o. o. ul. Głowackiego 35/341, 20-060 Lublin www.wydawnictwo-tygiel.pl Spis treści Żaneta Anna Mierzejewska Analiza zjawiska biofilmu – mechanizmy powstawania, wpływ na organizm i implanty ............................ 7 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Joanna Sikora, Emilia Siemińska Antybiotykooporność – poważny problem dzisiejszej cywilizacji .................. 18 Joanna Woźniak, Natalia Dereń, Edyta Simińska Mechanizmy wnikania koronawirusów do komórek gospodarza..................... 27 Maciej Gawroński, Arkadiusz Goede, Tomasz Wandtke Wirusy onkolityczne jako potencjalna alternatywa w leczeniu nowotworów złośliwych ................................................................... 35 Monika Dyńda Wykorzystanie bakterii jako wektorów w terapii przeciwnowotworowej ...... 47 Anna Posmysz Zastosowanie krwi pępowinowej w medycynie czyli o możliwościach terapeutycznych komórek macierzystych pobranych z krwi pępowinowej ... 66 Małgorzata Waldowska, Wioleta Kowalska, Justyna Woś Fenotypowe i funkcjonalne zróżnicowanie populacji komórek NKT .............. 77 Martyna Bednarczyk, Urszula Mazurek, Małgorzata Muc-Wierzgoń Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu komórek raka jelita grubego ................................................................................ 94 Dominika Lach Terapie przeciwzapalne – nowy cel w leczeniu ostrych zespołów wieńcowych ....................................................... 112 Karolina Kątska, Jan Ostrowski, Ewa Kosior-Jarecka Zaburzenia ze strony narządu wzroku w przebiegu oponiaków ..................... 121 Anna Łabejszo, Tomasz Wandtke, Maciej Gawroński Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych – immunopatogeneza i leczenie......................................................................... 131 Adrian Dubicki Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci. Rodzaje kasków korekcyjnych oraz metody ich wykonywania ................................................. 141 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska Ocena deformacji i metody pomiaru czaszki u dzieci .................................... 161 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Tomasz Wybranowski Fluorescencyjna spektroskopia czasowo-rozdzielcza. Proste narzędzie diagnostyczne ......................................................................... 179 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Joanna Sikora Fotoluminescencja – proste narzędzie analizy wpływu pH na aktywność przeciwnowotworową pochodnych kamptotecyny .................. 192 Arkadiusz Goede, Maciej Gawroński, Tomasz Wandtke Technika DNA origami – potencjalne zastosowania ....................................... 204 Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych ................................................................................... 223 Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski Wpływ prekursorów porów na morfologię membran półprzepuszczalnych przeznaczonych do hodowli komórkowych ..................................................... 254 Bartosz Sikora, Aleksandra Skubis, Małgorzata Kimsa Ekspresja markerów molekularnych ABCG2 oraz P63 w świńskich epitelialnych komórkach macierzystych rąbka rogówki ................................. 265 Magdalena Antonowicz, Anita Kajzer, Magdalena Grygiel-Pradelok Dobór własności mechanicznych elementów stabilizatora zewnętrznego do leczenia kurzej klatki piersiowej .................................................................. 277 Żaneta Anna Mierzejewska Wieloaspektowa analiza problematyki związanej z mechanizmami niszczenia implantów ........................................................... 293 Żaneta Anna Mierzejewska Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów wytwarzanych tradycyjnymi technologiami..................................................... 308 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska Projekt indywidualnego implantu kości biodrowej.......................................... 325 Magdalena Grygiel-Pradelok, Janusz Szewczenko, Wojciech Kajzer, Magdalena Antonowicz Ocena wpływu biodegradowalnej warstwy polimerowej (PLGA) na korozję podłoża ze stopów tytanu ................................................................ 344 Adrian Dubicki Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy .......................................... 357 Indeks autorów ................................................................................................... 378 Żaneta Anna Mierzejewska1 Analiza zjawiska biofilmu – mechanizmy powstawania, wpływ na organizm i implanty 1. Wstęp/Wprowadzenie Biofilm to złożona struktura biologiczna, wielokomórkowy twór złożony z drobnoustrojów jednego lub wielu gatunków mikroorganizmów, otoczony warstwą zewnątrzkomórkowych polisacharydów [1]. W jego skład wchodzić mogą bakterie, grzyby, glony i pierwotniaki. Biofilm powstaje w wyniku rozrastania się form drobnoustrojów, które przyjmują uporządkowaną, skomplikowaną strukturę złożoną z mikrokoloni bakteryjnych [2]. Mikrokolonie poprzedzielane są siecią otwartych kanalików, w których krążąca ciecz jest odpowiedzialna za dostarczanie tlenu, substancji odżywczych oraz usuwanie zbędnych produktów przemiany materii. Dzięki temu nawet głębiej położone warstwy komórek mają zapewnione warunki do życia i rozwoju[1]. Biofilm wpływa na wiele aspektów naszego życia, dlatego takie ważne jest jego dokładne poznanie. Mikroorganizmy wchodzące w jego skład charakteryzują się inwazyjnością, przyczyniają się do rozwoju wielu infekcji, powstaje również na implantach biomedycznych, prowadząc do rozwoju różnego typu stanów zapalnych, również w warunkach szpitalnych. Są one oporne na działanie wysokiej temperatury, środków dezynfekujących i antyseptycznych, surfaktantów oraz antybiotyków [3]. Do biomateriałów szczególnie podatnych na formowanie się biofilmu zalicza się: sztuczne serce, protezy stawów, soczewki kontaktowe, zastawki serca, cewniki, szwy, protezy naczyń krwionośnych, spirale domaciczne, rozrusznik serca oraz implanty metaliczne [4]. W przypadku tych ostatnich biofilmu może powodować powstawanie szczególnie uciążliwych i niebezpiecznych stanów zapalnych, które zapoczątkowują procesy resorpcji tkanki kostnej wokół implantu. Zmniejszenie stabilizacji wszczepu prowadzi do jego obluzowania, uszkodzenia otaczającej go tkanki kostnej, a w konsekwencji zniszczenia jej struktury i złamania kości lub implantu [4‚6]. 1 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej, Wydział Mechaniczny, Politechnika Białostocka 7 Żaneta Anna Mierzejewska 2. Cel pracy Ze względu na duży wpływ biofilmu na życia człowieka oraz jego otoczenie, bardzo ważne jest dokładne poznanie mechanizmów formowania się oraz funkcjonowania tej struktury. Dotychczas badania były prowadzone przede wszystkim w zawiesinach komórkowych, które zawierały pojedyncze komórki mikroorganizmów [2]. Niestety komórki swobodnie żyjące zasadniczo różnią się od komórek tworzących biofilm. Z tego powodu powinno się skupić na badaniu komórek w kontekście biofilmu jako całości. W tym celu należy przede wszystkim ulepszyć techniki pozyskiwania oraz pomiaru tej struktury. Obecnie stosowane metody są niestety mało efektywne. Należy również rozwijać modele systemowe, które można wykorzystać do analizy biofilmu. Powinny one umożliwiać uzyskanie powtarzalnych oraz dokładnych wyników. Istotne jest także poznanie czynników indukujących i wpływających na tworzenie się biofilmu [6]. 3. Budowa biofilmu Powstawanie biofilmu jest procesem wielostopniowym, uwarunkowanym właściwościami tworzących go mikroorganizmów oraz budową i właściwościami kolonizowanych materiałów lub organizmów (rys.1) [7]. Szczególną rolę w procesie adhezji odgrywają wytwarzane przez mikroorganizmy tworzące biofilm polimery zewnątrzkomórkowe, lipopolisacharydy i białka ich ściany komórkowej. Kolonizację ułatwia także struktura powierzchni oraz wszelkie jej uszkodzenia i chropowatości [8]. Adhezja komórek mikroorganizmów jest procesem wieloetapowym [9]. Początkowo przemieszczanie się komórek w kierunku zasiedlanej powierzchni regulują oddziaływania fizyczne związane z działaniem sił hydrodynamicznych, grawitacyjnych, termodynamicznych oraz sił van der Waalsa [10]. Dużą rolę w procesie kolonizacji powierzchni przez bakterie odgrywają ich struktury zewnętrzne, takie jak fimbrie czy rzęski [11]. Ruchliwość bakterii wynikająca natomiast z posiadania przez nie rzęsek sprawia, że łatwiej docierają one do powierzchni, a następnie po jej osiągnięciu wędrują w poszukiwaniu innych drobnoustrojów, dążąc do wytworzenia nowej mikrokoloni lub powiększenia już istniejącej [12]. Adhezja ma charakter nieodwracalny, dochodzi bowiem do wytworzenia specyficznych wiązań między zasiedlaną powierzchnią a występującymi na powierzchni komórkami [13]. Podstawową rolę w tym procesie odgrywają polimery zewnątrzkomórkowe (EPS) tworzące tzw. glikokaliks [12‚14], który umożliwia adhezję komórek do takich powierzchni, jak tworzywa sztuczne czy metale [15]. Adhezja nieodwracalna umożliwi wytworzenie mikrokoloni i dojrze- 8 Analiza zjawiska biofilmu – mechanizmy powstawania, wpływ na organizm i implanty wanie biofilmu. Następuje namnażanie drobnoustrojów i ich stopniowe różnicowanie. W ich komórkach dochodzi do aktywacji lub hamowania ekspresji niektórych genów [16]. Bakterie bytujące we wnętrzu biofilmu narażone są na ograniczenie dostępu tlenu, z tego też względu zmienia się ich metabolizm – wzrasta aktywność beztlenowych szlaków metabolicznych, zahamowaniu ulega też synteza niektórych enzymów oraz toksyn [17]. Dzięki tym zjawiskom komórki bakterii wchodzące w skład biofilmu wykazują odmienne cechy niż komórki żyjące w postaci wolnej [16]. Dojrzała forma biofilmu otoczona jest grubą warstwą glikokaliksu, do którego adsorbowane są substancje mineralne, związki organiczne i komórki innych drobnoustrojów [18]. W ostatnim etapie rozwoju biofilm osiąga tzw. krytyczną grubość i stopniowo przestaje utrzymywać istniejącą formę. Następuje wówczas migracja komórek z peryferyjnych części dojrzałego biofilmu do otoczenia [18-19]. Przyczyną tego zjawiska może być wyczerpanie składników pokarmowych lub problemy ich przepływu w obrębie biofilmu. Rysunek 1. Etapy rozwoju biofilmu [20] 3.1. Cechy biofilmu Charakterystyczne dla biofilmów jest to, iż występuje w nich mieszanina stanów metabolicznych. Bakterie na obrzeżach wykazują przejawy życia np. wzrost, natomiast komórki położone w głębszych warstwach znajdują się w stanie anabiozy (są żywe, ale „uśpione”). W obrębie biofilmu występuje zróżnicowane środowisko chemiczne oraz ograniczony dostęp do składników odżywczych (odmienne stężenie tlenu w warstwach), co jest główną przyczyną 9 Żaneta Anna Mierzejewska zmian w metabolizmie komórek bakteryjnych (rys.2). Ze względu na to komórki genetycznie identyczne mogą zachowywać się i wyglądać zupełnie inaczej [17]. Miejscowe warunki wpływają także na wytwarzanie przez bakterie wielu toksyn i innych substancji wywołujących objawy choroby. Mechanizmy obronne uruchamiane przez układ odpornościowy nie potrafią pokonać biofilmu. Często nawet antybiotykom nie udaje się pokonać lepkiej substancji polisacharydowej i przedostać się do ich wnętrza, co zapewniają im zmienne warunki środowiska oraz zróżnicowanie gatunkowego komórek tworzących biofilm. Przykładowo penicylina penetrująca Biofilm jest rozkładana przez beta-laktamazy, degradujące antybiotyk szybciej niż jest on w stanie przedostać się do głębszych warstw biofilmu [13]. Rysunek 2. Zróżnicowanie aktywności metabolicznych w obrębie biofilmu [21] 4. Biofilm a organizm ludzki W chwili obecnej uważa się, że 60 do 80% zakażeń z którymi spotyka się człowiek jest związane z tworzeniem biofilmów. Są to infekcje dotyczące np. implantów z tworzyw sztucznych, ale także odpowiadają za skutki m.in. zapaleniach ucha środkowego, zakażeniach dróg moczowych, zakażeniach dróg oddechowych w przebiegu mukowiscydozy itp. [13] Infekcje związane z biofilmem mają zwykle charakter przewlekły, niejednokrotnie groźny dla życia, a bakterie tworzące biofilm są szczególnie odporne na działanie antybiotyków, jak i na mechanizmy odpornościowe człowieka [17]. Nośnikiem informacji są związki chemiczne, które – po 10 Analiza zjawiska biofilmu – mechanizmy powstawania, wpływ na organizm i implanty przekroczeniu krytycznego stężenia – mogą powodować tworzenie się bądź rozpraszanie biofilmu, wydzielanie czynników zjadliwości oraz synchronizować aktywność całego biofilmu w kierunku korzystnym dla drobnoustrojów [18]. 4.1. Miejsca występowania biofilmu Zakażenie organizmu ludzkiego prowadzi do wielu niebezpiecznych komplikacji. Pomimo, iż protezy naczyniowe, zastawki serca czy protezy ortopedyczne ulegają zakażeniu dość rzadko, to jednak pojawienie się zakażenia może wymagać usunięcia protezy, amputacji kończyny lub spowodować śmierć pacjenta [22]. Biofilm powstający na zanieczyszczonych plastikowych implantach (np. zastawki serca) jest prawie niemożliwy do usunięcia przy pomocy antybiotyków. Dodatkowo, tworzywo sztuczne zniechęca migrację neutrofilów i makrofagów, które zwykle stanowią ochronę przed bakteriami [22]. Może to prowadzić do powstania zapalenia wsierdzia i uwolnienia bakterii do krwiobiegu, powodując miejscowe uszkodzenie serca. Bakterie odpowiedzialne za takie zakażenia to w szczególności S. epidermidis, S. aureus i Enterococcus sp. [23]Przylegają one do tworzywa, powodując powstawanie w nim zagłębień i szczelin. W wyniku tego konieczne jest chirurgiczne usunięcie implantu. Biofilm jest także przyczyną chorób szpitalnych spowodowanych mikroflorą pacjenta lub personelu (powstają w cewnikach i powodują kłopotliwe zakażenia, bardzo trudne do wyleczenia)[17‚19, 23] Ponadto bakterie tworzące biofilmy skórne mogą dostać się przez rurki i igły kroplówek do krwiobiegu i wywołać infekcje zagrażające życiu. Podając substancje bezpośrednio do krwiobiegu, omija się naturalny system niespecyficznej obrony skóry [24]. Producenci sprzętu medycznego zaczęli impregnować cewniki i rurki środkami przeciwbakteryjnymi takimi jak srebro czy antybiotyki w nadziei, że bakterie przestaną tworzyć błony biologiczne. Niestety, S. epidermidis uodparnia się bardzo szybko na nowo stosowane antybiotyki [24‚26]. 4.2. Zakażenia biomateriałów Zastosowanie implantów znacznie wzrosło w ciągu ubiegłych 20 lat. Szacuje się ze liczba wszczepów medycznych rośnie rocznie w granicach od 7% – 15% [25]. Materiały używane na wszczepy medyczne nazywane są biomateriałami i są one definiowane jako materiały używane do konstrukcji urządzeń medycznych charakteryzujące się biozgodnością (obojętność fizyczna i chemiczna w stosunku do otaczających tkanek), biofunkcjonalnością (właściwości danego materiału zoptymalizowane pod 11 Żaneta Anna Mierzejewska kątem funkcji jaką mają zastępować w organizmie) oraz stałością (niezmienność wymiarów i kształtu podczas sterylizacji) [26]. Stosowanie biomateriałów jest często związane z występowaniem infekcji bakteryjnych (Tabela nr. 1). Szacuje się, że jest to 1%-2% dla implantów ortopedycznych, natomiast dla cewników stosowanych do odprowadzania moczu 100%, dlatego ich stosowanie powinno być krótkotrwałe [27]. Takie infekcje mają bardzo poważne konsekwencje, w szczególności przy głęboko położonych tkankach i implantach naczyniowych, gdzie jedynym sposobem ratunku jest amputacja, a w wielu przypadkach zakażenie jest przyczyną śmierci pacjenta. Jak wynika z tabeli wiele rodzajów implantów wykazuje niski zakres infekcji, ale każda z nich wiąże się z poważnymi skutkami, dlatego proces kolonizacji implantów przez bakterie wymaga lepszego zrozumienia. Wielkości opisujące ilość infekcji na implantach spowodowanych występowaniem biofilmu podane są w tabeli poniżej: Tabela 1 Procentowy zakres infekcji na różnych biomateriałach [25] Materiał Rodzaj implantu Zakres infekcji [%] 7-10 Cewniki moczowe Silikon, Poliuretan, Polietylen Implanty ortopedyczne Tytan, Stal, Polietylen, Kobalt, Chrom 1-4 Implanty piersi Stenty Silikon Teflon, silikon, poliuretan, polietylen 5 1-5 Szkła kontaktowe Sztuczne naczynia krwionośne Zastawki serca PMMA 0.05-0.2 Fluoropolimery, Dacron, poliuretan 0.5-1 Tkanki naturalne, węgiel, stal 1-12 5. Profilaktyka zakażeń Celem profilaktyki antybiotykowej w przypadku zabiegów wszczepienia materiału sztucznego jest zminimalizowanie ryzyka kontaminacji bakteryjnej w okresie okołooperacyjnym i we wczesnym etapie gojenia rany [28]. W tym celu stosowane są antybiotyki o szerokim spektrum działania. Ich zastosowanie zmniejsza ryzyko śródoperacyjnej i wczesnej 12 Analiza zjawiska biofilmu – mechanizmy powstawania, wpływ na organizm i implanty pooperacyjnej drogi infekcji [28, 29]. Profilaktyka antybiotykowa w chirurgii kostnej stosowana jest zarówno w przypadku zabiegów przeprowadzanych w trybie planowym jak i tych, które z racji zaistniałych okoliczności muszą być przeprowadzone w trybie dyżurowym. Zgodnie z zaleceniami The Sanford Guide of Antimicrobial Therapy z 2010 roku [30], profilaktyka antybiotykowa w przypadku wszczepienia endoprotezy stawu powinna zostać wdrożona nie mniej niż 30 minut przed zabiegiem operacyjnym. Dodatkową profilaktykę stosuje się u pacjentów ze stwierdzonym nosicielstwem szczepów MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) lub na oddziałach ze stwierdzonym wzmożonym ryzykiem wystąpienia zakażeń szpitalnych. W przypadku wszczepienia implantu dentystycznego zagadnienie celowości stosowania profilaktyki antybiotykowej było przedmiotem dyskusji wśród wielu badaczy [29]. Zabiegi implantologiczne zostały zakwalifikowane jako zabiegi czyste skażone, wśród których ryzyko zakażenia miejsca operowanego jest oceniane na mniej niż 10% [31]. Przed wykonaniem zabiegu obowiązuje przeprowadzenie pełnej sanacji jamy ustnej, czyli eliminację wszelkich ognisk infekcji [1, 8]. Osobnym zagadnieniem jest profilaktyka antybakteryjna zakażeń w traumatologii narządu ruchu. Uważa się, że o profilaktyce można mówić wówczas, gdy wdrożenie leku nastąpiło do 6 h od urazu, gdy rana nie jest zakażona [32, 33]. W badaniach in vitro zaobserwowano, że obecność antybiotyku może zmniejszać adhezję komórek bakteryjnych do powierzchni implantu i tym samym opóźnić proces formowania biofilmu bakteryjnego [30‚32]. 5.1. Przykłady biofilmów na powierzchniach wyrobów medycznych Biofilmy mogą powstawać w wielu miejscach, gdzie może dojść do poważnych infekcji. Poniżej zostały przedstawione trzy przykłady miejsc występowania biofilmów i ich wpływ na zdrowie człowieka (rys.3) [8]. Stosowanie cewników wiąże się z niebezpieczeństwem zakażeń pochodzenia cewnikowego. W następstwie złożonych procesów na powierzchni cewnika powstaje biofilm, którego istotnym elementem są drobnoustroje. Najczęściej są to gronkowce charakteryzujące się bardzo wysoką opornością w stosunku do większości antybiotyków [11]. Zakażenia mogą rozwijać się lokalnie- w miejscu wprowadzenia cewnika lub też rozprzestrzeniać się drogą krwi; z użyciem cewników wiąże się występowanie septycznego zakrzepowego zapalenia żył, zapalenia wsierdzia, ropnia płuca, ropnia mózgu oraz zapalenia szpiku kostnego i gałki ocznej [21]. 13 Żaneta Anna Mierzejewska W protezach żółciowych powikłania obejmują najczęściej niedrożność protezy plastikowej w skutek powstania bakteryjnego biofilmu, tworzącego się na wewnętrznej powierzchni. Następstwem jest zapalenie dróg żółciowych i żółtaczka. Przypuszcza się ze adherencja protein i bakterii do wewnętrznej ściany protezy tworząca biofilm inicjuje jej zablokowanie. Bakterie dostają się do światła dróg żółciowych najprawdopodobniej już podczas wkładania protezy, a także refluksu treści dwunastniczej do dróg żółciowych już po jej założeniu. Powoduje to przylegnie kolejnych kolonii bakteryjnych wraz z kryształkami cholesterolu, tworząc szkielet włókien będący przyczyna powolnego zamykania światła protezy [11‚15]. a) b) c) d) Rysunek 3. Biofilm na a) protezie żółciowej [34], b) panewce implantu stawu biodrowego [35], c) szkliwie [36], d) implancie piersi [37] 6. Podsumowanie Obecnie nie istnieje jeden sprawdzony protokół postępowania diagnostycznego w przypadku zakażeń wynikających z obecności biofilmu. We wszystkich przypadkach o ostatecznym rozpoznaniu decyduje wystąpienie charakterystycznych objawów klinicznych wraz z odpowiednimi wynikami analiz laboratoryjnych krwi, badań mikrobiologicznych, histopatologicznych oraz diagnostyki obrazowej [2, 33]. Leczenie zakażeń jest trudne, długotrwałe 14 Analiza zjawiska biofilmu – mechanizmy powstawania, wpływ na organizm i implanty i często kończy się niepowodzeniem w wyniku, którego implant należy usunąć i zastosować inny algorytm postępowania leczniczego. Występowanie zakażeń znacznie wydłuża okres hospitalizacji chorego, generuje koszty, przyczynia się do obniżenia jakości jego życia a często nawet i śmierci pacjenta [38]. Praca zrealizowana przy wsparciu finansowym Wydziału Mechanicznego Politechniki Białostockiej w ramach projektu „Rozwój młodych naukowców i uczestników studiów doktoranckich‖ nr MB/WM/14/2014. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Paduch D., Niedzielski J., Materiały biomedyczne. Część I: Pojęcie filmu biologicznego (biofilmu) i fizykochemiczne podstawy przyczepności substancji organicznych do biomateriałów, Chirurgia Polska, (2005) Sałek A., Powstawanie biofilmu w warunkach przemysłowych. Cz.1. Mechanizm formowania biofilmu i jego struktura, Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 6 (2008) Bartoszewicz M., Rygiel A., Biofilm jako podstawowy mechanizm zakażenia miejsca operowanego, Chirurgia Polska, (2006) Donlan R. M., Biofi lms: Microbial life on surfaces, Emerging Infectious Disease, vol. 8 (2002), s. 136-151 Monds R. D., O´tool G. A., The developmental model of microbial biofi lms: Ten years of a paradigm up for review, Trends Microbiol, 17 (2009), s. 73-87 Chmiel A., Biotechnologia podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, PWN (1991) Libudzisz Z., Kowal K., Żakowska Z., Mikrobiologia techniczna, tom I, Mikroorganizmy i środowiska ich występowania, PWN (2001) Czaczyk K., Wojciechowska K., Tworzenie biofilmów bakteryjnych – istota zjawiska i mechanizmy oddziaływań, Biotechnologia, 3,62 (2003), s. 180-192 Marshall K. C., Adsorption and adhesion process in microbial growth at interfaces, Advances in Colloid Interface Science, vol. 25, 1(1986), s. 59-86 Czaczyk K., Czynniki warunkujące adhezję drobnoustrojów do powierzchni abiotycznych, Postępy Mikrobiologii, vol. 43, 3(2004), s. 267-283 Rijnaarts H. M., Norde W., Bouwer E. J., Lyklema J., Zehnder J. B., Bacterial adhesion under static and dynamic conditions, Applied and Environmental Microbiology, vol. 59 (1993), s. 3255-3265 Thi T. T. Le, Prigent-Combaret C., Dorel C., Lejeune P., First stages of biofi lm formation: characterization and quantifi cation of bacterial functions involved in colonization process, Methods in Enzymology, vol. 336(2001), s. 152-159 Percival S. L., Malic S., Cruz H., Williams D. W., Introduction to biofi lms, Biofi lms and Veterinary Medicine, vol. 6 (2011), s. 41-68 Pitts B., Fluorescence Microscopy to Assess Microbial Activity and Antimicrobial Performance in Biofilms, Biotechnologia, 3(2003), s. 180-192 Flemming H. C., Wingender J., Relevance of microbial extracellular polymeric substances (EPSs) – Part I: Structural and ecological aspects, Water Science and Technology, vol. 43(2001), s. 1-8 15 Żaneta Anna Mierzejewska 16. Costerton J. W., Lewandowski Z., DeBeer D., Caldwell D. E.,. Korber D. R, James G., Biofilms, the customized microniche, Journal of Bacteriology, vol. 176 (1994), s. 2137-2142 17. Costerton J. W., Lewandowski Z., Caldwell D. E., Korber D. R., Lappin-Scott H. M., Microbial biofilms, Annual Review of Microbiology, vol. 49 (1995), s. 711-745 18. Chandra J., Zhou G., Channoum M. A., Fungal biofi lms and actimycotics, Current Drug Targets, 8(2005), s. 887-894 19. Liu Y., Tay J. H., Detachment forces and their infl uence on the structure and metabolic behavior of biofilms, Journal of Microbiology and Biotechnology, vol. 17(2001), s. 111-117 20. https://pl.wikipedia.org/wiki/Biofilm [12.10.2015] 21. http://bioinfo.mol.edu.pl/articles/Buchala05 [12.10.2015] 22. Pokrowiecki R., Tyski S., Zaleska M., Problematyka Zakażeń Okołowszczepowych, POST. MIKROBIOL., 53, 2 (2014), s. 123-134 23. Amarasinghe J. J., Scannapieco F. A., Haase E. M., Transcriptional and translational analysis of biofilm determinants of Aggregatibacter actinomycetemcomitans in response to environmental perturbation, Infect. Immun. 77(2009), s. 2896-2907 24. Arciola C. R., Campoccia D., Gamberini S., Baldassarri L., Montanaro L., Prevalence of cna, fnbB adhesins genes among Staphylococcus aureus isolates from orthopedic infections asossciated to different types of implants, FEMS Microbiol. Lett. 246 (2005), s. 81-86 25. Lebeaux, D., Chauhan, A., Rendueles, O., Beloin, C., From in vitro to in vivo Models of Bacterial Biofilm-Related Infections, Pathogens, 2 (2013), s. 288356 26. Barei D. P., Nork S. E., Mills W. J., Henley M. B., Benirschke S. K. Complications associated with internal fixation of high-energy bicondylar tibial plateau fractures utilizing a two-incision technique, J. Orthop. Trauma, 18 (2004), s. 649-657 27. Trends in Microbiology, vol. 17, 2 (2009), s. 73-87 28. Resnik R. R, Misch C. E., Biofilms in dentistry, (w) Contemporary Implant Dentistry, red. Misch C.E., Abbas H.A. (2008), s. 495 29. Esposito M., Grusovin M. G., Loli V., Coulthard P., Worthington H. V., Does antibiotic prophylaxis at implant placement decrease early implant failures? A Cochrane systematic review, Eur. J. Oral. Implantol. 3(2010), s. 101-110 30. Gilbert D. N., Moellering R. C., Eliopoulos G. M., Chambers H. F., Saag M. S., The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2010, 40th ed. Sperryville, VA: Antimicrobial Therapy (2010) 31. Resnik R. R, Misch C. E., Pharmacology in Implant Dentistry, (w) Contemporary Implant Dentistry, red. Misch C. E., Abbas H. A. (2008), s. 468 32. Trampuz A., Zimmerli W., Antimicrobial agents in orthopaedic surgery, Drugs, 66 (2006), s. 1089-1105 33. Trampuz A., Zimmerli W., Diagnosis and treatment of infections associated with fracture-fixation devices, Injury, Int.J. Care Injured. 37, (2006), s. 59-66 34. http://polimery.am.wroc.pl/2006/301.pdf [12.10.2015] 16 Analiza zjawiska biofilmu – mechanizmy powstawania, wpływ na organizm i implanty 35. http://ec.europa.eu/research/health/infectious-diseases/antimicrobial-drug resistance/projects/087_en.html [12.10.2015] 36. http://www.iab.kit.edu/microbio/489.php [12.10.2015] 37. http://www.talroudnerplasticsurgery.com/breast-plastic-surgery/breastimplant-failure-due-to-capsular-contracture-caused-by-biofilm/ [12.10.2015] 38. Fang G., Keks T. F., Getry L. O., Harris A. A., Rivera N., Gett K., Fuchs P. C., Gustafson M., Wong E. S., Goetz A., Wagner M. M., Yu V. L., Prosthetic Valle endocarditis resulting from nosocomial bacteremia. A prospective, multicenter study, Ann. Intern. Med. 119, (1993), s. 560-567 Analiza zjawiska biofilmu – mechanizmy powstawania, wpływ na organizm i implanty Zadaniem implantów umieszczanych w organizmie ludzkim jest pełnienie funkcji zastępowanych tkanek. Często zabiegi wszczepiania implantów wiążą się ze zwiększeniem komfortu pacjenta, jednak nie są one pozbawione ryzyka. Szacuje się, że blisko 70% operacji wszczepiania implantów wiąże się z zakażeniami spowodowanymi występowaniem biofilmu. Infekcje związane z biofilmem mają charakter przewlekły, niejednokrotnie groźny dla życia ludzkiego, przy czym bakterie go tworzące są odporne na antybiotyki. Biofilm występując na powierzchniach biomateriałów może powodować korozję oraz wpływać na ich właściwości mechaniczne. Dlatego tak ważne jest poznanie mechanizmów powstawania biofilmów oraz znalezienie skutecznych środków umożliwiających jego zwalczanie bez konieczności chirurgicznej ingerencji w organizm ludzki. Analysis of the biofilm phenomenon – formation mechanisms, effects on the body and implants The task of implants placed in the human body is replacing the function of tissues. Common treatments are associated with increased patient comfort, but they are not without risk. It is estimated that nearly 70% of implant surgeries associated with infections caused by the occurrence of biofilm. Biofilm infections are chronic, often life-threatening, while bacteria forming it are resistant to antibiotics. The biofilm present on the surfaces of biomaterials can cause corrosion and affect their mechanical properties. Therefore, it is important to understand the mechanisms of biofilms and to find effective means to combat it without surgical intervention in the human body. 17 Alicja Janicka1, Anna Cwynar2, Blanka Ziomkowska3, Joanna Sikora4, Emilia Siemińska5 Antybiotykooporność – poważny problem dzisiejszej cywilizacji 1. Wprowadzenie Pierwszym krokiem w kierunku leczenia chorób bakteryjnych zarówno ludzi jak i zwierząt było odkrycie penicyliny 28 września 1928r. przez Aleksandra Fleminga. Penicylina miała okazać się panaceum na wszystkie zakażenia bakteryjne. Po tym nowatorskim odkryciu powoli nakręcało się koło napędowe, prowadzące do wyszukiwania i tworzenia coraz to nowszych naturalnych i półsyntetycznych antybiotyków. Był to okres przełomowy w medycynie, oddający w ręce lekarzy potężną broń do walki z drobnoustrojami, które stanowiły przyczynę chorób i śmierci wielu ludzi i zwierząt. W tamtym okresie mogłoby się wydawać, że lekom przeciwdrobnoustrojowym nic nie zagrozi. W latach 60. XX wieku uważano nawet, że zakażenia bakteryjne przeszły w niepamięć i że zwalczono je na zawsze. W późniejszym okresie jednak, zaczęto zauważać, że istnieją szczepy bakterii wykazujące oporność na antybiotykoterapię, przez co leczenie chorób przez nie wywołanych stało się problemem ówczesnych lat i trwa do dnia dzisiejszego [1, 2, 23]. Gronkowce oporne na metycylinę, enterokoki oporne na wankomycynę, a także pneumokoki oporne na penicyliny to tylko nieliczne przykłady bakterii (grupa Gram-dodatnich), które stanowią coraz to większy problem w lecznictwie, ze względu na fakt, że wiele z nich może być opornych jednocześnie na antybiotyki jak i chemioterapeutyki [3]. Z biegiem czasu i z postępami w pracach mających na celu odkrycie medykamentu, który miałby uporać się z drobnoustrojami wykazującymi oporność na dotychczasowe leczenie, okazało się że takim „antybiotykiem ostatniej 1 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Studenckie Koło Naukowe Biofizyki przy Zakładzie Biofizyki 2 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra i Zakład Patobiochemii i Chemii Klinicznej 3 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra i Zakład Biofizyki 4 [email protected], Wydział Lekarski, Katedra Farmakologii i Terapii 5 [email protected], Wydział farmaceutyczny, Studenckie Koło Naukowe Chemii Analitycznej 18 Antybiotykooporność – poważny problem dzisiejszej cywilizacji szansy” jest wankomycyna. Jednak i ten antybiotyk jest nieskuteczny w walce z infekcjami wywołanymi przez szczepy gronkowców i paciorkowców. Szczególnie niebezpiecznymi szczepami bakterii zwłaszcza dla pacjentów w trakcie leczenia szpitalnego, a także tych z zaburzeniami czynności immunologicznych są zakażenia Staphylococcusaureus opornym na leczenie metycyliną (MRSA – MethycillinResistantStaphylococcusaureus) [4]. Najważniejszym punktem w terapii chorób bakteryjnych, powinna być jak najwcześniejsza identyfikacja tego drobnoustroju oraz ustalenie jego wrażliwości na leki. Ma to wpływ na wywołanie pozytywnego efektu terapeutycznego. Pominięcie tego istotnego kroku i stosowania leków o szerokim spektrum działania jest jednym z powodów nabywania przez drobnoustroje antybiotykoodporności [5]. 2. Cel pracy Celem pracy jest omówienie problemuantybiotykoodporności drobnoustrojów, mechanizmów prowadzących do wytworzenia przez bakterie oporności oraz ewentualnych działań mających na celu zniwelowanie niniejszego zagrożenia dla dobra przyszłości cywilizacji. 3. Omówienie 3.1. Przyczyny prowadzące do powstania oporności bakterii na terapię antybiotykową Standardowo wyróżnia się antybiotykooporność wrodzoną oraz nabytą. Oporność na antybiotyki wrodzona, jak sama nazwa wskazuje jest naturalna i charakteryzuje się niewrażliwością niektórych bakterii na poszczególne antybiotyki. Jest to zjawisko, które obserwuje się u większości bakterii Gramujemnych, opornych na działanie penicylin pochodzenia naturalnego. Jest ono spowodowane budową komórki drobnoustroju i poprzez to np. niemożliwe jest wnikanie antybiotyku do wnętrza komórki bakteryjnej i oddziaływanie na nią. Bakterie z opornością nabytą posiadają umiejętność przystosowania się do środowiska w celu przeżycia w panujących warunkach. Jednym z takich efektów przystosowawczych są mutacje bakterii pojawiające się z częstotliwością 1 na 10-8-10-9 podziałów chromosomalnych. W wyniku tych przemian dochodzi do współzawodnictwa z innymi bakteriami, migracją czy też zmianą środowiska, a to z kolei prowadzi do nabycia przez drobnoustroje niewrażliwości na działanie antybiotykoterapii. W obecnej dobie, kiedy to antybiotyki są szeroko stosowane także w sektorze rolno-spożywczym, bakterie oporne na ich działanie, rozwijają się również poprzez spożywanie przez ludzi produktów spożywczych pochodzenia zwierzęcego. U tych zwierząt wdrożone zostało leczenie antybiotykami i nie zachowano po tej 19 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Joanna Sikora, Emilia Siemińska terapii okresu między zakończeniem podawania antybiotyków, a ubojem zwierzęcia [6, 7, 8, 24]. To właśnie stosowanie w życiu codziennym antybiotyków i nieprzestrzeganie okresów karencji jest głównym z powodów zwiększenia się ilości patogenów opornych na działanie leków. Bardzo duże zagrożenie stanowią doniesienia, mówiące o tym, że bakterie posiadające status bezpiecznych dla człowieka (bakterie fermentacji mlekowej), mogą posiadać geny odpowiedzialne za antybiotykooporność, które są w stanie przenieść się na mikroorganizmy patogenne, poprzez m.in. transfer genów dzięki ruchomym elementom DNA. Dodatkowym zagrożeniem może okazać się fakt, że np. bakterie z rodzaju Lactobacillus, należące do grupy probiotyków, mogą wytworzyć w swoich komórkach więcej niż jeden mechanizm antybiotykoodporności. Dlatego też bardzo istotnym krokiem jest poddanie bakterii probiotycznych szerokim badaniom pod względem oporności na antybiotyki oraz możliwości przenoszenia przez nie genów oporności poprzez transfer. W dniu dzisiejszym po długoletniej, często syzyfowej, a także nadgorliwej walce z bakteriami naukowcy z całego świata obawiają się, że może dojść do sytuacji, gdzie oporność bakterii będzie tak duża, iż nie będą one wykazywać wrażliwości na żadne antybiotyki [24, 25]. 3.2. Mechanizmy prowadzące do nabywania antybiotykoodporności przez komórki bakteryjne Mutacja oraz horyzontalny transfer genów to dwa główne mechanizmy nabywania przez drobnoustroje oporności [29]. Jeden z wymienionych mechanizmów nabierania przez bakterie oporności na działanie antybiotyków – pionowy transfer genów, polega na tym, że bakterie obecne w organizmie wrażliwe na antybiotykoterapię zostają w procesie leczenia wyeliminowane, ustępując jednocześnie miejsca bakteriom opornym na działanie tego medykamentu. Tak się dzieje w przypadku np. szczepu Escherichia coli, kiedy to podczas leczenia streptomycyną jedna komórka na ok 10-9 staje się oporna na ten antybiotyk. Mogłoby się wydawać, że taka zmiana i uodpornienie się tak niewielkiej ilości bakterii nie powinno mieć większego znaczenia dla organizmu. Biorąc jednak pod uwagę szybkość z jaką bakterie się namnażają skala nowopowstałych drobnoustrojów opornych jest ogromna [9‚11, 26, 29]. Bardzo niebezpieczną drogą prowadzącą do szerzenia się antybiotykooporności jest kontakt zwierząt zdrowych ze zwierzętami, paszą czy środowiskiem zakażonym opornymi bakteriami. Innymi słowy duży wpływ na szerzenie się antybiotykooporności ma łańcuch żywieniowy. Człowiek może zostać zarażony poprzez spożywanie pokarmów odzwierzęcych (np. mleko, mięso), ale także poprzez bliski kontakt ze zwierzętami 20 Antybiotykooporność – poważny problem dzisiejszej cywilizacji (np. pies może zarazić człowieka gronkowcem opornym na metycylinę). Bakterie poprzez umiejętność modyfikacji cząsteczki antybiotyku, potrafią zmienić cel jego działania po czym przy pomocy pompy wypływowej (zwiększa się wypływ antybiotyku, który już dostał się do wnętrza bakterii dzięki tak zwanemu systemowi efflux(ang. efflux pumps of multi-drug resistance) usunąć antybiotyk z własnej komórki. Jest to mechanizm dzięki któremu, bakterie stają się niewrażliwe na działania antybiotyków. Są także w stanie zakłócić wchłanianie antybiotyku przez ścianę komórkową bakterii, zmienić jej strukturę oraz strukturę białek (poryn) jako kanałów, które umożliwiają antybiotykom penetracje wnętrza bakterii Gramujemnych w przypadku grupy aminoglikozydów [12, 13,15, 16, 24]. Poziome przenoszenie genów oporności z komórki bakteryjnej opornej, na komórki bakteryjne wrażliwe w procesach transformacji, transdukcji oraz koniugacji to kolejny mechanizm nabywania przez bakterie oporności. Transformacja polega na przejęciu materiału genetycznego ze środowiska zewnętrznego przez bakterię, najczęściej z pozostałości po martwej bakterii. Koniugacja zachodzi w trakcie kontaktu bakterii i przekazaniu sobie DNA w postaci plazmidu. Do transdukcji natomiast przyczyniają się bakteriofagi, które przenoszą DNA między bakteriami najczęściej tego samego rodzaju. Główną rolę w przenoszeniu genów oporności między bakteriami odgrywają wspomniane już plazmidy, często także transpozony oraz integrony rozmieszczone zarówno na plazmidach jak i w chromosomach, dla których charakterystyczną cechą jest zdolność dodawania i usuwania kodujących sekwencji z ruchomej kasety [9, 10, 11, 26, 29]. Enzymatyczna inaktywacja antybiotyku przez enzymy produkowane przez bakterie oporne to kolejny bardzo niebezpieczny mechanizm antybiotykoodporności. Najszerzej poznanymi (ze względu na częstość używania antybiotyków β-laktamowych) enzymami są β-laktamazy. Ich mechanizm działania polega na niszczeniu aktywności antybiotyku poprzez hydrolizowanie wiązania między węglem a azotem (C-N), który jest zlokalizowany w pierścieniu β-laktamowym antybiotyków z tej grupy (np. penicyliny, karbapenemy, cefalosporyny). Przykładem bakterii posiadającej takie właściwości jest Pseudomonas aeruginosa, czyli pałeczka ropy błękitnej [14, 26, 29]. 4. Możliwości postępowania w terapiach chorób z udziałem bakterii opornych na działanie antybiotyków Jedną ze strategii postępowania z antybiotykoopornością bakterii jest poszukiwanie nowych antybiotyków, mających wykazywać niszczące działanie na oporne szczepy. Często antybiotyki z grupy β-laktamów łączy się w preparatach z kwasem klawulanowym, sulbaktamem, czy też 21 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Joanna Sikora, Emilia Siemińska tazobaktamem, które mają spełniać rolę ochronną, poprzez umiejętność hamowania produkcji enzymów – β-laktamaz [17, 26]. Cekropiny oraz sapecyny należą do polipeptydów kationowych pozyskiwanych z owadów. Stwarzają one także możliwość alternatywnego wykorzystania ich w terapii chorób bakteryjnych. Ich dodatkowym atutem jest absolutny brak oddziaływania na organizm człowieka jak i zwierzęcia, przez co nie wywołują skutków ubocznych [23]. W związku z coraz szerzej występującym zjawiskiem antybiotykoodporności podejmuje się także wdrożenie alternatywy dla antybiotyków w postaci terapii przy pomocy bakteriofagów. Fagi działają wybiórczo na konkretne gatunki bakterii, nie uszkadzając naturalnej flory bakterii potrzebnych organizmowi (np. bakterie jelitowe). Między bakteriami, a fagami nie obserwuje się oporności krzyżowej, dzięki czemu w przypadku oporności na fagi dodatkowo można zastosować antybiotyk, ponieważ wytworzenie mechanizmu obronnego bakterii równocześnie na faga i antybiotyk jest niskie. Możliwe jest także wytworzenie superbakteriofaga, charakteryzującego się zdolnością do niszczenia jednocześnie przynajmniej kilku szczepów lub gatunków bakterii. Jednak jak każda metoda i ta posiada swoje ograniczenia do których zalicza się m.in. ewentualną replikacje fagów w leczonym organizmie i możliwość negatywnego oddziaływania na komórki zainfekowane bakteryjnie np. szczepienia mogą nie przynosić efektu uodparniającego [4, 18, 19, 20, 21, 22]. 5. Podsumowanie Antybiotyki często określane mianem „cudownych leków” są substancjami chemicznymi, które zabijają lub hamują wzrost bakterii poprzez, zahamowanie syntezy ścian komórkowych bakterii, lub hamowanie produkcji białek, RNA czy DNA. Po odkryciu przez Fleminga penicyliny i jej dobroczynnych właściwości w początkowym okresie wydawało się, że już niewielkie jej dawki są w stanie zwalczyć infekcje bakteryjne, jednak w miarę upływu czasu efekty nie były już tak spektakularne. Wtedy już, był to jeden z pierwszych przykładów antybiotykoodporności jako reakcji obronnej bakterii na działanie penicyliny, jako leku podawanego do organizmu w celu zwalczenia infekcji. To ważne spostrzeżenie ze względu na fakt, że zjawisko nabywania oporności jest procesem w pełni naturalnym i tak jak w przypadku penicyliny, produkowanej głównie przez grzyby w celu ochrony przed bakteriami nie powinno wzbudzać większego zdziwienia, a raczej być przedmiotem badań nad uczynieniem oporności łatwiejszej do kontrolowania [27, 28]. 22 Antybiotykooporność – poważny problem dzisiejszej cywilizacji Niestety w głównej mierze to właśnie człowiek przyczynił się do powstania zjawiska antybiotykoodporności, bez umiejętności pełnej jej kontroli, poprzez nadużywanie tych leków w różnych sektorach zarówno medycznym pacjent-lekarz, jak i w sektorze rolnym. Przykładów można by wymieniać wiele np. intuicyjne podparte na doświadczeniu lekarza przepisywanie antybiotyku, bez wykonania antybiogramu, nawet jeśli objawy występujące u chorego są efektem działania wirusów. Kolejnym przykładem jest odstawienie przez pacjentów leku niedługo po ustąpieniu objawów choroby takich jak gorączka lub też zbyt niskie stężenie stosowanego medykamentu (niemożliwe jest osiągnięcie stężenia terapeutycznego leku) co utrudnia pozbycie się bakterii i wytwarza u nich oporność. W sektorze rolniczym natomiast największym problem jest nadużywanie antybiotyków nie tyle w celu terapeutycznym, ale co przerażające, aż 80% jest wykorzystywana w celu profilaktycznym. Podawanie antybiotyków zwierzętom hodowlanym powoduje ich szybki wzrost i osiągnięcie znacznie większej masy, co z kolei przekłada się na zwiększoną produkcje mięsa, a co za tym idzie – wyższe dochody [30, 31, 32]. W walce z opornością bakterii na antybiotyk w celu zapobiegnięcia powstania „superbakterii”, wymagane są działania w skali globalnej. Mowa tu o racjonalnym gospodarowaniu antybiotykami, to znaczy używaniu ich jako substancji leczniczych w terapii ludzi i zwierząt, zminimalizowanie ich użycia w sektorze rolniczym i całkowite wykluczenie ich używania jako dodatku do pasz w celu np. przyspieszonego wzrostu masy ciała zwierząt. Już te zabiegi znacząco zminimalizowałyby szerzenie się oporności bakterii na antybiotyki co mogłoby zaowocować lepszym zdrowiem oraz wyeliminowaniem zagrożenia jakim może stać się wyczerpanie możliwości leczenia chorób o podłożu bakteryjnym [30]. W związku z nadużywaniem stosowania antybiotyków, zrodziła się potrzeba promowania wiedzy na temat tych leków. Pierwszy na świecie Światowy Tydzień Wiedzy o Antybiotykach, organizowany przez WHO, odbył się między 16, a 22 listopada 2015 roku. Walka z antybiotykoopornością jest priorytetowym zagadnieniem dla m.in. Światowej Organizacji Zdrowia, Komisji Europejskiej, FDA, czy też dla Parlamentu Europejskiego. 23 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Joanna Sikora, Emilia Siemińska Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Angulo F. J., Nunnerz. A., Bair H. D. Ł., Antimicrobial resistance in zoonotic enteric pathogens, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epis. 23 (2004), 485-496 WHO,Containing of antimicrobial resistance: review of literature and report of a WHO workshop on the development of a global strategy for the containment of antimicrobial resistance, 4-5 February 1999, Geneva, WHO Geneva, pp. 1-34 Tacconelli E., De Angelis G., Cataldo M.A., Pozzi E., Cauda R., Does antibiotic exposure increase the risk of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) isolation? A systematic review and meta-analysis. J. Antimicrob. Chemother. 61 (2008), 26-38 Srinivasan A., Dick J. D., Perl T. M., Vancomycin resistance of staphylococci, Clin. Mirobiol. Rev. 15, (2002), 430-438 Barza M., Trawers K., Excess infections due to antimicrobial resistance to attributable infections, Clin. Infect. Dis. 34, (2002), 5126-5130 Denamur E., Matic I., Evolution of mutation rates in bacteria, Mol. Microbiol. 60, (2006), 820-827 Albrich W. C., Monnet D. L., Harbarth S., Antibiotic selection pressure and resistance in Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes, Emerg. Infect. Dis. 10, (2004), 514-517 Szczypta K., AntybiotykoopornośćStreptococcuspyogenes, Diagnostyka laboratoryjna, Laboratorium 3-4, (2015), 35-3 Martínez J. L., Antibiotics and antibiotic resistance genes in natural environments, Science131, (2008), 365-367 Tsubokura M., Matsumoto A., Otsuki K., Animas S. B., Sanekata T., Drug resistance and conjugative R plasmids in Escherichia coli strains isolated from migratory waterfowl, J. Wildlife Dis. 31, (1995), 352-357 Alekshun M., Levy S. B., Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance, Cell128, (2007), 1037-1050 Mathew A. G., Cissell R., Liamthong S., Antibiotic resistance in bacteria associated with food animals: a United States perspective of livestock production, Foodborne Pathog. Dis. 4, (2007), 115-133 Damborg P., Top J., Hendrickx A. P., Dawson S., Willems R. J., Guardabassi L., Dogs are a reservoir of ampicillin-resistant Enterococcus faecium lineages associated with human infections, Appl. Environ. Microbiol. 75, (2009), 23602365 Savjani J. K., Gajjar A. K., Savjan, K. T., Mechanisms of resistance: useful tool to design antibacterial agents for drug – resistant bacteria, MiniRevews. Med. Chemistry 9, (2009), 194-205 Bruin de M. A., Riley L. W., Does vancomycin prescribing intevention affect vancomycinresistant enterococcus infection and colonization in hospitals? A systematic review, BMC Infect. Dis. 10, (2007), 7-24 Li X., Nikadio H., Efflux-mediated drug resistance in bacteria: an update, Drug 69, (2009), 1555-1623 24 Antybiotykooporność – poważny problem dzisiejszej cywilizacji 17. Singh G., Kapoor I. P., Pandey S. K., Singh U. K., Singh R. K., Studies on essential oils: part 10; Antibacterial activity of volatile oils of some spices, Phytother. Res. 16, (2002), 680-682 18. Cao J., Sun Y., Berglindh T., Mellgard B., Li Z, Mardh B., Mardh S., Helicobacter pyloriantigen- binding fragments expressed on the filamentous M13 phage bacterial growth, Biochem.Biophys. Acta 1474, (2000), 107-113 19. Carlton M., Phage therapy: past history and present prospects, Arch. Immunol. Ther. Exp.47, (1999), 267-274 20. Boyd E. F., Davis B. M., Hochhut B., Bacteriophage – bacteriophage interactions in the evolution of pathogenic bacteria, Trends Microbiol. 9, (2001), 137-144 21. Mathur M. D., Vidhani S., Mehndiratta P. L., Bacteriophage therapy: an alternative to conventional antibiotics, J. Ass. Physicians 51, (2003), 593-596 22. Weber-Dąbrowska M., Mulczyk M., Górski A., Bacteriphage therapy of bacterial infections: an update of our Institute‘s experiments, Arch. Immunol. Ther. Exp. 48, (2000), 547-551 23. Gliński Z., Kostro K., Chełmiński M., Polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe owadów alternatywą w leczeniu zakażeń zwierząt, ludzi i roślin, Życie Wet. 81, (2006), 31-35 24. Rzepkowska A., Zielińska D., Kołożyn-Krajewska D., Antybiotykooporność bakterii z rodzaju Lactobacillus pochodzących z żywności, jako kryterium stawiane probiotykom, Zeszyty problemowe postępów nauk rolniczych 578, (2014), 99-110 25. WHO, Antimicrobial resistance: global report on surveillance, WHO Library Cataloguingin-Publication Data, (2014), 1-256 26. Wolska K., Kot B., Piechota M., Frankowska A., Oporność Pseudomonasaeruginosa na antybiotyki, Post.Hig. Med. Dośw.; 67, (2013), 1300-1311 27. Purdom G., Antibiotic Resistance of Bacteria: An example of Evolution in Action?,Answers, 2:3, (2007), 74-76 28. Todar K., Bacterial Resistance to Antibiotics, Lectures in Microbiology, 2009 29. Marciniak P., Oporność bakterii na antybiotyki, Gazeta farmaceutyczna. 12, (2008), 30-32 30. Hryniewicz W., Grzesiowski P., Narodowy Program Ochrony Antybiotyków w Polsce, Chrońmy antybiotyki, 2005 31. Khachatourians G. G., Agricultural use of antibiotics and the evolution and transfer of antibiotic-resistant bacteria, Canadian MedicalAssociation. 159, (1998), 1129-1136 32. Wise R., Hart T., Cars O., Streulens M., Helmuth R., Huovinen P., Sprenger M., Antimicrobial resistance is a major threat to public health, 317, (1998), 609-610 25 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Joanna Sikora, Emilia Siemińska Antybiotykooporność – poważny problem dzisiejszej cywilizacji Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) poziom antybiotykooporności zarówno w Państwach Unii Europejskiej jak i poza nią jest ogromnym problemem zdrowotnym społeczeństwa i dotyczy coraz to większej liczby osób. Antybiotykooporność stanowi bardzo poważne zagrożenie zdrowotne na całym świecie – zwłaszcza oporność na tak zwane antybiotyki ostatniej szansy. Tworzenie nowych antybiotyków jest procesem długotrwałym i pracochłonnym. Przy obecnym nadużywaniu ich, może okazać się, że leczenie najprostszych zakażeń krwi, skóry czy dróg oddechowych będzie nieskuteczne, a infekcje te staną się śmiertelne. Istotnym krokiem w walce z drobnoustrojami jest zarówno uświadomienie społeczeństwa o zagrożeniach płynących z nadużywania antybiotyków, jak i poznanie mechanizmów rozwoju oporności przez bakterie i opracowanie skutecznych strategii w walce z nimi. Antibiotic resistance – a serious problem of modern civilization According to the World Health Organization (WHO) the level of antibiotic resistance in European Union Countries and beyond is a huge health problem of a population and affects more and more people. Antibiotic resistance is a serious risk for health for whole world – especially resistance to antibiotics known as antibiotics of last resort. Creation of new antibiotics is a process that takes time and is very laborious. With the current situation of abusing the antibiotics it may occur that the simplest treatment of blood infections, skin or respiratory system is ineffective, and the infections become fatal. A very important step in the fight against microorganisms is both educate the public about the danger of overuse of antibiotics, as well as understand the mechanisms of the development of resistance by bacteria and develop effective strategies to combat them. 26 Joanna Woźniak1, Natalia Dereń2, Edyta Simińska3 Mechanizmy wnikania koronawirusów do komórek gospodarza 1. Wstęp Koronawirusy (ang. Coronaviruses, CoVs) należą do wirusów RNA. Pochodzą z podrodziny Coronavirinae, a wraz z Torovirinae należą do dużej rodziny Coronaviridae, rzędu Nidovirales. Podrodzina Coronavirinae została podzielona na podstawie cech genetycznych na różnerodzaje: alfa-, beta- gamma, a także delta-koronawirusy, przy czym do gatunków zakażających ludzkie organizmy należą alfa- i beta-koronawirusy [1]. Koronawirusy należą do jednych z największych wirusów RNA pod względem długości genomu oraz wielkości wirionu. Jego wielkość waha się od 80 do 120nm. Wirusowe RNA od strony końca 5’zajmuje gen kodujący 4-5 białek strukturalnych, 15-16 niestrukturalnychoraz 1-8 białek dodatkowych [2]. Wielkość genomu koronawirusów waha od 26,2 do 31,7 kb oraz zawiera od 6 do 10 otwartych ramek odczytu (ang. open readingframe, ORF). Pierwsza ORF (ORF1a / b) koduje białka replikazy i zawiera w przybliżeniu 2/3 genomu CoV. Pozostała 1/3 zawiera cztery geny białek strukturalnych: białko S (białko odpowiedzialne za interakcję z receptorem na powierzchni komórek, tzw. „Spike”), białko E (białko otoczki), białko M (białko błonowe, zwane również białkiem macierzy) oraz białko N (białko nukleokapsydu). Białka M i E są odpowiedzialne za składanie wirusa, podczas gdy białko S pozwala na wniknięcie wirusa do komórki gospodarza, tym samym pełniąc kluczową rolę z punktu widzenia niniejszej publikacji.Ostatnie białko – N – jest odpowiedzialne za modyfikację procesów komórkowych oraz bierze udział w replikacji kapsydu wirusowego RNA. Ponadto, niektóre z koronawirusówmogą także zawierać w genomie kodowane dodatkowe białka, HE (hemaglutynina-esteraza), a więc białka wirusowe, któresą znane jako białka odpowiedzialne za interakcję wirusów z komórką gospodarza [3]. Celem niniejszej pracy jest 1 [email protected], Zakład Genoterapii, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, wydział lekarski 2 [email protected], Katedra Położnictwa, Zakład Medycyny Rozrodu i Andrologii,Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, wydział nauk o zdrowiu 3 [email protected], Katedra i Zakład Toksykologii, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, wydział farmaceutyczny 27 Joanna Woźniak, Natalia Dereń, Edyta Simińska przedstawienie mechanizmów wnikania koronawirusów przez błonę komórkową gospodarza. 2. Ludzkie koronawirusy – charakterystyka ogólna Koronawirusy są w stanie zainfekować wiele różnych gatunków ptaków i ssaków. Infekcje CoVsdotyczą zwłaszcza układu oddechowego i pokarmowego wśród ssaków i ptaków. W niewielu przypadkach omawiane wirusy są przyczyną zapalenia wątroby i różnych chorób neurologicznych [4]. Podczas, gdy pierwsze wzmianki o koronawirusach sięgają 1930 roku [5], zyskały one sławę w 2003 roku jakoprzyczyna zespołu ostrej ciężkiej niewydolności oddechowej (ang. severe acute respiratory syndrome, SARS) [6]. Wirus wywołujący SARS, SARS-CoVto ludzki koronawirus o pojedynczej dodatniej nici RNA, o genomie wielkości 27-31kb i ogonem poli-A na końcu 3'. W latach 2002-2003 SARSCoV spowodował prawie 8000 zakażeń, a wskaźnik śmiertelności wyniósł aż 10% [7]. Wysoce niebezpieczny jest także koronawirusMERS (ang. middleeast respiratory syndrome – CoronaVirus, MERS-CoV), który został po raz pierwszy zidentyfikowany w Arabii Saudyjskiej w 2012 roku. Najnowsze doniesienia Światowej Organizacji Zdrowia (ang. World Health Organization, WHO) z 4 grudnia 2015 roku podają że dotychczas odnotowano 1621 laboratoryjne potwierdzonych przypadków zakażenia wirusem MERS, o śmiertelności wynoszącej blisko36%. Było to odpowiednio 584 zgonów związanych z MERS-CoV [8]. Dlatego też badania nad koronawirusamimogą mieć istotny wpływ nie tylko na wskaźniki zdrowotne, ale także ekonomiczne. 2.1. Białko S jako główny czynnik odpowiedzialny za wnikanie koronawirusa przez błonę komórki Białko S odgrywa niezwykle istotną rolę w procesie wnikania koronawirusa do komórki gospodarza, ponieważ wchodzi w interakcje z białkami gospodarza na błonie komórkowej. Dochodzi następnie do wnikania wirusowego nukleokapsydu, co spowodowane jest konformacją białka S [9]. Białko S to białko transmembranoweklasy I o typowym rozmiarze w zakresie od 1160 do 1400 aminokwasów. Zawiera on 21-35 miejsc N-glikozylacji. Białka S koronawirusów mają tendencję do wiązania się wtrimery na powierzchni wirionu. To właśnie z tego powodu koronawirusy zyskały nazwę rodziny. Przedrostek „korona” (łac. corona), nawiązuje do ich charakterystycznego wyglądu pod mikroskopem elektronowym [10]. Jako jedno z białek klasy I, białko S składa się z trzech segmentów: zewnętrznego, transmembranowego i krótkiego ogona wewnątrzkomórkowego 28 Mechanizmy wnikania koronawirusów do komórek gospodarza [11]. Segment zewnętrzny białka S zawiera 2 domeny: S1 (N-końcowa), która jest odpowiedzialna za wiązanie z receptorem, a następnie wnikanie przez błonę komórkową, a także S2 (C-końcową), stanowiącą najbardziej konserwatywny region białka S. Podjednostka S2 składa się z domen uczestniczących w fuzji błon: peptydu fuzyjnego (ang. fusion peptide, FP), hydrofobowych domen-1 i -2 (ang. heptadrepeat domains HR1, HR2) i domeny transbłonowej (ang. transmembrane domain, TM) [10]. Powszechnie domeny białka S pozostają połączone w przypadku alfa- i większości z betakoronawirusów. Jednakże w przypadku gamma-, a także w u niektórych betakoronawirusach białko S jest przecinane pomiędzy tymi domenami. Domena S1 składa się z dwóch niezależnych subdomen: N-końcowej (S1NTD) oraz C-końcowej (S1-CTD). Obie posiadają zdolność wiązania cząsteczek, takich jak cukry lub domeny wiążące receptory (ang. receptor binding domains, RBD) [9]. Casaisi wsp. wykazali znaczenie białka S w przypadku tropizmu komórkowego. Postanowili użyć rekombinowanego wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli, szczep Beaudette, (ang. infectious bronchitis virus, IBV), członka rodzinyCoronaviridae, który replikuje się głównie w drogach oddechowych, a także w komórkach nabłonkowych nerek. Typowa dla szczepów IBV jest infekcja tylko komórek zarodków kurzych. Postanowili więc wyprodukować rekombinowaną wersję wirusa,rIBV, w którym zastąpili białko S szczepu Beaudette na odpowiadający mu gen kodujący białko S ze szczepu IBV M41-CK. Szczep IBV Beaudette jest w stanie rozmnażać się w komórkach CK, CEF, BHK-21, a także w Vero. W przeciwieństwie do IBV Beaudette, IBV M41-CK może rozmnażać tylko w komórkach CK. Różnice te dały możliwość badania mechanizmu tropizmu komórkowego. W rezultacie, otrzymany BeauR-M41 posiadał taki sam tropizm komórkowy jaki występował w przypadku IBV M41-CK. To doświadczenie wykazało, że białka S są z pewnością odpowiedzialne za tropizm komórkowy [12]. 2.2. Białko N jako cząsteczka wirulencji Białko nukleokapsydu jest białkiem wiążącym RNA, które wchodzi w interakcję z białkiem M podczas składania wirionów. Jest także zaangażowanew tworzeniu kapsydu wirusa i odgrywa ważną rolę w replikacji [13]. Białko N wiąże się przede wszystkim zarówno z mRNA genomowym i subgenomowym oraz z mikrotubulami. Ponadto białko N wykazuje aktywność L RNazy, będąc antagonistą interferonu typu I (IFN) [14]. Białko nukleokapsydu składa się z dwóch domen: N-końcowej (N-NTD) oraz C-końcowej (N-CTD). Posiada również 3 konserwatywne regiony (I, II, III), które są odłączane w regionach A i B. Region II jest odpowiedzialny za wiązanie RNA, natomiast region III odgrywa ważną 29 Joanna Woźniak, Natalia Dereń, Edyta Simińska rolę w wiązaniu białka M [13]. Domenę NTD rozpoczyna konserwatywny region I, natomiast zakończona jest regionem II. Natomiast domena CTD znajduje się wewnątrz konserwatywnego regionu II i kończy się tuż przed obszarem B [15]. Cowely i wsp. postanowili zbadać rolę białka N w chorobie wywołanej przez wirus zapalenia wątroby u myszy (ang. Mouse hepatitis virus,MHV) wśród szczepów A59 i JHS. Badania były oparte na fakcie, że prawie 95% sekwencji aminokwasowych w białkach N tych szczepów jest identyczne. Badacze użyli dwóch chimerycznych wirusów, między którymi dokonano wymiany białek nukleokapsydu między szczepami A59 i JHS. W rezultacie nie zaobserwowano żadnych zmian morfologicznych w porównaniu ze szczepem dzikim. Jednakże zaobserwowano istotne zmiany dotyczące wirulencji, ponieważ zauważono istotne statystycznie różnicepodczas replikacji wirusów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Co ciekawe,znacznie większą ekspresję antygenu w mózgu zauważono w przypadku, gdy zastosowano chimerę A59 z białkiem N pochodzącym ze szczepu JHS [16]. 2.3. Receptory koronawirusów Pierwszym etapem infekcji komórki gospodarza jest rozpoznanie receptora przez wirus. Jak opisano powyżej, białko S jest odpowiedzialne za wiązanie do swoistego receptora na powierzchni komórki, a następnie fuzjędo komórki gospodarza [10, 17]. W kolejnym ważnym etapie infekcji biorą udział RBD oraz receptory. Koronawirusy są zdolne do wiązania wielu różnych receptorów. Inhibitory enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ang. angiotensin converting enzyme 2, ACE-2), to charakterystyczny receptor dla ludzkiego wirusa wywołującego SARS [18]. ACE-2 reguluje funkcje układu sercowo-naczyniowego [19, 20]. Kolejnym receptorem jest aminopeptydaza N (APN), znana również jako CD13.Jest to ektopeptydaza, której działanie zależne jest od cynku. W efekcie APN odpowiedzialna jest za odczepianie białek od N-końca peptydu. APN to białko transbłonowe typu II, z którym związane jest wiele funkcji, takich jak odczuwanie bólu, regulacja ciśnienia krwi, ale równieżangiogeneza, chemotaksja oraz adhezja komórek [21]. Do rozpoznawania APN zdolne są dwa CoVs: TGEV (ang. transmissible gastroenteritis virus), który infekuje komórki jelita cienkiego i dróg oddechowych, oraz PRCoV (ang. porcine respiratory CoronaVirus) [22]. Molekuła adhezji komórkowej antygenu karcynoembrionalnego 1, (ang. carcino embryonic antigen-related cell adhesion molecule 1, CEACAM1) jest cząsteczką adhezji komórkowej, która występuje na leukocytach, 30 Mechanizmy wnikania koronawirusów do komórek gospodarza nabłonka i śródbłonka. Jest ona odpowiedzialna za apoptozę, rozwój naczyń, a także indukcję odpowiedzi immunologicznej [23]. Dipeptydylopeptydaza-4 (DPP4), będąca egzoproteazą, odgrywa ważną rolę w procesach fizjologicznych poprzez usuwanie aminokwasów z N-końcaz wielu peptydów, w tym hormonów, neuropeptydów, chemokin i mitogennych czynników wzrostu [23]. Niektóre koronawirusy, na przykład atenuowany wirus zakaźnego zapalenia oskrzeli ptaków (ang. infectious bronchitis virus, IBV), wiążą cukry, które odgrywają istotną rolę w rozmaitych procesach biologicznych, takich jak interakcje międzykomórkowe czy w przypadku procesów związanych z regulacją układu odpornościowego [24]. Niestety powyższe przykłady nie potrafią odpowiedzieć na pytanie którekoronawirusy są w stanie rozpoznać jakie specyficzne receptory. Nie znaleziono dotychczas reguły dotyczącej sposobów rozpoznania swoistych receptorów. Podobne CoVs z tych samych rodzajów potrafią rozpoznawać różne receptory, np. MERS-CoV i SARS-CoV należą do beta-koronawirusów, ale ich S1CTDs wiążą odpowiednio DPP4 i ACE-2 [25, 26]. Z drugiej strony, niektóre CoVs z różnych rodzajów, są zdolne do rozpoznawania tego samego receptora, np NL63-CoV należy do alfakoronawirusów, natomiast SARS-CoV należy do beta-koronawirusów. Jednakże ich S1-CTDs wiążą ACE-2 [27]. 2.4. Mechanizmy wnikaniakoronawirusów do komórek gospodarza Po związaniu ze specyficznymi receptorami wirusy dochodzą do etapu fuzji z błoną gospodarza, aby następnie dostarczyć swój genom do komórki gospodarza. Istnieją dwie główne drogi infekcji. Pierwszy z nich, pH-niezależny, zachodzi w przypadku wirusów, otoczonych błoną lipidową, która zawiera białko fuzyjne. W tym mechanizmie dochodzi do tzw. fuzji otoczki lipidowej z błoną komórkową komórki docelowej, dzięki czemu wirus wnika do jej wnętrza. Jednakże, wiele koronawirusówwybieradrugi z mechanizmów – endocytozę – jako sposób na wniknięcie do komórki gospodarza. W tym procesie kluczowy etap odbywa się w endosomach, a cały proces uzależniony jest od niskiego pH. Równie istotne są reakcje redoks, a także aktywności proteolityczne, aby doszło do zmian w konformacji białek wirusowych, które w konsekwencji doprowadzą do fuzji osłonki wirusa i błony komórkowej gospodarza. Taki mechanizm umożliwia ścisłą kontrolę nad fuzją poprzez ochronę miejsca cięcia przed przedwczesną proteoliząumożliwiając efektywną reakcję dopiero po związaniu się z receptorem na komórkach docelowych [28]. 31 Joanna Woźniak, Natalia Dereń, Edyta Simińska Komórkowa endocytozamoże odbywać się zarówno na szlaku klatrynozależnym, kaweolozależnym, jak i również niezależnym od klatryny lub kaweoli. Wiele badań wykazało natomiast, że wirusy mogą wykorzystać więcej niż jedną drogę wejścia do komórki gospodarza [29]. 3. Podsumowanie Koronawirusy są jednymi z największych wirusów RNA, które wykształciły różne mechanizmy wnikania do komórek gospodarza. Najbardziej kluczową molekułą w tym procesie wydaje się być białko S. Niemniej istotne jest również białko N, stanowiące cząsteczkę, która odpowiada za wirulencję. Po rozpoznaniu swoistego receptora przez wirus następuje fuzja z błoną gospodarza, a następnie dostarczenie genomu wirusa do komórki gospodarza. Najczęściej odbywa się do na zasadzie endocytozy klatryno- lub kaweolozależnej, jak i również niezależnej od klatrynylub kaweoli. Poznanie szczegółowych mechanizmów wnikania koronawierusów do komórek gospodarza wydaje się kluczowe w celu projektowania przyszłych strategii skierowanymi przeciwko CoVs. Literatura 1. Hamre D., Procknow J. J., A new virus isolated from the human respiratorytract, Proc SocExpBiol Med., 121: (1966), s. 190-193 2. Perlman S., Netland J., Coronaviruses post-SARS: update on replication and pathogenesis, Nat Rev Microbiol 7: (2009), s. 439-450 3. Enjuanes L.,Almazan F., Sola I., Zuniga S., Biochemical aspects of coronavirus replication andvirus-host interaction, Annu. Rev. Microbiol, 60: (2006), s. 211-230. 4. Weiss S. R., Navas-Martin S., Coronavirus pathogenesis and the emerging pathogen severe acute respiratory syndrome coronavirus, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 69: (2005), s. 635-664 5. Hudson C. B., Beaudette F. R. Infection of the cloaca with the virus of infectious bronchitis, Science, 76:(1932), s. 34 6. Peiris J. S., Guan Y., Yuen K. Y., Severe acute respiratory syndrome, Nat Med., 10: (2004), s. 88-97 7. Ziebuhr J., Molecular biology of severe acute respiratory syndromecoronavirus, Curr. Opin. Microbiol., 7: (2004), s. 412-419 8. http://www.who.int/csr/don/4-december-2015-mers-saudi-arabia/en/ – (04.12.2015) 9. Belouzard S., MilletJ. K., LicitraB. N., Whittaker G. R., Mechanisms of Coronavirus Cell Entry Mediated by the Viral Spike Protein, Viruses 4: (2012), s.1011-1033 10. Bosch B. J.,Van der Zee R., de Haan C. A., Rottier P. J., The coronavirus spike protein is a class I virus fusion protein: Structural and functional characterization of the fusion core complex, J. Virol.,77: (2003), s. 8801-8811 32 Mechanizmy wnikania koronawirusów do komórek gospodarza 11. Li F., Berardi M., Li W. H., Farzan M., Dormitzer P. R., Harrison S. C.,Conformational states of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein ectodomain, J.Virol., 80: (2006), s. 6794-6800 12. Casais R., Dove B., Cavanagh D., Britton P., Recombinant Avian Infectious Bronchitis Virus Expressing a Heterologous Spike Gene Demonstrates that the Spike Protein Is a Determinant of Cell Tropism, J. Virol., : (2003), s. 9084-9089 13. Hurst K .R., Kuo L., Koetzner C .A., Ye R., Hsue B., Masters P. S., A major determinant for membrane protein interaction localizes to thecarboxyterminal domain of the mouse coronavirus nucleocapsid protein, J. Virol., 79: (2005), s. 13285-13297 14. Ye Y., Hauns K., Langland J. O., Jacobs B. L., Hogue B. G.,Mouse hepatitis coronavirus A59 nucleocapsid protein is a type I interferon antagonist, J. Virol., 81: (2007), s. 2554-2563 15. Saikatendu K. S., Joseph J. S., Subramanian V., Neuman B. W., Buchmeier M. J., Stevens R. C., Kuhn P., Ribonucleocapsid formation of severe acute respiratory syndrome coronavirus through molecular action of the N-terminal domain of N protein, J. Virol., 81:(2007), s. 3913-3921 16. Cowley T. J., Long S. Y., Weiss S. R, The Murine Coronavirus Nucleocapsid Gene Is a Determinant of Virulence, J. Virol., (2010), s. 1752-1763 17. Spaan W., Cavanagh D., Horzinek M. C., Coronaviruses: structure and genome expression, J. Virol., 69: (1988), s. 2939-2952 18. Towler P., Staker B., Prasad S. G., Menon S., Tang J., Parsons T., Ryan D., Fisher M., Williams D., Dales N. A., Patane M. A., Pantoliano M. W., ACE2 X-ray structures reveal a large hinge-bending motion important for inhibitor binding and catalysis, J. Biol. Chem., 279: (2004), s. 17996-18007 19. Keidar S., Kaplan M., Gamliel-Lazarovich A., ACE2 of the heart: from angiotensin I to angiotensin (1-7), Cardiovasc. Res., 73: (2007), s. 463-469 20. Boehm M., Nabel E. G., Angiotensin-converting enzyme 2–a new cardiac regulator, N. Engl., J. Med., 347: (2002), s. 1795-1797. 21. Mina-Osorio P.,The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target, Trends Mol. Med., 14: (2008), s. 361-371 22. Schultze B., Krempl C., Ballesteros M. L., Shaw L., Schauer R., Enjuanes L., Herrler G., Transmissible gastroenteritis coronavirus, but not the related porcine respiratory coronavirus, has a sialic acid (N-glycolylneuraminic acid) binding activity, J. Virol.,70: (1996), s. 5634-5637 23. Tan K., Zelus B .D., Meijers R., Liu J. H, Bergelson J. M, Duke N., Zhang R.,Joachimiak A., Holmes K. V., Wang J. H., Crystal structure of murine sCEACAM1a[1 ,4]: a coronavirus receptor in the CEA family, EMBO J., 21(9): (2002), s. 2076-2086 24. Ghazarian H., Idoni B., Oppenheimer S., A glycobiology review: Carbohydrates, lectins and implications in cancer therapeutics, ActaHistochemica, 113:(2011),s. 236-247 25. Raj V. S., Mou H., Smits S. L., Dekkers D. H., Müller M. A., Dijkman R., Muth D., Demmers J. A., Zaki A., Fouchier R. A., Thiel V., Drosten C., Rottier P. J., Osterhaus A. D., Bosch B. J., Haagmans B. L.,Dipeptidyl 33 Joanna Woźniak, Natalia Dereń, Edyta Simińska 26. 27. 28. 29. peptidase 4 is a functional receptor for the emerging human coronavirusEMC,Nature,14: (2013),s. 251-254 Mou H., Raj V. S., Van Kuppeveld F. J., Rottier P. J., Haagmans B. L., Bosch B. J., The receptor binding domain of the new Middle East respiratory syndrome coronavirus maps to a 231-residue region in the spike protein that efficiently elicits neutralizing antibodies, J.Virol.,87: (2013), s. 9379-9383 Lin H. X., Feng Y., Wong G., Wang L., Li B., Zhao X., Li Y., Smaill F., Zhang C.,Identification of residues in the receptor-binding domain (RBD) of the spike protein of human coronavirus NL63 that are critical for the RBDACE2 receptor interaction, J. Virol.,89: (2008), s. 1015-1024 Burkard C., Verheije M. H., Wicht O., Van Kasteren S. I., Van Kuppeveld F. J., Haagmans B. L., Pelkmans L., Rottier P. J., Bosch B. J., De HaanC. A.,Coronavirus cell entry occurs through the endo-/lysosomal pathway in a proteolysis-dependent manner,PLoSPathog.,6: (2014), s. 1004502 Wang H., Yang P., Liu K., Guo F., Zhang Y., Zhang G., Jiang C., SARS coronavirus entry into host cells through a novel clathrin- and caveolaeindependent endocytic pathway, Cell Res., 18: (2008), s. 290-301 Mechanizmy wnikania koronawirusów do komórek gospodarza Pierwsze doniesienia o koronawirusach sięgają lat 60’tych XIX wieku. Koronawirusy (ang. Coronaviruses, CoVs) należą do jednych z większych wirusów RNA pod względem wirionu oraz genomu, którego wielkość waha się od 80 do 120nm. Najbardziej znanym koronawirusem jest SARS-CoV, który na przełomielat 2002-2003 spowodował prawie 8 tysięcy zakażeń, ze wskaźnikiem śmiertelności blisko 10%. Kolejnym równie niebezpiecznym wirusem jest MERS, którym dotychczas zostało zarażone ponad 1,5 tysiąca osób ze wskaźnikiem śmiertelności o ok.36%. Białko S odgrywa niezwykle ważną rolę w procesie wnikania koronawirusa do komórki gospodarza. Infekcja wywoływana jest przez składowe wirusa, które wchodzą w interakcję z białkami gospodarza na błonie komórkowej. Dochodzi następnie do wiązania ze swoistym receptorem, a następnie do wnikania wirusowego nukleokapsydu. Zrozumienie mechanizmów rozpoznawania receptora przez CoVs wydaje się być kluczowe dla badań nad lekami skierowanymi przeciwko koronawirusom. Mechanisms of coronaviruses entry into host cells The first report of the coronavirus is from 1960. Coronaviruses (CoVs) are RNA viruses, whose size ranges from 80 to 120nm. The best known coronavirus is SARS-CoV, which infects in 20022003 almost 8,000 people, with a mortality rate up to 10%. Another dangerous virus is MERS, which has infected more than 1,500 people with a mortality rate of approximately 36%. The S protein plays an extremely important role in the fusion of the coronavirus into the host cell. The infection is caused by a virus components that interact with proteins of the host cell membrane. Subsequently it leads to bind with a specific receptor, and finally to the fusion of the viral nucleocapsid. Understanding the mechanisms of receptor recognition by CoVs seems to be essential for the studies about drugs directed against coronaviruses. 34 Maciej Gawroński1, Arkadiusz Goede2, Tomasz Wandtke-3 Wirusy onkolityczne jako potencjalna alternatywa w leczeniu nowotworów złośliwych 1. Wstęp Choroby nowotworowe stanowią obecnie jedno z największych zagrożeń dla zdrowia człowieka w wysoce rozwiniętych krajach Europy i w Stanach Zjednoczonych. Głównymi przyczynami takiego stanu rzeczy są: ciągle wydłużający się średni czas życia, zarówno wśród kobiet, jak i mężczyzn, postępujące zanieczyszczenie środowiska naturalnego substancjami o potencjale kancerogennym, zwiększona ekspozycja na promieniowanie jonizujące, dieta ubogo-resztkowa, bogata w tłuszcze nasycone i kancerogenne produkty powstające w wyniku termicznej obróbki pokarmu, jak również niepohamowane spożycie napojów alkoholowych, konsumpcja produktów tytoniowych (głownie papierosów, cygar, cygaretek, palenie fajki, zażywanie tabaki i żucie liści tytoniowych) i niewystarczająca aktywność fizyczna. Części z wymienionych powyżej czynników można oczywiście uniknąć prowadząc tzw. „zdrowy styl życia”, nie zmienia to jednak faktu, iż ekspozycja na kancerogeny środowiskowe i promieniowanie jonizujące z roku na rok jest coraz większa, a dłuższy średni czas życia, będący paradoksalnie rezultatem postępu w medycynie i naukach pokrewnych, sprzyja akumulacji mutacji somatycznych, a co za tym idzie przekłada się na zwiększoną częstotliwość zachorowań na nowotwory w wysoce rozwiniętych, zachodnich społeczeństwach [1]. Dlatego też profilaktyka i leczenie chorób nowotworowych są obecnie jednym z największych wyzwań, przed jakimi stoi współczesna medycyna. Szczególnie duży nacisk kładzie się na badania naukowe, których celem jest opracowanie nowych, bardzo często spersonalizowanych, technik terapeutycznych, które wykorzystując najnowsze zdobycze biologii mole1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Terapii Genowej, Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, http://www.cm.umk.pl 2 [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, http://www.cm.umk.pl 3 [email protected]; Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, http://www.cm.umk.pl 35 Maciej Gawroński, Arkadiusz Goede, Tomasz Wandtke kularnej, genetyki, biochemii, bioinformatyki, metabolomiki, czy też inżynierii tkankowej i genetycznej, stanowiłyby alternatywę dla obecnie stosowanych metod leczenia nowotworów złośliwych. Jest to niezwykle istotne, gdyż standardowe terapie bardzo często okazują się mało skuteczne, wykazują niską specyficzność względem komórek nowotworowych, a także generują szereg skutków ubocznych, do których możemy zaliczyć między innymi: indukowanie nowotworów wtórnych, bezpłodność, zaburzenia w funkcjonowaniu układu immunologicznego, a w konsekwencji częste zakażenia bakteryjne i wirusowe, zaburzenia w funkcjonowaniu narządów (np. nefropatia, niewydolność mięśnia sercowego), wymioty, utratę włosów. Wymienione wyżej skutki uboczne mogą być równie groźne dla życia i zdrowia pacjenta, co choroba nowotworowa, którą próbuje się wyleczyć. Co więcej, ich leczenie generuje dodatkowe koszty, co ma istotne znaczenie w skali systemów ochrony zdrowia danego kraju [2]. Nie dziwi zatem fakt, iż przy poszukiwaniu nowych metod walki z nowotworami, naukowcy sięgają po rozwiązania kontrowersyjne i nieszablonowe. Takim właśnie podejściem jest wykorzystanie tzw. wirusów onkolitycznych, które zostaną pokrótce omówione w niniejszej pracy. 2. Wirusy onkolityczne U podstaw idei wykorzystania wirusów jako narzędzia do niszczenia komórek nowotworowych leży ich ewolucyjnie nabyta zdolność do infekowania komórek eukariotycznych, namnażania się w nich, jak również zdolność do ich lizy, która umożliwia rozprzestrzenianie się cząsteczek wirusa w zainfekowanej tkance. Jednakże główną przeszkodą, jaka stała na drodze wykorzystania tych cech wirusów w celach terapeutycznych był fakt, iż wirusy infekują zarówno komórki zdrowe, jak i komórki zmienione nowotworowo, a zatem nie wykazują specyficzności lizy zainfekowanych komórek [3]. Rozwiązanie tego problemu nadeszło wraz z rozwojem technik inżynierii genetycznej, dzięki którym udało się poznać funkcję i sekwencję genów tworzących genom poszczególnych wirusów. Szczególnie istotnym, z punktu widzenia przyszłych zastosowań wirusów onkolitycznych, było poznanie molekularnych mechanizmów stojących za procesem ich replikacji w komórkach eukariotycznych, jak również mechanizmów warunkujących proces infekowania i lizy komórek. Dzięki genetycznym modyfikacjom poszczególnych genów stworzono pierwsze wirusy onkolityczne (OV, ang. oncolitic viruses), czyli takie, które mogą namnażać się jedynie w komórkach zmienionych nowotworowo [3, 4]. 36 Wirusy onkolityczne jako potencjalna alternatywa w leczeniu nowotworów złośliwych Takie właściwości omawianych cząsteczek można uzyskać na kilka sposobów. Pierwszym z nich jest usunięcie genów koniecznych do replikacji wirusa w prawidłowych komórkach. Zazwyczaj geny te odpowiedzialne są za inaktywację genów supresorowych, które hamują cykl komórkowy (np. gen p53, czy RB), lub warunkują syntezę substratów niezbędnych do replikacji wirusa. Modyfikacje genetyczne obejmujące usunięcie z genomu wyżej wymienionych genów skutkują tym, iż zmodyfikowany wirus zdolny jest do namnażania się jedynie w komórkach posiadających jakiś defekt genetyczny (np. brak aktywności białka p53 stwierdza się w większości komórek nowotworowych) [4, 5]. Drugim sposobem jest podmiana promotora genu wirusowego promotorem tkankowo specyficznym. W tym przypadku wirus jest zdolny do namnażania się tylko w komórkach tkanek, w których występują odpowiednie czynniki transkrypcyjne. Szczególną odmianą tej metody jest wykorzystanie promotorów, które ulegają aktywacji tylko i wyłącznie w komórkach charakteryzujących się odpowiednim stanem. Doskonałym przykładem takiej strategii jest wykorzystanie promotora dla czynnika drugiego indukowanego stanem hipoksji (HIF-2, ang. hipoxia inducible factor-2), dzięki któremu cząsteczki wirusa mogą replikować się tylko w komórkach niedotlenionych, a właśnie do takich należą komórki nowotworowe [4‚7]. Trzecia metoda opiera się na modyfikacji genów odpowiedzialnych za zdolność do infekowania komórek w taki sposób, by cząsteczki wirusa wykazywały znacznie większy tropizm do komórek nowotworowych, niż do komórek prawidłowych. Ma to szczególne znaczenie w przypadku wirusów, które mogą infekować komórki różnych tkanek, a chcemy je wykorzystać jedynie do niszczenia komórek nowotworowych wywodzących się z jednej z nich [8]. Wartym odnotowania jest także fakt, iż modyfikacje genetyczne wirusów onkolitycznych nie ograniczają się jedynie do genów odpowiedzialnych za infekcję, replikację i lizę komórek nowotworowych. Bardzo często do genomu wirusowego wprowadzane są tzw. „geny samobójcze”. Zazwyczaj są to geny kodujące enzymy, które standardowo nie występują w docelowej tkance. Posiadają one zdolność do enzymatycznego przekształcania bezpiecznych, nieaktywnych substancji, zwanych prolekami, do form cytotoksycznych. Dzięki tej modyfikacji komórki nowotworowe nabywają nową cechę, dzięki której po ogólnoustrojowym podaniu bezpiecznego proleku, efekt cytotoksyczny zostaje ograniczony jedynie do komórek zainfekowanych wirusem onkolitycznym. Takie podejście pozwala na uniknięcie ogólnoustrojowych skutków ubocznych, charakterystycznych dla standardowych terapii. Do najczęściej wykorzystywanych genów samobójczych należą: gen kinazy tymidynowej (TK, 37 Maciej Gawroński, Arkadiusz Goede, Tomasz Wandtke ang. thymidine kinase), deaminaza cytozyny (CDA, ang. cytosine deaminase), fosforybozylotransferaza uracylu (UPRT, ang. uracil phosphoribosyltransferase), fosforylaza nukleozydu purynowego (PNP, ang. purine nucleoside phosphorylase), czy też geny cytochromu p450 (np. CYP2B1 warunkujący przemiany cyklofosfamidu) [9‚12]. W ten sposób, dzięki modyfikacjom genetycznym otrzymuje się cząsteczki, które nie tylko w sposób selektywny infekują komórki nowotworowe, namnażają się w nich i doprowadzają do ich lizy, ale także uwrażliwiają zainfekowane komórki na standardowo stosowane chemioterapeutyki takie jak 5-fluorouracyl, cyklofosfamid, czy 2-fluoroadenina i gancyklowir. Co więcej, komórki nowotworowe po infekcji wirusem onkolitycznym zaczynają eksprymować na swojej powierzchni cząsteczki głównego układu zgodności tkankowej klasy I (MHC I, ang. major histocompatibility complex class I), przez co wracają pod nadzór układu immunologicznego – mogą zostać rozpoznane przez limfocyty cytotoksyczne CD8+ (Tc) i usunięte z organizmu [13]. Łatwość z jaką można manipulować genomem wirusowym sprawiła, iż badacze opracowali szereg wirusów onkolitycznych, które bazowały na wirusach różnego typu. Obecnie, do najczęściej stosowanych OV należą adenenowirusy, zmodyfikowane wirusy opryszczki, rabdowirusy, reowirusy, czy też wirus odry. W dalszej części pracy pokrótce omówione zostaną poszczególne wirusy onkolityczne, należące do wyżej wymienionych grup. 2.1. Adenowirusy Do najczęściej stosowanych wirusów onkolitycznych należą zmodyfikowane genetycznie adenowirusy. Są to relatywnie małe cząsteczki, o symetrii ikosaedralnej, zawierające podwójną nić DNA o długości około 36 tysięcy par zasad. Powstało wiele różnych modyfikacji adenowirusów, które pozwoliły na uzyskanie specyficzności względem komórek nowotworowych. Pierwszym przykładem jest wirus ONYX-015, występujący także pod nazwami dl1520 lub CI-1042, w którym dokonano delecji genu E1B. Produkt białkowy tego genu jest odpowiedzialny za inaktywację białka p53 w prawidłowych komórkach, dzięki czemu, podczas infekcji wirusowej cykl komórkowy nie zostaje zatrzymany, a sam wirus może replikować. Pozbawienie wirusa genu E1B sprawia, iż może on replikować jedynie w komórkach z nieaktywnym białkiem p53, a jak powszechnie wiadomo zaburzenia w funkcjonowaniu tego białka należą do jednych z najczęstszych defektów genetycznych, jakie znajduje się w komórkach nowotworowych. Badania kliniczne II fazy potwierdziły bezpieczeństwo stosowania tego wirusa w przypadku nowotworów głowy i szyi, w szczególności zauważono całkowitą remisję choroby u 10% chorych poddanych leczeniu, natomiast u 62% badanych udało się zahamować 38 Wirusy onkolityczne jako potencjalna alternatywa w leczeniu nowotworów złośliwych rozwój choroby [14]. Co więcej, wykazano efekt synergii w przypadku zastosowania terapii wirusowej w połączeniu z radioterapią. Połączenie to skutkowało znaczącym zmniejszeniem tkanki guzów litych w porównaniu do zastosowania pojedynczej terapii wirusem lub samej radioterapii [15]. Wykazano także podobną synergię dla połączenia terapii wirusowej z wykorzystaniem ONYX-015 i chemioterapii [16] Wyniki te sprawiły, iż obecnie ONYX-015 trafił do III fazy badań klinicznych w leczeniu nowotworów głowy i szyi. Jednakże wykorzystanie omawianego wyżej wirusa onkolitycznego, z racji wprowadzonych modyfikacji, zostało ograniczone do komórek z nieaktywnym białkiem p53, a co za tym idzie, nie może być on zastosowany do leczenia komórek nowotworowych z funkcjonującym p53, ale z zaburzeniami w funkcjonowaniu innych genów. Dlatego tez stworzono inne wirusy, które zostały pozbawione innego genu warunkującego replikację, mianowicie E1A, odpowiedzialnego za inaktywację białka RB. Ad5Delta24 jest takim wirusem, znalazł on zastosowanie w leczeniu glejaków, gdzie jego zastosowanie iv vivo skutkowało znaczącym zmniejszeniem masy guzów [17]. Natomiast w przypadku wirusa AxdAdB-3 dokonano delecji zarówno genu E1A, jak i E1B, co przełożyło się na jego wysoką skuteczność w leczeniu nowotworów posiadających mutacje zarówno w genie p53, jak i RB, takich jak rak woreczka żółciowego czy rak trzustki. Co więcej, taka modyfikacja skutkuje znacznym spadkiem toksyczności tego wirusa względem komórek prawidłowych, w porównaniu z wirusem ONYX-015 [18, 19]. W podobny sposób stworzono więcej wirusów zdolnych do namnażania się w komórkach z defektywnym RB np. wirusy Ar6pAE2fF i Ar6pAE2fE3F, m. in. z nieaktywnym promotorem dla E1A [20]. Innym przykładem zastosowania zmodyfikowanych adenowirusów są próby leczenia raka prostaty, który jest atrakcyjnym celem dla takiej terapii ze względu na łatwy dostęp do zmienionej nowotworowo tkanki, którą można nastrzyknąć roztworem zawierającym wysokie stężenie cząsteczek wirusa. Doskonałym przykładem takiego postępowania jest wirus CV787, w którym promotor dla genu E1B wymieniono na promotor specyficznego antygenu prostaty (PSA, ang. prostate specific antygen), natomiast promotor genu E1A został wymieniony na promotor PSRP (ang. prostatespecific rat probasin promoter). Dzięki tym modyfikacjom wirus może replikować jedynie w komórkach raka prostaty. Co więcej, terapia wirusowa z jego zastosowaniem wykazuje synergię z chemioterapią docetakselem i paklitakselem. W związku z tym wirus CV787 trafił do II fazy badań klinicznych leczenia nowotworu prostaty [21, 22]. Innymi przykładami użycia nowotworowo specyficznych promotorów jest adenowirus TRAD, w którym geny E1A i E1B podpięto pod gen 39 Maciej Gawroński, Arkadiusz Goede, Tomasz Wandtke ludzkiej telomerazy – enzymu, który jest aktywny w większości komórek nowotworowych. Podobne strategie wykorzystano w przypadku adenowirusów skierowanych przeciwko komórkom czerniaka, raka wątrobokomórkowego, raka piersi [7], czy raka jajnika opornego na chemioterapię (wektor Ad5/3MDR1E1) [23]. 2.2. Wirus opryszczki (Herpes Simplex Virus) HSV jest wirusem równie często stosowanym w terapii wirusowej, jak adenowirusy, przy czym posiada pewną przewagę ze względu na znacznie większy rozmiar cząsteczki dwuniciowego DNA (około 150 kpz), co sprawia, iż w większym stopniu można modyfikować jego genom. Główne modyfikacje tego wirusa polegają na wyeliminowaniu jego zdolności do namnażania się w komórkach prawidłowych. Obejmują one delecję genu dla reduktazy rybonukleotydów, genu kinazy tymidynowej, czy też czynnika wirulencji γ134.5. Reduktaza rybonukleotydów odgrywa kluczową rolę w syntezie deoksyrybonukleotydów, koniecznych do syntezy DNA – jej wysoki poziom jest charakterystyczny dla komórek szybko proliferujących, jest jej zaś mniej w komórkach w stanie spoczynku. Usunięcie genu UL39 kodującego dużą podjednostkę reduktazy rybonukleotydów powoduje, iż tak zmodyfikowany wirus może replikować jedynie w komórkach dzielących się, a do takich należą komórki nowotworowe. Brak genu kinazy tymidynowej uzależnia replikację wirusa od obecności tego enzymu w genomie infekowanej komórki, a obecność ta jest również charakterystyczna dla komórek dzielących się. Te cechy, w połączeniu z naturalnym neurotropizmem sprawiły, iż tak zmodyfikowane wirusy znalazły zastosowanie w próbach leczenia nowotworów mózgu, gdyż prawidłowe neurony, jako komórki niedzielące się, są oszczędzane przez tak zaprojektowane OV, natomiast komórki zmienione nowotworowo, dzielące się, ulegają zniszczeniu [24‚27]. Stworzono także szereg wirusów zawierających w swojej budowie geny, których celem, oprócz lizy komórek nowotworowych, była stymulacja układu immunologicznego. Zawierały one m.in. gen dla czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) [28], geny interleukiny 2 i 12 [29, 30] – efektem działania tych cytokin jest wywołanie polaryzacji immunologicznej w stronę odpowiedzi komórkowej, kluczowej z punktu widzenia terapii antynowotworowej. Ciekawym przykładem ogromnych modyfikacji, jakich można dokonać w wirusie opryszczki jest wirus rRp450. Posiada on delecję genu UL39, jak również szczurzy gen cytochromu P450, dzięki czemu jest on zdolny do enzymatycznej aktywacji cyklofosfamidu do formy cytotoksycznej, co przekłada się na uwrażliwienie komórek na ten lek i lepszy efekt terapeutyczny [31]. Co więcej, w tym przypadku wirus posiada gen kinazy 40 Wirusy onkolityczne jako potencjalna alternatywa w leczeniu nowotworów złośliwych tymidynowej, przez co zainfekowane komórki są również uwrażliwione na gancyklowir. Warto także zaznaczyć, iż podanie gancyklowiru i jego aktywacja w zainfekowanych komórkach skutkuje ich apoptozą, a co za tym idzie hamuje replikacje wirusa. Zatem podanie gancyklowiru można uważać za tzw. ”hamulec bezpieczeństwa” w razie niekontrolowanego rozprzestrzeniania się wirusa w organizmie, a także poprzez jego podanie uzyskuje się silną synergię działania z cyklofosfamidem, jak i samym działaniem litycznym wirusa [32]. Wykazano skuteczność terapii wirusowej z wykorzystaniem rRp450 w próbach leczenia raka okrężnicy i wątroby [33, 34]. 2.3. Reowirusy Wirusy te są od niedawna w polu zainteresowania terapii onkolitycznej, gdyż swoje właściwości lityczne wykazują jedynie w komórkach z nadaktywnym białkiem Ras, odpowiedzialnym za przekazywanie sygnałów z receptorów na powierzchni komórek (np. EGFR, receptor dla naskórkowego czynnika wzrostu, ang. epidermal growth factor receptor) do jądra komórkowego [35]. W komórkach prawidłowych dwuniciowy RNA, który stanowi materiał genetyczny reowirusów, aktywuje kinazę PKR, która w efekcie blokuje czynnik eIF2α (ang. eukaryotic initiation factor 2α), konieczny do replikacji wirusa. Jednakże w komórkach z nadekspresją Ras, aktywność omawianej wyżej kinazy jest zahamowana, a co za tym idzie możliwe jest wejście wirusa w fazę lityczną. Zastosowanie reowirusów wydaje się bardzo atrakcyjne, gdyż około 30% nowotworów posiada nadaktywność białka Ras, a także zaburzenia w funkcjonowaniu układu EGF/EGFR [36]. Wykazano onkolityczną aktywność reowirusów w przypadku modelu nowotworu pęcherza moczowego. Co więcej, wirusy te trafiły do badań klinicznych I fazy (glejaki) [37] i II fazy (przerzuty mięsaków tkanek miękkich do płuc) [38]. Podejmuje się także próby ich wykorzystania w leczeniu raka jajnika, jelita grubego, czerniaków, czy medulloblastomy [39, 40, 41]. 3. Podsumowanie Wirusy onkolityczne to potężne i wysoce wyrafinowane narzędzie do walki z nowotworami. Dzięki dogłębnemu poznaniu genomów wirusowych i zrozumieniu molekularnych mechanizmów, jakie stoją za procesami replikacji poszczególnych wirusów, możliwym stało się modyfikowanie ich genów w taki sposób, by uzyskać niezwykle specyficzne cząsteczki, zdolne do selektywnego niszczenia komórek nowotworowych. Ich główną zaletą jest fakt, iż w przeciwieństwie do standardowych strategii terapeutycznych, 41 Maciej Gawroński, Arkadiusz Goede, Tomasz Wandtke generują znacznie mniejsze skutki uboczne, a w połączeniu z wspomnianymi strategiami wykazują efekt synergii, co znacząco podnosi skuteczność leczenia. Ich wykorzystanie jest także relatywnie tanią metodą, gdyż o ile same badania prowadzące do stworzenia wirusa onkolitycznego są bardzo kosztowne, o tyle jego późniejsza synteza generuje niewielkie koszty. Warto także nadmienić, iż zastosowanie wirusów onkolitycznych jest metodą bezpieczną, gdyż ich aktywność ogranicza się do komórek nowotworowych. Co więcej w przypadku nadmiernego rozprzestrzenienia się w organizmie, cząsteczki wirusów są naturalnie usuwane przez komórki układu immunologicznego. Ponadto w razie konieczności możliwym jest podanie pacjentowi leków anty-wirusowych, które zapobiegną ich nadmiernemu rozprzestrzenianiu się. Z drugiej strony aktywność układu immunologicznego pełni rolę „obosiecznego miecza’ i może zmniejszać aktywność omawianych cząsteczek. Dlatego też duża część z obecnie prowadzonych badań skupia się na polepszeniu specyficzności wirusów onkolitycznych, obniżeniu ich immunogenności, jeszcze większej poprawie bezpieczeństwa stosowania, wzmocnieniu efektu onkolitycznego, jak również na wprowadzaniu dodatkowych modyfikacji, zwiększających ich potencjał terapeutyczny. Warto także nadmienić, iż wiele z omawianych w niniejszej pracy wirusów trafiło do II, a nawet do III fazy badań klinicznych, tak więc wydaje się, iż w niedalekiej przyszłości mogą one stać się uzupełnieniem rutynowego postępowania terapeutycznego w leczeniu nowotworów złośliwych, a w dalszej perspektywie być może zastąpić standardowo stosowane strategie leczenia. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Kułakowski A., Skowrońska-Gardas A., Onkologia Podręcznik dla studentów medycyny, Wydawnictwo Lekarskie PZWL., (2003),s. 10-150 Meder J., Podstawy onkologii klinicznej, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego., (2011), s. 5-260 He S., Li P., Chen C. H., Bakst R. L., Chernichenko N., Yu Y.A, et al. Effective oncolytic vaccinia therapy for human sarcomas, Journal of Surgical Research., 2 (2012), s.53-60 Wong H. H., Lemoine N. R., Wang Y., Oncolytic viruses for cancer therapy: Overcoming the obstacles, Viruses., 2 (2010), s. 78-106 Prestwich R. J., Errington F., Harrington K. J., Pandha H. S., Selby P., Melcher A., Oncolytic viruses: do they have a role in anti-cancer therapy?, Clinical Medicine. Oncology., 2 (2008), s. 83-96 Russell S. J., Peng K. W., Bell J. C., Oncolytic virotherapy, Nature Biotechnology., 7 (2012), s. 658-670 Zeyaullah M., Patro M., Ahmad I., Ibraheem K., Sultan P., Nehal M., et al., Oncolytic viruses in the treatment of cancer: a review of current strategies, Pathology and Oncology Research., 4 (2012), s.771-781 42 Wirusy onkolityczne jako potencjalna alternatywa w leczeniu nowotworów złośliwych 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Verheije M. H., Rottier P. J. Retargeting of viruses to generate oncolytic agents, Advances in Virology 2012 (2012), http://dx.doi.org/10.1155/2012/798526 Thirukkumaran C. M., Morris D. G. Oncolytic virotherapy for multiple myeloma: past, present, and future, Bone Marrow Research., 2011 (2011), http://dx.doi.org/10.1155/2011/632948 Tai C .K., Wang W., Lai Y. H., Logg C. R., Parker W. B., Li Y. F., Hong J. S., Sorscher E. J., Chen T. C., Kasahara N. Enhanced efficiency of prodrug activation therapy by tumor-selective replicating retrovirus vectors armed with the escherichia coli purine nucleoside phosphorylase gene, Cancer Gene Therapy., 17 (2010), s. 614-623 Bharara S., Sorscher E. J., Gillespie G. Y., Lindsey J. R., Hong J. S., Curlee K. V., Allan P. W., Gadi V. K., Alexander S. A., Secrist J. A, Parker W. B., Waud W. R., Antibiotic-Mediated Chemoprotection Enhances Adaptation of E. coli PNP for Herpes Simplex Virus-Based Glioma Therapy, Human Gene Therapy., 3 (2005), s. 339-347 Wei M. X., Tamiya T., Chase M., Boviatsis E. J., Chang T. K., Kowall N. W., Hochberg F. H., Waxman D. J., Breakefield X. O., Chiocca E. A., Experimental tumor therapy in mice using the cyclophosphamide-activating cytochrome P450 2B1 gene, Human Gene Therapy., 8 (1994), s. 969-78 Mahoney D. J, Stojdl D. F. Molecular pathways: multimodal cancer-killing mechanisms employed by oncolytic vesiculoviruses, Clinical Cancer Research., 19 (2013), s.758-763 Nemunaitis J., Khuri F., Ganly I., Arseneau J., Posner M., Vokes E., Kuhn J., McCarty T., Landers S., Blackburn A., Romel L., Randlev B., Kaye S., Kirn D. Phase II trial of intratumoral administration of ONYX-015, a replicationselective adenovirus, in patients with refractory head and neck cancer, Journal of Clinical Oncology., 2 (2001), s. 289-29 Kenneth R. Rogulski K. R., Freytag S. O., Zhang K., Gilbert J. D., Paielli D. L., Kim J. H., Heise C. C., Kirn D. H., In Vivo Antitumor Activity of ONYX015 Is Influenced by p53 Status and Is Augmented by Radiotherapy, Cancer Research., 60 (2000), s.1193-119 Galanis E., Okuno S. H., Nascimento A. G., et al., Phase I-II trial of ONYX015 in combination with MAP chemotherapy in patients with advanced sarcomas, Gene Therapy., 5 (2005), s.437-445 Juan-Fueyo J., Gomez-Manzano C., Alemany R., Lee P. S. Y., McDonnell T. J., MitliangaP., Shi Y., Levin V. A., Yung A. W. K., Kyritsis A. P. A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo, Oncogene., 1 (2000), s. 2-12 Fukuda K., Abei M., Ugai H., et al., E1A, E1B double-restricted adenovirus for oncolytic gene therapy of gallbladder cancer, Cancer Research., 63 (2003), s. 4434-4440 Sunamura M., Hamada H., Motoi F., et al., Oncolytic virotherapy as a novel strategy for pancreatic cancer, Pancreas., 3 (2004), s. 326-329 Jakubczak J. L., Ryan P., Gorziglia M., et al. An oncolytic adenovirus selective for retinoblastoma tumor suppressor protein pathway-defective tumors: 43 Maciej Gawroński, Arkadiusz Goede, Tomasz Wandtke 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. dependence on E1A, the E2F-1 promoter, and viral replication for selectivity and efficacy, Cancer Research., 63 (2003), s. 1490-1499 Yu D. C., Chen Y., Seng M., Dilley J., Henderson D. R. The addition of adenovirus type 5 region E3 enables calydon virus 787 to eliminate distant prostate tumor xenografts, Cancer Research., 59 (2000), s. 4000-4003 Yu D. C, Chan Y., Dilley J., et al., Antitumor synergy of CV787, a prostate cancer-specific adenovirus, and paclitaxel and docetaxel, Cancer Research., 61 (2001), s. 517-25 Gooding L. R., Regulation of TNF-mediated cell death and inflammation by human adenoviruses, Infectious Agents and Diseases., 3 (1994), s. 106-115 Shen Y., Nemunaitis J. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) for cancer treatment, Cancer Gene Therapy., 11 (2006), s. 975-992 Mineta T., Rabkin S. D., Martuza R. L., Treatment of malignant gliomas using ganciclovir-hypersensitive, ribonucleotide reductase-deficient herpes simplex viral mutant, Cancer Research.,54 (1994), s. 3963-3966 Langelier Y., Champoux L., Hamel M., et al., The R1 subunit of herpes simplex virus ribonucleotide reductase is a good substrate for host cell protein kinases but is not itself a protein kinase, The Journal of Biological Chemistry., 3 (1998),s. 1435-1443 Sanders P. G., Wilkie N. M.,. Davison A. J., Thymidine kinase deletion mutants of herpes simplex virus type 1, Journal of General Virology., 63 (1982), s. 277-295 Wong R. J., Patel S. G., Kim S. H. etal., Cytokine gene transfer enhances herpes oncolytic therapy in murine squamous cell carcinoma, Human Gene Therapy., 3 (2001), s. 253-265 Carew J. F., Kooby D. A., Halterman M. W., Kim S. H., Federoff H. J., Fong Y., A novel approach to cancer therapy using an oncolytic herpes virus to package amplicons containing cytokine genes, Molecular Therapy., 3 (2001), s. 250-256 Toda M., Martuza R .L, Kojima H., Rabkin S. D., In situ cancer vaccination: an IL-12 defective vector/replicationcompetent herpes simplex virus combination induces local and systemic antitumor activity, Journal of Immunology., 9 (1998), s.4457-4464 Pawlik T. M., Nakamura H., Yoon S. S., et al., Oncolysis of diffuse hepatocellular carcinoma by intravascular administration of a replicationcompetent, genetically engineered herpesvirus, Cancer Research., 60 (2000), s. 2790-2795 Yoon S. S., Carroll N. M., Chiocca E. A., Tanabe K. K. Cancer gene therapy using a replication- competent herpes simplex virus type 1 vector, Annals of Surgery., 3 (1998), s. 366-374 Aghi M., Chou T. C., Suling K., Breakefield X. O., Chiocca E. A. Multimodal cancer treatment mediated by a replicating oncolytic virus that delivers the oxazaphosphorine/rat cytochrome P450 2B1 and ganciclovir/herpes simplex virus thymidine kinase gene therapies, Cancer Research., 59 (1999), s. 3861-3865 44 Wirusy onkolityczne jako potencjalna alternatywa w leczeniu nowotworów złośliwych 34. Pawlik T. M., Nakamura H., Mullen J. T., et al., Prodrug bioactivation and oncolysis of diffuse liver metastases by a herpes simplex virus 1 mutant that expresses the CYP2B1 transgene, Cancer., 5 (2002), s. 1171-1181 35. Coffey M. C., Strong J. E., Forsyth P. A., Lee P. W. K. Reovirus therapy of tumors with activated Ras pathway, Science., 5392 (1998), s. 1332-1334 36. Bos J .L., Ras Oncogenes in human cancer: a review, Cancer Research., 49 (1989), s. 4682-4689 37. Forsyth P., Rold G., George D., et al., A phase I trial of intratumoral administration of reovirus in patients with histologically confirmed recurrent malignant gliomas, Molecular Therapy., 3 (2008), s. 627-632 38. Soefje S. A., Sarantopoulos J., Sankhala K. K., et al., A phase II study of intravenous reolysin (wild-type reovirus) in the treatment of patients with bone and soft tissue sarcomas metastatic to the lung, Journal of Clinical Oncology., 26 (2008), supplement, abstract 10568 39. Hirasawa K., Nishikawa S. G., Norman K. L., Alain T., Kossakowska A., Lee P. W. Oncolytic reovirus against ovarian and colon cancer, Cancer Research 62 (2002), s. 1696-1701 40. Jansen B., Schlagbauer-Wadl H., Kahr H., et al., Novel Ras antagonist blocks human melanoma growth, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America., 24.(1999), s. 14019-14024 41. Yang W. Q., Senger D., Muzik H., et al., Reovirus prolongs survival and reduces the frequency of spinal and leptomeningeal metastases from medulloblastoma. Cancer Research 63 (2003), s. 3162-3172 Wirusy onkolityczne jako potencjalna alternatywa w leczeniu nowotworów złośliwych Dynamiczny rozwój medycyny, biologii molekularnej i inżynierii genetycznej nie rozwiązał jak dotąd problemu zachorowań na nowotwory złośliwe, które są jednym z największych wyzwań współczesnej nauki. Co więcej, obecnie stosowane terapie leczenia nowotworów bardzo często zawodzą i wiążą się z szeregiem niepożądanych skutków ubocznych. Dlatego też poszukuje się innowacyjnych metod leczenia nowotworów, które stanowiłyby uzupełnienie i bezpieczną alternatywę dla obecnie stosowanych strategii. Dlatego szczególnym zainteresowaniem cieszy się wykorzystanie wirusów onkolitycznych, czyli wirusów zmodyfikowanych genetycznie, które selektywnie infekują i wybiórczo mnożą się w komórkach nowotworowych. Charakteryzują się wysokim tropizmem do komórek nowotworowych, szybkim tempem proliferacji, a także zdolnością do lizy zainfekowanych komórek, a ich użycie stymuluje antynowotworową odpowiedź układu immunologicznego. Cząsteczki zmodyfikowanych wirusów mogą także stanowić nośnik dla leków antynowotworowych, czy też genów samobójczych i terapeutycznych. Wykorzystano je w próbach klinicznych leczenia raka okrężnicy, szyjki macicy, jajnika, wątroby i trzustki. Wykazano także synergizm terapii wirusami onkolitycznymi i chemioterapii. Stworzono także wektory na bazie wirusa opryszczki (HSV), namnażające się tylko w komórkach nerwowych np. wektor rRp450, który znalazły zastosowanie w leczeniu nowotworów mózgu. Wirusy onkolityczne to różnorodna grupa wirusów, które selektywnie infekują i niszczą komórki nowotworowe przy jednoczesnym oszczędzaniu komórek prawidłowych. Ich prosta budowa pozwala na niemal dowolną modyfikację ich genomu. Dzięki unikalnym właściwościom i relatywnie niskim kosztom produkcji wektory te wydają się atrakcyjnym narzędziem terapeutycznym i potencjalnie mogą w przyszłości stanowić alternatywę dla obecnie stosowanych metod. 45 Maciej Gawroński, Arkadiusz Goede, Tomasz Wandtke Oncolytic viruses as potential alternative in the treatment of malignant tumorsitle in English The dynamic development of medicine, molecular biology and genetic engineering has not solved the problem of cancer diseases, which are one of the greatest challenges of modern science. Furthermore currently used anti-cancer therapies are often ineffective and are associated with a number of undesirable side effects. Therefore, there is an urgent need to find innovative cancer treatments that would be a complement and safe alternative to currently used therapeutic strategies. That is why there is particular interest in using oncolytic viruses – genetically modified vectors, that selectively infect and multiply only in cancer cells. They are characterized by a high tropism for cancer cells, high proliferation rate and the ability to lyse infected cells. Moreover, their usage stimulates anti-tumor immune response. Modified viral vectors may also act as a transporter of anticancer drugs or suicide and therapeutic genes. They were used in clinical trials in treatment of colon, cervical, ovarian, liver and pancreas cancer. Synergy between viral therapy and chemotherapy has also been shown. Vectors based on herpes simplex virus (HSV), capable to proliferate only in nerve cells such as vector rRp450 were created and are currently used in the treatment of brain tumors. Oncolytic viruses are diverse group of viruses that selectively infect and destroy cancer cells while saving normal cells. Due to their simple construction it is possible to modify their genome in almost any way. Due to unique properties and relatively low production costs, these vectors appear to be an attractive therapeutic tool and a potential alternative to currently used methods in the future. 46 Monika Dyńda1 Wykorzystanie bakterii jako wektorów w terapii przeciwnowotworowej 1. Wprowadzenie Celem pracy jest przeglądowe przedstawienie zastosowań wybranych drobnoustrojów i ich szczepów w terapii przeciwnowotworowej ze szczególnym uwzględnieniem prób leczenia guzów litych. Schorzenia nowotworowe są jednymi z najczęstszych ludzkich przypadłości, których występowanie zazwyczaj nie jest uwarunkowane wiekiem. Istnieją natomiast dowody na korelację występowania różnego typu mutacji spontanicznych oraz indukowanych działaniem mechanicznych i chemicznych czynników mutagennych a rozwojem komórek nowotworowych. Aktualnie stosowane terapie przeciwnowotworowe są bardzo wyniszczające dla organizmu ludzkiego. Zalicza się do nich chemioterapię, czyli stosowanie cytostatyków działających degradująco nie tylko na komórki nowotworowe, ale i na pozostałe zdrowe, radioterapię i/lub immunoterapię. Cechą wspólną tych wszystkich metod jest brak specyficzności wobec samego nowotworu, niszczone są wszystkie komórki, w tym odpornościowe. Konsekwencją jest zazwyczaj zniszczenie flory bakteryjnej organizmu oraz pozbawienie go bariery ochronnej w postaci aktywnego układu odpornościowego i ogólne osłabienie organizmu. Jednym z nowszych kierunków badań jest zastosowanie bakterioterapii, czyli wykorzystanie określonych gatunków bakterii w celu niszczenia nowotworów. W ostatnich kilku latach obiecujące wyniki badań uzyskano na modelach zwierzęcych, podczas eksperymentalnej terapii bakteriami z rodzaju Clostridium,Listeria, Pseudomonas czy Salmonella. Pozytywne skutki uzyskano zarówno przy samodzielnym stosowaniu szczepów bakteryjnych w różnych postaciach, jak i przy ich współdziałaniu z terapiami standardowymi. 1 [email protected], Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki 47 Monika Dyńda 1.1. Obiecujące perspektywy wykorzystania bakterii w terapii antynowotworowej Uczeni starają się znaleźć nowe, innowacyjne metody w walce z nowotworem odznaczające się mniejszą inwazyjnością wobec organizmu oraz podobną, a nawet lepszą skutecznością niż w przypadku chemio- czy radioterapii. W tym celu zaczęto badać zależność między środowiskiem rozwoju komórek nowotworowych, a miejscem bytowania niektórych z bakterii. Bakterie żyjące w warunkach beztlenowych lub względnie beztlenowych, takie jak Clostridium, czy Salmonella są zdolne do zasiedlania obszarów, w których rozwijają się guzy lite, wykazując jednocześnie lizę tych komórek [22]. Mikroorganizmy modyfikuje się genetycznie, aby zwiększyć ich powinowactwo do kumulowania się w obrębie nowotworu lub w sposób, który umożliwia im przenoszenie odpowiedniego antygenu, który będzie stymulował przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną. Są to tak zwane szczepionki przeciwnowotworowe, których celem jest stymulacja limfocytów T cytotoksycznych skierowanych przeciwko komórkom nowotworowym poprzez prezentację antygenów przez komórki dendrytyczne kompleksom MHC-I. Ogólnie, immunoterapia przeciwnowotworowa polega na ponownej aktywacji mechanizmów obronnych organizmu oraz skierowaniu ich przeciwko komórkom nowotworowym, co jest m.in inicjowane przez dostarczenie odpowiednich antygenów oraz ich efektywne zaprezentowanie komórkom żernym i limfocytom T [8]. Antynowotworowe działanie bakterii odkrył nowojorski chirurg William Coley pod koniec XIX wieku po przeprowadzonej operacji usunięcia mięsaka u jednej ze swoich pacjentek. Przypadkowo doszło do zakażenia bakteriami Streptococcus pyogenes, które wywołały wysoką gorączkę, czyli aktywowały układ odpornościowy, co w konsekwencji spowodowało remisję choroby. Coley postanowił zbadać dokładniej tę metodę terapii, dlatego zaczął podawać swoim pacjentom S. pyogenes. Pojawiły się jednak problemy w postaci słabej stymulacji układu odpornościowego, wystąpienia zbyt silnej reakcji zapalnej czy wystąpienia zakażeń śmiertelnych. Coley użył więc dwóch szczepów nieżywych bakterii S. pyogenes i Serratia marcescens, a taką szczepionkę nazwano toksynami Coley’a. Jeden z pacjentów z poważnym stadium choroby, z nieoperacyjnym mięsakiem został poddany terapii wyżej wymienionymi toksynami po czym zaobserwowano u niego całkowitą remisję choroby. Po śmierci Coley’a naukowcy prowadzili dalsze badania, jednak szybko ich zaprzestano ze względu na brak pozytywnych wyników eksperymentów, oraz rozwój innych, skutecznych metod terapeutycznych jak chemioterapia i radioterapia [9]. 48 Wykorzystanie bakterii jako wektorów w terapii przeciwnowotworowej 1.2. Metabolizm komórek nowotworowych Komórki nowotworowe powstają w wyniku nagromadzenia w organizmie różnego rodzaju mutacji oraz pod wpływem czynników epigenetycznych. Takie „ingerencje” genetyczne prowadzą do powstania zmian metabolicznych w poszczególnych komórkach, które w sumie generują powstanie odmiennego mikrośrodowiska niż istniejące wśród komórek zdrowych. Jednym z procesów zachodzących podczas transformacji nowotworowej jest formowanie się tworów przypominających naczynia krwionośne. Procesy, w wyniku których powstają, to angiogeneza oraz mimikra waskulogenna [18]. Pierwszy z nich odpowiada za tworzenie się naczyń z tych już obecnych w organizmie, natomiast drugi proces odpowiada za tworzenie sieci naczyniopodobnej, która jest znacznie mniej różnicowana niż naczynia krwionośne organizmu, a krew płynie w nich znacznie wolniej. Obecność naczyń krwionośnych, zarówno tych nowopowstałych jak i tych, w obrębie której nowotwór usytuował się, zapewnia komórkom nowotworowym dostęp do tlenu oraz jego rozprzestrzenianie się w organizmie [19]. Oba procesy przebiegają jednak powolnie co sprawia, że komórki przez długi czas są niedotlenione, co prowadzi do stymulacji tworzenia nowych naczyń oraz syntezy ATP podczas procesu glikolizy, który jest jednym z systemów adaptacji komórek do beztlenowego środowiska. Komórki nowotworowe potrzebują energii w postaci adenozynotrójfosforanu, aby przeżyć i wytworzyć nową sieć prymitywnych naczyń krwionośnych, które ponownie doprowadzą do niedotlenienia. Wnioskując, jeżeli komórki przeprowadzają proces glikolizy, niezbędne do ich przeżycia są cząsteczki glukozy. Przystosowaniem komórek do beztlenowych warunków jest również ekspresja niektórych genów w tych warunkach, których produkty zwiększają inwazyjność nowotworu. Naukowcy starają się jak najdokładniej poznać mechanizmy powstawania oraz bytowania komórek nowotworowych ponieważ dzięki temu możliwe jest opracowywanie nowych metod terapeutycznych. Jednymi z obiecujących metod są terapie z użyciem niektórych gatunków bakterii, u których wykryto powinowactwo do gromadzenia się w okolicach lub wewnątrz nowotworu dzięki obecności beztlenowego środowiska oraz wykorzystanie ich jako wektorów szczepionkowych zawierających odpowiednie antygeny stymulujące układ immunologiczny. Informacje na ten temat zostaną omówione w dalszych rozdziałach. 49 Monika Dyńda 2. Charakterystyka wybranych drobnoustrojów wykorzystanych w terapii przeciwnowotworowej 2.1. Clostridium novyi-NT Bakterie z rodzaju Clostridium należą do rodziny Clostridiaceae i liczą obecnie 203 gatunki, przy czym tylko kilka z nich wywiera toksyczny wpływ na organizm człowieka. Są to Gram-dodatnie-laseczki wytwarzające spory. Clostridium to przeważnie bezwzględne beztlenowce. Są to organizmy wytwarzające silne egzotoksyny jak np. neurotoksyny powodujące tężec. Toksyny Clostridium są aktywnymi biologicznie białkami o charakterze antygenowym, czyli stymulującym wytwarzanie przeciwciał w organizmie gospodarza. Najbardziej niebezpieczną, powodującą objawy kliniczne jest alfa-toksyna wywołująca miejscową nekrozę tkanek poprzez stworzenie beztlenowego środowiska w obrębie danej tkanki spowodowanego obumieraniem naczyń krwionośnych [2]. Mimo swojej toksyczności, bakterie Clostridium, a raczej ich spory, zostały wykorzystane w eksperymentalnych terapiach bakteryjnych nowotworów. Techniki biologii molekularnej pozwoliły na uzyskanie nietoksycznego szczepu – Clostridium novyi-NT od słów „non toxic” poprzez wyeliminowanie genu, którego ekspresja powodowała wydzielanie egzotoksyny alfa [10, 15]. Rysunek1. Obraz mikroskopowy spor Clostridium novyi-NT [15] 50 Wykorzystanie bakterii jako wektorów w terapii przeciwnowotworowej Do celów terapeutycznych wykorzystano również cykl życiowy Clostridium, a dokładniej ich bezwzględną beztlenowość, która umożliwia zasiedlanie przez bakterie wnętrza guzów litych. W przeprowadzonych doświadczeniach, które zostaną przedstawione w tym podrozdziale spory podawano do organizmu poprzez ich wstrzyknięcie, gdzie po określonym czasie kiełkowały rozpoczynając działanie terapeutyczne. Brak genu odpowiedzialnego za syntezę alfa-toksyn powoduje, że układ immunologiczny nie reaguje gwałtownie, jego aktywność uwidacznia się dopiero po zasiedleniu bakterii w obszarze nowotworu. Badania nad wykorzystaniem Clostridium w leczeniu nowotworów wykazały ich korzystne działanie, przejawiające się toksycznym działaniem bakterii na komórki rakowe. Beztlenowe warunki mikrośrodowiska nowotworu sprawiają, że bakterie gromadzą się w zmienionym chorobowo miejscu, następnie czynniki wydzielane przez komórki nowotworowe aktywują bakterie do działania litycznego, w wyniku czego Clostridium namnaża się i powoduje nekrozę pobliskich komórek czyli nowotworu. Rysunek2. Mechanizm działania antynowotworowego bakterii jest uzależniony od mikrośrodowiska nowotworu. Kiedy Clostridium wnikają do organizmu, wytwarzają spory, które lokalizują się wewnątrz litego guza, czyli w miejscu występowania środowiska beztlenowego. Wewnątrz guza następuje kiełkowanie spor i wytworzenie toksyn, które działają nekrotycznie na komórki nowotworowe [14] 51 Monika Dyńda Jednym z badań w modelu zwierzęcym, jakie przeprowadzono, było wyznakowanie komórek rakowych lucyferazą. Powszechnie lucyferaza jest traktowana jako wskaźnik wzrostu nowotworu, dlatego spadek jej aktywności oznacza nekrozę komórek rakowych. Następnie bezpośrednio w okolice komórek nowotworowych podano przetrwalniki zmodyfikowanego szczepu Clostridium. Po ich wykiełkowaniu, które nastąpiło po 24 godzinach zaobserwowano spadek aktywności lucyferazy, co jest przejawem lizy komórek nowotworowych [20, 17]. Badania przeprowadzono też na szczurach z rakiem mózgu (glejak wielopostaciowy), którego terapia jest mocno utrudniona a samo wycięcie guza powoduje naruszenie zdrowych tkanek i niekiedy prowadzi do upośledzenia funkcjonowania całego organizmu. Po podaniu C. novyi-NT zaobserwowano remisję choroby, jednak efektem ubocznym było powstanie obrzęku w mózgu. Nie uznano tego faktu za wadę terapii, ponieważ leczenie obrzęku mózgu jest zdecydowanie łatwiejsze niż eliminacja samego nowotworu [17]. Dowód na gromadzenie się C. novyi-NT wewnątrz guza potwierdziły badania, które opisano w artykule z 2004 roku, gdzie zastosowano model nowotworu rozprzestrzeniający się w wątrobie i jamie opłucnej królików powodujący śmierć po około ośmiu tygodniach. Zwierzęta zaszczepiano zawiesiną komórek nowotworowych a po jego rozwoju, szczepiono bakteriami. Po 4 dniach od podania C. novyi króliki uśmiercano, oraz wycinano zmiany nowotworowe poddając je opracowaniu histopatologicznemu [1]. 52 Wykorzystanie bakterii jako wektorów w terapii przeciwnowotworowej Rysunek 3. Na zdjęciach przedstawiono przekrój poprzeczny guza u królika kontrolnego oraz zaczepionego C. novyi-NT. Zdjęcia a i b przedstawiają przekrój tkanki guza w powiększeniu 40x, wybarwionej hematoksyliną&eozyną oraz obszar nekrotyczny oznaczony literą N. A- to grupa kontrolna, b – organizm zaszczepiony C. novyi-NT. C- powiększenie 400x pokazuje wybarwione na fioletowo, wyraźnie widoczne jądra komórek guza oraz składniki cytoplazmy w obszarze nekrotycznym. D – w przypadku C. novyi-NT obraz nekrotyczny jest ujednolicony, niemożliwe jest wyodrębnienie jąder i poszczególnych składników nowotworu. Zdjęcia e i f przedstawiają ten sam preparat w powiększeniu 1000x wybarwiony zielenią Pico. Na zdjęciu f widoczne są wybarwione na zielono formy wegetatywne C. novyi-NT [1] Wyniki badań są obiecujące, jednak należy wziąć pod uwagę fakt, że taka terapia może nie być do końca bezpieczna, ponieważ bakterie w organizmie mogą odpowiednio zmutować i zacząć ponownie produkować toksyny. Są to jedne z niebezpieczeństw terapii, które musi zostać szczegółowo poznane i wyeliminowane. Trudno również ustalić czy C. novyi-NT zachowają aktywność terapeutyczną w obszarach tlenowych guza. 53 Monika Dyńda 2.2. Listeria monocytogenes W terapiach antynowotworowych bakteriami Listerianie wykorzystuje się pojedynczych właściwości czynników wirulencji, lecz cały cykl rozwojowy bakterii,używając w tym celu najczęściej żywych, atenuowanych szczepionek bakteryjnych. Działanie szczepionki jest oparte na cyklu życiowym L. monocytogenes i polega na wywoływaniu w organizmie silnej odpowiedzi immunologicznej, która zostanie później skierowana przeciwko komórkom nowotworowym. Bakterie wchodzące w skład szczepionki zostają wzbogacone o antygen specyficzny dla danej odmiany nowotworu. Listeria przeprowadzają swój naturalny cykl życiowy, czyli wnikają do komórek, a antygeny nowotworowe podlegając silnej ekspresji są prezentowane kolejno cząsteczkom MHC klasy pierwszej i drugiej. Następnie limfocyty T odbierają sygnał od antygenów, po czym zostaje uruchomiona silna odpowiedź immunologiczna skierowana przeciwko komórkom nowotworowym [3]. 54 Wykorzystanie bakterii jako wektorów w terapii przeciwnowotworowej Rysunek4. Indukcja odpowiedzi immunologicznej przez L. monocytogenes poprzez stymulowane rozpoznanie antygenu przez komórki dendrytyczne oraz współdziałaniu MHC klasy I i II z jednoczesną aktywacją cytotoksycznych limfocytów T, które atakują komórki nowotworowe [3] L. monocytogenes wnikają do organizmu drogą pokarmową, a dokładniej przez komórki nabłonka jelitowego. Bakterie te wykorzystują do tego komórki M, do których wiążą się z udziałem adhezyn-internaliny A, co pozwala na bezpośrednie wnikanie bakterii przez nabłonek. Po przekroczeniu bariery w postaci nabłonka i śluzu, Listeria rozpoczyna penetrację komórek gospodarza poprzez proces fagocytozy. Po wydostaniu się z fagosomu, bakterie poruszają się w cytoplazmie komórki wytwarzając specjalną strukturę, 55 Monika Dyńda tzw. „kometę listeryjną” na biegunach komórki, w której skład wchodzą filamenty aktynowe, które uległy polimeryzacji po zadziałaniu produktu bakterii – białka ActA. Bakterie przechodzą następnie do sąsiedniej komórki, gdzie zostają otoczone przez podwójną błonę fosfolipidową, z której ponownie się wydostają przy pomocy produkowanych enzymów (fosfolipaz). Cały proces penetracji komórek gospodarza przez L. monocytogenes odbywa się z pobudzeniem układu immunologicznego, w tym zachodzących z udziałem antygenów zgodności tkankowej klasy pierwszej i drugiej. Rozwój L. monocytogenes następuje wewnątrz komórek prezentujących antygen, którymi są monocyty, makrofagi i komórki dendrytyczne. Bakterie prezentują swoje antygeny (trawione w lizosomie białka i toksyny) cząsteczkom MHC klas I i II i tym samym stymulują do odpowiedzi limfocyty T pomocnicze i cytotoksyczne (CD4+ CD8+), co w przypadku nowotworów jest zjawiskiem pozytywnym, ponieważ specyfikacja nowotworu powoduje zahamowanie aktywności limfocytów T regulatorowych oraz cząsteczek MDCs. Taka stymulacja odpowiedzi immunologicznej znalazła zastosowanie przy produkcji wektorów szczepionkowych, które byłyby wykorzystywane jako środek terapeutyczny chorób, gdzie ważna jest wtórna indukcja układu odpornościowego [21]. Najnowsze badania przeprowadzone z użyciem L. monocytogenes dotyczyły skonstruowania oraz wykorzystania wektora szczepionkowego w terapii raka szyjki macicy, poprzez stymulację i skierowanie odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom nowotworowym. Działanie szczepionki opisano w artykułach w 2008 roku, gdzie badania przeprowadzono na pacjentkach z zaawansowanym stadium raka szyjki macicy. Produkt poddawany badaniom to Lovaxin-C czyli rekombinowane, żywe, atenuowaneL. monocytogenes zawierające specyficzny dla nowotworu antygen oraz pozbawioną hemolitycznych właściwości listeriolizynę O [16]. Przełomowym wynikiem badań okazała się nie tylko skuteczność szczepionki, ale również jej bezpieczeństwo wobec ludzkiego organizmu. Po trzech miesiącach kuracji zaobserwowano uwstecznienie objawów chorobowych u siedmiu z 15 pacjentek, u których chemioterapia oraz radioterapia nie przyniosły efektów. Kobietom poddawanym terapii szacowano około pół roku życia, włączono je więc w fazę kliniczną pierwszą i drugą. W odstępie trzech tygodni otrzymywały one szczepionkę. Do trzech miesięcy terapia przebiegała bezproblemowo w porównaniu do standardowych metod. Jedynymi efektami ubocznymi były gorączka, dreszcze i nudności. Po tym czasie, u pięciu pacjentek choroba postąpiła, natomiast u siedmiu stan ustabilizował się. Jedna z pacjentek, która była w IV stadium zaawansowania choroby została poddana chemioterapii, w wyniku czego po dwóch latach guz całkowicie zanikł [12]. 56 Wykorzystanie bakterii jako wektorów w terapii przeciwnowotworowej 2.3. Pseudomonas aeruginosa Najbardziej intensywne badania prowadzone są obecnie na jednym z niedawno zmodyfikowanych szczepów Pseudomonas o symbolu BN10. Jest to szczep Gram-ujemny, tlenowy z jedną wicią, nie formujący spor, zdolny do produkcji związków powierzchniowo czynnych, m. in.ramnolipidów należących do biosurfaktantów. Ramnolipidy mają glikolipidową budowę, a w ich w skład wchodzi ramnoza tworząc hydrofilową główkę oraz kwas beta-hydroksydekanowy formujący hydrofobowy ogon związku. Bakterie Pseudomonas charakteryzuje synteza oraz wydzielanie na zewnątrz tych związków. Z wyżej wymienionego szczepu udało się wyizolować na żelu krzemionkowym dwa rodzajeramnolipidów – RL-1 i RL-2, które zbadano metodą rezonansu magnetycznego i spektrometrii masowej (NMR-MS). Działanie poszczególnych związków badano m.in. na liniach komórkowych białaczki promielocytarnej (HL-60). Mechanizmem działania ramnolipidów jest wprowadzanie zmian morfologicznych w komórkach fagocytów i komórek niefagocytujących poprzez reorganizację cytoszkieletu w wyniku czego następuje różnicowanie keratynocytów i fibroblastów. Działanie przeciwnowotworowe obserwowano w przypadku RL-1, który spowodował zahamowanie żywotności komórek nowotworowych nawet w 50% już przy niskich stężeniach. W komórkach eksponowanych na RL-1 obserwowano zmiany kondensacji chromatyny, fragmentację organelli czy zmianę struktury cytoplazmy [5]. 57 Monika Dyńda Rysunek 5. Wpływ różnych ilości stężeń RL-1 i RL-2 na żywotność komórek nowotworowych białaczki promielocytarnej i ostrej białaczki limfoblastycznej typu B [5] Bakterie P. aeruginosa mają również zastosowanie jako wektor szczepionkowy. Ogólna zasada działania tego typu szczepionek polega na indukcji komórek układu odpornościowego oraz ukierunkowaniu aktywności komórek żernych i stymulacji odpowiedzi humoralnej przeciwko czynnikom chorobotwórczym, które wcześniej przez organizm nie zostały rozpoznane. W tym celu najczęściej wprowadza się do DNA bakterii odpowiednie geny kodujące określone białka, które ulegają ekspresji w organizmie gospodarza i stymulują odpowiedź immunologiczną dzięki lepszemu zaprezentowaniu komórkom żernym swoistego antygenu. W artykule z 2006 roku, autorstwa Epaulard’a i Toussaint’a [7], została opisana szczepionka zawierająca zmodyfikowane szczepy P. aeruginosa. Szczepionka, której bazą była albumina o zwiększonej przyswajalności, składała się z zawiesiny bakterii P. aeruginosa oraz mysich komórek dendrytycznych i limfocytów T. Do badań użyto myszy, u których indukowano nowotwór o typie czerniaka, którym wszczepiono podskórnie, w miejsce gdzie rozwijał się nowotwór terapeutyczną mieszaninę. Działanie substancji obserwowano po 5 i 12 dniach od implantacji nowotworu, gdzie zaobserwowano remisję choroby u 6 myszy. 58 Wykorzystanie bakterii jako wektorów w terapii przeciwnowotworowej Inne zastosowanie bakterii Pseudomonas przedstawiono w badaniach przeprowadzonych zaledwie rok temu. Naukowcy wykorzystali szczepy tych bakterii do stymulacji aktywności cytotoksycznej komórek działających przeciwko komórkom nowotworowym. Mowa o krwi pępowinowej (CB – Cord Blood), która stanowi bogate źródło komórek krwiotwórczych oraz NK indukowanych cytokinami (CIK). Są to komórki efektorowe, które wykazują aktywność antynowotworową zarówno w eksperymentach in vitro jak i in vivo w odniesieniu do odmian złośliwych nowotworu. Ich głównym zadaniem jest ekspresja limfocytów T oraz komórek dendrytycznych i tym samym wywołanie efektu cyto-toksycznego wobec komórek nowotworowych. W przeprowadzonym eksperymencie wykazano, że komórki CIK indukowane szczepem Pseudomonas indukują wydzielanie prozapalnych cytokin jak IFNgamma oraz wzmagają ekspresję receptorów TLR2, TLR4, TLR6, co powoduje zwiększenie stopnia cytotoksyczności wobec komórek rakowych [24]. Rysunek6. Wykres przedstawiający wzrost komórek nowotworowych poddanych wpływowi komórek CIK. Komorki nowotworowe potraktowane komórkami CIK przedstawione są na wykresie jako linie A, B i C (najmniejszy wzrost komórek), pozostałe krzywe przedstawiają wyniki wzrostu nowotworu bez CIK. H to kontrola [23] 59 Monika Dyńda 2.4. Salmonella typhimurium Bakterie z rodzaju Salmonella są ruchliwymi, orzęsionymi, Gramujemnymi pałeczkami. Nie wytwarzają toksyn, jak ma to miejsce w przypadku Clostridium, Pseudomonas czy Listeria. Niepożądanym immunostymulatorem jest jedynie lipopolisacharyd występujący w błonie zewnętrznej, który nadmiernie indukuje odpowiedź organizmu w momencie lizy komórki bakteryjnej, co może prowadzić do szoku toksycznego [13]. Pierwszym i najczęściej wykorzystywanym do badań jest szczep o obniżonej toksyczności VNP20009, w którym usunięto gen Purl potrzebny do syntezy puryn oraz msbB czego efektem była zmniejszona indukcja TNF-α przez LPS w organizmie gospodarza. Efekt ten zapobiega szokowi septycznemu [6]. Autorzy jednego z artykułów z 2010 roku przedstawiają wyniki badań na temat szczepu VNP20009, z których wynika, że wśród 31 pacjentów z czerniakiem złośliwym, tylko u trzech stwierdzono kolonizację guza przez bakterie. Jedną z możliwych odpowiedzi dlaczego tak się dzieje jest stopień wrażliwości układu odpornościowego danego pacjenta na szczep VNP20009, który próbuje usunąć go z organizmu. Podczas podawania S. typhimurium myszom z rakiem okrężnicy zauważono duży napływ krwi do wnętrza guza, co doprowadziło do nekrozy centralnej części nowotworu, tam gdzie bakterie proliferowały. Efekt ten został wykryty dzięki wysokiemu stężeniu cytokin w organizmie, które efekt ten powodowały. W martwiczych obszarach guza bakterie są zdolne do bardzo intensywnego rozwoju. Stwierdzono więc, że niepowodzenie poprzednich badań było spowodowane zbyt małą indukcją uwalniania TNF-α, co jest niezbędne do efektywnej inwazji i niszczenia nowotworu. Dlatego kolejnym krokiem było zmodyfikowanie szczepu S. typhimurium w taki sposób, aby był wystarczająco wirulentny wobec guzów przy jednocześnie zmniejszonych efektach ubocznych [11]. Podanie dożylnie dużej ilości bakterii nie wywołuje niepożądanych efektów u ludzi i jest dobrze tolerowane przez organizm, dlatego szczep VNP jest postrzegany jako stosunkowo bezpieczny wektor szczepionkowy [4]. Obiecujące badania z wykorzystaniem bakterii Salmonella przeprowadzili polscy naukowcy z Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie. Badania dotyczyły zmodyfikowania szczepu VNP w taki sposób, aby uzyskany wektor szczepionkowy wykazywał jak największe powinowactwo oraz toksyczność wobec komórek nowotworowych. Efekt taki próbowano uzyskać poprzez wymuszenie opóźnionej nadekspresji białka SipB w miejscach zmienionych chorobowo. Białko to jest kodowane przez pierwszą wyspę patogenności i odpowiada za indukcję apoptozy komórkowej, oraz usunięcie genu Trg odpowiedzialnego za chemotaksję bakterii w obszary o zwiększonym stężeniu glukozy. Nagromadzenie glukozy występuje w zewnętrznej części 60 Wykorzystanie bakterii jako wektorów w terapii przeciwnowotworowej guzów litych, dlatego usunięcie tego genu zwiększało powinowactwo gromadzenie się szczepu wewnątrz guza [4]. Próbowano znaleźć sposób w jaki bakterie mogłyby skuteczniej dotrzeć do komórek nowotworowych. Wykorzystano różnego rodzaju receptory, które w wyniku chemotkasji przyciągnęłyby S. typhimurium do specyficznych regionów guza. Szczep VNP zmodyfikowano tak, aby produkował fragment przeciwciała, który wiązałby antygen karcynoembrionalny (CEA) na powierzchni komórek nowotworowych. Dzięki oddziaływaniu przeciwciała z CEA bakteria pozostaje w guzie nowotworowym, zakaża niektóre komórki nowotworowe i wywołuje ich śmierć. Natomiast opóźniona nadekspresjagenu sipB potęguje ten efekt [4]. Do zweryfikowania skuteczności terapeutycznie zmodyfikowanego szczepu użyto myszy, którym wszczepiono podskórnie komórki nowotworów czerniaka i gruczolaka oraz czekano na jego rozwój. Zmodyfikowane bakterie Salmonella, czyli szczep VNP20009 z wbudowaną sekwencją 6xHis-sipB podawano w miejsce, gdzie rozwijał się nowotwór. Wyniki pokazały jednoznacznie, że bakterie ze wstawką hamują rozwój nowotworu w większym stopniu niż zastosowanie dzikiego szczepu VNP20009. U 80% myszy zakażonych nowotworem zaobserwowano całkowite wyeliminowanie choroby w wyniku zastosowania szczepu Salmonella z genem sipB, natomiast przy zastosowaniu bakterii bez wstawki, efekt ten wystąpił jedynie u 20% myszy. Pozytywne wyniki dotyczą linii komórkowych gruczolakoraka MC38CEA i nowotworów płuc, w przypadku których zaobserwowano zahamowanie rozwoju komórek nowotworowych w porównaniu z grupą kontrolną [4]. Podstawową wadą zmodyfikowanego szczepu VNP20009 była słaba inwazyjność względem komórek MC38CEA oraz ich niska przeżywalność in vivo. Było to spowodowane nagła ekspresją genu sipB. Aby wyeliminować niepożądane efekty, wprowadzono do plazmidu wstawkę składającą się z promotora PsifB, histydyny oraz białka sipB, który miał za zadanie indukować opóźnioną ekspresję genu kodującego białko sipB. Przesunięta w czasie ekspresja, czyli zachodząca już wewnątrz komórki bakteryjnej pozwoliła na zwiększenie przeżywalności szczepu oraz inwazyjności zakażanych komórek eukariotycznych. Nowopowstałego szczepu użyto ponownie stosując wybrane modele nowotworowe u myszy. W przypadku zwierząt z gruczolakorakiem (MC38CEA), po podaniu bakterii już w ósmym dniu zaobserwowano zmniejszenie guzów, natomiast cztery dni później guzy były niemożliwe do zmierzenia. W ciągu miesiąca eliminacja nowotworu nastąpiła u trzech myszy. W przypadku czerniaka zlokalizowanego w płucach, lepsze efekty zaobser- 61 Monika Dyńda wowano przy zastosowaniu szczepu VNP/SipB niż samego VNP. U dwóch osobników nastąpiła całkowita eliminacja nowotworu [4]. Rysunek 7. Efekty terapii nowotworowej przebiegającej z zastosowaniem zmodyfikowanych szczepów bakteryjnych Salmonella. Najlepsze efekty terapeutyczne uzyskano stosując szczep VNP/sipB [4]. W 2009 roku szczep VNP/SipB, proces jego otrzymywania oraz wykorzystanie jako wektora szczepionkowego zgłoszono do Urzędu Patentowego. Wynalazek został opatentowany na początku 2013 roku. Aktualnie trwają dalsze badania nad ulepszeniem i wykorzystaniem bakterii Salmonella oraz opisanego wektora VNP/sipB w leczeniu przeciwnowotworowym. 62 Wykorzystanie bakterii jako wektorów w terapii przeciwnowotworowej 3. Podsumowanie Mimo dużego postępu w opracowywaniu nowych leków o działaniu przeciwnowotworowym, skuteczność klasycznych terapii jest wciąż niezadowalająca. Dlatego też naukowcy na całym świecie poszukują alternatywnych sposobów leczenia pozbawionych większości skutków ubocznych. Wszystkie te metody, mają swoje zalety oraz wady, ale próby ich zastosowania w przyszłości mogą przynieść oczekiwane skutki. Jednym z nowszych kierunków badań jest zastosowanie bakterioterapii, czyli wykorzystanie określonych gatunków bakterii w celu niszczenia nowotworów. Wiele prób klinicznych przyniosło pozytywne skutki leczenia, dlatego warto analizować i ulepszać te metody terapii przeciwnowotworowej. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Agrawal N., Bettegowda Ch., Cheong I., Geschwind J. F., Drake Ch. G., Hipkiss E. L., Tatsumi M., Dang L. H., Diaz L. A., Pomper M., Abusedera M., Wahl R. L., Kinzler K. W., Zhou S., Huso D.L., Vogelstein B., Bacteriolytic therapy can generate a potent immune response against experimental tumors, PNAS, 101 (2004), s. 15172-15177. Boyd N., Walker P., Thomson R., The prevention of experimental Clostridium novyi gas gangrene in high-velocity missile wounds by passive immunisation, J Med. Microbiol., 5 (1972), s. 459-465 Brockstedt D., Dubensky T., Promises and challenges for the development of Listeria monocytogenes – based immuno therapies, ExpertRev. Vaccines, 7 (2008), s. 1069-1084 Chorobik P., Opracowanie metody zwiększenia efektywności bakterii Salmonella typhimurium w terapii przeciwnowotworowej poprzez nadekspresję endogennego białka SipB, Kraków, Uniwersytet Jagielloński, (2010) Christova N., Tuleva B., Kril A., Georgieva M., Konstantinov S., Terzlyski I., Nikolova B., Stoineva I., Chemicalstructure and in vitro antitumoractivity of rhamnolipids from Pseudomonasaeruginosa BN10, Appl. Biochem. Biotechnol., 170 (2013), s. 676-689 El-Bahy A. A., Abou-Aisha K., Noaman E., Mahran L. G., Regression of murineehrlichascites carcinoma using tumor-targeting Salmonella VNP20009 – comparison with the effect of the anticancerdrugdoxorubicin. Advances in cancer, Research&Treatment, (2012) Epaulard O. 1, Toussaint B., Quenee L., Derouazi M., Bosco N., Villiers Ch., Le Berre R., Guery B., Filopon D., Crombez L., Marche P., Polack B., Antitumor immunotherapy via antigendelivery from a live attenuated genetically engineered Pseudomonas aeruginosa type III secretion system-based vector, Nature, 14 (2006), s. 656-661 Epaulard O. 1, Toussaint B., Quenee L., Derouazi M., Bosco N., Villiers Ch., Le Berre R., Guery B., Filopon D., Crombez L., Marche P., Polack B., Antitumor immunotherapy via antigendelivery from a live attenuated genetically 63 Monika Dyńda 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. engineered Pseudomonas aeruginosa type III secretion system-based vector, Nature, 14 (2008), s. 656-661 Hoption C. S. A, Netten J. P, Netten C., Dr William Coley and tumor regression: a place in history or in the future, Postgrad Med. J, 79 (2003), s. 672-680 http://www.hopkinsmedicine.org/neurology_neurosurgery/centers_clinics/spin e/clinical_trials/chordoma_study_announcement.pdf Leschner S., Weiss S., 2010 Salmonella – allies in the fight against cancer, J Mol Med. 88 (2010), s. 763-773 Lowry F., Live Listeria vaccine proves safe against end-stagecervical ca in humantrial. Ob. Gyn. News, 15 (2008), s. 2 Mizerski W., Bednarczuk B., Kawalec M. Słownik bakterii [w:] Salmonella. Adamantan, Łódź, (2008) Olson, West Virginia University, www2.hsc.wvu.edu/som/physio/ppts/FIS%201Intro%20to%20bacteriology%20Olson%202006.ppt Plomp M., McCaffery M., Cheong I., Huang X., Bettegowda Ch., Kinzler K., Zhou S., Vogelstein B., Malkin A., Spore coat architecture of Clostridium novyi NT spores, J. Bacteriol. 189 (2007), s. 6457-6468 Radulovic S., Brankovic-Magic M., Malisic E., Jankovic R., Dobricic J., Plesinac-Karapandzic V., Maciag P. C., Rothman J., Therapeutic cancer vaccines in cervical cancer: phase I study of Lovaxin-C,J B.U.ON. 14 (2009), s. 165 Staedtke V., Bai R., Kinzler K., Zhou S., Vogelstein B., Riggins G., The genetically engineered Clostridium novyi-NT is effecacious in the treatment of intracranial glioblastomas, Neuro-Oncology, 16 (2014), s. 79-95 Szala S., Komórki mikrośrodowiska nowotworowego: cel terapii przeciwnowotworowej, Nowotwory Journal of Oncology, 57 (2007), s. 633-645 Szala S., Jarosz M. 2011. Nowotworowe naczynia krwionośne, PostepyHigMedDosw, 65: 437-446 Tiffen J. C., BaileyCh. G., Ng C., Rasko J., Holst J., Luciferaseexpression and bioluminescencedoes not affect tumor cellgrowth in vitro or in vivo, Molec. Cancer, 9 (2010), s. 299-307 Wiki.biol.uw.edu.pl Yu H., Bacteria-mediated disease therapy, ApplMicrobiolBiotechnol, 92 (2011), s. 1107-1113 Zhang L., Hou Y., Zhang J., Hu J., Zhang K., Cytotoxicity of cytokine-induced killer cells targeted by a bispecific antibody to gastric cancer cells, Oncol. Lett., 5 (2013), s. 1826-1832 Zhang Z., Wang L. P., Zhao X. L., Wang F., Huang L., Wang M., Chen X. F., Li H., Zhang Y., Pseudomonas aeruginosa injection enhanced antitumor cytotoxicity of cytokine-induced killer cells derived from cordblood, Biomed Pharmacother, 68 (2014), s. 1057-1063 64 Wykorzystanie bakterii jako wektorów w terapii przeciwnowotworowej Wykorzystanie bakterii i ich wektorów w terapii przeciwnowotworowej Współcześnie, jednymi z oporniejszych terapii jest leczenie chorób nowotworowych, dlatego naukowcy starają się opracować jak najskuteczniejsze metody w zwalczaniu komórek nowotworowych. Szerokim spektrum badań zostały poddane bakterie jak na przykład Clostridium novyi, Listeriamonocytogenes, Pseudomonasaeruginosa czy Salmonella typhimurium, gdzie wykorzystano ich specyficzny cykl życiowy w opracowywaniu skutecznych terapii przeciwnowotworowych. W przypadku C. novyizrekombinowano pozbawiony toksyczności szczep, który jako bezwzględny beztlenowiec namnaża się w beztlenowym mikrośrodowisku guzów litych. Natomiast L. monocytogenes została użyta do skonstruowania szczepionki z żywymi, atenuowanymi bakteriami, które mają za zadanie wzbudzać odpowiedź humoralną organizmu i skierować ją przeciwko komórkom nowotworowym. Szczepionka była testowana między innymi u kobiet w zaawansowanym stadium raka szyjki macicy. Podobne działanie wykazuje P. aeruginosa, która działa immunostymulująco na organizm gospodarza. Zastosowanie w terapii nowotworowej znalazł również specjalnie zmodyfikowany szczep BN10, który wydziela ramnolipidy działające toksycznie na komórki białaczki promielocytarnej. Obiecujące wyniki badań uzyskano również w przypadku S. typhimurium, a konkretnie szczepu VNP20009, który wykazuje nekrotyczne działanie w przypadku czerniaka złośliwego oraz szczep VNP/SipB skonstruowany przez polskich naukowców, który przyniósł pozytywne efekty u myszy z gruczolakiem, a nawet całkowitą eliminację nowotworu. Anti-tumor therapies with application of bacteriaand theirvectors Nowadays, cancer therapy is very challenging treatment so scientists are trying to discover the most effective way to kill cancer cells. Bacteria like Clostridium novyi, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa or Salmonella typhimurium were widely examined and surveys were focused on use their lifecycle in cancer therapy. During examination of C. novyi new recombinant strain was created and this strain was deprived of toxic features. This strain as obligate anaerobe was able to proliferate in anaerobic microenvironment of solid tumors. On the other hand L. monocytogenes was used to create vaccine. This vaccine contained alive, attenuated bacteria and the aim of this vaccine was to activate humoral immune response against cancer cells. This treatment was tested among women with late stadium of cervical cancer. Similar action can be observed in therapy with P. aeruginosa, which has immunostimulating influence on human organism. The strain of P.aeruginosa BN10 is also used in cancer therapy. This strain excrete ramnolipids, which can be toxic to promyelocytic leukemia cells. The examination of S. typhimurium ended with some promising results especially examination of strain called VNP20009. This strain was observed to cause necrosis of malignant melanoma cells. Another examined strain VNP/SipB, which was created by Polish scientists was tested on mice and it was effective in lung adenoma, even some mice fully recovered from this type of cancer 65 Anna Posmysz1 Zastosowanie krwi pępowinowej w medycynie czyli o możliwościach terapeutycznych komórek macierzystych pobranych z krwi pępowinowej 1. Wstęp Praca ta ma charakter przeglądowy. Na podstawie dostępnych publikacji w bazie PubMed oraz na stronach Polskiej Akademii Nauk dokonano usystematyzowania wiedzy na temat możliwości zastosowania krwi pępowinowej w leczeniu różnych jednostek chorobowych. Temat komórek macierzystych i ich wykorzystania w terapii chorób neurodegeneracyjnych, po zawałach serca i mózgu, medycynie sportowej czy nawet onkologii jest bardzo często poruszany w środowiskach naukowych i medycznych. Ponieważ krew pępowinowa jest odpadem medycznym, warto jest rozważyć jej zdeponowanie w bankach krwi pępowinowej czyli dokonanie tzw. bankowania. Aktualny stan wiedzy pozwala sformułować wnioski, że komórki macierzyste obecne w krwi pępowinowej wykazują duże możliwości różnicowania się w różnorodne typy komórek trzech listków zarodkowych. Ponadto, łatwiej je wyizolować niż np. ze szpiku kostnego. Mogą być stosowane w leczeniu nie tylko najbliższych nam osób, ale także ludzi zupełnie niespokrewnionych np. chorych na białaczkę, pacjentów po zawałach sercach, udarach mózgu i nowotworach będących zmorą współczesnego świata. Użycie tych komórek nie wymaga tak skomplikowanych zabiegów jak w przypadku poszukiwań dawcy szpiku kostnego, a tym samym leczenie może odbyć się szybciej, niż w sytuacji gdy dopiero poszukuje się odpowiedniego dawcy szpiku do przeszczepu. Jak wiadomo, im szybciej podejmie się terapię chorego, tym lepsze są dla niego rokowania. 1 [email protected], studia doktoranckie, Katedra Nauk Fizjologiczno-Medycznych, Zakład Fizjologii, Akademia Wychowania Fizycznego im. Jerzego Kukuczki w Katowicach, www.awf.katowice.pl 66 Zastosowanie krwi pępowinowej w medycynie czyli o możliwościach terapeutycznych komórek macierzystych pobranych z krwi pępowinowej 2. Wprowadzenie Komórki macierzyste (SC) to takie komórki, które charakteryzują się dużymi możliwościami samoodnowy oraz zdolnością do wielokierunkowego różnicowania się. Rozróżniamy trzy ich rodzaje: embrionalne, zarodkowe i somatyczne. Wymienione typy komórek macierzystych wykazują zróżnicowany potencjał. Komórki węzła zarodkowego są totipotencjalne, zarodkowe – pluripotencjalne, płodowe oraz somatyczne czyli te występujące w organizmie po urodzeniu –multipotencjalne [1, 2]. Wśród somatycznych SC wyróżnić można dwa podtypy: hematopoetyczne SC (HSC) oraz mezenchymalne SC (MSC). Zarówno HSC jak i MSC są multipotencjalne. W tabeli nr 1 zestawiono najważniejsze cechy wyżej wymienionych komórek w celu porównawczym. 2.1. Embrionalne komórki macierzyste Embrionalne komórki macierzyste (ES) w porównaniu z pozostałymi SC są najbardziej plastyczne – mają zdolność do przekształcania się w dowolny rodzaj komórek [1]. Komórki macierzyste ulegają podziałom symetrycznym (ES) lub asymetrycznym (płodowe SC, somatyczne SC). Somatyczne SC są obecne w znacznie większej liczbie typów tkanek i odpowiadają za odbudowywanie i regenerację organów i tkanek przez całe nasze życie. Na rycinie nr 1 przedstawiono graficznie pochodzenie ludzkich komórek macierzystych [3]. Rys. 1. Pochodzenie i właściwości ludzkich komórek macierzystych wg Jezierskiej-Woźniak [3] 67 Anna Posmysz 2.2. Różnicowanie komórek macierzystych i ich nisza Cecha nazywana różnicowaniem to nic innego jak zdolność komórki do zmiany fenotypu pod wpływem ekspresji, której ulegają geny związane z daną czynnością komórki. SC wcale nie dzielą się tak często, w dodatku do podziału potrzebują odpowiedniego bodźca. Przykład takiego zjawiska świetnie ukazuje znane wielu sportowcom dyscyplin wytrzymałościowych zwiększone wytwarzanie czerwonych krwinek w organizmie człowieka przez szpik kostny w warunkach hipoksji tlenowej podczas przebywania i trenowania na wysokości ponad 1500 m n.p.m. Drugi popularny przykład to złuszczanie się naskórka. Powszechnie wiadomo, że naskórek często ulega uszkodzeniu i gdyby nie komórki macierzyste, jego samoodnawianie się nie byłoby możliwe. Komórki macierzyste są regulowane przez tzw. niszę czyli mikrośrodowisko fizjologiczne o specyficznych właściwościach. To właśnie ona wysyła określone sygnały, które mają wpływ na powstawanie wewnętrznych sygnałów między komórkami macierzystymi i tym samym decyduje o przeznaczeniu komórki oraz reguluje proliferację komórkową [4, 5]. Tab. nr 1. Charakterystyka cech komórek macierzystych – opracowanie własne Totipotencjalne Zdolne do różnicowania się w dowolny rodzaj komórek budujących organy dorosłego osobnika, a także do komórek tworzących łożysko. Komórki totipotencjalne to zygota i blastomery Pluripotencjalne Zdolne do różnicowania się w dowolny typ komórek somatycznych, z wyłączeniem komórek trofoblastu. Pluripotencjalne komórki macierzyste, które pochodzą z wczesnego stadium zarodkowego (kilkudniowa blastocysta) dają początek wszystkim rodzajom komórek. Do komórek pluripotencjalnych zalicza się również dorosłe komórki macierzyste szpiku kostnego 68 Multipotencjalne Unipotencjalne Zdolne do różnicowania się w różne typy komórek, zazwyczaj jednak typy te mają podobne właściwości i pochodzenie embrionalne. Do tej grupy komórek zalicza się między innymi komórki macierzyste pochodzące z krwi pępowinowej Zdolne do różnicowania się tylko i wyłącznie w jeden typ komórek. Komórki macierzyste wykazujące tą zdolność nazywa się także prekursorowymi. Komórki unipotentne to np. keratynocyty Zastosowanie krwi pępowinowej w medycynie czyli o możliwościach terapeutycznych komórek macierzystych pobranych z krwi pępowinowej 2.3. Przeszczepy komórek macierzystych Po przeszczepieniu komórki macierzyste namnażają się. Prawie nigdy nie atakują komórek biorcy i nie dochodzi do odrzucenia przeszczepu. Jest to szczególne istotne przy ratowaniu chorych na białaczki. Komórki macierzyste z krwi pępowinowej nie są nośnikiem chorób nowotworowych, które mogą się rozwijać w trakcie życia człowieka np. na skutek oddziaływania środowiska lub pod wpływem zaburzonej ekspresji genów [6]. Świadczy to o bezpieczeństwie ich stosowania, które to cały czas jest udowadniane w badaniach naukowych na całym świecie. Najwięcej komórek macierzystych znajduje się w ludzkich embrionach, ale pozyskiwanie ich z płodów, np. w wyniku aborcji, nie może być akceptowane bez zastrzeżeń. Drugim, alternatywnym źródłem może być krew pępowinowa pobierana z pępowiny. Do niedawna była ona niszczona w szpitalach wraz z łożyskiem czyli stanowiła tzw. odpad medyczny. Ponieważ pobieranie krwi pępowinowej tuż po porodzie nie wiąże się z żadnym ryzykiem dla matki czy noworodka, powinno się rozważyć bankowanie krwi pępowinowej. Jednak przechowywanie krwi w tzw. bankach krwi pępowinowej wiąże się z pewnymi kosztami. 2.4. Bankowanie krwi pępowinowej Jak pisze w swoim artykule Pilonis, nie wszyscy uważają bankowanie krwi pępowinowej za coś wspaniałego i potrzebnego. Autorka opisuje postawę Profesora Wiesława Wiktora Jędrzejczaka z Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, który nie uważa, by bankowanie krwi pępowinowej przez banki komercyjne wiązało się z takimi korzyściami, jakie przedstawiane są rodzicom nowonarodzonych dzieci. Profesor podkreśla potencjał wykorzystania SC z krwi pępowinowej w autoprzeszczepach i terapii medycznej, lecz nie do końca zgadza się z polityką komercyjnych banków krwi [7]. Innym Znanym naukowcem opisywanym przez Pilonis w tym samym artykule jest Profesor Ryszard Poręba, prezes Polskiego Towarzystwa Ginekologii. Stoi on na stanowisku, że zainteresowane kobiety spodziewające się dzieci, które pytają o bankowanie krwi, powinny mieć dostęp do wszelkich sprawdzonych i rzetelnych informacji na ten temat [7]. Profesor Jędrzejczak sam dokonał przeszczepu komórek macierzystych choremu na białaczkę i nie jest wrogiem jego stosowania, zwłaszcza że bardzo często trudno jest znaleźć dawcę szpiku [7]. Pilonis przytacza słowa Jędrzejczaka – Wykonano już kilka tysięcy takich przeszczepień i połowa z nich się powiodła. Chodzi jednak o krew innego dziecka, a nie krew samego chorego. W 1/4 przypadków bowiem we krwi pępowinowej już znajdują się komórki nowotworowe, mimo że nie ma klinicznych objawów białaczki. Poza tym, wskutek reakcji przeszczepu przeciw nowotworowi, obca krew daje lepszy 69 Anna Posmysz efekt terapeutyczny. Prowadzi się wiele prac badawczych dotyczących wykorzystania komórek macierzystych do odbudowy uszkodzonych tkanek. Nie są to jednak nawet badania kliniczne, nie mówiąc o wykorzystywaniu tej technologii jako metody leczenia. Wyniki wykonanych dotąd pojedynczych przeszczepów autologicznych krwi pępowinowej nie zostały udokumentowane w czasopismach naukowych. Opisane zostało w 2007 r. tylko 1 udane przeszczepienie autologiczne, ale w przypadku ostrej białaczki limfoblastycznej, co oznacza, że może nastąpić jej nawrót – komentuje Jędrzejczak [7]. Pilonis stwierdza, że wszyscy znani jej eksperci są zgodni, że krew pępowinowa w przeszczepach allogenicznych może uratować życie pacjentom, dla których nie można znaleźć odpowiedniego dawcy szpiku. Dotyczy to około 40% chorych [7]. Profesor Jędrzejczak zaznacza, że całe piękno krwi pępowinowej tkwi w tym, że zgodność cech może wynosić 4 na 6, podczas gdy do przeszczepu szpiku konieczne jest 9 na 10. Ponadto, jest ona dostępna błyskawicznie, a dawcy szpiku się szuka, co trwa często długo [7]. Polskie Ministerstwo Zdrowia nie stosuje specjalnych działań promujących bankowanie krwi pępowinowej ani nie finansuje takich zabiegów, gdyż uważa, że potrzeba znacznie więcej badań naukowych na ten temat [7]. Jednocześnie daje wolność obywatelom w tym temacie, więc mogą oni swobodnie zawierać transakcje komercyjne [7]. 12 października 2010 roku został przyjęty przez Radę Ministrów tzw. Program Wieloletni: Narodowy Program Rozwoju Medycyny Transplantacyjnej na lata 2011-2020. W programie tym przewidziany jest rozwój allogenicznego bankowania komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej w celach publicznych [7]. 3. Naukowe uzasadnienie bankowania krwi pępowinowej i jej zastosowania w terapii medycznej 3.1. Badania chińskich naukowców dotyczące leczenia SAA Lin Na Xie i Fang Zhou z Chin przeprowadzili eksperyment, w który zaangażowali pacjentów chorych na ciężką niedokrwistość aplastyczną (SAA). Wszystko przebiegało za zgodą pacjentów i odpowiednich komisji bioetycznych. Pacjentów z ciężką postacią SAA poddawali zwiększonemu leczeniu immunosupresyjnemu (IST). Następnie dokonywali transfuzji krwi pępowinowej (UCB). W rezultacie wykazali oni wysoką wydajność leczenia SAA przy pomocy transfuzji krwi pępowinowej, a także dowiedli niskiego ryzyka nawrotów tej choroby. Wspomagane leczenie immunosupresyjne jakie zastosowali to nic innego jak popularny cyklofosfamid w niskich dawkach i tzw. antymiocytowe globuliny [8]. Innym, równie ciekawym i spektakularnym eksperymentem tego zespołu naukowego było badanie przeprowadzone na dwóch pacjentach z SAA. 70 Zastosowanie krwi pępowinowej w medycynie czyli o możliwościach terapeutycznych komórek macierzystych pobranych z krwi pępowinowej Tym razem także zaaplikowali chorym leczenie IST i przetoczyli krew pępowinową. Badacze skupili się na obserwacji oznak powikłania nazywanego powszechnie przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD). Badanie trwało dwa lata i przez ten dwuletni okres obserwacji nie zauważyli objawów GVHD. Nie było także żadnych nawrotów [8]. 3.2. Eksperymenty z MSC Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) po raz pierwszy zidentyfikowano w szpiku kostnym [9]. Wykazano, że MSC mogą działać przeciwzapalnie i immunoregulująco oraz naprawczo w uszkodzeniach płuc i chorobach serca [10]. Szpik kostny (BM) to główne źródło MSC. Niestety, liczne badania wykazały, że wraz z wiekiem obniża się liczba MSC w szpiku, a pobór tych komórek ze szpiku kostnego jest inwazyjny [10, 11]. W 2004 roku naukowiec Wang wraz ze swoim zespołem, wykazali, że ludzka krew pępowinowa (UCB) jest bogata w MSC [12]. Te komórki posiadały charakterystyczne dla MSC markery i tak samo jak MSC z innych tkanek i z BM były zdolne do indukcji różnicowania. Aktualnie komórki macierzyste MSC są stosowane na szeroka skalę w modelowaniu doświadczalnym przeróżnych chorób np. neurodegeneracyjnych, urazów rdzenia kręgowego, uszkodzenia płuc, nadciśnienia płucnego i innych [13, 14]. Próbowano użyć MSCs indukowanych z krwi pępowinowej w celu leczenia stanów przedrzucawkowych u ciężarnych [15]. W tym celu ludzkie pępowiny pozbierano ze szpitali położniczych. Wszystko odbywało się wg odpowiednich procedur etycznych i za zgodą komisji bioetycznej na te badania oraz za zgodą pisemną darczyńców. Następnie pępowiny były cięte na kawałki o grubości 3 mm i przenoszone na odpowiednio przygotowane pożywki, które w swym składzie zawierały 10 % płodowej surowicy bydlęcej (FBS), penicylinę oraz streptomycynę. Następnie tkanki były umieszczane w specjalnej mieszaninie z hialuronidazy, kolagenazy i dyspazy w temperaturze 37 stopni. Potem następowało odwirowywanie i umieszczenie w pożywce, a następnie komórki trawiono trypsyna i pasażowano. Komórki od piątej do ósmej generacji poddano cytometrii przepływowej w celu identyfikacji i wykorzystano je do indukcji oraz transplantacji. Badacze w opisywanym doświadczeniu przeprowadzili różnicowanie osteogenne i adipogenne, używając do tego odpowiednich pożywek. I tak do osteogenezy używano pożywki DMEM – F12, którą odpowiednio zmodyfikowano poprzez uzupełnienie 10% PBS i innymi substancjami. Natomiast do adipogenezy użyto pożywki DMF, także zmodyfikowanej. Wykonano również próbę kontrolną. Po upływie niecałych 4 tygodni zauważono, że komórki macierzyste z krwi pępowinowej uległy zarówno 71 Anna Posmysz osteogenezie, jak i adipogenzie. Zauważono złogi wapnia w osteocytach oraz wakuole z lipidami w adipocytach. Dodatkowo wykonywano odpowiednie barwienie indukowanych adipocytów poprzez zastosowanie tzw. oil red O, natomiast osteocyty wybarwiono czerwienią alizarynową. Dzięki cytometrii przepływowej autorzy określili obecność bądź brak fenotypowych antygenów powierzchniowych charakterystycznych dla MSC. Wykazali także przydatną rolę MSC w leczeniu stanów przedrzucawkowych [15]. Tab. nr 2. Zestawienie antygenów powierzchniowych w komórkach wyhodowanych w doświadczeniu aCD105 Antygeny powierzchniowe, których nie wykryto CD19 CD73 CD45 CD90 CD11b Antygeny powierzchniowe obecne HLA-DR CD34 Źródło: wyniki Fu L, Liu Y, Zhang D, Xie J, Guan H, Shang T [15] 3.3. 3.3 Badania kliniczne W Korei wykorzystano krew pępowinową do wykonania doświadczenia transplantacji komórek macierzystych z krwi pępowinowej i terapii komórkowej w leczeniu schorzeń u ludzi [16]. W swoim artykule badacz Young-Ho Lee podaje, że w Korei pobieranie i gromadzenie krwi pępowinowej jest regulowane przez odpowiednie ustawy i wytyczne. Zebrana krew pępowinowa (CB) jest poddawana obróbce tzn. wirowaniu w specjalnym, sterylnym urządzeniu [8]. Tak jak i na całym świecie, w Korei istnieją banki krwi pępowinowej publiczne i prywatne. Badacze stwierdzają, że CB jest dobrym źródłem do terapii komórkowej pacjentów cierpiących na różne jednostki chorobowe. Wskazują jednocześnie, że pomimo coraz większej ilości banków prywatnych i publicznych, wskaźnik wykorzystania CB pozostaje wciąż niski. Naukowiec na podstawie analizy różnych publikacji stwierdził, że krew pępowinowa może być źródłem komórek macierzystych używanych dla ratowania życia i pomaga ona w regeneracji różnych tkanek. Uważa jednocześnie, że istnieje potrzeba prowadzenia dalszych badań i informuje, że krew pępowinowa jest bankowana na całym świecie w prywatnych bankach krwi, a stosowanie komórek krwi z pępowiny, która właściwie stanowi odpad medyczny, jest jak najbardziej etyczne. Poniżej zamieszczono schemat 72 Zastosowanie krwi pępowinowej w medycynie czyli o możliwościach terapeutycznych komórek macierzystych pobranych z krwi pępowinowej z publikacji Young-Ho Lee, który w klarowny sposób ilustruje możliwości zastosowania krwi pępowinowej w medycynie [16]. Rys. 2. Możliwości różnicowania HSC i MSC znajdujących się w krwi pępowinowej Źródło: Clinical utilization of cord blood over human health: experience of stem cell transplantation and cell therapy using cord blood in Korea [16] 3.4. Polskie jednostki badawcze Polscy naukowcy wyhodowali ludzkie komórki nerwowe z krwi pępowinowej w 2002 roku. Wyhodowano trzy różne typy komórek nerwowych wchodzących w skład ludzkiego mózgu. Mogą się one okazać przydatne w leczeniu uszkodzeń powstałych po udarze oraz w chorobie Parkinsona. Dokonał tego zespół badaczy w składzie: Leonora Bużańska, Barbara Zabłocka, Krystyna Domańska-Janik z Centrum Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN w Warszawie oraz Eugeniusz Machaj, Zygmunt Pojda z Zakładu Hematologii Eksperymentalnej Centrum Onkologii w Warszawie [17, 18]. 4. Podsumowanie Badania kliniczne prowadzone na całym świecie, również w Polsce, potwierdzają zasadność bankowania krwi pępowinowej. Krew ta wraz z pępowiną stanowi tzw. odpad medyczny. Należałoby informować zainteresowane osoby o korzyściach płynących z bankowania krwi pępowinowej i możliwościach jej wykorzystania w przyszłości. Aktualnie za pomocą terapii komórkami macierzystymi leczy się kilkadziesiąt jednostek chorobowych. Wśród nich są nowotwory takie jak np. białaczka, rak piersi i nerki. Choroby neurodegeneracyjne, cukrzycę, 73 Anna Posmysz choroby krwi, zaburzenia układu odpornościowego i wiele chorób uwarunkowanych genetycznie także leczy się przy użyciu komórek macierzystych. Planuje się dalsze badania naukowe nad zastosowaniem komórek macierzystych z krwi pępowinowej np. w leczeniu choroby Parkinsona czy Alzheimera. Istnieje potrzeba informowania społeczeństwa o możliwościach wykorzystania krwi pępowinowej w przyszłości, jednakże nie powinny to być informacje przejaskrawione oraz niesprawdzone lecz takie, które opierają się na badaniach naukowych. Literatura 1. Klimanskaya I, Chung Y, Becker S, Lu S. J, Lanza R, 2006, Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres, Nature 444: 481485 2. Tsonis P. A. 2002, Regenerative biology: the emerging field of tissue repair and restoration, Differentation 70: 397-409 3. Jezierska-Woźniak K, Nosarzewska D, Tutas A, Mikołajczyk A, Okliński M, Jurkowski K.,2010, Wykorzystanie tkanki tłuszczowej jako źródła mezenchymalnych komórek macierzystych, Postepy Hig Med Dosw, 64:326-32 4. Nilson S. K, Simons P. J., 2004, Transplantable stem cells: home to specific niches.Curr Opin Hmatol, 11: 102-106 5. Li L., Xie T., 2005, Stem cell niche: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol, 21: 605-631 6. Cohen Y., Nagler A., 2004, Umbilical cord blood transplantation--how, when and for whom? Blood Rev, Sep;18(3):167-79 7. Pilonis H., 2010, Pępowinowy marketing. Służba Zdrowia, e-book nr 93-100, 13 grudzień 8. Xie L. N., Zhou F., 2015, Unexpected unrelated umbilical cord blood stem cell engraft in two patients with severe aplastic anemia that received immunosuppressive treatment: A case report and literature review, Department of Hematology, The General Hospital of Jinan Military, Jinan, Shandong 250031, P.R. China 9. Friedenstein A. J, Piatetzky-Shapiro II, Petrakova K. V., Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. 1966. J Embryol Exp Morphol 16:381-390 10. Mueller S. M., Glowacki J., 2001, Age-related decline in the osteogenic potential of human bone marrow cells cultured in three-dimensional collagen sponges, J Cell Biochem 82:583-590. doi: 10.1002/jcb.1174 11. Kode J. A., Mukherjee S., Joglekar M. V., Hardikar A. A., 2009, Mesenchymal stem cells: Immunobiology and role in immunomodulation and tissue regeneration, Cytotherapy 11:377-391. doi: 10.1080/14653240903080367 12. Wang H. S., Hung S. C., Peng S. T., et al., 2004, Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord, Stem Cells 22:1330-1337. doi: 10.1634/stemcells.2004-0013 74 Zastosowanie krwi pępowinowej w medycynie czyli o możliwościach terapeutycznych komórek macierzystych pobranych z krwi pępowinowej 13. Pullamsetti S. S, Schermuly R., Ghofrani A., et al., 2014, Novel and emerging therapies for pulmonary hypertension, Am J Respir Crit Care Med 189:394400. doi: 10.1164/rccm.201308-1543PP 14. Moodley Y., Atienza D., Manuelpillai U., et al., Human umbilical cord mesenchymal stem cells reduce fibrosis of bleomycin-induced lung injury, Am J Pathol. 2009;175:303-313. doi: 10.2353/ajpath.2009.080629 15. Fu L., Liu Y., Zhang D., Xie J., Guan H., Shang T., 2015, Beneficial effect of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on an endotoxininduced rat model of preeclampsia, Exp Ther Med Nov;10(5):1851-1856. Epub 2015 Sep 11 16. Lee Y.-H., 2014, Clinical utilization of cord blood over human health: experience of stem cell transplantation and cell therapy using cord blood in Korea, Korean J Pediatr Mar; 57(3): 110-116. Published online 2014 Mar 31. doi: 10.3345/kjp.2014.57.3.110 17. Bużańska L., Zychowicz M., Sarnowska A., Domańska-Janik K., 2013, Bioengineering of neural stem cell niche, Postępy Biochem 59 (2): 175-86 Rev. Polish 18. Grabowska I., Streminska W., Janczyk-Ilach K., Machaj E. K., Pojda Z., Hoser G., Kawiak J., Moraczewski J., Ciemerych M. A., Brzoska E., 2013, Myogenic potential of mesenchymal stem cells – the case of adhesive fraction of human umbilical cord blood cells. Curr Stem Cell Res Ther Jan; 8(1): 82-90 Zastosowanie krwi pępowinowej w medycynie czyli o możliwościach terapeutycznych komórek macierzystych pobranych z krwi pępowinowej Dokonano przeglądu najnowszych badań dotyczących użycia komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej. W tym celu posłużono się bazą PubMed oraz informacjami podawanymi przez Polską Akademię Nauk. Istnieją badania naukowe, które dowodzą, że przeszczepy komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej są bardzo bezpieczne i prawie nigdy nie atakują komórek biorcy – nawet przy braku pokrewieństwa między biorcą i dawcą. Komórki macierzyste z krwi pępowinowej nie są nośnikami chorób. Ponadto, pozyskanie ich z krwi pępowinowej nie wiąże się z ryzykiem ani dla płodu ani dla matki. Przemawia to za bezpieczeństwem ich stosowania i daje im przewagę nad komórkami macierzystymi uzyskiwanymi z innych źródeł. Zespoły naukowe na całym świecie badają skuteczność terapii z zastosowaniem komórek macierzystych krwi pępowinowej. Przykładowo, badacze z Chin wielokrotnie potwierdzili skuteczność leczenia chorych z ciężką niedokrwistością aplastyczną. Inny zespół zastosował te komórki w leczeniu stanów przedrzucawkowych u ciężarnych. W Polsce również bada się możliwości terapeutyczne komórek macierzystych z krwi pępowinowej. Komórki macierzyste są pomocne w terapii wielu chorób np. cukrzycy, białaczki, nowotworów i chorób neurodegeneracyjnych. Ponieważ krew pępowinowa jest odpadem medycznym, warto rozważać jej zdeponowanie w tzw. bankach krwi pępowinowej, gdyż w przyszłości może zostać ona wykorzystana do leczenia. 75 Anna Posmysz Application of umbilical cord blood in medicine – therapeutic possibilities of stem cells derived from umbilical cord blood We made a review of recent studies on the use of stem cells derived from umbilical cord blood. For this purpose, the PubMed database and some information given by The Polish Academy of Science were used. There are many scientific publications, which show that transplants of stem cells derived from umbilical cord blood are very safe, also almost never attack the recipients’ cells, even in the absence of consanguinity between the recipient and the donor. Stem cells from umbilical cord blood are not disease vehicles. Moreover, their acquisition from umbilical cord blood is associated neither with problems for child nor for mother. That facts speaks in favor of the safety of the usage of stem cells and gives them an advantage over stem cells derived from other sources. Scientific teams all over the world are studying the efficacy of therapy with the use of stem cells from umbilical cord blood. For example, researchers from China have repeatedly confirmed the effectiveness of the treatment of patients with severe aplastic anemia. Another team, applied these cells in the treatment of pre-eclampsia in pregnant women. In Poland, the therapeutic possibilities of stem cells from umbilical cord blood are also tested. Stem cells are helpful in therapy of many diseases, for example: diabetes, leukemia, cancer and neurodegenerative diseases. Because cord blood is a medical waste, its deposit should be considered in the so called umbilical cord blood banks, because it may be used in the future for medical therapy. 76 Małgorzata Waldowska1, Wioleta Kowalska2, Justyna Woś3 Fenotypowe i funkcjonalne zróżnicowanie populacji komórek NKT 1. Wstęp Komórki NKT (naturalkiller T cells)stanowią niewielką subpopulację limfocytów T. Pomimo swojej małej liczebności, odgrywają istotną rolę w regulacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, pojawiając się jako jedne z pierwszych w miejscu infekcji czy zapalenia [1]. W wyniku odpowiedniej stymulacji antygenem, limfocyty te potrafią szybko uwalniać cytokiny i wpływać na funkcje komórek dendrytycznych, komórek NK (naturalkillers), limfocytów B, a także limfocytów T CD4+ i CD8+, determinując kierunek i jakość odpowiedzi nabytej [2, 3]. Nazwa tej populacji limfocytów nawiązuje do pierwotnie zaobserwowanej, jednoczesnej ekspresji pewnych markerów charakterystycznych dla komórek NK oraz limfocytów T. Podobnie jak inne subpopulacje limfocytów T, komórki NKT posiadają na swojej powierzchni receptory TCR (T cell receptor). Umożliwiają one konwencjonalnym limfocytom Trozpoznawanie antygenów peptydowych związanych z cząsteczkami MHC klasy I lub II, zaśkomórkom NKT warunkują odpowiedz wobec własnych i obcych antygenów o charakterze lipidowym i glikolipidowym [4, 5].Cechy współdzielone z komórkami NK to obecność typowych dla nich receptorów, zwłaszcza CD161 (u myszy CD161c znany jako NK1.1) [6, 7], a także zdolność do udziału w bezpośredniej odpowiedzi cytotoksycznej poprzez wytwarzanie perforyny i granzymów [7]. W świetle aktualnej wiedzy, powyższa definicja komórek NKT zdaje się być niewystarczająca i niepełna. Obecnie uznaje się, iż ekspresja wspomnianych markerów komórek NK nie jest warunkiem koniecznym do określenia komórek jako NKT [4]. Wszakże wiele konwencjonalnych limfocytów T zwiększa ekspresję tych markerów (włączając CD161/NK1.1) przy aktywacji. Pewna część komórek NKT w ogóle nie wykazuje ich obecności na swojej powierzchni [7, 8], podczas gdy na innych ich ekspresja ulega 1 [email protected], Katedra i Zakład immunologii Klinicznej, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl, 2 [email protected], Katedra i Zakład immunologii Klinicznej, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 3 [email protected], Katedra i Zakład Immunologii Klinicznej, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 77 Małgorzata Waldowska, Wioleta Kowalska, Justyna Woś zmianom w zależności od stopnia dojrzałości, aktywacji, a u myszy również podłoża genetycznego [9, 10]. Sięgając 25 lat wstecz do początkowych doniesień dotyczących limfocytów T rozpoznających lipidy [11‚13], wiedza na temat biologii i właściwości komórek NKT uległa znacznemu pogłębieniu. Dlatego konieczne stało się uaktualnienie i uporządkowanieich nomenklatury. Przedstawiona w niniejszym artykule klasyfikacja komórek NKT opiera się na rodzaju używanych łańcuchów TCR, a także rodzaju cząsteczki prezentującej rozpoznawane antygeny.Biorąc pod uwagę powyższe kryteria, wśród komórek NKT wyróżniamy trzysubpopulacje przedstawione w tabeli 1. Dwie pierwsze subpopulacje posiadają ‘kanoniczne’ receptory TCR i rozpoznają antygeny prezentowane przez niepolimorficzne cząsteczki MHC klasy I- podobne. Z historycznego punktu widzenia, termin kanoniczny lub niezmienny TCR odnosi się do komórek NKT, które posiadają łańcuch Vα24Jα18 u ludzi (Vα14Jα18 u myszy).Stąd takie komórki NKT określa się jako invariant NKT (iNKT) [14, 15]. Udowodniono, że rozpoznają one antygeny prezentowane przez cząsteczki CD1d [16].Na łamach Science, w 1995 roku ukazała się praca o odkryciu nowego genu powiązanego z cząsteczką MHC, MR1 [17]. Dopiero w 2003 roku zidentyfikowano grupę komórek, która wiąże się ze wspomnianymi cząsteczkami. Nazwano jemNKT lubkomórkami MAIT (mucosa-associated invariant T cells) [13]. Podobnie jakiNKT, ich receptory TCR są częściowo niezmienne; zawierają łańcuch Vα19 połączony z Jα33 segmentem u ludzi (Vα7.2Jα33 u myszy) [18, 19]. Zatem iNKT oraz mNKT można zakwalifikować do grupycanonicalcNKT. Trzecia grupa komórek NKT, określana jako variant NKT (vNKT), obejmuje limfocyty T CD1d-reaktywne, ale korzystające z heterogennego kanonu łańcuchów tworzących receptory TCR. 2. Komórki cNKT 2.1. KomórkiiNKT Najlepiej poznaną grupą limfocytów NKT są komórki typu I, znane również jako invariant NKT [20]. Lepsze zrozumienie biologii tych komórek stało się możliwe dzięki odkryciu przez zespół Kawano w 1997 roku αgalaktozyloceramidu (α-GalCer) [14].Ten syntetyczny glikolipid otrzymywany z gąbek morskich Agelasmauritianus, efektywnie aktywuje komórki iNKT. Tak jak inne antygeny lipidowe czyglikolipidowe, α-GalCer wiążesię z cząsteczkami CD1d (niepolimorficznymi glikoproteinami strukturalnie podobnymi do MHC) [21], które są obecne w zwiększonej ilości na powierzchni komórek APC, takich jak komórki dendrytyczne [22].Dopiero tak utworzone kompleksy są rozpoznawane przezniezmienne receptory TCR 78 Fenotypowe i funkcjonalne zróżnicowanie populacji komórek NKT zarównomysich, jak i ludzkich komórekiNKT [23]. Zastosowanie kompleksów CD1d/α-GalCer związanych z odpowiednim fluorochromem stanowi dobrą metodę identyfikacji komórek iNKT [24]. Komórki NKT typu I używają ograniczonej puli genów do rearanżacji swoich receptorów TCR. Ich wyjątkowy receptor TCR składa się z łańcuchaα (Vα24Jα18 u ludzi, Vα14Jα18 u myszy) powiązanego z łańcuchem β (Vβ11 u ludzi, Vβ8.2, Vβ7, Vβ2 u myszy) [9, 25]. Kolejną typową cechą tej populacji komórek jest ekspresja markerów,które współdzielą z komórkami NK, np. CD161 u ludzi (NK1.1 homologicznie u myszy) [26] [Tabela 1]. Właściwie większość limfocytów T NK1.1+ u myszy C57BL/6 stanowią omawianą subpopulację komórek NKT [8, 27], podczas gdy u ludzi, subpopulacja komórek Vα24/Vβ11 stanowi mniejszość spośródodsetka limfocytów T CD161+ [28]. Należy zaznaczyć, że większość komórek NKTopuszczając grasicę nie posiada markera NK1.1 na swojej powierzchni. Zyskują go dopiero na obwodzie, stając się wówczas w pełni dojrzałe [29]. Komórki iNKT zdają się być wysoce autoreaktywne nawet w stanie spoczynku; wykazują fenotyp komórek aktywowanych/pamięciz obecnością na swojej powierzchni charakterystycznych markerów aktywacji: CD69, CD44, CD122, oraz w mniejszym stopniu CD62L – markera komórek dziewiczych, które przemieszczają się do węzłów chłonnych [30]. Obecność koreceptorów CD4 i CD8 na powierzchni limfocytówiNKT, dzieli je na komórki CD4+CD8-występujące w znacznej większości (90% u myszy), i pozostałe CD4-CD8-doublenegative(DN). Zaobserwowano, iż tylko u ludzi występuje dodatkowo subpopulacja CD4-CD8+(CD8αα+ i CD8αβ+)[7, 31]. Zarówno CD4+ jak i CD4- iNKTsą odnajdywane u miejscach występowania innych limfocytów T, jednakże częstość ich występowania waha się znacznie w różnych tkankach. Najliczniej mysie komórki Vα14Jα18NKT zasiedlają wątrobę (10-40% limfocytów wątroby), natomiast są również obecne w szpiku kostnym, płucach, tarczycy, śledzionie, węzłach chłonnych, jelitach, czy we krwi obwodowej [27, 32].U ludzi,dystrybucja komórek Vα24Jα18 NKT w tkankach zdaje się być podobna jak u myszy. Jednakczęstośćich występowania u ludzi jest znacznie obniżona, choć odnotowuje się znaczne różnice osobnicze. Badania zespołu Kenna wykazały, że ludzka wątroba zawiera wyraźnie mniej komórek Vα24Jα18 (<1%), w porównaniu z tą samą tkanką u myszy [33]. Komórki iNKT stanowią 0,01-0,1% ludzkich komórek mononuklearnych krwi obwodowej, chociaż u pewnych osób obserwowano wartości przewyższające 3% [34, 35]. Ta szczególna populacja limfocytów T, mimo korzystania z ograniczonego repertuaru receptorów TCR, wykazuje szeroki i zróżnicowany zakres działania. Uważa się, iż komórki NKT typu I odgrywają kluczową rolę w rozwoju miejscowej i uogólnionej odpowiedzi immunologicznej. Potrafią modulować reakcje organizmu w wielu schorzeniach obejmu79 Małgorzata Waldowska, Wioleta Kowalska, Justyna Woś jących nowotwory, choroby autoimmunizacyjne, infekcje czy alergie [36‚40]. Za pomocą swoich receptorów TCR, rozpoznają one antygeny lipidowe zarówno prawidłowych komórek naszego organizmu, jak i antygeny drobnoustrojów i komórek nowotworowych [14, 41, 42]. Stymulując komórki iNKT antygenem (α-GalCer), zauważono gwałtowny (w ciągu kilku godzin) wzrost produkcji IL-4 i IFN-γ [9]. Późniejsze badania wykazały, że tak szybkie uwalnianie wspomnianych cytokin, które nota bene stały się znakiem rozpoznawczym komórek iNKT, jest związane ze stałą ekspresją mRNA [43]. Jednak to nie jedyne cytokinyprodukowane przez komórki iNKT. Dotychczas udowodniono uwalnianie przez nie również IL-2, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, IL-21, czynnika martwicy nowotworów (TNF),transformującego czynnika wzrostu β(TGFβ), czychemokin, takich jak białko zapalne makrofagów (MIP-1α) czy RANTES. Komórki iNKT są także źródłem hematopoetycznych czynników wzrostu, np. czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) [9, 44, 45].Wśród wymienionych cytokin znajdują się te charakterystyczne dla limfocytów Th1, jak i Th2 [14]. Zatem paradoksalnie komórki iNKT mogą uczestniczyć zarówno w reakcjach prozapalnych jak i przeciwzapalnych [8]. Uwolnione cytokiny wpływają na szereg komórek uczestniczących w odpowiedzi immunologicznej: komórki dendrytyczne, neutrofile, makrofagi, limfocyty Tγδ, konwencjonalne komórki T, limfocyty B, komórki NK, czy komórki NKT typu II. Rola immunoregulacyjna komórek iNKT wydaje się być kluczową dla ich działania [46]. Wielokierunkowy wpływ tej niezwykłej populacji limfocytów T, próbuje się tłumaczyć istnieniem subpopulacji, różnych pod kątem funkcjonalnym i fenotypowym. 2.1.1. Zróżnicowanie komórekiNKT Ludzkie komórki CD4+ i CD4-iNKTcharakteryzują się różnym profilem wydzielanych cytokin. DN oraz CD8+CD4- są fenotypowo i funkcjonalnie zbliżone, wykazując dominującą składową typu Th1 (IFN-γ) wśród uwalnianych cytokin, podczas gdy komórki CD4+ generują zarówno cytokiny typu Th1, jak i Th2 (IFN-γ, TNF, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13) [47]. Funkcjonalne różnice pomiędzy subpopulacjami CD4+ i DN iNKT u myszy rysują się mniej wyraźnie [48]. W literaturze znajdują się doniesienia o lokalizacji komórek NKT CD4+ o profilu typu Th2 w płucach i ich potencjalnej roli w rozwoju astmy [49]. Ponieważ komórki iNKT zasiedlające różne tkanki i narządy, mogą wykazywać różnice w ekspresji markerów powierzchniowych i profilu wydzielanych cytokin, trudno jest jednoznacznie określić ich funkcje. Zgodnie z wynikami opublikowanymi w 2003 roku przez Crowe’a i współpracownikówna modelu mysim, 80 Fenotypowe i funkcjonalne zróżnicowanie populacji komórek NKT komórki CD4- NKT wątroby promują odrzucanie nowotworu, natomiast inne subpopulacje komórek NKT wywodzące się z tarczycy, śledziony, czy komórki CD4+ NKT wątrobynie wykazują podobnych właściwości ochronnych [50]. Według Kenna i współpracowników, komórki Vα24Jα11 pochodzące z ludzkiej wątroby są źródłem cytokin typu Th1 (IFN i TNF), ale nie Th2 (IL-4). Wykazali oni także znaczne obniżenie ilości tych komórek u pacjentów z nowotworem wątroby, co sugeruje ich potencjalne działanie przeciwnowotworowe in vivo [33]. W oparciu o preferencję do produkcji poszczególnych cytokin oraz ekspresję określonych czynników transkrypcyjnych, komórki iNKT zostały podzielone na subpopulacje, które przywodzą na myśl podział obserwowany wśród konwencjonalnych limfocytów T. Odnosi się to zwłaszcza do komórek NKT1, NKT2 i NKT17, wykazujących ekspresję czynników transkrypcyjnych regulujących linie limfocytów Th1, Th2 oraz Th17 (odpowiednio T-bet, GATA3 i RORγt) [9, 51] [Rys.1]. Wymienione subpopulacje powstają naturalnie i znajdują się w grasicy. Dodatkowe subpopulacje NKTfh oraz FoxP3+iNKT, różnicują się pod wpływem ekspozycji na antygen[44, 45, 52]. Niedawno odkryto również komórki iNKT obdarzone funkcją regulatorową, nazwane komórkami NKT10 [53, 54] [Rys.1]. Wobec takich doniesień, zamiast klasycznego modelu ‘0-1-2-3’ rozwoju komórek iNKT opartego na ekspresji markerów powierzchniowych, zaproponowano alternatywny model różnicowania ich linii, uwzględniający ekspresję czynników transkrypcyjnych. Zaobserwowano, iż komórki Tbethigh NKT1 są zdolne do produkcji dużych ilości IFN-γ, kluczowego dla ich zaangażowania w odpowiedź przeciwwirusową czy przeciwnowotworową [51]. Stanowią dominującą subpopulację komórek iNKT wątroby i śledziony modelu C57BL/6 myszy [55]. Subpopulacje GATA3high NKT2 i RORγt+ NKT17 są rzadkie w modelu B6 myszy, ale dominują w innych szczepach [56]. NKT2 przeważają w płucach; zdają się odgrywać istotną rolę w schorzeniach, których patogeneza związana jest z przewagą limfocytów typu Th2 poprzez wydzielane cytokiny: IL-4, IL-9, IL-10 czy IL-13 [52]. Aktualnie duże zainteresowanie wzbudzają komórki NKT17, będące źródłem IL-17A. Cytokina ta posiada silne właściwości prozapalne, indukując uwalnianie IL-6 oraz TNF-α; rekrutuje także neutrofile do miejsca rozwijającej się reakcji zapalnej.Komórki NKT17 są przede wszystkim odnajdywane w obwodowych węzłach chłonnych, skórze i płucach [44, 45]. Zaobserwowano również występowanie komórek iNKT z ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3+, które zachowują się podobnie do regulatorowych limfocytów T, hamując proliferację innych limfocytów T [57].Dwie prace, opublikowane w Nature Immunology [58] oraz w Journal of Immunology [59] w 2012 roku wskazują na niewielką subpopulację komórek iNKT, która tworzy stabilne i długotrwałeinterakcje 81 Małgorzata Waldowska, Wioleta Kowalska, Justyna Woś z limfocytami B i indukuje powstawanie wczesnych ośrodków rozmnażania. W realizacji tego celu, ludzkie i mysie komórki NKTfh wydzielają IL-21. Do ich powstania niezbędna jest ekspresja czynnika transkrypcyjnego Bcl-6 [58]. Niedawno pojawiły się również doniesienia o istnieniu komórek NKT10, wykazujących ekspresję czynnika E4BP4. Poprzez uwalnianie IL-10, subpopulacja ta może osłabiać odpowiedź przeciwnowotworową, a także chronić przed rozwojem chorób autoimmunologicznych (wykazano na mysim modelu stwardnienia rozsianego EAE – experimental autoimmune encephalomyelitis) [53, 54, 60]. 2.2. Komórki mNKT Druga populacja kanonicznych komórek NKT została znacznie słabiej poznana. Komórki mNKT (mucosal NKT), bo o nich mowa, wykazują ekspresję niezmiennego łańcucha α receptora TCR, wykorzystując najczęściej rearanżacjeVα19Jα33 (u myszy) lub Vα7.2Jα33 (u ludzi). Łańcuch ten jest sparowany z łańcuchem β, powstającym w wyniku rearanżacji ograniczonej puli genów (Vβ13, Vβ2 u ludzi, Vβ8.2, Vβ6 u myszy) [Tabela 1] [61, 62].Obserwacja, że komórki MAIT w ogóle nie występują w obwodowych tkankach myszy wolnych od zarazków, zasugerowała wpływ mikroflory na utrzymanie i rozwój tych komórek na obwodzie [13]. Chociaż preferencyjnie komórki te gromadzą się w błonach śluzowych jelit czy płuc [63], zlokalizowano je również we krwi, węzłach chłonnych, wątrobie, śledzionie czy szpiku kostnym [19, 61]. Stąd komórki mNKT zwykło się też nazywać komórkami MAIT (mucosal-associated invariant T cells). Komórki mNKT powstają w grasicy, gdzie podobnie do limfocytów iNKT, przechodzą selekcję pozytywną. Ten etapdojrzewania, wiąże się z ekspresjącząsteczek MR1 (MHC-related protein 1) [64]. W przeciwieństwie do komórek iNKT, komórki MAIT dojrzewają całkowicie dopiero na obwodzie,zyskując profil komórek pamięci i funkcje efektorowe [64, 65]. Udowodniono, iż myszy pozbawione ekspresji MR1 nie posiadają komórek MAIT [13]. MR1 stanowi niepolimorficzną cząsteczkę MHC klasy I, o wysokim stopniu homologii pomiędzy ludźmi a myszami [66]. Uważa się, że działa ona jako cząsteczka prezentująca antygeny [67]. Większość limfocytów mNKT jest podwójnie ujemnych (CD4-CD8-). Chociaż u myszy nie występują populacje CD8α+, niektóre komórki Vα7.2 NKT posiadają ekspresję CD8[ 61]. Komórki te wykazują również obecność markerów komórek NK, NK1.1 u myszy i CD161 u ludzi [19]. Podobnie jak iNKT, komórki mNKTsą zdolne do gwałtownego uwalniania różnych cytokin, takich jak IL-4, IL-5, IL-10, IL-17 czy IFN-γ [13, 19, 68]. Potrafią migrować do miejsc rozwoju reakcji zapalnej, gdzie 82 Fenotypowe i funkcjonalne zróżnicowanie populacji komórek NKT poprzez wspomniane cytokiny wpływają na jej przebieg. Zaobserwowano gromadzenie się ich w obrębie centralnego układu nerwowego oraz w płynie mózgowo-rdzeniowym u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym [69]. W 2006 roku ten sam zespół przedstawił wyniki dokumentujące ochronną rolę komórek Vα19Jα33 NKT w przebiegu EAE. Ich przewaga łagodziła chorobę, natomiast niedobór pogarszał [70]. W badaniach obserwowano również nasilenie aktywności komórek mNKT w odpowiedzi na zakażenia bakteryjne i grzybicze. Niewątpliwe znaczenie odgrywa tutaj ich preferencyjna lokalizacja w obrębie błon śluzowych [71, 72]. Jednak przez długi czas, identyfikacja konkretnych antygenów prezentowanych przez cząsteczki MR1, nastręczała trudności. Dopiero publikacja zespołu Kjer-Nielsen’az2012 roku, wskazująca na metabolity witaminy B2 pełniące rolę antygenów komórek MAIT, okazała się przełomową. Zaobserwowano, że drobnoustroje pozbawione możliwości produkowania ryboflawiny (np. Streptococcus pyogenes czy Enterococcus faecalis) nie indukują aktywacji komórek mNKT w sposób zależny od MR1 [73].Jako że stymulacja komórek mNKT może zachodzić również bez pośrednictwa TCR/MR1 poprzez IL-12 oraz IL-18, zakłada się immunoregulatorowe działanie komórek mNKT również wobec bakterii i wirusów niesyntetyzujących ryboflawiny [74]. 3. NKT typ II Komórki NKT typu II należą do CD1d-zależnych limfocytów T, jednak w odróżnieniu od komórek typu I, nie odpowiadają na α-GalCer. Dlatego bliższe poznanie tej subpopulacji stało się znacznie trudniejsze w porównaniu z iNKT. Ostatnie badania ukazują reaktywność tych komórek wobec sulfatydu. Jednak zastosowanie tetrametrów sulfatyd/CD1d do identyfikacji komórek NKT typu II nie jest powszechne, z uwagi na małą stabilność wspomnianych tetramerów i wysokie barwienie tła [75].Wiedza zdobywana o tych komórkach, opiera się przede wszystkim na badaniachprowadzonych na mysich modelach modyfikowanych genetycznie. Myszy CD1d-nie posiadają komórek NKT typu I i II, podczas gdy myszy Jα18-mają jedynie NKT typu I [76]. Informacja o istnieniu omawianej populacji pojawiła się w literaturze po raz pierwszy w 1995 roku [77], charakteryzując ją jako nieposiadającą ekspresji niezmiennego łańcucha Vα14Jα18. Repertuar receptorów TCR z których korzystają komórki NKT typu II jest zróżnicowany, stąd nazywane są one także variant albo diverse NKT (vNKT lub dNKT) (Tabela 1). Należy zaznaczyć, żeniektóre subpopulacje mysich dNKTwykazujączęsto ekspresję Vα3.2Jα9 i Vα8 [78].Podobnie jak komórki NKT typu I, typ II obejmuje populacje NK1.1+ i NK1.1- [79].Wiele z nich wykazuje fenotyp komórek 83 Małgorzata Waldowska, Wioleta Kowalska, Justyna Woś aktywowanych lub pamięci z obecnością CD44high, CD69+, CD122+ na swojej powierzchni [80]. Wydaje się, że komórki NKT typu II reagują głównie z własnymi antygenami lipidowymi, choć mogą również rozpoznawać podobne strukturalnie lipidy pochodzące z mikroorganizmów.Rozpoznanie przez ich receptory TCR kompleksu ligand/CD1d, jest główną drogą prowadzącą do ich aktywacji. Komórki NKT typu I dodatkowo mogą być pobudzane cytokinami, obecnymi w podwyższonych stężeniach np. w czasie zapalenia [81]. Badania wykazały, że stymulacja komórek NKT typu II, prowadzi do produkcji szeregu cytokin, włącznie z IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, GM-CSF, a także perforyny. Cecha ta pozwala im pełnić funkcje immunoregulatorowe. Podobieństwa do komórek iNKT dotyczą także stałej ekspresji mRNA dla IL-4, autoreaktywności, czy ekspresji czynnika transkrypcji PLZF [82]. Ponadto, podobnie jak komórki NKT typu I, typ II może również posiadać funkcjonalnie różne subpopulacje, a zatem niezwykle ważne jest określenie korelacji stopnia funkcjonalnego zróżnicowania ze specyfiką rozpoznawanych antygenów [55]. 4. Rysunki Rysunek 1. Model subpopulacji wyodrębnionych w ramach komórek iNKT, uwzgledniający ekspresję odpowiednich czynników transkrypcyjnych i uwalniane cytokiny Źródło: Opracowanie własne na podstawie [51, 54] 84 Fenotypowe i funkcjonalne zróżnicowanie populacji komórek NKT 5. Tabele Tabela 1. Populacja komórek NKT i ich subpopulacje mNKT (Vα19i NKT, Vα7.2i NKT,lub komórki MAIT) iNKT (Vα14i NKT, Vα24iNKT, NKT typ I, lub klasyczne NKT) Komórki vNKT (NKT typ II,dNKT, lub nieklasyczne NKT) Vα19Jα33 (M) Vα14-Jα18 (M) Różne, niekiedy Vα8, Vα3.2Jα9 (M) Vα7.2Jα33 (H) Vα24-Jα18 (H) TCRα Różne (H) Vβ8.2, Vβ7, lub Vβ2 (M) Vβ8.1/8.2, Vβ6 (M) TCRβ Vβ13, Vβ2 (H) Różne, niekiedy Vβ8 (M) Vβ11 (H) Restrykcja MR1 CD1d CD1d Reaktywność αManCer αGalCer sulfatyd DN, CD4+ (M) CD4+, DN (M) DN, CD4+, CD8α+ (H) CD4+, DN, CD8α+ (H) NK1.1 (M) NK1.1 (M) CD161 (H) CD161 (H) Komórek aktywowanych/ pamięci Komórek aktywowanych/ pamięci Obecność koreceptorów Obecność receptora komórek NK Fenotyp na obwodzie CD4+, DN NK1.1 85 Komórek aktywowanych/ pamięci Małgorzata Waldowska, Wioleta Kowalska, Justyna Woś Lokalizacja w stanie spoczynku Śledziona, wątroba, tarczyca, szpik kostny, węzły chłonne, krew obwodowa, tk. tłuszczowa, skóra, błona śluzowa jelit i płuc Blaszka właściwa płuc, wątroba Wątroba, śledziona Źródło: Opracowanie własne na podstawie [13,55, 61, 68, 83] Skróty: cNKT (canonical natural killer T), iNKT (invariant NKT), mNKT (mucosal NKT), vNKT (variant NKT), dNKT (diverse NKT), MAIT (mucosal associated invariant T cells), DN (double negative), αManCer(αmannosylceramide), αGal-Cer (α-galactosylceramide), MHC (major histocompatibility complex), TCR (T cell antigen receptor) 6. Podsumowanie Komórki NKT stanowią niezwykłą populację limfocytów T, występującą zarówno u myszy, jak i u ludzi. Ich immunologiczny potencjał, pozwala patrzeć z optymizmem na wykorzystanie ich w przyszłości jako efektywnych narzędzi we wzmacnianiu odpowiedzi przeciwnowotworowej. Kroki, jakie zostały poczynione w sferze bliższego poznania populacji komórek NKT, pozwoliły na wyodrębnienie różnych subpopulacji tych komórek, przedstawionych w tej pracy. Niemniej niezbędne są dalsze badania, poświęcone głębszemu poznaniu subpopulacji komórek NKT typu I (NKT1, NKT2, NKT17, NKT10, NKTreg, NKTfh), komórek mNKT, czy NKT typu II, oraz ich interakcji z innymi komórkami naszego układu immunologicznego. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. Godfrey D. I., Hammond K. J., Poulton L. D., Smyth M. J., Baxter A. G., NKT cells: facts, functions and fallacies, Immunology Today, 21 (2000), s.573-583 Taniguchi M., Seino K., Nakayama T., The NKT cell system: bridging innate and acquired immunity, NatureImmunology, 4 (2003), s. 1164-1165 Kitamura H., Iwakabe K., Yahata T., Nishimura S., Ohta A., Ohmi Y., Sato M., Takeda K., Okumura K., Van Kaer L.,The natural killer T (NKT) cell ligand alpha-galactosylceramide demonstrates its immunopotentiating effect by inducing interleukin (IL)-12 production by dendritic cells and IL-12 receptor expression on NKTcells, The Journal of experimentalmedicine, 189 (1999), s.1121-1128 Terabe M., BerzofskyJ. A., The Role of NKT Cells in Tumor Immunity, Advances in cancer research, 101 (2008), s. 277-348 Beckman E. M., Porcelli S. A., Morita C. T., Behar S. M., Furlong S. T., Brenner M. B., Recognition of a lipid antigen by CD1-restricted alpha beta+ T cells, Nature, 372 (1994), s. 691-694. 86 Fenotypowe i funkcjonalne zróżnicowanie populacji komórek NKT 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. Bendelac A., Rivera M. N., Park S., Roark J. H., Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function, Annual Review of Immunology, 15 (1997), s. 535-562 Godfrey D. I., MacDonald H. R., Kronenberg M., Smyth M. J., Van Kaer L., NKT cells: what‘s in a name?, Nature Reviews Immunology, 4 (2004), s. 231-237 Godfrey D. I., Kronenberg M., Going both ways: Immune regulation via CD1d-dependent NKT cells, The Journal of Clinical Investigation, 114 (2004), s. 1379-1388 Matsuda J. L., Mallevaey T., Scott-Browne J., Gapin L., CD1d-restricted iNKT cells, the ―Swiss-Army knife‖ of the immune system, Current Opinion in Immunology, 20(2008), s. 358-368 Terabe M., Berzofsky J. A., NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis, Trends in Immunology, 28(2007), s. 491-496 Porcelli S., Brenner M. B., Greenstein J. L., Balk S. P., Terhorst C., Bleicher P. A., Recognition of cluster of differentiation 1 antigens by human CD4-CD8cytolytic T lymphocytes, Nature,341(1989), s. 447-50 Porcelli S., Morita C. T., Brenner M. B., CD1b restricts the response of human CD4-8- T lymphocytes to a microbial antigen, Nature,360 (1992), s. 593-597 Treiner E., Duban L., Bahram S., Radosavljevic M., Wanner V., Tilloy F., Affaticati P., Gilfillan S., Lantz O., Selection of evolutionarily conserved mucosal-associated invariant T cells by MR1,Nature, 422(2003), s. 164-9 Kawano T., Cui J., Koezuka Y., Toura I., Kaneko Y., Motoki K., Ueno H., Nakagawa R., Sato H., Kondo E., Koseki H., Taniguchiet M., CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides, Science, 278 (1997), s. 1626-1629 Dellabona P., Casorati G., Friedli B., Angman L., Sallusto F., Tunnacliffe A., Roosneek E., Lanzavecchia A., In vivo persistence of expanded clones specific for bacterial antigens within the human T cell receptor alpha/beta CD4-8subset, The Journal of Experimental Medicine, 177 (1993), s. 1763-1771 Bendelac A., Lantz O., Quimby M. E., Yewdell J. W., Bennink J. R., Brutkiewicz R. R., CD1 recognition by mouse NK1+ T lymphocytes, Science, 268 (1995), s. 863-865 Hashimoto K., Hirai M., Kurosawa Y., A gene outside the human MHC related to classical HLA class I genes, Science, 269 (1995), s. 693-695 Treiner E., Lantz O., CD1d- and MR1-restricted invariant T cells: of mice and men, Current Opinion in Immunology,18 (2006), s.519-526 Kawachi I., Maldonado J., Strader C., Gilfillan S., MR1-restricted Vα19i mucosal-associated invariant T cells are innate T cells in the gut lamina propria that provide a rapid and diverse cytokine response, The Journal of Immunology,176 (2006), s.1618-1627 Mallevaey T., Selvanantham T., Strategy of lipid recognition by invariant natural killer T cells: ‗one for all and all for one‘, Immunology, 136 (2012), s. 273-282 Porcelli S. A., Segelke B. W., Sugita M., Wilson I. A., Brenner M. B., The CD1 family of lipid antigen-presenting molecules, Immunology Today, 19 (1998), s. 362-368 87 Małgorzata Waldowska, Wioleta Kowalska, Justyna Woś 22. Nieda M., Nicol A., Koezuka Y., Kikuchi A., Takahashi T., Nakamura H., Furukawa H., Yabe T., Ishikawa Y., Tadokoro K., Juji T., Activation of humanVα24 NKT cells by alpha-glycosylceramide in a CD1d-restricted and Vα24 TCR-mediated manner, HumanImmunology, 60 (1999), s. 10-19 23. Sidobre S., Naidenko O. V., Sim B. C., Gascoigne N. R., Garcia K. C., Kronenberg M., The V alpha 14 NKT cell TCR exhibits high-affinity binding to a glycolipid/CD1d complex, The Journal of Immunology, 169 (2002), s. 1340-1348 24. Benlagha K., Weiss A., Beavis A., Teyton L., Bendelac A., In vivo identification of glycolipid antigen-specific T cells using fluorescent CD1d tetramers, The Journal of Experimental Medicine,191 (2000), s. 1895-1903 25. Lantz O., Bendelac A., An invariant T cell receptor alpha chain is used by a unique subset of major histocompatibility complex class I-specific CD4+ and CD4-8- T cells in mice and humans, The Journal of Experimental Medicine, 180 (1994), s. 1097-1106 26. Kronenberg M., Toward an understanding of NKT cell biology: progress and paradoxes, Annual Review of Immunology, 23 (2005), s. 877-900 27. Eberl G., Lees R., Smiley S. T., Taniguchi M., Grusby M. J., MacDonald H. R., Tissue-specific segregation of CD1d-dependent and CD1d-independent NKT cells,The Journal of Immunology, 162(1999), s. 6410-6419 28. IshihiraS., Nieda M., Kitayama J., Osada T., Yabe T., Ishikawa Y., Nagawa H., Muto T., Juji T., CD8+NKR-P1A+ T cells preferentially accumulate in human liver, European Journal of Immunology, 29 (1999), s. 2406-2413 29. McNab F. W., Pellicci D. G., Filed K., Besra G., Smyth M. J., Godfrey D. I., Berzins S. P., Peripheral NK1.1 NKT cells are mature and functionally distinct from their thymic counterparts, Journal of Immunology, 179 (2007), s. 6630-6637 30. Bendelac A., Matzinger P., Seder R. A., Paul W. E., Schwartz R. H., Activation events during thymic selection, The Journal of Experimental Medicine, 175 (1992), s. 731-742 31. Gadola S. D., Dulphy N., Salio M., Cerundolo V., Valpha24-Jalpha Cindependent, Cd1d-restricted recognition of alpha-galactosylceramide by human CD4(+) an CD8alpha(+) T lymphocytes, Journal of Immunology, 168 (2002), s. 5514-5520 32. Bendelac A., Rivera M. N., Park S. H., Roark J. H., Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function, Annual Review of Immunology, 15 (1997), s. 535-562 33. Kenna T., Mason L. G., Porcelli S. A., Koezuka Y., Hegarty J. E., O’Farrelly C., Doherty D. G., NKT cells from normal and tumor-bearing human livers are phenotypically and functionally distinct from murine NKT cells, The Journal of Immunology, 171 (2003), s. 1775-1779 34. Lee P. T., Putnam A., Benlagha K., Teyton L., Gottlieb P. A., Bendelac A., Testing the NKT cell hypothesis of human IDDM pathogenesis, The Journal of Clinical Investigation, 110 (2002), s. 793-800 35. Slauenwhite D., Johnston B., Regulation of NKT cell localization in homeostasis and infection, Frontiers in Immunology, 6 (2015), 255 88 Fenotypowe i funkcjonalne zróżnicowanie populacji komórek NKT 36. Bendelac A., Savage P. B., Teyton L., The biology of NKT cells, Annual Review of Immunology, 25 (2007), s. 297-336 37. Umetsu D. T., Dekruyff R. H., Natural killer T cells are important in the pathogenesis of asthma: the many pathways to asthma, The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 125 (2010), s. 975-979 38. Tupin E., Kinjo Y., Kronenberg M., The unique role of natural killer T cells in the response to microorganisms, Nature reviewsImmunology, 5 (2007), s. 405-417 39. Smyth M. J., Crowe N. Y., Pellicci D. G., Kyparissoudis K., Kelly J. M., Takeda K., Yagita H., Godfrey D. I., Sequentialproduction of interferongamma by NK1.1(+) T cells and natural killer cells is essential for the antimetastatic effect of alpha-galactosylceramide, Blood, 99 (2002), s. 12591266 40. Paget C., Trottein F., Role of type 1 natural killer T cells in pulmonary immunity, Mucosal Immunology, 6 (2013), s. 1054-1067 41. Fais F., Tenca C., Cimino G., Coletti V., Zanardi S., Bagnara D., Saverino D., Zarcone D., De Rossi G., Ciccone E., Grossi C. E., CD1d expression on Bprecursor acute lymphoblastic leukemia subsets with poor prognosis, Leukemia, 19 (2005), s. 551-556 42. Song L., Asgharzadeh S., Salo J., Engell K., Wu H., Sposto R., Ara T., Silverman A. M., DeClerck Y. A., Seeger R. C., MetelitsaL. S., Vα24invariant NKT cells mediate antitumor activity via killing of tumor-associated macrophages, The Journal of clinical investigation, 119 (2009), s. 1524-1536 43. Stetson D. B., Mohrs M., Reinhardt R. L., Baron J. L., Wang Z. E., Gapin L., Kronenberg M., Locksley R. M., Constitutive cytokine mRNAs mark natural killer (NK) and NK T cells poised for rapid effector function, The Journal of Experimental Medicine, 198 (2003), s.1069-1076 44. Coquet J. M., Chakravart S., Kyparissoudis K., McNab F. W., Pitt L. A., McKenzie B. S., Berzins S. P., Smyth M. J., Godfrey D. I., Diverse cytokine production by NKT cell subsets and identification of an IL-17–producing CD4−NK1.1− NKT cell population, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105 (2008), s. 11287-11292 45. Michel M. L., Keller A. C., Paget C., Fujio M., Trottein F., Savage P. B., Wong C. H., Schneider E., Dy M., Leite-de-Moraes M. C., Identification of an IL-17-producing NK1.1-iNKT cell population involved in airway neutrophilia, The Journal of Experimental Medicine, 204 (2007), s. 995-1001 46. Smyth M. J., Godfrey D. I., NKT cells and tumor immunity – a double-edged sword,Nature Immunology, 1 (2000), s. 459-460 47. Gumperz J. E., Miyake S., Yamamura T., Brenner M. B., Functionally distinct subsets of CD1d-restricted natural killer T cells revealed by CD1d tetramer staining, The Journal of Experimental Medicine, 195 (2002), s. 625-36 48. Godfrey D. I., Stankovic S., Baxter A. G.Rasing the NKT cell family, Nature Immunology, 11 (2010), s. 533-555 49. Akbari O., Stock P., Meyer E., Kronenberg M., Sidobre S., Nakayama T.,Grusby M. J., DeKruyff R. H., Umetsu D.T., Essential role of NKT cells 89 Małgorzata Waldowska, Wioleta Kowalska, Justyna Woś 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. producing IL-4 and IL-13 in the development of allergen-induced airway hyperreactivity, Nature Medicine, 9 (2003), s. 582-588 Crowe N. Y., Coquet J. M., Berzins S. P., Kyparissoudis K., Keating R., Pellicci D. G., Hayakawa Y., Godfrey D. I., Smyth M. J., Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo,The Journal of Experimental Medicine,202(2005), s. 1279-1288 Lee Y. J., Holzapfel K. L., Zhu J., Jameson S. C., Hogquist K. A., Steady state production of IL-4 modulates immunity in different strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells, Nature Immunology, 14(2013), 10.1038/ni.2731 Watarai H., Sekine-Kondo E., Shigeura T., Motomura Y., Yasuda T., Satoh R., Yoshida H., Kubo M., Kawamoto H., Koseki H., Taniguchi M., Development and function of invariantnaturalkiller T cells producing T(h)2and T(h)17-cytokines, PLoS Biology, 10(2012), e1001255 Sag D., Krause P., Hedrick C. C., Kronenberg M., Wingender G., IL-10producing NKT10 cells are a distinct regulatory invariant NKT cell subset, The Journal of Clinical Investigation, 124 (2014), s. 3725-40 Wingender G., Sag D.,Kronenberg M., NKT10 cells: a novel iNKT cell subset,Oncotarget, 6 (2015), s. 26552-26553 Macho-Fernandez E., Brigl M., The extended family of CD1drestricted NKT cells: sifting through a mixed bag of TCRs, antigens, and functions, Frontiers in Immunology, 6 (2015), 362 Constantinides M. G., Bendelac A., Transcriptional regulation of the NKT cell lineage, Current Opinion in Immunology, 25 (2013), s. 161-167 Moreira-Teixeira L., Resende M., Devergne O., Herbeuval J. P., Hermine O., Schneider E., Dy M., Cordeiro-da-Silva A., Leite-de-Moraes M. C., Rapamycin combined with TGF-beta converts human invariant NKT cells into suppressive Foxp3+ regulatory cells, Journal of Immunology, 188 (2012), s. 624-631 Chang P. P., Barral P., Fitch J., Pratama A., Ma C. S., Kallies A., Hogan J. J., Cerundolo V., Tangye S. G., Bittman R., Nutt S. L., Brink R., Godfrey D. I., Batista F. D., Vinuesa C. G., Identification of Bcl-6-dependent follicular helper NKT cells that provide cognate help for B cell responses,Nature Immunology, 13 (2012), s. 35-43 Tonti E., Fedeli M., Napolitano A., Iannacone M., von Andrian U. H., Guidotti L. G., Abrignani S., Casorati G., Dellabona P., Follicular helper NKT cells induce limited B cell responses and germinal center formation in the absence of CD4(+) T cell help,Journal of Immunology, 188 (2012), s. 3217-3222 Lynch L., Michelet X., Zhang S., Brennan P. J., Moseman A., Lester C., Regulatory iNKT cells lack expression of the transcription factor PLZF and control the homeostasis of T cells and macrophages in adipose tissue, Nature Immunology, 16 (2014), s. 85-95 Tilloy F., Treiner E., Park S. H., Garcia C., Lemonnier F., de la Salle H., Bendelac A., Bonneville M., Lantz O., An invariant T cell receptor α chain defines a novel TAP-independent major histocompatibility complex class Ib-restricted α/β T cell subpopulation in mammals,The Journal of Experimental Medicine, 189 (1999), s. 1907-1921 90 Fenotypowe i funkcjonalne zróżnicowanie populacji komórek NKT 62. Reantragoon R., Kjer-Nielsen L., Patel O., Chen Z., Illing P.T., Bhati M., Kostenko L., Bharadwaj M., Meehan B., Hansen T. H., Godfrey D. I., Rossjohn J., McCluskey J., Structural insight into MR1-mediated recognition of the mucosal associated invariant T cell receptor,The Journal of Experimental Medicine,209 (2012), s. 761-774 63. Dusseaux M., Martin E., Serriari N., Peguillet I., Premel V., Louis D.,Milder M., Le Bourhis L., Soudais C., Treiner E., Lantz O., Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells, Blood, 117 (2011), s. 1250-1259 64. Seach N., Guerri L., Le Bourhis L., Mburu Y., Cui Y., Bessoles S., Soudais C., Lantz O., Double-positive thymocytes select mucosal-associated invariant T cells,Journal of Immunology, 191(2013), s. 6002-6009 65. UssherJ. E., Klenerman P., Willberg C. B., Mucosal-Associated Invariant T-Cells: New Players in Anti-Bacterial Immunity, Frontiers Immunology, 5 (2014), 450 66. Szabo P. A., Anantha R. V., Shaler C. R., McCormick J. K., Haeryfar S. M. M., CD1d- and MR1-restricted T cells in sepsis, Frontiers in Immunology, 6 (2015), 401 67. Miley M. J., Truscott S. M., Yu Y. Y., Gilfillan S., Fremont D. H., Hansen T. H., Lybarger L., Biochemical features of the MHC-related protein 1 consistent with an immunological function, Journal of Immunology, 170 (2003), s. 6090-6098 68. Wingender G., Kronenberg M., Role of NKT cells in the digestive system. IV. The role of canonical natural killer T cells in mucosal immunity and inflammation, American Journal of Physiology- Gastrointestinal and Liver Physiology, 294 (2008), G1-G8 69. Illes Z., Shimamura M., Newcombe J., Oka N., Yamamura T., Accumulation of Vα7.2-Jα33 invariant T cells in human autoimmune inflammatory lesions in the nervous system, International Immunology, 16 (2004), s. 223-230 70. Croxford J. L., Miyake S., Huang Y. Y., Shimamura M., Yamamura T., Invariant V(α)19i T cells regulate autoimmune inflammation, Nature Immunology, 7 (2006), s. 987-994 71. Gold M. C., Cerri S., Smyk-Pearson S., Cansler M. E., Vogt T. M., Delepine J., Winata E., Swarbrick G. M., Chua W. J., Yu Y. Y., Lantz O., Cook M. S., Null M. D., Jacoby D. B., Harriff M. J., Lewinsohn D. A., Hansen T. H., Lewinsohn D. M., Human mucosal associated invariant T cells detect bacterially infected cells,PLoS Biology,8 (2010), e1000407 72. Chua W. J., Truscott S. M., Eickhoff C. S., Blazevic A., Hoft D. F., Hansen T. H., Polyclonal mucosa-associated invariant T cells have unique innate functions in bacterial infection, Infection and Immunity, 80 (2012), s. 3256-3267 73. Kjer-Nielsen L., Patel O., Corbett A. J., Le Nours J., Meehan B., Liu L., Bhati M., Chen Z., Kostenko L., Reantragoon R., Williamson N. A., Purcell A. W., Dudek N. L., McConville M. J., O'Hair R. A., Khairallah G. N., Godfrey D. I., Fairlie D. P., Rossjohn J., McCluskey J., MR1 presents microbial vitamin B metabolites to MAIT cells, Nature, 491 (2012), s. 717-723 91 Małgorzata Waldowska, Wioleta Kowalska, Justyna Woś 74. Salio M., Cerundolo V., Regulation of Lipid Specific and Vitamin Specific Non-MHC Restricted T Cells by Antigen Presenting Cells and Their Therapeutic Potentials, Frontiers in Immunology, 6 (2015), 388 75. Blomqvist M., Rhost S., Teneberg S.,Löfbom L., Osterbye T., Brigl M., Månsson J. E., Cardell S. L., Multiple tissue-specific isoforms of sulfatide activate CD1d-restricted type II NKT cells, European Journal of Immunology, 39(2009), s. 1726-1735 76. Chen Y. H., Chiu N. M., Mandal M., Wang N., Wang C. R., Impaired NK1+ T cell development and early IL-4 production in CD1- deficient mice, Immunity, 6 (1997), s. 459-467 77. Cardell S., Tangri S., Chan S., Kronenberg M., Benoist C., Mathis D., CD1restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice, The Journal of Experimental Medicine, 182 (1995), s. 993-1004 78. Park S. H., Weiss A., BenlaghaK., Kyin T., Teyton L., Bendelac A., The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families,The Journal of Experimental Medicine, 193(2001), s. 893-904 79. Chiu Y. H., Jayawardena J., Weiss A., Lee D., Park S. H., Dautry-Varsat A., Bendelac A., Distinct subsets of CD1d-restricted T cells recognize selfantigens loaded in different cellular compartments, The Journal of Experimental Medicine, 189(1999), s. 103-10 80. Weng X., Liao C. M., Bagchi S., Cardell S. L., Stein P. L., Wang C. R., The adaptor protein SAP regulates Type II NKT cell development, cytokine production and cytotoxicity against lymphoma, European Journal of Immunology, 44 (2014), s. 3646-3657 81. Marrero I., Ware R., Kumar V., Type II NKT cells in inflammation, autoimmunity, microbial immunity, and cancer,Frontiers in Immunology, 6 (2015), 00316 82. Zhao J., Weng X., Bagchi S., Wang C. R., Polyclonal type II natural killer T cells require PLZF and SAP for their development and contribute to CpGmediated antitumor response, Proceedings in the National Academy of Sciences U S A, 111 (2014), s. 2674-2679 83. Takahashi T., Chiba S., Nieda M., Azuma T., Ishihara S., Shibata Y., Juji T., Hirai H., Cutting edge: analysis of human V alpha 24+CD8+ NK T cells activated by alpha-galactosylceramide-pulsed monocyte-derived dendritic cells, The Journal of Immunology, 168 (2002), s. 3140-3144 92 Fenotypowe i funkcjonalne zróżnicowanie populacji komórek NKT Fenotypowe i funkcjonalne zróżnicowanie populacji komórek NKT Komórki NKT stanowią istotną grupę komórek uczestniczących w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej. Łączą cechy komórek NK (naturalkiller) oraz limfocytów T. Tak jak komórki NK, z łatwością odpowiadają na stymulację antygenem i uwalniają liczne cytokiny i chemokiny, wpływając w ten sposób na inne komórki układu immunologicznego. Ponadto, wykazują one również cechy konwencjonalnych limfocytów T, posiadając na swojej powierzchni receptory TCR. Klasycznie komórki NKT dzieli się na dwie główne grupy: komórki NKT typu I i typu II. Jednak ostatnie badania wskazują na głębszą kompleksowość w tej materii i istnienie różnych subpopulacji w obrębie komórek NKT, z ekspresją odpowiednich czynników transkrypcyjnych iunikalnym profilem uwalnianych cytokin. Pozwala to na częściowe wyjaśnienie funkcjonalnych różnic przypisywanych komórkom NKT. W artykule dokonujemy podsumowania aktualnej wiedzy dotyczącej subpopulacji komórek NKT. Phenotypic and functional heterogeneity of NKT population Natural killer T (NKT) cells are an important mediator of immune responses. They possess features of NK (natural killer) cells and T lymphocytes. Like innately functioning NK cells, they swiftly respond to antigen stimulation and produce multiple cytokines and chemokines, to influence other elements of the immune system. But they also share features with conventional T lymphocytes by expressing T cell receptors (TCR). NKT cells have been divided into two major subsets, including type I and type II. However, recent studies revealed the existence of distinct lineages of NKT cells with a unique profile of secreted cytokines and transcription factors. It can therefore explain the remarkable versatility of functions, assigned NKT cells. Here, we summarize the actual knowledge concerning NKT subpopulations. 93 Martyna Bednarczyk1, Urszula Mazurek2, Małgorzata Muc-Wierzgoń1 Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu komórek raka jelita grubego 1. Wstęp Autofagia, inaczej samotrawienie, oznacza wysoce zachowawczy filogenetycznie mechanizm, dzięki któremu degradowane są wszystkie uszkodzone białka oraz organelle komórkowe. Występuje u wszystkich organizmów eukariotycznych. Istniejące dowody wskazują, że autofagia odpowiada za regulację różnych funkcji komórkowych, obejmujących wzrost, różnicowanie, odpowiedź na niedobór składników odżywczych oraz stres oksydacyjny, a także śmierć komórki [1, 2, 3, 4]. Cechą charakterystyczną tego procesu jest to, że nie jest jedynie synonimem śmierci komórki, w przeciwieństwie do apoptozy. Niedawno podkreślono, że może również być mechanizmem adaptacyjnym, umożliwiającym przeżycie komórki w niekorzystnych warunkach, na przykład podczas niedotlenienia lub niedoboru składników odżywczych [2, 5]. Uważa się, że wadliwy szlak autofagii lub błędy w genach związanych z autofagią leżą u podstaw patogenezy wielu chorób, w tym chorób neurodegeneracyjnych, chorób płuc lub nowotworów [6, 7]. W zależności od sposobu dostarczenia białka do lizosomu, wyróżniamy cztery rodzaje autofagii: swoistą (na przykład mitofagię, lipofagię, peksofagię, rybofagię), mikroautfagię, makroautofagię oraz autofagię zależną od białek opiekuńczych (chaperonów) [2, 8]. Mikroautofagia jest nieselektywnym procesem, podczas którego białko przeznaczone do degradacji zostaje bezpośrednio wchłonięte do lizosomu, gdzie dochodzi do jego hydrolizy. Jest to najmniej popularny rodzaj autofagii, który do końca jeszcze nie został poznany, a jego rola w procesie nowotworzenia do tej pory jest niewyjaśniona [2, 9, 10]. Autofagia zależno od chaperonów różni się od pozostałych rodzajów obecnością w białkach substratowych pentapeptydu Lys – Phe – Glu – Arg – Gln (KFERQ), pełniącego funkcję sekwencji kierującej do lizosomy [11]. Motyw ten obecny jest w około 1 [email protected], Katedra i Oddział Kliniczny Chorób Wewnętrznych, Wydział Zdrowia Publicznego w Bytomiu, Śląski Uniwersytet Medyczny 2 [email protected], Katedra i Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny 94 Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu komórek raka jelita grubego 30% białek cytozolowych. Białko szoku cieplnego HSP70 wiąże się z substratem, następnie sekwencja KFERQ rozpoznawana jest przez receptor LAMP2A obecny w błonie lizosomalnej. Białko substratowe dostaje się do wnętrza lizosomu, gdzie ulega degradacji [2, 6, 12, 13]. Podczas makroautofagii zniszczeniu ulegają znacznie większe struktury niż w przypadku poprzednich procesów. Jest to najczęściej występująca forma autofagii. Degradacja białek zachodzi za pośrednictwem specjalnej struktury, autofagosomu. Proces regulowany jest przez produkty genów Atg, zidentyfikowanych po raz pierwszy u drożdży. Najważniejszymi białkami uczestniczącymi w tym procesie są: kompleks kinazy ULK1/2, białko błonowe Atg9, kompleks kinazy PI3K – III oraz ubikwitynopodobne systemy sprzęgania Atg12 i Atg9 [2,9, 10, 14]. W procesie autofagii wyróżniamy cztery podstawowe fazy: inicjację, elongację fagoforu, dojrzewanie autofagosomu, jego fuzję z lizosomem oraz degradację zawartości. W przebieg tych faz zaangażowanych jest ponad 30 genów [4]. Autofagia indukowana jest przede wszystkim niedoborem składników odżywczych lub podczas niedotlenienia [15]. W inicjacji tego procesu uczestniczy kinaza ULK1, białko FIP200, mAtg13 (nośnik sygnału do rozpoczęcia autofagii) oraz Atg101. Ten etap kontrolowany jest przede wszystkim aktywnością kinazy mTOR (ssaczy cel dla rapamycyny). Podczas aktywacji mTOR autofagia ulega zahamowaniu [8, 12, 16]. Mechanizm autofagii rozpoczyna się od wstępnego formowania fagoforu (nukleacja) oraz jego stopniowego wydłużania na kształt litery C. Fagofor powstaje w wyniku fuzji wielu pęcherzyków pochodzących z retikulum endoplazmatycznego. W ten etap zaangażowana jest kinaza 3fosfatydyloinozytolu (PI3K-III), Beklina 1 oraz kinaza serynowa p150. Ważną rolę odgrywa tu również białko Atg9, dostarczające składników lipidowych koniecznych do powstania błony fagosomu. Atg9 oddziałuje z białkiem Atg2, dzięki czemu możliwe jest utworzenie błony izolującej [2, 8, 16]. Białka antyapoptotyczne BCL-2 oraz BCL-XL hamują aktywność kompleksu Beklina1 : PI3K : p150 [4]. Dalszym etapem jest elongacja (wydłużanie fagoforu), gdzie uczestniczą dwa ubikwitynopodobne kompleksy białek: Atg12-Atg5 oraz LC3-II-fostatydyloetanoloamina (LC3-II-PE). W tworzenie pierwszego systemu koniugacyjnego (Atg12-Atg5) zaangażowane są cztery białka: Atg5, 7, 10 i 12. Białko Atg12 wiąże się kowalencyjnie z Atg5. W następnym etapie powstały kompleks Atg12-Atg5 wiąże się z białkiem Atg16L, zachodzi multimeryzacja i utworzony zostaje tetramer Atg12Atg5-Atg16L uczestniczący w elongacji fagoforu. Naukowcy twierdzą, że ten kompleks bierze udział w jego zakrzywieniu. W momencie powstania dojrzałego autofagosomu, białko Atg16L oddysocjowuje, co świadczy 95 Martyna Bednarczyk, Urszula Mazurek, Małgorzata Muc-Wierzgoń o tym, że nie może stanowić markera procesu autofagii. Następie dochodzi do aktywacji drugiego ubikwitynopodobnego kompleksu LC3-II-PE. LC3 jest białkiem związanym z mikrotubulami, znajduje się w cytozolu i syntetyzowane jest jako prekursor pro-LC3. Forma pro-LC3 w wyniku cięcia przez Atg4 ulega przemianie do LC3-I, do którego przyłącza się białko Atg7, Atg3 oraz powstały niedawno kompleks Atg12-Atg5-Atg16L. W kolejnym etapie LC3-I przyłącza lipofilną fosfatydyloetanoloaminę (PE) i przekształca się w formę LC3-II. W następstwie tych zdarzeń z fagoforu powstaje autofagosom. LC3-II uznaje się za wiarygodny marker autofagii, ponieważ jego stężenie jest proporcjonalne do liczby powstałych autofagosomów. W ostatnim etapie błona autofagosomu ulega fuzji z lizosomom, powstaje autofagolizosom, w którym dochodzi do trawienia białek przeznaczonych do degradacji, dzięki obecności enzymów lizosomalnych [2, 8, 12]. Rysunek 1 przedstawia schemat przebiegu autofagii. Rysunek 1. Przebieg autofagii [2] Od dawna wiadomo, że autofagia bierze udział w patogenezie chorób nowotworowych, w tym raka jelita grubego [5]. W warunkach fizjologicznych, jeśli występuje odpowiedni poziom składników odżywczych, jest obecna w większości tkanek, wpływając na utrzymanie homeostazy komórkowej. Uszkodzone białka i organelle ulegają degradacji. W przypadku, kiedy zmniejsza się poziom autofagii, komórki tracą zdolność do usuwania materiałów i zaczynają akumulować cytotoksyczne składniki, co w efekcie może prowadzić do onkogenezy [2]. Uważa się, że ma dwojaki wpływ na rozwój choroby nowotworowej, korzystny, jak i niekorzystny. Pozytywnym skutkiem jest to, że działa supresorowo na guz ograniczając wielkość komórek rakowych i usuwając uszkodzone białka mogące wzmagać proces mutagenny. Natomiast za negatywne działanie uznaje się to, że autofagia może przyczyniać się do 96 Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu komórek raka jelita grubego przeżycia komórek rakowych nawet w środowisku ubogim w składniki odżywcze [17]. Rola autofagii w kancerogenezie nie została jeszcze dokładnie poznana i może zależeć od wielu czynników, na przykład od stopnia zaawansowania choroby lub od mutacji genów obecnych w określonym typie nowotworu [4, 18]. Poza tym niektórzy badacze donoszą, że zahamowanie autofagii hamuje rozwój nowotworów, a co za tym idzie może być skutecznym sposobem leczenia raka jelita grubego. Drugim istotnym faktem jest to, że lizosomy przyczyniają się do rozwoju lekooporności komórek nowotworowych i blokują proces autofagii [5, 19]. Ponadto we wczesnym stadium choroby autofagia może przyczyniać się do hamowania przerzutów, dzięki indukcji reakcji zapalnej. Zapobiega również inicjacji nowotworu. Natomiast w późnym stadium sprzyja progresji lub powstawaniu przerzutów, poprzez zwiększenie przeżywalności komórek w warunkach niedotlenienia lub braku składników odżywczych [2, 20]. Aktualne metody leczenia raka jelita grubego obejmują chirurgię, radioterapię oraz chemioterapię. Rodzaj leczenia zależy od stopnia zaawansowania choroby. Prowadzone są nadal badania nad opracowaniem nowych metod leczenia, z naciskiem na metody molekularne [21]. Jednym z najbardziej obiecujących celów terapeutycznych ostatnich lat, wydaje się być proces autofagii. Chociaż rola autofagii w rozwoju nowotworów jest tematem kontrowersyjnym, wiadomo, że w przypadku raka jelita grubego, wzrasta jej aktywność. Zaobserwowano wzrost ekspresji genów LC3 i BECN1 w komórkach guzów w porównaniu z tkankami niezmienionymi chorobowo [22]. Wstępne badania genetyczne sugerują, że Beclina 1 działa jako supresor guzów, a jej delecja prowadzi do powstawania spontanicznych nowotworów. Chociaż Beclina 1 i LC3 są ważnymi mediatorami autofagii, inne cząsteczki oraz szlaki sygnalizacyjne, również wymagają zbadania w celu określenia ich roli w procesie autofagii (np. p53, PI3K / Akt / mTOR) [17]. 2. Cel pracy Celem niniejszego badania było zbadanie ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu komórek raka jelita grubego z wykorzystanie mikromacierzy oligonukleotydowych HGU-133A. 3. Materiały i metody Aktywność transkrypcyjną genów związanych z autofagią wyznaczano w wycinkach raka jelita grubego oraz jelita prawidłowego. Podczas zabiegu operacyjnego uzyskano materiał obejmujący tkankę guza oraz margines wynoszący 5 cm. Margines był oceniony makroskopowo i histopatolo- 97 Martyna Bednarczyk, Urszula Mazurek, Małgorzata Muc-Wierzgoń gicznie jako jelito zdrowe. Do analizy molekularnej typowano 123 wycinki jelita grubego, z czego 40 na podstawie analizy histopatologicznej oceniono jako jelito prawidłowe (kontrola), a pozostałe jako gruczolakoraka w różnych stopniach zaawansowania (CSI – 11, CSII – 25, CSIII – 32, CSIV – 15). 3.1. Ekstrakcja RNA Pierwszym etapem badania było przeprowadzenie ekstrakcji całkowitego RNA. Dostarczony materiał poddano homogenizacji z wykorzystaniem homogenizatora Polytron (Kinematyka, AG, Szwajcaria). Następnie wyizolowanao całkowite RNA za pomocą odczynnika TRIzol® (Invitrogen Life Technologies, Kalifornia, USA), zgodnie instrukcją producenta. Ostatnim etapem było oczyszczenie wyizolowanego RNA na kolumienkach zestawu RNeasy Mini Kit firmy Qiagen w połączeniu z trawieniem DNazą I. 3.2. Ocena jakościowa i ilościowa całkowitego RNA Po wyizolowaniu RNA, jednym z pierwszych wykonywanych etapów jest analiza ilościowa, czyli określenie stężenia RNA. W tym celu wykorzystano spektrofotometr GeneQuant II. Stężenie RNA wyznacza się na podstawie pomiaru absorbancji światła UV przy długości fali 260 nm. Analiza ilościowa polega na przeprowadzeniu elektroforezy w 1% żelu agarozowym wybarwionym bromkiem etydyny. 3.3. Mikromacierze oligonukleotydowe Aktywność transkrypcyjna genów związanych z autofagią została wyznaczona techniką mikromacierzy HG-U133A (Affymetrix). Do zsyntetyzowania dwuniciowego cDNA, wykorzystano jako matrycę 8 μg RNA (SuperScript Choice system; Invitrogen Life Technologies, CA, USA). Syntezę biotynylowanego cRNA przeprowadzono z użyciem BioArray HighYield RNA Transcript Labeling Kit (Enzo Life Sciences, New York, USA). W celu przeprowadzenia fragmentacji cRNA zastosowano Sample Cleanup Module Kit (Qiagen GmbH, Germany). Płukanie, barwienie kompleksem streptawidyna-fikoerytryna i skanowanie mikromacierzy w skanerze GeneArray (Agilent) wykonywano zgodnie z zaleceniami Affymetrix Gene Expression Analysis Technical Manual. 3.4. Analiza statystyczna Analiza otrzymanych wyników prowadzona jest z wykorzystaniem Infrastruktury PL-Grid (http://www.plgrid.pl/). W analizie statystycznej zastosowano poziom istotności statystycznej wynoszący p(α) < 0,05. Dla każdego analizowanego parametru wyznaczono najważniejsze elementy 98 Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu komórek raka jelita grubego statystyki opisowej: średnią, medianę, wartość minimalną i maksymalną, odchylenie standardowe oraz kwartyl górny (75%) i dolny (25%). Zróżnicowanie ekspresji genów określono za pomocą testu jednoczynnikowej ANOVA. Następnie wykonano test bardziej precyzyjny, post hoc TUKEYA. 4. Wyniki 4.1. Grupowanie hierarchiczne transkryptomów Ocenę stopnia zróżnicowania transkryptomów rozpoczęto od porównania zgodności grupowania wycinków w zależności od stopnia zaawansowania raka jelita grubego wyznaczonego na podstawie analizy histopatologicznej, klinicznej oraz molekularnej. W tym celu przeprowadzono grupowanie hierarchiczne, z miarą Czebyszewa. Transkryptomy zostały podzielone na cztery grupy, dwie charakterystyczne dla raka jelita grubego – w niskim stopniu zaawansowania (NSZ) oraz w wysokim stopniu zaawansowania (WSZ) oraz dwie grupy kontrolne (K i K2). Grupa K2 wykazuje podobieństwo do raka w wysokim stopniu zaawansowania, chociaż jest to wycinek jelita oceniony histopatologicznie i makroskopowo jako tkanka prawidłowa. Rysunek 2. Dendrogram obrazujący wyniki grupowania hierarchicznego profili znormalizowanego poziomu sygnałów fluorescencji 22283 ID mRNA w transkryptomach wyznaczonych metodą mikromacierzy oligonukleotydowych HGU 133A [opracowanie własne] 99 Martyna Bednarczyk, Urszula Mazurek, Małgorzata Muc-Wierzgoń 4.2. Ocena stopnia zróżnicowania pomiędzy grupami transkryptomów genów związanych z autofagią Analizę stopnia zróżnicowania transkryptomów rozpoczęto od statystyki opisowej rozkładu sygnału fluorescencji mRNA transkryptów w poszczególnych grupach (rys. 3). Na osi x zaznaczono dwie kontrole (K i K2) oraz hodowlę komórek raka jelita grubego o wysokim stopniu zaawansowania (WSZ) i niskim stopniu zaawansowania (NSZ). Na tej podstawie można stwierdzić, że kontrola jest zbliżona do próbek badanych. We wszystkich grupach wartości mediany występują na zbliżonym poziomie, lecz są zauważalne różnice w wartościach rozstępu kwartylowego oraz wartościach oddalonych. Rysunek 3. Statystyki opisowe przedstawiające rozkład sygnału fluorescencji mRNA w grupach transkryptomów kontroli [K i K2] oraz komórek raka jelita grubego o niskim stopniu zaawansowania [NSZ] i wysokim stopniu zaawansowania [WSZ] [opracowanie własne] 4.3. „Mapa gorąca” trankryptów genów związanych z autofagią Kolejnym etapem było wyznaczenie za pomocą Infrastruktury PL-Grid (http://www.plgrid.pl/) „map gorąca” (heatmap). „Mapy gorąca” umożliwiają porównanie aktywności transkrypcyjnej badanych genów w odniesieniu do średniej aktywności transkrypcyjnej komórek jelita grubego (barwa żółta). Poniższa rycina przedstawia „mapę gorącą” obrazującą 100 Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu komórek raka jelita grubego zróżnicowanie profilu stężeń mRNA genów związanych z autofagią ulegających nadekspresji w raku jelita grubego. Wzrost ekspresji danego genu koreluje ze zmianą barwy w kierunku odcieni czerwieni, natomiast spadek aktywności transkrypcyjnej oznacza zmianę barwy w kierunku odcieni niebieskiego. Na podstawie poniższej „mapy gorąca” stwierdzono, że poziom mRNA badanego białka jest wyższy w wycinkach raka w porównaniu do kontroli, natomiast nie zależy od stopnia zaawansowania klinicznego. Rysunek 4. Mapa intensywności sygnałów fluorescencji 26 ID mRNA genów związanych z autofagią w grupach tran skryptów jelita grubego (kolor niebieski – najniższe wartości, kolor czerwony najwyższe wartości sygnałów fluorescencji rejestrowanych w analizowanych mikromacierzach [opracowanie własne] 101 Martyna Bednarczyk, Urszula Mazurek, Małgorzata Muc-Wierzgoń 4.4. Ocena stopnia zróżnicowania ilościowego pomiędzy grupami transkryptomów genów związanych z autofagią testem jednoczynnikowej ANOVA Kolejnym etapem było przeprowadzenie dalszej analizy wyników, w celu oceny statystycznej znamienności obserwowanych zmian na poziomie profilu stężeń ID mRNA genów związanych z autofagią w zależności od stopnia zaawansowania gruczolakoraka jelita grubego. Przeprowadzono test jednoczynnikowej ANOVA z korekcją BenjaminiHochberga, który miał na celu jednoczesne porównanie wszystkich analizowanych grup transkryptomów w odniesieniu do prób kontrolnych K i K2 (tab. 1). Tabela 1. Test jednoczynnikowej ANOVA przedstawiający liczbę ID mRNA genow związanych z autofagią różnicujących transkryptomy gruczolakoraka jelita grubego w wysokim oraz niskim stopniu zaawansowania [opracowanie własne] Liczba mRNA różnicujących K vs NSZ vs WSZ wartość p różnicujące 207 p < 0,05 p < 0,02 p < 0,01 p < 0,005 p <0,001 26 20 13 11 3 Z przedstawionej analizy statystycznej ANOVA wynika, że spośród grupy 207 mRNA genów związanych z autofagią, w przypadku 26 ID mRNA występują znaczne różnice w intensywności fluorescencji dla wartości p < 0,05. Z czego wynika, ze 26 mRNA różnicuje wycinki gruczolakoraka od kontroli K1. Podczas zaostrzenia kryteriów różnicowania, zwiększono siłę różnicowania poprzez zmianę wartości p z 0,05 na 0,001, obserwowano stopniowe zmniejszanie liczby mRNA różnicujących poszczególne grupy transkryptów. Test ANOVA wykonuje się celem określenia różnic poziomu ID mRNA w analizowanych grupach transkryptomów. Pierwszą częścią są różnice między porównywanymi grupami mRNA: NSZ, WSZ, K 2 w porównaniu do K1, natomiast drugą grupę stanowią różnice między wynikami wewnątrz analizowanych grup mRNA (błąd losowy). Dlatego w kolejnym etapie analizy statystycznej przeprowadzono test wielokrotnych porównań post – hoc (po fakcie) – test Tukeya z poprawką Benjamini-Hochberga (tab. 2). Wykonuje się go jako kolejny krok analizy wariancji. Jest on bardziej precyzyjny niż test ANOVA. Jego zadaniem jest określenie, jaka liczba ID mRNA różnicuje analizowane grupy transkryptomów między sobą. Test ten jest wykorzystywany tylko dla wybranej grupy ID mRNA dopiero, jeśli na podstawie testu ANOVA zostanie stwierdzony brak równości między średnimi. 102 Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu komórek raka jelita grubego Tabela 2. Test post – hoc Tukeya, który wskazuje liczbę reprezentatywnych ID mRNA różnicujących poszczególne grupy transkryptomów. Kolorem czarnym jest zaznaczona liczba 26 ID mRNA wyznaczona za pomocą testu ANOVA, które różnicowały analizowane grupy transkryptomów. Kolorem czerwonym – liczbę ID mRNA reprezentatywnych dla różnicowania badanych grup transkryptomów przy założeniu, p < 0,05. Kolorem niebieskim – liczbę ID mRNA niereprezentatywnych w różnicowaniu porównywanych grup [opracowanie własne] Grupa transkryptomów K2 K NSZ WSZ K2 K 26 22 13 8 NSZ 4 26 21 14 WSZ 13 5 26 19 18 12 7 26 Podczas analizy średnich sygnałów fluorescencji w grupach K2, NSZ i WSZ w porównaniu do K1, stwierdzono, że z grupy 26 ID mRNA wytypowano przy wartości p < 0,05, dla K2 vs K1 – 4 ID mRNA, dla NSZ vs K1 – 5 ID mRNA oraz dla WSZ vs K1 – 12 ID mRNA. Kolejnym etapem była ocena specyficzności ID mRNA w różnicowaniu grup transkryptomów gruczolakoraka jelita grubego o niskim i wysokim stopniu zaawansowania w odniesieniu do kontroli K1. W tym celu posłużono się diagramem VENNA (ryc. 5). Uzyskane wyniki świadczą o tym, że z grupy 26 ID mRNA wytypowanych jako różnicujące wycinki raka jelita grubego o niskim stopniu zaawansowania od kontroli, nie ma żadnych genów specyficznych tylko dla NSZ. W przypadku różnicowania raka jelita grubego o wysokim stopniu zaawansowania od kontroli, specyficznych jest 8 genów: dwa ID dla receptora BECN1 oraz po jednym dla TMEM59, NBR1, PSEN1, VTI1B, DRAM1 i SH3BP4. Rysunek 5. Diagram Venna grupujący mRNA wytypowane testem post-hoc – Tukeya z poprawką Benjamini-Hochberga – po teście jednoczynnikowym ANOVA, w zależności od specyficzności różnicowania grup transkryptomów jelita grubego [opracowanie własne] 103 Martyna Bednarczyk, Urszula Mazurek, Małgorzata Muc-Wierzgoń Tabela 3. Legenda do diagramu Venna wskazującego specyficzność ID mRNA w różnicowaniu grup transkryptomów K2, NSZ i WSZ w odniesieniu do kontroli K1, wyznaczonych na podstawie analizy wariancji i testu post-hoc – Tukeya z poprawką Benjamini-Hochberga [opracowanie własne] Grupy porównywanych transkryptomów mRNA różnicujące Liczba ID Symbol Wartość p NSZ vs K1 – 5 ID mRNA NSZ vs K1 NSZ vs K1NSZ vs WSZ 0 3 NSZ vs K1WSZ vs K1 2 NSZ vs K1WSZ vs K1NSZ vs WSZ 0 201471_s_at SQSTM1 0.0013664293 202723_s_at FOXO1 4.2396536E-5 207829_s_at BNIP1 7.935236E-5 209018_s_at PINK1 3.3543853E-5 209019_s_at PINK1 7.000239E-8 WSZ vs K1 – 12 ID mRNA WSZ vs K1 8 WSZ vs K1NSZ vs K1 2 WSZ vs K1NSZ vs WSZ 2 NSZ vs K1WSZvs K1NSZ vs WSZ 0 200620_at TMEM59 0.0026670145 201383_s_at NBR1 0.0012132392 207782_s_at PSEN1 4.188373E-4 208945_s_at BECN1 4.977536E-7 208946_s_at BECN1 7.3220895E-4 209452_s_at VTI1B 2.458908E-4 218627_at DRAM1 9.152737E-5 222258_s_at SH3BP4 2.3106563E-4 209018_s_at PINK1 3.3543853E-5 209019_s_at PINK1 7.000239E-8 201553_s_at LAMP1 2.6293748E-4 212312_at BCL2L1 2.975771E-6 104 Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu komórek raka jelita grubego NSZ vs WSZ – 7 ID mRNA NSZ vs WSZ NSZ vs WSZ WSZ vs K1 NSZ vs WZS NSZ vs K1 NSZ vs K1WSZvs K1NSZ vs WSZ 2 2 3 201552_at LAMP1 0.006088007 221874_at KIAA1324 0.0020695326 201553_s_at LAMP1 2.6293748E-4 212312_at BCL2L1 2.975771E-6 201471_s_at SQSTM1 0.0013664293 202723_s_at FOXO1 4.2396536E-5 207829_s_at BNIP1 7.935236E-5 0 Grupa NSZ różni się od grupy WSZ 7 IDmRNA, mimo tego, że obydwie grupy w ocenie histopatologicznej stanowią wycinki raka jelita grubego. Wynik analizy Tukeya wskazuje również, że obydwie kontrole z pośród 26 ID mRNA wytypowanych jednoczynnikowym testem ANOVA, różnią się istotnie od siebie 4 ID mRNA. 5. Dyskusja Nowotwór jelita grubego jest jedną z najczęstszych przyczyn śmierci na świecie [23]. Najnowsze badania wykazały, że jest to wieloetapowa choroba genetyczna. Jednak czynniki środowiskowe mogą również wspierać rozwój tej choroby [24, 25]. Pomimo postępu w diagnostyce, badaniach oraz leczeniu, przyczyny choroby nie zostały jeszcze dokładnie poznane [26]. Rak jelita grubego jest wynikiem postępujących genetycznych i epigenetycznych zmian, które powodują przekształcenie prawidłowego nabłonka okrężnicy w gruczolakoraka jelita grubego [27]. Badania z ostatnich lat w dużej mierze koncentrują się na biologii molekularnej choroby. Podstawowym celem prowadzonych badań jest nie tylko szukanie sposobów zapobiegania nowotworom oraz wczesne wykrywanie, ale również poznanie skutecznych metod walki z chorobą. Celem naukowców jest wprowadzenie terapii działającej bezpośrednio na guz. Jednak brakuje wciąż wiedzy na temat kancerogenezy na poziomie molekularnym [26]. Najnowszym stosowanym sposobem leczenia przerzutów raka jelita grubego jest hamowanie szlaku EGFR w celu zablokowania wzrostu guza i proliferacji komórek. Jednak naukowcy nadal poszukują alternatywnych metod leczenia. Ostatnio uważa się, że autofagia może być odpowiednim celem terapeutycznym w leczeniu nowotworów, ponieważ powoduje 105 Martyna Bednarczyk, Urszula Mazurek, Małgorzata Muc-Wierzgoń oporność guzów na chemioterapię [23]. Wśród czynników zaangażowanych w etiologię tej choroby, duże znaczenie ma autofagia. Dokładny mechanizm prowadzący do autofagii w raku nie jest jeszcze dokładnie poznany. Wiadomo tylko, że proces ten pełni podwójną rolę w nowotworach. Z jednej strony może chronić komórki przed transformacją nowotworową poprzez usunięcie uszkodzonych organelli, zagregowanych białek czy zmniejszenie reaktywnych form tlenu. Z drugiej strony autofagia powoduje przeżycie komórek guza ułatwiając im dostęp do składników odżywczych, hamuje śmierć komórek oraz zwiększa odporność na leki [20]. Nowotwór jest wynikiem zmian zachodzących w materiale genetycznym, czego następstwem są zaburzenia w ścieżkach metabolicznych. Białkowe produkty zmienionych genów wpływają na procesy zachodzące w komórkach nowotworowych, takie jak proliferacja, różnicowanie, apoptoza i angiogeneza. Te białka mogą być markerami nowotworowymi, przydatnymi w przypadku diagnostyki choroby. W celu oznaczania obecności markerów nowotworowych konieczne jest wykonanie badań molekularnych [28]. Mikromacierze oligonukleotydowe stanowią ostatnio bardzo popularną technikę analizy ekspresji genów [29]. Dzięki nim można ocenić jednorazowo dużą ilość genów oraz istnieje możliwość określenia ich profilu ekspresji genów charakterystycznego dla danego typu nowotworu [30]. W tym przypadku badano profil ekspresji genów związanych z autofagią. Wytypowanie genów, które zmieniają swoją aktywność w gruczolakoraku jelita grubego w porównaniu do jelita zdrowego, może mieć zastosowanie w diagnostyce klinicznej oraz terapii tego nowotworu (opracowanie nowych, skutecznych leków). Brak zmian w ekspresji genów w stosunku do kontroli może oznaczać, że te geny nie uczestniczą w rozwoju choroby [31]. W niniejszym baniu wykorzystano mikromacierze oligonukleotydowe HG-U133A (Affymetrix), dzięki którym oceniono profil ekspresji genów charakterystycznych dla autofagii. Metodę tę cechuje bardzo wysoka czułość i dokładność. W bazie danych Affymetrix znajduje się 207 sond dla mRNA genów związanych z autofagią. Do przeprowadzenia niniejszego badania wyselekcjonowano 26 ID mRNA genów związanych z autofagią a kolejnym krokiem było wykonanie analizy porównawczej K2, NSZ i WSZ w odniesieniu do kontroli K1. Wstępną ocenę zróżnicowania poszczególnych grup transkryptomów przeprowadzono na podstawie intensywności sygnałów fluorescencji w postaci „map gorąca”. Następnie znamienność statystyczną obserwowanych różnic oceniono wykonując jednoczynnikowy test ANOVA oraz test post hoc Tukeya wskazującego ID mRNA różnicujące K2, NSZ i WSZ od kontroli K1. 106 Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu komórek raka jelita grubego Przeprowadzono analizę porównawczą transkryptomów genów (207 ID mRNA) biorących udział w autofagii i uzyskano wynik, wskazujący, że profil stężenia mRNA w wycinkach jelita grubego zmienia się w zależności od stopnia zaawansowania gruczolakoraka jelita grubego. Próbując odnaleźć geny uczestniczące w autofagii nie wykryto żadnych genów specyficznie różnicujących wycinki raka w grupie NSZ od K. W przypadku pacjentów z rakiem jelita grubego w wysokim stopniu zaawansowania (WSZ) proces chorobowy uległ znacznemu postępowi. Zmiany, które zaobserwowano w NSZ są już nieobecne, natomiast obserwujemy 8 genów specyficznie różnicujących WSZ: TMEM59, NBR1, PSEN1, VTI1B, DRAM1, SH3BP4 oraz 2 ID dla BECN1. Dokładna funkcja białka TMEM59 nie jest poznana, wiadomo, że uczestniczy w makroautofagii. Znajduje się w błonie aparatu Golgiego i hamuje glikozylację białka APP w aparacie Golgiego (ang. amyloid precursor protein) oraz zmniejsza poziom APP na powierzchni komórki. Ponadto TMEM59 powoduje aktywację LC3, co potwierdza jego proapoptotyczne zdolności [32, 33]. Z kolei białko NBR1 zaangażowane jest w autofagię, głównie mitofagię [34]. Głównym zadaniem PSEN1 jest udział w produkcji β-amyloidu, co przyczynia się do rozwoju choroby Alzheimera. Bierze również udział w rozwoju nowotworów oraz oporności na chemioterapię, jednak proces ten nie jest do końca poznany [35]. Duże znaczenie w powstawaniu nowotworów ma białko DRAM1, które bierze udział w indukcji autofagii i apoptozy zależnej od TP53 [36]. Białko SH3BP4 pełni funkcję hamowania GTPazy Rag i jest również negatywnym regulatorem szlaku sygnalizacyjnego mTORC1, co przyczynia się do rozwoju wielu typów nowotworów [37]. Z pośród wymienionych genów największe znaczenie w autofagii ma białko BECN1 (Beclina 1). Uczestniczy w początkowej fazie autofagii – w formowaniu fagoforu [2]. Ponadto bierze udział w oporności na chemioterapię [38]. Na temat roli genu VTI1B w rozwoju nowotworów, nie znaleziono informacji w piśmiennictwie. Udowodniono w niniejszym badaniu, jak ważną rolę odgrywa autofagia w procesie nowotworzenia. Podsumowując, badania na poziomie molekularnym przyczynią się do opracowania nowych metod diagnostyki, terapii oraz nieinwazyjnych metod wykrywania wczesnych postaci nowotworów jelita grubego. Poznanie genów zaangażowanych w autofagię oraz ścieżek sygnałowych biorących udział w najwcześniejszych etapach choroby, może przyczynić się do opracowania leków kontrolujących lub zapobiegających dalszemu rozwojowi choroby [39]. Obecnie prowadzone są intensywne badania nad opracowaniem nowych metod terapii, polegające na aktywacji autofagii, np. w wyniku indukcji stresu ER, hamowana szlaku mTOR lub aktywacji AMPK w różnych typach nowotworu [18]. 107 Martyna Bednarczyk, Urszula Mazurek, Małgorzata Muc-Wierzgoń 6. Wnioski Badanie ekspresji genów techniką mikromacierzy oligonukleotydowych w gruczolakoraku jelita grubego, stanowi cenną metodę uzupełniającą diagnostykę wczesnej postaci nowotworu. Zmiany molekularne wyprzedzają zmiany fenotypowe. Świadczy o tym fakt, że w grupie kontrolnej K2 mogą znajdować się już komórki nowotworowe. Zaobserwowane różnice ekspresji genów związanych z autofagią w badanej grupie chorych z gruczolakorakiem jelita grubego w porównaniu z wycinkami jelita zdrowego, mogą wskazywać na istotną rolę wyodrębnionych genów w patogenezie tego nowotworu. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Badadani M., Autophagy Mechanism, Regulation, Functions, and Disorders, Cell Biology, (2012), s. 1-11 Dereń-Wagemann I., Kiełbiński M., Kuliczkowski K., Autofagia – proces o dwóch obliczach, Acta Hematologica Polonica, 44 (2013), s. 383-391 Kost A., Kasprowska D., Łabuzek K. i in., Autofagia w niedokrwieniu mózgu, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 65 (2011), s. 524-533 Świderek E., Strządał L., Autofagia i białko BNIP3 w nowotworach, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej., 67 (2013), s. 363-370 Niedźwiedzka-Rystwej P. Deptuła W., Autofagia – ważne zjawisko odpornościowe, Postępy Biologii Komórki, 36 (3) (2009), s. 455-464 Ghavami S., Shojaei S., Yeganeh B. et al., Autophagy and apoptosis dysfunction in neurodegenerative disorders, Progress in Neurobiology, 112 (2014), s. 24-49 Fujita Y., Araya J., Ito S. et al., Suppression of autophagy by extracellular vesicles promotes myofibroblast differentiation in COPD pathogenesis, Journal of Extracellular Vesicles, 4 (2015), s. 1-12 Lisak N., Totoń E., Rybczyńska M., Autofagia, nowe perspektywy w terapii przeciwnowotworowej, Postępy Medycyny i Higieny Doświadczalnej, 68 (2014), s. 925-935 Dumit V., Dengjel J., Autophagosomal Protein Dynamics and Influenza Virus Infection, Frontiers in Immunology, 3 (43) (2012), s. 1-10 Zielniok K., Gajewska M., Znaczenie autofagii w procesie nowotworzenia, Życie Weterynaryjne, 90 (9) (2015), s. 565-569 Qi L., Zhang XD., Wu Ch. et al., The role of chaperone-mediated autophagy in huntingtin degradation, PLoS ONE, 7 (10) (2012), s. 1-16 Polewska J., Autofagia – mechanism molekularny, apoptoza i nowotwory, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 66 (2012), s. 921-936 Kiffin R., Christian Ch., Knecht E. et al., Activation of chaperone-mediated autophagy during oxidative stress, Molecular Biology of the Cells, 15 (2004), 4829-4840 108 Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu komórek raka jelita grubego 14. Muntz Ch., Antigen processing by macroautophagy for MHC presentation, Frontiers in Immunology, 2 (42) (2011), s. 1-7 15. Eskelinen E. Saftig P., Autophagy A lysosomal degradation pathway with a central role in health and disease, Biochemica et Biophysica Acta, 1793 (2009), s. 664-6 16. Yang Z., Klionsky D., Mammalian autophagy core molecular machinery and signaling regulation, Current Opinion in Cell Biology., 22 (2) (2010), s. 1-14 17. Hasima N., Ozpolat B., Regulation of autophagy by polyphenolic compounds as a potential therapeutic strategy for cancer, Cell Death and Disease, 509 (2014), s. 1-13 18. Kania E., Pająk B., Orzechowski A., Calcium homeostasis and ER stress in control of autophagy in cancer cells, BioMed Research International, (2015), s. 1-12 19. Sakitani K., Hirata Y., Hikiba Y. et al., Inhibition of autophagy exerts anticolon cancer effects via apoptosis induced by p53 activation and ER stress, BMC Cancer, 15 (795) 2015, s. 1-14 20. Burada F., Nicoli E. R., Ciurea M. E. et al., Autophagy in colorectal cancer An important switch from physiology to pathology, World Journal of Gastrointestinal Oncology, 7 (11) (2015), s. 271-284 21. Grossi A., Peserico A., Tezil T. et al., p38α MAPK pathway a key factor in colorectal cancer therapy and chemoresistance, World Journal of Gastroenterology, 20 (29) 2014, s. 9744-9758 22. Groulx J. F., Khalfaoui T., Benoit Y. D., Autophagy is active in normal colon mucosa, Autophagy, 8 (6) (2012), 893-902 23. Alvces S., Castro L., Fernandes M. S. et al., Colorectal cancer-related mutant KRAS alleles function as positive regulators of autophagy, Oncotarget, 6 (31) 2015, s. 30787-30802 24. Arnold C. N., Goel A., Blum H. E., Molecular pathogenesis of colorectal cancer implications for molecular diagnosis, Cancer, 104 (10) 2005, s. 2035-2047 25. Tye H., Jenkins B. J., Tying the knot between cytokine and toll – like receptor signaling in gastrointestinal tract cancer, Cancer Science, 104 (9) 2013, s. 1139-1145 26. Grande-Pulido E., Riquelme-Oliveira A., Ballesteros-Bargues J. et. al., Molecular Biology of colorectal cancer, Research Signpost. 2 (2011), s. 569-579 27. Kheirelseid E., Miller N., Chang K. H. et al., Clinical applications of gene expression in colorectal cancer, Journal of Gastrointestinal Oncology, 4 (2) (2013), s. 144-157 28. Siedlecki J., Diagnostyka molekularna nowotworów, Postępy Nauk medycznych, 2 (2011), s. 88-93 29. Wang M., Crager M., Pugazhenthi S., Modulation of apoptosis pathways by oxidative stress and autophagy in β cells, Experimental Diabetes Research, (2012), s. 1-14 30. Jęda A., Witek A., Janikowska G. i in., Profil ekspresji genów związanych z układem histaminergicznym wyznaczony techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A u kobiet z gluczorakorakiem endometrium, Ginekologia Polska, 85 (2014), s. 172-179 31. Kazula A., Wykorzystanie mikromacierzy DNA w terapii i diagnostyce, Genetyka, 65 (3) (2009), s. 229-238 109 Martyna Bednarczyk, Urszula Mazurek, Małgorzata Muc-Wierzgoń 32. Zhang L., Ju X., Cheng Y. et al., Identifying Tmem59 related gene regulatory network of mouse neural stem cell from a compendium of expression profiles, BMC System Biology, 5 (152) (2011), s. 1 -12 33. Boada-Romero E., Letek M., Fleischer A., et al., TMEM59 defines a novel ATG16L1-binding motif that promotes local activation of LC3, The EMBO Journal, 32 (2013), s. 566-582 34. Shi J., Fung G., Zhang J., et al., NBR1 is dispensable for PARK2-mediated mitophagy regardless of the presence or absence of SQSTM1, Cell Death and Disease, 6 (2015), s. 1-9 35. Sassi C., Guerreiro R., Gibbs R., et al., Investigating the role of rare coding variability in Mendelian dementia genes (APP, PSEN1, PSEN2, GRN, MAPT, and PRNP) in late-onset Alzheimer's disease, Neurobiology of Aging, 35 (12) (2014), s. 2881-2887 36. Guan JJ., Zhang XD., Sun W., et al., DRAM1 regulates apoptosis through increasing protein levels and lysosomal localization of BAX, Cell Death and Disease, 6 (2015), s. 1-12 37. Kim Y., Stone M., Hwang TH., et al., SH3BP4 is a negative regulator of amino acid-Rag GTPase-mTORC1 signaling, Molecular Cell., 46 (6) (2012), s. 1-25 38. Ying H., Qu D., Liu Ch., et al., Chemoresistance is associated with Beclin-1 and PTEN expression in epithelial ovarian cancers, Oncology Letters, 9 (2015), s. 1759-1763 39. Markowitz S., Bertagnolli M., Molecular origins of cancer: Molecular basis of colorectal cancer, The New England Journal of medicine, 361 (25) (2009), s. 2449-2460 Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu komórek raka jelita grubego Autofagocytoza, to proces biologiczny polegający na kontrolowanym rozkładzie cząsteczek, fragmentów komórki, organelli komórkowych w celu pozyskania dodatkowego źródła energii. Wyróżniamy trzy rodzaje autofagii: mikroautofagię, autofagię związaną z chaperonami (białkami opiekuńczymi) oraz makroautofagię. Celem badania było zbadanie profilu ekspresji genów związanych z autofagią w różnicowaniu komórek raka jelita grubego. Analiza profilu ekspresji genów była wykonywana przy użyciu mikromacierzy of HG-U133A (Affymetrix, Santa Clara, CA). Wyznaczanie genów różnicujących przeprowadzono z wykorzystaniem Infrastruktury PL-Grid (http://www.plgrid.pl/). Podczas analizy średnich sygnałów fluorescencji w grupach K2, NSZ i WSZ w porównaniu do K1, stwierdzono, że z grupy 26 ID mRNA wytypowano przy wartości p < 0,05, dla K2 vs K1 – 4 ID mRNA, dla NSZ vs K1 – 5 ID mRNA oraz dla WSZ vs K1 – 12 ID mRNA. Z analizy diagramu Venna wynika, że z grupy 26 ID mRNA wytypowanych jako różnicujące wycinki raka jelita grubego o niskim stopniu zaawansowania od kontroli, nie ma żadnych genów specyficznych tylko dla NSZ. W przypadku różnicowania raka jelita grubego o wysokim stopniu zaawansowania od kontroli, specyficznych jest 8 genów: dwa ID dla receptora BECN1 oraz po jednym dla TMEM59, NBR1, PSEN1, VTI1B, DRAM1 i SH3BP4. Wnioski: Zmiany molekularne wyprzedzają zmiany fenotypowe. Ekspresja genów związanych z autofagią zależy od stopnia zaawansowania gruczolakoraka 110 Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu komórek raka jelita grubego The expression profile of genes involved in autophagy in the differentiation of colon adenocarcinoma Autophagy is a biological process which plays role in cellular homeostasis by eliminating aged, damaged or malfunctioning organelles and damaged or misfolded proteins. There are three types of autophagy: microautophagy, macroautophagy and chaperone – related autophagy. The aim of this study was to compare the expression profile of genes involved in autophagy in the differentiation of colon adenocarcinoma. The analysis of the expression profile of genes was performed using oligonucleotide microarrays of HG-U133A (Affymetrix, Santa Clara, CA). Appointment of differentiating genes was performed with the use of PL-Grid Infrastructure (http://www.plgrid.pl/). The results showed that of the group 26 ID mRNA were chosen at p <0.05 for C2 vs C1 – 4 ID mRNA, for LCS vs C1 – 5 ID mRNA and for HCS vs C1 – 12 ID mRNA. The analysis of a Venn diagram shows that from 26 ID mRNA selected as a differential of colorectal cancer LCS vs C1, there is no specific genes only LCS. In the case of the differentiation of colorectal cancer HCS vs C1 – specific genes is 8, two ID for BECN1 receptor and one for TMEM59, NBR1, PSEN1, VTI1B, DRAM1 and SH3BP4. Conclusions: Molecular changes occur before phenotypic changes. Expression of genes involved in autophagy depend on the clinical stage of adenocarcinoma. 111 Dominika Lach1 Terapie przeciwzapalne – nowy cel w leczeniu ostrych zespołów wieńcowych 1. Wstęp Według danych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO, ang. World Health Organization) choroby układu krążenia, w tym choroba niedokrwienna serca, stanowią najczęstszą przyczynę zgonów na świecie. Co więcej, z powodu zwiększającego się wraz z wiekiem ryzyka wystąpienia tych zespołów chorobowych i starzenia się populacji na świecie, odnotowuje się ciągły wzrost liczby zgonów [1, 2]. Choroba niedokrwienna serca jest zespołem objawów, a ostry zespół wieńcowy (OZW) jej szczególnie niebezpieczną konsekwencją. W zależności od obserwowanych objawów klinicznych, zmian elektrokardiograficznych i badań biochemicznych OZW dzielimy na: ostry zespół wieńcowy z uniesieniem odcinka ST (STEMI, ang. ST-segment Elevation Myocardial Infarction) – ostry zawał mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST lub ostry zespół wieńcowy bez uniesienia odcinka ST (NSTE-ACS, ang. non-ST-Segment Elevation Acute Coronary Syndromes). Ponadto wśród NSTE-ACS wyróżnia się: zawał mięśnia sercowego bez uniesienia odcinka ST (NSTEMI, ang. non-ST-segment Elevation Myocardial Infarction) oraz niestabilną dławicę piersiową (UA, ang. Unstable Angina) [3]. Patofizjologia OZW, niezależnie od szerokiego spectrum manifestacji klinicznej, związana jest zawsze z erozją i/lub pęknięciem blaszki miażdżycowej, która prowadzi do zakrzepicy wewnątrz tętnicy wieńcowej, nagle zmniejszającej lub całkowicie uniemożliwiającej prawidłowy przepływ krwi, m. in. w wyniku aktywacji kaskady krzepnięcia i aktywacji płytek krwi. Pomimo ciągłego unowocześniania standardów leczenia interwencyjnego i farmakologicznego w OZW, nawracające niedokrwienia mięśnia sercowego i śmiertelność pacjentów z powodu powikłań niedokrwiennych pozostają na wysokim poziomie [4]. Z tego względu nadal potrzebne jest opracowywanie bardziej skutecznych metod zapobiegania i leczenia OZW. W tym celu konieczne jest lepsze poznanie molekularnych mechanizmów OZW. Najnowsze badania wskazują na istotną rolę aktywnych procesów zapalnych w patofizjologii OZW [5, 6]. Celem niniejszej pracy jest przed- [email protected], Katedra Biochemii Ogólnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl 112 Terapie przeciwzapalne – nowy cel w leczeniu ostrych zespołów wieńcowych stawienie najnowszych danych na temat potencjalnych terapii przeciwzapalnych u pacjentów z OZW. 2. Procesy zapalne w OZW W obrębie zmian miażdżycowych, których erozja lub pęknięcie prowadzące do niedotlenienia mięśnia sercowego, skutkuje wystąpieniem OZW, toczy się przewlekły stan zapalny. W tętnicach wieńcowych objętych zmianami miażdżycowymi dochodzi do zaburzeń interakcji międzykomórkowych pomiędzy śródbłonkiem naczyń, komórkami zapalnymi i chemokinami [7]. Zaburzenia te doprowadzają do destabilizacji, erozji i ostatecznie pęknięcia blaszki miażdżycowej. Do głównych czynników inicjujących i nasilających stan zapalny w tętnicach wieńcowych pacjentów z OZW należą mediatory zapalenia, takie jak: interleukiny (IL-1 i IL-6), białko C-reaktywne (CRP, ang. C Reactive Protein), cząsteczki adhezyjne, czynnik martwicy nowotworu (TNF-α, ang. Tumor Necrosis Factor-α) oraz metaloproteinazy [7]. Ponadto, spowodowane działaniem mediatorów prozapalnych, nagromadzenie i aktywacja makrofagów, leukocytów oraz płytek krwi w miejscu powstania blaszki miażdżycowej również istotnie wpływa na proces jej destabilizacji, erozji i pękania [8]. W tabeli 1. przedstawiono udział mediatorów prozapalnych w rozwoju zmian miażdżycowych doprowadzających do rozwoju OZW. Tab. 1 Udział wybranych mediatorów stanu zapalnego w rozwoju zmian miażdżycowych [7, 8] Mediator prozapalny VCAM-1 Miejsce wytwarzania śródbłonek ICAM-1 śródbłonek, limfocyty T i B, komórki dendrytyczne monocyty, makrofagi IL-6 Funkcja Rola ligand integryny VLA-4 ligand integryny LFA-1 adhezja leukocytów, rekrutacja monocytów adhezja leukocytów, rekrutacja monocytów cytokina, ligand CD126 aktywacja limfocytów T, stymulacja transformacji limfocytów B, hamowanie wydzielania TNF-α stymulacja makrofagów, rekrutacja neutrofilów destabilizacja blaszki miażdżycowej, synteza cytokin prozapalnych TNF-α głównie makrofagi cytokina, ligand TNF-R Metalo proteinazy m.in. śródbłonek, płytki krwi, makrofagi enzymy degradujące kolagen 113 Dominika Lach W wyniku pęknięcia blaszki miażdżycowej przebiegającego pod postacią odczynu zapalnego, również dochodzi do zaburzeń interakcji międzykomórkowych. Istotne znaczenie dla zaangażowania się mechanizmów immunologicznych w obszarze zawału ma uszkodzenie błony komórkowej kardiomiocytów spowodowane niedokrwieniem. Ponadto do zwiększenia przepuszczalności sarkolemy przyczynia się podwyższona ilość wolnych rodników (nadtlenkowego i wodorotlenowego) gromadzących się w niedokrwionym mięśniu sercowym przy równoczesnym zmniejszeniu poziomu ich inaktywatorów. Powierzchnia komórek mięśnia sercowego zmienia się również poprzez ekspresję cząsteczek adhezyjnych, co skutkuje reakcją komórek immunologicznie kompetentnych odpowiedzialnych za rozwój i utrzymanie procesu zapalnego [9]. Na komórkach endotelium dochodzi do ekspresji m.in. cząsteczki adhezji komórkowej płytkowo-śródbłonkowej 1 (PECAM-1, ang. Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1), która umożliwia przechodzenie leukocytów pomiędzy komórkami śródbłonka. Zablokowanie powierzchniowej ekspozycji PECAM-1 może zapobiec pozawałowemu uszkodzeniu mięśnia sercowego poprzez potencjalne zahamowanie migracji neutrofili [10]. W następstwie niedokrwienia dochodzi również do zmiany stężeń cząstek adhezyjnych rozpuszczalnych w osoczu. Zwiększa się ekspresja rozpuszczalnych form cząsteczek adhezji komórkowej naczyń 1 (VCAM-1, ang. Vascular Adhesion Molecule-1) oraz cząsteczek adhezji międzykomórkowej 1 (ICAM-1, ang. Intercellular Adhesion Molecule-1), a u pacjentów z UA rośnie stężenie cząsteczki biorącej udział w adhezji m.in. neutrofili do śródbłonka naczyń – selektyny – E (CD62E) [10, 11]. Powstanie nacieku zapalnego w niedokrwiennym miokardium i aktywacja wędrujących komórek zapalnych związana jest z pobudzeniem sieci cytokinowej, która pomimo licznych publikacji nie jest do końca poznana. U pacjentów po przebytym zawale mięśnia sercowego dochodzi do zwiększenia stężenia w osoczu cytokin prozapalnych (IL-1, IL-6, TNF-α). Działanie prozapalne cytokin w OZW związane jest z aktywacją cząsteczek adhezyjnych, wpływem na zwiększenie przepuszczalność śródbłonka, mobilizacją komórek monocytów i leukocytów oraz odkładaniem w ścianach naczyń cząsteczek lipidów [12]. Naciek komórek zapalnych w obrębie zawału aktywowany jest również przez chemotaktyczne oddziaływania składowych układu dopełniacza skierowane na te komórki [13]. Zaburzenia interakcji międzykomórkowych w postaci odczynu zapalnego wywołanego niedokrwieniem są istotą procesów zachodzących podczas zawału mięśnia sercowego [14]. 114 Terapie przeciwzapalne – nowy cel w leczeniu ostrych zespołów wieńcowych 3. Terapie przeciwzapalne w OZW Stosowane obecnie leki przeciwzapalne należące do niespecyficznych inhibitorów zapalenia prowadzą do niepożądanych zmian w obrębie zawału mięśnia sercowego, takich jak powiększenie obszaru zawału oraz powikłania spowodowane niedostatecznym uformowaniem blizny pozawałowej [15]. Postęp w terapii przeciwzapalnej OZW mogłoby stanowić specyficzne hamowanie procesów zapalnych. Lepsze poznanie udziału procesów pro – i przeciwzapalnych w patomechanizmie OZW zaowocowało w ostatnim czasie wzrostem liczby badań nad potencjalnymi terapiami przeciwzapalnymi. Zachodzące u pacjentów z OZW procesy zapalne mogą stanowić cel działania dla nowych kierunków terapii. Nowe leki przeciwzapalne stanowiące potencjalny efekt poszukiwań skutecznej terapii OZW różnią się zarówno mechanizmem, jak i obszarem działania i mogą wykazywać działanie uogólnione lub też działać bardziej specyficznie [16]. W tabeli 2. przedstawiono zestawienie potencjalnych leków przeciwzapalnych, będących przedmiotem szczegółowych badań u pacjentów z OZW. Tab. 2 Potencjalne cele terapii przeciwzaplnych w OZW [16] Lek Mechanizm działania Faza badań klinicznych Kolchicyna uogólnione działanie przeciwzapalne II VT-111a inhibitor proteazy serynowej I Losmapimod inhibitor kinazy p38 MAPK Wyniki Zmniejsza ryzyko wystąpienia ponownego zawału; wpływa na zmniejszenie obszaru zawału mięśnia sercowego Obniżenie poziomu troponiny w porównaniu do placebo; dopuszczony do dalszych badań III Ocena wpływu na poziom troponiny Daraplapid inhibitor fosfolipazy A2 III Brak istotnych różnic w porównaniu do placebo Gevokizumab inhibitor IL-1β Badania przedkliniczne W trakcie badań Kanakinumab inhibitor IL-1β W trakcie II W trakcie badań 115 Dominika Lach 3.1. Kolchicyna Do leków wykazujących uogólnione działanie na układ immunologiczny należy kolchicyna, która jest stosowana od lat głównie u osób z dną moczanową. Kolchicyna jest alkaloidem wykazującym szereg właściwości przeciwzapalnych. Poprzez wiązanie się z mikrotubulami tworzącymi wrzeciono kariokinetyczne, hamuje podziały komórkowe. Ponadto modyfikuje funkcje komórek układu immunologicznego wpływając na ich zdolność do fagocytozy, mobilizacji, degranulacji zawartości wewnątrzkomórkowych lizosomów oraz adhezji do śródbłonka naczyń krwionośnych [17]. Lek ten obecnie poddawany jest II fazie badań klinicznych (LoDoCo, ang. Low Dose Colchicine for Secondary Prevention of Cardiovascular Disease) w grupie pacjentów z OZW. Podczas tych 3letnich randomizowanych badań wykazano, że jej przyjmowanie w dawce 0,5 g na dobę zmniejsza ryzyko wystąpienia ponownego zawału mięśnia sercowego i powikłań OZW w porównaniu z placebo i może również wpływać na zmniejszenie obszaru zawału mięśnia sercowego [18]. 3.2. Inhibitor proteazy serynowej – VT-111a Inhibitor proteazy serynowej, – VT-111a działa poprzez wiązanie się z receptorem urokinazowego aktywatora plazminogenu (uPAR, ang. urokinase-type Plasminogen Activator Receptor), który uczestniczy w procesach zapalnych. Ten potencjalny lek w terapii przeciwzapalnej OZW powoduje obniżenie poziomu troponiny we krwi po 24 godzinach w porównaniu do placebo. Pozytywne wyniki I fazy badań pozwoliły na dopuszczenie go do dalszych testów klinicznych [19]. 3.3. Inhibitor kinazy p38 MAPK – losmapimod Losmapimod, będący inhibitorem kinazy p38 aktywowanej mitogenami (MAPK, ang. Mitogen Activated Kinases), która jest zaangażowana w regulację odpowiedzi zapalnej, cyklu komórkowego, apoptozy i różnicowanie się komórek, został poddany ocenie w badaniach klinicznych II fazy u pacjentów z OZW. Badania nad losmapimodem prowadzono w porównaniu z grupą kontrolną przyjmującą placebo. Wykazano, że stężenie białka Creaktywnego w 72 godzinie po podaniu leku było mniejsze w grupie pacjentów przyjmujących losmapimod w porównaniu z placebo, a po 12 tygodniach na porównywalnym poziomie [20]. Obecnie trwają zakrojone na szeroką skalę badania kliniczne III fazy mające ocenić wpływ losmapimodu na stężenie troponiny u pacjentów z OZW w porównaniu z chorymi przyjmującymi placebo [21]. 116 Terapie przeciwzapalne – nowy cel w leczeniu ostrych zespołów wieńcowych 3.4. Inhibitor fosfolipazy A2 – darapladip Fosfolipaza A2 jest enzymem hydrolizującym cząsteczki fosfolipidów. Darapladip to lipoproteina wiążąca się z fosfolipazą A2, która jest zaangażowana w rozwój blaszki miażdżycowej ponieważ procesy hydrolizy fosfolipidów prowadzą m. in. do powstania potencjalnie aterogennych frakcji lipidów oraz do zwiększenia ekspozycji śródbłonka naczyń krwionośnych na działanie stresu oksydacyjnego [22]. Jednakże randomizowane badania kliniczne pacjentów z OZW nie wykazały istotnych różnic w porównaniu z placebo [23]. 3.5. Inhibitory interleukiny IL-1β – gevokizumab i kanakinumab Gevokizumab i kanakinumab są przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko IL-1 beta (IL-1β), która odrywa dużą rolę w procesach prozapalnych w OZW, patogenezie miażdżycy, a także wielu innych chorobach o podłożu zapalnym. Cytokina ta obok TNF-α i IL-6 odgrywa istotną rolę w kluczowej ścieżce sygnałowej procesów zapalnych [24, 25] Gevokizumab poddawano ocenie w badaniach przedklinicznych na modelu szczurzym miażdżycy. Wykazano, iż może on istotnie hamować procesy zapalne toczące się w obrębie zmian miażdżycowych. W celu sprawdzenia jego potencjalnych możliwości hamowania procesów zapalnych w tętnicach wieńcowych u pacjentów z OZW postanowiono przeprowadzić pilotażowe badania kliniczne II fazy [26]. Natomiast kanakinumab, zatwierdzony w leczeniu rzadkich schorzeń o podłożu zapalnym, został poddany badaniom klinicznym II fazy (The CANTOS trial) na grupie pacjentów z OZW również w celu sprawdzenia wpływu na zmniejszenie stanu zapalnego w obrębie zmian miażdżycowych tętnic wieńcowych [27]. 4. Podsumowanie Ostry zespół wieńcowy stanowi jedną z najczęstszych przyczyn zgonów na świecie. Pomimo ciągłego unowocześniania standardów leczenia OZW, nawracające epizody niedokrwienia mięśnia sercowego i śmiertelność pacjentów są nadal bardzo częste. Z tego względu potrzebne jest opracowanie bardziej skutecznych metod zapobiegania i leczenia OZW. W tym celu konieczne jest dokładniejsze poznanie molekularnych mechanizmów prowadzących do rozwoju OZW. Patofizjologia OZW polega na erozji i/lub pęknięciu blaszki miażdżycowej, co prowadzi do zaczopowania tętnicy wieńcowej. Najnowsze badania wskazują również na istotną rolę aktywnych procesów zapalnych w patomechanizmach OZW. Lepsze poznanie udziału procesów pro – i przeciwzapalnych w patomechanizmie OZW zaowocowało w ostatnich latach wzrostem liczby 117 Dominika Lach badań nad potencjalnymi terapiami przeciwzapalnymi. Prowadzone aktualnie duże wieloośrodkowe badania klinicznie pozwolą zweryfikować skuteczność i bezpieczeństwo potencjalnych terapii przeciwzapalnych. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. http://www.who.int Centres for Disease Control and Prevention. Deaths: Final Data for 2013, Natl Vital Stat Rep 2013 Kumar A., Cannon C. P., Acute Coronary Syndromes: Diagnosis and Management, Part I., Mayo Clinical Proc 2009; 84, s. 917-938 Smolina K., Wright F. L., Rayner M., Goldacre M. J., Long-term survival and recurrence after acute myocardial infarction in England 2004 to 2010, Circ Cardiovasc Qual Outcomes 2012; 5, s. 532-40 Libby P., Tabas I., Fredman G., Fisher E. A., Inflammation and its resolution as determinants of acute coronary syndromes, Circ Res 2014; 114, s.1867-79 Falk E., Nakano M., Bentzon J. F., Finn A. V., Virmani R., Update on acute coronary syndromes: the pathologists view, European Heart of Journal 2013; 34, s.719-28 Pasqui A. L., Di Renzo M., Pro-inflammatory/anti-inflammatory cytokine imbalance in acute coronary syndromes, Clin Exp Med 2006; 6, s. 3844 Bonetti P. O., Lerman L. O., Endothelian dysfunction – a marker of atherosclerotic risk, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; 23, s. 168-175 Ishibashi T., Kijama M., Yokoyama K., Expresion of cytokine and adhesion molecule mRNA in atherectomy specimens from patients with coronary artery disease, Jpn Circ J 1999; 63, s. 249-254 Murohara T., Delyani J. A., Albelda S. M., Lefer A. M., Blockade of endothelial cell adhesion molecule-1 protects against myocardial ischemia and reperfusion injury in cats, Journal of Immunology 1996; 156, s. 3550-1557 Wallen N.H., Elevated serum intercellular adhesion molecule-1 and vascular adhesion molecule-1 among patients with stable angina pectoris who suffer cardiovascular death or nonfatal myocardial infarction, European Heart of Journal 1999; s. 20: 1039-1043 Marciniak A., Rokownicze znaczenie osoczowego stężenia Il-1, Il-6, Il-8 oraz CRP w zawale serca, Pol Arch Med Wewn 2003; 109, s. 15-22 Lucchesi B. R., Kilgore K. S., Complements inhibitors in myocardial ischemia/reperfusion injury, Immunopharmacology 1997; 38, s. 27-42 Niessen H. W., Lagrand W. K., Visser C. A., Meijer C. J., Hack C. E., Upregulation of ICAM-1 on cardiomyocytes in jeopardized human myocardium during infraction, Cardiovascular Research 1999; 41, s. 603-610 Young M. J., Rickard A. J., Mineralocorticoid receptors in the heart: lessons from cell selective transgenic animals, Journal of Endocrinology, 2015; 224, s.1-13 Ridker P. M., Luscher T. F., Anti-inflammatory therapies for cardiovascular disease, Eur Heart J 2014; 35, s. 1782-91 118 Terapie przeciwzapalne – nowy cel w leczeniu ostrych zespołów wieńcowych 17. Nuki G., Colchicine: its mechanism of action and efficacy in crystal-induced inflammation, Current Rheumatology Rep 2008; 10, s. 218-27 18. Nidorf S. M., Eikelboom J. W., Budgeon C. A., Thompson P. L., Low-dose colchicine for secondary prevention of cardiovascular disease, Journal of the American College of Cardiology 2013; 61, s. 404-10 19. Tardif J. C., L’Allier P. L., Gregoire J., Ibrahim R., McFadden G., Kostuk W., Knudtson M., Labinaz M., Waksman R., Pepine C. J., Macaulay C., Guertin M. C., A randomized controlled, phase 2 trial of the viral serpin Serp-1 in patients with acute coronary syndromes undergoing percutaneous coronary intervention, Circulation Cardiovascular Interventions 2010; 3, s. 543-8 20. Newby L. K., Marber M. S., Melloni C., Sarov-Blat L., Aberle L. H., Aylward P. E., Cai G., de Winter R. J., Hamm C. W., Heitner J. F., Kim R., Lerman A., Patel M. R., Tanguay J. F., Lepore J. J., Al-Khalidi H. R., Sprecher D. L., Granger C. B.; SOLSTICE Investigators., Losmapimod, a novel p38 mitogen activated protein kinase inhibitor, in non-ST-segment elevation myocardial infarction: a randomized phase 2 trial, The Lancet 2014; 384 (9949) s. 1187-95 21. GlaxoSmithKline. A Phase 3 clinical outcomes study to compare the incidence of major adverse cardiovascular events in subjects presenting with acute coronary syndrome treated with losmapimod compared to placebo (LATITUDE-TIMI 60), ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02145468 22. Rosenson R. S., Stafforini D. M., Modulation of oxidative stress, inflammation, and atherosclerosis by lipoprotein-associated phospholipase A2, J Lipid Res, 2012; 53, s. 1767-82 23. O’Donoghue M. L., Braunwald E., White H. D., Lukas M. A., Tarka E., Steg P. G., Hochman J. S., Bode C., Maggioni A. P., Im K., Shannon J. B., Davies R. Y., Murphy S. A., Crugnale S. E., Wiviott S. D., Bonaca M. P., Watson D. F., Weaver W. D., Serruys P. W., Cannon C. P,, SOLID-TIMI 52 Investigators, Steen D. L., Effect of darapladib on major coronary events after an acute coronary syndrome: the SOLID-TIMI 52 randomized clinical trial, JAMA 2014; 312, s. 1006-15 24. Dinarello C. A., Interleukin-1 in the pathogenesis and treatment of inflammatory diseases, Blood 2011; 117, s. 3720-32 25. Ridker P.M., Howard C.P., Walter V., Everett B., Libby P., Hensen J., Thuren T., Effects of interleukin-1b inhibition with canakinumab on IL-6, fibrinogen, and hsCRP: A Randomized placebo controlled trial, Journal of American College of Cardiology 2012; 59(13s1):E1539 26. Roubille F., Busseuil D., Shi Y., Nachar W., Mihalache-Avram T., Mecteau M., Gillis M. A., Brand G., Theberge-Julien G., Brodeur M. R., Kernaleguen A. E., Gombos M., Rheaume E., The interleukin-1beta modulator gevokizumab reduces neointimal proliferation and improves reendothelialization in a rat carotid denudation model, Atherosclerosis 2014; 236, s. 277-85 27. Novartis Pharmaceuticals. Cardiovascular risk reduction study (reduction in recurrent major CV disease events) (CANTOS), ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01327846; 2011 119 Dominika Lach Terapie przeciwzapalne – nowy cel w leczeniu ostrych zespołów wieńcowych Choroba niedokrwienna serca jest zespołem objawów chorobowych stanowiących najczęstszą przyczynę zgonów na świecie. Szczególnie niebezpieczną jej konsekwencją jest ostry zespół wieńcowy (OZW) charakteryzujący się znacznym ograniczeniem lub ustaniem przepływu krwi w tętnicach wieńcowych. Pomimo ciągłego unowocześniania standardów leczenia interwencyjnego i farmakologicznego, nawracające niedokrwienia mięśnia sercowego i śmiertelność pacjentów pozostają na wysokim poziomie. Z tego względu potrzebne jest opracowanie bardziej skutecznych metod zapobiegania i leczenia OZW. W tym celu konieczne jest lepsze poznanie molekularnych mechanizmów OZW. Patofizjologia OZW najczęściej polega na erozji i pękaniu blaszki miażdżycowej, co prowadzi do zaczopowania tętnicy wieńcowej. Najnowsze badania wskazują na istotną rolę aktywnych procesów zapalnych w patofizjologii OZW. Leki przeciwzapalne stanowiące potencjalny efekt poszukiwania terapii OZW różnią się zarówno mechanizmem, jak i obszarem działania i mogą wykazywać działanie uogólnione (kolchicyna) lub też działać bardziej specyficznie (VT-111a, losmapimod, daraplapid, gevokizumab, kanakinumab). Celem niniejszej pracy jest przedstawienie najnowszych danych na temat potencjalnych terapii przeciwzapalnych u pacjentów z OZW. Anti-inflammatory therapies – a new target for the treatment of acute coronary syndromes Ischemic heart disease (IHS) is a syndrome of symptoms which are the most common cause of death in the world. The especially dangerous consequence of IHS is acute coronary syndrome (ACS) that is characterized by a significant reduction or cessation of blood flow in the coronary arteries. Despite the continuous upgrading of standards of interventional and pharmacological treatment in ACS, recurrent myocardial ischemia and mortality of patients remain at a high level. For this reason, there is still a need to develop more effective methods of prevention and treatment of ACS. For this purpose, a better understanding of the molecular mechanisms of ACS is necessary. Pathophysiology of ACS usually consists of erosion and rupture of atherosclerotic plaques, leading to coronary artery obstruction. Recent studies point to the important role of active inflammatory processes in the pathophysiology of ACS. Anti-inflammatory drugs, which are being searched for effective therapy of ACS, are different due to the mechanism or activity area, and may have general (colchicine) or specific (VT-111a, losmapimod, daraplapid, gevokizumab and canacinumab) action. The aim of this study is to present the latest data on the potential anti-inflammatory therapy in patients with ACS. 120 Karolina Kątska1, Jan Ostrowski2, Ewa Kosior-Jarecka3 Zaburzenia ze strony narządu wzroku w przebiegu oponiaków 1. Wstęp Oponiaki należą do najczęstszych guzów mózgu, które stwierdza się u osób dorosłych. Stanowią około 20% pierwotnych nowotworów wewnątrzczaszkowych, wykazują zazwyczaj łagodny charakter. Obserwowane są zwykle u pacjentów w 4. i 5. dekadzie życia, dwukrotnie częściej u kobiet niż u mężczyzn. Oponiaki są guzami pochodzenia łącznotkankowego, rozwijającymi się z komórek kosmków pajęczynówki. Guzy te są wyraźnie odgraniczone od otaczającej je tkanki mózgowej, nie powodują jej naciekania, lecz jedynie ucisk [1]. Zaburzenia ze strony narządu wzroku stanowią częstą i niejednokrotnie pierwszą manifestację kliniczną oponiaków. Objawy oczne są najbardziej wyrażone w oponiakach wywodzących się z następujących struktur tj. osłonek nerwu wzrokowego, rynienki węchowej, guzka siodła tureckiego (oponiaki nadsiodłowe) oraz skrzydła kości klinowej. Guzy te mogą powodować ucisk nerwu wzrokowego i w konsekwencji jego zanik. Do częstych objawów oponiaków należą m.in. zaburzenia ostrości wzroku, ubytki w polu widzenia ale także dwojenie, wytrzeszcz czy zaburzenia widzenia barw. 2. Cel pracy Celem niniejszej pracy było omówienie wybranych rodzajów oponiaków wykazujących istotne klinicznie objawy oczne na podstawie przeglądu aktualnego piśmiennictwa. Z uwagi na możliwość penetracji tej grupy oponiaków w obręb tkanek oczodołowych u pacjentów dotkniętych tymi schorzeniami może dochodzić do zaburzeń widzenia i innych objawów dotyczących narządu wzroku. Z tego względu zasadne wydało się zwrócenie uwagi na te, nie tak rzadkie, patologie wewnątrzczaszkowe. 1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze Okulistyki Uniwersytetu Medycznego w Lublinie 2 ) [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze Okulistyki Uniwersytetu Medycznego w Lublinie 3 [email protected], Klinika Diagnostyki i Mikrochirurgii Jaskry Katedry Okulistyki Uniwersyetu Medycznego w Lublinie 121 Karolina Kątska, Jan Ostrowski, Ewa Kosior-Jarecka 3. Charakterystyka wybranych oponiaków Niektóre guzy wewnątrzczaszkowe powodują postępujące deficyty widzenia oraz ubytki w polu widzenia w ciągu tygodni lub miesięcy zanim zostanie postawiona ostateczna diagnoza [2]. Początkowe objawy są często niewłaściwie interpretowane zarówno przez samych pacjentów jak i lekarzy, co powoduje opóźnienie w rozpoczęciu odpowiednich badań [3]. Należy zwrócić uwagę na fakt, że w wielu przypadkach okulista jest pierwszym lekarzem, do którego zgłasza sie pacjent, zanim trafi do właściwego specjalisty [3]. 3.1. Oponiak osłonek nerwu wzrokowego Oponiak osłonek nerwu wzrokowego (ONSM – Optic Nerve Sheath Meningioma) jest łagodnym guzem występującym w obrębie oczodołu, czasem wrastającym do przestrzeni wewnątrzczaszkowej. Stanowi 1-2% wszystkich oponiaków. Zachorowania są częstsze u kobiet (5:1) w średnim wieku (30-40 lat), rzadziej dzieci [4]. ONSM jest rzadkim nowotworem wywodzącym się z komórek pajęczynówki nerwu wzrokowego (II). Opona pajęcza otacza nerw II w odcinku wewnątrzoczodołowym i w kanale wzrokowym, występowanie ONSM stwierdza się częściej w pierwszej lokalizacji (92%). Pierwotnie zlokalizowane w przednim dole czaszki oponiaki naciekające odcinek wewnątrzczaszkowy nerwu i wkraczające do oczodołu określane są niekiedy jako wtórne ONSM [6]. OSNMs są to guzy które wywodzą się z komórek kosmków pajęczynówki i mogą rozwinąć się w każdej lokalizacji wzdłuż całego przebiegu osłonki nerwu. Guzy te wykazują charakter wzrostu typowy dla oponiaków, następujący drogą najmniejszego oporu. Zajęcie przez oponiaki otaczającej opony twardej, tkanek, mięśni i kości oczodołu jest rzadkie aczkolwiek takie przypadki były notowane. Wraz ze swoim rozwojem, nowotwór ten upośledza funkcje nerwu wzrokowego, głównie poprzez wywoływanie efektu masy na naczynia zaopatrujące oponę miękką, co wywołuje zmiany o charakterze niedokrwiennym oraz zaburza transport aksonalny. Ponadto ONSMs rosną otaczając nerw II na jego obwodzie co powoduje oddzielenie struktur nerwu od jego zaopatrzenia w krew. Ten charakter wzrostu sprawia, że guzy te stają się często niemożliwe do usunięcia bez istotnego naruszenia struktury nerwu II [7]. Klasyczna triada objawów obejmuje: zanik nerwu wzrokowego, spadek ostrości widzenia i obecność naczynia wzrokoworzęskowego krążenia obocznego [4, 7]. Jednakże jednoczesne wystąpienie wszystkich trzech objawów u jednego pacjenta jest rzadkie [9]. Najczęstszym objawem występującym u pacjentów z ONSM (obecny w około 96% przypadkach) jest bezbolesny, przewlekły spadek ostrości widzenia lub ubytki w polu widzenia które mogą utrzymywać się przez okres od 122 Zaburzenia ze strony narządu wzroku w przebiegu oponiaków 1-5 lat zanim pacjent zgłosi się do lekarza. Spośród rzadziej spotykanych objawów obserwuje się wytrzeszcz, dwojenie, względny defekt aferentnej drogi odruchu źrenicznego oraz zaburzenie widzenia barw [4]. Do innych niespecyficznych dolegliwości należą ból zlokalizowany w oczodole i bóle głowy, które to objawy były obserwowane u 2-50% pacjentów z ONSM [7]. Badanie dna oka praktycznie zawsze ukazuje patologiczny wygląd tarczy nerwu wzrokowego, na który może się składać jej obrzęk i różnego stopnia zanik nerwu wzrokowego, co może wskazywać na neuropatię uciskową nerwu II [8]. Do obrzęku tarczy nerwu wzrokowego dochodzi zazwyczaj gdy guz otacza lub powoduje ucisk odcinka wewnątrzoczodołowego nerwu [8]. Trudności diagnostyczne polegają na różnicowaniu ONSM z glejakami n.II. Diagnostyki różnicowej wymagają również sarkoidoza, chłoniak, hemangiopericytoma, oczodołowa schwannoma, demielinizacyjne zapalenie nerwu II, przerzuty nowotworowe [4]. Rysunek 1. Oponiak nerwu wzrokowego. U góry: wczesny ucisk nerwu wzrokowego; u dołu: wytrzeszcz jako późny objaw (rycina zaadaptowana z [9]) Najważniejszym badaniem, które pozwala na rozpoznanie oponiaka jest tomografia komputerowa (TK) oczodołów, która wykazuje cylindryczne pogrubienie nerwu wzrokowego, a w 20% przypadków także obecność patologicznych zwapnień w obrębie guza. Patognomoniczną cechą jest obecność zwapnień w TK, które mogą dawać obraz „szyn tramwajowych”, tzn. cewkowatego wzmocnienia echogennego zwapnień w pochewkach n. II. Alternatywnym badaniem jest rezonans magnetyczny (MR), który jest szczególnie przydatny w ocenie wewnątrzczaszkowej ekspansji guza [4, 10]. Postępowanie w przypadku oponiaków nerwu wzrokowego powinno być indywidualnie dobrane dla każdego pacjenta. U osób w średnim wieku, z powoli rosnącym guzem, gdzie rokowanie jest dobre, wystarczy obser123 Karolina Kątska, Jan Ostrowski, Ewa Kosior-Jarecka wacja. Jeśli stwierdza się postęp zmian, przy zachowanej zadowalającej ostrości wzroku, postępowaniem z wyboru jest nowoczesna trójwymiarowa radioterapia, polegająca na stosowaniu odpowiednio dawkowanej wiązki promieni, celowanej na pochewki nerwu wzrokowego. U młodszych pacjentów, z tendencją do rozrostu zmiany, należy usunąć ją chirurgicznie, oszczędzając gałkę oczną. W przypadku bardziej agresywnego przebiegu, najpierw usuwa się dostępną masę guza, a następnie stosuje się radioterapię. Oponiak nerwu wzrokowego to zmiana łagodna, rośnie powoli i rokowanie jest zazwyczaj dobre. Duży odsetek oponiaków można bezpiecznie obserwować przez wiele lat. Guzy o ciężkim przebiegu, penetrujące wewnątrzczaszkowo, mogą stanowić zagrożenie nawet dla życia chorego, na szczęście są to zmiany niezwykle rzadkie. Rokowanie w przypadku oponiaka nerwu wzrokowego jest dużo gorsze u dzieci niż u dorosłych [10]. 3.2. Oponiaki wewnątrzczaszkowe Oponiaki podstawy przedniego dołu czaszki są guzami wewnątrzczaszkowymi powodującymi istotne zaburzenia ze strony narządu wzroku. Jest to niejednorodna grupa, obejmująca guzy szeroko rozmieszczone na podstawie przedniego dołu czaszki, począwszy od oponiaków rynienki węchowej, poprzez oponiaki mające swój przyczep na łęku klinowym, aż do oponiaków okolicy guzka siodła tureckiego. Ta grupa nowotworów, z uwagi na różnorodność miejsca przyczepu oponowego, cechuje się różnym charakterem wzrostu w stosunku do nerwów wzrokowych i naczyń podstawy czaszki, a przez to odmiennością objawów i różnym przebiegiem choroby u chorych z oponiakami zlokalizowanymi odpowiednio w przedniej i tylnej części podstawy przedniego dołu czaszki. Niezależnie jednak od ścisłej lokalizacji oponiaki podstawy przedniego dołu czaszki mogą powodować zaburzenia widzenia, które często są głównym objawem klinicznym i których ustąpienie po leczeniu operacyjnym w pierwszym rzędzie decyduje o powrocie pacjenta do pełni zdrowia [13]. 124 Zaburzenia ze strony narządu wzroku w przebiegu oponiaków Rysunek 1. Ucisk wewnątrzczaszkowy odcinka nerwu wzrokowego przez oponiaki oraz ubytki w polu widzenia spowodowane uciskiem oponiaka guzka siodła tureckiego (rycina zaadaptowana z [11]) 3.2.1. Oponiaki rynienki węchowej Oponiak rynienki węchowej należy do grupy oponiaków wewnątrzczaszkowych. Częstość występowania tego nowotworu sięga 8-14% wszystkich guzów pochodzenia oponowego. Oponiaki te są najczęściej obustronne i asymetryczne. Rozrastają się zazwyczaj w obrębie środkowej części przedniego dołu czaszki, między grzebieniem kogucim, znajdującym się w centralnej części kości sitowej, a szwem czołowo-klinowym [1]. Jest to anatomicznie najsłabsza część pokrywy czaszki, dlatego nowotwór szybko penetruje do podstawy czaszki oraz oczodółu, zatok przynosowych i jamy nosa. Oponiaki rynienki węchowej rosną wolno i, zanim pojawią się pierwsze cechy wzrostu ciśnienia wewnątrzczaszkowego, osiągają zazwyczaj dość duże rozmiary. Przez większość czasu pozostają nieme klinicznie [12]. Zaburzenia ze strony narządu wzroku pod postacią pogorszenia ostrości wzroku oraz ubytków w polu widzenia stanowią istotny i często pierwszy zauważalny przez pacjentów objaw rozwijającego się guza. Objawy oczne występują najczęściej w zaawansowanych postaciach nowotworu, gdy masa guza uciska od góry i spycha ku tyłowi skrzyżowanie nerwów wzrokowych lub też na skutek nadciśnienia wewnątrzczaszkowego powstaje obrzęk tarcz nerwów wzrokowych i cechy ich wtórnego zaniku. Triada objawów charakterystycznych dla oponiaka rynienki węchowej określana jest jako zespół Fostera-Kennedy’ego. W jego skład wchodzą zaburzenia węchu po stronie nowotworu, zanik 125 Karolina Kątska, Jan Ostrowski, Ewa Kosior-Jarecka tarczy n.II po tej samej stronie i tarcza zastoinowa po stronie przeciwnej. W czasie powolnego rozwoju nowotwory te stopniowo uciskają płaty czołowe, powoduje to zaburzenia osobowości i funkcji poznawczych, związane z uszkodzeniem tej okolicy mózgu [1]. Według wielu retrospektywnie opisywanych przypadków, najczęstszym objawem okazuje się być ból głowy. Dolegliwość ta jest zazwyczaj zgłaszana wówczas gdy guz osiągnie duże rozmiary. Natomiast osłabienie węchu, często stwierdzane w badaniu neurologicznym juz po przyjęciu chorego do szpitala, rzadko bywa objawem zwracającym uwagę pacjenta i prowadzącym do postawienia właściwego rozpoznania [3]. 3.2.2. Oponiaki nadsiodłowe Oponiaki nadsiodłowe wyrastają najczęściej z okolicy guzka siodła tureckiego i płaszczyzny klinowej- mogą również mieć swój początek w przeponie siodła tureckiego, rosnąc zarówno do wnętrza siodła jak i ku górze [14]. Stanowią one około 3-10% oponiaków wewnątrzczaszkowych [15]. Pierwszym objawem klinicznym w przypadku guzów o tej lokalizacji są zaburzenia wzrokowe, rozpoczynające się ograniczeniem pola widzenia [14]. Wynika to z faktu, że oponiaki wyrastające z guzka siodła tureckiego już we wczesnym etapie wzrostu wnikają pod skrzyżowanie nerwów wzrokowych i unosząc je ku górze, powodują krytyczne napięcie zarówno skrzyżowania jak i nerwów wzrokowych. Wielu autorów podkreśla dominującą w obrazie klinicznym tych oponiaków stosunkowo szybką, często niezauważalną dla pacjenta utratę widzenia [13]. Najczęściej postępująca utrata widzenia ma charakter niesymetryczny, czasem rozpoczyna się od niedowidzenia połowiczego dwuskroniowego, pierwotnego lub wtórnego zaniku tarcz nn. wzrokowych, czasem zespołu Foster-Kennedy’ego. Oponiaki nadsiodłowe uciskają jeden bądź oba nn. wzrokowe wraz ze skrzyżowaniem ku tyłowi, najczęściej nie naciekając tętnicy szyjnej wewnętrznej. Duże guzy mogą przemieszczać skrzyżowanie nn. wzrokowych zarówno ku dołowi, jak i ku górze, rozpychając na boki tętnice szyjne i odsuwając od skrzyżowania kompleks obu tętnic przednich. Rzadziej występujące objawy stanowią bóle głowy, a w dalszej kolejności zaburzenia psychiczne, zniesienie węchu, napady padaczkowe, podwójne widzenie, ból oka i zaburzenia hormonalne [15]. 3.2.3. Oponiaki skrzydła kości klinowej Oponiaki położone wzdłuż skrzydła kości klinowej stanowią około 18%. Guzy te są zlokalizowane w pobliżu istotnych struktur nerwowych i naczyniowych tj. nerw wzrokowy, zatoka jamista, tętnica szyjna wewnętrzna oraz tętnice środkowe mózgu. W skutek tego, odpowiadają one 126 Zaburzenia ze strony narządu wzroku w przebiegu oponiaków za wysoki odsetek zachorowań i przypadków śmiertelnych. Wśród objawów tych nowotworów wymienia się bóle głowy, utratę widzenia, epizody niedokrwienne oraz podwójne widzenie wynikające z porażenia jednego lub więcej mięśni zewnętrznych gałki ocznej [16]. Oponiaki skrzydła kości klinowej, w zależności od kształtu, sklasyfikowano na nowotwory typu „guzowatego”, przybierające kulisty kształt oraz oponiaki typu pełzającego „en plaque”. Oponiaki kuliste to guzy obrastające i przemieszczające w różnym stopniu tętnice wewnątrzczaszkowe i nerwy czaszkowe, mające swój przyczep oponowy. Guzy rosnące w sposób pełzający, płaskie, wnikają do kości przez kanały Haversa, powodując jej przebudowę. Oponiaki „en plaque” naciekają kości podstawy czaszki i części twarzowej czaszki, nierzadko doprowadzając do znacznego zniekształcenia twarzy, przez przebudowę kości i zaburzenia w odpływie żylnym [14]. Spośród oponiaków o guzowatym typie wzrostu, ze względu na miejsce przyczepu i odmienną symptomatologię, wyodrębniono oponiaki przyśrodkowej, środkowej i zewnętrznej części skrzydła mniejszego kości klinowej. Oponiaki 1/3 przyśrodkowej części najczęściej poza jednostronną utratą wzroku powodują powoli narastającą oftalmoplegię, połączoną z wytrzeszczem gałki ocznej (spowodowanym utrudnieniem odpływu żylnego z oczodołu), a w końcu zajęcie I gałęzi nerwu trójdzielnego, spowodowane uciskiem bocznej ściany zatoki. Oponiaki zlokalizowane w części środkowej często rozrastają się do znacznych rozmiarów, powodując dominujące objawy wzmożonego ciśnienia śródczaszkowego w postaci bólów głowy, wymiotów i obrzęku tarcz nn. wzrokowych. Zaburzenia w polu widzenia, zniesienie węchu po stronie guza i napady padaczkowe z aurą wzrokową i węchową pojawiają się zazwyczaj w późnym okresie choroby. Kuliste oponiaki zewnętrznej części skrzydła mniejszego kości klinowej powodują objawy patologicznej masy w okolicy skroniowej bądź czołowej w przeciwieństwie do oponiaków „en plaque”. Te ostatnie objawiają się najczęściej zniekształceniem okolicy skroniowej, powolnym narastaniem wytrzeszczu gałki ocznej, spowodowanym pogrubieniem kości, wrastaniem guza do wnętrza oczodołu, utrudnieniem odpływu żylnego czy odpływu chłonki z oczodołu i wreszcie narastającymi zaburzeniami w polu widzenia [14]. 4. Diagnostyka i leczenie Rozpoznanie oponiaka ustala się na podstawie obrazu klinicznego oraz charakterystycznych zmian widocznych w tomografii komputerowej i rezonansie magnetycznym. Objawy okulistyczne mogą stanowić niejednokrotnie pierwsze symptomy obecności guza a zaobserwowanie szybkiej progresji spadku ostrości widzenia i dołączanie się objawów 127 Karolina Kątska, Jan Ostrowski, Ewa Kosior-Jarecka dodatkowych powinno skłonić lekarza okulistę do uwzględnienia patologii wewnątrzczaszkowej w diagnostyce różnicowej. Najskuteczniejszym sposobem leczenia oponiaków jest ich całkowita resekcja chirurgiczna. Często jest ona jednak trudna do wykonania ze względu na naciekanie przez komórki nowotworowe naczyń tętniczych mózgu, nerwów wzrokowych oraz kości przedniego dołu czaszki. Coraz częściej więc wykorzystuje się techniki mikrochirurgiczne. Leczenie oponiaków bywa wspomagane radioterapią oraz embolizacją patologicznych naczyń guza. Decyzja o podjęciu interwencji chirurgicznej zależy od wielu czynników, między innymi od stopnia wizualizacji guza, jego rozmiarów i zachowania okolicznych struktur nerwowych i naczyniowych oraz ryzyka rozwoju powikłań. O skuteczności leczenia oponiaków świadczy brak nawrotu choroby. Częstość nawrotów zależy przede wszystkim od tego, jak szybko dokonano resekcji i czy była ona kompletna [10]. Istnieje zgodność, że decydującymi czynnikami wpływającymi na wyniki leczenia są przede wszystkim wielkość guza oraz ostrość widzenia przed operacją. W sposób znamienny poprawę widzenia rokują także brak zaniku nerwu wzrokowego na dnie oka i zachowana ostrość wzroku powyżej 0,3. Nawet w przypadkach śladowo zachowanej funkcji wzroku i obecności zaniku nerwu wzrokowego na dnie oka w ok. 20% przypadków można liczyć na istotną poprawę widzenia po leczeniu operacyjnym. Stwierdzenie ślepoty przed operacją nie rokuje poprawy po leczeniu operacyjnym [13]. 5. Podsumowanie Oponiaki należą do jednych z najczęściej występujących guzów mózgu, stwierdzanych u osób dorosłych. Zaburzenia ze strony narządu wzroku są istotne klinicznie i niejednokrotnie stanowią pierwsze objawy rozrastającego się guza. Objawy oczne są najczęściej stwierdzane w oponiakach osłonek nerwu wzrokowego oraz oponiakach wewnątrzczaszkowych tj. rynienki węchowej, guzka siodła tureckiego (oponiaki nadsiodłowe) oraz skrzydła kości klinowej. Należy zwrócić uwagę, iż okulista może być lekarzem do którego w pierwszej kolejności zgłosi się pacjent z oponiakiem manifestującym się objawami zarówno neurologicznymi jak i okulistycznymi. Zaburzenia neurookulistyczne powinny być uważnie monitorowane ażeby uniknąć opóźnienia w kwestii postawienia diagnozy patologii wewnątrzczaszkowej [3]. Najbardziej przydatne w diagnostyce oponiaków, oprócz obrazu klinicznego są badania obrazowe, głównie TK i MR. Całkowita chirurgiczna resekcja guza stanowi w większości przypadków jedyną trwale skuteczną metodę leczenia. 128 Zaburzenia ze strony narządu wzroku w przebiegu oponiaków Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Napora K. J., Obuchowska I., Mariak Z., Objawy okulistyczne w przebiegu oponiaka rynienki węchowej, OKULISTYKA, 4 (2011), s. 105-107 Aui-aree N., Phruanchroen C., Oearsakul T., Hirunpat S., Sangthong R., Three years experience of suprasellar tumors in neuro-ophthalmology clinic, Journal of the Medical Association of Thailand, 7 (2010), s. 818-23 Jung J. J., Warren F. A., Kahanowicz R., Bilateral visual loss due to a giant olfactory meningioma, Clinical Ophthalmology, 6 (2012), s. 339-342 Chipczyńska B., Grałek M., Trzebicka A., Hautz W., Kanigowska K., Klimczak-Ślączka D., Obustronny oponiak osłonek nerwu wzrokowego (ONSM)problemy diagnostyczne i lecznicze, Klinika Oczna, 4-6 (2006), s. 202-205 Sefi-Yurdakul N., Visual findings as primary manifestations in patients with intracranial tumors, International Journal of Ophthalmology 8 (2015), s. 800-803 Dutton J. J., Optic nerve sheath meningiomas, Survey of Ophthalmology, 37 (1992), s. 167-183 Eddleman C. S., Liu J. K., Optic nerve sheath meningioma: current diagnosis and treatment, Neurosurgical Focus, 23 (2007), s. 1-7 Miller N. R., Primary tumours of the optic nerve and its sheath, Eye 18 (2004), s. 1026-1037 Kański J. J., red. wyd. pol. Zagórski Z. Okulistyka Kliniczna, 1 (1997), s.50 http://okulistyka.mp.pl/chorobyoczu/neurookulistykaizez/83020,oponiaknerwu-wzrokowego Kański J. J., Bowling B., red. wyd. pol.: Szaflik J., Izdebska J. Okulistyka kliniczna, 4 (2013), s.106-107 Tuna H., Bozkurt M., Ayten M., Erdogan A., Deda H., Olfactory groove meningiomas, Journal of Clinical Neuroscience, 6 (2005), s. 664-8 Nowak A., Marchel A., Leczenie operacyjne oponiaków podstawy przedniego dołu czaszki, Neurologia I Neurochirurgia Polska, 40 (2006), s. 484-492 Ząbek M., Zarys neurochirurgii, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 1 (1999), s. 56-70 Chi J. H., Mcdermott M. W., Tuberculum SellaeMeningiomas, Neurosurgical Focus, 14 (2003) Chaichana K. L., Jackson C., Patel A., Miller N. R., Subramanian P., Lim M., Gallia G., Olivi A., Weingart J., Brem H., Quiones-Hinojosa A., Predictors of Visual Outcome Following Surgical Resection of Medial Sphenoid Wing Meningiomas, Journal of Neurological Surgery, 73 (2012), s. 321-326 Lindsay K. W, Bone I., Neurologia i Neurochirurgia. Elsevier Urban&Partner, Wrocław, 1 (2004), s. 321-323 129 Karolina Kątska, Jan Ostrowski, Ewa Kosior-Jarecka Zaburzenia ze strony narządu wzroku w przebiegu oponiaków Oponiaki należą do najczęstszych guzów mózgu, które stwierdza się u osób dorosłych. Zachorowania są częstsze u kobiet w średnim wieku. W wielu przypadkach objawy oponiaków pochodzące z narządu wzroku pojawiają się jako pierwsze, co może być przydatne w postawieniu właściwej diagnozy. Manifestacja oczna stanowi istotny element obrazu klinicznego wielu spośród tych chorób, a w szczególności oponiaka osłonek nerwu wzrokowego oraz oponiaków przedniego dołu czaszki tj. oponiak rynienki węchowej, guzka siodła tureckiego oraz skrzydła kości klinowej. Do najczęstszych objawów należą zaburzenia ostrości wzroku, ubytki w polu widzenia, dwojenie czy też wytrzeszcz. Guzy te mogą powodować ucisk nerwu wzrokowego a nawet jego zanik. Diagnostyka opiera się na obrazie klinicznym oraz badaniach obrazowych. Najskuteczniejszym sposobem leczenia oponiaków jest ich całkowita resekcja chirurgiczna. Ocular disorders in the course of meningiomas Meningiomas are the most common tumors of the brain that are found in adults. The disease most often develops in middle-aged women. In many cases, ocular symptoms of meningiomas appear first, which might be useful for a diagnosis. Ocular manifestation is an important part of the clinical picture of many of these diseases, especially optic nerve sheath meningioma and anterior cranial fossa meningiomas, ie. olfactory groove meningioma, tuberculum sella and sphenoid wing. The most common symptoms include deterioration of vision acuity, visual field defects, diplopia or proptosis. These tumors can cause compression of the optic nerve and even its atrophy. Diagnosis is based on clinical presentation and imaging studies. The most effective treatment for meningiomas is their complete surgical resection. 130 Anna Łabejszo1, Tomasz Wandtke2, Maciej Gawroński3 Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych – immunopatogeneza i leczenie 1. Wprowadzenie, pojęcia wstępne Niniejsza praca ma na celu przegląd informacji o obecnym stanie wiedzy dotyczącej alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych, a także prezentację metod leczenia tejże choroby oraz przybliżenie nowych perspektyw terapeutycznych. Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych (AZPP, HP – hypersensitivity pneumonitis) to choroba, rozwijająca się u osób wcześniej narażonych ekspozycją na antygen, u których doprowadziło to do rozwoju uczulenia. Jest to schorzenie o charakterze ziarniniakowym, a skłonności do zapadania na tę chorobę są indywidualną predyspozycją [1, 2]. Nie istnieją jednoznaczne kryteria do rozpoznania choroby. Uważa się, że u osób narażonych na ekspozycję na czynniki środowiskowe, warunki klimatyczne, pyły pochodzące z przemysłu rolno-spożywczego, a także pora roku mają wpływ na częstsze występowanie tego schorzenia [3, 4]. W związku z różnorodnością czynników uczulających wyróżniamy wiele rodzajów alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych, m.in.: płuco farmera – charakteryzujące się występowaniem w organizmie pacjenta precypityn, czyli rodzaju przeciwciał surowicy krwi powodujących wytrącanie się (tzw. precypitację) z roztworu rozpuszczalnego antygenu, w tym przypadku są nim termofilne promieniowce. Na podstawie badańimmunofluorescencyjnych wycinków płuc stwierdza się obecność precypityn w przegrodach międzypęcherzykowych i w ścianie oskrzeli. Choroba ta najczęściej występuje u mężczyzn w wieku 40-50 lat. U osób z ostrą postacią choroby okresem, w którym odnotowuje się szczyt zachorowań to koniec lata i zimy, czyli najbardziej intensywne okresy pracy w rolnictwie. Diagnozę schorzenia często utrudniają podobne objawy 1 [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy 2 [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy 3 [email protected] 131 Anna Łabejszo, Tomasz Wandtke, Maciej Gawroński jak w przypadku innych chorób układu oddechowego: astmy, przewlekłej obturacyjnej choroby płuc [5, 19]; płuco hodowców ptaków – w przypadku tej choroby jednym z antygenów jest mucyna, wydzielana do przewodu pokarmowego zwierząt i wydalana z odchodami. Schorzenie dotyka najczęściej hodowców gołębi, kur, kaczek, papug, gęsi oraz ptaków dzikich. Istotnym czynnikiem rozwoju choroby jest bezpośredni kontakt z ptactwem. Badacze stwierdzili, iż progresja choroby jest skorelowana ze stężeniem przeciwciał IgG1 oraz IgG3, a jak wiadomo IgG to klasa immunoglobulin o istotnym znaczeniu w walce z patogenami wnikającymi do organizmu. Ich stężenie w surowicy jest największe w porównaniu z przeciwciałami innych klas [6, 7, 20]; choroba hodowców grzybów – reakcję alergiczną mogą wywoływać tak jak w przypadku płuca farmera promieniowce termofilne. Wysoka temperatura i wilgotność to warunki, w jakich hoduje się grzyby, a to sprzyja rozwojowi promieniowców. Pyły unoszące się przy uprawie wywołują u osób wrażliwych reakcję alergiczną prowadzącą do rozwinięcia stanu chorobowego; płuco robotników produkujących środki piorące – przyczyną schorzenia jest reakcja alergiczna, jaką wywołują antygeny laseczki siennej (Bacillus subtilis). Mimo doniesień naukowych wskazujących na związek między bakterią, a występowaniem choroby nie udało się wyizolować swoistych przeciwciał; izocyjanianowe HP – przyczyną schorzenia jest reakcja na pełnowartościowy antygen powstały z połączenia izocyjanianu (haptenu) i białek wydzieliny dróg oddechowych [2, 6]. Według najnowszych danych można wyróżnić około 200 antygenów powodujących HP. W tabeli zestawiono najczęstsze antygeny i odpowiadające im typy alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych [9]. 132 Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych – immunopatogeneza i leczenie Tabela 1. Czynniki wywołujące AZPP [9] Antygen Micropolysporafaeni Źródło Systemy nawilżające powietrze, klimatyzatory Izocyjaniany, cynk Farby, plastik Pyrethrum Pestycydy Białko sierści zwierząt futerkowych Białka surowicy, skóry, sierści, odchodów zwierząt laboratoryjnych Zwierzęta laboratoryjne Płuco pracowników laboratoriów Trichosporoncutaneus Środowisko domowe Promieniowce termofilne, Saccharopolyspora Spleśniałe siano Mycobacteriumavium Płuco pracowników przemysłu chemicznego AZPP wywołane środkami owadobójczymi Płuco kuśnierzy Penicillium sp. Mycobacteriumspecies Płuco nawilżaczowe Futra Surowica, pióra, odchody gołębi, papug, kaczek, indyków Płyny stosowane do chłodzenia metalu w przemyśle metalowym Woda w basenach, jaccuzi, itp. Sery Białka surowicy, piór, odchodów ptaków Choroba Płuco hodowcy ptaków Płuco pracowników przemysłu metalowego hot tub lung Płuco serowarów Japońskie letnie zapalenie pęcherzyków płucnych Płuco farmera Źródło: [9] Podział AZPP na postać ostrą, podostrą i przewlekłą, poddaje się dyskusji dlatego obecnie przyjmuje się wyróżnienie typów: ostry postępujący – charakterystyczne są objawy wymagające hospita-lizacji, które występują niedługo po ekspozycji na antygen (2-9 godzin); ostry przerywany – objawy pojawiają się po ekspozycji, ale nie są tak nasilone jak w postaci ostrej postępującej, pomiędzy epizodami wyniki badań chorego są w normie i nie pojawiają się objawy; subkliniczny – charakteryzuje się obecnością przeciwciał skierowanych przeciw antygenom, nie występują objawy, natomiast przy 133 Anna Łabejszo, Tomasz Wandtke, Maciej Gawroński ciągłej ekspozycji na czynnik uczulający może dojść do rozwoju postaci przewlekłej; przewlekły postępujący – może przebiegać z początku w utajeniu, lub rozwija się z nawracających ostrych epizodów, charakterystyczna jest zwiększająca się duszność wysiłkowa, kaszel, co może doprowadzić do włóknienia płuc [18]. Częstość zachorowań w Polsce na alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych wynosi 10/100 tys. i jest trzecią pod tym względem chorobą śródmiąższową w Polsce [8]. 2. Immunopatogeneza Przyczyną alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych jest powtarzająca się ekspozycja na daną cząstkę immunologiczną, która wywołuje reakcję alergiczną. Istotnym jest fakt, że cząstki te mają wielkość poniżej 5 µm przedostają się do dolnych dróg oddechowych, a konkretnie wnikają do pęcherzyków płucnych i organizm nie jest w stanie ich usunąć. Czy rozwinie się dalej choroba decydują o tym czynniki takie, jak: predyspozycja osobnicza, odpowiednie stężenie alergenów czy też współistnienie kofaktorów, którymi mogą być infekcje grzybicze, wirusowe. W HP mamy do czynienia z typem III i IV reakcji immunologicznej. Typ III wiąże się z produkcją przeciwciał klasy IgG oraz IgM. Precypityny (przeciwciała) tworzą z antygenami, które przedostały się z pęcherzyków płucnych do krwi kompleksy immunologiczne [10]. Ich obecność nie została potwierdzona wynikami badań, biopsja płuc wykazuje tylko nacieki granulocytów i limfocytów [11]. Powstałe kompleksy immunologiczne uruchamiają układ dopełniacza. Ten natomiast stymuluje aktywację makrofagów (komórek żernych), stanowiących znaczący element w obronie organizmu. Makrofagi zaczynają wydzielać szereg chemokin i cytokin: interleukinę 8 (IL-8),czynnik martwicy guza α (TNF-α) oraz interleukinę 6 (IL-6),makrofagowe białko hamujące (MIP-1). Ich zadaniem jest wzmaganie procesu zapalnego, a dodatkowo powodują napływ makrofagów i neutrofili do śródmiąższu. Makrofagi wydzielają też w większych ilościach czynnik tworzenia kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) oraz lizozym, kolagenzę, elastazę i rodniki tlenowe odpowiedzialne za uszkodzenia pęcherzyków płucnych. Jest to pierwszy etap odpowiedzi na antygen [12]. Jednak ważniejszą rolę w immunopatogenezie alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych odgrywa reakcja typu późnego (typ IV), w której zaangażowane są limfocyty T. Liczba aktywnych limfocytów wzrasta i może osiągnąć nawet do 70% ogólnej liczby komórek odzyskanych z płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. W dużym stopniu wzrasta poziom limfocytów CD8+ (cytotoksycznych), a w mniejszym CD4+ (pomocniczych). W proces tworzenia ziarniniaków szczególnie zaangażowane są 134 Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych – immunopatogeneza i leczenie limfocyty CD4+, inaczej Th. Jedna subpopulacja tych limfocytów- Th1 uwalnia interferon γ (INFγ) i IL-2, a druga Th2- szereg interleukin : 4, 5, 10 [2]. Postuluje się, że przewaga limfocytów CD8+ jest związana z aktywną fazą choroby, natomiast przewaga komórek CD4+ świadczy o postępującym procesie włóknienia [12]. Niezwykle ważnym elementem patogenezy jest podłoże genetyczne stanu zapalnego. Mianowicie badacze sugerują, iż geny kodujące układ zgodności tkankowej o zwiększonej częstości występowania alleli HLA – DQB1 oraz HLA – DR B1 koreluje z przebiegiem reakcji zapalnej u chorych hodowców gołębi [11]. Na uwagę zasługuje również interleukina 10, której niedobór powoduje, że aktywność komórek Th1 nie jest hamowana, czego konsekwencją jest ciągle wzrastające lub utrzymujące się na wysokim poziomie stężenie interferonu γ. W konsekwencji prowadzi to do rozwoju zapalnej reakcji ziarniniakowej [2]. Wysoki odsetek limfocytów jest związany nie tylko z nadmiernym ich napływem do pęcherzyków płucnych, ale także z zaburzonym procesem zaprogramowanej śmierci komórki, czyli apoptozy [13]. To zjawisko ma miejsce nie tylko w AZPP, ale jest istotnym elementem patogenezy innych chorób śródmiąższowych, takich jak sarkoidoza, samoistne włóknienie płuc, czy nieswoiste śródmiąższowe zapalenie płuc. Na uwagę zasługują także komórki NK– natural killers, bowiem w ostrym przebiegu AZPP komórki NK występują w zwiększonych ilościach w stosunku do liczby u osób zdrowych [2]. Interesującym wydaje się fakt, że osoby palące mniej są narażone na rozwój AZPP, być może dlatego, że cechują się niższym stężeniem przeciwciał klasy IgG, które są skierowane przeciw antygenom. Naukowcy tłumaczą to występowaniem w dymie tytoniowym substancji mających supresyjny wpływ na odpowiedź immunologiczną prowadzącą do wytwarzania interleukiny 1 i TNFα i rozwoju stanu zapalnego [2]. 3. Metody badań i wykrywania Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych diagnozuje się na podstawie badania radiologicznego klatki piersiowej, badania czynnościowego, laboratoryjnego, płukania oskrzelowo-pęcherzykowego oraz badania histologicznego. W niniejszej pracy uwaga zostanie skupiona na metodach dających informację o obrazie immunologicznym. W celu prawidłowego rozpoznania choroby w pierwszej kolejności zbierany jest wyczerpujący wywiad. Ważną informacją wymagającą uwzględnienia jest fakt czy pacjent ma kontakt z cząstkami pochodzenia organicznego o rozmiarach pozwalających przemieszczenie do dolnych dróg oddechowych [2]. Badanie radiologiczne klatki piersiowej jest zazwyczaj pierwszym krokiem w ocenie pacjenta z podejrzeniem AZPP. Podobnie jak w innych chorobach śródmiąższowych ukazuje niespecyficzne wyniki, szczególnie 135 Anna Łabejszo, Tomasz Wandtke, Maciej Gawroński w typie ostrym i podostrym [21]. Z uwagi jednak na niedoskonałość podziału na postać ostrą, podostrą i przewlekłą Ismail proponuje podział na cztery typy. W postaci podostrej w środkowych i dolnych obszarach płuc obserwuje się zacienienia guzkowe słabo odgraniczone, a w postaci przewlekłej ogniska zagęszczeń miąższowych mają charakter nieregularny, płuca mają zmniejszoną objętość. Znacznie istotniejszą rolę w diagnozowaniu zmian w płucach ma tomografia komputerowa klatki piersiowej (HRCT). Metoda ta jest znacznie bardziej czuła niż RTG. Dzięki tej metodzie diagnostycznej można wykryć zmiany odpowiadające poszczególnym obrazom histopatologicznym [9]. Badania laboratoryjnego nie wykonuje się rutynowo z powodu zbyt małej ilości danych, które pozwalałyby na rozpoznanie AZPP. Jeśli już jest przeprowadzane to analizie poddawana jest krew, w której po wywołaniu alergenem odpowiedzi można zaobserwować nowo wykształcone granulocyty obojętnochłonne, a także zjawisko eozynofilii. Mogą również wystąpić zwiększone stężenia lizozymu i enzymu przekształcającego angiotensynę (ACE). Enzym ten jest odpowiedzialny za konwersję angiotensyny I do angiotensyny II, która wykazuje właściwości powodujące kurczenie naczyń krwionośnych. Spośród chorych istnieje grupa, u której we krwi można wykryć przeciwciała skierowane przeciw antygenom wywołującym AZPP [9,17].Zaobserwować można podwyższone stężenia immunoglobulin IgM i IgG, czasem także obecność białka C-reaktywnego, czynnika reumatoidalnego (RF) [15]. Jednak nie upoważnia to do rozpoznania choroby [4,9,18]. Bardziej pomocnym, ale niewyrokującym okazuje się być płukanie oskrzelowo pęcherzykowe (bronchoalveolarlavage, BAL), dzięki któremu można uzyskać obraz różnych populacji komórkowych. Kilka godzin od pobrania materiału BAL po ekspozycji na alergen zwiększa się ilość populacji granulocytów obojętnochłonnych, potem ten poziom się obniża. Jednak w ciągu następnych godzin wzrasta frakcja limfocytów i utrzymuje się nawet kilka lat przy braku ponownego kontaktu z alergenem. W większości badań obserwowana jest limfocytoza na poziomie powyżej 50% ogólnej liczby komórek w płynie z BAL. W populacji limfocytów przeważają Tc, czyli limfocyty cytotoksyczne CD8+ (stosunek limfocytów CD4/CD8 w większości przypadków wynosi poniżej 1) [2]. Można również w niektórych przypadkach dostrzec zwiększony odsetek komórek plazmatycznych, tucznych i eozynofilii [4]. Badanie histologiczne dostarcza nam więcej informacji. W fazie ostrej alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych, już w niewielkim czasie po ekspozycji na alergen stwierdza się obecność nacieków neutrofilów i eozynofilóww oskrzelikach, pęcherzykach płucnych i wokół naczyń krwionośnych. W miarę upływu czasu uwidaczniają się nie tylko nacieki zapalne, ale formują się też ziarniniaki. Jeśli ekspozycja na alergen nie jest kontynuowana ziarniniaki mogą ulec wchłonieniu, ale naciek z komórek zapalnych pozostaje [4]. 136 Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych – immunopatogeneza i leczenie 4. Leczenie Do działań profilaktycznych przede wszystkim zalicza się unikanie ekspozycji na alergeny wywołujące chorobę poprzez zmianę środowiska. Jeśli nie jest to możliwe, to w miarę możliwości wymagane jest stosowanie masek ochronnych, filtrów, odzieży ochronnej, czy też opracowanie technologii mających na celu zapobieganie wilgoceniu siana i rozwojowi grzybów [9]. Z reguły przy ostrym przebiegu HP to wystarczy by objawy choroby uległy cofnięciu. W celu przyspieszenia reemisji choroby stosuje się leczenie glikokortykosteroidami (GCS) w dawce 0,5 mg//kg m.c. do czasu ustąpienia objawów spowodowanych ekspozycją na antygen. A następnie w okresie około 6 tygodni odstawia się leki.Kortykoterapia może być wskazana w przypadku pacjentów z typem podostrym postępującym i przewlekłym jednak nie wydaje się by miała wpływ na długotrwały wynik [21]. Aby zapobiec dalszemu włóknieniu stosuje się próby leczenia skojarzonego- GCS z lekami immunosupresyjnymi, np. zazatiopryną wykazującą działanie cytotoksyczne [4, 16]. W jednym z badań przeprowadzonych na myszach naukowcy próbowali zneutralizować interleukinę (IL-17), która jak wiadomo, wzmaga proces zapalny, stosując poliklonalne przeciwciała skierowane przeciw IL-17. Dzięki zmniejszeniu aktywności tej cytokiny HP miało łagodniejszy przebieg. Dane te podkreślają istotną rolę IL-17 w czasie progresji choroby. Potrzebne są jednak dalsze badania [14]. 5. Podsumowanie Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych jest chorobą spowodowaną przez reakcję immunologiczną na antygeny środowiskowe, którymi mogą być, np. pyły, zanieczyszczenia środowiska, grzyby, bakterie. Ze względu na rodzaj antygenu wyróżniamy wiele odmian tej choroby. Objawami charakterystycznymi są m.in. duszność, kaszel, gorączka. Patogeneza choroby wiąże się z III i IV typem reakcji immunologicznej, w których istotną rolę odgrywają przeciwciała klasy IgG i IgM. Przeciwciała tworzą z antygenem kompleksy immunologiczne, które uruchamiają kaskadę zdarzeń prowadzącą do rozwinięcia stanu zapalnego, a następnie procesu włóknienia. Jednoznaczna przyczyna, dlaczego alergeny będące w środowisku wzmagają odpowiedź immunologiczną nie jest znana. AZPP diagnozuje się na podstawie badania radiologicznego, tomografii komputerowej klatki piersiowej, adodatkowych cennych informacji dostarcza badanie histopatologiczne i BAL. Charakterystyczna jest limfocytoza na poziomie powyżej 50% ogólnej liczby komórek odzyskanych z BAL. W populacji limfocytów przeważa frakcja tych o charakterze cytotoksycznym. Brak obecnie standardu w postępowaniu leczniczym 137 Anna Łabejszo, Tomasz Wandtke, Maciej Gawroński AZPP. Stosuje się terapię glikokortykosteroidami, lecz u niektórych osób schorzenie przechodzi w fazę przewlekłą z włóknieniem, w którym leczenie jest często nieskutecznei zmniejszenie objawów klinicznych jest krótkotrwałe. Podejmowane są próby leczeniaskojarzonego – GCS z lekami immunosupresyjnymi, np. z azatiopryną. Przy tak wąskim zakresie stosowanych terapii wydaje się być koniecznym poznawanie i rozważanie zagadnień związanych z mechanizmami immunologicznymi i podłożem genetycznym choroby w celu opracowania lepszych metod leczenia skierowanych na przeciwdziałanie przyczynom, a nie tylko niwelowaniu objawów. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Bourke S. J., Dalphin J. C., Boyd G., Hypersensitivity pneumonitis: current concepts, European Respiratory Journal, 18, (2001), s. 81-92 Wiatr E., Rowińska-Zakrzewska E., Pirożyński M., Choroby śródmiąższowe płuc, α-medicapress, (2012), s. 124-133 Selman M., Hypersensitivity pneumonitis, Interstitial lung diseases, (2003), s. 452-484 Diego C. P., Cullinan P., Extrinsic allergic alveolitis. European Respiratory Monograph, 46 (2009), s. 112-125 Monakare S., Haahtela T., Farmer‘s lung – a 5 yr. follow-up of eighty-six patients, Clinical & Experimental Allergy,17 (1987), s. 143-51 Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W.,Stokłosa T., Imunnologia, Wydawnictwo Naukowe PWN, (2013), s. 129-137 Rose C., Lara A., Hypersensitivity pneumonitis, Murray&Nadel’s Textbook of Respiratory Medicine, (2010), s. 1587-1601 Rowińska-Zakrzewska E., Bestry I., Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych, Choroby Wewnętrzne, (2005), s. 580-583. Lewandowska K., Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych, Postępy Nauk Medycznych, 4 (2011), s. 274-285 Woda B. A., Hypersensitivity pneumonitis an immunopathology review, Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 132 (2008), s. 204-205 Mcsharry C., Anderson K., Bourke S. J., Boyd G., Takes your breath away – the immunology of allergic alveolitis,Clinical & Experimental Immunology, 128 (2002), s. 3-9 Lacasse Y., Assayag E., Cormier Y., Myths and controversies in hypersensitivity pneumonitis, Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine, 29 (2008), s. 631-642 Girard M., Lacasse Y., Cormier Y., Hypersensitivity pneumonitis, Allergy, 64(2009), s. 322-334 Amrita D. J., Daniel J. F., Sameer R. O., Glenda T., Kevin R. F., Fernando J. M., Cory M. H.,: Interleukin-17–mediated Immunopathogenesis in Experimental Hypersensitivity Pneumonitis, American Journal Of Respiratory And Critical Care Medicine, 179 (2009) s. 705-716 138 Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych – immunopatogeneza i leczenie 15. Selman M., Mejia M., Pardo A., Hypersensitivity pneumonitis, Intersitial pulmonary and bronchiolar disorders, (2008), s. 267-288 16. Navarro C., Meja M., Gaxiola M., Mendoza F., Carrillo G., Selman M., Hypersensitivity pneumonitis, Treatments in Respiratory Medicine, 5 (2006), s. 167-179 17. Richerson H. B., Bernstein I. L., Fink J. N. et al., Guidlines for the clinical evaluation of hypersensitivity pneumonitis: report of the Subcomittee on Hypersensitivity Pneumonitis, The Journal Of Allergy And Clinical Immunology, 84 (1989), s. 839-844 18. Ismail T., Mcsharry C., Boyd G., Extrinsic allergic alveolitis, Respirology, 11 (2006),s. 262-268 19. Kirkhorn S. R., Garry V. F., Agricultural Lung Diseases, Environmental Health Perspectives, 108 (2000), s. 705-712 20. Hanak V., Golbin J. M., Ryu J. H., Causes and presenting features in 85 consecutive patients with hypersensitivity pneumonitis, Mayo Clinic proceedings, 82 (2007), s. 812-816 21. Spagnolo P., Rossi G., Cavazza A., Bonifazi M., Paladini I., Bonella F., Sverzellati N., Costabel U., Hypersensitivity Pneumonitis: A Comprehensive Review, J Investig Allergol Clin Immunol., 25(4), 2015, s. 237-250 Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych- immunopatogeneza i leczenie Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych (HP) to choroba ziarniniakowa miąższu płuc i oskrzelików, której przyczyną jest reakcja alergiczna na ciągłe lub powtarzane narażenie na antygeny środowiskowe, którymi mogą być pyły przemysłu rolniczego i spożywczego, białka bakterii, roślin i zwierząt, grzyby lub też cząstki nieorganiczne, takie jak izocyjaniany. Objawami towarzyszącymi chorobie są: gorączka, kaszel, duszność, ból głowy, narastająca duszność wysiłkowa. Wyróżniamy wiele odmian tej choroby, m.in. płuco farmera, płuco kuśnierzy, czy płuco hodowców ptaków.Proces zapalny zaczyna się od odpowiedzi układu immunologicznego w postaci reakcji nadwrażliwości typu III (kompleksy immunologiczne), a następnie (z punktu widzenia całej patogenezy) ważniejszego etapu, czyli reakcji typu IV (reakcja komórkowa typu późnego). Jeśli proces ten nie zostanie zahamowany z czasem postępuje włóknienie. Przy stawianiu diagnozy bierze się pod uwagę wynik badania histologicznego, radiologicznego klatki piersiowej, badania czynnościowego, laboratoryjnego, płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Podwyższone stężenie przeciwciał klasy IgG i IgM, limfocytoza z przeważającą ilością limfocytów cytotoksycznych to charakterystyczne cechy AZPP. Obserwuje się też obecność ziarniniaków oraz cechy zapalenia oskrzelików i śródmiąższowego włóknienia. W płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego przeważają limfocyty, które mogą stanowić nawet około 70% składu komórkowego płynu. Najskuteczniejszym działaniem jakie można podjąć by zapobiegać rozwojowi choroby to zaprzestanie ekspozycji na antygen powodujący reakcję alergiczną. W ciężkich i przewlekłych przypadkach stosuje się terapię kortykosteroidową, leczenie skojarzone- GCS z lekami immunosupresyjnymi. Naukowcy próbują opracowywać coraz to nowe metody leczenia, czego przykładem są badania nad interleukiną 17. 139 Anna Łabejszo, Tomasz Wandtke, Maciej Gawroński Hypersensitivity pneumonitis- immunopathogenesis and treatment Hypersensitivity pneumonitis (HP) is an inflammatory disease of the lung parenchyma and bronchioles, caused by continuous, repeated exposure to environmental antigens, such asdusts ofagricultural industry and nutritional industry, bacterial proteins, plants and animals, fungi or inorganic particles, such as isocyanates. The symptoms associated with the disease include fever, cough, shortness of breath, headache, progressive dyspnoea.There are several variations of this disease, including farmer's lung, furriers’ lung, or bird breeders’ lung. Theinflammatory process begins with the type IIIimmune response (creation of immune complexes), and subsequently by the type IV reaction (delayed cell response), which is more important step from the point of view of the whole pathogenesis. If this process is not stopped, in time the fibrosis will progress. The diagnosis takes into account the results of histologic examination, chest X-ray, functional testing, laboratory testing, bronchoalveolar lavage, but the most important is HRCT of lung. Characteristics of HP are: increased concentration of IgG and IgM, lymphocytosis with prevalent amount of cytotoxic lymphocytes. The presence of granulomas and features of bronchiolitis and interstitial fibrosis is also observed. In bronchoalveolar lavage fluid prevalent lymphocytes are observed, they may constitute up about 70% of the cellular composition of this fluid.The most effective action that patients can uptake to prevent development of the disease is eradicate exposure to the antigen, which cause an allergic reaction. In severe or chronic cases corticosteroid therapy, or combinated therapy with GCS andimmunosuppressants is necessary. Scientists are trying to develop new, more effective methods of treatment, for example by studying role of interleukin 17 in inflammation processes. 140 Adrian Dubicki1 Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci. Rodzaje kasków korekcyjnych oraz metody ich wykonywania 1. Wstęp Przed wiekami odmienność w budowie ciała, a szczególnie w kształcie głowy, była wyznacznikiem statusu społecznego, cechą rozpoznawczą danej kultury lub talizmanem. Z tego powodu czaszka była często poddawana celowym deformacjom. Większość współczesnego społeczeństwa unika takiego wyróżniania się i dąży do idealnego wyglądu. Dlatego gdy dojdzie do zniekształcenia czaszki u dziecka, rodzice ze względów zdrowotnych, jak i estetycznych coraz częściej decydują się na leczenie. Połączenie wiedzy medycznej z techniczną pozwala na szybkie i dokładne postawienie diagnozy oraz rozpoczęcie leczenia prowadzącego do przywrócenia prawidłowego kształtu czaszki dziecka. Czas w przypadku tego schorzenia ma zasadniczy wpływ. Zbyt późne stwierdzenie deformacji może ograniczyć możliwość wykorzystania nieinwazyjnych, nieoperacyjnych metod korekcji, a nawet doprowadzić do uszkodzeń neurologicznych wywołanych zwiększonym ciśnieniem śródczaszkowym. Współczesna medycyna wypracowała metody korekcji deformacji – od inwazyjnych operacji chirurgicznych do nieinwazyjnych ortez, zwanych kaskami korekcyjnymi, które szczegółowo opisano w niniejszej pracy. Wzrost zainteresowania leczeniem schorzeń czaszki stanowi inspirację do tworzenia nowych metod terapii. 2. Cel pracy Zamysłem niniejszej pracy jest usystematyzowanie wiedzy z zakresu metod leczenia deformacji czaszki u dzieci. W pracy szczególną uwagę poświęcono kaskom korekcyjnym, które stają się coraz częściej stosowaną metodą leczenia deformacji ułożeniowych czaszki. 1 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej, Wydział Mechaniczny, Politechnika Białostocka, www.pb.edu.pl 141 Adrian Dubicki 3. Rodzaje deformacji Powstanie deformacji związane jest z zaburzeniami wzrostu płaskich kości czaszki. Rozwijające się mózgowie powoduje wzrost ciśnienia śródczaszkowego co sprawia, że łączące poszczególne kości czaszki szwy ulegają rozciągnięciu. Gdy możliwość swobodnego wzrostu kości we wszystkich kierunkach jest zaburzona, dochodzi do powstania deformacji [1]. Gdy przyczyną deformacji jest przedwczesne zamknięcie czy zrośnięcie się pojedynczego lub kilku szwów czaszkowych, mamy do czynienia z kraniosynostozą. Takie schorzenie występuje u jednego na 2500 żywo urodzonych dzieci. W zależności od tego który szew uległ przedwczesnemu zrośnięciu, głowa przybiera konkretny kształt. Nazwy rodzajów kraniosynostoz tworzone są na podstawie wyglądu czaszki. Możemy więc wyróżnić łódkogłowie, krótkogłowie, trójkątnogłowie i skośnogłowie. Leczenie tego rodzaju deformacji wymaga najczęściej interwencji chirurgicznej [2]. Przyczyną deformacji może być również długotrwały zewnętrzny ucisk na daną okolicę czaszki. Ciągle rosnące, miękkie kości ulegają zniekształceniu, gdyż uniemożliwiony jest rozwój mózgowia w danym, uciskanym kierunku. Tutaj wyróżniamy deformacje ułożeniowe takie jak łódkogłowie, krótkogłowie oraz skośnogłowie. W większości wypadków nie zagrażają one powikłaniom neurologicznym ani rozwojowym u dziecka. Wiążą się głównie z aspektem estetycznym [1, 3]. 4. Metody leczenia Leczenie deformacji czaszki w każdym przypadku wymaga indywidualnego podejścia. Pierwszym i niezbędnym krokiem jest dokładna diagnoza wskazująca przyczynę powstania deformacji oraz jej zaawansowanie. Pozwala ona obrać odpowiednią ścieżkę leczenia lub jego zaniechanie. Podstawową metodą w przypadku stwierdzenia kraniosynostoz jest zabieg chirurgiczny. Głównym jego celem jest rozcięcie skostniałych szwów. Tradycyjne operacje wiążą się z dużym ryzykiem i obecnie stosowane są w ciężkich przypadkach kraniosynostozy. Gdy zrośnięciu uległ pojedynczy szew, możliwe jest wykonanie zabiegu przy użyciu endoskopu. Głównym celem jest zmniejszenie ciśnienia śródczaszkowego oraz dodatkowo poprawa estetyki kształtu głowy [4, 5]. Gdy przyczyna deformacji nie wynika z synostozy szwów ważny jest poziom zaawansowania deformacji. Gdy zniekształcenie jest lekkie, lekarze zalecają metodę odpowiedniego pozycjonowania dziecka. Pomaga ona w korekcji małych deformacji, ale jej skuteczność objawia się głównie wtedy gdy stosowana jest do zapobiegania powstaniu zniekształceń głowy. W bardziej zaawansowanych przypadkach stosuje się zaopatrzenie orto- 142 Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci. Rodzaje kasków korekcyjnych oraz metody ich wykonywania pedyczne. Specjalnie dopasowane kaski lub opaski pomagają w korygowaniu kształtu głowy nawet już u raczkujących czy zaczynających chodzić dzieci. Wywoływane przez nie naciski w miejscach zniekształcenia uniemożliwiają dalsze ich postępowanie i stopniową poprawę geometrii czaszki [6]. Wzrost liczby przypadków takich deformacji powoduje powstawanie coraz to nowych metod leczenia. Stosowane są specjalne poduszki odpowiednio układające głowę dziecka. Jedną z metod jest też powstała w USA chiropraktyka. Nie zdobyła ona jednak uznania wśród lekarzy. Nową, będącą w fazie testów klinicznych terapią jest leczenie farmakologiczne. Gdy istnieje ryzyko genetycznych kraniosynostoz, to (aby im zapobiec) ciężarnej kobiecie podawany jest lek. Hamuje on aktywność zaangażowanego w rozwój zrostów szwów enzymu ERK, który regulowany jest przez zmutowane geny FGF. Przed takim leczeniem należy jednak wykonać szereg skomplikowanych badań genetycznych aby sprawdzić mutacje tych genów. Niestety takie leczenie jest zapobiegawcze i musi rozpocząć się jeszcze w życiu płodowym [7]. 4.1. Zabiegi chirurgiczne Interwencja chirurgiczna najczęściej stosowana jest w przypadku deformacji wywołanej kraniosynostozą. W zależności od ilości zrośniętych szwów, zabieg może być wykonany inwazyjnie lub mało inwazyjnie przy użyciu endoskopu. Głównym celem tego zabiegu jest zmniejszenie ciśnienia wewnątrzczaszkowego oraz poprawa efektu estetycznego. Zabiegi powinny być wykonywane jak najwcześniej, najlepiej do ukończenia 1 roku życia. Kości dziecka są wtedy miękkie i nie doprowadza się do powikłań neurologicznych. Ich późniejsze przeprowadzenie prawdopodobnie uniemożliwia zastosowanie endoskopu [8]. 4.1.1. Operacje klasyczne Kiedyś podstawowym (dziś stosowanym tylko w skomplikowanych przypadkach deformacji czaszki) rodzajem zabiegu była operacja klasyczna. Polega ona na wycięciu kostnych pasków wraz ze zrośniętymi szwami i dopasowaniu sąsiadujących kości w czaszce. Jest zabiegiem poważnym, wiążącym się z dużym ryzykiem poprzez podanie znieczulenia oraz dużą utratę krwi. Pomimo tego częstotliwość komplikacji utrzymuje się na poziomie ok. 2%, co czyni ten rodzaj leczenia bezpiecznym. Ma to związek ze stosowaniem coraz to nowocześniejszych technik wspomagających planowanie operacji [9, 10]. Często stosowana jest przez chirurgów metoda „π”. Polega ona na rozcięciu zrośniętego, poprzecznego szwu oraz przecięciu kości po obu 143 Adrian Dubicki stronach podłużnego szwu (rys. 1). Rozcięcia czaszki kształtem przypominają gracką literę π, która stała się nazwą tej metody. Powstały jej liczne modyfikacje, zależne od rodzaju deformacji [10]. Rysunek 1. Model głowy z łódkogłowiem przed zabiegiem (po lewej) i po wykonaniu nacięć π [10] Inną metodą w bardziej zaawansowanych przypadkach jest podzielenie czaszki półksiężycowatymi nacięciami na segmenty. Są one odpowiednio docinane, dopasowywane i (jeżeli zachodzi taka potrzeba) zamieniane między sobą (rys. 2), tak aby uzyskać jak najlepszy efekt zabiegu [10]. Rysunek 2. Schemat korekcji metodą całkowitej rekonstrukcji – segmentacja łódkogłowia [10] 144 Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci. Rodzaje kasków korekcyjnych oraz metody ich wykonywania W przypadku zrostu większości szwów czaszka może zostać ponacinana aby umożliwić jej rozrost (rys. 3). W tym przypadku coraz częściej używane jest oprogramowanie komputerowe pomagające uzyskać modele bryłowe i numeryczne umożliwiające przeprowadzenie analiz i otrzymanie wizualizacji efektów leczenia [9]. Rysunek 3. Nacięcia czaszki podczas klasycznej operacji [9] Po takich zabiegach często w celu ochrony czaszki stosuje się specjalne kaski. Zostały one opisane w rozdziale 4.2.1. 4.1.2. Zabiegi endoskopowe Przeprowadzenie zabiegu przy użyciu endoskopu najczęściej stosowane jest u dzieci do 6 miesiąca życia, u których występują izolowane kraniosynostozy (skostnienia jednego szwu). Wprowadzany podskórnie endoskop z odpowiednią końcówką rozcina skostniałe szwy umożliwiając normalny wzrost czaszki. Po ich rozcięciu (w zależności od przypadku), kości mogą zostać od siebie oddalone za pomocą specjalnych płytek (rys. 4A). Po takim zabiegu zaleca się stosowanie specjalnych kasków modelujących czaszkę, aby podczas wzrostu przybrała ona prawidłową geometrię [11]. 145 Adrian Dubicki Rysunek 4. Zabiegi endoskopowe: A – metoda rozcięcia szwów, B – metoda nacięcia czaszki [11] Inną techniką stosowaną przy operacjach endoskopowych jest nacięcie czaszki w takich miejscach, aby podczas wzrostu kości czaszki naturalnie przybierały odpowiedni kształt (rys. 4B). W tym przypadku wzrost czaszki odbywa się podobnie jak u zdrowego dziecka i nie jest potrzebne stosowanie ortez modelujących [11]. Zabieg endoskopowy jest bardziej korzystny od klasycznej operacji. Jest to zabieg mało inwazyjny, dzięki czemu zmniejsza się ryzyko powikłań. Poprzez zmniejszenie miejsca cięcia poprawia się również efekt kosmetyczny. Dodatkowo jego wykonanie jest możliwe w pierwszych miesiącach życia, dzięki czemu unika się zwiększenia ciśnienia śródczaszkowego i powikłań neurologicznych oraz uzyskuje lepszą korekcję czaszki [8]. Rysunek 5. Zabieg usunięcia synostozy szwów przy użyciu endoskopu [12] Współcześnie operacje przy użyciu endoskopu cieszą się coraz większą popularnością, co skutkuje szybkim rozwojem tej techniki, zarówno poprzez nowe pola wykorzystania w leczeniu, jak i w coraz nowocześniejszych modelach endoskopów pojawiających się na rynku. 146 Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci. Rodzaje kasków korekcyjnych oraz metody ich wykonywania 4.2. Aparaty stosowane w leczeniu Zabiegi operacyjne nie są jedyną metodą korekcji deformacji. Coraz większą popularnością zarówno wśród pacjentów, jak i lekarzy cieszą się różnego rodzaju aparaty m.in. ortezy czy wyciągi kostne. Są one mało lub nieinwazyjne, a tym samym bezpieczniejsze od operacji, które stosowane są tylko w bardzo zaawansowanych przypadkach, głównie przy kraniosynostozach. W niektórych przypadkach, po operacji rozcięcia szwów czy też modelowania kości czaszki, aby zabezpieczyć głowę i zachować odpowiednie efekty operacji lub wymodelować odpowiedni kształt czaszki stosuje się specjalne kaski ochronno-modelujące [5]. Innym rodzajem aparatów są kaski korekcyjne. Stosowane głównie przy deformacjach ułożeniowych, pozwalają na bezpieczną korekcję powstałych zniekształceń i uzyskanie odpowiedniej geometrii główki dziecka. Ważne jest odpowiednio szybkie zastosowanie tej terapii, aby odbyła się ona w trakcie okresu wzmożonego rozwoju mózgowia [3, 13]. W przypadku leczenia twarzoczaszki stosowane są głównie wyciągi twarzowo-czaszkowe. Ich zastosowanie poprzedzone jest rozcięciem kości w miejscach które mają być wydłużone, co pobudza je do zrostu. Następnie w obu częściach rozciętej kości umieszczane są specjalne płytki połączone cylindrem dystrakcyjnym. Poprzez powolne zwiększanie odległości (o ok. 1 mm dziennie) za pomocą cylindra, rozciągnięciu ulega pierwotna kostnina powstająca w miejscu przecięcia oraz okoliczne tkanki – nerwy, naczynia krwionośne, skóra i mięśnie. Proces ten nosi nazwę osteogenezy dystrakcyjnej. Metoda ta umożliwia dosyć szybkie oraz zgodne z zamierzeniem wydłużenie kości [14]. 4.2.1. Kaski ochronno-modelujące [5, 15] Po operacyjnym leczeniu deformacji czaszki, rozcięciu lub wycięciu szwów często niezbędne jest zastosowanie kasków. Jak sama nazwa wskazuje pełnią one rolę ochronną oraz modelują odpowiedni kształt czaszki. Kask ochronno-modelujący jest elementem leczenia kraniosynostoz za pomocą zabiegu operacyjnego. Po jego wykonaniu lekarz może zlecić zamówienie uniwersalnego lub przygotowanie indywidualnie dopasowanego kasku. Wybór zależy głównie od rodzaju zabiegu chirurgicznego, jego efektów oraz stopnia deformacji. Jeśli podczas operacji dokonano wycięcia kliku szwów i rekonstrukcji czaszki, zalecane jest zazwyczaj wykonanie indywidualnie dopasowanego kasku, ponieważ musi być on używany przez dziecko nawet przez 12 miesięcy. W przypadku rozcięcia pojedynczego szwu, dokonywanego głównie podczas zabiegu przy użyciu 147 Adrian Dubicki endoskopu, ingerencja w kości czaszki nie jest zbyt wielka, więc może być zastosowany kask uniwersalny. Posiada on specjalne peloty które umieszcza się w odpowiednich, wskazanych przez lekarza miejscach tak aby dopasować kask do głowy dziecka i aby spełniał on swoje funkcje. Rysunek 6. Uniwersalny kask ochronno-modelujący z pelotami używany również do ochrony głowy przy atakach epilepsji [16] Zaopatrzenie dziecka w taki kask możliwe jest po 7-14 dniach od operacji. Wówczas zmniejszeniu ulegają obrzęki pooperacyjne i możliwe staje się odpowiednie dopasowanie uniwersalnego kasku lub określenie wymiarów potrzebnych do wykonania indywidualnie dopasowanego. Kaski wykonywane są zazwyczaj z termoplastycznych materiałów – polipropylenu lub poliwęglanu, w uniwersalnych rozmiarach lub na podstawie pobranych miar od konkretnego pacjenta. Mogą być one przezroczyste lub specjalnie zabarwiane i z nadrukami aby uatrakcyjnić ich stosowanie z myślą o dzieciach. Budowa kasków jest różna i zależy zarówno od zapotrzebowania pacjenta, jak i od firmy go wykonującej. Najczęściej spotykane są kaski jednolite, składające się z jednej, ciągłej warstwy materiału, z otworami wentylacyjnymi oraz czasami z nacięciem umożliwiającym nakładanie kasku (rys. 6). Gdy kask posiada rozcięcie, niezbędne jest dodanie elementu łączącego obie krawędzie, którym najczęściej jest rzep. Niekiedy takie kaski posiadają dodatkowo materiałowy pasek na podbródek pomagający utrzymać się ortezie w odpowiednim położeniu. Innym rodzajem jest kask składający się z dwóch części materiału (rys. 7). Jedna część nakładana jest na głowę dziecka (najczęściej na jej tylną powierzchnię), a druga na przeciwną stronę, dodatkowo zachodząc wypustkami na pierwszą. Taki typ kasku również wyposażany jest w rzep 148 Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci. Rodzaje kasków korekcyjnych oraz metody ich wykonywania utrzymujący go w odpowiednim miejscu. Jego zakładanie jest jednak łatwiejsze niż kasku z rozcięciem. Rysunek 7. Kask ochronno-modelujący wykonany dla konkretnego pacjenta [5] Noszenie takiego kasku wiąże się z utrudnieniem wymiany ciepła głowy z otoczeniem i ze wzrostem temperatury. W tym celu kaski mają specjalne otwory wentylacyjne, umieszczane w miejscach, w których nie występuje zbyt duży kontakt z powierzchnią głowy. W przypadku dosyć luźnych kasków uniwersalnych takie rozwiązanie jest wystarczające, lecz przy dopasowanych kaskach należy obserwować dziecko czy nie występują u niego objawy przegrzania. 4.2.2. Kaski korekcyjne Coraz większą popularnością w leczeniu ułożeniowej deformacji czaszki, cieszy się terapia kaskami korekcyjnymi. Chociaż powstała w drugiej połowie XX wieku, dopiero obecnie zyskuje coraz większe grono zwolenników zarówno wśród lekarzy, jak i pacjentów. Prawdopodobnie jest to związane z satysfakcjonującymi wynikami w leczeniu dzieci uzyskanymi w czasie akcji przeciwko SIDS oraz z obecnym dążeniem ludzi do idealnego wyglądu [17, 18]. Terapia kaskiem korekcyjnym wykorzystuje naturalny wzrost głowy dziecka. Wewnętrzna powierzchnia kasku jest odpowiednio konstruowana na podstawie kształtu głowy, dlatego muszą one być wykonywane indywidualnie. Głównym celem kasku jest zablokowanie możliwości 149 Adrian Dubicki wzrostu czaszki w miejscach prawidłowo rozwiniętych. W tych miejscach orteza styka się z powierzchnią głowy uniemożliwiając ich dalszy wzrost i pogłębianie się deformacji. Przeciwnie dzieje się w miejscach gdzie występuje zniekształcenie. Są one celowo odbarczone poprzez pozostawienie wolnej przestrzeni, dzięki czemu umożliwiony jest dalszy wzrost czaszki w tych rejonach i zmniejszanie się spłaszczenia [17, 19]. Ze względu na wykorzystanie w tej metodzie wzrostu czaszki, niemożliwe jest korzystanie z niej gdy takowego wzrostu nie ma. Z tego powodu terapia kaskowa ma ograniczenia związane z wiekiem dziecka. Wzrost czaszki jest dość intensywny do ukończenia 1 roku życia. Jest to najbardziej odpowiedni czas na rozpoczęcie i ukończenie terapii. Jej rozpoczęcie zalecane jest po wyczerpaniu innych metod np. pozycjonowania czy metod fizjoterapeutycznych, przeważnie już po ukończeniu 4-5 miesiąca życia. Im wcześniej rozpocznie się korekcja czaszki tym szybszy będzie w jej trakcie wzrost, a więc i krócej potrwa leczenie [17, 19]. Szacunkowy czas terapii przedstawiony został w tabeli poniżej. Tabela 1. Szacunkowy czas trwania terapii w zależności od wieku jej rozpoczęcia [17] Wiek dziecka gdy rozpoczęto terapię Długość leczenia 3-5 miesięcy 2-4 miesięcy 5-7 miesięcy 3-5 miesięcy 7-9 miesięcy 4-7 miesięcy 10 miesięcy 6-9 miesięcy Im później rozpoczyna się terapię tym dłużej trwa leczenie. Późne rozpoczęcie leczenia może powodować również nieuzyskanie pełnej korekcji. Za ostateczny czas kiedy terapia może się rozpocząć uważa się 1,5 roku życia. Po tym czasie efekty leczenia są mało zauważalne, a leczenie trwa bardzo długo [18]. Przeciwskazaniem do zastosowania terapii kaskowej może być kraniosynostoza. Z tego powodu na pierwszej wizycie dziecko powinno być poddane dokładnej diagnozie z określeniem przyczyny powstania deformacji. Również wodogłowie czy nieprawidłowości w rozwoju mózgu i wzrost ciśnienia śródczaszkowego uniemożliwiają wdrożenie terapii kaskowej. Dzieci powyżej 18 roku życia również nie powinny być poddawane leczeniu tą metodą. Ma to związek z jej małą skutecznością, gdyż w tym wieku głowa nie rośnie już wystarczająco szybko oraz często do tego czasu zrośnięciu ulegają już szwy czaszkowe [20]. 150 Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci. Rodzaje kasków korekcyjnych oraz metody ich wykonywania Na początku terapii, w jej pierwszych dniach należy zwracać szczególną uwagę na podrażnienia skóry oraz w szczególnych przypadkach na przegrzanie. Co 4 godziny należy zdejmować kask i sprawdzać czy na skórze nie występują otarcia i zaczerwienienia. Gdy takie wystąpią, należy odczekać 30 minut i jeżeli po tym czasie nie ustąpią oznacza to konieczność wykonania poprawek kasku. W takiej sytuacji należy skontaktować się z lekarzem prowadzącym lub protetykiem w celu naniesienia korekty. Jeżeli podrażnienia nie będą występować przez kolejne trzy dni, kontrole należy przeprowadzać co 12 godzin. Nie zwalnia to jednak z wizyt kontrolnych, które w zależności od wieku dziecka, zaawansowania terapii oraz deformacji powinny odbywać się co 2 do 6 tygodni [20]. W trakcie terapii ważne jest utrzymanie odpowiedniej czystości kasku. Dziecko powinno w nim spędzać 23 godziny na dobę, więc czyszczenie takiego kasku najlepiej wykonywać w trakcie kąpieli dziecka. Najlepszym sposobem jest przetarcie wnętrza kasku alkoholem lub jakimś preparatem antybakteryjnym po czym przemycie go wodą [20]. Prawidłowo prowadzone leczenie deformacji za pomocą kasków nie powoduje poważnych komplikacji. Głównym problemem jest utrzymanie kasku w czystości oraz związane z tym występowanie podrażnień skórnych. Z powodu bezpośredniego stykania się skóry z wyściółką kasku może powstać kontaktowe zapalenie skóry. Zbyt wysoka temperatura może wywołać przegrzanie, a dodatkowo występujący pot – wysypkę cieplną czy potówki. Nieprawidłowe dopasowanie kasku może skutkować powstaniem otarć lub skaleczeń. Należy w takiej sytuacji skontaktować się z lekarzem prowadzącym w celu dokonania poprawek. Nieprawidłowo wykonany kask może powodować nadmierne ciśnienie śródczaszkowe i wywołane nim powikłania neurologiczne lub pogorszenie geometrii głowy. Takie sytuacje zdarzają się jednak bardzo rzadko. Aby uniknąć takich problemów zaopatrzenia się w kask należy dokonywać w renomowanych placówkach z dużym doświadczeniem [20]. 5. Rodzaje kasków korekcyjnych Wszystkie kaski działają na tej samej zasadzie – ograniczania wzrostu w prawidłowo ukształtowanych miejscach przy równoczesnym umożliwieniu go w miejscach zdeformowanych. Mimo to istnieją różne wersje kasków w zależności od firmy je produkującej oraz od rodzaju deformacji. Najczęściej spotyka się kaski w całości pokrywające powierzchnię głowy oraz takie z wycięciem na jej górnej powierzchni. 151 Adrian Dubicki Rysunek 8. Dziecko podczas przymiarki kasku z wyciętą górną częścią [17] Kaski z wyciętą górną powierzchnią (rys. 8), którą nie poddaje się korekcji są również często nazywane opaskami korekcyjnymi. Głównym producentem na terenie Europy jest Cranioform. Obejmują one tylko miejsce wymagające korekcji. Takie rozwiązanie jest korzystne ze względu na zmniejszenie ilości potrzebnego materiału, a więc i zmniejszenie ciężaru kasku oraz kosztów jego wykonania. Inną ważną korzyścią jest zwiększenie powierzchni niezaburzonej wymiany ciepła z otoczeniem. W przypadku takiego kasku często nie stosuje się dodatkowych otworów wentylacyjnych. Opaski przeważnie posiadają wycięcia na małżowiny uszne, przez co nie utrudniają komunikacji z dzieckiem i nie powodują niepotrzebnych ucisków [17]. Pierwszą firmą, która na terytorium Polski wprowadziła terapię kaskową było V!GO. Oferuje ona typowe kaski, które w przeciwieństwie do wcześniej omawianych opasek nie posiadają wycięcia na górnej powierzchni (rys. 9). Niewprowadzenie takiego rozwiązania tłumaczone jest ryzykiem wzrostu czaszki w kierunku wycięcia i przybraniem przez nią stożkowego kształtu. Wymusza to zastosowanie licznych otworów, aby umożliwić wymianę ciepła. Dodatkowo kask nie posiada wycięć przy uszach aby ułatwić utrzymanie się go w prawidłowym położeniu. Firma wprowadziła możliwość wyboru tekstury, aby urozmaicić wygląd kasku i zachęcić dziecko do korzystania z niego [19]. 152 Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci. Rodzaje kasków korekcyjnych oraz metody ich wykonywania Rysunek 9. Kask korekcyjny obejmujący całą powierzchnię głowy [19] Niektóre zakłady produkcyjne oferują kaski wykonane z przezroczystych tworzyw. Jedną z nich jest firma KidCap działająca w USA. Ich zaletą jest możliwość ciągłej obserwacji skóry dziecka i reagowanie w przypadku powstania uczulenia, wysypki czy otarć (rys. 10). Kask ten w przeciwieństwie do poprzednio przedstawionych nie posiada na całej swej powierzchni wyściółki. Jest ona umieszczona tylko przy łącznikach. Styka się on bezpośrednio swą formującą częścią z głową dziecka. Dodatkowo wyposażony jest w polimerowe łączniki, które reagują (rozciągając się) na zmiany kształtu głowy[18]. Rysunek 10. Przezroczyste kaski umożliwiające obserwację skóry głowy [18] 153 Adrian Dubicki 5.1. Budowa oraz materiały używane do produkcji kasków Budowa kasków jest z reguły podobna. Zewnętrzna, twarda część wykonana jest z tworzywa sztucznego. Do najczęściej używanych należy poliwęglan (PC), polipropylen (PP), kopolimer estrowy (PETG) oraz rzadziej z polietylen, głównie ten o wysokiej gęstości (PE-HD). Ta warstwa materiału ma za zadanie powstrzymanie dalszego wzrostu czaszki w wybranych rejonach. Z tego powodu materiał powinien mieć wysoką sztywność i być odporny na odkształcenia. Dodatkowo, głównie w przypadku bezpośredniego kontaktu ze skórą, powinien być zgodny biologicznie i nie powodować reakcji alergicznych (hipoalergiczny). Ważna jest również odporność na działanie czynników mechanicznych, termicznych oraz na wilgotność. Dodatkowo tworzywo powinno w łatwy sposób odbierać ciepło i wymieniać je z otoczeniem [17, 18, 19]. Wewnętrzna warstwa wykonywana jest najczęściej ze spienionego kopolimeru etylu i octanu winylu (EVA), spienionego polietylenu (PE) oraz firmowego tworzywa Aliplast. Wyściółka kasku nie powinna chłonąć wilgoci – potu, co mogło by powodować rozwój bakterii oraz powstanie nieprzyjemnego zapachu. Dodatkowo musi być dosyć twarda, nie powinna zbytnio odkształcać się pod wpływem ścisku, co mogłoby pogarszać wyniki leczenia. Podobnie jak w przypadku zewnętrznej części, wyściółka powinna umożliwiać wymianę ciepła. Ważna jest również jej biozgodność oraz hipoalergiczność. Wewnętrzna część kasku składa się przede wszystkim z kilku warstw materiału. Umożliwia to odpowiednie dopasowanie kasku i doszlifowanie w trakcie leczenia wynikające ze zmieniającego się kształtu głowy oraz jej wzrostu. Ponadto, materiał wyściółki służy do amortyzacji [17, 18, 19]. Większość kasków posiada rozcięcia umożliwiające nakładanie go na głowę. Po nałożeniu takiego kasku konieczne jest unieruchomienie takiego przecięcia, aby unieruchomić kask na właściwym miejscu. Do tego celu stosowane są najczęściej rzepy. Umożliwiają one każdorazowe dopasowanie kasku do kształtu i rozmiaru głowy. Ważna jest również (w pewnym stopniu) podatność tego połączenia, w przypadku gdyby głowa została za mocno ściśnięta [17, 18, 19]. Większość kasków (prócz wcześniej wspomnianych opasek korekcyjnych) posiada dodatkowe otwory. Służą one do polepszenia wentylacji, wymiany ciepła oraz odprowadzenia wilgoci. Jest to bardzo ważne w celu uniknięcia przegrzania głowy czy powstania podrażnień i uczuleń skórnych [18, 19]. 154 Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci. Rodzaje kasków korekcyjnych oraz metody ich wykonywania 5.2. Wykonywanie kasków Proces wykonania kasków nie różni się zbytnio od standardowego postępowania w przypadku tworzenia lejów protezowych czy ortez. Pierwszym etapem jest konsultacja z lekarzem, który zdiagnozuje pacjenta określając przyczyny powstania deformacji, jej zaawansowanie oraz podejmie decyzję o leczeniu i jego przebiegu. Kolejnym krokiem jest wykonanie modelu głowy dziecka, który posłuży do dalszego wykonania kasku. W tym przypadku istnieją dwie metody. Pierwsza bazuje na wykonaniu negatywu i pozytywu przy użyciu masy gipsowej. Druga wykorzystuje nowe technologie, które umożliwiają digitalizację powierzchni głowy, obróbkę obrazu i tworzenie jej modelu za pomocą oprogramowania komputerowego [17, 21]. Obie ścieżki produkcji przedstawiono w poniższej tabeli. Tabela 2. Porównanie metod (etapów) produkcji kasków korekcyjnych [17, 21] Nr. etapu Metoda cyfrowa Nałożenie folii ochronnej na powierzchnię głowy 1 Nałożenie na powierzchnię głowy trykotu umożliwiającego poprawienie dokładności otrzymanych zdjęć 3D Nałożenie uprzednio namoczonych opasek gipsowych na głowę; oczekiwanie na utwardzenie gipsu 2 Wykonanie zdjęć 3D i wczytanie ich do oprogramowania komputerowego 3 Opracowanie wirtualnego modelu głowy dziecka o prawidłowej geometrii, dodanie naddatków 4 Wykonanie modelu głowy dziecka przy użyciu frezarki sterowanej numerycznie 5 Przygotowanie i rozgrzanie materiału termoplastycznego 6 Formowanie kasku na podstawie pozytywu przy użyciu pompy próżniowej Metoda tradycyjna Rozcięcie negatywu gipsowego i zdjęcie z głowy pacjenta Przygotowanie negatywu: połączenie rozcięcia, pokrycie wewnętrznej części negatywu warstwą umożliwiającą późniejsze oddzielenie negatywu i pozytywu Przygotowanie masy gipsowej i zalanie nią negatywu, umocowanie metalowego pręta Rozcięcie negatywu, wyjęcie pozytywu 155 Adrian Dubicki Dodanie naddatków, ukształtowanie powierzchni pozytywu, która posłuży do wykonania kasku (należy pamiętać o naddatku na całej powierzchni na wyściółkę kasku) 7 Usunięcie nadmiaru materiału i pozytywu z wnętrza kasku Przygotowanie i rozgrzanie materiału termoplastycznego 8 Dodanie wyściółki Formowanie kasku na podstawie pozytywu przy użyciu pompy próżniowej 9 Obróbka wykańczająca, dodanie klamer, rzepów Usunięcie nadmiaru materiału i pozytywu z wnętrza kasku 10 Dodanie wyściółki 11 Obróbka wykańczająca, dodanie klamer, rzepów 12 Metody z wykorzystaniem masy gipsowej coraz częściej wypierane są przez o wiele szybsze, bardziej ekonomiczne i czystsze metody komputerowe. Największą ich zaletą jest szybkość zarówno przy pomiarach, jak i wykonaniu pozytywu. Zrobienie zdjęć może trwać nawet tylko ok. 1,5 ms, co jest bardzo korzystne mając na względzie żwawość dzieci. Pozwala to również na skrócenie czasu wizyty, a często również i strachu dziecka [17, 18, 21]. Rysunek 11. Tworzenie negatywu za pomocą opasek gipsowych [22] 156 Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci. Rodzaje kasków korekcyjnych oraz metody ich wykonywania W obu metodach wykorzystywane są materiały termoplastyczne. Zrezygnowano w nich z użycia laminatów. Prawdopodobnie ma to związek z dużą ilością laminatu jaka potrzebna by była do wytworzenia takiego kasku, trudnością w jego równomiernym rozprowadzeniu, więc i w zachowaniu równomiernej siły nacisku na czaszkę. Kask wykonany z żywic musiałby utwardzać się przez kilka godzin, podczas których wydzielane by było ciepło. Rysunek 12. Komputerowy model głowy dziecka [17] Po uformowaniu tworzywa termoplastycznego według pozytywu dokonuje się jego obróbki. Usuwane są niepotrzebne fragmenty tworzywa, wykonywane nacięcia umożliwiające nakładanie ortezy, nadawany jest odpowiedni kształt krawędziom oraz ma miejsce ich zaokrąglanie. W większości przypadków dodaje się wyściółkę. Ważnym elementem jest również wykonanie otworów wentylacyjnych w odpowiednich miejscach oraz klamr i rzepów mocujących [17, 21, 22]. Rysunek 13. Pozytyw gipsowy wykonany przy pomocy frezarki CNC [17] 157 Adrian Dubicki Taki kask trafia do pacjenta w celu przymiarki oraz ewentualnych poprawek. W pierwszych dniach korzystania z terapii kaskowej należy zwracać uwagę na ewentualne podrażnienia skórne czy otarcia. Każdy taki przypadek sugeruje nieodpowiednie dopasowanie kasku i konieczność doszlifowania wyściółki [20]. 6. Podsumowanie Rozwój i udoskonalanie metod korekcji czaszki napędzane są coraz większą dbałością o zdrowie i wygląd. Są one również możliwe dzięki wykorzystaniu przez medycynę rozwijającej się techniki. Połączenie wiedzy medycznej z techniczną skutkuje uzyskaniem zadowalających efektów leczenia, przy jednoczesnym zapewnieniu jak największego komfortu oraz bezpieczeństwa w trakcie terapii. Indywidualne podejście do pacjenta umożliwia wdrożenie skutecznej i bezpiecznej terapii. Przyczynia się do tego rozwój diagnostyki i wykorzystanie metod komputerowych. Od przyczyny powstania deformacji oraz jej stopnia zależy wybór odpowiedniej terapii. Wśród zabiegów operacyjnych, popularne staje się wykorzystanie endoskopii. Deformacje niezaawansowane coraz częściej korygowane są indywidualnie wykonanymi kaskami. Metody pomiarów oraz produkcji takich ortez są stale rozwijane. Rozwój techniki i medycyny będzie skutkował powstaniem coraz nowszych metod korekcji oraz rozwojem już istniejących. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Bochenek A., Reicher M., Anatomia człowieka. Tom I, Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2009, s. 298-436 Aleck K., Craniosynostosis Syndromes in the Genomic Era. Phoenix: XI Seminars in Pediatric Neurology, Elsevier, 2004, strony 256-26 Biggs W. S., Diagnosis and management of positional head deformity, Michigan: American Family Physician, 2003, zeszyt 67, strony:1953-1956 Laskowska-Ziętek A., Misiuk-Hojło M., Przedwczesne zarośnięcie szwów czaszkowych – aspekty okulisty-czne i stomatologiczne, Wrocław: Dental and Medical Problems, 2007, zeszyt 44, strony 242-246, ISSN 1644-387X Kaufman A. B., Muszynski C. A., Matthews A., Etter N., The Circle of Sagittal Synostosis Surgery, Milwaukee: Elsevier, XI Seminars in Pediatric Neurology, 2004, strony 243-248 Halberg A., Graham J. M., Gomez M., Earl D. L., Management of Deformational Plagiocephaly: Repositioning Versus Orthotic Theraphy, Los Angeles: Elsevier, The Journal of Pediatrics, 2005, strony 258-262 Jak zapobiegać i leczyć przedwczesny zrost kości czaszki [online], PAP – Nauka w Polsce, www.naukawpolsce.pap.pl/ aktualnosci/ news, 65110, jak-zapobiegaci-leczyc-przedwczesny-zrost-kosci-czaszki.html [dostęp: 24 XII 2013 r.] 158 Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci. Rodzaje kasków korekcyjnych oraz metody ich wykonywania 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. Larysz D., Przedwczesne zarośnięcie szwów czaszkowych – kraniosynostoza [online],http://www.nzozkangur.pl/artykuly,przedwczesne_zarosniecie_szwow_ czaszkowych_kraniosynostoza.html [dostęp: 24 XII 2013 r.] Gzik M., Tejszerska D., Wolański W., Gzik-Zroska B., Komputerowe wspomaganie planowania zabiegu korekcji trigonocefalii u dzieci, Gliwice: Modelowanie Inżynierskie, 2009, zeszyt 38, strony 51-56, ISSN 1896-771X Wolański W., Larysz D., Gzik M., Kawlewska E., Komputerowe metody wspomagania leczenia kraniosynostozy, Gliwice: Modelowanie Inżynierskie, 2011, zeszyt 41, strony 437-444, ISSN 1896-771X Wolański W., Larysz D., Gzik M., Inżynierskie wspomaganie endoskopowych zabiegów neurochirurgicznych, Gliwice: Modelowanie Inżynierskie, 2011, zeszyt 41, strony 429-436, ISSN 1896-771X Medim – Instrumenty mistrzów, Nowość w ofercie Karl Storz [online], http://www.medim.pl/aktualnosci. php?nID=109 [dostęp 26 XII 2013r.] Co to jest "plagiocefalia ułożeniowa"(positional plagiocephaly)? [online], http://www. mamopedia.pl/10-11-mies/zdrowie/plagiocefalia-ulozeniowa [dostęp: 15 XII 2013r.] Kulewicz M., Osteogeneza dystrakcyjna w chirurgii ortognatycznej, Warszawa: Fundacja Multis Multum, 2001, Acta Clinica, Tom 1, Numer 3, strony 117-128 Murad G. J. A., Clayman M., Seagle M. B., White S., Perkins L. A., Pincus D. W.: Endoscopic-assisted repair of craniosynostosi, Gainesville: Neurosurgical Focus, 2005, Tom 19, strony 1-10 Danmar Clear Helmet[online], http://www.adaptivespecialties.com/danmar-clearhelmet.aspx [dostęp 26 XII 2013 r.] Cranioform babies head correction [online], Cranioform Group, http://www.cranioform.de/pl.html [dostęp: 26 XII 2013 r.] KidCap. Innovative design, complete car, optimal results [online].: http://www.helmettherapy.com/ [dostęp: 26 XII 2013 r.] Kaski korekcyjne [online], V!GO-Ortho Polska.: http://www.vigoortho.pl/kaski_korekcyjne,9.html [dostęp: 26 XII 2013 r.] Cranial molding helmet information and wearing instructions [online], Orthotic Solutions, http://www.orthoticsolutions.com/cranial.html [dostęp: 26 XII 2013 r.] Jak robi się protezy [online], http://www.amputacja.pl/index.php [dostęp: 30 XII 2013 r.] Cranial Molding Helmets [online], Atlantic Prosthetics & Orthotics, http://www.unchospitalpando.com /Site/Cranial_Molding_Helmets.html [dostęp: 30 XII 2013r.] 159 Adrian Dubicki Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci. Rodzaje kasków korekcyjnych oraz metody ich wykonywania Deformacje czaszki u dzieci są coraz częściej dostrzeganym i leczonym schorzeniem. W zależności od przyczyn powstania zniekształcenia należy wprowadzić odpowiednie postępowanie korygujące. Współczesna medycyna coraz chętniej korzysta z nowinek technologicznych, wykorzystując postępy w leczeniu deformacji. Przypadki deformacji wywołanych kraniosynostozą, coraz częściej korygowane są przy wykorzystaniu endoskopów, wypierając tradycyjne zabiegi chirurgiczne. Opracowana została również nieinwazyjna metoda leczenia deformacji ułożeniowych – kaskami korekcyjnymi. Do niedawna korekcja tego rodzaju deformacji była lekceważona. Obecnie rozwijane są metody pomiarów, metody oceny poziomu deformacji oraz sposobu produkcji kasków korekcyjnych. Treatment methods of the skull malformations in children. The types of corrective helmets and methods of their execution The skull malformations in children are being increasingly recognized and treated diseases. Depending on the causes of malformation, appropriate corrective procedure must be introduced. Contemporary medicine is increasingly willing to use the technological innovations, using the advances in the treatment of malformations. Cases of malformations triggered by craniosynostosis, are more and more frequently corrected using endoscopes displacing traditional surgery. Non-invasive method for the treatment of positional malformations has also been developed – with corrective helmets. Until recently, correction of this type of malformation was neglected. Currently, measurement methods, methods to assess the level of malformation and helmets production are being developed. 160 Adrian Dubicki1, Żaneta Anna Mierzejewska2 Ocena deformacji i metody pomiaru czaszki u dzieci 1. Wstęp Oznaką zdrowia człowieka, zarówno fizycznego jak i psychicznego jest jego wygląd zewnętrzny. Jest on również ważnym elementem postrzegania go w społeczeństwie przez innych ludzi. W szczególności ważny jest wygląd głowy, głównie ze względu na jej pierwszoplanową rolę w komunikacji werbalnej i niewerbalnej. Pojawienie się wszelkich nieprawidłowości w kształcie czaszki może świadczyć o wadach genetycznych, nieprawidłowym rozwoju kości czaszki, lub niewłaściwej pielęgnacji. W każdym z tych przypadków ważna jest dokładna diagnostyka i poznanie przyczyny ich powstawania. Współczesna technika pozwala na coraz szybsze i dokładniejsze rozpoznanie problemu oraz opracowanie postępowania naprawczego. 2. Cel pracy Zamysłem tej pracy jest usystematyzowanie wiedzy w zakresie najczęściej występujących deformacji czaszki, z przypisaniem ich do przyczyn powstania. Niniejsze opracowanie ukazuje również obecnie stosowane w takich przypadkach metody diagnostyczne oraz sposób oceny stopnia zniekształceń. 3. Rodzaje deformacji czaszki oraz przyczyny ich powstawania Płaskie kości czaszki rosną w trzech kierunkach. Grubościowy wzrost przebiega od ich wewnętrznej strony, a przyrost na długość i szerokość rozpoczyna się przy ograniczonych elastycznymi szwami brzegach kości. Rozwijające się mózgowie, poprzez wywoływane ciśnienie śródczaszkowe, powoduje rozciąganie się szwów determinując wzrost kości czaszki. Jakiekolwiek zaburzenia związane ze szwami, objawiające się najczęściej w ich za wczesnym kostnieniu, powoduje niesymetryczny, nierównomierny rozrost kości czaszki w jednym kierunku i powstanie deformacji [1]. 1 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej, Wydział Mechaniczny, Politechnika Białostocka, www.pb.edu.pl 2 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej, Wydział Mechaniczny, Politechnika Białostocka, www.pb.edu.pl 161 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska Takie ograniczenie możliwości wzrostu może być spowodowane również częstym i długotrwałym uciskiem na daną okolicę czaszki. Wówczas prócz uniemożliwienia rozrostu może dojść do zniekształcenia miękkich kości. Powstanie takich deformacji może wiązać się również z krzywicą i wywołanym utrzymującym się zmiękczeniem kośćca czaszki [1]. 3.1. Kraniosynostoza Kraniosynostoza jest wadą wrodzoną polegającą na przedwczesnym zamknięciu, zrośnięciu się szwu lub szwów czaszkowych, prowadzących do zmian w kształcie głowy – powstaniu deformacji. Do zrośnięcia szwów może dojść nie tylko po narodzinach, ale nawet już w życiu płodowym [2, 3]. Kraniosynostoza jest dość częstym przypadkiem. Występuje u jednego na 2500 żywo urodzonych dzieci [2]. Zarówno pod względem etiologicznym jak i morfologicznym każdy przypadek kraniosynostozy jest różny. Z tego powodu każda deformacja wymaga dokładnych badań klinicznych [2]. W przypadku podejrzenia zrośnięcia szwów, czego oznaką jest nienaturalny kształt głowy, konieczne jest wykonanie zdjęcia RTG lub bardziej zaawansowanych badań takich jak tomografia komputerowa, która jest niezbędna przy dalszym leczeniu schorzenia. Każde dziecko z podejrzeniem kraniosynostozy powinno być skonsultowane przez neurochirurga dziecięcego, a w szczególności te ze znacznymi deformacjami w prawidłowej geometrii czaszki [4]. 162 Ocena deformacji i metody pomiaru czaszki u dzieci Rysunek 1. Rodzaje kraniosynostoz [2] Wygląd głowy przy kraniosynostozie zależny jest od tego, który szew czaszkowy uległ przedwczesnemu zrośnięciu. Brak możliwości symetrycznego wzrostu kości w kierunku wzdłużnym i poprzecznym oraz postępujący wzrost mózgu powoduje niegeometryczny rozwój czaszki i powstanie deformacji, które poprzez charakterystyczny wygląd pozwalają określić skostniały szew. Wyróżniane są cztery zasadnicze rodzaje kraniosynostoz: łódkogłowie (scaphocephaly); krótkogłowie (brachycephaly); trójkątnogłowie (trigonocephaly); skośnogłowie (plagiocephaly). W przypadku skośnogłowia wyróżnia się dodatkowo odmianę przednią lub tylną, w zależności od tego, czy zrośnięciu uległ odpowiednio szew wieńcowy czy węgłowy [4]. Na rysunku 1 zaprezentowane zostały szkice głównych rodzajów kraniosynostoz wraz z umiejscowieniem skostniałych w danych przypadkach szwów. Kraniosynostoza wymaga leczenia nie tylko z powodu wyglądu, estetyki ale również powikłań neurologicznych związanych ze wzrostem ciśnienia śródczaszkowego takich jak spadek przepływu krwi przez mózg, 163 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska prowadzące do niedotlenienia i w konsekwencji zaburzeń słuchu, wzroku i upośledzenia umysłowego [2, 3]. 3.1.1. Łódkogłowie (scaphocephaly) Przyczyną łódkogłowia jest kościozrost, znajdującego się pomiędzy kośćmi ciemieniowymi szwu strzałkowego. Biegnie on od przodu ku tyłowi głowy, na środku górnej części czaszki. Brak możliwości wzrostu w tym szwie powoduje zablokowanie rozwoju szerokościowego czaszki (rys. 2a). Staje się ona nadmiernie długa w stosunku do małej szerokości. Dodatkowo czoło jest uwypuklone ku przodowi, a potylica ku tyłowi podkreślając jeszcze bardziej łódkowaty wygląd czaszki [1, 5]. Łódkogłowie jest najczęściej występującą spośród wszystkich kraniosynostoz. Diagnozuje się ją w 50% wszystkich przypadków deformacji [6]. 3.1.2. Krótkogłowie (brachycephaly) Przedwczesny zrost szwu wieńcowego, łączącego kości ciemieniowe z czołową, powoduje powstanie deformacji zwanej krótkogłowiem. Mózgowie ma ograniczoną przestrzeń i nie może rozwijać się w kierunku długościowym – przednim i tylnym (rys. 2b). Rekompensowane jest to wzrostem szerokościowym, w kierunku boków czaszki. Głowa staje się przez to nienaturalnie szeroka, a często również i wysoka. Te schorzenie występuje często jako dodatkowy objaw przy zespołach wad genetycznych [1, 6]. Krótkogłowie jest drugą po łódkogłowiu, najczęściej występującą formą kraniosynostozy. Szacuje się, że występuje w 22% wszystkich przypadków [2]. 164 Ocena deformacji i metody pomiaru czaszki u dzieci a) b) Rysunek 2. Rozrost mózgowia a) przy łódkogłowiu, b) przy krótkogłowiu [6] 3.1.3. Trójkątnogłowie (trigonocephaly) Trójkątnogłowie wiąże się z kościozrostem szwu czołowego, biegnącego od czubka głowy, przez środek czoła w kierunku nosa. Normalnie szew ten powinien zamknąć się do 2 roku życia. Jego przedwczesne zrośnięcie, często już przed porodem powoduje nacisk mózgowia na czoło, które przybiera klinowaty kształt [1, 5]. 165 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska Rysunek 3. Kształt czaszki przy trójkątnogłowiu [6] Szew wieńcowy wyczuwalny, a czasami i widoczny jest w postaci krawędzi kości. Gdy dojdzie do przedwczesnego zamknięcia, poprzez działające ciśnienie śródczaszkowe, na powierzchni zewnętrznej szwu powstaje grzbiet [6]. Prócz klinowatego zniekształcenia kości czołowej, przy trójkątnogłowiu można zaobserwować dystopię oczodołów. Wada ta stanowi od 5 do 10% przypadków kraniosynostoz [7]. 3.1.4. Skośnogłowie (plagiocephaly) Skośnogłowie może powstać przez przedwczesny zrost szwów, ale i również przez wrodzoną asymetrię półkul mózgowych [1]. W zależności od tego, czy skostnieniu uległ szew wieńcowy czy węgłowy rozróżnia się odpowiednio skośnogłowie przednie lub tylne (rys. 4) [4]. 166 Ocena deformacji i metody pomiaru czaszki u dzieci a) b) Rysunek 4. Rozrost mózgowia przy skośnogłowiu przednim (a) oraz tylnym (b) [6] Przednie skośnogłowie charakteryzuje się wzrostem czaszki po przeciwnej stronie od zrośniętego szwu wieńcowego. Wzrost ten obejmuje zarówno górną część czaszki jaki i jej podstawę. Powoduje to deformację czoła, twarzy, uszu oraz nosa. Ucho po stronie zrośniętego szwu jest lekko wysunięte do przodu. Czoło po przeciwnej od szwu stronie ulega zniekształceniu, poprzez charakterystyczne wysunięcie kości czołowej ku przodowi [2]. Skośnogłowie tylne wygląda podobnie jak przednie. Po przeciwnej stronie od zrośniętego szwu węgłowego, wybrzuszeniu ulega kość czołowa oraz część tylna czaszki. Ucho po stronie skostniałego szwu pozostaje w prawidłowym położeniu lub jest lekko cofnięte. Schorzeniu towarzyszy zniekształcenie twarzy, oczodołów. Zniekształceniu ulega również podstawa czaszki przez co przybiera ona pochylony kształt [2]. Spośród wszystkich kraniosynostoz, skośnogłowie występuje najrzadziej. Diagnozuje się je u ok. 2-4% dzieci z kraniosynostozą [2]. 3.2. Deformacje ułożeniowe Przyczyną deformacji nie zawsze jest zrost szwów czaszkowych. Może do nich dochodzić również z powodu długotrwałego zewnętrznego ucisku na daną okolicę czaszki. Miękkie kości ulegają wtedy zniekształceniu, a uniemożliwiony w tym kierunku rozwój mózgowia skutkuje powstaniem deformacji [1]. Takie zniekształcenia czaszki, którego przyczyną nie jest kościozrost szwów, nazywane są deformacjami ułożeniowymi. Radykalny wzrost liczby przypadków nastąpił między 1992, a 1999 rokiem. Spowodowane to było przez akcję Amerykańskiej Akademii 167 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska Pediatrycznej (AAP) nazwanej „Back to Sleep‖. Kampania ta miała na celu zachęcenie rodziców do układania dzieci na plecach, aby zapobiec tzw. nagłej śmierci łóżeczkowej (SIDS – ang. Sudden Infant Death Syndrome). Akcja przyniosła pozytywne skutki, liczba śmiertelnych przypadków zmniejszyła się o ponad 50%, lecz skutkowało to nagłym zwiększeniem (ok. 5-krotnym) przypadków deformacji czaszki. Częste przebywanie dziecka na plecach, nie układanie w innej pozycji (na boku), powodowało uciski na potylicę i jej spłaszczenie. Szacuje się że deformacja ułożeniowa dotyka jedno na 60 dzieci [8]. Rysunek 5. Rodzaje deformacji ułożeniowych [9] Podobnie jak w przypadku kraniosynostoz, rozróżnia się kilka rodzajów deformacji ułożeniowych. Ich nazwy są ściśle związane z kształtem zdeformowanej czaszki. W zależności od miejsca długotrwałego nacisku, głowa przybiera inny kształt. Są one bardzo podobne do tych związanych z kraniosynostozą, więc i przyjęto dla nich podobne nazwy (z dodatkiem wskazującym na przyczynę – ułożeniowe). Do najczęściej występujących deformacji ułożeniowych czaszki należą [9]: łódkogłowie ułożeniowe (positional scaphocephaly); krótkogłowie ułożeniowe (positional brachycephaly); skośnogłowie ułożeniowe (positional plagiocephaly). Na rysunku 5 zaprezentowane zostały fotografie oraz szkice najczęściej występujących deformacji ułożeniowych. Deformacja ułożeniowa w większości wypadków nie zagraża powikłaniom neurologicznym ani rozwojowym u dziecka. Głównie wiąże się ona z aspektem estetycznym. Ważna jest odpowiednia diagnoza i odróżnienie deformacji ułożeniowych od zrostowej, ze względu na odmienne leczenie obu tych przypadków. 168 Ocena deformacji i metody pomiaru czaszki u dzieci Rysunek 6. Różnice pomiędzy skośnogłowiem ułożeniowymi a wywołanym kraniosynostozą [6] Może w tym pomóc często wyczuwalny grzbiet występujący na skostniałym szwie. W przypadku skośnogłowia dodatkowo pomocne będzie położenie ucha (w deformacji ułożeniowej ucho po spłaszczonej stronie jest widocznie przesunięte względem drugiego, w kraniosynostozie przeciwnie – ucho po przeciwnej do spłaszczonej strony jest przesunięte) oraz bardziej wysunięte z jednej strony czoło (podobnie jak w przypadku uszu). Najlepsza oraz jednoznacznie określająca przyczynę deformacji będzie diagnoza za pomocą zdjęć RTG lub tomografii komputerowej [8]. 169 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska 4. Ocena stopnia deformacji Zaawansowanie deformacji ma duży wpływ przy podejmowaniu decyzji co do rodzaju leczenia, określania czasu oraz prognozowania jego efektów. Stopień zniekształcenia określany jest na podstawie przeprowadzonych pomiarów, będących elementem diagnozy [10]. Jednym z pierwszych etapów diagnozy jest wykonanie pomiarów czaszki. W większości przypadków dokonuje się to metodą stykową, czyli za pomocą przyrządów stykających się z głową dziecka. Należą do nich mały cyrkiel kabłąkowy, miarka obwodów głowy lub zwykła miarka krawiecka. Często dopiero po stwierdzeniu deformacji dokonuje się pomiarów bezstykowych za pomocą np. skanerów czy zdjęć 3D oraz dokładnej analizy otrzymanych wyników. Dla ocenienia stopnia deformacji przyjęte są specjalne wzory wypracowane na podstawie uśrednionych proporcji czaszek o prawidłowej geometrii. Krótkogłowie wraz z łódkogłowiem posiada wspólny wzór pomagający określić stopień zniekształcenia czaszki. W przypadku skośnogłowia dokonuje się porównania otrzymanych wartości [11]. 4.1. Pomiary stopnia krótkogłowia i łódkogłowia [11] Aby uzyskać prawidłowe wyniki konieczne jest odpowiednie określenie skrajnych punktów, pomiędzy którymi mierzona będzie odległość. Wyróżniamy cztery takie punkty (rys. 7): A – umieszczony nieco powyżej, pomiędzy brwiami; P – najdalej wysunięte miejsce na tylnej części głowy; S oraz D – znajdujące się po obu stronach głowy, nieco powyżej uszu. Rysunek 7. Umiejscowienie punktów pomiarowych [11] 170 Ocena deformacji i metody pomiaru czaszki u dzieci Po zmierzeniu odległości pomiędzy tymi punktami należy podstawić je do specjalnego wzoru (1), który pozwoli obliczyć tzw. Cephalic Index (CI). CI(%)= (SD/AP)*100 (1) Na podstawie indywidualnej wartości indeksu możemy obliczyć tzw. Deformation Index (DI). Określa on w jakim stopniu pacjent odbiega od standardowej wartości CI. Za standardowy, uśredniony wynik CI przyjęto wartość 78%. Tabela 1. Wzory do określania stopnia DI Krótkogłowie (gdy CI > 78%) DI(%) = CI – 78% Łódkogłowie (gdy CI < 78%) DI(%) = 78% – CI Za prawidłową wartość CI uważa się przedział od 75 do 85%. Przedział 70-75% oraz od 85% do 90-95% świadczy o łagodnej, umiarkowanej deformacji. Pozostałe wartości nie mieszczące się w powyższych przedziałach oznaczają bardziej zaawansowane deformacje. 4.2. Pomiary stopnia skośnogłowia [11] Do określenia stopnia zaawansowania skośnogłowia podobnie jak w przypadku krótkogłowia i łódkogłowia potrzebne jest kreślenie położenia punktów AP. Utworzą one linię podziałową pomiędzy dwoma półkulami. Dodatkowo niezbędne jest określenie dłuższej przekątnej czaszki, której miejsca styku utworzą punkty Ll oraz krótszej z początkowymi punktami Rr. Ważny jest również kąt α pomiędzy przekątnymi a linią podziałową (rys. 8). Rysunek 8. Punkty oraz kąt przy pomiarze stopnia skośnogłowia [11] 171 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska Początkowo należy określić linie podziałową. Od punkt A znajdującego się pomiędzy brwiami, należy poprowadzić prostopadłą względem czoła linię, do punktu P. Jeżeli jest ono zdeformowane należy określić jak ta linia przebiegałaby przy prawidłowej geometrii czaszki. Kolejnym krokiem jest określenie najdłuższej przekątnej czaszki, wyznaczenie punktów L-l oraz zmierzenie odległości między nimi. Dłuższa przekątna wraz z linią podziałową przecina się pod kątem α. Pod takim samym kątem należy zmierzyć odległość pomiędzy punktami R-r, tworzącymi krótszą przekątną. Od otrzymanej wartości długości dłuższej przekątnej, należy odjąć wartość krótszej. Różnica ta jest miarą potrzebną do określenia stopnia deformacji (tabela 2). Tabela 2. Miara skośnogłowia Łagodne Umiarkowane Ciężkie 1-9 mm 10-19 mm powyżej 20 mm Pomiarów potrzebnych do określenia zaawansowania skośnogłowia, jak i krótkogłowia i łódkogłowia można dokonać zarówno przy wykorzystaniu przyrządów stykowych i bezstykowych. Najczęściej używane i wykorzystywane w medycynie przedstawione zostały w poniższych podrozdziałach. 5. Pomiary stykowe Pomiary stykowe najczęściej stosowane do postawienia pierwszej diagnozy, stwierdzenia czy u danego pacjenta występuje deformacja czaszki. Dokonywane są przy pomocy prostych urządzeń bezpośrednio pokazujących wartość mierzonej wielkości. Jednym z takich urządzeń jest cyrkiel kabłąkowy. Zbudowany jest on z dwóch ruchomych, wygiętych kabłąkowo ramion oraz prostopadle umieszczonej do nich linijki. Na jej powierzchni umieszczona jest podziałka umożliwiające odczytanie wartości pomiaru. Pozwala on na mierzenie średnic np. kości, stóp czy głowy. Istnieją jego dwie odmiany – duży i mały. Duży służy do pomiarów np. szerokości klatki piersiowej czy bioder. Mała odmiana cyrkla (rys. 9) wykorzystywana jest przy mierzeniu mniejszych średnic. Do pomiarów deformacji czaszki wykorzystuje się odmianę małą cyrkla, gdyż jej wymiary mieszczą się w zakresie pomiarowym tego rodzaju cyrkla [11]. Do pomiaru obwodu główki dziecka wykorzystywane są specjalne miarki (rys. 10). Przybierają one różne formy. Mogą być zwijane do specjalnego pojemnika lub wyglądać jak zwykła miarka krawiecka. 172 Ocena deformacji i metody pomiaru czaszki u dzieci Rysunek 9. Cyrkiel kabłąkowy mały [11] Do metod stykowych należy również zaliczyć skanery stykowe. Umożliwiają one otrzymanie dokładnie odwzorowanej powierzchni głowy w postaci cyfrowego modelu. Specjalne ramie pomiarowe sczytuje położenie w przestrzeni po zetknięciu się z badanym obiektem. Niestety nie mogą być one stosowane do bezpośredniego pomiaru głowy dziecka ze względu na długi czas takiego pomiaru i konieczność unieruchomienia badanego obiektu. Drugim powodem jest plastyczność tkanek, a ta metoda może być wykorzystywana tylko przy twardych, nieodkształcalnych obiektach [12]. Rysunek 10. Miarka do pomiaru obwodu głowy noworodków i niemowląt [13] 173 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska 6. Pomiary bezstykowe Bezstykowe metody pomiarowe wykorzystywane są głównie przy dalszej diagnozie oraz planowaniu leczenia. Pomiar dokonywany jest bez bezpośredniego kontaktu urządzenia z badaną powierzchnią. Do takiego rodzaju urządzeń mogą więc również zostać zaliczone m.in. rezonans magnetyczny lub tomografia komputerowa, wykorzystywane w diagnozie do oceny poziomu skostnienia szwów oraz ewentualnych powikłań neurologicznych [4, 12]. Bezstykowe pomiary najczęściej wykonywane są za pomocą skanerów, głównie laserowych. Niestety nie wszystkie ich rodzaje dopuszczane są do użytku w medycynie. Głównie ma to związek z zastosowanym w urządzeniu rodzajem lasera i ryzykiem uszkodzenia wzroku [12]. Jednym z bezpiecznych, przeznaczonych do korzystania w medycynie body skanerów jest ręczny, przenośny skaner Go!Scan 3D. Wykorzystuje on biały laser o małej energii, bezpieczny dla wzroku. Wiązka światła pada na powierzchnię skanowanego przedmiotu tworząc linię świetlną. Jej obraz sczytywany jest przez detektor. W zależności od odległości pomiędzy skanowaną powierzchnią a skanerem zmienia się kąt linii świetlnej. Po jego przechwyceniu przez detektor, przy znanym położeniu źródła światła i detektora oraz kąta odbicia linii, przy wykorzystaniu metody triangulacji, obliczane jest położenie punktów tworzących powierzchnię. Zaletą tego skanera jest szybkość uruchomienia (gotowy do użycia po 2 minutach) oraz skanowania zarówno małych jak i dużych powierzchni. Skanowany obiekt nie musi być sztywno przytwierdzony, nieruchomy. Może poruszać się w trakcie skanowania (głównie obracać). Zadowalająca jest również jakość skanowania. Pozwala ona na skanowanie różnych materiałów z dokładnością do 0,1 mm [14]. Innym często stosowanymi czytnikami są skanery prążkowe. Ich działanie jest podobne jak wcześniej opisanych skanerów laserowych. Różnicą jest rodzaj obrazu padającego na badaną powierzchnię. Zamiast pojedynczej linii, obiekt jest oświetlany za pomocą rzutnika sekwencją prążków o znanej grubości i gęstości. Wykorzystywany jest w tym przypadku efekt prążków Moire’a [12]. Przykładem takich skanerów, często używanych w medycynie są m.in. Gemini, MegaCapturor czy Cyclops. Są to skanery stacjonarne, które umieszcza się na płaskiej powierzchni lub na statywie. Umożliwiają one nie tylko skanowanie pojedynczych fragmentów, ale również całego ciała. Skanery te dodatkowo pozwalają otrzymać bardzo realistyczny obraz wraz z kolorem. Ich dokładność jest zależna od odległości pomiaru oraz powierzchni. Im większa powierzchnia skanowania, tym mniejsza jest dokładność skanu [14]. 174 Ocena deformacji i metody pomiaru czaszki u dzieci Często pomiary wykonywane są przy użyciu kilku ustawionych wokół badanego obiektu i odpowiednio skalibrowanych aparatów fotograficznych lub kamer. Taka technika nosi nazwę fotogrametrii [15, 16]. W tym samym momencie, wszystkie aparaty wykonują zdjęcia badanego obiektu, a specjalny program komputerowy łączy je tworząc trójwymiarowy model obiektu (rys. 11). Położenie poszczególnych punktów określane jest na podstawie odległości i kątów z przynajmniej dwóch zdjęć. Przy znanej skali, położeniu aparatów i katów możliwe jest określenie rzeczywistej odległości pomiędzy punktami. Tak otrzymany obraz jest dalej przetwarzany, w celu otrzymania modelu bryłowego, który może zostać wykorzystany do dokładnego określenia deformacji oraz zaplanowania leczenia [15, 16]. Rysunek 11. Skanowanie przy użyciu zestawu kamer [15] Istnieje wiele metod bezkontaktowego pomiaru (rys. 12). Są one bardzo przydatne przy diagnozie (rys. 13) oraz planowaniu leczenia. W znaczny sposób pomagają w zmniejszeniu do minimum czasu trwania często stresującej dla dziecka diagnozy. 175 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska a) Rysunek 12. a) model głowy w trakcie pomiarów (widoczne wyświetlane na powierzchni modelu sekwencje pasków), b) proces dopasowania chmur Rysunek 13. Pomiar odległości pomiędzy punktami AP (długość) i SD (szerokość) 7. Podsumowanie Deformacje czaszki, które niegdyś były często bagatelizowane, obecnie są coraz sprawniej diagnozowane i leczone. Połączenie wiedzy medycznej z techniczną pozwala na szybkie i dokładne postawienie diagnozy oraz wdrożenie środków prowadzących do prawidłowego ukształtowania czaszki u dziecka. Czas w przypadku tego schorzenia ma zasadniczy wpływ. 176 Ocena deformacji i metody pomiaru czaszki u dzieci Za późne stwierdzenie deformacji może w znaczny sposób ograniczyć możliwość wykorzystania nieinwazyjnych, nieoperacyjnych metod leczenia, a nawet doprowadzić do uszkodzeń neurologicznych, wywołanych zwiększonym ciśnieniem śródczaszkowym. Wykorzystanie w diagnostyce bezstykowych metod pomiarowych pozwala na znaczne skrócenie czasu potrzebnego do określenia poziomu zmian. zaprezentowane w pracy techniki cyfrowe umożliwiają w pewnym stopniu zautomatyzowanie procesu stawiania diagnozy, gdyż poprzez wykorzystanie odpowiednich programów komputerowych możemy otrzymać bardzo dokładną analizę deformacji. Zaletą jest również bardzo duża dokładność pomiarów, często nie osiągalna tradycyjnymi metodami. Podziękowania Praca zrealizowana przy wsparciu finansowym Wydziału Mechanicznego Politechniki Białostockiej w ramach projektu „Rozwój młodych naukowców i uczestników studiów doktoranckich‖ nr MB/WM/14/2014. Literatura Bochenek A., Reicher M., Anatomia człowieka. Tom I, Warszawa, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2009, s. 298-436 2. Aleck K., Craniosynostosis Syndromes in the Genomic Era, Phoenix, XI Seminars in Pediatric Neurology, Elsevier, 2004, s. 256-26 3. Gzik M., Tejszerska D., Wolański W., Gzik-Zroska B., Komputerowe wspomaganie planowania zabiegu korekcji trigonocefalii u dzieci, Gliwice, Modelowanie Inżynierskie, 2009, zeszyt 38, s. 51-56 4. Wolański W., Larysz D., Gzik M., Kawlewska E., Komputerowe metody wspomagania leczenia kraniosynostozy, Gliwice, Modelowanie Inżynierskie, 2011, zeszyt 41, s.437-444 5. Polskie Centrum Medyczne Elobot., Kraniosynostoza [online], http://o.elobot.pl/ artykul/kraniosynostoza-anomalii-twarzoczaszki [dostęp: 8 XII 2013r] 6. Oregon Health & Science University., Craniofacial & Cleft Palate Program [online], http://www.ohsu.edu/xd/health/services/doernbecher/programsservices/ cleft-palate-craniofacial.cfm [dostęp: 8 XII 2013r.] 7. Laskowska-Ziętek A., Misiuk-Hojło M., Przedwczesne zarośnięcie szwów czaszkowych – aspekty okulistyczne i stomatologiczne, Wrocław, Dental and Medical Problems, 2007, zeszyt 44, s. 242-246 8. Biggs W. S., Diagnosis and management of positional head deformity, Michigan, American Family Physician, 2003, zeszyt 67, s.1953-1956 9. Co to jest "plagiocefalia ułożeniowa"(positional plagiocephaly)? [online], http://www.mamopedia.pl/10-11-mies/zdrowie/plagiocefalia-ulozeniowa [dostęp: 15 XII 2013r.] 10. Larysz D., Ocena wyników leczenia izolowanych kraniosynostoz u dzieci z uwzględnieniem aspektów klinicznych, biomechanicznych oraz 1. 177 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska 11. 12. 13. 14. 15. 16. neurorozwojowych – Suplement do rozprawy habilitacyjnej [online], http://leczeniekraniosynostoz.pl/ [dostęp: 12 XII 2013r.] Measuring Plagiocephaly [online], MIMOS, http://www.plagiocephalyflathead.com/cart_mimos_CRANEO.php [dostęp: 1 I 2014r.] CAD / CAM / CAE / MES [online] Design News Polska, http://www.designnews.pl/menu-gorne/kanaly-tematyczne/cad-cam-cae-mes/ [dostęp: 3 I 2014 r.] Miarka do pomiaru obwodu głowy noworodków i niemowląt SECA 212 [online]. http://www.medysklep.pl/ index.php [dostęp: 1 I 2014r.] CaspSystem Systemy wizyjne 3D [online]. http://www.pomiar3d.pl/ [dostęp:3 I 2014 r.] Cranioform babies head correction [online]. Cranioform Group, http://www.cranioform.de/pl.html [dostęp: 26 XII 2013 r.] Tokarczyk R., Fotogrametria cyfrowa w zastosowaniach medycznych do pomiaru ciała ludzkiego – przegląd i tendencje rozwojowe systemów pomiarowych [online], http://home.agh.edu.pl/~tokarcz/public/fot_med.pdf [dostęp 4 I 2014 r.] Ocena deformacji i metody pomiaru czaszki u dzieci Zewnętrzny wygląd człowieka jest oznaką jego zdrowia, zarówno fizycznego jak i psychicznego, jest również ważnym elementem postrzegania w społeczeństwie przez innych ludzi. Najistotniejsza jest płaszczyzna czołowa, głównie ze względu na zasadniczą rolę w komunikacji werbalnej i niewerbalnej z ludźmi. Jeśli chodzi o zniekształcenia czaszki, rodzice z powodów zdrowotnych i estetycznych coraz częściej decydują o leczeniu. Współczesna medycyna rozwinęła metody korekty zdeformowanego ciała – od inwazyjnych zabiegów chirurgicznych do bezinwazyjnych metod leczenia kaskami korekcyjnymi. W pracy zaprezentowane zostały podstawowe, najczęściej spotykane rodzaje deformacji czaszki, z uwzględnieniem przyczyn ich powstawania – przedwczesny zrost szwów czaszkowych lub długotrwałe naciski na dany rejon głowy. Określenie przyczyny powstania zniekształceń umożliwia wdrożenie odpowiedniego leczenia. Zależy ono również od stopnia deformacji, który określany jest za pomocą opisanych w niniejszym opracowaniu wzorów. Rozwój techniki umożliwia coraz szybsze i dokładniejsze przeprowadzenie pomiarów czaszki, a nawet ich analizę w celu otrzymania gotowych zaleceń do korekcji. Evaluation methods for measuring skull deformation in pediatric patients The external appearance of human is a sign of his health, both physically and mental and an important element of perception in the community by other people. The most important in that plane is the appearance of the head, mainly because of its essential role in verbal and nonverbal communication with people. When it comes to distortion of the skull, parents due to health reasons and for aesthetic increasingly decide on treatment. Modern medicine has developed methods for correcting deformities – from invasive surgical procedures to non-invasive orthoses called corrective helmets. The increased interest in the treatment of diseases of the skull stimulates the creation of new therapies. The development of technology creates enormous opportunities ranging from speeding up diagnosis, by designing the helmet until his execution. The work has been shown and described individually tailored course design helmet using the latest technical solutions. 178 Alicja Janicka1, Anna Cwynar2, Blanka Ziomkowska3, Tomasz Wybranowski4 Fluorescencyjna spektroskopia czasowo-rozdzielcza. Proste narzędzie diagnostyczne 1. Wprowadzenie Metody spektroskopowe używane są od dawnych czasów, początkowo (Newton, Kartezjusz) kiedy spektroskopia stawiała pierwsze kroki, nie dostrzegano rozległości potencjału jaki stanowią metody spektroskopowe. W dzisiejszych czasach badania przy użyciu światła są dość dobrze poznaną sztuką badawczą, która jednak w dobie obecnej nauki ciągle podlega modyfikacjom i ulepszeniom. Spektroskopia czasowo- rozdzielcza jest szeroko stosowana w biochemii, fizyce, farmacji czy medycynie. Jej największą zaletą jest prostota oraz z klinicznego punktu widzenia mała inwazyjność i bezpieczeństwo. Jest to istotną cechą zarówno dla pacjenta jak i lekarzy i naukowców. Jednym z najprostszych przykładów małoinwazyjności w zastosowaniu fluorescencyjnej spektroskopii czasoworozdzielczej jest analiza osocza uzyskanego z krwi pełnej pacjenta. 2. Cel pracy Celem niniejszej pracy jest przedstawienie spektroskopii jako małoinwazyjnej, szybkiej oraz niewymagającej długiego czasu techniki, która dzięki korelacji, jaka występuje między światłem a cząsteczkami, może być używana m.in. do badania właściwości białek oraz wykorzystywana przy diagnostyce różnego rodzaju schorzeń. 1 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Studenckie Koło Naukowe Biofizyki przy Zakładzie Biofizyki 2 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra i Zakład Patobiochemii i Chemii Klinicznej 3 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra i Zakład Biofizyki 4 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra i Zakład Biofizyki 179 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Tomasz Wybranowski 3. Omówienie 3.1. Ogólna charakterystyka białek Białkami (inaczej proteiny lub polipeptydy) nazywamy wielkocząsteczkowe elementy budujące wszystkie organizmy żywe. Białka przede wszystkim są produktami, które powstają poprzez połączenie się grup alfakarboksylowych z alfa-aminowymi, których spoiwem są wiązania peptydowe. Praktycznie wszystkie białka składają się z połączenia w różnej kombinacji 20 aminokwasów powszechnie występujących w przyrodzie, których to łańcuchy boczne są odmienne. Te boczne łańcuchy tak zwane reszty R różnią się między sobą kształtem, zdolnością do wytwarzania wiązań wodorowych, ale także reaktywnością chemiczną, charakterem hydrofobowym oraz wielkością i posiadanym ładunkiem elektrycznym [1]. W związku z tym, że białka są tworzone przez kombinację różnych aminokwasów, logicznym wydaje się fakt, że w zależności od tych składowych elementów, zmieniają się właściwości fizyczne i chemiczne powstałych peptydów. Ogólna norma wagowa, pozwalająca stwierdzić czy dana cząsteczka jest peptydem mówi, że za białko uznaje się cząsteczkę, której łączna masa cząsteczkowa przekracza 10 kDa. Białka mają budowę złożoną, a ponieważ są zbudowane często z wielu aminokwasów, których reszty są mocno rozgałęzione, ich struktura jest przestrzenna. Struktura pierwszorzędowa białek jest przydatna podczas określania kolejno po sobie postępujących aminokwasów. Jednak oprócz struktury pierwszorzędowej wyróżnić można jeszcze kolejne 3 poziomy organizujące złożoną strukturę białek, które różnią się rodzajem i stabilnością wiązania. Wiązania wodorowe są charakterystyczne w strukturach drugorzędowych. Złożone łańcuchy białkowe mogą tworzyć różne konstrukcje helisy polipeptydowej typu, alfa, beta – harmonijki, pętli, a także wstęga – zwrot – wstęga. Boczne niepolarne łańcuchy aminokwasów, występujące w trzeciorzędowej strukturze białka „chowają się” wewnątrz makrocząsteczki w tak zwanym rdzeniu hydrofobowym. Wewnątrz protein niezwykle istotną rolę, polegającą w głównej mierze na stabilizacji konstrukcji białka odgrywają siły Van der Waalsa oraz mostki dwusiarczkowe. Czwartorzędowa struktura określa białka składające się z kilku łańcuchów polipeptydowych. Sposób upakowania białka zależy od jego funkcji. Białka pełnią funkcje praktycznie we wszystkich procesach zachodzących w organizmie począwszy od mechanicznego stabilizowania tkanek oraz narządów jako funkcji strukturalnych, przez pełnienie roli katalizatorów różnych reakcji do transportu różnych związków metali, enzymów oraz innych substancji. Białka to także hormony, które regulują procesy zachodzące wewnątrz organizmu. Dodatkowo jako np. przeciw- 180 Fluorescencyjna spektroskopia czasowo-rozdzielcza. Proste narzędzie diagnostyczne ciała ochraniają przed czynnikami atakującymi organizm pełniąc funkcję białek układu odpornościowego [1‚4]. 3.2. Białka osocza Osocze zwane także plazmą jest zasadniczym składnikiem krwi otrzymywanym po odwirowaniu krwi pełnej w odpowiednich warunkach, w którym zawieszone są komórkowe elementy morfotyczne krwi. Całkowite stężenie białka u zdrowego człowieka w jego osoczu wynosi od 65 do 80 g/l. Osocze jest bogato białkowym supernatantem krwi pełnej, bowiem znajduje się w nim nawet ponad 300 różnych białek, jednakże najważniejsze są dwie grupy z rodziny immunoglobulin i albuminy, odpowiedzialne za zmiany całkowitego stężenia protein. To właśnie białka osocza odpowiadają za kontrolę zaopatrywania w płyny przestrzeni pozanaczyniowych, regulują procesy homeostatyczne oraz regulują krzepnięcie krwi, pełnią funkcje transportowe dla wielu substancji oraz odpowiadają za ochronę organizmu przed czynnikami chorobotwórczymi. Z powodu na przykład nadmiernej utraty białka przez nerki czy przewód pokarmowy, upośledzonego jego wchłaniania czy też niedostatecznej biosyntezy w osoczu może dojść do hipoproteinemi, która objawia się poprzez zmniejszenie stężenia albuminy. Odwrotnym do hipoproteinemi zjawiskiem patologicznym jest hiperproteinemia objawiająca się podwyższoną syntezą immunoglobulin (podwyższona synteza albumin jest praktycznie niespotykana), stąd właściwsza nazwa dla tego zjawiska to hipergammaglobulinemia [4]. Białka osocza można rozdzielić za pomocą elektroforezy na 5 głównych frakcji do których zaliczmy: albuminę, α1-globuliny, α2-globuliny, β-globuliny oraz γ-globuliny. Wszystkie z tych frakcji pełnią różnorodne funkcje. Skład poszczególnych frakcji białkowych w prawidłowych warunkach po rozdziale elektroforetycznym przedstawia Tab. 1. 181 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Tomasz Wybranowski Tab. 1. Poszczególne frakcje białkowe po rozdziale elektroforetycznym surowicy. Źródło: Dembińska-Kieć A., Naskalski J.: Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej FRAKCJA STĘŻENIE BIAŁKA (g/l) ZAWARTOŚĆ BIAŁKA (%) Albumina 35-55 55,0-70,0 α1-globuliny 0,9-2,1 1,4-2,9 α2-globuliny 5,0-7,9 7,0-11,0 β-globuliny 8,0-13,0 5,7-7,9 γ-globuliny 9,0-16,0 5,7-7,9 Razem 65,0-82,0 100 W każdą z przedstawionych w powyższej tabeli frakcji wliczają się konkretne białka. Jakie konkretnie białka należą do konkretnej grupy przedstawia Tab. 2. 182 Fluorescencyjna spektroskopia czasowo-rozdzielcza. Proste narzędzie diagnostyczne Tab. 2. Poszczególne białka tworzące frakcje po rozdziale elektroforetycznym. Źródło: Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej. Dembińska-Kieć A., Naskalski J. Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2010. Frakcja Białka Albumina albumina α1-globuliny α1-antytrypsyna, α1-kwaśna glikoproteina, α1-lipoproteina (apoA, HDL) α2-globuliny α2-makroglobulina, haptoglobina β-globuliny Transferryna, betalipoproteina (apoB, LDL) Β2-globuliny Frakcja C3 dopełniacza, immunoglobulina A, immunoglobulina G γ-globuliny Immunoglobuliny klasy A, G, M, białko C-reaktywne 3.2.1. Albumina Głównym białkiem osocza, którego stężenie we krwi wynosi 40-52 g/l (stanowi do 50-70% całościowej ilości białek surowicy) jest albumina [4]. Białko to jest syntezowane w wątrobie, a za jego degradację w organizmie odpowiedzialne są komórki śródbłonka naczyń, mięśni i skóry, degeneracja w wątrobie oraz nerkach zachodzi w mniejszej ilości [5]. Albumina pełni w organizmach żywych wiele różnych funkcji. Jest odpowiedzialna m.in. za utrzymanie prawidłowego ciśnienia osmotycznego krwi, jest zarazem białkiem antyoksydacyjnym oraz buforującym, a jej cząsteczki są swoistego rodzaju magazynem dla aminokwasów. Pełni także funkcje transportujące będąc nośnikiem drobnocząsteczkowych metabolitów, przenosi ona po wcześniejszym związaniu się kwasy tłuszczowe, bilirubinę, hormony oraz co istotne jony różnych metali w tym wapnia, miedzi, kobaltu czy niklu. Albumina jest stosunkowo dużym białkiem zbudowanym z 585 reszt aminokwasowych, gdzie jedną z reszt jest tryptofan Trp-214 [6]. Fragment N – końcowy albuminy jest najistotniejszym obszarem z punktu widzenia wiązania się z nim jonów metali przejściowych. Składa się on z czterech aminokwasów kwasu asparaginowego – alaniny – histydyny – lizyny. To fragment szczególnie narażony i wrażliwy na uszkodzenia. Wiele różnych czynników w tym zwiększony 183 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Tomasz Wybranowski stres oksydacyjny może wpływać na strukturę albuminy, która pod jego wpływem może ulec zmianie [7, 8]. 3.3. Fluorescencja Zjawisko emisji fal świetlnych generowanych przez różnego rodzaju cząsteczki to jedno z najczęściej stosowanych w badaniach biofizycznych i biochemicznych metod badawczych wykorzystywanych w biologii molekularnej. Terminem fluorescencji określa się emitowanie światła przez wcześniej wzbudzoną cząsteczkę, która w tym czasie przechodzi z najniższego poziomu oscylacyjnego S1 do stanu S0 podstawowego. Cząsteczka absorbuje kwanty światła, w wyniku czego jest jej dostarczana energia. Skutkiem takiego procesu jest wejście cząsteczki w stan wzbudzony. Proces pobrania energii w postaci światła przez cząsteczkę zachodzi bardzo szybko zachodząc w przeciągu około 10-15s. Promieniowanie, które emituje cząsteczka w procesie świecenia (fluorescencji), zanika praktycznie natychmiast po odcięciu źródła promieniowania w szybkim czasie około 10-8s [9]. Przechodzenie cząsteczek ze stanu podstawowego do wzbudzonego i odwrotnie w sposób zarówno promienisty (z emisją światła) jak i bezpromienisty) przedstawia diagram Jabłońskiego (Rys. 1.) Rys. 1 Diagram Jabłońskiego, Źródło: Lakowicz J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy., Springer, USA 2006 Do przejścia cząsteczki na wyższy poziom oscylacyjno-wibracyjny w stanie S1 albo S2 dochodzi poprzez absorpcję przez fluorofor kwantu światła. Do najniższego poziomu energetycznego (stan poziomu wibracyjnego S1) przechodzi większość molekuł w trakcie procesów bezpromienistej konwersji wewnętrznej. Jest to czas rzędu 10-12s. Energia cząsteczki, która znajduje się w stanie singletowym S1 może także rozproszyć energię w sposób promienisty. Do takich procesów zaliczamy 184 Fluorescencyjna spektroskopia czasowo-rozdzielcza. Proste narzędzie diagnostyczne fluorescencję, fosforescencję oraz opóźnioną fluorescencję. Do procesów bezpromienistych zalicza się konwersję wewnętrzną oraz konwersję międzysystemową [9]. Przejście międzysystemowe zachodzi wówczas, kiedy będąca w stanie wzbudzonym cząsteczka podda się konwersji do tak zwanego stanu trypletowego T1. Taka sytuacja zachodzi wówczas, gdy jedna molekuła zderzy się z inną. Przejściem cząsteczki ze wzbudzonego stanu trypletowego (T1) do stanu podstawowego S0, któremu towarzyszy emisja fotonu nazywa się fosforescencją. Po takim przejściu czas zaniku może trwać długo po przerwaniu emisji promieniowania wzbudzającego [10, 11]. Energia wytwarzana podczas fluorescencji jest znacznie niższa od tej, którą początkowo cząsteczka absorbuje. Jest to wynikiem tego, że w trakcie procesu część energii zostaje pochłonięta przez zjawiska konwersji wewnętrznej. Takie zjawisko tłumaczy przesunięcie Stokes’a wskazujące na to, że do utraty energii dochodzi wskutek przesunięcia się widma emisji w stronę dłuższych fal w porównaniu do fal absorpcji. Istnieją jeszcze inne procesy powodujące straty energetyczne zalicza się do nich relaksację rozpuszczalnikową, wygaszanie fluorescencji, a także transfer energii. Cząsteczka wraca do stanu początkowego po pewnym czasie (czasie życia fluorescencji) oraz po tzw. wydajności kwantowej. Wydajność kwantowa w zjawisku fluorescencji jest stosunkiem ilości fotonów jakie cząsteczka wyemitowała w trakcie promienistego procesu przechodzenia ze stanu S1 do stanu S0 w porównaniu do liczby fotonów jakie ta sama cząsteczka pochłonęła w momencie absorpcji. Czasem życia fluorescencji (fluorescence lifetime, FLT), określa się natomiast średni czas, jaki cząsteczka pokonuje w trakcie wzbudzenia do czasu zanim nastąpi jej powrót do stanu podstawowego. Jeżeli cząsteczka w stanie wzbudzonym zderzy się w trakcie przebywanej drogi z wygaszaczem, intensywność jej fluorescencji może znacznie się obniżyć. W trakcie takiego „karambolu” na poziomie molekularnym, energia z molekuły wzbudzonej przenosi się na wygaszacz (np. cząsteczka tlenu, amina lub halogenek), który przejmując część energii ze stanu podstawowego przechodzi w stan wzbudzony [9‚13]. 3.3.1. Rezonansowy transfer energii Rezonansowe przeniesienie energii (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) to mechanizm podczas którego dochodzi do przeniesienia energii pomiędzy dwoma chromoforami. Cząsteczka, która została wzbudzona absorbując energię w postaci światła nazywa się donorem, natomiast molekuła wzbudzona w trakcie bezpromienistego procesu przekazania energii nazywamy akceptorem. Zajście tego mechanizmu jest zależne od odległości jaka dzieli akceptor od donora. Jeżeli cząsteczki znajdują się od siebie w granicach rzędu 2-10nm, a także jeżeli fala 185 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Tomasz Wybranowski emitowana przez molekuły donora nakładają się na siebie z falą absorpcyjną molekuły akceptora, donor przechodzi do podstawowego stanu elektronowego, a molekuła która jest akceptorem przechodzi w stan wzbudzenia. Czas życia donora zmniejsza się, a badacz obserwuje zmianę pasma emisji molekuły, która została wzbudzona na skutek w procesie absorpcji światła [14]. 3.3.2. Fluorescencyjne właściwości białek Związki biologiczne takie jak białka, czasami zawierają w swojej budowie fluorofory, czyli grupy wykazujące zdolność absorpcji energii o konkretnej długości fali zdolne później oddać tą energię w postaci sygnału świetlnego. Takie właściwości związków znalazły zastosowanie w badaniach nad fluorescencją, pełniąc funkcje sondy molekularnej lub znacznika fluorescencyjnego. W analizach klinicznych to pożądane cechy pomagające określić lokalizację obszaru patologicznego, który ma zostać poddany obserwacji. Dzięki znajomości maksimum absorpcji i emisji reszt aminokwasów fluorescencyjnych oraz np. znajomości wartości referencyjnych czasów życia fluorescencji można dzięki spektroskopii określić np. poziom uszkodzenia białek spowodowanych działaniem leków czy też np. nadmiernym wysiłkiem fizycznym [15]. Do grupy substancji, które posiadają zdolność emisji światła należą takie barwniki jak fluoresceina oraz rodamina, białka, barwniki pochodzenia roślinnego np. chlorofil i karotenoidy, poszczególne witaminy oraz hormony takie jak ryboflawina i kwas foliowy a także kwasy nukleinowe. Właściwości fluorescencyjne protein wynikają z obecności w ich łańcuchu aromatycznych reszt aminokwasowych takich jak fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan (Rys. 2.). Rys. 2. Wzory strukturalne fenyloalaniny, tyrozyny oraz tryptofanu występujących w białkach i będące chromoforami Źródło: [http://ztibsl.ch.pw.edu.pl/3wm/upl/1361989118.pdf] 186 Fluorescencyjna spektroskopia czasowo-rozdzielcza. Proste narzędzie diagnostyczne Każdy z przedstawionych powyżej aminokwasów fluoryzuje z zakresie fali bliskiemu nadfioletowi. Dla fenyloalaniny maksymalna absorpcja wynosi 260nm, a emisja jest równa 282nm. Tyrozyna charakteryzuje się nieco niższą energią, maksimum jej absorpcji wynosi 275nm a emisja 304nm. Widmo absorpcji dla tryptofanu sięga najdłuższych fal wynosząc 295nm, a emisji 353nm (Tab.3.) [9]. Tab.3. Maksimum absorpcji oraz maksimum emisji reszt aminokwasów fluorescencyjnych Maksimum absorpcji Maksimum emisji Fenyloalanina 260 nm 282 nm Tyrozyna 275 nm 304 nm Tryptofan 298 nm 353 nm Reszta tryptofanowa odgrywa najważniejszą rolę w absorpcji, a następnie fluorescencji emitowanej przez białka. Fluorescencja tyrozyny jest wyciszana w procesie bezpromienistego przeniesienia energii (rezonansowego) pomiędzy tyrozyną i tryptofanem. Fenyloalanina wykazuje się bardzo niską wartością fluorescencji, która jest możliwa do zaobserwowania prawie wyłącznie w przypadku braku w łańcuchu polipeptydowym tyrozyny i tryptofanu. Pierścień indolowi, który wbudowany jest w cząsteczkę tryptofanu, odpowiada za jego fluorescencję. To właśnie od tego fragmentu zależą właściwości fluorescencyjne chromoforu, a także ładunek sąsiednich reszt aminokwasów oraz przestrzenna lokalizacja [16]. Jeżeli aminokwas tryptofanu jest zlokalizowany na powierzchni białka maksimum emisji światła jest takie jak prezentuje powyższa tabela 3. Jeżeli natomiast reszta tryptofanowa położona jest wewnątrz cząsteczki białka, maksimum emisji przesuwa się w kierunku krótszych fal [14, 15]. 3.3.3. Spektroskopia czasowo-rozdzielcza Stosowanie spektroskopii czasowo-rozdzielczej pozwala dokładnie zmierzyć czas życia fluorescencji. Proces ten polega na wzbudzaniu badanej próbki energią w postaci fotonów, a następnie rejestracji czasu w którym dochodzi do zaniku fluorescencji [9]. Natężenia promieniowanego światła maleje wykładniczo wraz z upływem czasu. Ten mechanizm opisywany jest wzorem: I(t)=I0e –t/ô (1) 187 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Tomasz Wybranowski gdzie: I0 – natężenie fluorescencji w chwili przerwania wzbudzenia; η – średni czas życia fluorescencji, po tym czasie natężenie świecenia próbki maleje e-krotnie; I(t) – zanik intensywności fluorescencji [16]. 3.3.4. Przykłady wykorzystania spektroskopii Spektroskopia czasowo-rozdzielcza wykorzystywana jest między innymi do określenia kinetyki dezaktywacji dzięki analizie widm absorbcji np. kamptotetycyny, związku pochodzenia naturalnego o działaniu przeciwnowotworowym. Aktywna przeciwnowotworowo w środowisku alkalicznym laktonowa forma kamptotecyny, wiąże się z albuminą w osoczu, a poprzez hydrolizę, stopniowo przechodzi w nieaktywną formę karboksylową. W trakcie tego procesu dzięki obserwacji ewoluujących widm (forma aktywna przechodzi w formę nieaktywną) możliwe jest określenie kinetyki dezaktywacji związku [17, 18]. Metody spektroskopowe są także podstawą działania wielu urządzeń laboratoryjnych. Zasadę ich działania wykorzystuje się m.in. przy analizie albuminy modyfikowanej niedokrwieniem (IMA, ischemia modified albumin) jako markera ostrego niedotlenienia mięśnia sercowego. Praktycznie marker ten oznacza się przy użyciu spektroskopii w teście wiązaniu kobaltu przez albuminę. Kiedy w surowicy zwiększa się poziom IMA ilość niezwiązanego kobaltu także się zwiększa, przez co dochodzi do powstania kompleksu z chromogenem – ditiotreitolem (DTT). Reakcja barwna oceniana właśnie spektrofotomotrycznie nasila się proporcjonalnie do stężenia IMA w surowicy. Analiza dokonywana jest przy długości fali równej 470 nm, a wynik odczytywany jest w standardowych jednostkach absorbancji [7, 19, 20]. Analiza spektroskopowa wykorzystywana jest także przy diagnostyce chorób zwyrodnieniowych ośrodkowego układu nerwowego (tzw. taupatie), które są związane z patologią białka tau. Do taupatii zalicza się m.in. chorobę Alzheimera, otępienie czołowo-skroniowe, czy też zwyrodnienie korowo-podstawne. Spektroskopia, którą wykorzystuje się do badania taupatii jest w stanie wykazać swoiste zaburzenia metabolizmu, które objawiają się spadkiem stężenia NAA zwłaszcza w stosunku do stężenia białka kreatyny oraz wysokoenergetycznych związków fosforu. Stężenie białka tau oceniane spektroskopowo, uznawane jest za marker we wczesnej diagnostyce procesu zwyrodnieniowego w ośrodkowym układzie nerwowym [21]. Spektroskopia wykorzystywana jest również w diagnostyce zmian onkologicznych piersi. Dla przykładu spektroskopia Ramana, przy długości 188 Fluorescencyjna spektroskopia czasowo-rozdzielcza. Proste narzędzie diagnostyczne fali 514 i 532nm, pozwala odróżnić tkanki o budowie prawidłowej od tkanek ze zmianami nowotworowymi w zależności od charakterystycznych drgań karotenoidów, białek, lipidów oraz wody. I tak, zakres drgań dla lipidów oraz białek mieści się w przedziale 2800-3100cm-1, pasma dla cząsteczek wody to normy 3258, 3311, 3410cm-1, a dla karotenoidów 1004, 1158, 1518cm-1. Cząsteczki te uznaje się za markery, które pozwalają (dzięki ustalonym wartościom) odróżnić komórki o budowie prawidłowej od zmienionych nowotworowo. Dla przykładu uznaje się, że pasmo 3311cm-1 dla cząsteczek wody, jest typowe dla komórek nowotworowych w ludzkim gruczole piersiowym. Wynika to z większej hydratacji komórek nowotworowych od komórek niezmienionych. Odpowiednie ich nawodnienie pobudza procesy dzielenia się, ekspresję onkogenu oraz dezaktywuje te geny, które są odpowiedzialne za różnicowanie się komórek. Bogata hydratacja tkanki nowotworowej hamuje także proces apoptozy, oraz jest proporcjonalna do stopnia złośliwości nowotworu [22]. 4. Podsumowanie Autorzy pracy przedstawili unikalne właściwości białek, które dzięki obecności aminokwasów takich jak fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna (chromofory) stanowią swoistego rodzaju markery, zdolne do wykrywania uszkodzeń białek wywołanych przez np. leki, intensywny wysiłek fizyczny czy też zanieczyszczone środowisko. Do takiej identyfikacji dochodzi na skutek fotoluminescencji. Badana cząsteczka w pierwszym etapie pobiera energię w postaci fotonów, a następnie oddaje energię, która mierzona jest przez intensywność fluorescencji czyli intensywność emitowanego przez nią światła. W zależności od wspomnianej intensywności świecenia przedstawionego w postaci wykresu świadczy poziom uszkodzenia białka. Podane właściwości białek, zwłaszcza białek osocza, sprawiają, że stanowi ono doskonały materiał do badań. Dokładnie opisano zasadę zajścia procesu fluorescencji, w wyniku której dochodzi do wejścia cząsteczki w stan wzbudzony. Autorzy pracy starali się przedstawić spektroskopię jako wygodną, szybką i niezagrażającą życiu metodę, na której działaniu oparta jest praca wielu urządzeń diagnostycznych, pomagających w rozpoznaniu różnego rodzaju schorzeń. 189 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Tomasz Wybranowski Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Ponczek M. B., Wachowicz B., Oddziaływanie reaktywnych form tlenu i azotu z białkami, Postępy Biochem., 2005, 51, 2, 140-145 Berg J., Tymoczko J., Stryer L., Biochemia, PWN, Warszawa 2007 Kłyszejko-Stefanowicz L., Ćwiczenia z Biochemii, PWN, Warszawa 1999 Dembińska-Kieć A., Naskalski J., Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej, Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2010 Gburek J., Gołąb K., Juszczyńska K., Nerkowy katabolizm albuminy – aktualne poglądy i kontrowersje, Postępy Hig. Med. Dośw., 2011, 65, 668-677 Moriyama Y., Ohta D., Hachiya K., Mitsui Y., Takeda K., Fluorescence behavior of tryptophan residues of bovine and human serum albumins in ionic surfactant solutions: a comparative study of the two and one tryptophan(s) of bovine and human albumins, Journal of Protein Chemistry, 1996, 15, 3, 256-272 Myszka W., Dudziak J., Torliński L., Albumina modyfikowana niedokrwieniemnowy marker biochemiczny niedokrwienia mięśnia sercowego – przegląd wyników badań klinicznych, Now. Lek.,2006, 75, 2, 174-178 Kordecka M., Piwowar A., Płaskej E., Warwas M., Albumina modyfikowana niedokrwieniem – specyficzny marker w diagnostyce kardiologicznej?, Wiad. Lek., 2008, 61, (10-12), 263-268 Lakowicz J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy., Springer, USA 2006 Jóźwiak Z., Bartosz G., Biofizyka. Wybrane zagadnienia wraz z ćwiczeniami, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005 Atkins P. W., Postawy chemii fizycznej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009 Bartosz G., Druga twarz tlenu, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003, 19-120 Kalisz O., Wolski T., Gerkowicz M., Smorawski M., Reaktywne formy tlenu (RFT) oraz ich rola w patogenezie niektórych chorób, Annales Veterinaria, 2007, 62, 87-99 Suppan P., Chemia i światło, tł. J. Prochorow, Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa 1997 Paszyc S., Podstawy fotochemii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1992 Bryszewska M., Leyko W., Biofizyka dla biologów, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1997 Kruszewski S., Ziomkowska B., Cyrankiewicz M., i in., Kinetyka dezaktywacji kamptotecyny określana metodą analizy ewoluujących widm absorpcji, Annales Academiae Medicae Bydgostiensis, 2004, 18/3, 53-57 Ziomkowska B., Kruszewski S., Siuda R., Cyrankiewicz R., Deactivation rate of camptothecin determined by factor analysis of steady-state fluorescence and absorption spectra, Optica Applicata, Vol. XXXVI, No.1,2006 Malczewska-Malec M., Kieć-Wilk B., Leszczyńska-Gołąbek I. i wsp., Albumina modyfikowana niedokrwieniem jako marker choroby niedokrwiennej, Kardiologia Polska 2009; 67 (supl.6): 441-448 Birkner K., Hudzik B., Poloński L., Nowe potencjalne markery w chorobie wieńcowej, Folia Cardiologica Excerpta 2011, 6;2, 144-151 190 Fluorescencyjna spektroskopia czasowo-rozdzielcza. Proste narzędzie diagnostyczne 21. Pokryszko-Dragan A., Zagrajek M. M., Słotwiński K., Taupatie – choroby zwyrodnieniowe ośrodkowego układu nerwowego związane z patologią białka tau, Postępy Hig. Med. Dośw., 2005;59: 386-391 22. Brożek-Płuska B., Metody spektroskopowe w diagnostyce zmian nowotworowych ludzkiego gruczołu piersiowego, Zeszyty naukowe nr 1157, Wydawnictwo Politechniki Łódzkiej, Łódź 2013 Fluorescencyjna spektroskopia czasowo-rozdzielcza. Proste narzędzie diagnostyczne Spektroskopia czasowo-rozdzielcza wykorzystywana była już od dawna. To prosta i nieskomplikowana metoda, która opiera się na analizie światłem. W przyrodzie istnieje wiele związków zdolnych do pobrania energii i oddania jej w postaci emisji światła. Do takich związków zaliczyć można białka. To cecha wynikająca z obecności fenyloalaniny, tryptofanu i tyrozyny, które stanowią swoistego rodzaju marker. Głównym białkiem osocza jest albumina, która posiada w swoim składzie tryptofan. Badanie osocza metodą spektroskopową jest małoinwazyjną metodą badawczą. Time-resolved fluorescence of spectroscopy. A simple diagnostic tool Time-resolved spectroscopy has been used for a long time. This is a simple and uncomplicated method, which is based on the analysis of light. In the nature there are many compounds which are able to absorb energy and emit it in the form of light emission. Proteins are an example of such compounds. It is characteristic of the presence of phenylalanine, tryptophan and tyrosine, which are a kind of marker. The main plasma protein is albumin, which also contains a tryptophan. The study plasma spectroscopy method is minimally invasive research method. 191 Alicja Janicka1, Anna Cwynar2, Blanka Ziomkowska3, Joanna Sikora4 Fotoluminescencja – proste narzędzie analizy wpływu pH na aktywność przeciwnowotworową pochodnych kamptotecyny 1. Wprowadzenie Co roku na nowotwory choruje oraz umiera coraz większa liczba osób. Dzięki rozwojowi medycyny i technologii średnia długość życia społeczeństwa wzrasta, a co za tym idzie rozwijający się i dłużej żyjący człowiek, wykazuje się zwiększoną podatnością na choroby nowotworowe. Czynniki takie jak zanieczyszczone środowisko, palenie tytoniu, ale także niewłaściwa dieta oraz styl życia są przyczynami wzmożonej zachorowalności. W przeciągu 10-lecia począwszy od roku 2000, zarejestrowany został spadek zgonów z powodu nowotworów tylko o 10%, podczas gdy obniżenie śmiertelności z powodu chorób układu krążenia zmniejszono o 30% [1]. Choroby nowotworowe są ogromnym problemem, ponieważ mimo rozwoju medycyny oraz ciągłego udoskonalania technik ich wykrywania są wciąż w dużej mierze uznawane za choroby nieuleczalne. Grupy naukowców na świecie nieustannie opracowują nowe leki mogące okazać się antidotum na choroby nowotworowe. Obecnie za jedną z potencjalnych substancji uznawanych za antynowotworowe uznaje się kamptotecynę wraz z jej pochodnymi. Właściwości związku wynikają prawdopodobnie z mechanizmu jego działania, w trakcie którego dochodzi do inhibicji topoizomerazy I [2]. 2. Cel pracy Celem niniejszej pracy jest zwrócenie uwagi czytelnika na możliwość wykorzystania prostych metod spektroskopowych do analizy aktywności przeciwnowotworowej związków kamptotecyny, których dobroczynne właściwości są zależne od środowiska pH, w jakim się znajdują. 1 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Studenckie Koło Naukowe Biofizyki przy Zakładzie Biofizyki 2 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra i Zakład Patobiochemii i Chemii Klinicznej 3 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra i Zakład Biofizyki 4 [email protected], Wydział Lekarski, Katedra Farmakologii i Terapii 192 Fotoluminescencja – proste narzędzie analizy wpływu pH na aktywność przeciwnowotworową pochodnych kamptotecyny 3. Omówienie W obecnej dobie nauki oczywistym wydaje się fakt, że wartości pH (potencjał wodorowy) w organizmie ludzkim są zmienne w zależności od zajmowanego obszaru. Okazuje się jednak, że wiedza ta z medycznego punktu widzenia może mieć ogromne znaczenie w leczeniu nowotworów. Zdrowe komórki występujące w organizmie ludzkim posiadają pH w granicach ok. 7,2. Podobnie jeżeli chodzi o krew. Wartość pH dla krwi ludzkiej u zdrowego człowieka kształtuje się między 7,35 a 7,45. Niemiecki biochemik Otto Heinrich Warburg dokonał ciekawego odkrycia. Otóż wnętrze komórek nowotworowych posiada środowisko, którego punkt pH wynosi ok. 6,8, a więc jest nieznacznie przesunięte w stronę środowiska kwaśnego [2]. Taka zmiana we wnętrzu komórek nowotworowych dokonuje się poprzez produkcję kwasu mlekowego, która jest wynikiem niewłaściwie zachodzącego szlaku glikolizy oraz wysokiego poziomu dwutlenku węgla. Wysokie stężenie CO2 wewnątrz komórek nowotworowych jest spowodowane małym ich dotlenieniem, a więc także ich słabym ukrwieniem. Wynikiem tych spostrzeżeń było odkrycie, że komórki nowotworowe, którym zostanie stworzone środowisko alkaliczne nie są zdolne do przetrwania w nim [3]. W niniejszej pracy fotoluminescencja została okrzyknięta mianem narzędzia. Takie sformułowanie jest w pełni uzasadnione. Światło posiada zdolność do oddziaływania z różnymi układami molekularnymi, także z tkankami czy cząsteczkami np. we krwi czy osoczu. W wyniku tych oddziaływań zachodzą takie procesy jak rozpraszanie, skupianie, fotoluminescencja, absorpcja itd. Na podstawie unikatowego zachowania światła po jego zetknięciu się z układem molekularnym, można uzyskać informacje na temat różnego rodzaju właściwości badanego obszaru czy związku [25]. 3.1. Kamptotecyna Kamptotecyna jest naturalnym roślinnym związkiem wywodzącym się z drzewa Camptotheca acuminata (japońska nazwa to xi shu – drzewo szczęścia). Dobroczynne właściwości antynowotworowe kamptotecyny od dawnych czasów wykorzystywali już Chińczycy między innymi w leczeniu białaczki [4]. Kamptotecyna jest alkaloidem i została wyizolowana w 1966 r. podczas, gdy jej właściwości przeciwnowotworowe zostały potwierdzone 8 lat wcześniej przez Monroe E. Walla i Jonathana Hartwella. Wyizolowany alkaloid używany był w leczeniu nowotworów przewodu pokarmowego w latach 70-tych, jednak musiano zaprzestać tych praktyk z powodu występujących biegunek oraz krwotocznego zapalenia pęcherza [5]. 193 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Joanna Sikora Z chemicznego punktu widzenia pięciocykliczną cząsteczkę kamptotecyny można podzielić na trzy części: część chinolinowa, indolizynowa, a także część α-hydroksylaktonowa. Zależnie od środowiska w jakim obecnie znajduje się cząsteczka, może dojść do zamknięcia lub otworzenia się pierścienia α-hydroksylaktonowego (Rys. 1). W przyrodzie wyróżnia się dwie formy kamptotecyny: laktonową – stabilną w środowisku kwaśnym, gdzie wartości pH nie przekraczają 5,5 oraz formę karboksylową stabilną w pH powyżej 9, w którą do przekształcenia dochodzi w środowisku o wyższym pH. Pierwsza z wspomnianych warunkuje właściwości przeciwnowotworowe związku, gdzie pierścień jest zamknięty. Forma karboksylowa natomiast, do której przekształcenia dochodzi w wyniku hydrolizy z formy laktonowej jest nieaktywną chemoterapeutyczną postacią związku, w której pierścień ulega otworzeniu [6]. Mimo niestabilności formy laktonowej i szybkiego jej przechodzenia w środowisku fizjologicznym do formy karboksylowej działanie przeciwnowotworowe kamptotecyny jest niepodważalne i w latach 80’ ponowiono badania nad tworzeniem leków kamptotecynopochodnych, których celem jest utworzenie kompleksu topoizomeraza I – DNA [7]. Rys. 1. Wzory strukturalne formy laktonowej i karboksylowej kamptotecyny [23] 3.2. Topoizomeraza I i jej inhibitory Życie komórki oraz prawidłowe funkcjonowanie kwasu deoksyrybonukleinowego jest zapewniane przez enzymy jądrowe czyli topoizomerazy. Niezwykły mechanizm działania tych enzymów polega na wprowadzaniu oraz usuwaniu tak zwanych superskrętów DNA. W topoizomerazie 194 Fotoluminescencja – proste narzędzie analizy wpływu pH na aktywność przeciwnowotworową pochodnych kamptotecyny występującej w organizmie ludzkim wyróżnia się 4 domeny otaczające centralne zagłębienie, w której wnętrzu znajduje się reszta aminokwasu tyrozyny (tyr 723). Rola tyrozyny polega na przecięciu DNA w reakcji katalizowanej przez topo I [8]. Cząsteczka DNA wiąże się z wewnętrzną częścią zagłębienia enzymu, w trakcie której grupa –OH tyr723 działa na jedną z nici DNA z grupą fosforanową w wyniku czego dochodzi do powstania wiązania fosfodiestrowego enzym-DNA. Rozcięta dzięki zajściu tego procesu cząsteczka DNA uwalnia jedną z grup OH 5’, po czym dzięki energii z superhelikalnych skrętów może dojść do skrętu nici wokół nieprzeciętego łańcucha. Poprzez taką rotację DNA superskręty zostają wyeliminowane. To właśnie topoizomeraza I stoi na straży szybkości rotacji, dokładnie kontrolując w ten sposób zajście procesu, a kiedy już aktywowana reszta tyrozynowa powraca do formy początkowej topoizomeraza odłącza się od DNA [9]. Działanie inhibitorów topoizomerazy I, w tym kamptotecyny i jej pochodnych, polega na wiązaniu się w kompleks DNA-topo I oraz jego stabilizacji. Dzięki nim hamowana jest ponowna ligacja rozdzielonych już nici jednak sam proces rozdzielania nie jest zakłócany, co w efekcie doprowadza do nagromadzania się pęknięć w DNA. Te jednoniciowe pęknięcia nie szkodzą samej komórce i są odwracalne o ile nie dojdzie jednak do spotkania się widełek replikacyjnych z uszkodzoną nicią kwasu deoksyrybonukleinowego. Jeżeli jednak takie zetknięcie nastąpi, dojdzie do trwałego uszkodzenia obu nici DNA doprowadzając do śmierci komórki. Na podstawie takiego działania inhibitorów topoizomerazy można stwierdzić, że są one terapeutykami dla fazy S cyklu komórkowego pełniąc rolę cytostatyczną w trakcie zachodzącej syntezy DNA [5]. 3.3. Pochodne kamptotecyny wykorzystywane w lecznictwie Topotekan to pochodna kamptotecyny rozpuszczalna w wodzię dzięki przyłączeniu w pozycji 9-C grupy N,N-dimetyloaminometylowej (Rys. 2) [10]. Topotekan jest wykorzystywany w leczniu m.in. raka jajnika, drobnokomórkowego raka płuc, a także raka szyjki macicy [11]. Dużą zaletą tego związku jako leku (np. Hycamtin w postaci chlorowodorku topotekanu), jest jego nienagromadzanie się w organizmie człowieka dzięki krótkiemu okresowi półtrwania. Niestety jak każdy lek tak i topotekan powoduje skutki uboczne do których zalicza się m.in. gorączkę, krwiomocz, wymioty, bięgunkę oraz neutropenię [12]. 195 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Joanna Sikora Rys. 2. Wzór strukturalny topotekanu [24] Irinotekan (SN-38) jest kolejną pochodną kamptotecyny. W pozycji C-10 grypy karbonylowej przyłączony jest fragment bispiperydynowy (Rys. 3). Enzym karboksyesterazy hydrolizuje grupę karboksypiperydynową do powstania 7-etylo-10-karboksybispiperydyny SN-38 która jest aktywnym metabolitem irynotekanu. Tak powstały związek wykazuje silne działanie przeciwnowotworowe jako inhibitor topoizomerazy I [10]. Lek stosowany jest w leczeniu nowotworów płuc (rak drobnokomórkowy i nie drobnokomórkowy), okrężnicy i odbytnicy, ale także jako skuteczny terapeutyk w leczeniu raka piersi, jajników, szyjki macicy nowotworach złośliwych szyi i głowy oraz wielu innych [12]. Powstały SN-38 jest silnie lipofilny, jego okres półtrwania jest dłuższy niż w postaci topotekanu i aktualnie jest stosowany w terapii skojarzonej z cisplatyną [11]. Rys. 3. Wzór strukturalny irinotekanu [24] 196 Fotoluminescencja – proste narzędzie analizy wpływu pH na aktywność przeciwnowotworową pochodnych kamptotecyny 3.4. Kamptotecyna a albumina Albumina to przeważające ilościowo białko osocza (ok. 60%), jej prawidłowe stężenie w organizmie ludzkim wynosi 34-47g/l, a masa cząsteczkowa to ok. 69 kDa. Białko to charakteryzuje elipsoidalny kształt. Taka cecha powoduje, że lepkość osocza nie zwiększa się przez co transport białka w krwioobiegu jest łatwy. Dodatkowym atutem jest znaczna ilość aminokwasów polarnych z hydrofilnymi grupami takimi jak grupa hydroksylowa, tiolowa, aminowa i karboksylowa, dzięki czemu albumina jest dobrze rozpuszczalna w wodzie i osoczu [13]. Głównym organem, który syntezuje albuminę jest wątroba (ok. 8-14g białka na dobę). Łącznie jest to w przybliżeniu 25% całej ilości albuminy. W początkowym etapie reakcji dochodzi do syntezy tego białka jako preproteiny, dochodzi do usunięcia peptydu sygnalnego w procesie jego przejścia do tak zwanych cystern w szorstkiej siateczce śródplazmatycznej. W związku z tym, że to właśnie wątroba jest głównym organem syntezy albumin wiele chorób dotyczących tego organu charakteryzuje się ogólnym zmniejszeniem białka w osoczu ludzkim [14]. Albumina zbudowana jest z 585 reszt aminokwasowych oraz zawiera 17 mostków disiarczkowych. Dzięki enzymom tnącym białka tzw. proteazą, można wyodrębnić 3 główne domeny tego białka pełniące różne funkcje. Zarówna pierwsza, druga jak i trzecia domena dzieli się na 2 części (poddomeny) co wyjaśnia możliwość wiązania się z albuminą wielu różnych cząsteczek [15]. W organizmie ludzkim białko to w dużej mierze jest białkiem transportowym, przenosząc między innymi jony wielu różnych metali takich jak na przykład jony miedzy czy wapnia (połowa Ca2+ znajdującego się w organizmie człowieka jest związanych z albuminą), ale również i z wolnymi kwasami tłuszczowymi wywodzących się z adipocytów (komórek tłuszczowych) transportując je do różnych tkanek. Albumina ma zdolność do wiązania wielu leków w tym do wiązania się z kamptotecyną i jej pochodnymi, silnie wpływając przy tym na jej skuteczność działania oraz farmakokinetykę [15]. Znając właściwości kamptotecyny oraz działanie formy karboksylowej oraz laktonowej wiemy już, że ta pierwsza ma większe powinowactwo do wiązania się w fizjologicznych warunkach (chodzi tu o warunki pH) z albuminą niż forma laktonowa co ma znaczenie w jej przeciwnowotworowym działaniu. Mimo, że w warunkach in vitro badacze są w stanie w prosty sposób doprowadzić do przejścia z formy karboksylowej do formy laktonowej i na odwrót (zmiana warunków pH), w organizmie ludzkim proces ten jest niemożliwy ze względu na to, że w osoczu w którym znajduje się albumina, dochodzi tylko do procesu hydrolizy (Rys. 4.) 197 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Joanna Sikora Rys.4. W warunkach fizjologicznych forma laktonowa przechodzi w formę karboksylową. Wykres pokazuje jak we krwi zmniejsza się stężenie formy laktonowej [25] Ze względu na niemożność zajścia w takich warunkach laktonizacji, jest to proces nieodwracalny. Po mniej więcej 120 minutach od wprowadzenia kamptotecyny w formie laktonowej do roztworu z albuminą, aktywna przeciwnowotworowo jej postać w procesie hydrolizy zanika. Z powyższego procesu można wywnioskować, że najistotniejsze dla długotrwałego działania leku jest jak najdłuższe utrzymanie jego odpowiedniego stężenia w organizmie pacjenta w postaci niezwiązanej z białkiem. Tylko to gwarantuje farmakologiczną aktywność i działanie przeciwnowotworowe. O ile w warunkach in vitro jest to stosunkowo proste ze względu na operowanie zmianą pH, o tyle in vivo jest to utrudnione ze względu na zachowanie homeostazy i pH fizjologicznego. To właśnie w związku z tym poszukiwane były wcześniej wspomniane związki pochodne kamptotecyny (topotekan, irinotekan), stabilne w warunkach fizjologicznych, o zachowanych właściwościach przeciwnowotworowych, łatwo wiążące się z obszarem zmienionym nowotworowo [6, 13, 22]. 198 Fotoluminescencja – proste narzędzie analizy wpływu pH na aktywność przeciwnowotworową pochodnych kamptotecyny 3.5. Fotoluminescencja Czym jest fotoluminescencja najlepiej w sposób graficzny opisuje schemat Jabłońskiego, przedstawiający procesy fizyczne zachodzące w cząsteczce, która to oddziałuje z fotonami (Rys. 5.). Schemat w prosty sposób demonstruje tak zwane stany elektronowe cząsteczki zarówno trypletowe jak i singletowe oraz wskazuje przepływ energii z jednego do drugiego i odwrotnie. Najczęściej schemat wykorzystuje się do przeanalizowania fluorescencji oraz fosforescencji czyli tak zwanej luminescencji [16]. Rys. 5. Diagram Jabłońskiego (wg Lakowicz 2006) [19] Fluorochrom – jego mianem nazywamy cząsteczkę, która jest zdolna do emitowania światła, po uprzednim pobraniu energii. W początkowym stadium (to znaczy w stanie podstawowym) cząsteczka znajduje się w stanie singletowym (na rysunku 5 oznaczony jako S0). Działająca na cząsteczkę odpowiednio duża energia powoduje jej przejście na wyższy stan, także singletowy. Foton jest absorbowany z bardzo dużą szybkością rzędu nawet 10-15s [16]. Istnieje reguła mówiąca o tym że elektrony mogą przechodzić miedzy stanami, których multipletowość jest taka sama. Diagram Jabłońskiego ma na celu łatwiejsze wyróżnienie oraz zademonstrowanie zjawisk fizycznych, które przebiegają we wnętrzu cząsteczki już po zaabsorbowaniu przez nią fotonów. W tym miejscu należy zaznaczyć, że do takich procesów oprócz wymienionych powyżej zjawisk fotoluminescencji czyli fosfore- i fluorescencji zalicza się także tak zwane procesy bezpromieniste. Konwersja wewnętrzna to proces bezpromienisty dotyczący zarówno przejść międzysystemowych czyli przejścia między stanami o innej multipletowości, oraz przejść elektronowych między stanami gdzie multipletowość jest taka sama [16]. 199 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Joanna Sikora Analizując diagram Jabłońskiego należy zwrócić uwagę na dwa terminy dotyczących rodzajów fotoluminescencji. Fluorescencja wiąże się z przejściem ze stanu S1 do S0, w trakcie czego dochodzi do „wyświecenia”. W trakcie fosforescencji cząsteczka przechodzi ze stanu T 1 do stanu S0. Różnica występuje także w czasie opóźnienia świecenia od momentu absorbancji fotonu. Dla fluorescencji jest to czas rzędu 10-8s, gdzie fosforescencja potrzebuje nawet do kilku sekund. Jest to związane z czasem życia cząsteczki w stanie S i T [17, 18, 19]. 3.6. Fluorescencja, a określanie właściwości kamptotecyny Spektroskopowe pomiary czasu życia fluorescencji, pomiary zaników anizotropii fluorescencji oraz analizy widm fluorescencji kamptotecyny są bardzo istotne w badaniach właściwości nad aktywnością kamptotecyny zależną od pH, w jakim się znajduje. Na podstawie wyników tych analiz można dowiedzieć się, co dzieje się z cząsteczką w czasie życia stanu wzbudzonego, po czym możliwe jest określenie miejsca, w jakim znajdują się fluoryzujące cząsteczki i czy są one wolne czy związane oraz określenie, jaki jest współczynnik powinowactwa kamptotecyny do białek czy błon komórkowych. Im większe powinowactwo pochodnych kamptotecyny do tkanki, tym większe ich właściwości przeciwnowotworowe. Wynika to z faktu, że w organizmie związki kamptotecyny w formie laktonowej (forma stabilna w środowisku kwaśnym) ulegają hydrolizie do formy karboksylowej (pH zasadowe), natomiast co ciekawe laktonowa forma, która uległa już związaniu z błoną nie ulega przemianie do formy nieaktywnej nowotworowo. Przed taką kumulacją cząsteczek aktywnych w tkance zmienionej, może jednak dojść do trwałego związania się kamptotecyny z albuminą we krwi co spowoduje zmniejszenie się ilości formy laktonowej zanim dotrze ona do miejsca docelowego, w którym ma się nagromadzić [19, 25]. 4. Podsumowanie Światło jest cennym narzędziem badawczym. Opisany przypadek jego wykorzystania jest dobrym przykładem na używanie światła w badaniach farmaceutyków. Zjawiska fotoluminescencji towarzyszące działaniu światła są w stanie dostarczyć badaczowi istotnych informacji na temat analizowanego związku czy tkanki, z których można wyczytać tak jak w przypadku kamptotecyny zależność kamptotecyny od środowiska pH w jakim się znajduje na jej działanie przeciwnowotworowe [25]. Z niniejszej pracy jasno wynika, że w pH oscylującym wokół 6,8 hydroliza aktywnej przeciwnowotworowo formy laktonowej kamptotecyny zachodzi wolniej. Adams i in. [2] w swojej publikacji tłumaczą ten 200 Fotoluminescencja – proste narzędzie analizy wpływu pH na aktywność przeciwnowotworową pochodnych kamptotecyny wolniejszy proces uwodnienia cząsteczki w takich warunkach środowiskowych jej budową. W pH powyżej 7 dochodzi do otworzenia się pierścienia E, co jak już wiemy prowadzi do unieaktywnienia czynnej antynowotworowo postaci związku. Istnieją liczne doniesienia wskazujące, że hydroliza procesu zachodzi tym szybciej im wyższe jest pH [2], a metody pomiaru fotoluminescencji są w stanie bardzo dokładnie (poprzez np. pomiar widm absorbcji) określić m.in. czy w danym pH, pochodna kamptotecyny jest aktywna przeciwnowotworowo oraz czy związała się z obszarem patologicznym [6, 20, 21]. Literatura Dane statystyczne dotyczące przyczyn zgonu, 2012, http://ec.europa.eu/eurostat/statisticsexplained/index.php/Causes_of_death_statistics/pl, data wejścia na stronę 2. Adams D. J., Wahl M. L., Flowers J. L., Sen B., Colvin M., Dewhirst M. W., Manikumar G., Wani M. C., Camptothecin analogs with enhanced activity against human breast cancer cells. II. Impact of the tumor pH gradient, Cancer Chemother Pharmacol 2006; 57 145-154 3. Dr Otto Heinrich Warburg o głównej przyczynie powstawania nowotworów, CudpH, http://cudph.pl/dr-otto-heinrich-warburg-o-glownej-przyczyniepowstawania-nowotworow 4. Van Wyk B. E., Wink M., Rośliny lecznicze świata. Ilustrowany przewodnik, MedPharm Polska, Wrocław 2008, 76 5. Brunton L. L. i in., Analogi kamptotecyny, Farmakologia Goodmana i Gilmana, Tom II, Wydawnictwo Czelej, Lublin 2007, 1450-1453 6. Ziomkowska B., Kruszewski S., Cyrankiewicz M., Stolarska P., Siepielska A., Badanie oddziaływania kamptotecyny i 7-etylo-10-hydroksykamptotecyny z białkami osocza metodą pomiaru anizotropii fluorescencji, Medical and Biological Sciences, 2007, 21 (4) 127-132 7. Perry M. C., The chemotherapy source book, Williams & Wilkins, Baltimore 1996, 425 8. Berg J. M. i in., Topoizomerazy przygotowują podwójną helisę DNA do rozplecenia, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2011, 794 9. Berg J. M. i in., Topoizomerazy typu I odpowiadają za relaksację struktur superhelikalnych, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2011, 794-795 10. Cragg G. M. i in., Anticancer agents from natural products, CRC Press, Boca Raton FL 2012, 6-16 11. Katzung B. G. i in., Farmakologia ogólna i kliniczna, Wydawnictwo Czelej, Lublin 2012, 1096 12. Kostowski W., Herman Z. S., Inhibitory topoizomerazy, Farmakologia. Podstawy farmakoterapii, Tom II, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2008, 423-425 1. 201 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Joanna Sikora 13. Bańkowski E., Biochemia. Podręcznik dla studentów studiów licencjackich i magisterskich, MedPharm Polska, Wrocław 2014, 36 14. Murray R. K. i in., Albumina jest głównym białkiem ludzkego osocza, Biochemia Harpera, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2002, 924-925 15. Davidson V. L., Sittman D. B., Biochemia, Urban & Partner, Wrocław 2002, 44 16. Ślusarek G., Fluorescencja i fosforescencja, Biofizyka molekularna, Red. Grajkowska B., Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2011, 464-465 17. Jaroszyk F., Zjawiska fizyczne zachodzące w cząsteczkach wzbudzonych. Fotoluminescencja. Schemat Jabłońskiego, Biofizyka, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2011, 783-786 18. Jóźwiak Z., Bartosz G., Polaryzacja fluorescencji, Biofizyka. Wybrane zagadnienia wraz z ćwiczeniami, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2008, 136-137 19. Lakowicz J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic /Plenum Publishers, New York 1999, 303-304 20. Mi Z., Burke T. G., Differential Interactions of Camptothecin Lactone and Carboxylate Forms with Human Blood Components, Biochemistry, 1994, 33 10325-10336 21. Ziomkowska B., Cyrankiewicz M., Kruszewski S., Hydroxycamptothecin Deactivation Rates and Binding to Model Membranes and HSA Determined by Fluorescence Spectra Analysis, Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 2007, 10 (6) 459-465 22. Ziomkowska B., Kruszewski S., Siuda R., Cyrankiewicz M., Określenie kinetyki dezaktywacji kamptotecyny metodą analizy ewolucji czasowej widm absorbancji i fluorescencji, XIII Krajowa Konferencja Naukowa "Biocybernetyka i inżynieria biomedyczna". Gdańsk, 10-13 IX 2003. T. 2. Biopomiary. Red. A. Nowakowski, [B.m., 2003] s. 1156-1161 23. Ziomkowska B., Cyrankiewicz M., Kruszewski S., Determination of Hydroxycamptothecin Affinities to Albumin and Membranes by Steady-State Fluorescence Anisotropy Measurements, Combinatorial Chemistry & High Troughput Screening 2007, 10, 486-492 24. Naumczuk B., Synteza I badanie właściwości chemicznych I biologicznych potencjalnych inhibitorów topoizomerazy I oddziaływujących z oligomerami DNA, Praca przedstawiona Radzie Naukowej Instytutu Chemii Organicznej Polskiej Akademii Nauk w celu uzyskania stopnia doktora nauk chemicznych, Warszawa 2015 25. Kruszewski S., Zastosowanie zjawisk fotoluminescencji w badaniach farmaceutycznych oraz w diagnostyce i terapii przeciwnowotworowej, Wykład wygłoszony podczas Ogólnopolskiego Dnia Nauki 2005, Wiadomości Akademickie 19, 2005 202 Fotoluminescencja – proste narzędzie analizy wpływu pH na aktywność przeciwnowotworową pochodnych kamptotecyny Fotoluminescencja – proste narzędzie analizy wpływu pH na aktywność przeciwnowotworową pochodnych kamptotecyny Kamptotecyna jest alkaloidem pochodzącym z drzewa Camptotheca acuminata. Ta substancja należy do inhibitorów topoizomerazy I. Kamptotecyna ze względu na działania niepożądane nie jest wykorzystywana w lecznictwie bezpośrednio, ale za pomocą pochodnych takich jak irynotekan czy topotekan. Działanie przeciwnowotworowe pochodnych kamptotecyny jest zależne od pH, w jakim się znajdują. Dzięki fotoluminescencji, możliwe jest zbadanie aktywności kamptotecyny. Photoluminescence – a simple tool to analyze the impact of pH on the antitumor activity of camptothecin derivatives Camptothecin it is an alkaloid which is produced of the Camptotheca acuminate tree. This substance belongs to the inhibitors of topoisomerase I. The Camptothecin has many adverse drug reactions and is not used in therapeutics directly, but with using its derivatives such as irinotecan and topotekan. The antitumor effect of camptothecin derivatives is dependent on the pH at which they are located. By the photoluminescence, to research the activity of camptothecin it is possible. 203 Arkadiusz Goede1, Maciej Gawroński2, Tomasz Wandtke3 Technika DNA origami – potencjalne zastosowania 1. Wprowadzenie DNA przez wzgląd na swoje cechy takie jak: rozpoznawanie molekularne, programowalność, prostota syntezy, zdolność do samoorganizacji, oraz łatwość przewidzenia struktury w nanoskali, wydaje się być wspaniałą molekułą umożliwiającą tworzenie złożonych struktur dwu i trójwymiarowych. Nanotechnologia DNA wykorzystuje w dużej mierze zasadę samoistnego łączenia się dwóch pojedynczych nici DNA w podwójną helisę za pomocą wiązań między komplementarnymi parami zasad. Wiązanie się adeniny wyłącznie z tyminą i cytozyny z guaniną pozwala na programowanie procesu budowy struktur z DNA. Podwójna helisa DNA natywnie posiada liniową nierozgałęzioną topologię umożliwiającą powstanie wyłącznie struktur jednowymiarowych [1]. Jednakże porównując liniową, nierozgałęzioną strukturę cząsteczki DNA z cząsteczką, która ma np. jedno rozgałęzienie można zauważyć podobieństwo. Każda ze wspomnianych cząsteczek posiada 100% sparowanych komplementarnie ze sobą zasad. Jedyną różnicą jest występowanie w rozgałęzionej cząsteczce dodatkowego ramienia, które może mieć dowolną długość – (Rysunek 1). Dodatkowe ramie nie wpływa jednak w żaden sposób na komplementarność pomiędzy pierwszą a drugą nicią DNA, jednakże replikacja takiej cząsteczki przez polimerazę DNA jest nieskuteczna. Rozgałęzione cząsteczki DNA nie są tylko wytworem sztucznym. Rozgałęzione struktury kwasu nukleinowego naturalnie występują i są używane, głównie jako nietrwałe półprodukty w procesach replikacji, rekombinacji i naprawy. 1 [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, http://www.cm.umk.pl 2 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Terapii Genowej, Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, http://www.cm.umk.pl 3 [email protected]; Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, http://www.cm.umk.pl 204 Technika DNA origami – potencjalne zastosowania Rysunek 1. Porównanie natywnej dwuniciowej liniowej cząsteczki DNA (a) z cząsteczką DNA rozgałęzioną (b) [2] 2. Początek nanotechnologii DNA – badania Seeman’a Seeman jako pierwszy zdał sobie sprawę z możliwości wytworzenia sztucznych punktów rozgałęzień DNA. Obserwacja DNA podczas jego kopiowania w czasie podziału komórkowego była krokiem milowym dla Seeman’a. Podczas powielania materiału genetycznego podwójna nić DNA może się częściowo rozszczepić i przyłączyć komplementarnie do innej nici DNA. W taki sposób naturalnie powstaje punkt rozgałęzienia, a powstała cząsteczka nie wykazuje już liniowej topologii. Struktury wytworzone podczas badań Seeman’a były raczej niewielkie. Budowa nowych struktur wymagała żmudnego projektowania, a później syntezy wszystkich składowych nici DNA. Ograniczenie stanowiło również wykorzystanie syntezatorów DNA mogących produkować nici DNA o długości dochodzącej tylko do setek par zasad. Jest to niestety niewystarczające do wytworzenia dużych, wielowymiarowych i złożonych struktur DNA [3]. Początkowe próby użycia molekuł DNA o pojedynczym punkcie łączenia nie były udane. Problem stanowiła zbytnia elastyczność komponentów DNA wykorzystywanych w budowie skomplikowanych struktur. Pojedynczy punkt wiązania nie był wstanie zapewnić stabilnego 205 Arkadiusz Goede, Maciej Gawroński, Tomasz Wandtke i silnego połączenia między cząsteczkami, uniemożliwiając tym samym konstrukcję struktur wyższego rzędu [4]. Dopiero zastosowanie wielorozgałęzionych łańcuchów pozwoliło osiągnąć wymaganą sztywność i stabilność połączeń. Podwójnie rozgałęziony motyw po raz pierwszy wykorzystano w 1993 roku i od tego czasu stał się motywem często wykorzystywanym w nonotechnologii DNA. Złożone struktury DNA często składają się z powtarzalnych komponentów utrzymywanych razem dzięki lepkim końcom na każdym z nich [5-12]. 3. Lepkie końce w nanotechnologii DNA Lepkie końce wykorzystuje się do produkcji zrekombinowanych liniowych cząsteczek DNA od prawie 35 lat [13]. Połączenie kohezji lepkich końców z rozgałęzionymi cząsteczkami DNA, umożliwia produkcję wielu złożonych struktur o różnej topologii przy stosunkowo niewielkim wysiłku. Rozpoznanie jednej nici DNA przez inną nić jest wykorzystywane w wielu typach nanotechnologii DNA i biologii molekularnej. Szczególną cechą strukturalną nanotechnologii DNA jest to, że wykorzystuje ona dobrze zdefiniowane struktury w miejscu łączenia się dwóch helis DNA. 4. Powstawanie struktur rozgałęzionych Kluczowym założeniem podczas analizy krystalicznej struktury 3D cząsteczki DNA jest to, że kiedy dwie cząsteczki DNA są utrzymywane razem przez lepkie końce, a znane są współrzędne w analizowanej strukturze jednej z cząsteczek, to są znane również współrzędne drugiej. W przypadku użycia innego systemu rozpoznawania biologicznego opartego np. na oddziaływaniach przeciwciało-antygen, trzeba byłoby opracować zależności przestrzenne dwóch partnerów w reakcji wiązania w każdej parze. Wiele różnych lepkich końców posiada struktury, które są niemal identyczne. Dlatego też w strukturalnej nanotechnologii DNA wykorzystuje się również różne metody kohezji: kohezję PX, dzielenie się krawędziami, kohezję boczną [14‚18]. Wytworzenie cząsteczek rozgałęzionego DNA przy wykorzystaniu systemu biologicznej, wzajemnej wymiany nici nie jest trudne. Rysunek 2 przedstawia kilka motywów uzyskanych w ten sposób, które okazały się ważne w strukturalnej nanotechnologii DNA. Połączenie Holiday’a (ang. Holliday junction; HJ) występuje naturalnie jako biologiczny półprodukt w rekombinacji genetycznej. Powstaje na skutek pojedynczej wzajemnej wymiany między podwójnymi helisami DNA. Podwójnie skrzyżowana cząsteczka (ang. Double cross-over; DX) jest półproduktem pochodzącym z dwóch wymian pomiędzy podwójnymi helisami podczas mejozy. Cząsteczka potrójnie 206 Technika DNA origami – potencjalne zastosowania skrzyżowana (ang. Triple crossover; TX) generowana jest przez dwie wzajemne wymiany pomiędzy helisą cząsteczki DX a inną podwójną helisą DNA [19-22]. Dwie nici DNA tworzące podwójną helisę mają przeciwną biegunowość względem siebie. Wymiana może odbywać się pomiędzy nićmi tej samej biegunowości lub przeciwnej. HJ, DX i TX są wynikiem wymiany między nićmi o przeciwnej polaryzacji. Cząsteczka PX charakteryzuje się wymianą pomiędzy nićmi tej samej polaryzacji [23]. Wymiana w motywie PX występuje w każdym możliwym miejscu, gdzie nici są zestawione ze sobą. Wariant JX2 pozbawiony jest dwóch połączeń w środku, w porównaniu do cząsteczki PX. Wykorzystuje się go do tworzenia wytrzymałych nanomechanicznych „urządzeń”. Opisane wyżej cząsteczki: DX, TX, PX, JX2 należą do grupy motywów sztywnych i wytrzymałych i zostały przedstawione na rysunku 2 [18, 24]. Rysunek 2. Przegląd wybranych motywów rozgałęzionych [2] Rysunek 3 przedstawia pojedyncze miejsce rozgałęzienia HJ. Każde z czterech podwójnych spiralnych ramion jest zakończone lepkim końcem. Rysunek pokazuje cztery z tych skrzyżowań zmontowanych razem w strukturę czworokąta poprzez łączenie się lepkich końców. Lepkie końce oprócz występowania wewnątrz wspomnianej struktury, występują również na jej zewnętrznej części, co umożliwia jej rozszerzenie o kolejne podjednostki składowe w postać dwuwymiarowych tablic krystalicznych. Dwuwymiarowość wspomnianych tablic jest tak naprawdę tylko umowna, gdyż natura DNA w postaci podwójnej helisy tak naprawdę czyni je systemem 3D, a nie systemem 2D. W ten sposób rozgałęzione cząsteczki DNA zaopatrzone w lepkie końce mogą być połączone w obiekty 3D i tworzyć struktury w postaci siatki. 207 Arkadiusz Goede, Maciej Gawroński, Tomasz Wandtke Rysunek 3. Schemat tworzenia dwuwymiarowych tablic krystalicznych z czterech HJ [2] Istnieje szereg enzymów, które mogą być stosowane podczas prac z DNA: ligazy przyłączają kowalencyjnie lepkie końce; enzymy restrykcyjne, mogą być stosowane do tworzenia interesujących odcinków DNA jak i do celów analitycznych; egzonukleazy mogą zostać użyte w celu usuwania nieprawidłowych komponentów; topoizomerazy natomiast można wykorzystać do diagnozowania problemów topologicznych [7, 13, 25‚27]. 5. Minimalizacja symetrycznych sekwencji (ang. Sequence symetry minimalization) W inżynierii molekularnej ważne jest zaprojektowanie elementów, które mają możliwość łączenia się tylko w jeden sposób, w celu wyeliminowania możliwości powstawania dwóch lub więcej konkurencyjnych, niespecyficznych produktów. Ważne jest również oszacowanie termodynamiki w zależności od użytych sekwencji i wybrania najbardziej optymalnej dla powstania zamierzonego produktu [28]. Rysunek 4 przedstawia czteroramienne skrzyżowanie DNA. Ramiona są długie na 8 nukleotydów, więc każda z nici zawiera ich 16. 16 nukleotydów dzieli się na szereg pokrywających się elementów (w tym przypadku 13 tetramerów). Każdy z tych elementów, takich jak sekwencja CGCA czy GCAA jest unikalny. Ponadto każdy tetramer obejmujący „zakręt” (np. sekwencja CTGA) nie posiada komplementarnej sekwencji (TCAG) w żadnym miejscu rozgałęzionej cząsteczki. Dzięki takiemu zaprojektowaniu sekwencji w całej cząsteczce jedyną konkurencję dla docelowych oktamerów mogą stanowić trimery, takie jak sekwencja ATG. Wspomniane podejście zakłada, że podwójne helisy są najkorzystniejszymi strukturami, które może 208 Technika DNA origami – potencjalne zastosowania stworzyć DNA i że formowanie się podwójnej helisy doprowadzi do pomyślnego utworzenia punktów odgałęzienia. Powodzenie tego sposobu polega na kooperatywności tworzenia podwójnej helisy DNA. Rysunek 4. Schemat czteroramiennej cząsteczki DNA [2] Zbudowano jak dotąd kilka rozgałęzionych cząsteczek zawierających trzy, cztery, pięć, sześć, osiem i dwanaście ramion. Z wielu badań wynika, że kąt między ramionami wydaje się być elastyczny. W związku z tym wcześniejsze konstrukcje były stałe pod względem topologii, a niekoniecznie pod względem ich trójwymiarowej struktury [29‚34]. 6. Tablice DNA (ang. DNA arrays) Po stworzeniu szeregu struktur rozgałęzionych, przedmiotem zainteresowania stało się połączenie różnych gatunków struktur ze sobą. Podczas budowy tablic DNA wymagana jest wysoka, strukturalna integralność między poszczególnymi komponentami. Jak wspomniano wyżej, pojedyncze skrzyżowanie, takie jak struktura HJ jest stosunkowo elastyczne. Cząsteczki DX wykazują znacznie większą sztywność, w porównaniu do podwójnej helisy DNA, czy cząsteczek HJ [8, 35]. Molekuły TX i PX wykazują podobne cechy pod względem sztywności co 209 Arkadiusz Goede, Maciej Gawroński, Tomasz Wandtke DX. Właściwości te stały się podwaliną do użycia ich jako materiału budulcowego w celu stworzenia tablic DNA [22, 36]. Tablice DNA okazały się użyteczne jako rusztowanie podczas montażu urządzeń nanomechanicznych. Przy użyciu komponentów DNA możliwe jest wytworzenie swoistego rodzaju szablonów DNA, które zawierają przewidywalne właściwości opierając się na kohezji lepkich końców indywidualnych motywów. Szablony DNA można modyfikować poprzez enzymatyczne dodanie lub usunięcie poszczególnych cech. Oprócz tworzenia tablic z cząsteczek DX, możliwe jest również ich wytwarzanie z periodycznych cząsteczek TX [22, 37]. Dwuwymiarowe struktury DNA mogą również zostać zbudowane przy użyciu struktur DNA o wyglądzie równoległoboków. Motywy te są wytwarzane przez połączenie czterech HJ-podobnych rozgałęzień. W przeciwieństwie do DX, TX oraz cząsteczek PX, dwie domeny cząstek HJ nie są równoległe do siebie [38‚40]. Zastosowanie cząsteczek DX pozwoliło na stworzenie różnych motywów, w tym równoległoboków, czy trójkątów [41]. Tablice DNA, niebawem po ich stworzeniu zostały zastosowane między innymi w celu stworzenia rusztowania dla nanoczasteczek [42]. 7. Tworzenie struktur 3D Nanostruktury 3D powstają najczęściej przez składanie płaskich figur. Innym sposobem montażu struktur trójwymiarowych jest tworzenie stosów płaskich struktur. Jest to możliwe dzięki zastosowaniu miejscowospecyficznych sond w każdej warstwie, które selektywnie wiążą się z konkretnym miejscem w innej warstwie. Pierwszy obiekt trójwymiarowy zbudowany z DNA miał postać sześcianu, w którym krawędzie składały się z podwójnych helis DNA, a wierzchołki stanowiły punkty trójramiennych rozgałęzień. Każda z krawędzi sześcianu powstaje poprzez dwukrotny obrót nici DNA ją tworzącej, co umożliwia złożenie całej struktury z zachowaniem odpowiednich kątów pomiędzy jej poszczególnymi elementami. W każdej krawędzi powstałej cząsteczki jest obecne unikalne miejsce restrykcyjne. Dowodem zbudowania pożądanej cząsteczki może być trawienie miejsc restrykcyjnych, doprowadzające do zmian w budowie cząsteczki [26, 42]. Następną cząsteczką zbudowaną na bazie DNA był ścięty oktaedr. Ośmiościan ścięty posiada 14 ścian. Sześć nici DNA odpowiada za tworzenie ścian kwadratowych a osiem nici DNA za tworzenie ścian sześciokątnych. Z każdego wierzchołka ośmiościanu ściętego wychodzą trzy krawędzie, jednak cała struktura powstała poprzez wykorzystanie rozgałęzień czteroramiennych. Dodatkowe helisy mogą być użyte do połączenia wielościanów w wersję 210 Technika DNA origami – potencjalne zastosowania makrocząsteczki zeolitu A. W ciągu ostatnich kilku lat zbudowano ośmiościan przy użyciu cząsteczek PX [25, 7, 15, 43]. Za strukturę wielowymiarowej cząsteczki zbudowanej z DNA odpowiadają zastosowane węzły. Pół obrotu helisy DNA odpowiada jednemu węzłowi. Węzły negatywne produkowane są na bazie konwencjonalnych prawo skrętnych helis B-DNA, natomiast węzły pozytywne powstają z lewoskrętnych helis Z-DNA. Rysunek 5A przedstawia węzeł negatywny, a rysunek 5C węzeł pozytywny. Rycina 5B przedstawia strukturę złożoną z dwóch pozytywnych i dwóch negatywnych węzłów. Wszystkie z tych węzłów zostały wyprodukowane z jednej nici DNA, w zależności od zastosowanych warunków ligacji [44, 45]. Rysunek 5D ilustruje pierścienie Borromean`a zbudowane z kombinacji prawoskrętnego trójramiennego B-DNA połączonego z lewoskrętnym trójramiennym Z-DNA. Pierścienie Borromean’a mają szczególną właściwość: gdy dowolny pierścień w zestawie jest cięty, wszystkie pierścienie rozpadają się. Jest to niezwykle trudna topologia do produkcji metodami konwencjonalnymi, ale struktura ta jest stosunkowo łatwa do wykonania z DNA [46, 47]. Rysunek 5. Schemat węzłów DNA: A – węzeł negatywny; C – węzeł pozytywny; B – struktura złożona z dwóch pozytywnych i dwóch negatywnych węzłów; D – pierścienie Borromean’a [2] 8. Początek DNA origami – Badania Rothemund’a Prekursorem techniki DNA origami był Rothemund (2006r.). Idea wspomnianej metody jest bardzo prosta i opiera się na składaniu długiej nici rusztowania w pożądany kształt. Kształt ten osiąga się wykorzystując 211 Arkadiusz Goede, Maciej Gawroński, Tomasz Wandtke specjalnie zaprojektowane krótkie odcinki DNA w postaci spinek, czy zszywek. Rothemund w swoim badaniu użył nici DNA genu bakteriofaga M13mp18 o długości 7,249 pz. Wykorzystana przez niego cząsteczka DNA była pojedynczą i kolistą nicią kwasu deoksyrybonukleinowego. Wybór tej konkretnie cząsteczki był nieprzypadkowy. Genom bakteriofaga M13 był dobrze poznany, a wykorzystana przez Rothemunda sekwencja wykazywała niewielką strukturę drugorzędową. Krótkie 30 nukleotydowe odcinki DNA, będące spinkami, zaprojektowano by były komplementarne do dwóch różnych domen w nici będącej rusztowaniem. Połączenie domen przez spinki utrzymuje i stabilizuje strukturę nici-rusztowania. Sukces Rothemunda można zawdzięczyć wykorzystaniu stu-krotnego nadmiaru każdej ze spinek DNA, minimalnej strukturze drugorzędowej M13 i selekcji spinek w taki sposób, aby nie były względem siebie komplementarne [48, 49]. Obecnie w celu uzyskania dowolnego kształtu DNA origami, otrzymuje się najpierw przybliżony kształt zewnętrzny. Następnie kształt ten jest wypełniany cylindrami o średnicy równej średnicy spirali DNA i długości równej całkowitej wielokrotności skoku linii śrubowej. Cylindry są następnie łączone ze sobą w określonych punktach rozgałęzień. Należy zauważyć, że punkty rozgałęzień muszą być oddalone od siebie o 1,5 obrotu, aby utrzymać płaskość całej struktury. Następnie nić rusztowania jest „tkana” przez cylindry – (Rysunek 6). Rysunek 6. Schemat metody DNA origami [48] 9. Problemy w technice DNA origami Metody oparte na wykorzystaniu techniki DNA origami nadal posiadają szereg poważnych wad i niedogodności. Struktury DNA origami nie są stabilne w zmiennych warunkach i wymagają specjalnego traktowania. Drastyczny wpływ na strukturę DNA origami wywiera np. pH. W roztworach charakteryzujących się niskim pH może dojść do depurynacji, czyli hydrolizy zasady purynowej (adeniny lub guaniny) od reszty nukleotydu (deoksyrybozy i reszty fosforanowej). W wysokim pH natomiast wiązanie wodorowe pomiędzy nićmi DNA może ulec zniszczeniu. Podwyższona temperatura, czy organiczne rozpuszczalniki doprowadzają do denaturacji podwójnych nici 212 Technika DNA origami – potencjalne zastosowania DNA. Deoksyrybonukleazy katalizują rekcję niszczenia nici DNA. Również jony obecne w roztworze mają silny wpływ na omawiane struktury DNA. Przy niskiej sile jonowej ww. struktury DNA ulegają rozkładowi, natomiast wysokie stężenia soli prowadzą do ich agregacji. Dodatkowo molekularne napięcia i siły mechaniczne mogą mieć negatywny wpływ w szczególności na długie i rozbudowane struktury. W związku z powyższym przechowywanie, jak i prace z wykorzystaniem próbek zawierających struktury DNA muszą być prowadzone bardzo ostrożnie i pod specjalnym nadzorem [50]. Najczęściej wykorzystywana w technice DNA origami sekwencja M13 o długości ok. 7000 par zasad posiada jednak pewne ograniczenia. Duże i bardzo skomplikowane projekty wymagają znacznie dłuższej nici tworzącej rusztowanie. Jedną z głównych przyczyn, dla których sekwencja M13 jest szeroko stosowana jest jej niski koszt, duża dostępność oraz brak struktury drugorzędowej. Istnieje więc potrzeba opracowania taniej procedury stworzenia pojedynczej, długiej nici DNA, z minimalną strukturą drugorzędową lub jej brakiem, w celu zastąpienia sekwencji M13[48, 49]. 10. Nanotechnologia DNA – próby wykorzystywania Struktura krystalicznej klatki zbudowana z DNA może posłużyć do orientowania w przestrzeni innych molekuł uwięzionych w jej wnętrzu. Siatki krystaliczne z DNA mogą zostać użyte w celu pozycjonowania i orientowania w przestrzeni elementów molekularnych z ogromną precyzją [51‚53]. Urządzenia oparte na DNA przyczyniają się do rozwoju robotyki w nanoskali jak również do stworzenia nowych inteligentnych materiałów, które np. odpowiadają na konkretne bodźce poprzez przemiany przestrzenne w ich strukturze. 10.1. Sondy na bazie DNA origami Wykorzystując technikę DNA origami można zbudować prostokątną płytkę rusztowania, zawierającą zestaw lepkich sond komplementarnych do cząsteczek RNA. Mogą one posłużyć do ich wykrywania. Lepkie sondy mają postać wiszących łańcuchów i nie są widoczne podczas obrazowania w mikroskopii sił atomowych, jednak gdy RNA wiąże się z sondą, ich struktura ulega usztywnieniu i zostają uwidocznione w AFM (ang. atomic force microscope). Prostokątna płytka DNA z sondami posiada kilka osi symetrii. W związku z tym pewien region każdej płytki, (konkretnie, w lewym górnym rogu), zawiera kilka spinek, które wskazują orientacje płytki, i pozwalają określić dokładną lokalizację na płytce. Różne płytki posiadają unikalne sondy komplementarne do specyficznych sekwencji RNA, zatem RNA może wiązać się tylko do jednej płytki. Płytki są oznaczone kodami kreskowymi dla zmultipleksowanego wykrywania sekwencji RNA. 213 Arkadiusz Goede, Maciej Gawroński, Tomasz Wandtke 10.2. Mapowanie struktury białek Shih po raz pierwszy wykorzystał nanotechnologię DNA do mapowania struktury białka podczas spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego NMR (ang. nuclear magnetic resonance). Technika ta polega na identyfikacji magnetycznej sygnatury atomów białek w stosunku do swoich sąsiadów. Poprzez poznanie sąsiadów każdego atomu, możliwe jest złożenie struktury ogólnej białka. Technika działa tylko dla niewielkich rozmiarów białek, dla których uporządkowanie interakcji między sąsiadami nie nastręcza zbyt wielu trudności. Modyfikacje standardowych NMR dostarczyły naukowcom dodatkowych informacji pomocnych w rozwiązywaniu struktury białek. Zastosowanie ciekłych kryształów w roztworze NMR częściowo rozwiązało problem szybkiej zmiany konformacji badanych białek. Niestety ciekłe kryształy są wrażliwe na działanie detergentów, niezbędnych w roztworze NMR podczas badania białek błon komórkowych. W 2007r. Shih zastąpił ciekłe kryształy nanorurkami DNA origami, które wykazują sporą odporność na działanie detergentów. Dzięki zastosowaniu techniki DNA origami możliwe stało się rozwiązanie struktury przezbłonowej domeny białka receptora komórek T, jak również struktury białka błonowego UCP2, które pomaga regulować wydzielanie insuliny w komórkach trzustki [54]. 10.3. Badanie reakcji między cząsteczkami w czasie rzeczywistym Sugiyama jako pierwszy zaproponował wykorzystanie nanotechnologii DNA w celu obserwacji białkowych katalizatorów w czasie rzeczywistym. Przy użyciu DNA origami skonstruowano miniaturową „ramkę”, która została rozpięta pomiędzy dwoma prawie identycznymi nićmi dwuniciowego DNA. Jej zastosowanie pozwoliło na stworzenie sztucznego kompartymentu, do którego została ograniczona analizowana reakcja enzymatyczna. Dietz i wsp. użyli DNA origami w celu stworzenia lepszego narzędzia do obserwacji DNA i białek w procesie ich rozrywania, czy oddzielania od siebie. W standardowej procedurze używa się laserów molekularnych do uwięzienia plastikowych koralików w danym miejscu w roztworze. Następnie do koralików dołącza się linkery umożliwiające przyłączenie białek lub innych molekuł, które są akurat badane. Poprzez regulowanie promienia lasera możliwe jest oddalanie i zbliżanie koralików względem siebie, w celu zaobserwowania jak zmiany naprężeń wpływają na właściwości badanego białka takie jak zdolność do fałdowania się. Niestety technika oparta na wykorzystaniu koralików ma pewne ograniczenia. W wielu przypadkach na łączniki musi być wywarta duża siła, aby rozdzielić od siebie białka. Podczas gdy białko jest rozciągane, 214 Technika DNA origami – potencjalne zastosowania łączniki odpływają od siebie, więc eksperyment nie może być odwrócony ani powtórzony [55]. Zespół badawczy Dietz’a postanowił więc zastąpić zwykłe łączniki sztywnymi prętami wykonanymi w technice origami DNA, zawierającymi aż 18 spiralnych rurek. Początkowe próby wykazały, że sztywne wiązki DNA są lepsze w przenoszeniu siły przemieszczającej na rozdzielane molekuły, a co za tym idzie wymagana siła, którą należy wywrzeć w celu rozdziału molekuł jest o połowę mniejsza. Sztywne łączniki powinny również pozostawać w miejscu podczas przeprowadzania eksperymentu, co stwarza możliwość jego odwrócenia [56]. 10.4. Sensory pH W ostatnim czasie opracowano nanomechaniczne urządzenia origami DNA takie jak: DNA Origami szczypce czy DNA Origami kleszcze. Powstały one z połączenia dwóch elementów podobnych do wydłużonych walców o długości 170 nm, licząc od punktu ich podparcia. DNA Origami Szczypce mogą zatem występować w trzech konformacjach: postać otwartego krzyża, w której obie połączone jedynie w punkcie podparcia ze sobą dźwignie tworzą kształt litery X; postać równoległa i antyrównoległa zamknięta forma, w której dwa ramiona są ustawione horyzontalnie za pomocą dwóch lub więcej mostków między ramionami. Dziewięć par sekwencji 12-nukleotydowych obecnych w strukturze szczypiec może dimeryzować w czteroniciową, drugorzędową strukturę DNA podczas protonowania cytozyny. W takim wypadku następuje zmiana konformacji i przejście z otwartej formy krzyża w zamkniętą formę równoległą. Taka zmiana formy zależy od pH i jest bardzo łatwa do zaobserwowania stosując mikroskopię sił atomowych (AFM). Pokazuje to potencjalne zastosowanie powyższego systemu jako pojedynczych molekularnych czujników pH [57‚59]. 10.5. Nanopory Nanopory od niedawna wykorzystuje się w celu wykrywania, oznaczania i określania fizycznych właściwości pojedynczych molekuł. Nanopory stały się przedmiotem dużego zainteresowania w takich dziedzinach jak sekwencjonowanie DNA [60]. Podstawowa koncepcja wykrywania pojedynczej cząsteczki polega na zastosowaniu napięcia przebiegającego przez dwa roztwory elektrolitów rozdzielonych strukturą z nanoporami, oraz zmierzeniu powstałego prądu jonowego. Seminal w 1990r. po raz pierwszy pokazał, że pojedyncze cząsteczki, takie jak kwasy nukleinowe mogą być wykryte w ten sposób. W ciągu ostatnich dwóch dekad nanopory zostały zastosowane do wykrywania wielu cząsteczek biologicznych takich jak DNA, RNA i białka [61]. Badania nad nanoporami można podzielić na te dotyczące stałych nanoporów 215 Arkadiusz Goede, Maciej Gawroński, Tomasz Wandtke i nanoporów biologicznych. Stałe nanopory są całkowicie syntetyczne i mogą być wytworzone za pomocą technik takich jak wiercenie jonowo cienkich otworów w błonach izolacyjnych lub przeciąganie przez błonę szklanych kapilar za pomocą lasera [62]. Nanopory biologiczne powstają poprzez modyfikowanie dwuwarstwy lipidowej. Kluczowym aspektem działania nanoporów zarówno stałych, jak i biologicznych, jest możliwość uzyskania konkretnej struktury i właściwości pod względem geometrii i powierzchni funkcjonalnej. Geometria determinuje sygnał pomiarów i umożliwia selekcjonowanie na podstawie wielkości fizycznej. Funkcjonalność powierzchni pozwala na osiągnięcie specyficzności chemicznej w eksperymentach. Nanopory biologiczne są ograniczone do badania małych molekuł, co najwyżej cząsteczek jednoniciowego DNA. Natomiast średnica stałych nanoporów może zostać dostosowana do badania większych molekuł w tym dsDNA i białek [63]. Nanopory biologiczne znacząco wyprzedzają swoich stałych odpowiedników pod względem funkcjonalności powierzchni. Inżynieria genetyczna nanoporów biologicznych pozwala na precyzyjne pozycjonowanie grup chemicznych, które wiążą się do analitów. W stałych nanoporach precyzyjne pozycjonowanie pojedynczego miejsca wiążącego pozostaje niezwykle trudne, dlatego DNA origami zdaje się być bardzo atrakcyjną techniką formowania nanoporów. Szczególnie cenna jest możliwość budowy trójwymiarowych konstrukcji, umożliwiających precyzyjną kontrolę geometrii jak i funkcjonalności. Grupy funkcyjne, z zastosowaniem technik DNA origami, mogą być umieszczone w konstrukcji z dokładnością do kilku nanometrów [49]. 10.6. Organizowanie nanocząsteczek Nanocząstki plazmoniczne wykazują różne właściwości pochłaniania, rozpraszania i sprzęgania, które są zależne od kształtów, rozmiarów i odległości między cząstkami. Właściwości te są szeroko stosowane do pomiarów, diagnozowania w leczeniu, obrazowaniu komórek i budowie nanoelektroniki. Właściwość fototermiczna plazmonicznych nanocząsteczek może być również stosowana w leczeniu raka. Właściwości optyczne nanocząsteczek plazmoniczncyh silnie zależą od morfologii, składu chemicznego oraz środowiska. Dlatego też dąży się do osiągnięcia indywidualnych właściwości optycznych cząsteczek, gdzie każdy element jest precyzyjnie rozmieszczony. DNA wydaje się być obiecującym materiałem do organizowania funkcjonalnych nanoobiektów takich jak nanocząsteczki metali. Organizowanie nanoczasteczek na tablicach DNA origami polega na zastępowaniu standardowych zszywek DNA, w strukturze DNA origami, modyfikowanymi nićmi DNA zawierającymi 216 Technika DNA origami – potencjalne zastosowania nanoczasteczki. W taki sposób można precyzyjnie organizować nanoczasteczki takie jak AuNSs, AuNRs i AgNPs [64]. 10.7. Nanoroboty Nanoroboty DNA należy postrzegać jako swoistego rodzaju trójwymiarowe kontenery zbudowane z DNA. Ich powierzchnie są w pełni adresowalne, pozwalając na przyłączenie różnych ligandów, znaczników dla bioobrazownia, przeciwciał, hormonów. Najważniejsze jest jednak to, że nanoroboty mogą być używane do skutecznego dostarczania i uwalniania leków w konkretnym miejscu. Zwiększona specyficzność w dostarczaniu leków pozwala na rozwiązanie problemu ich toksyczności, gdyż lek w założeniu ma trafiać wyłącznie w miejsce docelowe. Douglas ze swoim zespołem badawczym zaproponował stworzenie nanorobotów DNA mających możliwość wyszukiwania i niszczenia komórek nowotworowych. Robot Douglas’a wyglądem przypomina wydrążony cylinder o długości 60 nanometrów i szerokości 25 nanomentrów. Zbudowany jest z origami DNA i zamknięty poprzez aptamer zaprojektowany tak, aby wiązał się do cząsteczek charakterystycznych dla komórek nowotworowych. Połączenie się aptameru z cząsteczką na komórce nowotworowej powoduje uwolnienie wyznakowanych fluorescencyjnie białek układu odpornościowego, które po związaniu się z komórkami nowotworowymi indukują apoptozę. W testach in vitro wykazano 40% skuteczność w zabijaniu komórek zmienionych nowotworowo, co wydaje się być dobrym wynikiem [65‚68]. 11. Podsumowanie Technika DNA origami pozwala na stworzenie wysoce zaawansowanych struktur, które znajdują zastosowanie w wielu gałęziach nauk biomedycznych. Przełomowym etapem w rozwoju omawianej techniki było stworzenie sztywnych struktur DX, które dały podwaliny do stworzenia trójwymiarowych obiektów, wykorzystywanych do tworzenia nanonarzędzi, takich jak nanoszczypce, będące w istocie czujnikiem pH. Ciekawą i atrakcyjną aplikacją przestrzennych obiektów DNA jest pozycjonowanie poszczególnych molekuł w przestrzeni z niezwykłą dokładnością, co jest szczególnie istotne w badaniach nad funkcjonowaniem cząsteczek takich jak kwasy nukleinowe i białka. W podobnym celu wykorzystano tablice DNA, a także utworzone w technice DNA origami porowate nanostruktury, które charakteryzują się znacznie większą specyficznością niż materiały standardowo stosowane w takich analizach. Przy wykorzystaniu dwuwymiarowych płytek DNA, wyposażonych w sondy molekularne stworzono również wysoce specyficzne narzędzia do wykrywania i rozpoznawania pojedynczych cząsteczek kwasów nukleinowych i innych cząsteczek, których zasada działania w dużej mierze 217 Arkadiusz Goede, Maciej Gawroński, Tomasz Wandtke przypomina standardowo wykorzystywane mikromacierze DNA. Najciekawszym, a zarazem najbardziej skomplikowanym przykładem wykorzystania DNA origami, są nanoroboty DNA, które pozwalają na dostarczenie różnego rodzaju biomolekuł, takich jak leki antynowotworowe, do zdefiniowanych celów w postaci antygenów występujących na powierzchni komórek nowotworowych. Budzą one ogromne zainteresowanie świata naukowego, który upatruje w nich alternatywy dla obecnie stosowanych strategii terapeutycznych, która pozwoliłaby na selektywne niszczenie komórek nowotworowych, przy jednoczesnym uniknięciu poważnych, ogólnoustrojowych skutków ubocznych, jakie towarzyszą chemioterapii i radioterapii. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Seeman N. C., In the nick of space: Generalized nucleic acid complementarity and the development of DNA nanotechnology, Synlett., (2000), s. 1536-1548 Seeman N. C., An overview of structural DNA nanotechnology, Molecular Biotechnology., 37 (2007), s. 246-257 Seeman N. C., Nucleic acid junctions and lattices, Journal of Theoretical Biology., 99 (1982), s.237-247 Seeman N. C., DNA nanotechnology: novel DNA constructions, Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure., 27 (1998), s. 225-248 Fu T. J., Seeman N. C., DNA double crossover structures, Biochemistry., 32 (1993), s. 3211-3220 Chen J. H., Kallenbach N. R., Seeman N. C., A specific quadrilateral synthesized from DNA branched junctions, Journal of the American Chemical Society., 111 (1989), s. 6402-6407 Zhang Y., Seeman N. C., The construction of a DNA truncated octahedron, Journal of the American Chemical Society., 116 (1994), s.1661-1669 Li X. J., Yang X. P., Qi J., Seeman N. C., Antiparallel DNA double crossover molecules as components for nanoconstruction, Journal of the American Chemical Society., 118 (1996), s. 6131-6140 LaBean T. H., Yan H., Kopatsch J., Liu F. R., Winfree E., Reif J. H., Seeman N. C., The construction of DNA triple crossover molecules, Journal of the American Chemical Society., 122 (2000), s.1848-1860 Winfree E., Liu F., Wenzler L.A ., Seeman N. C., Design and selfassembly of twodimensional DNA crystals, Nature., 394 (1998), s. 539-544 Liu Y., Lin C., Li H., Yan H., Aptamer directed self-assembly of proteins on a DNA nanostructure, Angewandte Chemie International Edition., 44 (2005), s. 4333-4338 Lin C., Liu Y., Rinker S., Yan H., DNA tile based self-assembly: building complex nanoarchitectures, ChemPhysChem., 7 (2006), s. 1641-1647 Cohen S. N., Chang A. C. Y., Boyer H. W., Helling R. B., Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America., 70 (1973), s. 3240-3244 218 Technika DNA origami – potencjalne zastosowania 14. Zhang X., Yan H., Shen Z., Seeman N. C., Paranemic cohesion of topologicallyclosed DNA molecules, Journal of the American Chemical Society., 124 (2002), s. 12940-12941 15. Shih W. M., Quispe J. D., Joyce G. F., A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron, Nature., 427 (2004), s. 618-621 16. Shen Z., Yan H., Wang T., Seeman N. C., Paranemic crossover DNA: A generalized Holliday structure with applications in nanotechnology, Journal of the American Chemical Society., 126 (2004), s. 1666-1674 17. Yan H., Seeman N. C., Edge-sharing motifs in DNA nanotechnology, Journal of Supramolecular Chemistry., 1. (2003), s. 229-237 18. Kuzuya A., Wang R., Sha R., Seeman N.C., Sixhelix and eight-helix DNA nanotubes assembled from half-tubes, NanoLetters., 6 (2007), s. 1757-1763 19. Holliday R., A mechanism for gene conversion in fungi, Genetical Research., 5 (1964), s. 282-304 20. Fu T. J., Seeman N.C., DNA double crossover structures, Biochemistry., 32 (1993), s. 3211-3220 21. Schwacha A., Kleckner N., Identification of double Holliday junctions as intermediates in meiotic recombination, Cell., 83 (1995), s. 783-791 22. LaBean T., Yan H., Kopatsch J., Liu F., Winfree E., Reif J. H., Seeman N. C., The construction, analysis, ligation and self-assembly of DNA triple crossover complexes, Journal of the American Chemical Society., 122 (2000), s.1848-1860 23. Seeman N. C., DNA nicks and nodes and nanotechnology, NanoLetters., 1 (2001), s. 22-26 24. Mathieu F., Liao S., Mao C., Kopatsch J., Wang T., Seeman N. C., Six-helix bundles designed from DNA, NanoLetters., 5 (2005), s. 661-665 25. Zhang Y., Seeman N. C., A solid-support methodology for the construction of geometrical objects from DNA, Journal of the American Chemical Society., 114 (1992), s. 2656-2663 26. Chen J., Seeman N. C., The synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube, Nature., 350 (1991), s. 631-633 27. Qi J., Li X., Yang X., Seeman N. C., The ligation of triangles built from bulged three-arm DNA branched junctions, Journal of the American Chemical Society., 118 (1996), s. 6121-6130 28. Seeman N. C., Kallenbach N. R., Design of immobile nucleic acid junctions, Biophysical Journal., 44 (1983), s. 201-209 29. Ma R. I., Kallenbach N. R., Sheardy R. D., Petrillo M. L., Seeman N. C., Three arm nucleic acid junctions are flexible, Nucleic Acids Research., 14 (1986), s. 9745-9753 30. Kallenbach N. R., Ma R. I., Seeman N. C., An immobile nucleic acid junction constructed from oligonucleotides, Nature., 305 (1983), s. 829-831 31. Wang Y., Mueller J. E., Kemper B., Seeman N. C., The assembly and characterization of 5-Arm and 6-Arm DNA junctions, Biochemistry., 30 (1991), s. 5667-5674 32. Wang X., Seeman N. C., The assembly and characterization of 8-arm and 12-arm DNA branched junctions, Journal of the American Chemical Society., 26 (2007), s. 8169-8176 219 Arkadiusz Goede, Maciej Gawroński, Tomasz Wandtke 33. Petrillo M. L., Newton C. J., Cunningham R. P., Ma R. I., Kallenbach N. R., Seeman N. C., Ligation and flexibility of four-arm DNA junctions, Biopolymers., 27 (1988), s. 1337-1352 34. Eis P. S., Millar D. P., Conformational distributions of a four-way DNA junction revealed by time-resolved fluorescence resonance energy transfer, Biochemistry., 32 (1993), s. 13852-13860 35. Sa-Ardyen P., Vologodskii A. V., Seeman N. C., The flexibility of DNA double crossover molecules, Biophysical Journal., 84 (2003), s. 3829-3837 36. Yan H., Zhang X., Shen Z., Seeman N. C., A robust DNA mechanical device controlled by hybridization topology, Nature., 415 (2002), s. 62-65 37. Liu F., Sha R., Seeman, N. C., Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals, Journal of the American Chemical Society., 121 (1999), s. 917-922 38. Mao C., Sun W., Seeman, N. C., Designed twodimensional DNA Holliday junction arrays visualized by atomic force microscopy, Journal of the American Chemical Society., 121 (1999), s. 5437-5443 39. Sha R., Liu F., Millar D. P., Seeman N. C., Atomic force microscopy of parallel DNA branched junction arrays, Chemical Biology., 7 (2000), s. 743-751 40. Sha R., Liu F., Seeman N. C., Atomic force measurement of the interdomain angle in symmetric Holliday junctions, Biochemistry., 41 (2002), s. 5950-5955 41. Constantinou P. E., Wang T., Kopatsch, J., Israel L.B., Zhang X., Ding B., Sherman W. B., Wang X., Zheng J., Sha R., Seeman N. C., Double cohesion in structural DNA nanotechnology, Organic & Biomolecular Chemistry., 4 (2006), s. 3414-3419 42. Chen J., Seeman N. C., The electrophoretic properties of a DNA cube and its substructure catenanes, Electrophoresis., 12 (1991), s. 607-611 43. Goodman R. P., Schaap I. A. T., Tardin C. F., Erben C. M., Berry R. M., Schmidt C. F., Turberfield A. J., Rapid chiral assembly of rigid DNA building blocks from molecular fabrication, Science., 310 (2005), s.1661-1664 44. Seeman N. C., The design of single-stranded nucleic acid knots, Molecular Engineering., 2 (1992), s. 297-307 45. Du S. M., Stollar B. D., Seeman N. C., A synthetic DNA molecule in three knotted topologies, Journal of the American Chemical Society., 117 (1995), s. 1194-200 46. Mao C., Sun W., Seeman N. C., Assembly of Borromean rings from DNA, Nature., 386 (1997), s. 137-138 47. Chichak K. S., Cantrill S. J., Pease A. R., Chiu S. H., Cave G. W .V., Atwood J. L., Stoddart J. F., Molecular Borromean rings, Science., 304 (2004), s. 1308-1312 48. Rothemund P., Design of DNA origami, (2005), s. 471-478 49. Rothemund P., Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns, Nature., 440 (2006), s. 297-302 50. Zadegan R. M., Norton M. L., Structural DNA nanotechnology: from deign to applications, International Journal of Molecular Sciences., 6 (2012), s. 7149-7162 51. Yan H., Park S. H., Ginkelstein G., Reif J. H., LaBean T. H., DNAtemplated selfassembly of protein arrays and highly conductive nanowires, Science., 301 (2003), s. 1882-1884 220 Technika DNA origami – potencjalne zastosowania 52. Deng Z. X., Tian Y., Lee S. H., Ribbe A. E., Mao C. D., DNA-encoded selfassembly of gold nanoparticles into one-dimensional arrays, Angewandte Chemie International Edition., 44 (2005), s. 3582-3585 53. Sharma J., Ke Y., Lin C., Chhabra R., Wang Q., Nangreave J., Liu Y., Yan H., DNA tile directed self-assembly of quantum dots into two-dimensional nanopatterns, Angewandte Chemie International Edition., 47 (2008), s. 5157-5159 54. Douglas S. M., Chou J. J, Shih W. M., DNA-nanotube-induced alignment of membrane proteins for NMR structure determination, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America., 16 (2007), s. 6644-6648 55. Endo M., Katsuda Y., Hidaka K., Sugiyama H., Regulation of DNA methylation using different tension of double strands constructed In a defined DNA nanostructure, Journal of American Society., 5 (2010), s. 1592-1597 56. Kim D. M., Kilchherr F., Dietz H., Bathe M., Quantitative prediction of 3D solution shape and flexibility of nucleic acid nanostructures, Nucleic Acids Research., 7 (2012), s. 2862-2868 57. Kuzuya A., Sakai Y., Yamazaki T., Xu Y., Komiyama M., Nanomechanical DNA Origami ―Single-Molecule Beacons‖ Directly Imaged by Atomic Force Microscopy, Nature Communicates., 2 (2011), doi:10.1038/ncomms1452 58. Yamazaki T., Aiba Y., Yasuda K., Sakai Y., Yamanaka Y., Kuzuya A., Ohya Y., Komiyama M., Clear-Cut Observation of PNA Invasion Using Nanomechanical DNA Origami Devices, Chemical Communications., 48 (2012), s. 11361-11363 59. Kuzuya A., Watanabe R., Hashizume M., Kaino M., Minamida S., Kameda K., Ohya Y., Precise Structure Control of Three-State Nanomechanical DNA Origami Devices, Methods., 67 (2014), s. 250-255 60. Pennisi E., Search for pore-fection, Science., 336 (2012), s. 536-537 61. Wanunu M., Nanopores: a journey towards DNA sequencing, Physics of Life Reviews., 9 (2012), s. 125-158 62. Bell N. A. W., Thacker V. V., Hernández-Ainsa S., Fuentes-Perez M. E., MorenoHerrero F., Liedl T., Keyser U. F., Multiplexed ionic current sensing with glass nanopores, Lab on a Chip., 13 (2013), s. 1859-1862 63. Dekker C., Solid-state nanopores, Nature Nanotechnology., 2 (2007), s. 209-215 64. Liu Q., Song C., Wang Z. G., Li N., Ding B., Precise organization of metal nanoparticles on DNA origami template, Methods., 67 (2014), s. 205-214 65. Douglas S. M., Dietz H., Liedl T., Hogberg B., Graf F., Shih W. M., Selfassembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes, Nature., 459 (2010), s. 414-418 66. Andersen E. S., Dong M., Nielsen M. M., Jahn K., Subramani R., Mamdouh W., Golas M. M., Sander B., Stark H., Oliveira C. L., Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid, Nature., 459 (2009), s. 73-76 67. Moghimi S. M., Hunter A. C., Murray J. C., Nanomedicine: current status and future prospects, FASEB Journal., 19 (2005), s. 311-330 68. Douglas S. M., Bachelet I., Church G. M., A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads, Science., 335 (2012), s.831-834 221 Arkadiusz Goede, Maciej Gawroński, Tomasz Wandtke Technika DNA origami – potencjalne zastosowania Technika DNA origami bazuje na zdolności cząsteczek DNA do formowania wieloniciowych struktur przestrzennych, wynikającej z komplementarności zasad. Pozwala ona na uzyskanie sztywnych obiektów 2D i 3D, które mogą zostać użyte do stworzenia wielu nanonarzędzi. Szczególnie ważny jest motyw DX, który zapewnia sztywność i stabilność konstruktów DNA. Dzięki odpowiedniemu zaprogramowaniu reakcji syntezy składowych elementów omawianych struktur można stworzyć nano-szczypce działające jak wysoce czuły sensor pH. Siatki i tabliczki wykonane w technice DNA origami pozwalają na niezwykle dokładne umiejscowienie cząsteczek w przestrzeni, a także analizę ich funkcji. Ma to szczególne znaczenie w badaniach nad właściwościami białek. Płytki stworzone za pomocą DNA origami posłużyły do stworzenia niezwykle czułych mikromacierzy DNA, zdolnych do detekcji pojedynczych cząsteczek kwasów nukleinowych. Najbardziej zaawansowaną formą tej techniki jest konstruowanie trójwymiarowych nanorobotów DNA, które potrafią rozpoznać komórki docelowe, na przykład komórki nowotworowe i dostarczać do nich cząsteczki leków przeciwnowotworowych. Budzą one ogromne nadzieje na wykorzystanie ich w przyszłości jako alternatywy dla obecnie stosowanych strategii terapeutycznych. DNA origami technique – potential aplications DNA Origami technology is based on the ability of DNA molecules to form the multi-strand spatial structures. Such ability arises from the rule of base complementarily. It allows to obtain stiff 2D and 3D objects that can be used to create many nanodevices. Especially important is DX motive which provides stiffness and stability of the DNA constructs. By appropriate programming of synthesis reaction constituent elements of aforementioned structures can be created to build nano-pliers that act as highly sensitive pH sensor. Lattices and arrays made in the DNA origami technology allow for extremely accurate positioning of molecules in space, as well as an enable analysis of their functions. It is particularly important in research on the properties of proteins. Arrays that were developed by using the DNA origami technique were used to create highly sensitive DNA microarrays capable of detecting single molecules of nucleic acids. The most advanced form of this technique is the construction of three-dimensional DNA nanorobots that can recognize the target cells such as cancer cells and deliver molecules of anticancer drugs into them. It is hoped that their usage in the future will be an alternative to currently used therapeutic strategies. 222 Małgorzata Sieradzka1, Joanna Kołodziejczyk-Czepas2, Paweł Nowak3 Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych New trends in biomedical research on hydroxycinnamic acids 1. Wprowadzenie Kwasy hydroksycynamonowe stanowią najliczniejszą grupę kwasów fenolowych i fenylopropanoidów pochodzenia naturalnego. Są to wtórne metabolity roślinne, powstające z fenyloalaniny lub tyrozyny, na szlaku przemian kwasu szikimowego [1]. W roślinach występują głównie w formie złożonej – glikozydów lub depsydów, w mniejszym natomiast stopniu w postaci wolnej. Fenolokwasy w formie estrów z glukozą lub kwasu chinowego obecne są przeważnie w owocach, a w ziarniakach zbóż większość fenolokwasów związana jest z arabinoksylanami. Wolne kwasy hydroksycynamonowe występują w tkankach roślinnych na ogół w niewielkich ilościach [2]. W organizmach roślin fenolokwasy pełnią funkcję ochronną [3], a ze względu na aktywność biologiczną wykazywaną w organizmach zwierząt i człowieka związki te stanowią także przedmiot wielu badań naukowych. Do niedawna, większość prac badawczych dotyczących roślinnych kwasów fenolowych dotyczyła aktywności przeciwutleniającej – wykazano m.in., że związki te posiadają zdolność zmiatania wolnych rodników, chelatowania jonów metali, a także modulowania aktywności enzymów i białek nieenzymatycznych [4]. W ostatnich latach obserwuje się jednak znaczącerozszerzenie zakresu prac badawczych dotyczących kwasów fenolowych [5], obejmujących ocenę ich właściwości przeciwzapalnych i przeciwnowotworowych, a także syntezę nowych pochodnych fenolokwasów oraz opracowywanie formulacji preparatów 1 [email protected], Katedra Biochemii Ogólnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl/biochogl 2 [email protected], Katedra Biochemii Ogólnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl/biochogl 3 [email protected], Katedra Biochemii Ogólnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl/biochogl 223 Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak zawierających kwasy fenolowe, umożliwiających uzyskanie pożądanej aktywności farmakologicznej tych związków. 2. Cel pracy Przedmiotem prezentowanej pracy jest omówienie aktualnego stanu wiedzy i najnowszych kierunków w badaniach biomedycznych, dotyczących perspektyw wykorzystania biologicznej aktywności wybranych fenolokwasów roślinnych z grupy kwasów hydroksycynamonowych (kwas kawowy, kumarowy, chlorogenowy, ferulowy, rozmarynowy i synapinowy). Praca obejmuje przegląd najnowszego piśmiennictwa (głównie z ostatnich 5 lat), ze szczególnym uwzględnieniem najnowszych doniesień na temat właściwości przeciwutleniających, przeciwzapalnych oraz przeciwnowotworowych wymienionych kwasów fenolowych. 3. Charakterystyka kwasów hydroksycynamonowych Kwasy hydroksycynamonowe stanowią grupę związków fenylopropanoidowych o ogólnym wzorze szkieletu węglowego C6-C3, syntetyzowanych w procesie deaminacji fenyloalaniny lub tyrozyny [6, 2]. Głównymi przedstawicielami fenolokwasów hydroksycynamonowych są kwasy: kawowy, kumarowy, ferulowy, synapinowy [4] oraz pochodne kwasu kawowego: estry utworzone z kwasem chinowym (kwas chlorogenowy), α-hydroksydihydrokawowym (kwas rozmarynowy) oraz ester fenetylowy kwasu kawowego (CAPE, ang. caffeic acid phenethyl ester) (Ryc.1). Obecność kwasów hydroksycynamonowych stwierdzono m.in. w zbożach, warzywach, owocach, nasionach i orzechach, a także licznych produktach spożywczych, np. napojach (Tabela 1). 224 Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych Ryc. 1. Wzory strukturalne wybranych kwasów hydroksycynamonowych. Tabela 1. Występowanie kwasów fenolowych w wybranych roślinach i produktach spożywczych (kompilacja danych wg [4, 7]; zmodyfikowano) Kwas kawowy kumarowy ferulowy synapinowy chlorogenowy rozmarynowy Występowanie piwo, wino, jęczmień, owies, ryż, żyto, pszenica, jagody, fasola, groszek, orzech laskowy, orzech włoski, len, musztarda, krokosz, słonecznik, seler, ziemniaki, pomidory piwo, wino, herbata, jęczmień, kukurydza, owies, ryż, żyto, pszenica, jagody, winogrona, fasola, groszek, orzech laskowy, orzechy pekan, orzech ziemny, orzech włoski, len, musztarda, krokosz, słonecznik, seler, pomidory piwo, wino, jęczmień, kukurydza, owies, ryż, żyto, pszenica, jagody, fasola, groszek, orzech laskowy, orzech ziemny, orzech włoski, len, musztarda, rzepak, krokosz, słonecznik, seler, pomidory piwo, owies, żyto, pszenica, fasola, orzech laskowy, orzech ziemny, orzech włoski, musztarda, rzepak kawa, wino, herbata, jęczmień, jabłka, gruszki, fasola, migdały, słonecznik, seler, sałata, ziemniaki, pomidory melisa lekarska, rozmaryn lekarski, mięta pieprzowa 3.1. Aktywność przeciwutleniająca Główne molekularne mechanizmy przeciwutleniającego działania kwasów fenolowych obejmują przejęcie przez rodnik elektronu odłączonego od fenolokwasu lub przekazanie przez fenolokwas atomu wodoru z utwo- 225 Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak rzeniem stabilnych rodników fenoksylowych. Poza zmiataniem rodnikowych i nierodnikowych reaktywnych form tlenu (RFT), związki te mogą wykazywać działanie przeciwutleniające także poprzez chelatowanie jonów metali przejściowych, hamowanie aktywności enzymów pro-oksydacyjnych, a także modulację ekspresji genów, w tym wpływ na działanie szlaku ARE/Nrf-2 (element odpowiedzi antyoksydacyjnej, ang. antioxidant response element/czynnik transkrypcyjny Nrf-2, ang. nuclear erythroid 2related factor), aktywujący mechanizmy cytoprotekcyjne [6]. Właściwości przeciwutleniające kwasów fenolowych badane są obecnie pod kątem zastosowania tych związków jako bioaktywnych składników żywności funkcjonalnej oraz suplementów diety i innych nutraceutyków. Wiedza na temat aktywności antyoksydacyjnej kwasów hydroksycynamonowych, obserwowanej zarówno w układach in vitro, jak i in vivo została kilka lat temu podsumowana m.in. w obszernej publikacji poglądowej [4]. Również w ciągu ostatnich lat pojawiły się kolejne doniesienia, potwierdzające aktywność przeciwutleniającą fenolokwasów oraz opisujące mechanizmy tego działania w różnych układach badawczych (dane zebrano w tabeli 2), a także porównawcze analizy działania różnych fenolokwasów lub ich pochodnych. Na przykład, wyższą aktywność przeciwutleniającą kwasu kawowego w porównaniu do efektywności działania kwasu chlorogenowego (w zakresie stężeń 0,01-10 mM) wykazano w badaniach na zwierzęcym modelu niedokrwienia/ reperfuzji [45]. Najnowsze kierunki w badaniach dotyczących właściwości antyoksydacyjnych kwasów hydroksycynamonowych dotyczą syntezy nowych pochodnych tych związków, obejmujących połączenia ze związkami naturalnymi (np. biopolimerami), substancjami syntetycznymi, a także składnikami nieorganicznymi. Stwierdzono m.in., że kwas rozmarynowy w kompleksach z różnymi pochodnymi dekstryn wykazuje silniejszą zdolność redukującą (ocenianą testem redukcji jonów miedzi – CUPRAC, ang. cupric reducing antioxidant capacity) niż zastosowany samodzielnie [46]. Pochodne 4-winylowe kwasów hydroksycynamonowych (p-kumarowego, synapinowego, ferulowego oraz kawowego) wykazują wyższą aktywność antyoksydacyjną (oznaczenia zmiatania DPPH oraz O2), niż same kwasy hydroksycynamonowe [47]. Badane są też możliwości zastosowania fenolokwasów w formie pochodnych chitozanu. Wykorzystanie chitozanu w tego typu badaniach wynika z faktu, że jest on jest biopolimerem oszerokim spektrum potencjalnego zastosowania w naukach biomedycznych, ze względu na zdolność tworzenia związków chelatowych, możliwość tworzenia żeli, nietoksyczność oraz biozgodność z organizmem ludzkim [48]. Utworzenie koniugatu kwasu ferulowego i chitozanu nadaje powstałej pochodnej silniejsze od substratów właściwości przeciwrodnikowe, co wykazano na przykład przy zastosowaniu rodników 226 Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych DPPH[49] i ABTS+[50]. Natomiast badania porównawcze działania antyoksydacyjnego chitozanu oraz jego koniugatów z kwasem ferulowym lub kawowym prowadzone w innych układach doświadczalnych in vitro wykazały, że największą zdolność przeciwutleniającą (zmiatanie rodników nadtlenkowych, rodnika hydroksylowego i nadtlenku wodoru oraz hamowanie peroksydacji lipidów) posiada chitozanowa pochodna kwasu kawowego, mniej efektywnym przeciwutleniaczem był koniugat kwasu ferulowego, a najsłabiej działał chitozan [51]. Aktywność przeciwutleniającą hydroksycynamonowych pochodnych chitozanu oceniano także w warunkach in vivo. Przez 42 dni myszom (przyjmującym 100 mg/kg/dzień D-galaktozy) podawano 200 mg/kg/dzień chitozanu, chitozanu skoniugowanego z kwasem kawowym lub pochodnej chitozanu z kwasem ferulowym. Zaobserwowano zwiększenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych: dysmutazy ponadtlenkowej (SOD, ang. superoxide dismutase), katalazy (CAT, ang. catalase) oraz peroksydazy glutationowej (GPx, ang. glutathione peroxidase) oraz zmniejszenie poziomu dialdehydu malonowego (MDA, ang. malonyldialdehyde) zarówno w surowicy krwi, jak i próbkach wątroby myszy, które otrzymywały chitozan skoniugowany z kwasem kawowym lub kwasem ferulowym. Dane dotyczące efektywności działania przeciwutleniającego różnych pochodnych fenolokwasowych są jednak niejednorodne. Chociaż głównymzałożeniem tworzenia pochodnych kwasów fenolowych lub opracowywania różnych formuł ich stosowania/podawania jest uzyskanie wzrostu aktywności przeciwutleniającej, w ostatnich latach pojawiły się także prace, sugerujące, że niektóre pochodne mogą być znacznie mniej efektywne niż związki wyjściowe. Wykazano m.in., że alkilowe estry kwasu kawowego (metylowy, etylowy, propylowy i butylowy słabiej zmiatają rodniki DPPH, ale wykazują większą zdolność redukcyjną (mierzoną w teście FRAP, ang. ferric reducing ability) niż kwas kawowy. Natomiast estry ferulowe (metylowy, etylowy, propylowy i butylowy) słabiej zmiatają rodniki DPPH, mają też mniejszą zdolność redukcyjną (FRAP) niż kwas ferulowy [52]. Wyższą aktywność redukującą i przeciwrodnikową w porównaniu do związku wyjściowego posiada natomiast acyloglukuronid kwasu ferulowego, ale inne pochodne fenolokwasowe, takie jak 4’-O-siarczany i 4’-O-glukuroniany kwasu kawowego i ferulowego mają słabsze właściwości przeciwutleniające niż same fenolokwasy [53]. Ponadto, wprawdzie w oznaczeniach zmiatania rodnika DPPH i zdolności redukującej (FRAP) wykazano aktywność antyoksydacyjną zarówno kwasu synapinowego, jak i jego alkilowego estru na podobnym poziomie efektywności działania [54], ale dostępne są też doniesienia, wskazujące, że alkilowe pochodne kwasu kawowego wykazują słabszą zdolność zmiatania rodników DPPH niż kwas kawowy[55]. 227 Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak Tabela 2. Ocena właściwości antyoksydacyjnych wybranych fenolokwasów przy zastosowaniu różnych modeli doświadczalnych Kwas fenolowy kawowy Badania in vitro Badania in vivo ograniczanie peroksydacji lipidów, zmiatanie reaktywnych form tlenu (NO, H2O2) oraz redukcja kationorodnika ABTS+ – ale także efekt prooksydacyjny w badaniach redukcji jonów żelaza (przy stężeniach 5µM) i zmiatania DPPH (przy stężeniach 20 µM) [8] hamowanie peroksydacji lipidów przez CAPE w roztworze kwasu linolowego, zmiatanie wolnych rodników (ABTS+, DPPH, DMPD+ oraz O2) przez CAPE. Ponadto, zdolność redukcji jonów żelaza i miedzi (test FRAP i CUPRAC), chelatowanie jonów metali przejściowych [9] aktywność antyoksydacyjna kwasu kawowego w oznaczeniach zmiatania ABTS+ oraz pomiarach FRAP [10] zdolność zmiatania rodników DPPH oraz NO przez koniugat kwasu kawowego z chitooligosacharydem [11] chelatowanie jonów metali, przeciwdziałanie powstawaniu rodników hydroksylowych wytwarzanych w reakcji Fentona; hamowanie powstawania uszkodzeń wywołanych działaniem produktów reakcji Fentona (badania in vitro na wątrobach szczurów [12] hamowanie generowania wolnych rodników, ale brak wpływu na aktywność SOD w badaniach na homogenatach z kory mózgowej myszy z epilepsją [18] hamowanie powstawania rodnika 1-hydroksyetylowego w badaniach na mikrosomach ze szczurzej wątroby, prawdopodobnie będące wynikiem chelatowania jonów metali [19] hamowanie peroksydacji lipidów (oznaczenia poziomu MDA) oraz aktywności SOD, CAT, GPx przez CAPE w badaniach z użyciem homogenatów tkanki jąder szczurów z zaburzeniami czynności jąder indukowanymi kadmem [20] ograniczanie stresu oksydacyjnego (oznaczenia SOD i CAT w homo-genacie z hipokampu) u szczurów z napadami padaczkowymi induko-wanymi pilokarpiną [21] obniżenie całkowitego potencjału oksydacyjnego w tkance mózgowej w badaniachna szczurach z ostrym zatruciem środkiem owadobójczym (chloropiryfosem) [22] hamujący efekt CAPE na 228 Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych aktywność SOD oraz tworzenie RFT w komórkach nabłonkowych ucha środkowego, w warunkach stresu oksydacyjnego indukowanego H2O2 [13] zmiatanie DPPH oraz NO; spadek tworzenia TBARS w badaniach na fibroblastach płucnych poddanych działaniu H2O2[14] zahamowanie powstawania rodników 7karboksyheptylowych, zmiatanie 1 O2[15] hamowanie peroksydacji lipidów przez CAPE (badania z użyciem homogenatów komórek tarczycy i wątroby szczurów [16] hamowanie aktywności cytochromu P450 w badaniach na mikrosomach wątroby (hLMs) [17] kumarowy hamowanie peroksydacji lipidów (lipoprotein frakcji LDL), zmiatanie rodników ABTS+, DPPH, O2, OH; redukcja i chelatowanie jonów żelaza [23] zdolność zmiatania wolnych rodników w następującej efektywności działania: OHOCH3>OOH>OOCH3[24] 229 Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak ferulowy synapinowy aktywność antyoksydacyjna w badaniach peroksydacji lipidów (w badaniach na frakcjach mikrosomalnych wątroby myszy); zmiatanie ABTS oraz NO i H2O2 w badaniach in vitro na śledzionie myszy, ale także prooksydacyjne działanie w badaniach redukcji żelaza (dla stężeń 5 µM) i zmiatania DPPH (dla stężeń 20 µM) [8] wzrost aktywności SOD i CAT oraz obniżenie poziomu MDA w komórkach embrionalnych nerki(linia HEK293), traktowanych H2O2[25] hamowanie generowania RFT ispadek stężenia MDA, zwiększenie aktywności SOD i GPx oraz obniżenie ekspresji NADPH w szczurzych komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych, traktowanych H2O2[26] hamowanie generowania OH, NO oraz spadek poziomu TBARS przez ferulan izopentenylu [27] przeciwdziałanie peroksydacji lipidów w ludzkich erytrocytach, w warunkach stresu oksydacyjnego wywołanego hiperglikemią [28] obniżenie poziomu peroksydacji lipidów w kardiomioblastach poddanych działaniu H2O2[31] 230 cofnięcie zmian/uszkodzeń morfologicznych wywołanych powstawaniem amyloidu β, zależne od neutralizacji RFT, wykazane obserwacjami mikroskopowymi na modelu badawczym zarodków jeżowca Paracentrotus lividus[29] zmniejszenie poziomu MDA, wzrost poziomu glutationu całkowitego oraz zmniejszenie aktywności GPx oraz SOD u szczurów z sepsą [30] Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych + chlorogenowy rozmarynowy zmiatanie rodników ABTS i DPPH, zdolność redukcji jonów żelaza (FRAP) oraz chelatowanie jonów metali przejściowych przez izomery kwasu chlorogenowego [32] zmiatanie DPPH, O2, OH oraz wewnątrzkomórkowych RFT w badaniach na linii komórkowej HaCaT [33] hamowanie aktywności CYT450, obniżenie stężenia MDA, spadek generowania RFT oraz hamowanie ekspresji NFκB (ang. nuclear factor-κB) hepatocytach linii L-02, traktowanych acetaminofenem (paracetamolem) [34] zmiatanie rodnika DPPH[37] anty- i prooksydacyjna aktywność kwasu rozmary-nowego w badaniach in vitro z użyciem H2O2 oraz rodnika ABTS+[38] hamowanie peroksydacji lipidów w badaniach na modelu błony komórkowej [39] spadek stężenia MDA oraz zwiększenie całkowitej pojemności antyoksydacyjnej (TAC, ang. total antioxidant capacity) u szczurów, u których stres oksydacyjny powodowany był ekspozycją na działanie pola elektromagnetycznego [40] zmiatanie rodnika DPPH[41] hamowanie aktywności SOD, CAT, GPx, GSH oraz GST (Stransferaza glutationowa, ang. glutathione-S-transferase) oraz ekspresji NFκB u szczurów z cukrzycą indukowaną streptozotocyną [42] 231 hamowanie peroksydacji lipidów u szczurów z niedokrwieniem/reperfuzją wywołaną zamknięciem mikrokrążenia w lewym płacie wątroby [35] inhibicja peroksydacji lipidów (pomiar MDA) w surowicy krwi oraz wątrobie i tkance mózgowej szczurów; przywrócenie prawidłowego stężenia globulin i albumin, współczynnika albuminowoglobulinowego, poziomu serotoniny, noradrenaliny, dopaminy w surowicy oraz aktywności SOD i GPx w krwi oraz wątrobie myszy, którym podawano metamfetaminę [36] spadek generowania wolnych rodników, ale brak wpływu na aktywność SOD (w badaniach na homogenatach z kory mózgowej myszy z epilepsją) [18] hamowanie aktywności SOD i CAT – badania z użyciem homogenatów tkanek z nerek lub wątroby szczurów z cukrzycą wywołaną streptozotocyną [43] obniżenie poziomu MDA, a zwiększenie aktywności SOD, CAT i GPx w badaniach z użyciem homogenatów z wątroby i nerek starzejących się myszy [44] Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak 3.2. Aktywność przeciwzapalna Najnowsza literatura dostarcza informacji na temat przeciwzapalnych właściwości kwasów hydroksycynamonowych (tabela 3), a także ekstraktów bogatych w kwasy hydroksycynamonowe. W badaniach tych zwraca się uwagę przede wszystkim na aktywność kwasu rozmarynowego, którego działanie może być porównywalne lub nawet silniejsze od niektórych niesteroidowych leków przeciwzapalnych. Efektywność przeciwzapalnego oraz immunomodulującego działania tego fenolokwasu wynika głównie ze zdolności hamowania aktywności lipooksygenaz, cyklooksygenaz oraz białek układu dopełniacza. Kwas rozmarynowy badany jest obecnie zarówno pod kątem zastosowania leczniczego, jak i profilaktycznego w postaci nutraceutyków [80]. Zainteresowanie naukowców tym związkiem obejmuje doskonalenie metod jego produkcji, tworzenie nowych, aktywnych farmakologicznie pochodnych [81], a także badania naturalnych ekstraktów bogatych w ten związek. W ostatnich latach, oceniano m.in. przeciwzapalną aktywność kwasu rozmarynowego z Prunella vulgaris iThunbergia laurifolia. Ekstrakt z nadziemnych części P. vulgaris zawierający kwas rozmarynowy hamuje produkcję prostaglandyny E2(PGE2 ang. prostaglandin E2) oraz tlenku azotu in vitro. Ekstrakt ten hamował ponadto ekspresję genów dla cyklooksygenazy 2 (COX-2, ang. cyclooxygenase-2) oraz indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS, ang. inducible nitric oxide synthase) w komórkach stymulowanych lipopolisacharydem bakteryjnym (LPS) [82].Natomiast kwas rozmarynowy z liści T. laurifoliapodawany myszom drogą pokarmową w dawkach 50, 100 i 150 mg/kg wykazywał działanie przeciwzapalne in vivo, wyraźnie hamując występowanie indukowanego PGE2obrzęku [83]. Silne działanie przeciwzapalne mogą również wykazywać inne kwasy hydroksycynamonowe. Badania działania farmakologicznego kwasu chlorogenowego zawartego w ekstrakcie z części nadziemnych T. diversifoliawykazały, że ekstrakt (10, 50, 100 i 150 mg/kg) wykazuje wyższą aktywność przeciwzapalną niż niesteroidowy lek przeciwzapalny (indometacyna, 10 mg/kg) w badaniach in vivo [84]. Naukowcy poszukują ponadto kolejnych związków o działaniu terapeutycznym, opartych na strukturze kwasów hydroksycynamonowych. W 2014 roku, zespół badawczy Park i wsp. [85] opublikował wyniki wstępnych badań z zastosowaniem nowej pochodnej kwasu kawowego (acetyl-caffeic acid–1-piperonylpiperazine), jako związku o działaniu przeciwzapalnym. Doświadczenia na makrofagach poddawanych stymulacji LPS-em wykazały, że badana pochodna hamuje aktywność iNOS, COX-2 oraz syntezę interleukiny 6 i 1β. Ponadto, zaobserwowano supresję działania czynnika transkrypcji NFκB oraz genów zależnych od NFκB. 232 Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych W najnowszej literaturze, można także znaleźć wyniki badań aktywności przeciwzapalnej nowych hybryd estru CAPE (CAPE-aspiryna i CAPE-indometacyna). Stosując zwierzęcy model badawczy, wykazano, że połączenie CAPE-aspiryna hamuje proces zapalny indukowany paracentezą, którego nasilenie oceniano mierząc poziom TNF-α (ang. tumor necrosis factor) oraz PGE2[86]. Również wyniki innych prac badawczych, obejmujących analizę porównawczą aktywności przeciwzapalnej kwasu ferulowego, kumarynowego i ich pochodnych, prowadzone na makrofagach (Raw 264.7) stymulowanych LPS-em wskazują, że najsilniejszą aktywność przeciwzapalną (hamowanie ekspresji iNOS oraz tworzenia NFκB) wykazuje diferuloiloputrescyna, następnie p-dikumaroiloputrescyna, kwas ferulowy i p-kumarynowy izolowane z otrąb kukurydzianych [87]. Jednocześnie, należy także wspomnieć, że pojawiają się doniesienia na temat prozapalnych właściwości kwasu chlorogenowego. W badaniach in vivo (na szczurach) wykazano, że wysokie dawki kwasu chlorogenowego (7 mg/kg)powodują zwiększoną adhezję leukocytów, tworzenie nadtlenków i wyciek albuminy z naczyń krwionośnych. Ponadto, zaobserwowano wzrost poziomu MDA,nasilenie aktywności mieloperoksydazy i uwalniania cytokin prozapalnych oraz zwiększenie aktywności oksydazy NADPH, SOD oraz CAT [88]. 233 Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak Tabela 3.Ocena właściwości przeciwzapalnych wybranych fenolokwasów przy zastosowaniu różnych modeli doświadczalnych Kwas kawowy Badania in vitro hamowanie aktywacji i ekspresji NFκB pod wpływem działania TNF-α w ludzkich keratynocytach [56] obniżenie poziomu IL-1β, TNF-α oraz MCP-1 (ang. monocyte chemoattractant protein) w makrofagach, w których stan zapalny indukowano LPS-em [57] przeciwzapalna aktywność CAPE wykazana w badaniach z użyciem ludzkich komórek nabłonkowych z ucha środkowego (hamowanie ekspresji TNF-α i COX-2) – stan zapalny indukowano H2O2 [58] hamowanie generowania NO oraz PGE2 w makrofagach stymulowanych LPS-em. Hamowanie ekspresji TNF-α, iNOS oraz COX-2 [59] hamowanie produkcji NO, IL-6 oraz IL-1β w makrofagach pobudzanych LPS-em [60] kumarowy 234 Badania in vivo działanie przeciwzapalne w badaniach na szczurzym modelu zapalenia opłucnej wywołanej karagenem (66% redukcja migracji białych krwinek przy stężeniu kwasu 5mg/kg i 92,9%10mg/kg) [61] zmniejszenie poziomu TNF-α i IL-1β u szczurów po ostrym urazie rdzenia kręgowego [62] hamowanie aktywacji i ekspresji NFκB indukowanej przez TNF-α w komórkach ludzkich keratynocytów. Ponadto, stwierdzono hamowanie ekspresji TNF-α, iNOS oraz COX-2 w badaniach na myszach [63] hamowanie wydzielania IL-1β, IL-6 i TNF-α, zmniejszenie ekspresji iNOS, COX-2 i GFAP (ang. glial fibrillary acidic protein) oraz obniżenie produkcji NO oraz PGE2 u myszy, którym podawano 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6tetrahydropirydynę [64] hamowanie syntezy TNFα u szczurów z zapaleniem stawów, wywołanym adjuwantem [65] zmniejszenie aktywności enzymów lizosomalnych oraz peroksydacji lipidów u szczurów ze stanem zapalnym indukowanym moczanem sodu [66] Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych ferulowy chlorogenowy hamowanie ekspresji genów dla NFκB i iNOS oraz zmniejszenie produkcji TNFα, IL-6, IL-1β i NO w szczurzych komórkach mięśni gładkich, w których stan zapalnywywoływanoH2O2[26] hamowanie translokacji NFκB z cytoplazmy do jądra komórkowegooraz hamowanie ekspresji MCP-1 i IL-6 w komórkach gwiaździstych wątroby (kom. Browicza-Kupffera), stymulowanych LPS-em [68] hamowanie syntezy NO, IL1β, IL-6 oraz TNF-α oraz ekspresji COX-2 i iNOS. Hamowanie translokacji NFκB w makrofagach i komórkach mikgogleju stymulowanych LPS-em [69] hamowanie NO i PGE2 oraz ekspresji iNOS i COX-2 w ludzkich chondrocytach poddanych stymulacji IL-1β [70] Obniżenie poziomu TNF-α i IL-6 oraz ekspresji genów dla NFκB w komórkach mikrogleju stymulowanych HSV [71] hamowanie adhezji i migracji neutrofili w badaniach na liniach komórkowych śródbłonka (ang. primary culture of microvascular endothelial cell – PMEC)w których stan zapalny indukowano formyloleucyno-metioninofenyloalaniną [72] 235 obniżenie poziomu TNF-α i IL-1β u szczurów z zapaleniem stawów, indukowanym kolagenem [67] obniżenie poziomu TNF-α oraz aktywności COX-2 i iNOS w surowicy u szczurów z niedokrwieniem/reperfuzją spowodowanym umieszczeniem klamry uniemożliwiającej przepływ krwi w płucach [35] hamowanie ekspresji białka zapalnego makrofagów 2 oraz IL-1β u myszy, u których stan zapalny wywoływano dekstranem siarczanu sodu [73] Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak rozmarynowy hamowanie syntezy NFκB w neuronach stymulowanych TNF-α [74] hamowanie odpowiedzi zapalnej zależnej od niehistonowego białka chromosomalnego HMGB1 (ang. high mobility group box 1 protein) i czynnika NFκB w ludzkich komórkach śródbłonka, w warunkach stanu zapalnego indukowanego cytokiną HMGB1 (ang. high mobility group box 1) [75] obniżenie poziomu TNF-α, IL-1β, Il-6, NO oraz ekspresji NFκB u szczurów z cukrzycą, wywołaną działaniem streptozotocyny [76] 236 działanie przeciwzapalne na szczurzym modelu uszkodzenia płuc indukowanego LPS-em (spadek wydzielania cytokin prozapalnych: TNF-α, IL-6 i IL-1) [77] ograniczenie uszkodzeń widocznych w obrazowaniu histopatologicznym, zmniejszenie obrzęku mózgu, hamowanie ekspresjiHMGB1 (ang. high-mobility group box1) i aktywności NFκB u szczurów z cukrzycą, u których indukowano stan zapalny streptozotocyną (Luan i wsp., 2013) hamowanie migracji leukocytów u myszy ze stanem zapalnym wywołanym LPS-em [75] spadek aktywności aminotransferaz ALAT (ang. alanine aminotransferase) i AspAT (ang. aspartate aminotransferase) oraz stężenia MDA w surowicy szczurów z niedokrwieniem/reperfuzją wywołanym założeniem klamry blokującej przepływ krwi w naczyniach krwionośnych wątroby [78] łagodzenie ostrego stanu zapalnego trzustki, indukowanego u myszy taurocholanem sodu – kw. rozmarynowy zastosowano w dawce50 mg/kg masy ciała [79] Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych 3.3. Przeciwnowotworowe właściwości kwasów hydroksycynamonowych Dostępne są liczne prace oryginalne, wskazujące na chemoprewencyjne, antyproliferacyjne i anty-adhezyjne właściwości różnych kwasów fenolowych, a także prace poglądowe podsumowujące aktualny stan wiedzy (np. [89,90]). Molekularne mechanizmy działania tych związków pozostają jednak nie w pełni wyjaśnione, stąd też, w ostatnich latach obserwuje się liczne badania, prowadzone w oparciu o doświadczenia na różnych liniach komórkowych lub modelach zwierzęcych, mające na celu ustalenie głównych biochemicznych szlaków działania fenolokwasów (Tabela 4). Badania porównawcze pozwalają natomiast na uzyskanie szerszego obrazu efektywności działania przeciwnowotworowego kwasów hydroksycynamonowych. W pracach badawczych tego typu potwierdzono m.in. przeciwnowotworowe właściwości kwasu kawowego, p-kumarowego i ferulowego, wykorzystując model doświadczalny komórek raka płuca (A549) oraz linii komórek raka jelita grubego (HT29-D4). Wymienione fenolokwasy (50-200 μM) hamowały nie tylko proliferację komórek obu linii, ale także ich wiązanie się z różnymi białkami adhezyjnymi (lamininą 1, witronektyną i fibronektyną), co sugeruje, że związki te mogłyby działać na różnych etapach rozwoju choroby nowotworowej, hamując zarówno namnażanie komórek transformowanych, jak i ich adhezję [109]. Również w innych badaniach wykazano, że kwasy: kawowy, chlorogenowy i ferulowy (w zakresie stężeń ≥100 μM) mogą hamować proliferację oraz adhezję komórek A549, stymulowanych zastosowaniem estru forbolu (PMA, ang. phorbol-12-myristate-13-acetate). Biochemiczne mechanizmy obserwowanych efektów obejmują hamowanie szlaków przekazywania sygnału z udziałem kinaz MAPK, kinazy 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K) oraz Akt, a także inaktywacji regulatorów transkrypcji, takich jak NF-κB (ang. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), kompleksu AP-1 (ang. activator protein 1) oraz STAT (ang. signal transducer and activator of transcription 3) [110]. W przypadku kwasu kawowego, najnowsze badania wskazują, że dla przeciwnowotworowego działania tego związku in vitro i in vivo istotne znaczenie ma także zdolność hamowania podziałów macierzystych komórek nowotworowych (CSCs, ang. cancer stem cells). Molekularny mechanizm tego efektu obejmuje blokowanie przez kwas kawowy szlaków przekazywania sygnałów zależnych od czynnika TGFβ i receptora Smad2 [111]. Omawiając postęp w badaniach nad przeciwnowotworowym działaniem fenolokwasów należy jednak przede wszystkim wymienić syntezę nowych pochodnych różnych kwasów fenolowych w celu zwiększenia skuteczności ich działania farmakologicznego oraz ocenę działania tych pochodnych. Do niedawna, większość badań nad pochodnymi kwasów hydroksycynamonowych dotyczyła estru fenetylowego kwasu kawowego (CAPE), 237 Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak stanowiącego jeden z bioaktywnych składników miodów i propolisu. Jako główny mechanizm działania biologicznego tego związku wskazuje się zdolność specyficznego hamowania czynnika transkrypcyjnego NF-κB. Z uwagi na zdolność NF-κB do hamowania apoptozy, indukcji proliferacji oraz nasilania procesu angiogenezy, czynnik ten odgrywa ważną rolę w onkogenezie i progresji zmian nowotworowych – dlatego też może stanowić cel działania terapii przeciwnowotworowych [112]. Obecnie, wśród najnowszych doniesień dotyczących pochodnych fenolokwasów również można znaleźć kolejne prace na temat przeciwnowotworowego działania CAPE (np. [113,114,115]), ale zauważalny jest wyraźny wzrost zainteresowania nowymi, syntetycznymi pochodnymi kwasów fenolowych, takimi jak np. heterocykliczne estry kwasu kawowego[116] lub połączenia z chitozananem. Wiadomo, że koniugaty kwas kawowy-chitooligosacharyd posiadają m.in. właściwości przeciwrodnikowe [117], ale ostatnio zwrócono również uwagę na fakt, że chitozanowe pochodne fenolokwasów mogą działać przeciwnowotworowo. W badaniach na linii komórkowej CT26 (raka jelita grubego) stwierdzono, że koniugaty kwasu kawowego i chitozanu (kw. kawowy przyłączony do grup aminowych chitozanu) charakteryzują się silniejszymi właściwościami anty-proliferacyjnymi i pro-apoptotycznymi niż chitozan. Opisywane pochodne ograniczały także inwazję komórek nowotworowych w testach z użyciem podłoża Matrigel® [118], stanowiącego zrekonstruowaną błonę podstawną. Ponadto, chitozan w połączeniu z kwasem kawowym może stanowić bazę do tworzenia nanocząsteczek służącychjako nośniki leków przeciwnowotworowych. Ostatnio badane jest m.in. zastosowanie samoorganizujących się nanocząsteczek zbudowanych z koniugatów chitozanu i kwasu kawowego oraz karboksymetylodekstranu i glikolu polietylenowego (CMD-PEG), jako formy precyzyjnego dostarczania doksorubicyny do komórek nowotworowych in vitro [119]. Stosując model eksperymentalny raka płuc (doświadczenia in vitro i in vivo) wykazano z kolei przeciwnowotworowe właściwości kwasu 4-O-(2″-O-acetylo-6″-O-p-kumaroilo-β-D-gluko-piranozylo)-p-kumarynowego [120]. Opublikowano także prace na temat właściwości przeciwnowotworowych kawoilo- i feruilopochodnych wanilliny oraz metylowaniliny pochodzące z badań in vitro oraz in vivo. W testach in vitro wyraźny efekt cytotoksyczny stwierdzono w przypadku kilku pochodnych, natomiast w badaniach na myszach, najsilniejszym efektem przeciwnowotworowym charakteryzował się 5-nitro kawoilan adamantylu, zmniejszający wagę guzów o ok. 36,7% (przy zastosowaniu dawki 40 mg/kg masy ciała) [121]. Wśród najnowszych odkryć w dziedzinie potencjalnego zastosowania kwasu kawowego w terapii nowotworów warto również wspomnieć możliwość zastosowania tego związku w formie stałych nanocząstek lipidowych [122]. Ponadto, trwają badania nad przeciwnowotworowymi właściwościami nieorganicznych pochodnych kwasu ferulowego, o charak- 238 Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych terze nanohybryd. W doświadczeniach na komórkach linii HeLa stwierdzono, że takie pochodne wykazują dwukrotnie silniejszą aktywność przeciwproliferacyjną w porównaniu do samego fenolokwasu [123]. Z kolei kompleksy kwasu chlorogenowego i oksowanadu (Na[VO(kw. chlorogenowy)(H2O)3]4H2O) są badane pod kątem zastosowania w leczeniu raka sutka. W warunkach in vitro wykazano selektywną cytotoksyczność tych związków w stosunku do komórek linii raka sutka (SKBR3) [124]. Inną możliwością terapeutycznego wykorzystania i wzmocnienia przeciwnowotworowego działania kwasów fenolowych jest opracowanie terapii opartych na synergistycznym działaniu tych związków z innymi substancjami lub lekami. Oddziaływania synergistyczne pomiędzy chemoterapeutykami przeciwnowotworowymi i naturalnymi związkami fenolowymi, a także synergizm przeciwnowotworowy między roślinnymi (poli)fenolami są obecnie intensywnie badane. Efekt taki wykazano dla wielu związków fenolowych lub ekstraktów bogatych w polifenole (w tym fenolokwasy), w badaniach z zastosowaniem cytostatyków przeciwnowotworowych o różnych mechanizmach działania, takich jak np. doksorubicyna (antybiotyk antracyklinowy), tamoksyfen (modulator receptora estrogenowego),5-fluorouracyl (antymetabolit),docetaksel ipaklitaksel (taksany, inhibitory mitozy), czy winkrystyna (alkaloid, inhibitor mitozy) [125]. W przypadku zastosowania fenolokwasów jako wzmocnienia terapii przeciwnowotworowejoceniane są takżemożliwości ich stosowania w połączeniu z inhibitorami polimeraz poli-ADP-rybozy (PARP, ang.poly (ADP-ribose) polymerase). Ze względu na kluczową rolę PARP w procesach naprawy DNA, blokowanie ich aktywności w komórkach nowotworowych stanowi cel terapii nowotworów uwarunkowanych niedoborem aktywności BRCA1/2, takich jak rak piersi czy jajnika. Zahamowanie aktywności PARP prowadzi zjawiska tzw. sztucznie wywołanej letalności (ang. synthetic lethality), stanowiącej podstawę działania leków z grupy inhibitorów PARP [126]. Ocena działania kombinacji kwasu ferulowego oraz ABT-888 (inhibitor PARP) wykazała, że kwas ferulowy uwrażliwia komórki raka sutka (linia MDA-MB-231) na działanie tego inhibitora PARP[127]. Ponadto, działanie kwasu ferulowego może być również wzmocnione poprzez podawanie go z kwasem acetylosalicylowym (aspiryna) w formie nanokapsułek pokrytych chitozanem. W doświadczeniach na liniach komórkowych raka trzustki wykazano, że połączenie kwasu ferulowego i aspiryny w formie takich nanokapsułek znacząco redukuje przeżywalność komórek linii MIA PaCa-2 oraz Panc-1, a in vivo ogranicza wzrost guzów u zwierząt objętych badaniem[128]. Synergistyczny efekt antyproliferacyjny zaobserwowano także stosując kwas ferulowy w połączeniu z δ-tokotrienolem (badania na komórkach linii DU-145, MCF-7 oraz PANC-1) [129]. 239 Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak Tabela 4. Ocena właściwości przeciwnowotworowych wybranych fenolokwasów przy zastosowaniu różnych modeli doświadczalnych Kwas ferulowy Badania in vitro radiouczulające działanie na komórki raka szyki macicy (linii HeLa oraz ME-180) [91] efekt antyproliferacyjny i hamowanie zdolności tworzenia kolonii komórek linii TT (raka rdzeniastego tarczycy na skutek ekspresji genu URG4/URGCP [92] hamowanie cyklu komórkowego w komórkach raka prostaty linii PC-3 oraz działanie proapoptotyczne w komórkach linii LNCaP [93] działanie antyangiogenne – hamowanie odpowiedzi komórkowej na czynnik wzrostu fibroblastów 1 (FGF1, ang. basic fibroblast growth factor 1); kwas ferulowy wykazuje zdolność hamowania/blokowania funkcji receptora dla czynnika FGF-1, powoduje zahamowanie szlaków przekazywania sygnału z udziałem kinazy 3fosfatydyloinozytolu (PI3K) oraz kinazy Akt [94] zastosowanie kombinacji kw. ferulowego oraz weliparybu (ABT-888) – inhibitora receptorów PARP, zwiększa wrażliwości komórek raka sutka na działanie tego inhibitora (linie MDA-MB231 oraz MCF-7) [95] zaobserwowano spadek przeżywalności i hamowanie tworzenia kolonii komórek linii MIA PaCa-2 traktowanych kw. ferulowym [96] 240 Badania in vivo hamowanie karcynogenezy (zapobieganie tworzeniu guza w badaniu na zwierzętach) poprzez modulowanie ekspresji i aktywności cyklooksygenazy 2, NF-B oraz czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF, ang. vascular endothelial growth factor[97] ochrona przed hepatotoksycznością diosbulbiny B i wzmocnienie przeciwnowotworowego jej działania – badania na myszach [98] hamowanie angiogenezy i wzrostu guzów indukowanych u myszy poprzez wprowadzenie komórek linii czerniaka B16F10 [94] Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych kawowy o-kumarowy p-kumarowy chlorogenowy rozmarynowy hamowanie proliferacji komórek włókniakomięsaka (linia HT-1080) [99] działanie proapoptotyczne w komórkach białaczkowych (linii HEL) [100] efekt chemoprewencyjny w doświadczeniach na komórkach raka sutka (linia MCF-7) [101] działanie antyangiogenne (linia ECV304) na skutek hamowania szlaków przekazywania sygnałów z udziałem kinaz AKT i ERK [102] indukcja apoptozy w komórkach białaczki U937 na skutek stymulacji wzrostu ekspresji kaspazy 3, 7, 8 oraz 9, a także poprzez zmiany (redukcję) potencjału błony mitochondrialnej [103] hamowanie proliferacji i proapoptotyczne działanie na komórki linii HL-60 (ostrej białaczki promielocytowej) [104] efekt anty-angiogenny, będący wynikiem inhibicji szlaku przekazywania sygnału z udziałem czynnika HIF-1α (czynnika transkrypcyjnego indukowany hipoksją) oraz kinazy AKT [105] wzmocnienie przeciwnowotworowego działania 5-fluorouracylu na komórki raka wątrobowokomórkowego (linie HepG2 i Hep3B) [106] radiouczulające działanie na komórki czerniaka (linia B16F10) [107] 241 hamowanie wzrostu guzów, indukowanych u myszy poprzez iniekcję komórkami RENCA [102] hamowanie indukowanej 7,12dimetylobenzo[a]antracenem karcynogenezy komórek skóry myszy [108] Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak 4. Podsumowanie W odróżnieniu od flawonoidów badanych bardzo intensywnie od ponad 25 lat, wzrost zainteresowania biologiczną aktywnością fenolokwasów roślinnych stanowi stosunkowo nowe zagadnienie w naukach biomedycznych. Szczególnie w ostatnich kilku latach obserwuje się znaczący postęp i rozszerzenie zakresu prac badawczych tych związków oraz ich pochodnych. Dostępna literatura dostarcza najwięcej danych dotyczących właściwościach kwasu kawowego (głównie aktywności antyoksydacyjnej) oraz o jego naturalnej pochodnej – estru fenetylowego kwasu kawowego (CAPE) potwierdzonych w badaniach in vitro jak i in vivo. Ponadto, znaleźć można prace dotyczące działania antyoksydacyjnego, przeciwzapalnego oraz przeciwnowotworowego kwasu ferulowego, chlorogenowego i rozmarynowego. Najmniej poznanymi fenolokwasami pozostają nadal kwas kumarynowy oraz synapinowy. Główne kierunki badań dotyczących możliwego zastosowania farmakologicznego fenolokwasów dotyczą przeciwzapalnej i przeciwnowotworowej aktywności różnych pochodnych kwasów hydroksycynamonowych (m.in. koniugatów z naturalnymi biopolimerami, substancjami syntetycznymi oraz składnikami nieorganicznymi), projektowanych w celu zwiększenia efektywności potencjalnego działania leczniczego. Warto również wspomnieć, że badania tego typu obejmują również opracowanie odpowiednich formulacji preparatów fenolokwasowych, w tym użycie ich w postaci nanocząstek lipidowych, a także, jako składników mieszanin o synergistycznym efekcie terapeutycznym. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Maeda H., Dudareva N., The Shikimate Pathway and Aromatic Amino Acid Biosynthesis in Plants, The Annual Review of Plant Biology 63 (2010), s. 73-105 Gawlik-Dziki U., Fenolokwasy jako bioaktywne składniki żywności, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość 4 (2004), s. 29-40 Budryn G., Nebesny E., Fenolokwasy – ich właściwości, występowanie w surowcach roślinnych, wchłanianie i przemiany metaboliczne, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna 2 (2006), s. 103-110 Shahidi F., Chandrasekara A., Hydroxycinnamates and their in vitro and in vivo antioxidant activities, Phytochemistry Reviews 9 (2010), s. 147-170 Saibabu V., Fatima Z., Khan L. A, Hameed S,. Therapeutic Potential of Dietary Phenolic Acids, Advances in Pharmacological Sciences 2015, doi: doi:10.1155/2015/823539 Teixeira J., Gaspar A., Garrido E. M., Garrido J., Borges F., Hydroxycinnamic Acid Antioxidants: An Electrochemical Overview (2013) http://dx.doi.org/10.1155/2013/251754 Petersen M., Simmonds, Rosmarinic acid, Phytochemistry 62 (2003), s. 121-125 242 Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Maurya D. K., Devasagayam T. P. A., Antioxidant and prooxidant nature of hydroxycinnamic acid derivatives ferulic and caffeic acids, Food and Chemical Toxicology 48 (2010), s. 3369-3373 Gocer H., Gulcin I., Caffeic acid phenethyl ester (CAPE): correlation of structure and antioxidant properties, International Journal of Food Sciences and Nutrition, 62(8) (2011), s. 821-825 Jeong Ch-H., Jeong H. R., Choi G. N., Kim D-O., Lee U., Heo H. J., Neuroprotective and anti-oxidant effects of caffeic acid isolated from Erigeron annuus leaf, Chinese Medicine 6:25 (2011) s. 1-9 Eom T-K., Senevirathne M., Kim S-K., Synthesis of phenolic acid conjugated chitooligosaccharides and evaluation of their antioxidant activity, Environmental Toxicology And Pharmacology 34 (2012), s. 519-527 Genaro-Mattos T. C., Maurício A. Q., Rettori D., Alonso A., Hermes-Lima M., Antioxidant Activity of Caffeic Acid against Iron-Induced Free Radical Generation – A Chemical Approach, PLoS ONE 10(6) (2015) e0129963 Song J-J., Lim H. W., Kim K., Kim K-M., Cho S., Chae S-W., Effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on H2O2 induced oxidative and inflammatory responses in human middle ear epithelial cells, International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology 76 (2012), s. 675-679 Santos J. L. A., Bispo V. S., Filho A. B. C., Pinto I. F. D., Dantas L. S., Vasconcelos D. F., Abreu F. F., Melo D. A., Matos I. A., Freitas F. P., Gomes O. F., Medeiros M. H. G., Matos H. R., Evaluation of Chemical Constituents and Antioxidant Activity of Coconut Water (Cocus nucifera L.) and Caffeic Acid in Cell Culture, Annals of the Brazilian Academy of Sciences 85(4) (2013), s. 1235-1246 Asano M., Iwahashi H., Caffeic Acid Inhibits the Formation of 7Carboxyheptyl Radicals from Oleic Acid under Flavin Mononucleotide Photosensitization by Scavenging Singlet Oxygen and Quenching the Excited State of Flavin Mononucleotide, Molecules 19 (2014), s. 12486-12499 Kokoszko-Bilska A., Stepniak J., Lewinski A., Karbownik-Lewinska M., Protective antioxidative effects of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) in the thyroid and the liver are similar to those caused by melatonin, Thyroid Research 7:5 (2014) Rastogi H., Jana S., Evaluation of Inhibitory Effects of Caffeic acid and Quercetin on Human Liver Cytochrome P450 Activities, Phytotherapy Research 28 (2014), s. 1873-1878 Coelho V. R., Vieira C. G., de Souza L. P., Moysés F., Basso C., Papke D. K. M., Pires T. R., Siqueira I. R., Picada J. R., Pereira P., Antiepileptogenic, antioxidant and genotoxic evaluation of rosmarinic acid and its metabolite caffeic acid in mice, Life Sciences 122 (2015), s. 65-71 Ikeda H., Kimura Y., Masaki M., Iwahashi H., Caffeic acid inhibits the formation of 1 hydroxyethyl radical in the reaction mixture of rat liver microsomes with ethanol partly through its metal chelating activity, Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition 48 (3) (2011), s.187-193 Erboga M., Kanter M., Aktas C., Donmez Y. B., Erboga Z. F., Aktas E., Gurel A., Anti-Apoptotic and Anti-Oxidant Effects of Caffeic Acid Phenethyl Ester 243 Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. on Cadmium-Induced Testicular Toxicity in Rats, Biological Trace Element Research (2015) DOI 10.1007/s12011-015-0509-y dos Santos Sales I. M., do Nascimento K. G., Feitosa Ch. M., Saldanha G. B., Feng D., de Freitas R. M., Caffeic acid effects on oxidative stress in rat hippocampus after pilocarpine-induced seizures, Neurological Sciences 32 (2011), s. 375-380 Ozkan U., Osun A., Basarslan K., Senol S., Kaplan I., Alp H., Effects of intralipid and caffeic acid phenethyl ester on neurotoxicity, oxidative stress, and acetylcholinesterase activity in acute chlorpyriphos intoxication, International Journal of Clinical and Experimental Medicine 7(4) (2014), s. 837-846 Kilic I., Yesiloglu Y., Spectroscopic studies on the antioxidant activity of p-coumaric acid, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 115 (2013), s. 719-724 Garzón A., Bravo I., Barbero A. J., Albaladejo J., Mechanistic and Kinetic Study on the Reactions of Coumaric Acids with Reactive Oxygen Species: A DFT Approach, Journal od Agricultural and Food Chemistry 62 (2014), s. 9705-9710 Bian Y-Y., Guo J., Majeed H., Zhu K-X., Guo X-N., Peng W., Zhou H-M., Ferulic acid renders protection to HEK293 cells against oxidative damage and apoptosis induced by hydrogen peroxide, In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal 51 (2015), s. 722-729 Cao Y-J., Zhang Y-M., Qi J-P., Liu R., Zhang H., He L-Ch., Ferulic acid inhibits H2O2-induced oxidative stress and inflammation in rat vascular smoothmuscle cells via inhibition of the NADPH oxidase and NF-κB pathway, International Immunopharmacology 28 (2015), s. 1018-1025 Machado K. C., Oliveira G. L. S., de Sousa E. B. V., Costa I. H. F., Machado K. C., de Sousa D. P., Satyal P., de Freitas R. M., Spectroscopic studies on the in vitro antioxidant capacity of isopentyl ferulate, Chemico-Biological Interactions 225 (2015), s. 47-53 Sompong W., Cheng H., Adisakwattana S., Glucose-Induced Protein Glycation, Lipid Peroxidation, and Membrane Ion Pump Activity in Human Erythrocytes, PLoS ONE 10(6): e0129495 Picone P., Nuzzo D., Di Carlo M., Ferulic Acid: a Natural Antioxidant Against Oxidative Stress Induced by Oligomeric A-beta on Sea Urchin Embryo, The Biological Bulletin 224 (2013), s. 18-28 Bacanlı M., Aydın S., Taner G., Göktas H. G., Sahin T., Basaran A. A., Basaran N., The protective role of ferulic acid on sepsis-inducedoxidative damage in Wistar albino rats, Environmental Toxicology and Pharmacology 38 (2014), s. 774-782 Silambarasan T., Manivannan J., Priya M. K., Suganya N., Chatterjee S., Raja B., Sinapic acid protects heart against ischemia/reperfusion injury and H9c2 cardiomyoblast cells against oxidative stress, Biochemical and Biophysical Research Communications 456 (2015), s. 853-859 244 Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych 32. Xu J-G., Hu Q-P., Liu Y., Antioxidant and DNA-Protective Activities of Chlorogenic Acid Isomers, Journal of Agricultural and Food Chemistry 60 (2012), s. 11625 -11630 33. Cha J. W., Piao M. J., Kim K. Ch., Yao Ch. W., Zheng J., Kim S. M., Hyun Ch. L., Ahn Y. S., Hyun J. W., The Polyphenol Chlorogenic Acid Attenuates UVB-mediated Oxidative Stress in Human HaCaT Keratinocytes, Biomolecules and Therapeutics 22(2) (2014), s. 136-142 34. Pang Ch., Sheng Y-cC, Jiang P., Wei H., Ji L-l., Chlorogenic acid prevents acetaminophen-induced liver injury: the involvement of CYP450 metabolic enzymes anD some antioxidant signals, Biomedicine & Biotechnology 16(7) (2015), s. 602-610 35. Yun N., Kang J-W., Lee S-M., Protective effects of chlorogenic acid against ischemia/reperfusion injury in rat liver: molecular evidence of its antioxidant and anti-inflammatory properties, Journal of Nutritional Biochemistry 23 (2012), s. 1249-1255 36. Koriem K. M. M., Soliman R. E., Chlorogenic and Caftaric Acids in Liver Toxicity and Oxidative Stress Induced by Methamphetamine, Journal of Toxicology (2015), http://dx.doi.org/10.1155/2014/583494 37. Mehni F., Sharififar F., Ansari M., Antioxidant activity and rosmarinic acid content of ten medicinal plants, Research in Pharmaceutical Sciences 7(5) (2012) 38. Muñoz-Muñoz J. L., Garcia-Molina F., Ros E., Tudela J., García-Canovas F., Rodriguez-Lopez J. N., Prooxidant and antioxidant activities of rosmarinic acid, Journal of Food Biochemistry (2011) doi:10.1111/j.17454514.2011.00639.x 39. Fadel O., Kirat K. E., Morandat S., The natural antioxidant rosmarinic acid spontaneously penetrates membranes to inhibit lipid peroxidation in situ, Biochimica et Biophysica Acta 1808 (2011), s. 2973-2980 40. Hajhosseini L., Khaki A., Merat E., Ainehchi N., Effect Of Rosmarinic Acid On Sertoli Cells Apoptosis And Serum Antioxidant Levels In Rats After Exposure To Electromagnetic Fields, African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines 10(6) (2013), s. 477-480 41. Zhu F., Asada T., Sato A., Koi Y., Nishiwaki H., Tamura H., Rosmarinic Acid Extract for Antioxidant, Antiallergic, and α‑Glucosidase Inhibitory Activities, Isolated by Supramolecular Technique and Solvent Extraction from Perilla Leaves, Journal of Agricultular and Food Chemistry 62 (2014), s. 885−892 42. Govindaraj J., Pillai S. S., Rosmarinic acid modulates the antioxidant status and protects pancreatic tissues from glucolipotoxicity mediated oxidative stress in high-fat diet: streptozotocin-induced diabetic rats, Molecular and Cellular Biochemistry 404 (2015), s. 143-159 43. Mushtaq N., Schmatz R., Ahmed M., Pereira L. B., da Costa P., Reichert K. P., Dalenogare D., Pelinson L. P., Vieira J. M., Stefanello N., de Oliveira L. S., Mulinacci N., Bellumori M., Morsch V. M., Schetinger M. R., Protective effect of rosmarinic acid against oxidative stress biomarkers in liver and kidney of strepotozotocin-induced diabetic rats, Journal of Physiology and Biochemistry (2015) DOI 10.1007/s13105-015-0438-4 245 Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak 44. Zhang Y., Chen X., Yang L., Zu Y., Lu Q., Effects of rosmarinic acid on liver and kidney antioxidant enzymes, lipid peroxidation and tissue ultrastructure in aging mice, Food and Function 6 (2015), s. 927-931 45. Sato Y., Itagaki S., Kurokawa T., Ogura J., Kobayashi M., Hirano T., Sugawara M., Iseki K., In vitro and in vivo antioxidant properties of chlorogenic acid and caffeic acid, International Journal of Pharmaceutics 403 (2011), s. 136-138 46. Celik S. E., Özyürek M., Tufan A. N., Güclü K., Apak R., Spectroscopic study and antioxidant properties of the inclusion complexes of rosmarinic acid with natural and derivative cyclodextrins, Spectrochimica Acta Part A 78 (2011), s. 1615-1624 47. Terpinc P., Polak T., Ńegatin N., Hanzlowsky A., Ulrih N. P., Abramovic H., Antioxidant properties of 4-vinyl derivatives of hydroxycinnamic acids, Food Chemistry 128 (2011), s. 62-69 48. Modrzejewska Z., Formy chitozanowe do zastosowań w inżynierii biomedycznej, Inżynieria i Aparatura Chemiczna 50 (2011), s. 74-75 49. Woranuch S., Yoksana R., Preparation, characterization and antioxidant property of water-soluble ferulic acid grafted chitosan, Carbohydrate Polymers 96 (2013), s. 495-502 50. Lee D-S., Woo J-Y., Ahn Ch-B., Je J-Y., Chitosan – hydroxycinnamic acid conjugates: Preparation, antioxidant and antimicrobial activity, Food Chemistry 148 (2014), s. 97-104 51. Liu J., Wen X-Y., Lu J-F., Kan J., Jin Ch-H., Free radical mediated grafting of chitosan with caffeic and ferulicacids: Structures and antioxidant activity, International Journal of Biological Macromolecules 65 (2014), s. 97-106 52. Garrido J., Gaspar A., Garrido E. M., Miri R., Tavakkoli M., Pourali S., Saso L., Borges F., Firuzi O., Alkyl esters of hydroxycinnamic acids with improved antioxidant activity and lipophilicity protect PC12 cells against oxidative stress, Biochimie 94 (2012), s. 961-967 53. Piazzon A., Vrhovsek U., Masuero D., Mattivi F., Mandoj F., Nardini M., Antioxidant Activity of Phenolic Acids and Their Metabolites: Synthesis and Antioxidant Properties of the Sulfate Derivatives of Ferulic and Caffeic Acids and of the Acyl Glucuronide of Ferulic Acid, Journal of Agricultural and Food Chemistry 60 (2012), s. 12312−12323 54. Gaspar A., Martins M. Silva P., Garrido E.M., Garrido J., Firuzi O., Miri R., Saso L., Borges F., Dietary Phenolic Acids and Derivatives. Evaluation of the Antioxidant Activity of Sinapic Acid and Its Alkyl Esters, Journal Agricultural and Food Chemistry 58 (2010), s. 11273-11280 55. Wang J., Gu S-S., Pang N., Wang F-Q,, Pang F., Cui H-S., Wu X-Y., Wu FA., Alkyl Caffeates Improve the Antioxidant Activity, Antitumor Property and Oxidation Stability of Edible Oil, PLoS ONE 9(4) (2014) e95909 56. Lim K-M., Bae S., Koo J. E., Kim E-S., Bae O-N, Lee J. Y., Suppression of skin inflammation in keratinocytes and acute/chronic disease models by caffeic acid phenethyl ester, Archives of Dermatological Research 307 (2015), s. 219-227 246 Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych 57. Juman S., Yasui N., Ikeda K., Ueda A., Sakanaka M., Negishi H., Mikia T., Caffeic Acid Phenethyl Ester Suppresses the Production of Proinflammatory Cytokines in Hypertrophic Adipocytes through Lipopolysaccharide-Stimulated Macrophages, Biological and Pharmaceutical Bulletin 35(11) (2012), s. 1941-1946 58. Song J-J., Lim H. W., Kim K., Kim K-M., Cho S., Chae S-W., Effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on H2O2 induced oxidative and inflammatory responses in human middle ear epithelial cells, International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology 76 (2012), s. 675-679 59. Yang W. S., Jeong D.,1 Yi Y-S., Park J. G., Seo H., Moh S. H., Hong S., Cho J. Y., IRAK1/4-Targeted Anti-Inflammatory Action of Caffeic Acid (2013) http://dx.doi.org/10.1155/2013/518183 60. Choi E-Y., Choe S-H., Hyeon J-Y., Choi J-I., Choi I. S., Kim S-J., Effect of caffeic acid phenethyl ester on Prevotella intermedia lipopolysaccharideinduced production of proinflammatory mediators in murine macrophages, Journal of Periodontal Research (2015), doi:10.1111/jre.12260 61. Gamaro G. D., Suyenaga E., Borsoi M., Lermen J., Pereira P., Ardenghi P., Effect of Rosmarinic and Caffeic Acids on Inflammatory and Nociception Process in Rats, (2011), doi:10.5402/2011/451682 62. Ak H., Gülşen I., Karaaslan T., Alaca I., Candan A., Koçak H., Atalay T., Çelikbilek A., Demir I., Yılmaz T., The effects of caffeic acid phenethyl ester on inflammatory cytokines after acute spinal cord injury, Journal of Trauma and Emergency Surgery 21(2) (2015), s. 96-101 63. Lim K-M., Bae S., Koo J.E., Kim E-S., Bae O-N., Lee J. Y., Suppression of skin inflammation in keratinocytes and acute/chronic disease models by caffeic acid phenethyl ester, Archives of Dermatological Research 307 (2015), s. 219-227 64. Tsai S-J., Chao Ch-Y., Yin M-Ch., Preventive and therapeutic effects of caffeic acid against inflammatory injury in striatum of MPTP-treated mice, European Journal of Pharmacology 670 (2011), s. 441-447 65. Pragasam S. J., Venkatesan V., Rasool M., Immunomodulatory and Antiinflammatory Effect of p-Coumaric Acid, a Common Dietary Polyphenol on Experimental Inflammation in Rats, Inflammation 36 (1) (2013) 66. Pragasam S. J., Rasool M .K., Dietary component p-coumaric acid suppresses monosodium urate crystal-induced inflammation in rats, Inflammation Research 62 (2013), s. 489-498 67. Zhu H., Liang Q-H., Xiong X-G., Chen J., Wu D., Wang Y., Yang B., Zhang Y., Zhang Y., Huang X., Anti-Inflammatory Effects of the Bioactive Compound Ferulic Acid Contained in Oldenlandia diffusa on CollagenInduced Arthritis in Rats (2014) http://dx.doi.org/10.1155/2014/573801 68. Shi H., Dong L., Dang X., Liu Y., Jiang J., Wang Y., Lu X., Guo X., Effect of chlorogenic acid on LPS-induced proinflammatory signaling in hepatic stellate cells, Inflammation Research 62 (2013), s. 581-587 69. Hwang S.J., Kim Y-W., Park Y., Lee H-J., Kim K-W., Anti-inflammatory effects of chlorogenic acid in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells, Inflammation Research 63 (2014), s. 81-90 247 Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak 70. Chen W-P., Wu L-D., Chlorogenic acid suppresses interleukin-1β-induced inflammatory mediators in human chondrocytes, International Journal of Clinical and Experimental Pathology 7(12) (2014), s. 8797-8801 71. Guo Y-J., Luo T., Wu F., Mei Y-W., Peng J., Liu H., Li H-R., Zhang S-L., Dong J-H., Fang Y., Zhao L., Involvement of TLR2 and TLR9 in the antiinflammatory effects of chlorogenic acid in HSV-1-infected microglia, Life Sciences 127 (2015), s. 12-18 72. Hebeda C. B., Bolonheis S. M., Nakasato A., Belinati K., Souza P. D. C., Gouvea D. R., Lopes N. P., Farskya S. H. P., Effects of chlorogenic acid on neutrophil locomotion functions in response to inflammatory stimulus, Journal of Ethnopharmacology 135 (2011), s. 261-269 73. Shin H. S., Satsu H., Bae M-J., Zhao Z., Ogiwara H., Totsuka M., Shimizu M., Anti-inflammatory effect of chlorogenic acid on the IL-8 production in Caco-2 cells and the dextran sulphate sodium-induced colitis symptoms in C57BL/6 mice, Food Chemistry 168 (2015), s. 167-175 74. Luan H., Kan Z., Xu Y., Lv Ch., Jiang W., Rosmarinic acid protects against experimental diabetes with cerebral ischemia: relation to inflammation response, Journal of Neuroinflammation 10:28 (2013) 75. Yang E-J., Ku S-K., Lee W., Lee S., Lee T., Song K-S., Bae J-S., Barrier Protective Effects of Rosmarinic Acid on HMGB1- Induced Inflammatory Responses In Vitro and In Vivo, Journal of Cellular Physiology 228 (2013), s. 975-982 76. Govindaraj J., Pillai S. S. Rosmarinic acid modulates the antioxidant status and protects pancreatic tissues from glucolipotoxicity mediated oxidative stress in high-fat diet: streptozotocin-induced diabetic rats, Molecular and Cellular Biochemistry 404 (2015), s.143-159 77. Chu X., Ci X., He J., Jiang L., Wei M., Cao Q., Guan M., Xie X., Deng X., He J., Effects of a Natural Prolyl Oligopeptidase Inhibitor, Rosmarinic Acid, on Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice, Molecules 17 (2012), s. 3586-3598 78. Rocha J., Eduardo-Figueira M., Barateiro A., Fernandes A., Brites D., Bronze R., Duarte C. M. M., Serra A. T., Pinto R., Freitas M., Fernandes E., SilvaLima B., Mota-Filipe H., Sepodes B., Anti-inflammatory Effect of Rosmarinic Acid and an Extract of Rosmarinus officinalis in Rat Models of Local and Systemic Inflammation, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 116 (2015), s. 398-413 79. Fan Y. T., Yin G..J, Xiao W.Q., Qiu L., Yu G., Hu Y. L., Xing M., Wu D. Q., Cang X. F., Wan R., Wang X. P., Hu G. Y.. Rosmarinic acid attenuates sodium taurocholate-induced acute pancreatitis in rats by inhibiting nuclear factor-κB activation, The American Journal of Chinese Medicine 43 (2015), s. 1117-35 80. Nunes S., Madureira R., Campos D., Sarmento B., Gomes A.M., Pintado M., Reis F.,Therapeutic and Nutraceutical Potential of Rosmarinic Acid – Cytoprotective Properties and Pharmacokinetic Profile,Critical Reviews in Food Science and Nutrition (2015), DOI: 10.1080/10408398.2015.1006768 248 Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych 81. Kim G. D., Park Y. S., Jin Y. H., Park C. S., Production and applications of rosmarinic acid and structurally related compounds, Applied Microbiology and Biotechnology 99(5) (2015), s. 2083-92 82. Huang N., Hauck C., Yum M-Y., Rizshsky L., Widrlechner M. P., McCoy JA., Murphy P. A., Dixon P. M., Nikolau B. J., Birt D. F., Rosmarinic Acid in Prunella vulgaris Ethanol Extract Inhibits Lipopolysaccharide-Induced Prostaglandin E2 and Nitric Oxide in RAW 264.7 Mouse Macrophages, Journal Agricultural and Food Chemistry 57 (2009), s. 10579-10589 83. Boonyarikpunchai W., Sukrong S., Towiwat P., Antinociceptive and antiinflammatory effects of rosmarinic acid isolated from Thunbergia laurifolia Lindl., Pharmacology, Biochemistry and Behavior 124 (2014), s. 67-73 84. Chagas-Paula D. A., de Oliveiraa R. B., da Silva V. C., Gobbo-Neto L., Gasparotoc T. H., Campanellic A. P., Faccioli L. H., Da Costaa F. B., Chlorogenic acids from Tithonia diversifolia demonstrate better antiinflammatory effect than indomethacin and its sesquiterpene lactones, Journal of Ethnopharmacology 136 (2011), s. 355-362 85. Park S-Y., Hwang J-S., Jang M., Lee S. H., Park J-H., Han I-O., A novel caffeic acid-1-piperonylpiperazine hybridization compound HBU-47 inhibits LPS-mediated inflammation in RAW264.7 macrophage cells, International Immunopharmacology 19 (2014), s. 60-65 86. Pittalà V., Salerno L., Romeo G., Siracusa M. A., Modica M. N., Romano G. L., Salomone S., Drago F., Bucolo C., Effects of novel hybrids of caffeic acid phenethyl ester and NSAIDs on experimental ocular inflammation, European Journal of Pharmacology752 (2015), s. 78-83 87. Kim E. O., Min K. J., Kwon T. K., Um B. H., Moreau R. A., Choi S. W., Antiinflammatory activity of hydroxycinnamic acid derivatives isolated from corn bran in lipopolysaccharide-stimulated Raw 264.7 macrophages, Food and Chemical Toxicology 50 (2012), s. 1309-1316 88. Du W-Y., Chang Ch., Zhang Y., Liu Y-Y., Sun K., Wang Ch-S., Wang M-X., Liu Y., Wang F., Fan J-Y., Li P-T., Han J-Y., High-dose chlorogenic acid induces inflammation reactions and oxidative stress injury in rats withoutimplication of mast cell degranulation, Journal ofEthnopharmacology147(2013), s. 74-83 89. Rocha L. D., Monteiro M. C., Teodoro A. J., Anticancer properties of hydroxycinnamic acids – a review, Cancer and Clinical Oncology 1 (2012), s. 109-121 90. Su P., Shi Y., Wang J., Shen X., Zhang J., Anticancer agents derived from natural cinnamic acids, Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry 15 (2015), s. 980-987 91. Karthikeyan S., Kanimozhi G., Prasad N. R., Mahalakshmi R., Radiosensitizing effect of ferulic acid on human cervical carcinoma cells in vitro, Toxicology in Vitro 25 (2011), s. 1366-1375 92. Dodurga Y., Eroğlu C., Seçme M., Elmas L., Avcı Ç.B., Şatıroğlu-Tufan N. L., Anti-proliferative and anti-invasive effects of ferulic acid in TT medullary thyroid cancer cells interacting with URG4/URGCP, Tumour Biology 2015 (artykuł w druku) 249 Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak 93. Eroğlu C., Seçme M., Bağcı G., Dodurga Y., Assessment of the anticancer mechanism of ferulic acid via cell cycle and apoptotic pathways in human prostate cancer cell lines, Tumor Biology 2015; doi:10.1007/s13277-015-3689-3 94. Yang G.-W., Jiang J.-S., Lu W.-Q., Ferulic acid exerts anti-angiogenic and anti-tumor activity by targeting fibroblast growth factor receptor 1-mediated angiogenesis, International Journal of Molecular Sciences 16 (2015), s. 24011-24031 95. Choi Y. E., Park E., Ferulic acid in combination with PARP inhibitor sensitizes breast cancer cells as chemotherapeutic strategy, Biochemical and Biophysical Research Communications 458 (2015), s. 520-524 96. Fahrioğlu U., Dodurga Y., Elmas L., Seçme M., Ferulic acid decreases cell viability and colony formation while inhibiting migration of MIA PaCa-2 human pancreatic cancer cells in vitro, Gene (2015) artykuł w druku 97. Manoharan S., Rejitharaji T., Prabhakar M. M., Manimaran A., Singh R. B., Modulating effect of ferulic acid on NF-κB, COX-2 and VEGF expression pattern during 7,12-Dimethylbenz(a)anthracene induced oral carcinogenesis, The Open Nutraceuticals Journal 7 (2014), s. 33-38 98. Wang J.-M., Sheng Y.-C., Ji L.-L., Wang Z.-T., Ferulic acid prevents liver injury and increases the anti-tumor effect of diosbulbin B in vivo, Journal of Zhejiang University SCIENCE B 15 (2014), s. 540-547 99. Prasad N. R., KarthikeyanA., Karthikeyan S., Reddy B. V., Inhibitory effect of caffeic acid on cancer cell proliferation by oxidative mechanism in human HT-1080 fibrosarcoma cell line, Molecular and Cellular Biochemistry 349 (2011), s. 11-19 100. Zambonin L., Caliceti C., Dalla Sega F. V., Fiorentini D., Hrelia S., Landi L., Prata C., Dietary phenolic acids act as effective antioxidants in membrane models and in cultured cells, exhibiting proapoptotic effects in leukaemia cells, Oxidative Medicine and Cell Longevity (2012), doi:10.1155/2012/839298 101. Sen A., Atmaca P., Terzioglu G., Arslan S., Anticarcinogenic effect and carcinogenic potential of the dietary phenolic acid: o-coumaric acid, Natural Product Communications 8 (2013), s. 1269-1274 102. Kong C.-S., Jeong C.-H., Choi J.-S., Kim K.-J., Jeong J.-W., Antiangiogenic effects of p-coumaric acid in human endothelial cells, Phytotherapy Research 27 (2013), s. 317-323 103. Yang J. S., Liu C. W., Ma Y. S., Weng S. W., Tang N. Y., Wu S. H., Ji B. C., Ma C. Y., Ko Y. C., Funayama S., Kuo C. L., Chlorogenic acid induces apoptotic cell death in U937 leukemia cells through caspase- and mitochondria-dependent pathways, In Vivo 26 (2012), s. 971-978 104. Liu Y.-J., Zhou C.-Y, Qiu C.-H., Lu X.-M., Wang Y.-T. Chlorogenic acid induced apoptosis and inhibition of proliferation in human acute promyelocytic leukemia HL-60 cells, Molecular Medicine Reports 8 (2013), s. 1106-1110 105. Park J. J., Hwang S. J., Park J.-H., Lee H.-J., Chlorogenic acid inhibits hypoxia-induced angiogenesis via down-regulation of the HIF-1α/AKT pathway, Cellular Oncology 38 (2015), s. 111-118 250 Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych 106. Yan Y., Li J., Han J., Hou N., Song Y., Dong L., Chlorogenic acid enhances the effects of 5-fluorouracil in human hepatocellular carcinoma cells through the inhibition of extracellular signal-regulated kinases, Anti-Cancer Drugs 26 (2015), s. 540-546 107. Alcaraz M., Alcaraz-Saura M., Achel D. G., Olivares A., López-Morata J.A., Castillo J. Radiosensitizing effect of rosmarinic acid in metastatic melanoma B16F10 cells, Anticancer Research 34 (2014), s. 1913-1921 108. Sharmila R., Manoharan S., Anti-tumor activity of rosmarinic acid in 7,12dimethylbenz(a)anthracene (DMBA) induced skin carcinogenesis in Swiss albino mice. Indian Journal of Experimental Biology (50) 2012, s. 187-194 109. Nasr Bouzaiene N., Kilani Jaziri S., Kovacic H., Chekir-Ghedira L., Ghedira K., Luis J., The effects of caffeic, coumaric and ferulic acids on proliferation, superoxide production, adhesion and migration of human tumor cells in vitro, European Journal of Pharmacology (2015) doi: 10.1016/j.ejphar.2015.09.044 110. Tsai C. M., Yen G. C., Sun F. M., Yang S. F., Weng C. J., Assessment of the anti-invasion potential and mechanism of select cinnamic acid derivatives on human lung adenocarcinoma cells, Molecular Pharmaceutics 10 (2013), s. 1890-1900 111. Li Y., Jiang F., Chen L., Yang Y., Cao S., Ye Y., Wang X., Mu J., Li Z., Li L., Blockage of TGFα-SMAD2 by demethylation-activated miR-148a is involved in caffeic acid-induced inhibition of cancer stem cell-like properties in vitro and in vivo, FEBS Open Bio 5 (2015) 466-475 112. Skórka K., Giannopoulos K., Budowa i funkcje jądrowego czynnika transkrypcyjnego NF kappa B (NF-κB) oraz jego znaczenie w przewlekłej białaczce limfocytowej, Acta Haematologica Polonica 43 (2012) 54-62 113. Ozturk G., Ginis Z., Akyol S., Erden G., Gurel A., Akyol O., The anticancer mechanism of caffeic acid phenethyl ester (CAPE): review of melanomas, lung and prostate cancers, European Review for Medical and Pharmacological Sciences 16 (2012), s. 2064-2068 114. Akyol S., Ozturk G., Ginis Z., Armutcu F., Yigitoglu M. R., Akyol O., In vivo and in vitro antıneoplastic actions of caffeic acid phenethyl ester (CAPE): therapeutic perspectives, Nutrition and Cancer 65 (2013), s. 515-526 115. Omene C., Kalac M., Wu J., Marchi E., Frenkel K., O’Connor O. A., Propolis and its active component, caffeic acid phenethyl ester (CAPE), modulate breastcancer therapeutic targets via an epigenetically mediated mechanism of action, Journal of Cancer Sciences and Therapy 5 (2013), s. 334-342 116. Ketabforoosh H. E., Amini M., Vosooghi M., Shafee A., Azizi E., Kobarfard F. Synthesis, evaluation of anticancer activity and QSAR study of heterocyclic esters of caffeic acid, Iranian Journal of Pharmaceutical Research 12 (2013), s. 705-719 117. Eom T. K., Senevirathne M., Kim S. K., Synthesis of phenolic acid conjugated chitooligosaccharides and evaluation of their antioxidant activity, Environmental Toxicology and Pharmacology 2 (2012), s. 519-527 118. Lee S.J., Kang M.-S., Oh J.-S., Na H.S., Lim Y.J., Jeong Y.-I., Lee H.-C., Caffeic acid-conjugated chitosan derivatives and their anti-tumor activity, Archives of Pharmacal Research 36 (2013), s. 1437-1446 251 Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak 119. Lee S. J., Choi K. C., Kang M. S., Oh J. S., Jeong Y. I., Lee H. C., Selforganized nanoparticles of caffeic acid cConjugated polysaccharide and its anticancer activity, Journal of Nanoscience and Nanotechnology 15 (2015), s. 1130-1134 120. Peng W., Wu J. G., Jiang Y. B., Liu Y. J., Sun T., Wu N., Wu C. J., Antitumor activity of 4-O-(2″-O-acetyl-6″-O-p-coumaroyl-β-D-glucopyranosyl)-pcoumaric acid against lung cancers via mitochondrial-mediated apoptosis, Chemico-Biological Interactions 233 (2015), s. 8-13 121. Chen H. Z., Chen Y. B., Lv Y. P., Zeng F., Zhang J., Zhou Y. L., Li H. B., Chen L. F., Zhou B. J., Gao J. R., Xia C. N., Synthesis and antitumor activity of feruloyl and caffeoyl derivatives, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 24 (2014), s. 4367-4371 122. Dikmen G., Güney G., Genç L., Characterization of solid lipid nanoparticles containing caffeic acid and determination of its effects on MCF-7 cells, Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery 10 (2015), s. 224-232 123. Kim H.-J., Ryu K., Kang J.-H., Choi A.-J., Kim T., Oh J.-M., Anticancer activity of ferulic acid-inorganic nanohybrids synthesized via two different hybridization routes, reconstruction and exfoliation-reassembly, The Scientific World Journal (2013) doi:10.1155/2013/421967 124. Naso L. G., Valcarcel M., Roura-Ferrer M., Kortazar D., Salado C., Lezama L., Rojo T., González-Baró A. C., Williams P. A., Ferrer E. G., Promising antioxidant and anticancer (human breast cancer) oxidovanadium(IV) complex of chlorogenic acid. Synthesis, characterization and spectroscopic examination on the transport mechanism with bovine serum albumin, Journal of Inorganic Biochemistry 135 (2014), s. 86-99 125. Lewandowska U., Gorlach S., Owczarek K., Hrabec E., Szewczyk K., Synergistic Interactions Between Anticancer Chemotherapeutics and Phenolic Compounds and Anticancer Synergy Between Polyphenols, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej 68 (2014), s. 528-540 126. Dębska S., Kubicka J., Czyżykowski R., Habib M., Potemski P., Inhibitory PARP – podstawy teoretyczne i zastosowanie kliniczne, Postepy Higieny i Medycyny Doświadczalnej 66 (2012), s. 311-321 127. Choi Y. E., Park E., Ferulic acid in combination with PARP inhibitor sensitizes breast cancer cells as chemotherapeutic strategy, Biochemical and Biophysical Research Communications 458 (2015), s. 520-524 128. Thakkar A., Chenreddy S., Wang J., Prabhu S., Ferulic acid combined with aspirin demonstrates chemopreventive potential towards pancreatic cancer when delivered using chitosan-coated solid-lipid nanoparticles, Cell & Bioscience (2015) doi:10.1186/s13578-015-0041-y 129. Eitsuka T., Tatewaki N., Nishida H., Kurata T., Nakagawa K., Miyazawa T., Synergistic inhibition of cancer cell proliferation with a combination of α-tocotrienol and ferulic acid, Biochemical and Biophysical Research Communications 453 (2014), s. 606-611 252 Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych W literaturze znaleźć można wiele informacji na temat biologicznej aktywności związków polifenolowych, głównie flawonoidów. Mniej poznaną grupą związków pozostają natomiast roślinne kwasy fenolowe, w tym kwasy hydroksycynamonowe. W ostatnich latach wzrasta jednak znacząco zainteresowanie naukowców tymi związkami. Najnowsze dane dostarczają informacji na temat przeciwutleniającego, przeciwzapalnego oraz przeciwnowotworowego działania fenolokwasów. Szeroki zakres działania biologicznego, jak również możliwość modulowania i zwiększania farmakologicznej aktywności fenolokwasów sprawia, że związki te stały się przedmiotem wielu badań biomedycznych. New trends in biomedical research on hydroxycinnamic acids Current literature provides a lot of information about biological activity of polyphenolic compounds, mainly flavonoids. Plant phenolic acids, including hydroxycinnamic acids (hydroxycinnamates), remain a less known group of compounds. However, scientific interest in these compounds has increased significantly in recent years. The newest data provide information on antioxidant, anti-inflammatory and anti-tumor activities of phenolic acids. These compounds have become subjects of numerous biomedical investigations owing to a broad range of biological action as well as the possibility of modulation and enhancement of their pharmacological activity. 253 Aleksandra Kruk1, Agnieszka Gadomska-Gajadhur2, Paweł Ruśkowski3 Wpływ prekursorów porów na morfologię membran półprzepuszczalnych przeznaczonych do hodowli komórkowych 1. Wstęp Hodowle komórkowe w ostatnich latach zyskały bardzo dużą popularność w naukach medycznych oraz przyczyniły się do rozwoju inżynierii tkankowej, dziedziny, której głównym celem jest regeneracja uszkodzonych, trudno odnawiających się tkanek. Przez wiele lat tradycyjne badania in vitro, dotyczące komórek prowadzono wykorzystując modele dwuwymiarowe. Komórki były hodowane w podłożach mikrobiologicznych umieszczonych na płytkach, szlakach Petriegolub w podłożu płynnym. Wraz z upływem czasu zaczęto się zastanawiać nad słusznością tych badań. Stwierdzono, że warunki jakie panują w hodowlach płaskich znacznie odbiegają od tych, które występują w tkance. W modelach tych nie dochodzi do interakcji międzykomórkowe, jakie mają miejsce w rzeczywistości w przestrzeni trójwymiarowej. Oddziaływania te są odpowiedzialne za wzajemną komunikację komórek w obrębie jednej tkanki, jak i sąsiadujących oraz za dostarczanie odpowiednich substancji odżywczych, czy cząsteczek sygnałowych niezbędnych do wzrostu. Na tej podstawie stwierdzono, że tkankę należy traktować jako skomplikowaną, trójwymiarową sieć połączeń, w której kluczowym elementem jest struktura przestrzenna. Ponadto dowiedziono, że komórki wyhodowane w modelach 2D mają zmieniony wzrost, metabolizm i ekspresję genów, w porównaniu do komórek wyhodowanych naturalnie. To wszystko spowodowało, że zaczęto poszukiwać metod hodowli komórek oddających możliwie jak najlepiej trójwymiarową strukturę tkanki. Jedną z technik pozwalających na prowadzenie hodowli 3D, są 1 [email protected], Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział Chemiczny, Politechnika Warszawskaprzypisie zachowujemy zasadę od komórki organizacyjnej najniższego stopnia do wyższych 2 [email protected], Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział Chemiczny, Politechnika Warszawska 3 [email protected], Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział Chemiczny, Politechnika Warszawska 254 Wpływ prekursorów porów na morfologię membran półprzepuszczalnych przeznaczonych do hodowli komórkowych rusztowania polimerowe, znane również pod angielskojęzyczną nazwą Scaffolds. Rusztowania te stanowią przestrzenną sieć wzajemnie połączonych ze sobą porów, której głównym zadaniem jest fizyczne utrzymanie komórekw przestrzeni [1‚4]. Rusztowania do hodowli komórkowych mają często formę membran półprzepuszczalnych. Oznacza to, że do ich wnętrza mogą jedynie przedostawać się cząstki o określonym, maksymalnym rozmiarze. Z tej przyczyny do hodowli określonego typu komórek, membrana musi posiadać pory o danej wielkości, występujące nie tylko we wnętrzu, ale także i na powierzchni. W przeciwnym przypadku, komórki nie dostaną się do środka rusztowania, pozostaną na jego powierzchni, czyli powstanie hodowla 2D. Do wytwarzania rusztowań wykorzystuje się przede wszystkim polimery, zarówno pochodzenia naturalnego, jak i syntetyczne oraz ulegającelub nieulegające biodegradacji. Wśród polimerów syntetycznych często wykorzystywanym jest polilaktyd (PLA). Jest to alifatyczny poliester pozyskiwany ze źródeł odnawialnych (kukurydza, trzcina cukrowa). Zbudowany jest z połączonych ze sobą liniowo cząsteczek kwasu mlekowego (LAc).LAcwystępuje w postaci dwóch enancjomerów, w wyniku czego mogą powstawać polimery różniące się konfiguracją centrów chiralnych, o odmiennych właściwościach fizycznych (Rysunek 1). Polilaktydhomochiralny, zbudowany jedynie z cząsteczek kwasu L- lub D-mlekowego (PLLA, PDLA) charakteryzuje się wysoką wytrzymałością mechaniczną oraz długim czasem biodegradacji, wzrastającym wraz z masą molową polimeru. Inne właściwości ma polilaktydheterochiralny, zawierający w strukturze oba enancjomery kwasu mlekowego. Jest on bardziej elastyczny oraz ulega szybszej degradacji. Przez organizm przyswajalny jest jedynie izomer kwasu L-mlekowego. Enancjomer o konfiguracji D może odkładać się w ustroju, powodując w konsekwencji jego zakwaszenie. Z tych względów największe znaczenie w zastosowaniu farmaceutycznym ma PLLA o małej masie molowej oraz PLA z kilkuprocentowym dodatkiem centrów o konfiguracji D. Polilkatyd jest polimerem biodegradowalnym, który ulega w organizmie enzymatycznemu, dwuetapowemu rozkładowi. W pierwszym etapie następuje hydroliza PLA do oligomerów kwasu mlekowego, które następnie są przekształcane w cyklu kwasu cytrynowego do dwutlenku węgla i wody [5‚9]. 255 Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski H3C H H CH3 OH OH HO HO O O kwas D-mlekowy kwas L-mlekowy Rysunek 1.Enancjomery kwasu mlekowego Innymi popularnymi,biodegradowlnymi polimerami syntetycznymi są poliε-kaprolakton, poliglikolid oraz ich kopolimery (także z PLA). Spośród polimerów nieulegających biodegradacji, stosuje się m.in.polisulfon oraz polieterosulfon. W inżynierii tkankowej stosuje się także polimery naturalne tj. chitozan, elastyna, kolagen czy kwas hialuronowy. Związki te oprócz tego, że stanowią materiał budujący rusztowanie, to również mogą być substancjami odżywczymi dla komórek, co jest ich niewątpliwą zaletą. Mimo to, nie są one najlepszym materiałem do wytwarzania rusztowań,ze względu na niższą wytrzymałość mechaniczną w porównaniu do polimerów syntetycznych. Ponadto są one niestabilne w warunkach zmiany temperatury oraz odczynu środowiska, co stwarza poważne problemy technologiczne. Zaletą polimerów syntetycznych w porównaniu do naturalnych, jest możliwość sterowana czasem degradacji rusztowania, poprzez dobieranie odpowiedniej długości łańcucha polimerowego [10‚13]. Istnieje wiele technik otrzymywania rusztowań komórkowych. Jedną z nich jest metoda inwersji faz (Rysunek 2). Charakteryzuje się ona łatwością i prostotą wykonania. Ponadto nie wymaga skomplikowanej aparatury, co z kolei nie generuje wysokich kosztów inwestycyjnych. Ograniczenia tej techniki to przede wszystkim konieczność dokładnej kontroli warunków otoczenia oraz ryzyko pozostałości rozpuszczalników i prekursorów porów. Metoda ta polega na wylaniu roztworu polimeru membrantwórczego na obojętny podkład (np. szklaną płytkę), równomiernym rozprowadzeniu, a następnie zanurzeniu w kąpieli żelującej, składającej się z nierozpuszczalnika polimeru [14, 15]. Wariantem tej metody jest dodatek prekursora porów (Rysunek 3), którego zadaniem jest wniknięcie między łańcuchy polimeru i odkształcenie tam porów. Na końcu procesu prekursor usuwa się ze struktury membrany, poprzez wypłukanie (w kąpieli żelującej lub w dodatkowej kąpieli płuczącej). Jako prekursory porów stosuje się głównie kryształy soli nieorganicznych (np. NaCl, LiCl, LiF) oraz polimery tj. poliwinylopirolidon (PVP) czy poli(glikol etylenowy) (PEG). Oprócz wyżej wymienionych polimerowych substancji porotwórczych, popularny jest także trójblokowy 256 Wpływ prekursorów porów na morfologię membran półprzepuszczalnych przeznaczonych do hodowli komórkowych kopolimerpoli (oksyetylen-b-oksypropylen-b-oksyetylen), znany pod handlową nazwą Pluronic®.Dzięki swej amfifilowej budowie zwiększa on hydrofilowość membran, co obniża ryzyko foulingu białkowego (zapychania porów związkami białkowymi, występującymi w organizmach) [14, 16]. Rysunek 2. Metoda inwersji faz [15] Rysunek 3. Metoda inwersji faz z zastosowaniem prekursora porów [16] 2. Cel pracy Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu dodatku prekursorów porów takich jak: PVP, Pluronic® oraz NaCl, na morfologię membran półprzepuszczalnych przeznaczonych do hodowli komórkowych. 3. Materiały i metody W badaniach użyto poli-L-laktydo Mn 86 000 g/mol (Nature Works NW 2003D), PVP o Mn 10 000 g/mol (Sigma Aldrich, Pluronic® f127) Mn3 600 g/mol(Sigma Aldrich) oraz NaCl (Cenos). Użytymi rozpuszczalnikami były: chloroform (cz.d.a. POCh SA)i metanol (cz.d.a. POCh SA). Wodę destylowaną otrzymano we własnym zakresie. Przygotowanie roztworów Roztwory PLLA w chloroformieo stężeniu 6%wagotrzymano, poprzez rozpuszczanie polimeru przez 24h w rozpuszczalniku organicznym (ChCl3). Podczas rozpuszczania poli-L-laktydu zapewniono ciągłe mieszanie, przy użyciu mieszadła magnetycznego bez grzania. Roztwory zawierające prekursory porów otrzymano w analogiczny sposóbz tą różnicą, że po całkowitym rozpuszczeniu PLLA, dodano substancje porotwórcze 257 Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski w stosunku wagowym 1:1 do poli-L-laktydu. W przypadku mieszanin prekursorów porów stosunek wagowy substancji w roztworze wynosił 10:5:5 (PLLA:prekursor1:prekursor2). Po dodaniu prekursorów porów, mieszanie kontynuowano przez kolejne 24 h. W przypadku NaCl, kryształy soli przed dodaniem do roztworu membranotwórczego, rozdrobniono za pomocą moździerza i przesiano przy użyciu sit mikrobiologicznych, po czym zebrano frakcję o rozmiarze <70 µm. Otrzymanie membran polilaktydowych Membrany otrzymano metodą inwersji faz. Sporządzone roztwory wylano na szklany podkład, a następnie rozprowadzono po całej powierzchni. Po uformowaniu roztworu, membranę żelowano wmetanolu. Z membran otrzymanych z dodatkiem polimerowych prekursorów porów (PVP, Pluronic®), substancje te usunięto jeszcze w kąpieli żelującej, gdyż oba te polimery rozpuszczają się w metanolu. W przypadku membran otrzymanych z dodatkiem NaCl, sól usunięto poprzez zastosowanie kąpieli płuczącej, składającej się z wody destylowanej. Podobnie postąpiono z membranami otrzymanymi z wykorzystaniem NaClwraz z PVP (obie substancje rozpuszczają się w wodzie). Po wyżelowaniu polimeru membranotwórczego i usunięciu substancji porotwórczych, membrany wysuszono na powietrzu. Metody analityczne Morfologię otrzymanych membran zbadano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (ang. Scanning Electron Microscopy, SEM) Hitachi TM1000. Próbki membran przed badaniem zanurzono w etanolu, a następnie połamano w ciekłym azocie. Po wysuszeniu, próbki membran pokryto warstwą złota 7-10 nm przy użyciu aparatu K550X Sputter Coater. Pokryte złotem próbki badano w różnych powiększeniachpod napięciem przyspieszania 15 kV. 4. Wyniki W Tabeli 1 przedstawiono morfologię membran z poli-L-laktydu otrzymanych bez dodatku prekursorów porów.Można zaobserwować, że powierzchnia I zawiera nieliczne, bardzo małe pory (poniżej 5 µm) oraz lekkie pofałdowania. W przełomie (wnętrzu) membrany występują liczne, małe pory których średnica wynosi około 10-15 µm. Na powierzchni II obserwuje się pory przykryte cienką warstwą naskórkową, uniemożliwiającą dostęp do wnętrza membrany, a więc powierzchnię tą można traktować jako litą. 258 Wpływ prekursorów porów na morfologię membran półprzepuszczalnych przeznaczonych do hodowli komórkowych Tabela 1. Morfologia membran otrzymanych bez dodatku prekursorów porów powierzchnia I przełom powierzchnia II W Tabeli 2 przedstawiono morfologię membran, otrzymanych z dodatkiem PVP jako prekursora porów. Na powierzchni I obecne pory mają rozmiar (średnicę) 5-20µm, dodatkowo pomiędzy nimi występują małe pory, przykryte warstwą naskórkową. Wnętrze membrany jest silnie porowate. Najmniejsze pory, których rozmiar wynosi 10-15 µm występują w samym środku przełomu. Wraz ze zbliżaniem się do obu powierzchni ich rozmiar wzrasta i osiąga średnicę 30-50 µm. Na powierzchni II pory są duże, ich średnica wynosi 20-50 µm. Należy jednak zauważyć, że porowatość obu powierzchni jest niewielka. Tabela 2. Morfologia membranotrzymanych z dodatkiem PVP jako prekursora porów powierzchnia I przełom powierzchnia II W Tabeli 3 zamieszczono membranę, otrzymaną z dodatkiem Pluronic®. Powierzchnia I nie zawiera porów. Podobnie jest w przypadku powierzchni II. Co prawda widoczne są na niej pory, lecz są przykryte cienką warstwa naskórkową, który czyni ją praktycznie nieprzepuszczalną. Pory w przełomie są rozmieszone bardzo nieregularnie, ich średnica waha się od 10 do 60 µm. Ponadto, można zaobserwować także skupiskabardzo małych porów, których rozmiar wynosi kilka µm. 259 Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski Tabela 3. Morfologia membranotrzymanych z dodatkiem Plurtonic® jako prekursora porów powierzchnia I przełom powierzchnia II W Tabeli 4 przedstawiono membranę, otrzymaną z zastosowaniem NaCl, będącego prekursorem porów. Powierzchnia I zawiera bardzo nieliczne pory, rzędu 15-40 µm oraz pofałdowania. Wnętrze membrany posiada pory o średnicy 10-15 µm, między którymi występują większe, o rozmiarze 30-40 µm. Przy jednej z powierzchni można zaobserwować bardzo duże pory, których wielkość przekracza 100 µm. Powierzchnia II jest bardzo nieregularna i zwiera pory o średnicy 10-20 µm Tabela 4. Morfologia membranotrzymanych z dodatkiem NaCl jako prekursora porów powierzchnia I przełom powierzchnia II W Tabeli 5 zamieszczono membranę, otrzymaną z dodatkiem PVP i Pluronic® jako prekursorów porów. Na powierzchni I są obecne pory ośrednicy 10-15 µm, pomiędzy którymi występują bardzo małe pory (kilka µm), w większości pokryte warstwą naskórkową. W silnie porowatym przełomie pory mają przeważnie średnicę 10-15 µm, przy czym pomiędzy nimi występują większe, o rozmiarze 30-50 µm. Przy powierzchni II jest najwięcej tych ostatnich porów, poza tym występują też nieregularnie rozmieszczonepory rzędu 10-40 µm. 260 Wpływ prekursorów porów na morfologię membran półprzepuszczalnych przeznaczonych do hodowli komórkowych Tabela 5. Morfologia membranotrzymanych z dodatkiem PVP oraz Plurtonic® jako prekursora porów powierzchnia I przełom powierzchnia II W Tabeli 6 znajdują sięobrazy membrany, otrzymanej z zastosowaniem NaCl oraz PVP jako prekursorów porów. PowierzchniaI posiada rzadko występujące pory o średnicy 10-20 µm. W samym środku przełomu obecne są pory o rozmiarze około 5 µm, między którymi znajdują się większe, o średnicy sięgającej 15-25 µm. Wraz zezbliżaniem się do obu powierzchni, wewnętrzumembrany pojawiają się pory o średnicy 30-80 µm. Powierzchnia II posiada dość licznie występujące pory o rozmiarze 15-30 µm. Tabela 6. Morfologia membranotrzymanych z dodatkiem NacCloraz PVP jako prekursora porów powierzchnia I przełom powierzchnia II 5. Dyskusja Membrany otrzymane bez dodatku prekursorów porów, wykazują dużą porowatość przełomu (Tabela 1). Jedna z powierzchni zawiera nieliczne pory, natomiast druga jest lita. Taka morfologia uniemożliwia wniknięcie komórek do wnętrza membrany. W przypadku membran otrzymanych z dodatkiem PVP obserwuje się występowanie porów na obu powierzchniach (Tabela 2). Dodatkowo, pory 261 Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski występujące w przełomie, zwłaszcza przy powierzchniach, mają większy rozmiar, w porównaniu do membrany otrzymanej bez dodatku PVP. W przypadkach, w których substancją porotwórczą jest Pluronic®, obie powierzchnie są pozbawione porów (Tabela 3). Przełom jest silnie porowaty, przy czym występujące pory są małych rozmiarów. Zastosowanie NaCl sprzyja powstawaniu bardzo dużych porów we wnętrzu membrany, które są nieregularnie rozmieszczone pomiędzy porami o małych średnicach (Tabela 4). Pory o największych rozmiarach są rozłożone wzdłuż jednej z powierzchni. Mimo dobrej porowatości przełomu, obie powierzchnie membran mają za mało porów. Dodatek dwóch prekursorów porów jednocześnie (PVP oraz Pluronic®) sprzyja powstawaniu porów, szczególnie na jednej z powierzchni(Tabela 5). Ponadto w przełomie membrany, oprócz małych porów, pojawiają się także posiadającewiększe średnice. Użycie NaCl wraz z PVP (Tabela 6) znacznie zwiększyło porowatość, szczególnie jednej z powierzchni. W przełomie, wzdłuż obydwu powierzchni pojawiły się pory o bardzo dużych średnicach. Należy jednak zauważyć, że przełom membrany zawiera także pory o bardzo niewielkich rozmiarach. Spośród prezentowanych przykładów, najkorzystniejszą morfologię z punktu widzenia prowadzenia hodowli komórkowych, posiada membrana otrzymana z wykorzystaniem PVP oraz Pluronic®, jako prekursorów porów. W membranie tej jedna z powierzchni wykazuje porowatość stwarzającą szanse na wniknięcie komórek do wnętrza. Z kolei druga z nich ma mało porów, co może zapobiegać „wypadaniu” komórek ze struktury membrany. Jednak do prowadzenia wydajnej hodowli komórkowej, wymagane są membrany o regularnie rozmieszczonych,większych porach w przełomie (20-40 µm) oraz o zwiększonej porowatości jednej z powierzchni,czego nie stwierdzono w membranach zamieszczonych wprezentowanych wynikach.Membrana otrzymana z dodatkiem NaCl oraz PVP,charakteryzuje się dużą porowatością jednej z powierzchni. Jednak pory występujące w jej przełomie są zbyt małe by móc zmieścić komórki. 6. Podsumowanie i wnioski Spośród zbadanych substancji, najkorzystniejszy wpływ na porowatość oraz wielkość porów, mają mieszaniny prekursorów porów, a szczególnie PVP wraz z Pluronic®. Substancje te zwiększają wielkość porów występujących w przełomie membran do około 50 µm oraz sprzyjają powstawaniu porów na jednej z powierzchni. Zaprezentowane w niniejszej pracy wyniki dostarczają informacji, które wskazują kierunek prowadzenia dalszych badań nad otrzymywaniem membran, służących do prowadzenia wydajnych i efektywnych hodowli komórkowych. 262 Wpływ prekursorów porów na morfologię membran półprzepuszczalnych przeznaczonych do hodowli komórkowych Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Grolik M., Inżynieria tkankowa-nowe narzędzie w rekonstrukcji tkanek, Zeszyty Naukowe Towarzystwa Doktorantów UJ Nauki Ścisłe, 3 (2011), s. 33-40 Kruk A., Gadomska-Gajadhur A., Ruśkowski P., Zastosowanie bioresorbowalnych rusztowań w inżynierii tkankowej, Wydawnictwo Tygiel (2015), s. 91-102 Ma P. X., Scaffolds for tissue fabrication, Materials Today, 7 (2004), s. 30-40 Gadomska-Gajadhur A., Kruk A., Ruśkowski P., Synoradzki L., Wpływ dodatku porofora na morfologię skafoldów polilaktydowych. TEMPO s.c., (2015), s. 294-297 Nowak B., Pająk J., Biodegradacja polilaktydu (PLA), Archiwum Gospodarki Odpadami i Ochrony Środowiska,12 (2010), s. 1-10 Gupta A. P., Kumar V., New emerging trends in synthetic biodegradable polymers Polylactide: a critique, European Polymer Journal, 43 (2007), s. 4053-4074 Gadomska A., Warych I., Ruśkowski P., Synoradzki L., Otrzymywanie nanosfer polilaktydowych,Przemysł Chemiczny, 93(2014), s.1311-1314 Gadomska A., Mierzejewska J., Ruśkowski P, Synoradzki L., Otrzymywanie sfer polilaktydowych zawierających paracetamol, Przemysł Chemiczny, 10 (2015), s. 1676-1678 Kruk A., Gadomska-Gajadhur A., Ruśkowski P., Przybysz A., Bijak V., Synoradzki L., Optymalizacja otrzymywania sfer poliaktydowych zawierających neomycynę z wykorzystaniem matematycznych metod planowania doświadczeń, Przemysł Chemiczny, w druku Ko H. F., Sfeir C., Kumta P. N., Novel synthesis strategies for natural polymer and composite biomaterials as potential scaffolds for tissue engineering, Philosophical Translations of the Royal Society A: Mathematical, Physical & Engineering Sciences, 368 (2009), s. 1981-1997 Kawazoe N., Creation of novel materials for tissue regeneration as next generation medical technology, National Institute for Materials Science, on-line (2012) Kim H. J., Kim K. K., Park I. K., Hybrid Scaffolds Composed of Hyaluronic Acid and Collagen for Cartilage Regeneration, Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 9 (2012), s. 57-62 Yang C. R., Di Chen J., Preparation and biological evaluation of chitosancollagen-icariin composite scaffolds for neuronal regeneration, Neurological Sciences, 34 (2013), s. 941-947 Chwojnowski A., Półprzepuszczalne membrany polisulfonowe, Warszawa: Zespół Wydawniczo – Poligraficzny IBIB PAN, 2011 Wen Y., Lian F., Ren Y., Guan H., Enhanced electrochemical properties of a novel polyvinyl formal membrane supporting gel polymer electrolyte by Al2O3 modification, Journal of polymer science part b polymer physics, 52 (2014), s.572-577 Lan Levengood S., Zhang M., Chitosan-based scaffolds for bone tissue engineering, Journal of Materials Chemistry B, 2 (2014),s. 3161-3184 263 Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski Wpływ prekursorów porów na morfologię membran półprzepuszczalnych przeznaczonych do hodowli komórkowych Hodowle komórkowe są ważnym aspektem inżynierii tkankowej, dziedziny której głównym celem jest wspomaganie regeneracji uszkodzonych, trudnoodnawiających się tkanek. Elementem, który znacznie zwiększa wydajność hodowli tkankowych są rusztowania komórkowe, będące fizycznym, trójwymiarowym podłożem. Jedną z form rusztowań są membrany półprzepuszczalne. W niniejszej pracy przedstawiono doświadczalne wyniki otrzymywania membran, których przeznaczeniem są hodowle komórkowe. Zbadano wpływ wybranych substancji porotwórczych (PVP, Pluronic® oraz NaCl) na morfologię otrzymanych membran. Na podstawie przeprowadzonych badań wytypowano substancje, stwarzające możliwości otrzymania membran o pożądanej porowatości i wielkości porów. Effect of pore precursors on the morphology of the semi-permeable membranes for cell cultures Cell cultures are important aspect of tissue engineering (TE). TE is a field whose main aim is to support regeneration of damaged, difficult to regeneration tissues. The scaffolds are the main and the latest issue of this science. Scaffolds are medium for cell culture characterized by a highly developed, three-dimensional spatial structure. One forms of scaffolds are semi-permeable membranes. Experimental results of the preparation of semi-permeable membranes for cell cultures were obtained. The effect of pore precursors (polyvinylpyrrolidone, Pluronic® and NaCl) on the morphology of the membranes was studied. The studies were selected substances which gave the largest porosity of membranes. 264 Bartosz Sikora1, Aleksandra Skubis2, Małgorzata Kimsa3 Ekspresja markerów molekularnych ABCG2 oraz P63 w świńskich epitelialnych komórkach macierzystych rąbka rogówki 1. Wprowadzenie Ślepota rogówkowa to zaburzenie, z którym na całym świecie żyje około 10 milionów osób. Jest to dysfunkcja wywołana uszkodzeniami fizycznymi, chemicznymi, ale również biologicznymi tj. zakażeniami wirusowymi i bakteryjnymi. Jedną ze stosowanych metod leczenia są przeszczepy rogówki. Jednak liczba transplantacji nadal jest niewystarczająca w odniesieniu do liczby chorych [1, 2, 3]. Nabłonek rogówki jest tkanką posiadającą właściwości samoodnowy [4]. Dlatego w przypadku uszkodzeń wyłącznie jednej rogówki stosuje się często metodę polegającą na wykorzystaniu komórek rąbka rogówki zdrowego oka [2]. Rąbek rogówki to obszar obejmujący cienką przezroczystą warstwę komórek znajdującą się pomiędzy rogówką, a twardówką oka. Warstwa ta bogata jest w epitelialne komórki macierzyste rąbka rogówki (LESCs ang. limbalepithelialstemcells), których zadaniem jest odnawianie sprawności i funkcjonalności rogówki. W przypadku komórek rąbka rogówki stwierdzono, że posiadają one wolne tempo cyklu komórkowego oraz niski wskaźnik mitotyczny [3]. Pomimo wielu zalet przeszczepu autologicznego metoda ta ma pewne ograniczenia. Jednym z nich jest ryzyko uszkodzenia rogówki prawidłowej w momencie pobrania fragmentów rąbka rogówki. W efekcie może to doprowadzić do obuocznej ślepoty [1]. Wśród powikłań obserwuje się zwłóknienie rogówki, rozrost nieprawidłowego nabłonka i mikrouszkodzenia [3]. 1 [email protected], Katedra i Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, www.sum.edu.pl 2 [email protected], Katedra i Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, www.sum.edu.pl 3 [email protected], Katedra i Zakład Biochemii, Wydział Lekarski, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, www.sum.edu.pl 265 Bartosz Sikora, Aleksandra Skubis, Małgorzata Kimsa Jednak dzięki rozwojowi medycyny regeneracyjnej istnieje szansa na terapię do tej pory nieuleczalnych schorzeń rogówki. Jedną z takich metod może być wykorzystanie komórek LESCs. Potwierdzono między innymi, żekomórki macierzyste mają zdolność do migracji w kierunku uszkodzonych miejsc i różnicowania w określony typ komórek w odpowiedzi na warunki środowiska w jakim się znajdują [3]. Głównym problemem wykorzystania komórek macierzystych jest problem ich identyfikacji. Bardzo często pewne typy komórek macierzystych nie posiadają w pełni sprecyzowanych markerów, w tym równieżLESCs. Komórki rogówki posiadają dwa charakterystyczne białka. Są to cytokeratyny: cytokeratyna-3 (CK3) i cytokeratyna-12 (CK12). Należy zaznaczyć, że cytokeratyna-3 jest białkiem charakterystycznym dla już zróżnicowanych komórek nabłonkowych rogówki. Stąd też może ona być wykorzystywana jako marker negatywny LESCs [4]. Obecnie profil markerów komórek macierzystych rąbka rogówki opiera się na obecności białek: p63, ABCG2, integryny-9 i braku ekspresji e-kadheryny, koneksyny-43, inwolukryny, a także cytokeratyny-3 i cytokeratyny-12 [5, 6]. Ważnym czynnikiem mającym wpływ na możliwości wykorzystania komórek macierzystych rąbka rogówki są warunki w jakich są hodowane in vitro. Konieczne jest zachowanie przez jak najdłuższy czas ich wzrostu, proliferacji i potencjału zróżnicowania. W zależności od typu pożywki komórki te wykazują różne fenotypy i zmienną ekspresję markerów specyficznych. Oznacza to, że optymalizacja procesu hodowli jest jednym z ważniejszych celów medycyny regeneracyjnej z wykorzystaniem LESCs. W zależności od przeznaczenia wykorzystania komórek rąbka rogówki inne czynniki muszą być dodawane do pożywek w celu szybszego procesu różnicowania lub też jego zahamowania [7]. W związku z poważnym deficytem rogówek ludzkich do przeszczepów rozważa się wykorzystanie komórek macierzystych rogówki pochodzących od zwierząt. Badania wykazały, że kompatybilnym zamiennikiem rogówki ludzkiej może być rogówka świńska. Bardzo często rogówki pobierane od dawców ludzkich mają słabą zdolność proliferacji ze względu na zawansowany wiek dawców. Jeżeli rogówki te byłyby pobierane od młodych świń transgenicznych wtedy zdolności regeneracyjne tego narządu były by też dużo większe [8]. Jednak do tego celu konieczna jest całkowicie powtarzalna identyfikacja pobieranych komórek do ksenotransplantacji. 2. Cel pracy Niniejsza praca miała na celu zidentyfikowanietranskryptów markerów powierzchniowych p63 oraz ABCG2 metodą QRT-PCR w epitelialnych komórkach macierzystych rąbka rogówki (LESCs)świni. 266 Ekspresja markerów molekularnych ABCG2 oraz P63 w świńskich epitelialnych komórkach macierzystych rąbka rogówki 3. Materiały i metody Źródłem materiału biologicznego poddanego analizie były świnie domowe (łac. Sus scrofa)poddane modyfikacji genetycznej. Transgeneza obejmowała wyciszenie antygenu galaktozylotransferazy lub wprowadzenie ludzkiego antygenu fukozylotransferazy. Badany materiał obejmował tkanki pochodzące ze świń zawierających losową ze wskazanych powyżej modyfikacji genetycznych. Ze świńex vivo pobierano gałki oczne i na czas dalszej preparatyki, przechowywano je w rozworze PBS (ang. phosphate-bufferedsaline; Lonza, Basel, Switzerland) z dodatkiem antybiotyków: amfoterycyny B, penicyliny i streptomycyny. Z gałek ocznychmetodami mikrochirurgii okulistycznej wypreparowywano fragmenty rąbka rogówki usytuowanego po obu biegunach gałki ocznej. W kolejnym etapie otrzymane fragmenty rozdrabniano z wykorzystaniem skalpela w celu uzyskania kawałków o rozmiarze około 2 mm2. Tkankę wysiewano na naczynia hodowlane w liczbie 2-3 kawałki na jeden dołek hodowlany, w płytkach 6-cio dołkowych (Nunc, Wiesbaden, Germany). W ten sposób rozmieszczone kawałki rąbka rogówki odstawiono naczas prawidłowego przywarcia do podłoża, pod komorą z laminarnym przepływem powietrza (od 15 do 20 minut). Przywarte kawałki tkanki następnie zalewano pożywką standardową DMEM (Dulbecco'sModifiedEagle Medium) z dodatkiem 10% FBS (bydlęca surowica płodowa, ang. fetalbovine serum) oraz 25 mg / 100 ml antybiotyku – gentamycyny (Lonza, Basel, Switzerland) i wstawiono do inkubatora (Direct Heat CO2 Incubator, ThermoScientific, Waltham, MA).Epitelialne komórki macierzyste rąbka rogówki były hodowane w atmosferze wzbogaconej dwutlenkiem węgla do całkowitego stężenia 5%, w temperaturze 37°C. Hodowlę obserwowano z wykorzystaniem mikroskopu odwróconego (Olympus IX81, Shinjuku, Tokyo, Japan). Badania zostały przeprowadzone za zgodą Komisji Bioetycznej. Liczba komórek i ich żywotność była monitorowanametodą zliczania komórek w komorze Bürker’astosując wybarwianie roztworem 0,2% błękitu trypanu (BiologicalIndustries, BeitHaEmek, Israel). Komórki były hodowane aż do czasu osiągnięcia całkowitej konfluencji i następnie pasażowane.Podczas pasażu wysiewano do nowych naczyńpo około 10 x 104 żywych komórek na dołek. Hodowlę zakończono po drugim pasażu. Do dokumentacji fotograficznej wykorzystano kamerę DP70 (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan) (Rysunek 1). Całkowity RNA został wyekstrahowany z osadu komórkowego wykorzystując odczynnik TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ekstrakty całkowitego RNA w celu oczyszczenia traktowano DNazą I (MBI Fermentas, Vilinus, Lithuania), zgodnie z instrukcją zamieszczoną przez 267 Bartosz Sikora, Aleksandra Skubis, Małgorzata Kimsa producenta. Jakość ekstraktów była weryfikowana elektroforetycznie stosując 0,8% żel agarozowy z dodatkiem bromku etydyny. Wyniki analizowano oraz dokumentowano wykorzystując system dokumentacji żeli 1D Bas-Sys (Biotech-Fisher, Perth, Australia). Stężenie kwasów nukleinowych zostało określone wykorzystując spektrofotometr RNA/DNA GeneQuant II (Pharmacia Biotech, Cambridge, UK). Rysunek 1. Epitelialne komórki macierzyste rąbka rogówki w naczyniu hodowlanym (pow. 4x). Ciemny obiekt w lewym-górnym rogu – fragment rąbka rogówki [opracowanie własne] W celu identyfikacji transkryptówmarkerów molekularnych p63 oraz ABCG2 zastosowano ilościową łańcuchową reakcję polimerazy w czasie rzeczywistym (QRT-PCR) z wykorzystaniem barwnika SYBR Green (SYBR Green Quantitect RT-PCR Kit, Qiagen) oraz aparatu Opticon™ DNA Engine ContinuousFluorescencedetector (MJ Research) zgodnie z procedurą opisaną wcześniej (Strzałka i in. 2008). Wszystkie próby powtarzano trzykrotnie. ACTB (beta-aktyna) została użyta jako wewnętrzna kontrola endogenna amplifikacji. Startery oligonukleotydowe specyficzne dla genów: p63 i ABCG2 zostały zaprojektowane w oparciu o sekwencje referencyjne (GenBankaccession No. XM_003483293.2, NM_214010.1) z wykorzystaniem oprogramowania PrimerExpressTM Version 2.0 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) (Tabela 1). Profil termiczny jednego cyklu reakcji RT-PCR był następujący: odwrotna transkrypcja w temperaturze 50˚C przez 30 min, denaturacja w temperaturze 95˚C przez 15 min. 40 cykli reakcji składało się z następujących po sobie temperatur i odstępów czasowych: 94˚C przez 15 s, 60˚C przez 30 s, i 72˚C przez 30 s. Analiza 268 Ekspresja markerów molekularnych ABCG2 oraz P63 w świńskich epitelialnych komórkach macierzystych rąbka rogówki każdej próbki była zakończona wyznaczeniem krzywej topnienia w celu potwierdzenia specyficzności produktu i wykluczenia powstania dimerów starterów. Produkty RT-PCR zostały rozdzielone na 6% żelu poliakrylamidowym i wybarwione solami srebra. Przeprowadzono analizę statystyczną wykorzystując program do analiz Statistica 10.0 (StatSoft Tulsa, Oklahoma, USA). W analizie statystycznej zastosowano poziom istotności p<0,05. Miarą aktywności transkrypcyjnej badanych genów była liczba cząsteczek mRNA przeliczona na 1 g całkowitego RNA.Wyniki przedstawiono za pomocą mediany (Me) wraz z kwartylemgórnym i kwartylem dolnym, oraz wartościami minimum i maksimum. W celu wyznaczenia różnic w ekspresji transkryptówp63 i ABCG2 wykorzystano test U manna-Whitney’a. Tabela 1. Charakterystyka starterów wykorzystanych do reakcji RT-PCR Sekwencja starterów Gen p63 ABCG2 ACTB Forward:5’GGAATGAACCGCCGTCCAA3’ Reverse:5’CGAGACTTGCTGCTTCCTGATGC3’ Forward:5’TGGGTCTGGATAAAGTGGCCG3’ Reverse:5’GGAGTCTAAGCCAGTCGTGGGC3’ Forward:5’TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA3’ Reverse:5’CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3’ Długość produktu(bp) Tm(oC) 153 82 152 80 295 85 Źródło: Opracowanie własne 4. Analiza wyników Badaniu molekularnym w kierunku poziomu ekspresji markerów molekularnych ABCG2 oraz p63 poddano 12 osadów komórkowych. 8 osadów stanowiło materiał zebrany po zakończeniu pasażu 0. Kolejne 6 osadów komórkowych stanowiło materiał zebrany po zakończeniu pasażu 2. Przy pomocy testu Shapiro-Wilka zbadano zgodność rozkładu z rozkładem normalnym (Tabela 2) 269 Bartosz Sikora, Aleksandra Skubis, Małgorzata Kimsa Tabela 2. Test normalności rozkładu Shapiro-Wilka Marker molekularny Materiał badany W p ABCG2 pasaż 0 0,983 0,975 p63 pasaż 0 0,962 0,825 ABCG2 pasaż 2 0,740 0,016 p63 pasaż 2 0,779 0,037 Źródło: Opracowanie własne Wobec niespełnienia w pełni założeń dotyczących normalności rozkładu zmiennych dla zmiennej ABCG2 i p63 pasaż 2 do wykazania różnic w wartościach pomiędzy badanymi zmiennymi zastosowano test U Manna -Whitney’a (Tabela 3) Tabela 3. Test U Manna-Whitney'a Marker molekularny p ABCG2 0,045 p63 0,001 Źródło: Opracowanie własne Wykazano istotną statystycznie zwiększoną liczbę kopii mRNA ABCG2/μg RNA w komórkach LESCsw pasażu 2 (Rysunek 2). 270 Ekspresja markerów molekularnych ABCG2 oraz P63 w świńskich epitelialnych komórkach macierzystych rąbka rogówki Rysunek 2. Wykres pudełkowy przedstawiający stosunek ekspresji markera ABCG2 w zależności od czasu hodowli [opracowanie własne] Wynik pomiaru dla poziomu ekspresji genu p63 był odwrotny w stosunku do ABCG2 i wykazał istotne statystycznie zmniejszenie ekspresji w pasażu 2 (Rysunek 3). Rysunek 3. Wykres pudełkowy przedstawiający stosunek ekspresji markera p63 w zależności od czasu hodowli [opracowanie własne] Wyniki pomiarów przedstawiono w tabeli 4. 271 Bartosz Sikora, Aleksandra Skubis, Małgorzata Kimsa Tabela 4. Statystyki opisowe badanych prób Marker Pasaż Mediana Min. Maks. Kwartyl-D Kwartyl-G Odch.std ABCG2 0 7359,02 3348,51 11550,00 5203,36 8897,02 2629,28 p63 0 267118,90 39340,00 489778,40 128973,46 331062,65 149834,75 ABCG2 2 11840,00 6719,82 13710,00 9584,81 12430,00 2752,95 p63 2 855,46 605,61 1510,51 689,20 1215,00 379,73 Źródło: Opracowanie własne 5. Dyskusja Ksenotransplantacja wiąże się z dużym ryzykiem odrzucenia wszczepianej tkanki. W przeciwieństwie do ksenotransplantacji, problem odrzutu przeszczepu allogenicznego wydaje się być rozwiązany poprzez zastosowanie terapii odpowiednimi lekami immunosupresyjnymi. Jednak w przypadku wykorzystania klinicznego ksenograftów zagrożenie odrzutem przeszczepu jest znacznie większe. Tkanki obcego gatunku posiadają znacznie więcej czynników zagrażających ludzkiemu organizmowi. Przeszczepienie niedostosowanych tkanek może wiązać się z natychmiastową ostrą reakcją odrzutu. Jest to spowodowane występowaniem odmiennej budowy układu dopełniacza [11]. Aby narządy, tkanki lub komórki pochodzące z obcego organizmu mogłyby zostać wykorzystane w celach leczniczych, konieczne jest dostosowanie ich do właściwego przyjęcia przez ludzki organizm. Świnia domowa (łac. Sus scrofa) gabarytami organów oraz wydolnością fizjologiczną jest bardzo bliska ludzkiemu ciału. Ze względu na to ten gatunek zwierząt staje się głównym obiektem zainteresowań jako źródło tkanek do przeszczepu [11]. Nietolerancję organów, tkanek lub komórek świni domowej przez ludzki organizm można wyeliminować poprzez wykorzystanie technik biotechnologicznych, które pozwalają na wprowadzenie zmian w genomie świni. Wykonywane modyfikacje genetyczne zwierząt skupiają się na trzech kierunkach. Jednym z nich jest wyłączenie genu warunkującego powstawanie antygenu αGal (α1,3-galaktozylotransferaza). Drugim, wprowadzanie do świńskiego genomu genów człowieka regulujących system dopełniacza, do których zaliczamy czynnik CD46, CD55 oraz CD59 oraz trzecim modyfikowanie białek powierzchniowych komórek dawcy: α1,2-fukozyotransferazy, α2,6-sjalilotransferazy, α2,3-sjalilotransferazy, α-galaktozydazy [11]. 272 Ekspresja markerów molekularnych ABCG2 oraz P63 w świńskich epitelialnych komórkach macierzystych rąbka rogówki Zagrożenie niosą także inne uwarunkowania. Doniesienia z ostatnich lat wskazują na obecność retrowirusów endogennych wbudowanych na stałe w genom każdego gatunku ssaków. Świńskie retrowirusy endogenne (PERVs – ang. porcine endogenous retroviruses) są wirusami zasiedlającymi genom świni domowej. Podobnie jak HERV (ang. human endogenous retroviruses) dla człowieka, retrowirusy te nie są patogenne dla organizmu świni. Należy jednak zapytać czy PERVpo dostaniu się do organizmu człowieka, nie staną się dla niego przyczyną poważnych powikłań [11, 12] Ocena bezpieczeństwa ksenotransplantacji między innymi sprowadza się do diagnostyki molekularnej w kierunku występowania różnych subtypówPERV, co ma na celu ustalenie jak duże ich stężenie występuje w tkance oraz czy posiada subtyp tworzący groźny dla człowieka rekombinant [13]. Ocena bezpieczeństwa badanych komórek pod względem zawartości PERV stanowiła oddzielne badania, które są w trakcie publikacji. Kontynuując analizę przydatności świńskich epitelialnych komórek macierzystych, w niniejszej pracy wykonano wstępną analizę mającą na celu identyfikację markerów powierzchniowych LESCs. Otrzymane wyniki potwierdzają, że uzyskane w hodowli komórki stanowią pule komórek macierzystych rąbka rogówki. Analiza statystyczna wykazała, że ekspresja badanych markerów zmienia się w zależności od czasu trwania hodowli. Uzyskane wyniki jednoznacznie wskazują na to, że po drugim pasażu tych komórek wzrasta poziom ekspresji ABCG2. Czas otrzymania osadu komórek pochodzących z drugiego pasażu od momentu założenia hodowli pierwotnej obejmował około 4 tygodni hodowli. ABCG2 (CD338) jest genem kodującym białko będące transporterem błonowym, należącym do rodziny białek G. Jest białkiem wiążącym kasetę ATP i zalicza się do białek transportujących (ABC) [14]. ABCG2 jest obecny w tkankach nabłonkowych, dlatego stanowi marker dla LESCs. Obecność ABCG2 jest konieczna dla utrzymania właściwego fenotypu komórek i zaburzenie jego ekspresji może wpłynąć na zmniejszenie populacji komórek lub zaburzyć przynależność do danej linii komórkowej. ABCG2 uważa się za białko odpowiedzialne za utrzymanie macierzystości komórek i zachowanie ich w stanie niezróżnicowanym [15]. Wzrost ekspresji tego markera w drugim pasażu hodowli wskazuje na uruchomienie mechanizmów pozwalających na utrzymanie stanu niezróżnicowania. Drugi badany marker molekularny stanowi białko kodowane przez gen p63 (TP63). Jest to czynnik transkrypcyjny zaangażowany w procesy morfogenetyczne. Obecność p63 jest charakterystyczna dla tkanek epitelialnych i jest zdefiniowanym markerem epitelialnych komórek macierzystych rąbka rogówki. Poziom ekspresji p63 wskazuje na 273 Bartosz Sikora, Aleksandra Skubis, Małgorzata Kimsa aktywność procesu proliferacji i świadczy o żywotności komórek. Zaproponowany nowy model białka p63 określa je jako „strażnik” kontrolujący przejście komórki na drogę zaprogramowanej śmierci. Wykazano, że brak ekspresji tego białka powoduje apoptozę komórek epitelialnych rąbka rogówki [16, 17]. Zaobserwowany silny spadek ekspresji p63 w uzyskanych wynikach może świadczyć zatem o wejściu hodowanych komórek na drogęprogramowanejśmierci. Wstępna analiza poziomu ekspresji markerów molekularnych ABCG2 i p63 w hodowli pierwotnej świńskich epitelialnych komórek macierzystych rąbka rogówki, toruje drogę dla dalszych analiz. Ustalenie poziomów ekspresji większej liczby markerów definiujących LESCs pochodzących od świni domowej oraz weryfikacja na poziomie translacji pozwoli na dokładniejsze poznanie procesów zachodzących na różnych etapach hodowli, a to z kolei przyczyni się do optymalizacji jej warunków i zwiększenia jej wydajności. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Zhang J., Huang C., Feng Y., Li Y., Wang W., Comparison of beneficial factors for corneal wound-healing of rat mesenchymal stem cells and corneal limbal stem cells on the xenogeneic acellular corneal matrix in vitro, Mol Vis. 2012;18:161-73. Epub 2012 Jan 20 Yao L., Bai H., Review: mesenchymal stem cells and corneal reconstruction, Mol Vis. 2013 Nov 7;19:2237-43. eCollection 2013 Acar U., Pinarli F. A., Acar D. E., Beyazyildiz E., Sobaci G., Ozgermen B. B., Sonmez A. A., Delibasi T., Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Res. 2015;53(2):82-9. doi: 10.1159/000368659. Epub 2015 Jan 20 Sun T. T., Lavker R. M., Corneal epithelial stem cells: past, present, and future, J InvestigDermatolSymp Proc. 2004 Sep;9(3):202-7 Figueira E. C., Di Girolamo N., Coroneo M. T., Wakefield D., The phenotype of limbal epithelial stem cells, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007 Jan;48(1):144-56 Li F., Zhao S. Z., Mesenchymal stem cells: Potential role in corneal wound repair and transplantation, World J Stem Cells. 2014 Jul 26;6(3):296-304 Loureiro R. R., Cristovam P. C., Martins C. M., Covre J. L., Sobrinho J. A., Ricardo J. R., Hazarbassanov R. M., Höfling-Lima A. L., Belfort R. Jr, Nishi M., Gomes J. Á., Comparison of culture media for ex vivo cultivation of limbal epithelial progenitor cells, Mol Vis. 2013;19:69-77 Lamm V., Hara H., Mammen A., Dhaliwal D., Cooper D. K.,Corneal blindness and xenotransplantation, Xenotransplantation, 2014 MarApr;21(2):99-114 Nieto-Miguel T., Calonge M., de la Mata A., López-Paniagua M., Galindo S., de la Paz M. F., Corrales R. M., A comparison of stem cell-related gene expression in the progenitor-rich limbal epithelium and the differentiating central corneal epithelium, Mol Vis. 2011;17:2102-17 274 Ekspresja markerów molekularnych ABCG2 oraz P63 w świńskich epitelialnych komórkach macierzystych rąbka rogówki 10. Nakatsu M. N., González S., Mei H., Deng S. X., Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014 Oct 2;55(10):6953-9 11. Smorąg Z., Słomski R., Jura J. i in., Transgeniczne świnie jako dawcy tkanek i narządów do transplantacji u ludzi, Przegląd hodowlany (2011) nr 11: 1-4 12. Gemeniano M., Mpanju O., Salomon D. R. et al., The infectivity and host range of the ecotropic porcine endogenous retrowirus, PERV-C, is modulated by residues in the C-terminal region of its surface envelope protein, Virology 346(2006): 108-117 13. Kimsa M. C., Strzałka-Mrozik B., Kimsa M. W., Porcine endogenous retroviruses in xenotransplantation – molecular aspects, Viruses 201413;6(5): 2062-83 14. Leccia F., Del Vecchio L., Mariotti E., Di Noto R., Morel A. P., Puisieux A., Salvatore F., Ansieau S., ABCG2, a novel antigen to sort luminal progenitors of BRCA1- breast cancer cells, Molecular cancer. 2014 Sep 12;13:213 15. Szabó D. J., Noer A., Nagymihály R., Josifovska N., Andjelic S., Veréb Z., Facskó A., Moe M. C., Petrovski G., Long-Term Cultures of Human Cornea Limbal Explants Form 3D Structures Ex Vivo – Implications for Tissue Engineering and Clinical Applications, PLoS One. 2015 Nov 18;10(11):e0143053 16. Das P., Pereira J. A., Chaklader M., Law A., Bagchi K., Bhaduri G., Chaudhuri S., Law S., Phenotypic alteration of limbal niche-associated limbal epithelial stem cell deficiency by ultraviolet-B exposure-induced phototoxicity in mice, Biochemistry and Cell Biology, 2013 Jun;91(3):165-75 17. López-Paniagua M., Nieto-Miguel T., de la Mata A., Galindo S., Herreras J. M., Corrales R. M., Calonge M., Consecutive expansion of limbal epithelial stem cells from a single limbal biopsy, CurrentEyeResearch, 2013 May;38(5):537-49 275 Bartosz Sikora, Aleksandra Skubis, Małgorzata Kimsa Ekspresja markerów świńskich epitelialnych komórek macierzystych rąbka rogówki Ślepota spowodowana zaburzeniami funkcji rogówki nadal stanowi poważny problem medyczny. Pomimo rozwoju medycyny regeneracyjnej, nie ma skutecznej metody leczenia dwustronnego niedoboru komórek macierzystych rąbka rogówki. Występuje niedobór rogówek dla przeszczepów. Alternatywnym rozwiązaniem może być wykorzystanie świńskich komórek rogówki. Opublikowane prace wskazują na to, ze ksenotransplantacja rogówki pochodzącej od świni może zostać wykorzystana klinicznie. Antygen Gal jest odpowiedzialny za indukcję reakcji przeszczep przeciw gospodarzowi. Udowodniono, że antygen Gal jest praktycznie nieobecny w świńskiej rogówce. LESCs (ang. limbalepithelialstemcells) są komórkami wyizolowanymi z rąbka rogówki. Cienka warstwa pomiędzy rogówką a twardówką oka jest miejscem, które jest bogate w te komórki. Komórki te odgrywają potężną rolę w naturalnej rekonstrukcji uszkodzonej rogówki. Są odpowiedzialne za właściwą wydajność tej części oka. Niestety nie ma w pełni określonych markerów powierzchniowych LESCs. Część badań sugeruje, że cytokeratyna-3 (CK3), cytokeratyna-12 (CK12), ABCG-2 charakteryzują epitelialne komórki macierzyste rąbka rogówki. Innym ważnym markerem jest białko P63, kodowane przez gen TP63, które jest obecne w tkankach epitelialnych. Pomimo problemów w identyfikacji, innym problemem jest oczyszczenie i hodowla tych komórek w warunkach in vitro. Przyszłe badania mogą poprawić obecną wiedzę na temat LESCs, a to z kolei może pozwolić na wykorzystanie tych komórek macierzystych w terapii. W tych badaniach przedstawiamy wyniki poziomu ekspresji dwóch markerów molekularnych sugerowanych przez literaturę. Ekspresję TP63, ABCG-2 zmierzono dzięki metodzie QRT-PCR w komórkach macierzystych rąbka rogówki zebranych z hodowli in vitro. Komórki były hodowane w standardowej pożywce DMEM z dodatkiem 10% FBS. The expression of porcine limbal epithelial stem cells markers. Blindness caused by disorders of cornea function are still serious problem of medicine. Despite development of regenerative medicine there is no treatment for bilateral limbal stem cell deficiency. There is lack of corneal allografts for transplantation. Alternative solution might be use of porcine corneal cells. Published papers showed that xenotransplantation of cornea obtained from pigs could be used for clinical applications. Gal antigens are responsible for induction of graft versus host reaction. It was proven that Gal antigen is almost absent in porcine cornea. LESCs are cells insulated from corneal limbus. The thin layer between cornea and sclera of eye is the rich place of stem cells. Those cells play a huge role in cornea reconstruction. They are responsible for proper efficiency of that part of eye. Unfortunately, there are not fully specified surface markers of LESCs. Some research suggests that cytokeratin-3 (CK3), cytokeratin-12 (CK12), ABCG-2 characterize limbal epithelial stem cells. Another significant marker is protein P63 encoded by TP63 gene, which is present in epithelial tissues. Despite problems with identification, another problem is to purify and culture them at in vitro conditions. Future research may improve present knowledge about LESCs and thus, this will allow to use them in stem cells therapy. In this study we present the results of two molecular markers expression suggested by literature. The expression of TP63 and ABCG-2 was examined by the use of QRT-PCR method in limbal epithelial stem cells collected from in vitro culture. Cells were cultivated in standard medium DMEM with 10% of fetal bovine serum. 276 Magdalena Antonowicz1, Anita Kajzer2, Magdalena Grygiel-Pradelok3 Dobór własności mechanicznych elementów stabilizatora zewnętrznego do leczenia kurzej klatki piersiowej 1. Wstęp Deformacje klatki piersiowej od lat stanowią istotny problem leczniczy. Do zniekształceń wrodzonych klatki piersiowej występujących najczęściej zalicza się klatkę lejkowatą, zwaną również szewską oraz rzadziej występującąklatkę kurzą [1]. Pierwotną przyczynątego typu zniekształceń mogą być zmiany spowodowane wrodzonymi nieprawidłowościami układu mięśni przyczepiających się i kształtujących klatkę piersiową. Według Willitala deformacje klatki piersiowej można sklasyfikować graficznie, wyróżniając 11 typów (rys.1) [2]: typ I: symetryczna lejkowata klatka piersiowa (rys. 1a); typ II: asymetryczna lejkowata klatka piersiowa (rys. 1b); typ III: symetryczna płasko-lejkowata klatka piersiowa (rys. 1c); typ IV: asymetryczna płasko-lejkowata klatka piersiowa (rys. 1d); typ V: symetryczna kurza klatka piersiowa (rys. 1e); typ VI: asymetryczna kurza klatka piersiowa (rys. 1f); typ VII: symetryczna płasko-kurza klatka piersiowa (rys. 1g); typ VIII: asymetryczna płasko-kurza klatka piersiowa (rys. 1h); typ IX: kombinacja kurzej i lejkowatej klatki piersiowej (rys. 1i); typ X: aplazja żeber (rys. 1j); typ XI: rozszczep mostka (rys. 1k); odsetek występowania wszystkich typów (rys. 1l). 1 [email protected], Katedra Biomateriałów i Inżynierii Wyrobów Medycznych, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Śląska 2 [email protected],Katedra Biomateriałów i Inżynierii Wyrobów Medycznych, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Śląska 3 [email protected], Katedra Biomateriałów i Inżynierii Wyrobów Medycznych, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Śląska 277 Magdalena Antonowicz, Anita Kajzer, Magdalena Grygiel-Pradelok Rysunek 1. Deformacje klatki piersiowej wg Willitala [2] Kurza klatka piersiowa (pectus carinatum) jest deformacją przedniej ściany klatki piersiowej. Wada ta charakteryzuje się zniekształceniem mostka oraz chrząstek żebrowych, powodując wypchnięcie ich do przodu [3] (rys. 2). Rysunek 2. Deformacja klatki piersiowej: a) budowa anatomiczna kurzej klatki piersiowej [4], b) kurza klatka piersiowa męska [5] Najważniejszym oraz praktycznie jedynym wskazaniem do leczenia kurzej klatki piersiowej jest aspekt psychologiczny oraz estetyczny. Wyróżniane są trzy główne rodzaje kurzej klatki piersiowej: symetryczna, asymetryczna oraz mieszana o różnym nasileniu i miejscu występowania [3, 7]. U mężczyzn wada ta występuje czterokrotnie częściej niż u kobiet. Leczenie jest dostosowywane indywidualnie w zależności od nasilenia wady, a także od cech anatomicznych i fizjologicznych pacjenta [3]. Obecnie schorzenie to leczy się operacyjnie bądź zachowawczo. 278 Dobór własności mechanicznych elementów stabilizatora zewnętrznego do leczenia kurzej klatki piersiowej Operacyjne metody małoinwazyjne stosowane są głównie w leczeniu pacjentów przy silnie rozwiniętych wadach bądź po nieudanym leczeniu za pomocą stabilizatora zewnętrznego [8‚10]. W celu przywrócenia anatomicznego ukształtowania klatki piersiowej podczas zabiegu operacyjnego wykorzystywane są odpowiednio wyprofilowane implanty (rys. 3a) [6]. Alternatywą technik operacyjnych jest leczenie zachowawcze polegające na zastosowaniu ortotycznych stabilizatorów zewnętrznych (rys. 3b). Główną zasadą działania zewnętrznego stabilizatora jest zastosowanie przez dłuższy czas ciągłego nacisku na występujące zdeformowanie w celu wymodelowania chrząstek żebrowych. Stabilizator zewnętrzny wykorzystujepasy z klamrami otaczającymi klatkę piersiową. Posiada co najmniej dwa punkty kontaktu ze ścianami klatki piersiowej. Jeden punkt styku występuje z przodu i ma na celu dostarczania nacisku na deformację, drugi punkt występuje od strony pleców. Zakłada się, że podatna klatka piersiowa dostosowuje się do tej techniki więc stosowanie stabilizatora zewnętrznego wymaga podatności klatki piersiowej [10]. Stabilizatory ortotyczneze względu na rodzaj występującej wady są dobierane i projektowane indywidualnie dla każdego pacjenta. Ich zadaniem jest uzyskanie anatomicznego ukształtowania klatki piersiowej oraz geometrycznego wyrównania poprzez generowanie sił oddziałujących na punkty najbardziej uwypuklonego miejsca [11]. Ta metoda leczenia dedykowana jest głównie dla młodych pacjentów ze względu na plastyczność chrząstek żebrowych oraz dla pacjentów, u których wada występuje o słabym bądź umiarkowanym nasileniu. Stabilizator, jako alternatywa dla leczenia chirurgicznego przynosi pozytywne efekty lecznicze, pozwalając uniknąć pooperacyjnych powikłań, blizn oraz bólu [12, 13]. Wykorzystanie zasad mechaniki i biomechaniki w połączeniu z metodami komputerowymi pozwala na stworzenie spersonalizowanych konstrukcji stabilizatorów stosowanych w leczeniu wad kurzej klatki piersiowej. Rysunek 3. Materiały wspomagające leczenie kurzej klatki piersiowej: a) płyta stabilizująca stosowana w leczeniu operacyjnym [6], b) stabilizator zewnętrzny firmy Trulifestosowany w leczeniu zachowawczym [14] 279 Magdalena Antonowicz, Anita Kajzer, Magdalena Grygiel-Pradelok Zasadniczym celem pracy było skonstruowanie fizycznego prototypu stabilizatora zewnętrznego dla mężczyzny w wieku 24 lat. W ramach pracy przeprowadzono uproszczoną analizę wytrzymałościową elementów stabilizatora metodą elementów skończonych (MES), wceluwytypowania obszarów o największych wartościach naprężeń. Na podstawie uzyskanych wyników dobrano materiały wykorzystywane na poszczególne jego elementy, dla których w dalszej kolejności przeprowadzono badania własności wytrzymałościowych. Efektem końcowym prowadzonych badań było wytworzenie prototypu stabilizatora do leczenia kurzej klatki piersiowej. 2. Materiały stosowane do konstrukcji stabilizatora zewnętrznego Stabilizator zewnętrzny do leczenia kurzej klatki piersiowej, zwany również ortezą,zdefiniowanym w normie dotyczącej biologicznej oceny wyrobów medycznych ISO 10993-1 jest wyrobem medycznym kontaktującym się z powierzchnią skóry. Stabilizator zewnętrzny charakteryzuje się konstrukcją techniczną dopasowaną do całej lub części kończyny górnej bądź dolnej, tułowia, głowy lub karku, atakże ich pośrednich przegubów. Ma za zadanie wspomagać lub zastępować funkcje statyczne i ruchowe oraz zabezpieczać przed powstaniem lub pogłębianiem się zniekształceń. Ortezę konstruują, opracowują technicy protetycy i ortotycy zakładów ortopedycznych na podstawie indywidualnych pomiarów[15, 16]. Materiałem, który może być zastosowany do produkcji stabilizatorów zewnętrznych będący wyrobem medycznym może być każdy polimer naturalny bądź syntetyczny, metal, stop metali, ceramika lub inna substancja nieożywiona, włączając w to tkankę pozbawioną funkcji życiowych. Przy doborze materiałów, które zostaną użyte przy produkcji wyrobu, zalecane jest rozważenie przydatności do zamierzonego celu. Należy wziąć pod uwagę cechy i własności materiału, w tym: toksykologiczne, morfologiczne, mechaniczne, elektryczne, chemiczne oraz fizyczne. Zaleca się również, aby zwrócić uwagę na materiały biologiczne, przewidziane środki dodatkowe, zanieczyszczenia z procesu produkcyjnego i ich pozostałości, substancje wymywalne, produkty degradacji, inne składniki i ich interakcje w produkcie gotowym oraz własności i charakterystykę produktu końcowego ze względu na wpływ na ogólną biologiczną ocenę wyrobów [15]. Przy doborze materiałów składowych ortezy należy również wziąć pod uwagę cechy takie jak [17]: własności mechaniczne; stopień kontaktu, inwazyjności z ciałem ludzkim; okres zastosowania; możliwości wykonawcze; ekonomiczność rozwiązania. 280 Dobór własności mechanicznych elementów stabilizatora zewnętrznego do leczenia kurzej klatki piersiowej W ostatnich latach nastąpił dynamiczny rozwój metod stabilizacji zewnętrznej kurzej klatki piersiowej. Na podstawie literatury można stwierdzić, że składowe stabilizatorów wykonywane są głównie z materiałów lekkich, szyn aluminiowych oraz elementów polimerowych [18‚20]. 3. Materiały i metody 3.1. Model trójwymiarowy stabilizatora zewnętrznego Wykonanie fizycznego modelu spersonalizowanego prototypu stabilizatora zewnętrznego do leczenia kurzej klatki piersiowej wymaga precyzyjnego opracowania wieloetapowej procedury. Pierwszym, niezbędnym etapem było sformułowanie modelu geometrycznego stabilizatora zewnętrznego dla konkretnego przypadku – mężczyzna lat 24.W tym celu przeniesiono rzeczywisty kształt trójwymiarowy męskiej klatki piersiowej o prawidłowej budowie (rys. 4a) do postaci cyfrowej z wykorzystaniem ręcznego skanera HandyScan 3D Revscan oraz oprogramowaniaGeoMagic 2012, a następnie w programie InventorFusion 2012 zasymulowano kurzą klatkę piersiową, która występuje wg literatury najczęściej (typ 5 wg skali Willitala – zniekształcenie symetryczne) (rys. 4b). Rysunek 4.Model klatki piersiowej: a) o prawidłowej budowie, b) kurzej [opracowanie własne] Na podstawie zamodelowanej kurzej klatki piersiowej zaprojektowano spersonalizowany stabilizator zewnętrzny do jej leczenia. Na etapie projektowania modelu wzięto pod uwagę założenia konstrukcyjne, materiałowe (aluminium H24, polimetakrylan metylu, poliuretan oraz polipropylen), użytkowe, funkcjonalne, estetyczne, a także płeć, wiek oraz predyspozycje rekonwalescenta. Model stabilizatora zewnętrznego wykonano w programie Inventor Professional 2015.W skład stabilizatora wchodzi 13 elementów stałych oraz 2 dodatkowe. Główne elementy, które odgrywają najważniejszą rolę w konstrukcji stabilizatora to łuk przedni oraz tylni okalające klatkę piersiową,połączone za pomocą pasków zapadkowych oraz klamer umożliwiającychregulację siły nacisku 281 Magdalena Antonowicz, Anita Kajzer, Magdalena Grygiel-Pradelok stabilizatora względem zniekształcenia. Symetrycznie, na środkowej części łuku przedniego umieszczono element powodujący ucisk największego uwypuklenia kurzej klatki piersiowej,tym samym przywracając pozycję mostka do pozycji anatomicznej.Zaprojektowano ochraniające pianki mające na celu zabezpieczeniepowierzchni skóry pacjenta przed możliwym podrażnieniem przez otaczające klatkę piersiową łuki. W celu nadania estetyki zaprojektowano pokrowce, które są elementami dodatkowymi. Utrzymanie stabilizatora w pozycji prawidłowej odbywa się poprzez odpowiedni docisk realizowany przez paski zapadkowe, natomiast w celu zwiększenia stabilności zamodelowano szelki (rys. 5). 8 1 7 6 2 3 4 5 Rysunek 5. Model geometryczny stabilizatora zewnętrznego 1-pokrowiec tylni, pod nim pianka oraz łuk tylni, 2-pasek zapadkowy, 3-klamra zaciskająca, 4-Pokrowiec prawy, pod nim pianka oraz łuk przedni, 5-łuk przedni, 6-pokrowiec na element uciskający, pod nim pianka, 7-element uciskający, 8-szelki [opracowanie własne] 3.2. Analiza wytrzymałościowa Zweryfikowanie wartości własności wytrzymałościowychelementów konstrukcji stabilizatora zewnętrznego przeprowadzono za pomocą uproszczonej analizy numerycznej metodąelementów skończonych. 3.2.1. Uproszczony model Model stabilizatora zewnętrznego uproszczono do elementu łuku przedniego, elementu uciskającego oraz wkrętów mocujących ze sobą obydwie częściortezy.Dodatkowo zamodelowano kościec odcinka piersiowego klatki piersiowej o szerokości 100mm. Zbudowane modele tworzą ze sobą układ stabilizator – kość (rys. 6). 282 Dobór własności mechanicznych elementów stabilizatora zewnętrznego do leczenia kurzej klatki piersiowej Rysunek 6. Uproszczony model geometryczny stabilizatora zewnętrznego oraz łuku odcinka piersiowego klatki piersiowej [opracowanie własne] 3.2.2. Opracowanie modelu obliczeniowego oraz wyniki analizy Dyskretyzację opracowanego układu stabilizator – kość wykonano z wykorzystaniem oprogramowania ANSYS Workbench v15 i elementu typu SOLID187. Dla układu stabilizator – kość wygenerowano siatkę o wysokiej jakości wykorzystując zaawansowane metody dyskretyzacyjne, tj. generowanie siatki od wnętrza objętości oraz wysoką jejrelewancję co pozwoliło na uzyskanie siatki o skośności poniżej 0,8 co przekłada się na miarodajność wyników (rys. 7). a) c) d) b) Rysunek 7. Modele zdyskretyzowane: a) kość żebra, b) łuk stabilizatora, c) element uciskający, d) wkręty [opracowanie własne] Zakres przeprowadzonej analizy obejmował: wyznaczenie stanu przemieszczeń, odkształceń i naprężeń zredukowanych w poszczególnych elementach układu stabilizator-kość w zależności od zadanego przemieszczenia. Poszczególnym elementom nadano własności mechaniczne struktur na podstawie danych literaturowych (tab. 1) [21, 22] oraz nadano warunki 283 Magdalena Antonowicz, Anita Kajzer, Magdalena Grygiel-Pradelok brzegowe, które z odpowiednim uproszczeniem odwzorowują zjawiska zachodzące w układzie rzeczywistym. Zastosowano przemieszczenie 2,5 mm przyłożone na końcachłuku przedniego, które spowodowało przywrócenieprzedniego łuku klatki piersiowej do pozycji anatomicznej (rys. 8). Połączenie stabilizatora z kością zrealizowano poprzez nadanie kontaktów tarciowych o współczynniku tarcia μ = 0,4. F F Rysunek 8. Zadane przemieszczenie dla układu stabilizator – kość [opracowanie własne] Tabela 1. Dane materiałowe dla potrzeby analizy [21, 22] Element Moduł Younga [MPa] Liczba Poissona Kość żebra Łukprzedni stabilizatora (aluminium H24) Element uciskający (polimetakrylan metylu) Wkręty mocujące 7500 69000 2450 200000 0,3 0,33 0,375 0,3 Rysunek 9. Rozkład przemieszczeń zredukowanych dla przemieszczenia o 2,5 mm w układzie stabilizator-kośćna osi Z [opracowanie własne] 284 Dobór własności mechanicznych elementów stabilizatora zewnętrznego do leczenia kurzej klatki piersiowej a) b) c) d) Rysunek 10. Rozkład odkształceń zredukowanych dla przemieszczenia o 2,5 mm w elementach układu stabilizator-kość: a) kość żebra, b) łuk przedni, c) element uciskający, d) wkręt [opracowanie własne] a) b) c) d) Rysunek 11. Rozkład naprężeń zredukowanych dla przemieszczenia o 2,5 mm w elementach układu stabilizator-kość: a) kość żebra, b) łuk przedni, c) element uciskający, d) wkręt [opracowanie własne] 285 Magdalena Antonowicz, Anita Kajzer, Magdalena Grygiel-Pradelok Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono zróżnicowany rozkład wartości przemieszczeń, odkształceń i naprężeńzredukowanych zarówno w poszczególnych elementach stabilizatora,jak i fragmencie kości.Największa wartość przemieszczenia wystąpiław środkowej części łuku stabilizatora pod elementem uciskającym w kierunku osi „Z” i wyniosła l= 0,49 mm (rys. 9). Ponadto stwierdzono, że maksymalne odkształcenie przy przemieszczeniu o 2,5 mm zaobserwowano na zewnętrznych krawędziach elementu uciskającego,które wynosiłoεmax = 0,19 %, naprężenie natomiast ζmax = 4,67 MPa. W kości żebra odkształcenie wyniosło εmax = 0,042 %, natomiast naprężenie ζmax = 3,15 MPa. Przy tym samym przemieszczeniu zaobserwowano również maksymalne naprężenie, które wystąpiło w łuku przednim ζmax = 102,45 MPa, odkształcenie w tym miejscu wyniosło εmax= 0,14 %. We wkrętach łączących ze sobą łuk przedni oraz element uciskowy naprężenie wyniosło ζmax = 12,48 MPa, natomiast odkształcenie εmax= 0,012%(rys. 10, 11). 125 105 Kość Naprężenie, MPa 85 Łuk przedni 65 45 Element uciskając y Wkręt 25 5 -15 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 Przemieszczenie, mm Rysunek 12. Naprężenia zredukowane w elementach stabilizatora w zależności od przemieszczenia układu [opracowanie własne] Uzyskane wartości przemieszczeń świadczą o stabilności i odpowiedniej sztywności analizowanego układu. Wartości naprężeń zredukowanych w stabilizatorze dla łuku przedniego nie przekroczyły granicy plastyczności aluminium (Rp0,2= 123 MPa) (rys. 12) przy przemieszczeniu układu w zakresie 0,5 mm‚ 3,0 mm. Gwarantuje to odkształcenie elementów stabilizatora w zakresie sprężystym. Natomiast przekroczenie tej wartości następuje przy przemieszczeniu układu powyżej 3,0 mm. 286 Dobór własności mechanicznych elementów stabilizatora zewnętrznego do leczenia kurzej klatki piersiowej 3.3. Badania własności mechanicznych elementów konstrukcyjnych W celu zweryfikowania wyników analizy numerycznej wstępnie dobranych materiałów konstrukcyjnych stabilizatora (głównie na łuki okalające klatkę piersiową) przeprowadzono statyczną próbę rozciągania. Do badań wytypowano blachę aluminium H24w stanie umocnionym, o grubościach: 0,5 mm, 1,0 mm, 1,5 mm i własnościach mechanicznych przedstawionych w tabeli 2 będącą materiałem odgrywającym najważniejszą rolę w konstrukcji stabilizatora. Dodatkowo statyczną próbę rozciągania przeprowadzono dla pasków poliuretanowych zastosowanych na paski zapadkowe oraz pasy polipropylenowe na ramiączka. W celu przeprowadzenia statycznej próby rozciągania przygotowano próbki aluminium dla każdej z grubości (rys. 13) oraz próbki poliuretanowe (rys. 14) i polipropylenowe (rys. 15). Tabela 2. Własności mechaniczne blachy aluminiowej o grubości 0,5 mm, 1,0 mm, 1,5 mm [23] Własności mechaniczne dla przekroju poprzecznego Blacha 0,5 mm aluminiow 1,0 mm a 1,5 mm o grubości Wytrzymałość na rozciąganie Rm [MPa] 138,0 123,0 Granica plastyczności Rp0,2 [MPa] 127,0 116,0 129,0 123,0 Wydłużenie A50 [%] 6,4 4,3 5,2 Rysunek 13. Aluminiowe próbki do badania [opracowanie własne] Rysunek 14. Próbki pasa poliuretanowego [opracowanie własne] Rysunek 15. Próbki pasa polipropylenowego [opracowani własne] 287 Magdalena Antonowicz, Anita Kajzer, Magdalena Grygiel-Pradelok Statyczną próbę rozciągania przeprowadzono zgodnie z zaleceniami normy PN-EN ISO 6892-1 [24]. W badaniach wykorzystano maszynę wytrzymałościową firmy MTS Criterion model 45. Próba dla wszystkich trzech rodzajów próbek została przeprowadzona w temperaturze pokojowej T=23°C z prędkością rozciągania 5 mm/min. Na podstawie wyników statycznej próby rozciągania wygenerowano przykładowy wykres dla próbek 3Al_0,5, 3Al_1,0 oraz 3Al_1,5 zależności wartości siły od wartościwydłużenia(rys. 16). 2500 Siła, N 2000 1500 3Al_0,5 1000 3Al_1,0 500 3Al_1,5 0 0,0 0,2 0,5 0,7 0,9 1,2 1,4 1,6 1,9 2,1 2,3 2,6 2,8 Wydłużenie, mm Rysunek 16. Przykładowy wykres zależności siła – wydłużenie dla próbek aluminiowych [opracowanie własne] Granica plastyczności dla blachy 0,5 mm, 1,0 mm oraz 1,5 mm jest zbliżona. Próbka aluminium o grubości 1,5 mm charakteryzuje się największym odkształceniem, a jej granica plastyczności wyniosła 123MPa. Na podstawie wyników statycznej próby rozciągania pasów poliuretanowych oraz polipropylenowych stwierdzono, iż są wystarczająco wytrzymałe na elementy stabilizatora zewnętrznego. 4. Prototyp stabilizatora zewnętrznego Na podstawie procedur weryfikujących konstrukcje stabilizatora zewnętrznego, przygotowano jego składowe poprzez następujące czynności: wyciętoz blachy aluminiowej za pomocą strumienia wody elementów do wyprofilowania z nich łuków: przedniego oraz tylnego; wyciętostrumieniem wody części z polimetakrylanu metylu jako elementu uciskającego największe uwypuklenie; wycięto ręcznie pianki poliuretanowe: przednie, tylneoraz na element uciskający, ochraniających ciało przed podrażnieniem przez aluminiowe łuki; 288 Dobór własności mechanicznych elementów stabilizatora zewnętrznego do leczenia kurzej klatki piersiowej zapadkowe paski polipropylenowe oraz klamry zaciskające jako elementy gotowe, mające za zadanie przemieszczenie stabilizatora jednocześnie uciskając klatkę piersiową; wykonano dwa zestawypokrowców na elementy stabilizatora z materiału bawełnianego. W skład jednego zestawu wchodzą dwa przedniepokrowce, jeden tylni oraz pokrowiec na element uciskający. Od strony wewnętrznej pokrowca, przymocowano piankę poliuretanową, przy dolnej krawędzi przymocowano zatrzaski umożliwiające zapięcie pokrowców natomiast na krawędzi górnej wykonano szlufki w celu przymocowania szelek Wykonane zostały dwa zestawy, ze względu na możliwość ich wymiany. Pokrowiec ma za zadanie ochronę przed podrażnieniami, zachowanie higieny oraz estetyki; wykonano szelki stabilizująceo długości 60 cm z dodatkową możliwością regulacji o 30 cm oraz ich odpięcia za pomocą haczyków. Tak przygotowane składowe elementów ze sobą połączono tworząc gotowy prototyp stabilizatora zewnętrznego (rys. 17, 18). W konstrukcji stabilizatora elementami nieruchomymi są paski zapadkowe oraz klamry zaciskające. Pozostałe części mogą zostać zdemontowane w celu wymiany pokrowca bądź jego oczyszczenia. Rysunek 17. Stabilizator zewnętrzny po montażu wszystkich składowych 289 Magdalena Antonowicz, Anita Kajzer, Magdalena Grygiel-Pradelok Rysunek 18. Stabilizator zewnętrzny umieszczony na klatce piersiowej 5. Podsumowanie W przedstawionej pracy zaprezentowano najistotniejsze aspekty dotyczące problematyki leczenia kurzej klatki piersiowej za pomocą stabilizatorów zewnętrznych. Dyskomfort psychiczny wywołany przez wadę kurzej klatki piersiowej powoduje wzrost zapotrzebowania na skuteczne i szybkie metody leczenia tej wady. W ostatnich latach nastąpił dynamiczny rozwój metod stabilizacji zewnętrznej kurzej klatki piersiowej. Wpracy głównie skoncentrowano się na procedurach pozwalających na konstrukcję fizycznego modelu stabilizatora zewnętrznego męskiego – ze względu na większy odsetek zachorowań wśród mężczyzn. Trudnością w podjęciu działań konstrukcyjnych jest indywidualne uwarunkowanie anatomiczne pacjenta oraz rodzaj i nasilenie wady. Pierwszym etapem było zaprojektowanie precyzyjnego stabilizatora zewnętrznego na podstawie wykonanego modelu kurzej klatki piersiowej oraz dobrano wstępnie materiały. W celu weryfikacji prawidłowego doboru materiałów na składowe stabilizatora wykonano analizę numeryczną z wykorzystaniem metody elementów skończonych dla uproszczonego układu stabilizator – kość. Wyniki analizy numerycznej elementów układu stabilizator- kość wskazują na zróżnicowany rozkład wartości przemieszczeń, odkształceń i naprężeń zredukowanych. Przy przemieszczeniu stabilizatora w zakresie L = 0,5 mm – 3,0 mm nie przekroczono granicy plastyczności zarówno w poszczególnych jego elementach, jak i w kości żebra. Następnie na podstawie wyników statycznej próby rozciągania stwierdzono że, materiałami konstrukcyjnymi na elementy stabilizatora są: blacha aluminium o grubości 1,5 mm, paski poliuretanowe oraz pasy polipropylenowe. Wyniki analizy numerycznej metodą elementów 290 Dobór własności mechanicznych elementów stabilizatora zewnętrznego do leczenia kurzej klatki piersiowej skończonych oraz statycznej próby rozciągania materiału dobranego na łuki okalające klatkę piersiową tj. aluminium H24 wskazują,żedobrany materiał jest wytrzymały, nie narażając na odkształcenie materiału podczas stabilizacji. Szacunkowy koszt wykonanego stabilizatora wynosi 170,45 zł uwzględniając w nim materiał oraz usługi produkcyjne, natomiast koszt zewnętrznego stabilizatora do leczenia kurzej klatki piersiowej firmy Trulife wynosi około 600 zł [23]. Koszt wykonanego stabilizatora uległ czterokrotnemu zmniejszeniu. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Fibak J.,Chirurgia repetytorium, Warszawa : Wydawnictwo Lekarskie PZWL, (2004) s. 164-169 Stoba Cz., Willitala G. H., Sołtysiak P. K., Atlas chirurgii dziecięcej, Pelpin : Bernardinum, (2008) s. 31-41 Czernik J., Powikłania w chirurgii dziecięcej, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa,(2009) s. 58, 59, 330-347 http://isurgical3d.com/. [Online] Coelho M., Guimaraes P., Pecus Carinatum, The Journal Brasileiro de Pneumologia, (2007), strony 463-474 Kajzer A., Kajzer W., Dzielicki J., Matejczyk D,. The study of physicochemical properties stabilizing plates removed from the body after treatment of pectus excavantum, Acta of Bioengineering and Biomechanics, (2015), 2, strony 35-44 Fokin A. A, Steuerwald N. M., Ahrens W. A., Allen K.E., Anatomical, Histologic, and Genetic Characteristics of Congenital Chest Wall Deformities, Thoracic and Cardiovascular Surgery, Elsevier (2009), s. 44-57 Park C. H., Kim T., Haam S. J., Jeon I., Lee S., The etiology of pectus carinatum involves overgrowth of costal cartilage and undergrowth of ribs, Journal of Pediatric Surgery, (2014) (49), s. 1252-1258 Emil S., Laberge J. M., Sigalet D., Baird R., Pectus carinatum treatment in Canada: current practices, Journal of Pediatric Surgery, (2012) (47), s. 862-866 Cohee A. S., Lin J. R., Frantz F. W., Kelly R. E., Staged management of pectus carinatum, Journal of Pediatric Surgery, (2013) (48), s. 315-320 Stephenson J. T., Du Bois J., Compressive orthotic bracing in the treatment of pectus carinatum: the use of radiographic markers to predict success, Journal of Pediatric Surgery, (2008) (43), s. 1776-1780 Martinez-Ferro M., Fraire C., Bernard S., Dynamic compression system for the correction of pectus carinatum, Seminars in Pediatric Surgery, (2008) (17), s. 194-200 Desmarais T. J., Keller M. S., Pectus Carinatum, Current Opinion surgery, (2013) (25), s. 375-379 www.trulife.com[Online] Norma PN – EN ISO 10993-1 Biologiczna ocena wyrobów medycznych, s. 5-7 Norma PN-EN ISO 9999 Pomoce techniczne dla osób niepełnosprawnych. Klasyfikacja 291 Magdalena Antonowicz, Anita Kajzer, Magdalena Grygiel-Pradelok 17. Marciniak J., Biomateriały, Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, Gliwice (2013), s. 18-27, 376-402 18. Kravarusic D., Dicken B. J., Dewar R., Harder J., Poncet P., Schneider M., Sigalet D. L,. The Calgary protocol for bracing of pectus carinatum: a preliminary report, Journal of Pediatric Surgery, (2006) (41), s. 923-926 19. Kang Y., Jung J., Chung S., Cho J., Lee S., Factors affecting patient compliance with compressive brace therapy for pectus carinatum, Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery (2014) s. 1-4 20. www.oandp.com [Online] 21. Pezowicz C., Głowacki M., The mechanical properties of human ribs in young adult. Acta of bioengineering and biomechanics.2012, Tom 2, 14, strony 53-60 22. www.matweb.com [Online] 23. Inspection Certificate AssanAluminyum EN 10204-3.1 24. Norma PN-EN ISO 6892-1: Metale, Próba rozciągania, Część 1: Metoda badania w temperaturze pokojowej Dobór własności mechanicznych elementów stabilizatora zewnętrznego do leczenia kurzej klatki piersiowej Celem pracy było zaprojektowanie oraz wykonanie prototypu zewnętrznego stabilizatora do leczenia kurzej klatki piersiowej. Na podstawie wykonanego skanu 3D powierzchni skóry klatki piersiowej o prawidłowej budowie dokonano symulacji kurzej klatki piersiowej. Wykonane modele umożliwiły precyzyjne zaprojektowanie i wytworzenie spersonalizowanego stabilizatora zewnętrznego. W celu zweryfikowania poprawności konstrukcji oraz doboru materiału na składowe stabilizatora wykonano analizę numeryczną za pomocą metody elementów skończonych. Na podstawie otrzymanych wartości przemieszczeń, odkształceń i naprężeń zredukowanych oraz wyników statycznej próby rozciągania stwierdzono, że najkorzystniejszymimateriałami na składowe stabilizatora są: aluminium o grubości 1,5 mm, pasy poliuretanowe oraz pasy polipropylenowe. Selection of mechanical properties of materials used in components of stabilizer for pectus carinatum treatment The aim of this study has been to design and make an external orthotic stabilizer (pectus bracing) used the in treatment of the chicken chest (pectus carinatum). On the basis of a 3D scan performed of the skin surface of the normal structured chest, there has been a simulation performed of the pectus carinatum. The performed models have made it possible to design and produce a personalized external stabilizer. In order to verify the correctness of the design and the selection of material making up the components of the pectus bracing, there has been a numerical analysis performed using the finite-element method. Based on the obtained values of dislocations, reduced stress and tensions and the static tensile test along, it has been found that the best materials for the components of the pectus bracing include: aluminum 1.5 mm thick, polyurethane belts and polypropylene straps. 292 Żaneta Anna Mierzejewska1 Wieloaspektowa analiza problematyki związanej z mechanizmami niszczenia implantów 1. Wstęp Przyczyn szybkiego zużywania się stawów, zarówno naturalnych, jak i sztucznych, jest kilka, m.in. aktywny tryb życia, wzrost liczby urazów, w tym wypadków komunikacyjnych i kontuzji przy uprawianiu sportu, często również nadwaga. Średnia wieku pacjentów poddawanych operacji endoprotezoplastyki stawu biodrowego z każdym rokiem spada, natomiast liczba wykonanych operacji systematycznie rośnie [1]. Lekarze ostrzegają przed przeprowadzania endoprotezoplastyki u młodych ludzi przez wzgląd na ograniczoną trwałość protez, niestety – coraz częściej zdarza się, że po kilkunastu latach od operacji stan endoprotezy wymaga jej reimplantacji [1]. W efekcie obok kolejki osób oczekujących na protezoplastykę pierwotną, tworzy się druga kolejka czekających na realloplastykę. Mimo to, chorzy bardzo często decydują się na wymianę stawu, bowiem taki zabieg oznacza dla nich powrót do życia pozbawionego dolegliwości bólowych [2]. Powszechnie stosowane do wytwarzania implantów materiały metaliczne, pomimo wielu zalet, posiadają szereg niekorzystnych cech. Metale o bardzo dobrych właściwościach mechanicznych są zbyt sztywne w stosunku do kości, jak również ulegają korozji w agresywnym środowisku biologicznym. Działanie na implanty naprężeń mechanicznych i obecność płynów ustrojowych, może przyspieszać ich degradację, zmniejszyć stabilność i trwałość [3]. 2. Cel pracy W pierwszej części pracy omówiono i przeanalizowano obciążenia oraz warunki ich występowania w stawie biodrowym. Przedstawiono tu najczęściej opisywane modele przenoszenia obciążeń. W kolejnym rozdziale krótko scharakteryzowano protezoplastykę, jej przebieg oraz powody, dla których zabieg ten jest wykonywany. Dalsza część pracy zwraca uwagę na problemy związane z eksploatacją materiałów stosowanych na implanty, przeanalizowano procesy niszczenia, a także problemy związane z eksploatacją i pękaniem trzpieni. 1 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej, Wydział Mechaniczny, Politechnika Białostocka, www.pb.edu.pl 293 Żaneta Anna Mierzejewska 3. Analiza warunków obciążeń w stawie biodrowym Układ ruchowy człowieka jest złożony z wzajemnie powiązanych ze sobą za pomocą więzadeł stawów i mięśni, nad którymi kontrolę sprawuje układ nerwowy. Każda zmiana anatomiczna lub fizjologiczna powoduje zaburzenia funkcjonowania i biomechaniki całego układu, ponieważ stanowi on łańcuch kinematyczny [3]. Staw biodrowy, jako składowa narządu ruchu podlega obciążeniom statycznym, które wynikają z oddziaływań mięśni, dynamicznym, powstającym na skutek wykonywanych ruchów oraz obciążeniom wynikającym z masy ciała. Wyróżniamy dwa rodzaje obciążeń: przewlekłe – powolne, systematyczne powstawanie zmian zwyrodnieniowych oraz nagłe, prowadzące do pęknięcia lub złamania kości [4]. Przenoszenie wymienionych obciążeń z kręgosłupa przez miednice na kończyny dolne prezentuje rys. 1. Siły oddziaływujące na staw biodrowy podzielić można na zewnętrzne i wewnętrzne. Siłami zewnętrznymi określa się siły przyciągania ziemskiego, oddziaływanie podporowe oraz siły, z jakimi inne ciała oddziaływają na organizm ludzki. Do sił wewnętrznych zalicza się siły, które są wynikiem pracy mięśni [3]. Dzięki odpowiedniej budowie stawu biodrowego, strukturze kostnej, silnym mięśniom i więzadłom, przystosowany jest on do przenoszenia dużych obciążeń oraz pełnienia funkcji podporowej podczas statycznego obciążenia kończyn. Ocena kierunków i wartości oddziaływań, z uwagi na dużą liczbę mięśni i miejsc przyłożenia sił oraz zmieniających się faz chodu, jest bardzo trudna. Wynika to ze zmiany położenia środka ciężkości ciała oraz ruchów w innych płaszczyznach (przywodzenie, odwodzenie, ruchy rotacyjne). W pracy przedstawiono trzy najczęściej opisywane w źródłach literaturowych modele przenoszenia obciążeń. 3.1. Model Pauwelsa Model ten rozpatruje fazę obciążania obunożnego i jednonożnego (rys.2a,b). Obciążenia pochodzące od głowy, tułowia i kończyn górnych stanowią 62% masy ciała. W modelu Pauwelsa wektor siły (R) ukierunkowany jest w punkt obrotu (O), stanowiący anatomiczny środek głowy kości udowej. Przyjmuje się, że całkowita wartość sił obciążających staw w fazie podparcia jednonożnego, wynika z oddziaływania masy ciała i sił mięśni okołostawowych. Relacje te przestawia się graficznie za pomocą dwuramiennej dźwigni, której punkt podparcia odwzorowuje środek stawu biodrowego [5]. Siła R jest wielkością wypadkową zredukowanego ciężaru ciała (P; Pz = 0,81 P) oraz siły mięśni odwodzących (M), tj. pośladkowego średniego i małego. Model uwzględnia oddziaływanie pasma biodrowopiszczelowego, natomiast w płaszczyźnie horyzontalnej – oddziaływanie mięśni rotujących. 294 Wieloaspektowa analiza problematyki związanej z mechanizmami niszczenia implantów Rysunek 1. Model przenoszenia obciążeń z kręgosłupa na kończyny dolne [5] b) a) c) d) Rysunek 2. Model obciążeń wg Pauwelsa: (a) podparcie obunożne, (b) podparcie jednonożne, (c) aktywny model oddziaływań obciążeń w stawie biodrowym wg Maqueta, (d) wg Będzińskiego [5] 3.2. Model Maqueta Na bazie modelu Pauwelsa powstał model Maqueta (rys.2. c), który w odmienny sposób przedstawia pasmo biodrowo-piszczelowe. W modelu tym, pasmo zewnętrzne w powięzi szerokiej uda napinane jest przez odwodziciele. Symulacja modelu przedstawia pasmo jako cięgno, które biegnie wzdłuż kości udowej od stawu kolanowego do kości miednicy i opiera się na krętarzu kości udowej, dzięki czemu ma możliwość ślizgania się po nim. Taki model stabilizuje staw biodrowy lepiej poprzez dodatkową siłę poziomą [6]. 3.3. Aktywny model oddziaływania obciążeń (Będzińskiego) Uwzględnia oddziaływanie masy tułowia na głowę kości udowej (R), jak również oddziaływania mięśni odwodzicieli (M), pasma biodrowo piszczelowego (T) oraz oddziaływanie mięśni rotujących, powodujących 295 Żaneta Anna Mierzejewska skręcanie kości udowej (rys.2d) [5]. Obciążenia mechaniczne, występujące w warunkach statycznych i dynamicznych, mają istotny wpływ na wytrzymałość struktur kostnych oraz ich budowę wewnętrzną 3.4. Rozkład sił w stawie biodrowym W odcinku bliższym kość udowa tworzy skomplikowany mechaniczny układ: ciężar ciała przenoszony jest z głowy kości udowej na jej trzon poprzez dźwignię, którą tworzy szyjka kości udowej i okolice krętarzy. Wektor tej siły, wg Pauwelsa działa pod kątem 159º do osi pionowej. Obciążenie podczas podparcia jednonożnego wzrasta trzykrotnie [4]. Punkt przyłożenia siły oraz jej wektor przebiegają w oddaleniu od osi długiej kości udowej, co jest wynikiem przesunięcia przyśrodkowego mechanicznej osi w stosunku do osi anatomicznej kończyny dolnej. To z kolei powoduje powstawanie w korowej warstwie kości udowej sił rozciągających (po stronie bocznej) i sił ściskających (po stronie przyśrodkowej). Siły te współistnieją w ścisłej równowadze – pomimo przeważającego działania sił ściskających, boczne ukształtowanie kości udowej kompensuje różnice sił [7]. Biomechaniczną konsekwencją działania zbyt dużych sił są najczęściej złamania w okolicy krętarza mniejszego, które stanowią 34% wszystkich złamań w okolicy biodra. W doświadczeniach nad biomechaniką oraz patomechaniką stawu biodrowego opracowywane są modele fizjologicznego rozkładu sił i naprężeń w stawie biodrowym. Badanie są również właściwości mechaniczne, zwłaszcza sztywność i wytrzymałość na obciążenia udarowe konstruowanych endoprotez przed i po implantacji. W badaniach tych coraz częściej wykorzystuje się komputerowe techniki numerycznej symulacji z zastosowaniem Metody Elementów Skończonych (MES). 4. Alloplastyka stawu biodrowego Endoprotezoplastykę stawu biodrowego stosuje się wtedy, gdy staw ulega zniszczeniu w wyniku procesów chorobowych (choroba zwyrodnieniowa, reumatoidalne zapalenie stawów, dysplazja stawu biodrowego, jałowa martwica kości udowej) i uniemożliwia funkcjonowanie lub gdy doszło do złamania szyjki kości udowej [8]. Pogorszenie stanu stawu może także nastąpić na skutek wielu wrodzonych i nabytych chorób oraz urazów. Zabieg ten zajmuje z reguły do 2 godzin. Chirurg wykonuje pojedyncze cięcie (długości 20-30 cm) ponad biodrem i udem. Przecinana jest szyjka kości udowej, po czym usuwana jest uszkodzona główka stawowa. Aby przygotować miejsce na wszczepienie endoprotezy stawu biodrowego wycina się chorą panewkę stawową i na jej miejscu mocuje się protezę panewki. Następnie opracowuje się jamę szpikową, w sposób 296 Wieloaspektowa analiza problematyki związanej z mechanizmami niszczenia implantów umożliwiający dokładne zamocowanie trzpienia protezy, przy pomocy cementu lub bez niego. Główkę protezy umieszcza się na trzpieniu. Obie części protezy są następnie łączone ze sobą w celu zbudowania stawu, tj. rdzeń z zamocowaną do niego główką scalany jest z panewką (rys.3). Mięśnie zostają zszyte, a rana zamknięta. W stawie umieszcza się dreny odprowadzające krew, gromadzącą się nad stawem biodrowym [1]. Wymiana stawu naturalnego na sztuczny powoduje likwidację powstałych zmian patologicznych, skutkiem czego jest wyeliminowanie bólu oraz odtworzenie naturalnych funkcji biodra. Rysunek 3. Schemat przebiegu operacji wymiany stawu biodrowego:(1) usunięcie głowy kości udowej, (2) mocowanie protezy panewki, opracowanie jamy szpikowej, (3) zamocowanie trzpienia, (4) łączenie komponentów w funkcjonalny przegub [1] 5. Materiały implantacyjne Materiały implantacyjne stanowią specyficzną grupę materiałów. Ich cechą charakterystyczną jest kompatybilność i możliwość współpracy z żywą tkanką. Definicją, która najtrafniej opisuje pojęcie biomateriału, jest ta, podana na Konferencji Biomateriałów przez National Institute of Health. Przedstawia ona biomateriał jako „ każdą inną niż lek substancję albo kombinację substancji syntetycznych lub naturalnych, która może być użyta w dowolnym okresie, w całości lub części, a której zadaniem jest uzupeł- 297 Żaneta Anna Mierzejewska nienie lub zastąpienie tkanek narządu albo jego części lub spełnianie ich funkcji” [9]. Biomateriały różnią się składem, budową i właściwościami. Ze względu na ich zachowanie w kontakcie z tkankami, biomateriały dzieli się na trzy grupy [10]. Pierwszą grupę stanowią materiały obojętne lub prawie obojętne – neutralne. Są to substancje, które nie wywołują żadnej znaczącej reakcji w otaczających je tkankach. Kolejną grupą są materiały aktywne, które integrują się z tkanką okołowszczepową, stymulują do rozwoju oraz pobudzają jej regenerację. Trzecią grupę stanowią materiały biodegradowalne, które po ściśle określonym czasie działania zostają rozłożone oraz wchłonięte przez otaczające je tkanki, nie powodując przy tym żadnych uszkodzeń i zmian patologicznych. Biomateriał pracuje w zmiennym stanie naprężeń i przemieszczeń oraz w środowisku reaktywnym. Stosowany jako wszczep, bez względu na przewidziane dla niego funkcje, musi spełniać szereg wymagań. Biomateriały o optymalnej biotolerancji nie powodują ostrych lub chronicznych reakcji organizmu. Oznacza to harmonijną interakcję pomiędzy implantem i tkanką. Ich zastosowanie poprzedzane jest wieloletnimi testami biozgodności tkankowej i jeśli wyniki badań są zadowalające, wtedy materiały takie mogą zostać dopuszczone do zastosowania na implanty [11]. Wymagania stawiane biomateriałom stosowanym w chirurgii kostnej są wyjątkowo wysokie. Dotyczy to szczególnie materiałów używanych do produkcji endoprotez stawów, które w trakcie eksploatacji poddawane są bardzo dużym obciążeniom, zarówno statycznym jak i dynamicznym. Średnie obciążenia stawu biodrowego u dorosłego człowieka podczas spoczynku osiągają wartość równą około trzykrotnej jego masie, natomiast w trakcie biegu wartość ta wzrasta nawet dziesięciokrotnie w stosunku do masy ciała [4]. Twórcą pierwszej endoprotezy stawu biodrowego był Amerykanin, prof. J. Charnley. Implant zaprojektowano i wykonano w połowie XIX w. i od tamtej pory jego konstrukcja nie uległa znaczącym zmianom [12]. Na podstawie doświadczeń i badań klinicznych gromadzonych na przestrzeni wielu lat, a także na podstawie badań z zakresu biomechaniki oraz biotolerancji, udoskonalano również skład chemiczny i struktury stopów, które następnie posłużyły do wytworzenia implantów. 6. Procesy niszczenia materiałów Poprawnie działający układ immunologiczny bardzo szybko wykryje w organizmie ciało obce, jakim jest implant. Naturalnym odruchem obronnym jest reakcja toksykologiczna i immunologiczna. Produkowane są antyciała, które mają silnie utleniające właściwości. Ich zadaniem jest unieszkodliwienie i „pozbycie się” ciała obcego. Antyciała w postaci limfocytów 298 Wieloaspektowa analiza problematyki związanej z mechanizmami niszczenia implantów i granulocytów otaczają implant, absorbują do wszczepu i powodują jego degenerację [1]. Najczęściej występującym problemem, związanym z wykorzystaniem na implant materiału metalicznego jest korozja. Spowodowane jest to silnie degradacyjnym i reaktywnym środowiskiem płynów ustrojowych oraz stałą, wysoką temperaturą i silnie obniżonym pH, które bardzo sprzyjają rozwojowi korozji. Z klinicznego punktu widzenia pojawienie się korozji w organizmie może znacznie ograniczyć zdolność do długotrwałej pracy implantu. Możliwe jest wystąpienie odczynów zapalnych, które ściśle związane są z uwalnianiem do tkanek okołowszczepowych produktów zużycia. Stan zapalny równoznaczny jest z pojawieniem się bólu, a jego długotrwałe utrzymywanie się jest czynnikiem decydującym o usunięciu wszczepu z ciała [1]. Poprawnie działający układ immunologiczny bardzo szybko wykryje w organizmie ciało obce, jakim jest implant. Naturalnym odruchem obronnym jest reakcja toksykologiczna i immunologiczna. Produkowane są antyciała, które mają silnie utleniające właściwości. Ich zadaniem jest unieszkodliwienie i „pozbycie się” ciała obcego. Antyciała w postaci limfocytów i granulocytów otaczają implant, absorbują do wszczepu i powodują jego degenerację [1]. Najczęściej występującym problemem, związanym z wykorzystaniem na implant materiału metalicznego jest korozja. Spowodowane jest to silnie degradacyjnym i reaktywnym środowiskiem płynów ustrojowych oraz stałą, wysoką temperaturą i silnie obniżonym pH, które bardzo sprzyjają rozwojowi korozji. Z klinicznego punktu widzenia pojawienie się korozji w organizmie może znacznie ograniczyć zdolność do długotrwałej pracy implantu. Możliwe jest wystąpienie odczynów zapalnych, które ściśle związane są z uwalnianiem do tkanek okołowszczepowych produktów zużycia. Stan zapalny równoznaczny jest z pojawieniem się bólu, a jego długotrwałe utrzymywanie się jest czynnikiem decydującym o usunięciu wszczepu z ciała [1]. 6.1. Rodzaje korozji Ze względu na rodzaje środowiska korozyjnego wyróżnia się dwa jej typy: chemiczną i elektrochemiczną [13]. W korozji chemicznej istotą procesu są jednoczesne reakcje utleniania metalu i redukcji utleniacza, będącego składnikiem środowiska. Z kolei korozja elektrochemiczna zachodzi w środowisku elektrolitycznym, w którym tworzą się ogniwa korozyjne. Schemat obrazujący poszczególne typy zniszczeń korozyjnych przedstawiono na rysunku 4.1., zamieszczonym na końcu podrozdziału. 299 Żaneta Anna Mierzejewska 6.1.1. Korozja ogólna (general corrosion) Jest to korozja stosunkowo najmniej groźna, gdyż polega na równomiernym zaatakowaniu całej powierzchni stali nierdzewnej. W wyniku tego grubość wyrobu stalowego zmniejsza się równomiernie, z jednoczesnym zmniejszeniem się ogólnej wytrzymałości korodowanego elementu. Szybkość ubytku grubości nie powinna jednak przekraczać pewnej praktycznie ustalonej granicy. Dla stali odpornych na korozję jako dopuszczalny przyjmuje się – dla większości zastosowań – średni roczny ubytek grubości nie przekraczający 0,1 mm (wyznacza się wg PN-78/H04610). Zapobieganie skutkom korozji równomiernej (przez ograniczenie jej szybkości) polega na: wymianie stali na stal o lepszej odporności na korozję, zmianie środowiska korozyjnego (zmiana stężenia, temperatury, prędkości przepływu cieczy, dodanie inhibitora itd.), okresowym pasywowaniu powierzchni stali [14]. 6.1.2. Korozja wżerowa (pitting) Korozja wżerowa charakteryzuje się punktowym ubytkiem masy stali. Przebieg procesu tego rodzaju korozji związany jest z działaniem lokalnego ogniwa. Pitting stali odpornych na korozję występuje najczęściej w środowiskach wodnych, zawierających jony chloru, bromu, jodu, przy czym jej intensywność zależy głównie od stężenia tych jonów i temperatury. Pojawia się przeważnie na wszelkiego rodzaju niejednorodnościach wewnętrznych metalu (wtrącenia niemetaliczne, wydzielenia, odkształcenia) i zewnętrznych (krawędzie, zarysowania, wgniecenia, resztki zgorzeliny) [15]. 6.1.3. Korozja szczelinowa (cervice corrosion) Ten typ korozji pojawia się w szczelinach i zagłębieniach konstrukcyjnych. Korozja szczelinowa powstaje w wyniku stopniowego zanikania warstewki pasywnej w szczelinach, w których na skutek utrudnionego napowietrzenia i zahamowanego dopływu tlenu, warstewka ta nie może się zregenerować [14]. Wystąpienie korozji szczelinowej prowadzi zazwyczaj do propagacji pęknięcia i w efekcie uszkodzenia wszczepu. Zapobieganie temu typowi degradacji materiału polega głównie na właściwym doborze cech konstrukcyjnych wykonywanych elementów [15]. 6.1.4. Korozja galwaniczna – stykowa (galvanic corrosion) Korozja ta jest wywołana stykiem dwóch metali lub stopów o różnych potencjałach, zanurzonych w elektrolicie, w którym możliwy jest przepływ elektronów. Skuteczność działania ogniwa zwiększa się ze wzrostem różnicy potencjałów stykających się ze sobą dwóch metali w środowisku 300 Wieloaspektowa analiza problematyki związanej z mechanizmami niszczenia implantów korozyjnym, np. zawierającym jony chlorkowe. Do korozji galwanicznej dochodzi również w stopach dwufazowych, w których jedna z faz jest szlachetniejsza od drugiej. Wytrącenia niemetaliczne w stopach jednofazowych również mogą być czynnikiem powodującym pojawienie się korozji stykowej. Odporność na korozję stopu jednofazowego o zbliżonym składzie jest zazwyczaj większa, niż stopu dwufazowego. Do powodów występowania tego zjawiska zalicza się: różnice w pH, odmienny stopień chropowatości powierzchni stykowych oraz utwardzenie materiału drogą wielokrotnego zgniatania [16]. 6.1.5. Korozja międzykrystaliczna (intergranular corrosion) Typ korozji występującej na granicach ziaren. Powstaje w wyniku istnienia w stopie obszarów o zróżnicowanym składzie chemicznym. Zróżnicowanie zawartości chromu na granicy ziarna i w jego wnętrzu prowadzi do wystąpienia korozji międzykrystalicznej. Powstawanie korozji inicjowane jest wzrostem zawartości węgla oraz spadkiem zawartości chromu w stali. Stal austenityczna w stanie przesyconym poddawana jest wygrzewaniu w temperaturze powyżej 500oC, co powoduje powstawanie węglików (FeCr)23C6 na granicach ziarn, a tym samym zubożenie granic w chrom. Zjawiska te powodują lokalnie zawartość w materiale metalicznym pierwiastków stopowych, zwłaszcza chrom oraz tworzenie mikroogniw korozyjnych, w których katodę stanowi węglik, natomiast anodę – otaczający metal. Dodatkowo pojawienie się naprężeń w miejscach tworzenia się nowych faz może niszczyć warstwę pasywną [16]. 6.1.6. Korozja cierna (fretting) Istotą tego procesu jest powstawanie miejscowych ubytków materiału w elementach, które poddawane są działaniu drgań, niewielkich poślizgów, ich przemieszczania się pod wpływem cyklicznych obciążeń oraz intensywnego korozyjnego oddziaływania środowiska [14]. Występowanie frettingu może znacząco obniżyć wytrzymałość zmęczeniową materiału, co jest szczególnie niebezpieczne w przypadku zastosowania implantacyjnego. Z frettingiem wiąże się emisja znacznej ilości produktów korozji do tkanek otaczających wszczep [13]. Może to być indykatorem do powstania pęknięć na powierzchni wszczepu, a w konsekwencji prowadzić do jego uszkodzenia. 6.1.7. Korozja naprężeniowa (stress corrosion) Korozja naprężeniowa pojawia się tylko wtedy, gdy stal podatna na ten typ korozji, poddawana naprężeniom wewnętrznym lub zewnętrznym, jest narażona na działanie środowisk korozyjnie agresywnych, które wywołują 301 Żaneta Anna Mierzejewska ten typ korozji. Im większe są te naprężenia i im bardziej agresywne środowisko otaczające implant, tym szybciej dojdzie do zużycia produktu. Pękanie naprężeniowe wywołane jest głównie naprężeniami w makroskali, występującymi w całej objętości materiału. Naprężenia zginające, rozciągające i ściskające wpływają na obniżenie odporności materiału na korozję w wyniku obniżania stabilności termodynamicznej metalu i naruszenia ciągłości warstwy pasywnej, jednak nie powodują one zlokalizowanych pęknięć materiału. Pęknięcia wynikające z korozji naprężeniowej rozwijają się po granicach ziaren oraz śródkrystalicznie [17]. 6.1.8. Korozja wodorowa (hydrogen damage) Pod wpływem naprężeń występujących w materiale tworzy się płaszczyzna poślizgu. Wynikiem poślizgu jest depasywacja powierzchni, prowadząca do reakcji anodowych, które są przyczyną powstawania wakansu i w efekcie absorpcji atomów wodoru. Na powierzchni powstałego pęknięcia obserwuje się dwa obszary: zmiękczony i utwardzony. Współpraca tych dwóch obszarów prowadzi do lokalnego wzrostu naprężeń. Zaabsorbowany wodór powoduje spadek energii kohezji pomiędzy płaszczyznami. Zmniejszenie tej energii oraz lokalne spiętrzenie naprężeń prowadzi do łatwej propagacji pęknięcia [17]. 6.2. Pękanie materiału (corrosion fatigue) Wśród najistotniejszych czynników powodujących przedwczesne zniszczenie materiałów wymienić należy: nieprawidłowo zrealizowaną obróbkę cieplną, ukryte wady materiałowe, nieodpowiednią konstrukcję implantu, niedopasowaną do warunków obciążeń, nieprawidłowe zamocowanie lub eksploatację. Możemy wyróżnić trzy rodzaje pękania materiałów: doraźne, będące wynikiem utraty spójności, zmęczeniowe oraz będące następstwem działania na materiał wysokiej temperatury i znacznych obciążeń – pełzanie. Oprócz powyższego podziału rodzaje pęknięć materiału można sklasyfikować jako: ciągliwe, kruche oraz będące wynikiem utraty spójności. Pękanie ciągliwe, inaczej rozdzielcze powstaje wtedy, kiedy na materiał działają obciążenia wywołujące nagłe przeciążenia plastyczne [18]. Na silnie rozwiniętej powierzchni przełomu widoczne są pustki wypełnione wydzieleniami lub zanieczyszczeniami w postaci sferycznych cząstek. Jeżeli większość cząstek, na których tworzą się pustki znajduje się na granicach ziarn, to pękanie zachodzi po granicach ziarn i jest nazywane międzykrystalicznym, jeżeli natomiast rozmieszczenie cząstek jest względnie równomierne, to pękanie zachodzi przez ziarna i jest nazywane transkrystalicznym. Kruche cząstki innej fazy w ciągliwej osnowie nie są 302 Wieloaspektowa analiza problematyki związanej z mechanizmami niszczenia implantów w stanie zaakomodować dużych odkształceń plastycznych osnowy. Dlatego nawet niewielkie odkształcenia plastyczne osnowy, będące wynikiem dyslokacji oraz sił zewnętrznych osiąga wartość wystarczającą do spowodowania pękania cząstek. Podczas pękania ciągliwego wytrzymałość na rozciąganie jest mniejsza niż naprężenia konieczne do rozprzestrzeniania się pęknięcia, dlatego próbka odkształca się najpierw równomiernie, a następnie tworzy się szyjka. Dalsze odkształcenie oraz łączenie się pustek jest ograniczone do obszaru szyjki. Końcowe rozdzielenie materiału uzyskuje się przez ścięcie lub niekiedy przez przewężenie się pierścienia otaczającego pęknięcie [18]. Pękanie zmęczeniowe materiału jest procesem pokrewnym do korozji naprężeniowej. Występuje, gdy materiał jest pod wpływem cyklicznych lub zmiennych naprężeń, które nie przekraczają granicy plastyczności materiału. Oddziaływanie tych naprężeń powoduje naruszenie powierzchniowej warstwy pasywnej i odsłonięcie metalu [Ratajczak, 2005]. W przeciwieństwie do korozji naprężeniowej, korozja zmęczeniowa w stali austenitycznej może pojawić się w dowolnym środowisku, począwszy od pary wodnej, poprzez wodę, do roztworów chemicznych. Tworzące się wżery i szczeliny mogą stać się zarodkami pęknięć. Wskutek dalszego działania naprężeń rozciągających oraz środowiska korozyjnego dochodzi do propagacji pęknięć śródkrystalicznych oraz po granicach ziaren, mających charakter pękania kruchego. Zasadniczy wpływ na odporność na ten typ niszczenia materiału metalicznego mają: wytrzymałość materiału na rozciąganie, wielkość ziaren oraz obecność składników stopowych, których zadaniem jest polepszenie pasywności stali. Podstawową rolę zmian w mikrostrukturze przypisuje się naprężeniom będącym skutkiem odkształceń sprężystych sieci krystalicznej na skutek wzrostu gęstości dyslokacji. W początkowej fazie występują lokalne odkształcenia plastyczne, których oznaką są pasma poślizgów. W obszarach, w których na skutek poślizgu gęstość dyslokacji przekroczy wartość krytyczną, pojawiają się mikropęknięcia. Również zmiany naprężeń, prowadzące do zmiany plastyczności materiału i jego lokalnego utwardzenia, mogą stać się przyczyną wystąpienia mikropęknięć. Przy dalszym cyklicznym obciążeniu zwiększa się powierzchni pęknięcia, co prowadzi do lokalnego zniszczenia [19]. Pękanie zmęczeniowe materiału przebiega w trzech etapach. Pierwszym etapem jest tworzenie się zarodka, a więc inicjacja powstania ogniska zmęczeniowego. Następnie dochodzi do propagacji pęknięcia i tworzenia się prążków zmęczeniowych, a ostatnim etapem jest pękanie doraźne z typowym złomem ciągliwym. Wygląd przełomu zależy od rodzaju i wielkości obciążeń zmęczeniowych, jakie spowodowały zniszczenie. Dzięki tej zależności można 303 Żaneta Anna Mierzejewska odtworzyć charakter obciążeń oraz ustalić położenie ogniska pęknięcia. Dla większości metali można wyróżnić dwie odmienne strefy, które odpowiadają dwóm następującym po sobie etapom niszczenia materiału: strefę zniszczenia zmęczeniowego oraz strefę zniszczenia doraźnego (rys. 4) [20‚21]. Rysunek 4. Charakterystyczny przełom zmęczeniowy [19] Strefa zniszczenia zmęczeniowego ma wygładzoną powierzchnię, często o kształtach muszlowych, z widocznymi niekiedy liniami frontu, świadczącymi o nierównomiernym, skokowym pogłębianiu się szczeliny. Im mniejsza jest ta strefa, w porównaniu ze strefą pęknięcia doraźnego, tym większa jest wartość naprężenia zmęczeniowego. Duże pole powierzchni strefy pęknięcia zmęczeniowego świadczy o działaniu małych naprężeń i małych prędkościach rozprzestrzeniania się pęknięcia. Natomiast strefa zniszczenia doraźnego (tzw. strefa resztkowa lub doraźna) ma powierzchnię wizualnie bardziej gruboziarnistą i powstaje nagle w ostatnim okresie pracy elementu. W okolicy przełomu brak jest widocznych odkształceń plastycznych, a więc ma on charakter przełomu kruchego [18‚20]. Ostatni typ zniszczenia materiału dotyczy utraty spójności Charakterystyczne jest tutaj nieznaczne lub w ogóle nie występujące odkształcenie plastyczne. Pęknięcie przebiega jedynie wzdłuż granic ziarn. Powodem zaistnienia utraty spójności jest osłabienie wytrzymałości granic ziarn spowodowane obecnością zanieczyszczeń, wtrąceń i segregacją pierwiastków [19]. 7. Podsumowanie Implanty stosowane w chirurgii kostnej powinny wykazywać dużą trwałość w środowisku biologicznym, co w praktyce nie zawsze jest spełnione. Przyczyną niepowodzenia może być zarówno źle zaplanowana i zrealizowana procedura wszczepienia implantu, jak też aspekty bio- 304 Wieloaspektowa analiza problematyki związanej z mechanizmami niszczenia implantów mechaniczne: wady materiałowe, brak biozgodności pomiędzy implantem i strukturą kości, niewłaściwe dobranie charakterystyki odkształceniowe implantu i kości, a także niewłaściwe zaprojektowanie części składowych w przypadku endoprotez. Ponadto implanty stosowane w leczeniu operacyjnym powinny być uniwersalne, posiadać różne możliwości korekcyjne i wykazywać jak najmniejszy zakres obróbki mechanicznej podczas zabiegu. Dlatego do uzyskania nowych w pełni funkcjonalnych biomateriałów i technologii dla medycyny, konieczna staje się zastosowanie nowoczesnego oprogramowania inżynierskiego, opartego na metodzie elementów skończonych (MES), które wprowadziło ogromny postęp w zakresie modelowania układów biologicznych [22]. Takie badania są ukierunkowane głównie na optymalizację konstrukcji implantów, ale też zastosowanie nowych materiałów. Decydujący wpływ na długotrwałą bifunkcyjność sztucznego stawu biodrowego ma relacja sztywności trzpienia endoprotezy do sztywności kości. Prowadzonych jest wiele prac z zastosowaniem obliczeń numerycznych, których celem jest dopasowanie sztywności implantu do sztywności otaczającej go struktury kostnej poprzez optymalizację kształtu endoprotezy i odpowiednie rozwiązania materiałowe. W tym celu buduje się specjalne trójwymiarowe modele układu kość – endoproteza i prowadza się obliczenia przy zastosowaniu różnych parametrów wytrzymałościowych. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że głównym czynnikiem wpływającym na procesy adaptacyjne zachodzące w kości i długotrwałe zamocowanie implantu endoprotezy stawu biodrowego, główny wpływ wywiera konstrukcja endoprotezy [3]. Praca zrealizowana przy wsparciu finansowym Wydziału Mechanicznego Politechniki Białostockiej w ramach projektu „Rozwój młodych naukowców i uczestników studiów doktoranckich‖ nr MB/WM/14/2014. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. Ackrermann K., Implantologia, Urban&Partner, (2004), s. 15-29 Korzyński M, Cwanek J., Procesy zużycia w stawie biodrowym, Zbiór prac seminarium naukowego Mechanika w Medycynie 1, (1993), s. 15-18 Buśkiewicz J., Podstawy konstrukcji w protetyce, Akademicka Oficyna Wydawnicza, AGH, (2008), s. 14-21 Bernakiewicz M., Będziński R., Analiza stanu naprężeń kości udowej w ekstremalnych warunkach obciążeń, Zeszyty Nukowe Konferencji Mechaniki Stosowanej, (1999), s. 33-38 Będziński R., Ścigała K., Biomechanika stawu biodrowego i kolanowego. Tom 5 Biocybernetyka i inżynieria rehabilitacyjna, Akademicka Oficyna Wydawnicza Exit, (2004), s. 34-54 Maquet P. G. J., Biomechanics of the hip, (1985), s. 16-18 305 Żaneta Anna Mierzejewska 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. Kapandji A., Physiology of the Joints: Lower Limb v. 2: Annotated Diagrams of the Mechanics of the Human Joints, Lincoln, LIN, (1997), s. 111-124 Przeździak B., Zastosowanie kliniczne protez, ortoz i środków pomocniczych, Via Medica, vol.40, (2008), s.17-24 Gierzyńska- Dolna M., Biotribologia, Wydawnictwo Politechniki Częstochowskiej, (2002), s.32-32 Żurek- Świeczko B., Biomateriały, Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej, (2009), s. 1-14 Nowacki L., Gustavo F., Biomateriały w konstrukcji implantów, Open Access Library vol. 11, (2012), s. 13-42 Brooks S., Fracture of fully hydroxyapatite-coated titanium femoral stem of a total hip replacement – a report of 3 cases, Acta Orthop Scand; 75 no. 6, (2004), s. 768-771 Costa I., Terada M., Microstructure and intergranular corrosion of the austenitic stainless steel, Journal of Nuclear Materials, (2006), s. 40-46 Surowska B., Wybrane zagadnienia z korozji i ochrony przed korozją, Politechnika Lubelska, (2002), s. 20-32 Blicharski M., Wstęp do inżynierii materiałowej, Wydawnictwa NaukowoTechniczne, (2009), s. 428-446 House K., Sernetz F., Dymock D., Sandy J. R., Ireland A. J., Corrosion of orthodontic appliances, American Journal of Orthodontics & Dentofacial Orthopedics, (2008), s. 584-595 Upadhyay D., Panchal M. A., Dubey R. S., Srivastava V. K., Corrosion of alloys used in dentistry: A review, Materials Science & Engineering, (2008), s. 1-15 Kowalewski L., Zmęczenie materiałów – podstawy, kierunki badań, ocena stanu uszkodzenia, Siedemnaste seminarium Nieniszczące Badania Materiałów, (2011) Ratajczak J., Badanie metali na zmęczenie, Politechnika Szczecińska, (2005), s.12-15 Prowans S., Metaloznawstwo, WNT, (1992), s. 34-45 Przybyłowicz K., Metaloznawstwo, WNT, (1997), s. 100-156 Madej T., Modelowanie strefy ruchowej endoprotezy stawu biodrowego w aspekcie biomateriałów, AGH, (2008), s. 29-43 306 Wieloaspektowa analiza problematyki związanej z mechanizmami niszczenia implantów Wieloaspektowa analiza problematyki związanej z mechanizmami niszczenia implantów Przyczyn szybkiego zużywania się stawów, zarówno naturalnych, jak i sztucznych, jest kilka, m.in. aktywny tryb życia, wzrost liczby urazów, w tym wypadków komunikacyjnych i kontuzji przy uprawianiu sportu, często również nadwaga. Średnia wieku pacjentów poddawanych operacji endoprotezoplastyki stawu biodrowego z każdym rokiem spada, natomiast liczba wykonanych operacji systematycznie rośnie. Lekarze ostrzegają przed przeprowadzania endoprotezoplastyki u młodych ludzi przez wzgląd na ograniczoną trwałość protez, niestety – coraz częściej zdarza się, że po kilkunastu latach od operacji stan endoprotezy wymaga jej reimplantacji. W efekcie obok kolejki osób oczekujących na protezoplastykę pierwotną, tworzy się druga kolejka czekających na realloplastykę. Mimo to, chorzy bardzo często decydują się na wymianę stawu, bowiem taki zabieg oznacza dla nich powrót do życia pozbawionego dolegliwości bólowych. Powszechnie stosowane do wytwarzania implantów materiały metaliczne, pomimo wielu zalet, posiadają szereg niekorzystnych cech. Metale o bardzo dobrych właściwościach mechanicznych są zbyt sztywne w stosunku do kości, jak również ulegają korozji w agresywnym środowisku biologicznym. Działanie na implanty naprężeń mechanicznych i obecność płynów ustrojowych, może przyspieszać ich degradację, zmniejszyć stabilność i trwałość. Jednym z najczęściej stosowanych biomateriałów metalicznych jest stal X2CrNiMo17-12-2 (316 L). Implanty wykonywane z tej stali zaliczane są do grupy wszczepów krótkotrwałych. Powinno to wykluczyć stosowanie stali 316 L na endoprotezy stawu biodrowego, które z założenia są wszczepami długookresowymi, jednak częstość stosowania implantów wykonanych z tej stali nie maleje, mimo obecności na rynku trwalszych materiałów. The multifaceted analysis of issues related to the mechanisms of implants destruction There are several reasons for the rapid wear of the joints, both natural and man-made, including active lifestyle, increase in the number of injuries, traffic accidents and injuries during sport, often overweight. The average age of patients undergoing hip replacement surgery each year is falling, while the number of operations is steadily growing. Doctors warn against carrying arthroplasty in young people for the sake of the limited durability of prostheses, unfortunately – more often it happens that after several years of transactions, the prosthesis requires its reimplantation. As a result, next to the queue of people waiting for THR primary forms a second queue waiting for realloplasty. Despite this, patients often decide to exchange the pond, because such treatment is for them to return to a life without pain. Commonly used implant materials for the production of metal, in spite of many advantages, have a number of disadvantages. Metals with very good mechanical properties are too stiff relative to the bone, as well as corrode in an aggressive biological environment. The effect on implants mechanical stress and the presence of body fluids, may accelerate their degradation, reduce stability and durability. One of the most common biomaterials metal is stainless X2CrNiMo17-12-2 (316 L). Implants made of this steel are among the short-term implants. This should exclude the use of stainless 316 L hip replacement, which by definition are long-term implants, but the frequency of the use of implants made from this steel is not decreasing, despite the presence of more durable materials on the market. 307 Żaneta Anna Mierzejewska1 Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów wytwarzanych tradycyjnymi technologiami 1. Wstęp Połączenia stawowe przyrównuje się do łożysk ślizgowych. Mechanizmy zużycia, zarówno w naturalnym stawie jak i w łożysku mechanicznym, są podobne. Wyróżniamy [1‚2]: zużycie adhezyjne, występujące w miejscach najbardziej obciążonych oraz na wierzchołkach nierówności chrząstki stawowej; zużycie ścierne, będące skutkiem oddziaływania fragmentów chrząstki stawowej oderwanych od podłoża, znajdujących się w mazi stawowej; zużycia zmęczeniowe – pod wpływem zmiennych obciążeń ciecz synowialna wtłaczana jest do mikroszczelin, skutkiem czego jest rozklinowanie naturalnych, bądź pourazowych mikroszczelin występujących w chrząstce stawowej; zużycie przez zwłóknienie chrząstki stawowej, opisywane jest jako proces, w którym w mazi stawowej pojawiają się cienkie włókna. Jeśli w naturalnym stawie biodrowym dochodzi do procesów chorobowych, to degradacja chrząstki stawowej przebiega intensywniej. Organizm nie ma czasu, aby naprawić uszkodzone tkanki. Przyjmuje się, że w zdrowym stawie biodrowym współczynnik tarcia jest rzędu 0,0025-0,0030, natomiast grubość warstwy smarującej jest rzędu 50*10-6 m [3]. W przypadku stawu, w którym przebiegi procesów zużycia są zaawansowane, współczynnik tarcia jest dziesięciokrotnie większy, grubość warstwy smarującej znacząco maleje, a nawet zanika [4]. Jako jedną z przyczyn niepowodzeń alloplastyki stawu biodrowego wymienia się zużycie ścierne elementów endoprotez, w wyniku którego do organizmu człowieka dostają się drobiny polietylenu i metali [3]. Produkty tarcia znajdujące się w strefie kontaktu metalu z polietylenem mogą wywoływać zwiększone zużycie ślizgowych elementów endoprotezy i powodować wzrost ilości produktów ścierania. Proces zużycia endoprotezy przebiega tym intensywniej, im większe jest obciążenie, działające na sztuczny staw biodrowy (ciężar i aktywność ruchowa pacjenta). 1 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej, Wydział Mechaniczny, Politechnika Białostocka 308 Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów wytwarzanych tradycyjnymi technologiami Z czasem, w skrajnych przypadkach, nadmierne zużycie może doprowadzić do ponownej dysfunkcji i konieczności reimplantacji [1‚4]. Drobiny polietylenu i metali uwalniające się w wyniku ścierania przedostają się z płynem tkankowym do przestrzeni okołostawowej, zaburzając zachodzące tam procesy biologiczne. Ciągłe drażnienie okolicznych tkanek przez produkty zużycia wywołuje reakcję obronną ze strony organizmu, który stara się pozbyć obcego dla niego ciała na drodze fagocytozy. Wokół produktów zużycia pojawiają się makrofagi i fibroblasty, i dochodzi do uaktywnienia osteoklastów, odpowiedzialnych za osteolizę tkanki kostnej. W efekcie prowadzi to do resorpcji kości w otoczeniu endoprotezy i jej obluzowania. W rejonie panewki proces ten rozpoczyna się od jej krawędzi bocznej i postępuje wzdłuż sklepienia [5]. Mechaniczna stabilność implantu określona jest przez stopień zaawansowania resorpcji i tworzenia pomiędzy cementem i tkanką kostną odczynowej błony łącznotkankowej, która z czasem może stanowić warstwę przejściową. Część produktów zużycia może wędrować z płynem tkankowym, wywoływać resorpcję kości i doprowadzić do obluzowania endoprotezy daleko poza miejscem jej uszkodzenia. Pozostała część może zostać przetransportowana poprzez naczynia limfatyczne do organizmu człowieka [1, 6]. Dominującą rolę w obluzowaniu trzpieni endoprotez odgrywają czynniki biomechaniczne. Struktura tkanki kostnej dostosowuje się do istniejącego stanu naprężeń. W fizjologicznym stawie biodrowym obciążenia są przenoszone przez miednicę na kość udową. Implantacja endoprotezy zmienia istniejący stan naprężeń, dochodzi do odciążenia okolicy krętarza i przenoszenia obciążeń przez tkankę kostną wokół dalszego odcinka trzpienia [7]. 2. Mechanizm zmęczeniowego pękania trzpieni Cykliczne obciążanie i odciążanie elementu powoduje zmęczenie materiału. Zmiany naprężeń prowadzą do zmiany plastyczności materiału oraz do lokalnego utwardzenia, co w konsekwencji może stać się przyczyną wystąpienia mikropęknięć. Zainicjowanie pęknięcia a następnie jego rozrost powoduje, że zmniejsza się powierzchnia, która efektywnie przenosi obciążenia [8]. Alloplastyka, tak jak wszystkie zabiegi i ingerencje chirurgiczne, obarczona jest pewnym prawdopodobieństwem pojawienia się komplikacji i powikłań. Jednym z nich jest dość rzadko występujące złamanie izolowane (bez naruszenia ciągłości tkanki kostnej). Prawdopodobieństwo wystąpienia złamania izolowanego trzpienia endoprotezy stawu biodrowego wynosi 0,27% [8‚10]. Z dostępnego piśmiennictwa wynika, że 309 Żaneta Anna Mierzejewska najczęstszym powodem zgłaszania się chorych do ortopedy są dolegliwości bólowe, zlokalizowane w okolicy biodra i/lub bliższej części uda po stronie operowanej. Niektórzy chorzy skarżą się na uczucie przeskakiwania w stawie biodrowym. Większość autorów zgadza się, iż wpływ na wystąpienie omawianego powikłania ma wiele, często nakładających się na siebie czynników [10‚11]. Pierwsze doniesienie na temat złamania trzpienia endoprotezy można spotkać w literaturze specjalistycznej z roku 1977. Carlsson opisał 14 przypadków złamań trzpienia endoprotezy Charnleya. Według niego czynnikiem prowadzącym do złamania implantu była błędna technika operacyjna. Murray oraz Yates, na podstawie analizy 14 przypadków złamania trzpieni endoprotezy stawu biodrowego doszli do podobnych wniosków, jednak jako nadrzędny czynniki ryzyka wystąpienia powikłania w postaci złamania trzpienia autorzy wskazali na wysoki wskaźnik masy ciała pacjenta – BMI (Body Mass Index) oraz błędy techniki operacyjnej. Harvie i Jarvi, niezależnie od siebie opisali przypadki złamania trzpieni, w których analiza metalurgiczna wykazała wady odlewnicze i materiałowe [12]. Większość opisanych przez autorów trzpieni wykonanych było ze stali austenitycznej. Znamienny jest fakt, że znaczna część z opisanych trzpieni uległa zniszczeniu w czasie krótszym niż 10 lat od przeprowadzenia endoprotezoplastyki. 3. Kliniczne przypadki złamań trzpienia Alloplastyka, tak jak wszystkie zabiegi i ingerencje chirurgiczne, obarczona jest pewnym prawdopodobieństwem pojawienia się komplikacji i powikłań [13‚16]. Jednym z nich jest złamanie izolowane (bez naruszenia ciągłości tkanki kostnej). Etiologia złamania jest wieloczynnikowa. Wyróżnia się trzy kategorie: kliniczną, techniczną i materiałową [17]. W kategorii klinicznej złamanie skorelowane jest z wiekiem, wagą, wzrostem pacjenta, jakością kośćca i poziomem aktywności fizycznej [17‚19]. W kategorii technicznej możliwość wystąpienia złamania trzpienia zależna jest od poprawnego doboru techniki operacyjnej, sposobu mocowania, jakości i ilości cementu kostnego i innych czynników [17‚19]. Z doniesień literaturowych wynika, że częściej dochodzi do złamań trzpieni endoprotez mocowanych za pomocą cementu kostnego, w porównaniu do metody bezcementowej. Zbyt rzadka lub zbyt gęsta konsystencja, zbyt mała ilość, nieprawidłowe wymieszanie lub nieodpowiednie rozłożenie warstwy kleju kostnego może skutkować przedwczesnym złamaniem trzpienia. Do kategorii materiałowej zalicza się konstrukcję, rodzaj i jakość materiał. Nieodpowiednia konstrukcja trzpienia jest przyczyną niekorzystnego rozkładu naprężeń, które w konsekwencji mogą prowadzić do nadmiernego 310 Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów wytwarzanych tradycyjnymi technologiami przeciążenia materiału i jego przedwczesnego zniszczenia. Ponadto, wszelkie nieciągłości i niejednorodność struktury (pod względem fazowym, składu chemicznego czy wielości ziarn), powodują zdecydowane obniżenie właściwości wytrzymałościowych stosowanych implantów. Z informacji podanych przez Amerykańskie Towarzystwo Chirurgów Biodra i Kolana wynika, że prawdopodobieństwo wystąpienia złamania izolowanego trzpienia endoprotezy stawu biodrowego wynosi 0,27% [14‚15, 20]. Jednak z badań przeprowadzonych przez Martensa [13] wynika, że procentowy wskaźnik złamań izolowanych w całkowitej liczbie niepowodzeń obserwowanych w alloplastyce stawu biodrowego, jest nawet o dwa rzędy wielkości większa i wynosi 11%. Złamania tego typu odnotowano przy implantach wykonanych z różnych materiałów, o różnej geometrii i różnym sposobie mocowania [13‚15] Doniesienie dotyczące złamania trzpienia endoprotezy znaleźć możnaw literaturze specjalistycznej, pochodzącej z roku 1977 [10, 13]. Carlsson [21] opisał czternaście przypadków złamań trzpienia endoprotezy Charnleya. Według tego autora, czynnikiem prowadzącym do złamania implantu była błędna technika operacyjna. Murray [22], na podstawie analizy czternastu przypadków złamania trzpieni endoprotezy stawu biodrowego doszedł do podobnych wniosków, jednak jako nadrzędny czynniki ryzyka wystąpienia powikłania w postaci złamania trzpienia wskazał na wysoki wskaźnik masy ciała pacjenta – BMI (Body Mass Index) oraz błędy techniki operacyjnej. Na uwagę zasługuje fakt, że większość odnotowanych przypadków złamań izolowanych dotyczy trzpieni wykonanych ze stali austenitycznej. Ponadto, znamienny jest fakt, że 60% z opisanych trzpieni uległa zniszczeniu w czasie krótszym niż 10 lat od przeprowadzenia endoprotezoplastyki. Jednym z przykładów złamania izolowanego jest przypadek opisany przez A. Kotela, przedstawiający złamania trzpienia endoprotezy stawu biodrowego typu Wellera (rys.1), zaimplantowanej 22 lata wcześniej z powodu wystąpienia zaawansowanych zmian zwyrodnieniowych. Złamanie nastąpiło w połowie długości trzpienia [16]. 311 Żaneta Anna Mierzejewska Rysunek 1. Zdjęcie rentgenowskie obrazujące złamanie, a) zdjęcie rentgenowskie, b) zdjęcie po ekstrakcji z kości [16] Kolejne 2 przykłady złamań trzpieni endoprotez opisują Drobniewski i Synder [10]. Jako pierwszy opisano przypadek 45-cio letniej kobiety z wrodzoną dysplazją stawów biodrowych, u której w 24 lata po wszczepieniu endoprotezy Mittlemeiera stwierdzono złamanie trzpienia w połowie długości endoprotezy. Endoprotezę tego samego typu wszczepiono również 32- letniej kobiecie, która podobnie jak poprzednia pacjentka, cierpiała na dysplazję stawu biodrowego. 10 lat po zaimplantowaniu endoprotezy u pacjentki stwierdzono złamanie trzpienia w dolnej jego części, poniżej 2/3 jego długości. W obu przypadkach nie podano przyczyn uszkodzenia, jednak przeprowadzony wywiad lekarski wykluczył jako przyczynę złamania uraz zewnętrzny [10]. Ciekawym przypadkiem jest historia 66-letniej kobiety, która zgłosiła się do szpitala z bólem w stawie biodrowym. Badanie rentgenowskie ujawniło złamanie trzpienia endoprotezy (DePuy, wykonanego ze stopu Co-Cr) w połowie jego długości. Jako powód uszkodzenia wskazano niekorzystny rozkład warstwy cementu kostnego. Nieodpowiednie zamocowanie trzpienia w kanale szpikowym spowodowało mikroruchy, które przyczyniły się do wykruszania kleju kostnego oraz do powstania pustej przestrzeni między kością a implantem. Ta pusta przestrzeń spowodowała, że spotęgowane zostały wartości pionowych obciążeń, działających na trzpień. Doprowadziło to do tego, że materiał uległ zniszczeniu na skutek zmęczenia materiału [23]. 312 Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów wytwarzanych tradycyjnymi technologiami Brooks (2004) opisał 3 przypadki złamania trzpieni endoprotez pokrytych warstwą hydroksyapatytu. We wszystkich przypadkach pęknięcie nastąpiło w połowie długości trzpienia. Uzasadnione zostało to przez autora nieprawidłową geometrią i kształtem endoprotezy (rys.2) Dodatkowo jeden z trzpieni poddano analizie metalograficznej (rys.3) za pomocą mikroskopu elektronowego. Analiza ta ujawniła, że uszkodzenie rdzenia spowodowane było działaniem mechanizmów zmęczeniowych. W miejscu inicjacji autor artykułu zaobserwował wiele rys, pęknięć i drobnych prążków zmęczeniowych. Powierzchnia przełomu charakteryzowała się niską deformacją plastyczną materiału, co dodatkowo potwierdza tezę o kruchym złamaniu zmęczeniowym [15]. Kolejny przypadek złamania izolowanego trzpienia endoprotezy został opisany przez Prendergasta (2002) z Departamentu Chirurgii Ortopedycznej Akademickiego Szpitala w Rotterdamie. U pacjentki, lat 52, zdiagnozowano złamanie trzpienia endoprotezy Exter, wprowadzonego do organizmu zaledwie 3 lata wcześniej [24]. Złamanie trzpienia nastąpiło na wysokości 9 cm od jego dolnego końca. Do analizy powierzchni przełomu użyto mikroskopu skaningowego. Jako miejsce inicjacji pęknięcia wyznaczono przednio-boczną krawędź trzonu. Na taką identyfikację pozwoliły, przede wszystkim, bardzo widoczne prążki zmęczeniowe, znajdujące się na powierzchni pęknięcia, wskazujące jednoznacznie na zniszczenie zmęczeniowe powstałe na skutek cyklicznych naprężeń (rys.4). Brak podparcia w części przednio-bocznej mógł być czynnikiem przyczyniającym się do wzrostu naprężeń rozciągających. Rysunek 2. Zdjęcia obrazujące złamanie, a) zdjęcie rentgenowskie, b) zdjęcie po ekstrakcji z kości [9] 313 Żaneta Anna Mierzejewska Rysunek 3. Zdjęcia przełomów wykonane przy użyciu wysokiej rozdzielczości SEM, a) powierzchnia przełomu w centralnej części trzpienia z widocznymi prążkami i szczelinami, b) powierzchnia na obrzeżach przełomu [9] Wydłużone ramię momentu siły wywierało nacisk na smukłą część dystalną protezy. Taki mechanizm pękania trzpieni został opisany w roku 1995 przez Rokkuma – na przykładzie matowych trzpieni typu Exter, przy czym wykluczono istnienie jakichkolwiek wad materiałowych i produkcyjnych. Połączenie dużego momentu działającego na przekrój o niewielkiej powierzchni może być więc powodem gromadzenia się dużych obciążeń zmęczeniowych stymulujących pękanie trzpienia [24]. Jak podaje źródło, przez 13 lat obserwacji gładko polerowanych trzpieni wykonanych ze stali 316L, zniszczeniu w postaci pęknięcia lub złamania izolowanego, uległo tylko 8 z 426 wszczepionych implantów. W roku 1976 zmieniono geometrię trzpienia oraz jego grubość, a powierzchnię z polerowanej zmieniono na wykończenie matowe. Wskaźnik złamań matowego trzpienia Exter w roku 1996 wyznaczono na 0,2 %, jednak okazało się, że trzpienie te w znacznej większości ulegały obluzowaniu w kanale szpikowym [24]. Wilson w swoim artykule opisał siedem przypadków złamań trzpieni endoprotez kołnierzowych, z których dwie mocowane były za pomocą cementu kostnego, pozostałe – na wcisk (rys.5). W przypadku sześciu z opisywanych trzpieni złamanie miało miejsce na wysokości 1/3 proksymalnej części trzpienia, natomiast złamanie siódmego trzpienia złamanie nastąpiło 20 mm od kołnierza. Zdaniem autora powodem pęknięcia trzpieni, w każdym z tych przypadków, były wady konstrukcyjne. Średni czas pomiędzy wszczepieniem implant, a zdiagnozowaniem złamania wynosił 41 miesięcy [25]. 314 Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów wytwarzanych tradycyjnymi technologiami Rysunek 4. Zdjęcie SEM obrazujące przełom przy różnym powiększeniu: a) 400 x i b) 100 x [24] Carlson, Stenport i Gentz [21] opisali 14 przypadków złamań trzpieni endoprotez mocowanych za pomocą cementu kostnego po operacjach endoprotezoplastyki przeprowadzonych w General Hospital w Malmo. Wszystkie te implanty wykonane były ze stali 316L technologią kucia i pochodziły z tej samej fabryki. Średni czas pomiędzy wszczepieniem implantu a zdiagnozowaniem złamania wynosił 40 miesięcy, przy czym jedno nastąpiło już po 14 miesiącach od wszczepienia endoprotezy. Rysunek 5. Zdjęcia obrazujące dwa różne miejsca złamania, a) przy kołnierzu, b) w miejscy zwężenia [25] Badania radiologiczne wykazały, że złamania nastąpiły w odległości 61100 mm od koniuszka trzpienia. Jako powód złamania trzpieni autorzy sugerują złe zamocowanie w kanale szpikowym poprzez niedokładne naniesienie cementu kostnego, co z kolei spowodowało poluzowanie endoprotezy i wykruszania się kleju kostnego. Skutkiem tego jest znaczący wzrost naprężeń panujących w trzpieniu, co może prowadzić do korozji, 315 Żaneta Anna Mierzejewska złamania zmęczeniowego lub do kombinacji tych czynników, co – według autorów, przy odpowiednio zamocowanej endoprotezie nie powinno się wydarzyć [21]. Wróblewski w swoim artykule opisuje badanie siedemdziesięciu trzpieni wykonanych ze stali 316 L. Jako przyczynę pęknięcia trzpieni wskazuje on na znaczne obciążenia skręcające wynikające z nieodpowiedniej konstrukcji trzpienia. Jako miejsce inicjacji pęknięcia autor wskazuje na przednio – boczną krawędź trzpienia i popiera swoją teorię fotografiami przełomów, na których widoczne są prążki zmęczeniowe. Pęknięcie trzpienia zainicjowane zostało w miejscu największych naprężeń i rozciągnęło się do góry, do tyłu i przyśrodkowo [18]. W innym artykule ten sam autor dokonuje analizy 120 przypadków złamań trzpieni Charnley’a wykonanych ze stali 316L [26]. Większość złamań odnotowano po 11 latach od przeprowadzenia endoprotezoplastyki na grupie 115 pacjentów. Jedynie w ośmiu przypadkach złamanie nastąpiło po ok. 2 latach i spowodowane było czynnikami zewnętrznymi, np. upadkiem pacjenta. Wszystkie endoprotezy mocowane były za pomocą cementu kostnego i właśnie tutaj autor dopatruje się przyczyn niepowodzeń implantacji. Dodatkowa analiza wykazała, że wszyscy pacjenci cierpieli na znaczną nadwagę, co w znacznym stopniu zwiększyło prawdopodobieństwo pęknięcia implantu [26]. Kishida, Sugano i Sakai przeprowadzili na grupie 176 pacjentów 204 operacje endoprotezoplastyki z użyciem porowatych implantów kobaltowo – chromowo – molibdenowych, mocowanych na wcisk. Jedynie 5 z nich uległo złamaniu, wszystkie na wysokości 1/3 odległości od wierzchołka trzpienia. Jedno ze złamań nastąpiło niecały tydzień po operacji, pozostałe powstały po okresie mniej więcej 5 lat. Autor wymienia kilka powodów, które mogły spowodować pęknięcie, m.in. wady materiałowe (wskazuje na obecność porów, ubytków i wtrąceń niemetalicznych), nieodpowiednie zamocowanie implantu, odbiegającą od normy geometrię kości udowej [27]. Lakstein analizuje 6 przypadków złamań trzpieni endoprotez (Zimmer, Warsaw, Indiana), które nastąpiły w okresie od 13 do 80 miesięcy po przeprowadzeniu endoprotezoplastyki. Wszystkie trzpienie były porowate, mocowane na wcisk. Trzy z nich (rys.6,7) poddane zostały analizie materiałowej. We wszystkich przypadkach odnotowano boczne i przednie uszkodzenie ścianki trzpienia, które pod działaniem naprężeń zginających doprowadziły do pęknięcia trzpienia. Dalsze oględziny powierzchni złamania ujawniły trzy różne tekstury na powierzchni przełomu. Obszar A (pękanie zmęczeniowe) zajmuje ok. 40% powierzchni złamania, charakteryzuje się gładką teksturą o płaskiej orientacji. Obszar C (przełom resztkowy) ma szorstką fakturę i obejmuje ok. 30% powierzchni złamania. Obszar B (pękanie doraźne) obejmuje również ok. 30% powierzchni 316 Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów wytwarzanych tradycyjnymi technologiami złamania, a jego charakterystyczną cechą jest chropowata struktura wewnątrz przełomu i gładka na obrzeżach [28]. Hernandez-Rodrigues i Orteza-Saenz (3) przedstawili w artykule przykład pacjenta, u którego złamanie trzpienia zdiagnozowano niecałe 5 lat od przeprowadzenia operacji endoprotezoplastyki. W celu ustalenia, dlaczego doszło do pęknięcia trzpień poddano analizie OM, SEM i EDS. Autorzy na podstawie wyników badań własnych wywnioskowali, że powodem pęknięcia była wysoka koncentracja naprężeń na przedniobocznej powierzchni trzpienia. Nieciągłości materiału i wady powierzchni skumulowane wokół miejsca inicjacji pęknięcia spowodowały, że przekrój poprzeczny trzpienia nie był w stanie utrzymać wysokich obciążeń, jakie generowane były przez aktywnego fizycznie pacjenta. Analiza wykazała również obecność dużych cząstek zanieczyszczeń, przede wszystkim siarki, ale według autorów zdecydowanie nie był to główny powód pęknięcia (rys.8,9) [29]. Rysunek 6. Zdjęcie rentgenowskie obrazujące przełom i a) wyszczególnione obszary złamania: (A) przełom doraźny, (B) przełom zmęczeniowy, (C) przełom resztkowy, b) ognisko [28] 317 Żaneta Anna Mierzejewska Rysunek 7. Zdjęcia przełomów wykonane przy użyciu wysokiej rozdzielczości SEM obrazujące przełom zmęczeniowy i ujawniające: a) obszar A, b) miejsce inicjacji i prążki zmęczeniowe, c) obszar przełomu z wtórnymi pęknięciami, d) dodatkowe pęknięcia poprzeczne, e, f) wgłębienia wynikające z przeciążenia materiału [28] Rysunek 8. Zdjęcia przedstawiające: a) złamany trzpień, b) przełom z wyszczególnionym:1 miejscem inicjacji, 2 odkształceniem plastycznym, c) widok z boku obrazujący skręcenie trzpienia w miejscu pęknięcia [29] 318 Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów wytwarzanych tradycyjnymi technologiami Rysunek 9. Zdjęcie z MO obrazujące: a) obecność wytrąceń siarczków, b) strukturę austenityczną bez widocznych węglików i fazy ferrytycznej [29] 4. Wnioski W tabeli 4 zsumowano dane dotyczące liczby złamań trzpieni endoprotez stawu biodrowego otrzymanych z różnych materiałów implantacyjnych oraz czas ich użytkowania. Dane zawarte w tabeli 4 ukazują, że najwięcej (88,6%) odnotowanych przypadków złamań izolowanych trzpieni endoprotez dotyczy stali austenitycznej. Stop ten, po przeróbce plastycznej na zimno, zazwyczaj charakteryzuje się bardzo drobnoziarnistą mikrostrukturą, która przyczynia się do zwiększenia wytrzymałości na rozciąganie. Z drugiej strony powoduje zwiększenie twardości i obniżenie ciągliwości stali, co może wpływać na pogorszenie jej odporności na pękanie [30]. Według brytyjskiej normy ISO 5832-1:199 stal austenityczna może zostać wykorzystana do produkcji trzpieni endoprotez stawu biodrowego. Natomiast zgodnie z polską normą PN-ISO 5832-1 implanty wykonywane z tej stali austenitycznej zaliczane są do wszczepów krótkotrwałych i nie powinny być stosowane na elementy endoprotez stawu biodrowego, które z założenia są wszczepami długookresowymi. Jednak na podstawie najnowszych danych literaturowych [10, 16, 22, 31‚35] należy stwierdzić, że częstość stosowania implantów wykonanych z tej stali nie maleje, pomimo dostępności na rynku innych materiałów. Na pewno, w przypadku stali istotnym czynnikiem jest jej cena. Chociaż norma ISO dopuszcza stal austenityczną do produkcji implantów przeznaczonych do długotrwałego funkcjonowania w organizmie ludzkim, to powstaje pytanie, czy rzeczywiście i w jakich przypadkach stop ten należy stosować. Być może istnieje potrzeba ustalenia kryteriów, które powinny być spełnione, w przypadku stosowania trzpieni wykonanych ze stali austenitycznej. 319 Żaneta Anna Mierzejewska Tabela 4 Tabela zbiorcza dotycząca różnych przypadków złamań trzpieni endoprotezy Liczba złamanych trzpieni Czas użytkowania [w miesiącach] 108 96 8 Materiał Mocowanie Stal austenityczna Stal austenityczna Tytan Tytan Kobalt Tytan Stal austenityczna Kobalt Kobalt Kobalt Stal austenityczna Cementowe Cementowe Bezcementowe Bezcementowe Bezcementowe Bezcementowe Cementowe Bezcementowe Bezcementowe Bezcementowe Cementowe 1 13 1 1 5 3 14 5 2 2 1 Stal austenityczna Cementowe 1 36 Kobalt Bezcementowe 5 82 Stal austenityczna Cementowe 1 264 Tytan Bezcementowe 6 48 Kobalt Bezcementowe 3 20 Kobalt Bezcementowe 4 45 Stal austenityczna Cementowe 5 163 Stal austenityczna Cementowe 2 Stal austenityczna Cementowe 1 48 Stal austenityczna Cementowe 1 54 Tytan Bezcementowe 2 Brak danych Stal austenityczna Cementowe 69 Brak danych Stal austenityczna Cementowe 120 108 Stal austenityczna Cementowe 14 47 320 36 66 40 80 150 Brak danych 48 Brak danych Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów wytwarzanych tradycyjnymi technologiami Łącznie złamanych trzpieni 282 % stal austenityczna 86,2 % % stopy kobaltu 9,2 % % stopy tytanu 4,6 % Trzpienie cementowe 86,2 % Trzpienie bezcementowe 13,8 % Chociaż nie wszystkie opisane w literaturze przypadki złamań poddano wnikliwej analizie metalograficznej, to badania, w których przeprowadzono obserwacje przy użyciu SEM ujawniły w zdecydowanej większości przypadków cechy złamania zmęczeniowego. Inicjacja pęknięcia zlokalizowana została na przednio-bocznym narożu trzpienia. Z przedstawionego przeglądu literaturowego wynika również, że główną przyczyną pękania trzpieni jest nadwaga pacjentów, która zgodnie z badaniami przeprowadzonymi przez Wróblewskiego, wykazuje liniową zależność pomiędzy masą ciała, a okresem użytkowania endoprotezy. Ponieważ, pomimo dynamicznego postępy, jaki jest obserwowany w endoprotezoplastyce stawu biodrowego, do chwili obecnej nie udało się w pełni wyeliminować problemów związanych z izolowanym pękaniem trzpieni endoprotez, należy podjąć dalsze badania zmierzające do wyjaśnienia tego zjawiska. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Korzyński M, Cwanek J., Procesy zużycia w stawie biodrowym, Zbiór prac seminarium naukowego Mechanika w Medycynie, 1 (1993) Blicharski M., Wstęp do inżynierii materiałowej, Wydawnictwa NaukowoTechniczne, (2009), s. 428-446 Nowacki, L., Gustavo F., Biomateriały w konstrukcji implantów, Open Access Library, vol. 11, (2012) Błaszczyk W., Biomechanika kliniczna. Podręcznik dla studentów medycyny i fizjoterapii, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, (2004) Ackrermann K., Implantologia, Urban&Partner, (2004) Będziński R., Ścigała K., Biomechanika stawu biodrowego i kolanowego. Tom 5 Biocybernetyka i inżynieria rehabilitacyjna, Akademicka Oficyna Wydawnicza Exit, (2004) Bernakiewicz M., Będziński R., Analiza stanu naprężeń kości udowej w ekstremalnych warunkach obciążeń, Zeszyty Nukowe Konferencji Mechaniki Stosowanej, (1999) 321 Żaneta Anna Mierzejewska 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. Kishida Y., Sugano N., Stem fracture of the cementless spongy metal Lubeck hip prosthesis, The Jurnal of Arthroplasty, (2002) Brooks S., Fracture of fully hydroxyapatite-coated titanium femoral stem of a total hip replacement – a report of 3 cases, Acta Orthop Scand (2004), 75 (6), s.768-771 Drobniewski M., Sibiński M., Złamanie trzpienia endoprotezy jaki rzadkie powikłanie alloplastyki stawu biodrowego – opis dwóch przypadków, Chirurgia Narządów Ruchu i Ortopedia Polska, (2010), s. 53-56 Hernandez-Rodriguez M., Ortega-Saenz J., Failure analysis of a total hip prosthesis implanted in active patient, Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials, (2010), s. 619-622 Lakstein D., Eliaz N., Fracture of cementless femoral stem at the mid-stem junction modular revision hip arthroplasty system, The Journal of Bone & Joint Surgery, (2011) Martens M., Aernoudt E., De Meester P., Ducheyne P., Muller J. C., Delangh R., Kestelijn P,. Factors in the Mechanical Failure of the Femoral Component in Total Hip Prosthesis, Acta Orthop Scandinavica (1974), 45(5), s. 693-710 Berkenbilt S. I., Hungeford W., Fracture of an Extensively Porous-Coated Femoral Stem-Case Report, About Joints, (2003) [cited 2013 Jan 21]. Avaliable from: URL: http://aboutjoints.com/physicianinfo/casereports/case4/Case4.htm Brooks S., Sharma D. K., Creasey S., Lewis B., Fracture of fully hydroxyapatite-coated titanium femoral stem of a total hip replacement—a report of 3 cases, Acta Orthop Scand, (2004),75(6), s. 768-71 Kotela A., Ambroziak P., Deszczyński M. J., Złamanie trzpienia endoprotezy stawu biodrowego – opis przypadku, Ostry dyżur (2012) tom 5, numer 1-2 Bono J., McCarthy J., Thornhill T., Revision Total Hip Arthroplasty, Springer, (1999) Wróblewski B. M., The mechanism of francture of the femoral prosthesis in total hip replacement, International Orthopaedics Springer, (1979), vol. 3(2), s. 137-139 Żurek-Świeczko B., Biomateriały, Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej, (2009) Martens M., Aernoudt E., De Meester P., Ducheyne P., Muller J. C., Delangh R., Kestelijn P., Factors in the Mechanical Failure of the Femoral Component in Total Hip Prosthesis, Acta Orthop Scandinavica (1974), 45(5), s.693-710 Carlsson A. S., Gentz C. F., Stenport J., Fracture of the femoral prosthesis in total hip replacement according to Charnley, Acta Orthop Scand (1977), 48(6), s. 650-655 Murray D. W., Cemented femoral fixation: the North Atlantic divide, Orthopedics (2011), 34(9), s. 462-463 Rae P. J., Hardinge K., Segmental fracture of the femoral stem of a lowfriction arthroplasty. A case report. J. Arthroplasty, (2011) vol.2, s. 241-243 Prendergast J., Fracture of an Exeter stem 3 years after impaction allografting— a case report, Acta Orthop Scand (2002), s.111-113 322 Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów wytwarzanych tradycyjnymi technologiami 26. Wilson L., Fracture of the femoral stem of the ring TCH hip prosthesis, British Editorial Society on Bone and Joint Surgery, (1992) 27. Wróblewski B. M., Fractured stem in total hip replacement: A clinical review of 120 cases, Acta Orthop Scand (1982), s. 279-284 28. Kishida Y., Sugano N., Ohzono K., Sakai T., Nishii T., Yoshikawa H., Stem Fracture of the Cementless Spongy Metal Lubeck Hip Prosthesis, The Journal of Arthroplasty, (2002)17:8, s.1021-1027 29. Lakstein D., Eliaz N., Levi O., Backstein D., Kosashvili Y., Safir O., Gross A. E., Fracture of cementless femoral stem at the mid – stem junction in modular revision hip arthroplasty system, The Journal of Bone & Joint Surgery (2011) 05;93(1), s. 57-65 30. Hernandez-Rodriguez M., Ortega-Saenz J., Failure analysis of a total hip prosthesis implanted in active patient, Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials, (2010), s. 619-622 31. Clemens D., Galante J., Rostoker W., The Influence of Grain Size on the Fatigue Behavior of Annealed 316 LVM Stainless Steel, J Biomed Mater Res (1979) 13(3), s.437-41 32. Ling S. M. R., Cahrity J., Lee A. J. C., Whitehouse S. L., Timperley A. J., Gie G. A., The Long-Term Results of the Original Exeter Polished Cemented Femoral Component – A Follow-up Report, The Journal of Arthroplasty (2009) 24(4), s.511-527 33. Purbach B., Kay P. R., Siney P. D., Fleming P. A., Wroblewski M., The C-Stem in Clinical Practice: Fifteen-Year Follow-Up of a Triple Tapered Polished Cemented Stem, The Journal of Arthroplasty (2013), vol. 28: 8, s. 1367-1371 34. Sen R. K., Mootha A. K., Saini R., Kumar V., Segmental Fracture Of A Cemented Femoral Stem – A Case Report And Review Of Litrature, The Internet Journal of Orthopedic Surgery (2009); vol.13, no. 1 35. Hailer N. P., Garellick G., Karrholm J., Uncemented and cemented primary total hip arthroplasty in the Swedish Hip Arthroplasty Register, Acta Orthop (2010);81(1), s.34-41 36. Scheerlinck T., Druyts P., Casteleyn P. P., The use of primary total hip arthroplasty in university hospitals of the European Union, Acta Orthop Belg (2004);70(3), s.231-239 323 Żaneta Anna Mierzejewska Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów wytwarzanych tradycyjnymi technologiami Prawidłowo zbudowany i funkcjonujący staw biodrowy umożliwia płynny zakres ruchu w wielu płaszczyznach. Jakakolwiek zmiana chorobowa w tym układzie może prowadzić do uszkodzenia stawu, poprzez jego deformację, ból lub utratę funkcji. Endoprotezoplastyka stawu biodrowego jest zabiegiem mającym na celu wymianę uszkodzonych powierzchni stawowych i zastąpienie ich elementami sztucznymi. Jednak, jak każda ingerencja chirurgiczna, niesie ze sobą ryzyko powikłań. Jednym z nich jest złamanie izolowanie trzpienia, polegające na złamaniu implantu wewnątrz kanału szpikowego, bez uszkodzenia otaczających go tkanek. Artykuł zawiera przegląd literatury dotyczącej klinicznych przypadków złamań izolowanych trzpieni endoprotez stawu biodrowego wykonanych ze stali austenitycznej. Pomimo, iż izolowane złamanie trzpienia nie jest zaliczane do częstych powikłań występujących po implantacji, to brak w literaturze fachowej przejrzystego opisu przyczyn występowania tego zjawiska oraz danych statystycznych, skłania do podjęcia tej tematyki. The causes of mechanical destroying of implants manufactured with traditional technologies A properly built and functioning hip joint enables a smooth range of motion in multiple planes. Any lesion in this system may lead to damage of the pond, through its deformation, pain or loss of function. Hip replacement is an operation designed to replace damaged articular surfaces and replacing them with artificial components. However, like any surgical intervention, carries the risk of complications. One of them is to break the isolated stem consisting in breaking the implant within the intramedullary canal without damaging surrounding tissues. The article contains a review of the literature on clinical cases of isolated fractures of the hip endoprosthesis stems mainly made of austenitic stainless steel. Although isolated fracture of the stem is not included in the frequent complications occurring after implantation, the lack in the literature a clear description of the causes of this phenomenon and statistical data tends to take up this subject. 324 Adrian Dubicki1, Żaneta Anna Mierzejewska2 Projekt indywidualnego implantu kości biodrowej 1. Wstęp Istnieje wiele różnych procedur leczenia dysfunkcji miednicy, zarówno inwazyjnych jak i nieinwazyjnych. Niektóre ze schorzeń wymagają zastosowania implantów lub endoprotez, które różnią się konstrukcją, wykorzystanymi materiałami i wykończeniem powierzchni. Często ich jedynym wspólnym punktem jest cel zastosowania, którym jest przywrócenie funkcji miednicy. Czasami zaawansowanie i rozległość choroby czy urazu nie pozwalają na skuteczne zastosowanie standardowych metod i jedynym wyjściem jest przygotowanie indywidualnego rozwiązania w postaci implantu [1, 2]. Rola implantów w organizmie oraz fakt, że będą wewnątrz niego umieszczone, powoduje konieczność postawienia im licznych wymagań [3]. Ze względu na rozległość oraz złożoność zabiegu chirurgicznego, ważne jest uniknięcie komplikacji oraz maksymalne skrócenie czasu operacji. Ważnym jej etapem, podczas którego występuje najwięcej problemów, jest dopasowanie takiego wszczepu. Z tego powodu, w trakcie przygotowywania spersonalizowanego implantu, należy zwrócić szczególną uwagę na jego dopasowanie, co pozwoli uniknąć komplikacji i znacząco skróci czas zabiegu jego wszczepienia [1]. 2. Cel pracy W związku z przedstawionymi powyżej problemami, zaproponowane w pracy rozwiązanie oparte będzie na wykorzystaniu programów komputerowych, umożliwiających otrzymanie wirtualnych modeli oraz wspomagających proces projektowania. Cyfrowy model kości miednicy otrzymany zostanie dzięki użyciu inżynierii odwrotnej (ang. Reverse Engineering) – badanie tomografem komputerowym, projektowanie na jego podstawie implantu przeprowadzone zostanie w programach wspomagających projektowanie (ang. Computer Aided Design), a do wytworzenia 1 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej, Wydział Mechaniczny, Politechnika Białostocka, www.pb.edu.pl 2 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej, Wydział Mechaniczny, Politechnika Białostocka, www.pb.edu.pl 325 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska wszczepu użyta będzie technika szybkiego prototypowania (ang. Rapid Prototyping) – wydruk 3D z proszków biozgodnych metali. Obranie takiej ścieżki pozwala na zwiększenie dokładności dopasowania implantu do pozostałych struktur anatomicznych pacjenta, co przekłada się na zmniejszenie ryzyka powikłań oraz skrócenie czasu trwania zabiegu operacyjnego. 3. Cyfrowy model kości Niemal u każdego pacjenta, z poważnymi schorzeniami czy uszkodzeniami w obrębie miednicy wykonywane jest badanie tomografem komputerowym lub rezonansem magnetycznym. Głównym celem jego przeprowadzenia jest poznanie rozległości choroby lub obrażeń chorego. Na podstawie badania, lekarz może potwierdzić wstępnie postawioną diagnozę, a dzięki dokładności wyników, rozszerzyć ją. Do otrzymania modelu komputerowego kości wykorzystano oprogramowanie MIMICS. Jest ono profesjonalnym narzędziem do segmentacji obrazów medycznych pochodzących z tomografii komputerowej lub rezonansu magnetycznego, ich wizualizacji oraz tworzenia trójwymiarowych modeli [4]. Proces przygotowania trójwymiarowego modelu kości miednicy rozpoczął się od wczytania danych z tomografii komputerowej. Do celów projektu wykorzystane zostały skany tomograficzne dostępne w bibliotece programu MIMICS, zawierające obrazy struktur anatomicznych potrzebnych do niniejszej pracy. Okno programu MIMICS z wczytanymi obrazami tomograficznymi przedstawione zostało na rysunku 1. Rysunek 1. Okno programu MIMICS z wczytanymi obrazami TK 326 Projekt indywidualnego implantu kości biodrowej W celu zebrania wszystkich pikseli prezentujących na obrazach dany rodzaj tkanki, np. zgrupowanie tkanek kostnych i ich oddzielenie od tkanek miękkich, należy przeprowadzić operację progowania – opcja Thresholding Opcja ta wykorzystuje przypisanie poszczególnym pikselom wartości ze skali Hounsfielda. Wybranie pewnego przedziału ze skali wartości powoduje utworzenie maski zawierającej tylko te punkty, które mają przypisany współczynnik mieszczący się w wybranym przez użytkownika zakresie. Program umożliwia indywidualne dobranie wartości interesującego nas przedziału lub wybranie określonych w programie przedziałów, które w przybliżony sposób odpowiadają danej tkance np. kościom. W projekcie wykorzystano zaproponowany w programie zakres progowania dla kości, wynoszący od 226 do 1634 jednostek HU. Po wybraniu odpowiedniego przedziału i utworzeniu maski z pikselami reprezentującymi kości, można przystąpić do jej edycji. W utworzonym zbiorze znajdują się wszystkie piksele z całego obszaru badania, które mieszczą się w zadanym zakresie wartości ze skali Hounsfielda. Utworzenie trójwymiarowego modelu na podstawie tej maski dało by efekt w postaci modelu połączonych ze sobą kości (brak przejść stawowych), części naczyń krwionośnych (głównie tętnic) i narządów. Z tego powodu należy podać maskę edycji. Interesująca nas prawa kość miedniczna musi zostać odłączona od pozostałych wybranych tkanek. Umożliwi to w dalszych krokach oddzielenie pikseli reprezentujących strukturę, której model chcemy otrzymać i utworzenie z nich nowej maski. W celu oddzielenia punktów kości miednicznej od innych, reprezentujących kość udową, krzyżową i spojenie łonowe należy użyć funkcji Edit masks i jej opcji Erase. Pozwala ona na usunięcie, wymazanie zbędnych pikseli, odseparowanie złączonych w modelu kości o których wiemy, że w rzeczywistości są połączone tylko za pomocą tkanki chrzęstnej i nadanie nowych granic obiektom. Funkcja programu MIMICS – Calculate 3D, umożliwia wygenerowanie na podstawie pikseli wybranej maski, trójwymiarowego modelu struktur anatomicznych (rysunek 2a). Wygenerowany trójwymiarowy model kości miednicznej (2b) mógłby zostać wyeksportowany do oprogramowania CAD, w celu zaprojektowania implantu kości biodrowej. Posiada on jednak liczne niedoskonałości i nieciągłości. Wykorzystanie takiego modelu mogłoby spowodować złe dopasowanie do struktur anatomicznych i nieprawidłowe zaprojektowanie implantu. Dzięki opcji Calculate polylines (rysunek 3) program tworzy polilinie, które prowadzone są na granicy pikseli danej maski. Powoduje to łagodne wygładzenie powierzchni modelu. Utworzenie polilinii umożliwia przeprowadzenie kolejnej ważnej operacji. Jest nią Cavity fill from 327 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska polylines, która umożliwia uzupełnienie luk wewnątrz modelu. W wyniku użycia tej opcji utworzona jest nowa maska, w której skład wchodzą również woksele w poprzednich maskach nie uwzględniane. a) b) Rysunek 2. Wygenerowany model a) kośćca miednicy i kręgów lędźwiowych, b) model kości biodrowej Rysunek 3. Okno funkcji Calculate polylines oraz utworzone, widoczne na modelu 3D polilinie 328 Projekt indywidualnego implantu kości biodrowej 4. Obróbka cyfrowego modelu kości [5] Dalsza obróbka utworzonego cyfrowego modelu kości miednicznej wykonana została przy użyciu modułu Mimics Remesh, będącego częścią oprogramowania MIMICS. Za jego pomocą przygotowany został gotowy, cyfrowy model prawej kości miednicznej (w rozszerzeniu STL), który będzie mógł następnie zostać wykorzystany do projektowania implantu w oprogramowanie CAD. Po wybraniu opcji Remesh w programie MIMICS trójwymiarowy model jest automatycznie przenoszony do modułu Mimics Remesh. Okno modułu podzielone jest na trzy części. Po lewej znajduje się podgląd na model oraz lista przeprowadzonych procesów, a po prawej stronie okna panel kontrolny modelu i miejsce do wprowadzenia parametrów wykonywanych na modelu operacji. Przeniesiony do Mimics Remesh model przedstawiony jest w postaci siatki trójkątów. Podobnie jak w przypadku wizualizacji modelu w programie MIMICS (bez wyświetlenia siatki trójkątów), podobnie i w jego module, na podstawie obserwacji siatki trójkątów można zauważyć liczne niedoskonałości i nierówności. Ich wygładzenie możliwe jest dzięki opcji Smooth. Po jej wybraniu należy ustawić parametry wygładzania. W tym celu współczynnik wygładzenia (Smooth factor) ustawiony został na wartość 0,7. Ilość iteracji wygładzania (Number of iterations) ustawiono na piętnaście powtórzeń. Działanie funkcji Smooth opiera się na porównywaniu trójkątów z sąsiednimi i ich dopasowaniu w celu usunięcia nierówności. W wyniku zastosowania tej opcji, siatka trójkątów została wygładzona. Krawędzie talerza biodrowego oraz panewki nie są ostre, a powierzchnie mają płynne, gładkie kształty. Kolejnym etapem obróbki modelu jest wykorzystanie opcji Reduce. Jej użycie ma na celu uproszczenie siatki trójkątów. Przed wykonaniem tego kroku, model utworzony jest z równomiernie ułożonych trójkątów. Niezależnie czy opisywana przez nie powierzchnia jest płaska czy wypukła, do ich opisania używana jest taka sama liczba trójkątów. Powoduje to niepotrzebne skomplikowanie modelu. Po wybraniu opcji redukcji należy wprowadzić w oknie parametry procesu. Pierwszym jest Flip thresholds angle, który ustawiamy na wartość 15. Ten parametr decyduje o wartości kątów – im jest wyższy, tym trójkąty tworzące siatkę będą bardziej równomierne. Ważnym parametrem jest Geometrical error. Decyduje on o odchyleniu położenia nowego trójkąta w stosunku do położeń trójkątów go tworzących. Ustawiona na 0,9 wartość błędu geometrycznego oznacza, że model będzie różnił się od wejściowego, utworzonego na podstawie zdjęć tomografii komputerowej 329 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska o wartość maksymalnie 1/8 piksela. Pomimo uproszczenia, pozwoli to na dosyć dokładne odwzorowanie zdjęć TK przez model. Ilość iteracji redukcji (Number of iterations) ustawiono na 25 powtórzeń. W wyniku wykonania opcji Reduce siatka trójkątów tworząca model składa się 2140. Przed jej wykonaniem liczba trójkątów wynosiła 15954, więc w wyniku redukcji model został opisany siatką mniejszą o 13814 trójkąty. Siatka tworząca model, po przeprowadzonych operacjach składa się z mniejszej liczby trójkątów, ale nie rozłożonych równomiernie. Niektóre powierzchnie składają się z pojedynczych, a niektóre z nawet kilkudziesięciu trójkątów. Aby wyrównać siatkę należy użyć opcji Auto Remesh. W celu uzyskania dokładnego wyrównania położenia trójkątów wprowadzono parametry procesu. Pierwszym jest dokładność odwzorowania kształtu (Shape quality) wynosząca 0,3 oraz maksymalny błąd geometrii (Maximum geometrical error) ustawiony na wartość 0,4. Wymienione parametry zablokują możliwość zbyt dużego odchylenia od wartości początkowych i pozwolą na dokładne odwzorowanie struktur anatomicznych. Maksymalna długość krawędzi trójkąta (Maximal edge length) została ustawiona na wartość 5. Oznacza to że każda powierzchnia będzie opisana trójkątami o podobnych wymiarach. Ilość iteracji (Number of iterations) ustawiona została na 15 powtórzeń. 330 Projekt indywidualnego implantu kości biodrowej Rysunek 4. Parametry opcji Reduce. Modele kości przed redukcją (u góry) oraz po jej wykonaniu (u dołu) W wyniku wykonania operacji Auto remesh model ponownie składa się z większej liczby trójkątów. Ich liczba zwiększyła się do 15728. Świadczy to o tym że siatka składała się w głównej mierze z dużych trójkątów. Powierzchnie utworzone z małych trójkątów stanowiły rzadkość w modelu. Wykorzystanie opcji sprawiło równomierne rozmieszczenie siatki, jej wygładzenie i rozbudowanie. 331 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska Ostatnim krokiem, mającym na celu edycję siatki trójkątów jest wykorzystanie funkcji Quality Preserving Reduce Triangles. Ma ona na celu ponowną redukcję ilości liczby trójkątów, przy jednoczesnym zachowaniu jak najlepszej jakości modelu. Wprowadzone parametry procesu miały takie same wartości, jak w przypadku operacji Auto Remesh. Różnice pomiędzy siatkami przed i po wykonaniu operacji uproszczenia siatki są niemal nie zauważalne. Powodem tego jest ilość trójkątów o które pomniejszono siatkę. W wyniku tej operacji, liczba trójkątów wchodzących w skład siatki zmniejszyła się już tylko o 372 elementy. Tak otrzymany model może posłużyć do wykonania implantu kości biodrowej, lecz przed opuszczeniem programu należy sprawdzić budowę siatki. W tym celu wykorzystano funkcję Fix Wizard (rys. 5). Pozwala ona wykryć wszystkie niedoskonałości siatki, np. nieciągłości oraz automatyczną naprawę prostych defektów. Rysunek 5. Okno opcji Fix wizard sprawdzającej poprawność siatki 5. Projektowanie indywidualnego implantu kości biodrowej przy użyciu oprogramowania CAD Zaawansowane zmiany kości biodrowej mogą uniemożliwiać wykorzystanie modelu do celów projektowych. W takim przypadku konieczne było by przygotowanie modelu zdrowej kości miednicznej. Wtedy pierwszym krokiem, po wgraniu modelu do programu CAD – SolidWorks lub jeszcze na etapie programu MIMICS, powinno być wykonanie lustrzanego odbicia modelu zdrowej kości. Budowa anatomiczna kości miednicznych danego 332 Projekt indywidualnego implantu kości biodrowej człowieka nie różni się aż w takim stopniu, by uniemożliwić ich naprzemienne wykorzystanie. Kość biodrowa jest jedną z kości tworzących kość miedniczną. Wraz z kością łonową i kulszową buduje również panewkę stawu biodrowego. Z tego powodu, wykonanie implantu tylko i wyłącznie kości biodrowej nie jest możliwe [6]. Projektowany wszczep musi być zatem wyposażony w sztuczną panewkę. Aby połączenie implantu z pozostałymi kośćmi pacjenta nie odbywało się w bezpośrednim sąsiedztwie zewnętrznych powierzchni panewki, będzie ono miało miejsce na trzonie kości kulszowej i górnej gałęzi kości łonowej. Aby przygotować przyszły kształt implantu i odrzucić z wczytanego do programu modelu kości, które mają być u pacjenta zachowane, użyto opcji Wyciągnięcie wycięcia (rys. 6). Za jej pomocą, wcześniej przygotowane, przestrzennie dopasowane do kości szkice, posłużyły do przecięcia kości, we wcześniej opisanych miejscach. Rysunek 6. Przecięte w programie SolidWorks kości miednicy (po lewej – trzon kości kulszowej, po prawej – gałąź kości łonowej) Kolejnym ważnym krokiem w procesie projektowania implantu kości biodrowej jest przygotowanie panewki stawu biodrowego. Musi być ona odpowiednio ustawiona względem kości miednicznej, jak i również kości udowej. Zakres kąta osi panewki względem trzonu kości udowej powinien o o mieścić się w przedziale od 115 do 150 [6]. Najlepszym rozwiązaniem do wypozycjonowania łoża pod panewkę jest wykorzystanie naturalnej panewki pacjenta, której model posiadamy. W tym celu utworzona została płaszczyzna, przechodzącą symetrycznie przez środek panewki z wczytanego modelu. Wykonanie przekroju, na podstawie odpowiednio ustawionej płaszczyzny pozwala naszkicować kształt przyszłej powierzchni stawowej implantu. Przed przystąpieniem do projektowania panewki należało usunąć zbędne elementy modelu. W tym celu utworzony został szkic, który posłużył do wycięcia w modelu sfery, poprzez wykorzystanie operacji 333 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska Wycięcie przez obrót. Tak przygotowane miejsce dało pewność, że model struktur anatomicznych pacjenta nie wpłynie na kształt projektowanego implantu stawowego, nie będą obecne przenikania na powierzchnię przyszłej panewki jak i puste przestrzenie pod nią. Następnie został przygotowany szkic łoża. Etapy jego przygotowania zostały ukazane poniżej, na rysunku 7. Do utworzenia panewki (rysunek 8 a) użyto operacji Dodanie przez obrót. Zaprojektowana została w taki sposób, aby mogła współpracować z implantami powierzchni stawowych – kapami (po uprzednim przygotowaniu powierzchni i pokryciu warstwą odpornego na ścieranie azotku tytanu (TiN)) lub po wyposażeniu we wkładkę polietylenową – z głową endoprotezy stawu biodrowego. Wkładka polietylenowa, po umieszczeniu jej w łożu i wciśnięciu, blokuje się za pomocą wypustek, uniemożliwiając wysunięcie się [2]. Rysunek 7. Etapy projektowania panewki stawu biodrowego w implancie kości biodrowej (A – przekrój przez model panewki, B – oczyszczenie miejsca pod panewkę, C – szkic łoża panewki) Po wykonaniu operacji dodania do modelu panewki, przeprowadzony został pomiar, (rys. 8 b) mający na celu sprawdzenie prawidłowego ustawienia łoża względem trzonu kości udowej. Na odpowiednio ustawionej względem osi panewki płaszczyźnie, naszkicowane zostały linie – przechodząca przez jej środek symetrii oraz pionowa. Dokonany pomiar o kąta wykazał wartość bliską 126 . Świadczy to o prawidłowym ustawieniu implantu panewki w modelu kości miednicznej pacjenta, gdyż wartość kąta o o mieści się w poprawnym zakresie od 115 do 150 [6]. Kolejnym etapem projektowania indywidualnego implantu kości biodrowej jest dodanie mocowań (rys. 9). Pozwolą one na trwałe połączenie wszczepu z pozostawionymi kośćmi – kulszową i łonową. Ważne jest aby wypustki mocujące jak najdokładniej pasowały do powierzchni kości, a osie otworów pod wkręty kostne nie przecinały się, aby nie doszło do skrzyżowania umieszczanych w kości wkrętów. Dodanie mocowań odbywało się przy użyciu operacji Wyciagnięcie dodania/bazy oraz Wyciągnięcie po profilach. Skomplikowana geometria 334 Projekt indywidualnego implantu kości biodrowej modelu wymagała pracy na licznych płaszczyznach i przekrojach, na których następnie rysowane były szkice mocowań. Po wymodelowaniu wypustek używana była operacja Zaokrąglenie, mająca na celu usunięcie już na etapie modelu komputerowego ostrych, mogących powodować skaleczenia pacjenta jak i lekarza krawędzi. Po przygotowaniu ramienia mocowania, na ich końcach dodawane były otwory. Będą one umożliwiały przymocowanie za pomocą wkrętów kostnych, implantu do kości. Średnice wszystkich otworów mają wartość 4,4 milimetra. W fazie obróbki wykańczającej powinny zostać rozwiercone do średnicy 4,6 milimetra, co umożliwi zastosowanie śrub dokostnych o średnicy 4,5 milimetra. a) b) Rysunek 8. Dodane do implantu kości biodrowej a) łoże panewki stawu biodrowego, b) pomiar wartości kąta pomiędzy osią panewki, a trzonem kości udowej Po zakończeniu przygotowywania otworów pod wkręty kostne, ważne jest również przygotowanie gniazda pod łeb śruby. W tym celu użyta została operacja Sfazowanie. Umożliwiła ona otrzymanie wgłębienia, w które przynajmniej w części schowany będzie łeb wkrętu kostnego. Kolejnym etapem projektowania jest dodanie na ścianach implantu, które będą łączyć się z kośćmi, powierzchni umożliwiających przerost tkanką kostną. Do ich wykonania posłużyła operacja Wyciągnięcie wycięcia wykonywana na podstawie sporządzonych na kilku płaszczyznach szkiców. Powierzchnie te umożliwią po pewnym okresie od implantacji wrośnięcie w przygotowaną strukturę, żywej tkanki kostnej. Rezultatem przerostu tkanką, będzie dodatkowe, mechaniczne połączenie na granicy implant- 335 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska kość, powodujące jeszcze lepszą stabilizację wszczepu. Mechanizm osteointegracji można porównać do mechanizmu zrastania się złamanych kości [7]. Korzystanie z takich powierzchni daje pozytywne efekty, dlatego w dużej części nowoczesnych implantów, zarówno ortopedycznych jak i stomatologicznych można zaobserwować ich użycie. Istnieją różnorodne metody wytwarzania takich struktur oraz ich różne formy [7]. Najczęściej stosowanymi obecnie są powierzchnie wytworzone z hydroksyapatytu, napylonego stopu tytanu, a wraz ze wzrostem technik przyrostowych, bezpośrednio projektowane i drukowane. Rysunek 9. Mocowania implantu do kości kulszowej (po lewej) i łonowej Kolejnym etapem jest wykonanie mocowania implantu z kością krzyżową. Ze względu na położenie implantu względem kości krzyżowej, utrudnione staje się dodanie mocowań podobnych do wcześniej omawianych. Wygodniejszym rozwiązaniem jest zastosowanie otworów przechodzących przez implant, które posłużą do przytwierdzenia implantu przy użyciu wkrętów kostnych. Do programu SolidWorks wczytany został wcześniej przygotowany w programie MIMICS, model kości krzyżowej. Zaimportowany został w formie grafiki, co powoduje że nie wpływa on na projektowany wszczep i nie mogą być na nim wykonywane żadne operacje. Implant wraz z wczytanym modelem ustawione zostały w płaszczyźnie strzałkowej. Podgląd struktury kości krzyżowej umożliwił prawidłowe rozmieszczenie otworów (rys. 10), w miejscach gdzie łączy się ona z kością biodrową, a zarazem gdzie można zauważyć jej grubsze, wypukłe ścianki. Przy użyciu operacji Wyciągnięcie wycięcia, na podstawie szkiców i ich rozmieszczenia do modelu dodane zostały otwory służące do wprowadzenia śrub kostnych i trwałego połączenia implant-kość krzyżowa. Możliwe jest ono dzięki zastosowaniu trzech śrub mocujących, które pewnie i stabilnie unieruchomią implant w odpowiednim płożeniu. 336 Projekt indywidualnego implantu kości biodrowej Podobnie jak w przypadku wcześniej omawianych i dodanych mocowań, wykonane zostały dodatkowe wgłębienia oraz sfazowania, mające na celu schowanie łba śruby. Tak jak poprzednio, średnice wszystkich otworów mają wartość 4,4 milimetra, a w fazie obróbki wykańczającej powinny zostać rozwiercone do średnicy 4,6 milimetra, aby było możliwe zastosowanie wkrętów takich jak w poprzednich mocowaniach. Na stabilność implantu wpływ ma również rozbudowana, dobrze dopasowana struktura powierzchni łączących się z kością krzyżową, przez którą będą przenoszone siły z górnej części ciała. W kolejnym etapie projektowania należało przygotować szereg dodatkowych otworów, których funkcją będzie zapewnienie miejsca przyczepu mięśniom. Bez przywrócenia utraconych, podczas usuwania zmienionej chorobowo kości, połączeń pomiędzy układem kostnym, którego częścią staje się projektowany implant, a układem mięśniowym, nie możliwe jest przywrócenie mobilności i stabilności organizmowi [6, 7].Większość otworów zlokalizowana jest na obwodzie talerza kości biodrowej. Będą one służyć do przyczepu szerokiego pasma mięśni biodrowych. Pozostałe, rozmieszczone m.in. na guzowatości kości kulszowej czy biodrowej, będą służyć jako miejsce mocowania, m.in. dla mięśnia krawieckiego, lędźwiowego, naprężacza powięzi szerokiej oraz mięśni pośladkowych. Do przygotowanych otworów przymocowane będą również więzadła – pachwinowe i krzyżowo-biodrowe [6, 7]. Rysunek 10. Dobranie położenia otworów do mocowania implantu do kości krzyżowej. Wczytany model kości krzyżowej służy do prawidłowego rozmieszczenia otworów 337 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska Górna pozostałość krawędzi panewki stawu biodrowego wykorzystana została do przeprowadzenia przez nią otworów, podobnie jak w poprzednich przypadkach, mających na celu przymocowanie więzadła biodrowoudowego [6, 7]. Kolejnym ważnym krokiem projektowania, którego celem jest zmniejszenie masy implantu, jest dodanie ażurowych wycięć w rejonach wszczepu nie przenoszących znacznych sił. Przed przystąpieniem do wykonania tej operacji, wykorzystano opcję Właściwości masy, pozwalająca określić objętość i masę modelowanych obiektów. Przed użyciem opcji Właściwości masy, należy modelowi przypisać materiał, z jakiego ma być wykonany. Do wykonania wszczepu użyty zostanie stop tytanu Ti6Al4V. Jest on obecnie najczęściej stosowanym materiałem na różnego rodzaju implanty, spośród wszystkich biomateriałów metalicznych. Posiada on dobre własności mechaniczne, charakteryzuje się bardzo dobrą odpornością korozyjną i biokompatybilnością [7]. W porównaniu do innych stosowanych na endoprotezy materiałów (stali austenitycznej i stopów kobaltu), stop tytanu posiada niższą masę właściwą oraz moduł Younga. Wpływa to pozytywnie przy współpracy i przenoszeniu sił na granicy implantkość. Najlepsza spośród materiałów biozgodność sprawia że stopy tytanu są stosowane w licznych wariantach endoprotez, a szczególnie tych przeznaczonych dla osób młodych [7]. Ze względu na te korzystne połączenie właściwości mechanicznych (sprężystość, plastyczność, wytrzymałość) materiał ten zostanie wykorzystany do produkcji zaprojektowanego implantu. W poniższej tabeli 1, przedstawiono podstawowe właściwości mechaniczne nadawane przez program SolidWorks projektowanemu wszczepowi. Tabela 1. Właściwości materiałowe stopu Ti6Al4V z bazy programu SolidWorks Właściwość Wartość Moduł Younga Współczynnik Poissona Wytrzymałość na rozciąganie Granica plastyczności Masa właściwa 104800,3 N/mm2 0,31 1050 N/mm2 825,4 N/mm2 4428,8 kg/m3 W celu porównania masy projektowanego implantu, przygotowany został również model prezentujący zastępowaną przez wszczep kość. Program SolidWorks nie zawiera danych dotyczących właściwości mechanicznych kości, dlatego należało przygotować i wprowadzić dane dotyczące tkanki kostnej. Wprowadzone dane (tabela 2) dotyczą uśrednionych wartości budującej kość tkanki korowej i gąbczastej. 338 Projekt indywidualnego implantu kości biodrowej Tabela 2. Wprowadzone do programu SolidWorks właściwości materiałowe kości [8] Właściwość Moduł Younga Współczynnik Poissona Granica plastyczności Masa właściwa Wartość 2130 N/mm2 0,3 148 N/mm2 2000 kg/m3 Po przypisaniu materiałów, oba modele zostały poddane badaniu Właściwości masy, które oblicza m.in. objętość modelu i podaje wartość jego masy. Z otrzymanych danych (rys. 11) wynika, że masa usuniętej pacjentowi kości wyniosła by ok. 823 gramy, a masa zastępującego ją implantu wynosi ok. 1816 gram. Jest to wartość ponad dwukrotnie przewyższająca masę usuniętych tkanek. Wykonanie badania potwierdziło konieczność wykonania w implancie ażurowych przestrzeni. Główną lokalizacją, ze względu na przenoszone przez implant siły, będzie powierzchnia talerza kości biodrowej. Obciążenia, z kręgosłupa na kończynę dolną, przenoszone są pomiędzy kością krzyżową, a panewką stawu biodrowego. Talerz kości biodrowej w głównej mierze służy jako miejsce przyczepu licznych mięśni. Zastosowanie implantu będzie wiązać się z koniecznością znacznego zmniejszenia aktywności fizycznej. Siły generowane przez mięśnie, które dodatkowo będą poddane rekonstrukcji nie będą tak duże jak u zdrowego człowieka. Daje to możliwość zastosowania konstrukcji ażurowej, przy zachowaniu łukowatego brzegu talerza, który będzie służył za miejsce przyczepu i do przenoszenia sił mięśni. Rysunek 11. Porównanie masy implantu z masą kości przez niego zastępowaną 339 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska Pierwszym etapem przygotowania powierzchni i konstrukcji ażurowej jest wybranie odpowiednich, jak najbardziej równoległych do ścian talerza biodrowego powierzchni. Na ich podstawie utworzone zostały szkice, pozwalające na przygotowanie za pomocą operacji Wyciągnięcie wycięcia wycięć w materiale, w postaci struktury tzw. plastra miodu. W taki sposób przygotowane zostały cztery takie powierzchnie. Dwie graniczne, położone nad połączeniem implant-kość krzyżowa oraz przy guzie przednim, górnym talerza biodrowego powierzchnie nie zostały wycięte przelotowo przez implant. Ma to na celu zachowanie dopasowanej powierzchni stawowej (w przypadku pierwszej struktury) oraz wzmocnienia guza przedniego, górnego implantu (druga struktura), który będzie miejscem przyczepu m.in. mięśnia krawieckiego. Pozostałe dwie powierzchnie przechodzą na wylot talerza kości biodrowej. Wykonanie konstrukcji ażurowej pozwoliło na zmniejszenie masy implantu, przy zachowaniu wystarczającej jego wytrzymałości. Zostało to potwierdzone dzięki wykonaniu badania Właściwości masy. Widok implantu z wykonanymi strukturami ażurowymi przedstawiony został na rysunku 12. Zastosowanie konstrukcji ażurowej pozwoliło zmniejszyć masę implantu o 141 gram. W stosunku do pełnego implantu, masa po wykonaniu operacji wycięcia spadła o ok. 8%. Pozwoliło to na otrzymanie wartości masy implantu dwukrotnie większej od wartości kości. W poprzednim przypadku różnica ta wynosiła ok. 2,2. W celu zmniejszenia masy można byłoby zastosować puste przestrzenie wewnątrz implantu. Nie wpływały by one znacząco na wytrzymałość wszczepu. Przy obecnym stanie techniki, nie posiadamy jednak rozwiązania umożliwiającego pozostawienie takich przestrzeni. Stosowane techniki przyrostowe, dające możliwość wytwarzania detali z metali, jako podpory stosują używany do produkcji proszek. Przy zamknięciu wszystkich ścian, nie można by go było usunąć z wnętrza takiego implantu, a w przypadku uszkodzeń wszczepu mogło by dojść do wysypania go wewnątrz organizmu. Zaproponowana konstrukcja implantu spełnia stawiane mu założenia i oczekiwania. Wierne odtworzenie modelu kości miednicznej pacjenta pozwoliło na wykorzystanie modelu do wykonania idealnie pasującego do pozostałego kośćca pacjenta wszczepu. Dodane wypustki mocujące do kości kulszowej i łonowej oraz otwory do zamocowania z kością krzyżową pozwolą na stabilne połączenie implantu z kośćmi, a dodatkowe powierzchnie do przerostu tkanką kostną pozwolą na kolejne jej zwiększenie. Zastosowanie otworów, których funkcją ma być rekonstrukcja przyczepów mięśniowych umożliwia w pewnym stopniu odtworzenie funkcji 340 Projekt indywidualnego implantu kości biodrowej układu mięśniowego w obrębie miednicy. Wykorzystane ażurowe wycięcia zmniejszają masę implantu, bez znaczących strat w jego wytrzymałości. Wpasowana na podstawie modelu pacjenta do implantu panewka, pozwoli na przywrócenie funkcji ruchomości w stawie biodrowym i z biegiem czasu, w procesie rehabilitacji, umożliwi na lokomocję pacjenta. Rysunek 12. Widoki rzutów indywidualnego implantu kości biodrowej prawej 341 Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska 6. Wnioski/Podsumowanie Indywidualne implanty stają się coraz powszechniej stosowanym sposobem zastąpienia uszkodzonych tkanek i przywrócenia pełnionych przez nie funkcji. Rosnąca popularność związana jest z coraz częstszymi przypadkami dysfunkcji w obrębie kośćca miednicy, spowodowanymi poprzez zmiany zwyrodnieniowe, onkologiczne lub urazy. Zaawansowanie i rozległość niektórych z nich sprawia, że często jedynym rozwiązaniem są spersonalizowane implanty. Do popularyzacji indywidualnych implantów przyczynia się również rozwój techniki, który umożliwia przygotowanie i wytworzenie idealnie dopasowanych wszczepów. Nie byłoby to jednak możliwe bez znacznego postępu, który można zauważyć w technikach obrazowego diagnozowania medycznego. Oprócz precyzyjnej diagnozy, pozwalają otrzymać niezwykle przydatne w obecnej medycynie, trójwymiarowe modele tkanek i narządów pacjenta. Zaproponowany w pracy projekt, opartego na trójwymiarowym modelu implantu oraz metoda jego produkcji pozwalają osiągnąć wymienione cele. Użycie techniki inżynierii odwrotnej, poprzez wykorzystanie obrazów z tomografii komputerowej pozwoliło na otrzymanie niezbędnych do utworzenia modelu 3D danych. Wykorzystanie oprogramowania do rekonstrukcji obrazów medycznych MIMICS umożliwiło otrzymanie modelu kości miednicznych, a moduł Mimics Remesh, na jego przygotowanie do wykorzystania w celach projektowych, w oprogramowaniu CAD – SolidWorks. Wykorzystanie programu do komputerowego wspomagania projektowania dało możliwość przygotowania implantu, który pomimo licznych, zmniejszających masę ażurowych obszarów, będzie miał odpowiednią wytrzymałość. Pomimo licznych zalet, metoda posiada również wady. Wykonanie gotowego, pustego wewnątrz wyrobu nie jest możliwe. Stosowany jako podpora proszek pozostaje wewnątrz wszczepu. Możliwość wykonania implantu w postaci skorupy dałaby pozytywne efekty. Tak przygotowany implant byłby równie wytrzymały, a dodatkowo lżejszy. Pozwoliłoby to na naśladowanie w pewnym stopniu naturalnej struktury kości, składającej się z zbitej, zewnętrznej warstwy korowej i wewnętrznej, ażurowej tkanki gąbczastej. Rozwój techniki i medycyny będzie skutkował powstaniem coraz to nowszych metod zastępowania tkanek i rozwoju już istniejących. W świetle obecnego stanu techniki, zaproponowany projekt implantu kości biodrowej, jak i proces jego wykonania spełnia stawiane oczekiwania. 342 Projekt indywidualnego implantu kości biodrowej Podziękowania Praca zrealizowana przy wsparciu finansowym Wydziału Mechanicznego Politechniki Białostockiej w ramach projektu „Rozwój młodych naukowców i uczestników studiów doktoranckich‖ nr MB/WM/14/2014. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Gonera K., Kurzac J., Rusińska M., Dybała B., Metody CAx w aplikacjach medycznych przy wytwarzaniu technologiami generatywnymi, Wrocław, Miesięcznik Naukowo-Techniczny Mechanik, 2010, tom 83, numer 2, s. 132-142 Madej T., Modelowanie strefu ruchowej endoprotezy stawu biodrowego w aspekcie biomateriałów, Kraków, 2008, Praca doktorska, Wydział inżynierii mechanicznej i robotyki, Akademia Górniczo-Hutnicza Markowska O., Budzik G., Innowacyjne metody wytwarzania implantów kostnych za pomocą inżynierii odwrotnej (RE) oraz technik szybkiego prototypowania (RP), Sosnowiec, X Forum Inżynierskie ProCAx, 2011 Mimics. Medical Edition. Skrócona instrukcja obsługi oprogramowania [katalog], Leuven, Materialise NV, 2014 Mimics Student Edition Course Book [podręcznik], Leuven, Materialise NV, 2012 Bochenek A., Reicher M., Anatomia człowieka. Tom I. Warszawa, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2009, s. 232-237, 518-541 i 853-868 Anatomia człowieka. Podręcznik dla studentów i lekarzy, Praca zbiorowa pod redakcją W. Woźniaka. Wrocław: Elsevier Urban i Partner, 2010, s. 379-431 Polak Sz., Modelowanie i analiza właściwości mechanicznych kości, Poznań, 2014, Praca dyplomowa inżynierska, Wydział budowy maszyn i zarządzania, Politechnika Poznańska Projekt indywidualnego implantu kości biodrowej Zamysłem niniejszej pracy jest połączenie wiedzy medycznej z techniczną, w celu uzyskania zadowalającego efektu, jakim jest odtworzenie funkcji miednicy. W pracy został przedstawiony i opisany przebieg projektowania indywidualnego implantu kości biodrowej, przy wykorzystaniu najnowszych rozwiązań technicznych. Wykonywane badania tomografii komputerowej pozwalają na postawienie precyzyjnej diagnozy, a otrzymany z ich przetworzenia cyfrowy model kości miednicznej, posłużył do zaprojektowania w programie CAD wspomnianego implantu, dokładnie dopasowanego do pozostałych kości miednicy pacjenta. Kolejną korzyścią jest możliwość szybkiego wykonania takiego wszczepu przy użyciu techniki szybkiego prototypowania – drukując go z proszku tytanowego, przy użyciu drukarki 3D, czy przy wykorzystaniu obrabiarek sterowanych numerycznie. The project of individual ilium bone implant The intention of this work is to combine technical and medical knowledge in order to achieve a satisfactory result, which is to restore the function of the pelvis. In this work and described progress of individual design of the implant of the ilium has been shown, using the most modern technical solutions. Computed tomography allows to place a precise diagnosis and resulting from their processing digital model of the pelvic bone and to design the CAD model precisely matched to the rest of the patient's pelvic bone. Another benefit is the ability to quickly execute such an implant using rapid prototyping techniques – printing it titanium powder using a 3D printer, whether using numerically controlled machine tools. 343 Magdalena Grygiel-Pradelok1, Janusz Szewczenko2, Wojciech Kajzer3, Magdalena Antonowicz4 Ocena wpływu biodegradowalnej warstwy polimerowej (PLGA) na korozję podłoża ze stopów tytanu 1. Wprowadzenie Pomimo dynamicznego rozwoju inżynierii tkankowej oraz nowoczesnych biomateriałów polimerowych i ceramicznych, w dalszym ciągu do produkcji implantów najczęściej wykorzystuje się biomateriały metalowe. Wśród nich wyróżnić można: stal austenityczną, stopy kobaltu, czysty tytan oraz stopy tytanu [1, 2]. Główną przyczynę szerokiego stosowania materiałów metalowych stanowi relatywnie niski koszt, w porównaniu do innych grup materiałowych oraz szeroka dostępność. Podstawowe ograniczenie ich stosowania stanowi umiarkowana biotolerancja, na którą wpływa głównie niewystarczająca odporność korozyjna w środowisku tkanek człowieka, alergiczne i toksyczne oddziaływanie produktów degradacji na tkanki okołowszczepowe, a także wysoka wartość modułu sprężystości. Natomiast do zalet biomateriałów metalowych zalicza się przede wszystkim: wysoką wytrzymałość, odporność na zmęczenie i zużycie, łatwość produkcji oraz sterylizacji [3]. W wyniku prowadzonych przez wiele lat badań, opracowano szereg wymagań dotyczących składu chemicznego, struktury i właściwości mechanicznych biomateriałów metalowych. Szczególnie istotnymi są normy z serii PN-EN ISO 5832 (części 1‚3) – Implanty dla chirurgii – Materiały metalowe, a także normy z serii PN-EN ISO 10993:1-18 – Biologiczna ocena wyrobów medycznych. Niestety nadal nie osiągnięto zadawalającego poziomu biotolerancji implantów. Obecnie powszechnym dążeniem jest poprawa biotolerancji materiałów metalowych poprzez 1 [email protected], Katedra Biomateriałów i Inżynierii Wyrobów Medycznych, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Śląska, www.ib.polsl.pl 2 [email protected], Katedra Biomateriałów i Inżynierii Wyrobów Medycznych, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Śląska, www.ib.polsl.pl 3 [email protected], Katedra Biomateriałów i Inżynierii Wyrobów Medycznych, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Śląska, www.ib.polsl.pl 4 [email protected], Katedra Biomateriałów i Inżynierii Wyrobów Medycznych, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Śląska, www.ib.polsl.pl 344 Ocena wpływu biodegradowalnej warstwy polimerowej (PLGA) na korozję podłoża ze stopów tytanu modyfikowanie ich warstwy wierzchniej [4, 5]. Głównymi celami stosowania różnych metod modyfikacji warstwy wierzchniej implantów metalowych są: poprawa własności implantów w środowisku płynów fizjologicznych człowieka, w tym osiągnięcie lepszej biokompatybilności poprzez poprawę ich odporności korozyjnej i ograniczenie ilości produktów degradacji. Celem modyfikacji jest obniżenie kinetyki degradacji, a także wytworzenie warstwy wydzielającej substancje lecznicze do tkanek okołowszczepowych. Jakości warstw powierzchniowych nakładanych na biomateriały metalowe poświęcono wiele prac, jednakże wciąż prowadzone są badania mające na celu wyłonienie najlepszej. Wyróżnić można wiele metod obróbki powierzchniowej implantów metalowych, m.in [5]: polerowanie elektrolityczne; pasywacja; nanoszenie powłok metodami CVD oraz PVD; nanoszenie powłok węglowe typu DLC oraz NCD; implantacja jonów; napylanie plazmowe; utlenianie anodowe; powłoki nanoszone metodą zol-żel; nanoszenie powłok polimerowych. Wybrana metoda obróbki powierzchniowej jest bezpośrednio zależna od modyfikowanego materiału oraz przeznaczenia docelowej formy implantu. Niemniej jednak najczęściej, na powierzchni biomateriału, ze szczególnym uwzględnieniem jego cech geometrycznych, wytwarza się warstwy pasywne. Warstwy te nie są doskonałe, ponieważ pod wpływem działania płynów ustrojowych w organizmie człowieka oraz czynników mechanicznym ulegają uszkodzeniu. Na skutek zniszczenia warstwy pasywnej dochodzi do procesów korozyjnych w wyniku których przenikające do tkanek okołowszczepowych produkty degradacji biomateriału metalowego mogą wywoływać reakcje zapalne, alergiczne, cytotoksyczne bądź po prostu efekt drażnienia tkanek [1]. Aby zapewnić dobre właściwości mechaniczne implantów oraz ograniczyć ich negatywny wpływ na organizm ludzki niezbędne okazało się stosowanie różnego rodzaju powłok ograniczających proces metalozy z jednoczesnym neutralizowaniem reakcji układu immunologicznego pomiędzy tkanką a implantem. Jedną z nowoczesnych metod jest nanoszenie powłok biopolimerowych na odpowiednio przygotowane podłoże metaliczne. Przeprowadzono próby poprawy biozgodności implantów metalowych poprzez zastosowanie biodegradowalnych warstw polimerowych na bazie poliestrów alifatycznych [6]. Naniesienie na powierzchnię implantu metalowego powłoki polimerowej zabezpiecza organizm przed produktami 345 Magdalena Grygiel-Pradelok, Janusz Szewczenko, Wojciech Kajzer, Magdalena Antonowicz degradacji implantu metalowego, a także może dodatkowo przyśpieszyć regenerację tkanek poprzez kontrolowane uwalnianie leku [7]. W chirurgii kostnej, poza stalą austenityczną, wykorzystywane są również stopy tytanu. Jednym z najczęściej używanych stopów tytanu jest stop Ti6Al4V ELI, który wykazuje się dobrym zespołem własności mechanicznych, sprzyjających uzyskaniu szybkiej osteointegracji. Niestety stop ten posiada toksyczne pierwiastki glinu i wanadu, które mogą uwalniać się do organizmu. Badania nad biomateriałami doprowadziły do powstania stopu Ti6Al7Nb [1]. Pomimo dobrych właściwości stopów tytanu – dobra odporność na korozję – nadal trwają prace nad modyfikacją powierzchni tych stopów, w celu polepszenia ich własności mechanicznych, chemicznych i biologicznych [8-10]. Jest to spowodowane zwiększającą się liczbą pacjentów, u których wystąpiły reakcje na produkty ich degradacji, w tym Ti i Al. Dużą uwagę w ostatnich latach przyciągnęły polimery biodegradowalne, które dzięki wchłanialności przez organizm mogą być stosowane w medycynie. W celu zmiany właściwości oraz zapobieganiu korozji możliwe jest naniesienie na powierzchnię stopu tytanu powłoki ochronnej, czyli powłoki z polimeru biodegradowalnego. Naniesiona na powierzchnię stopów warstwa ma za zadanie podwyższenie odporności na korozję, zwiększenie biokompatybilności lub też uwalnianie leków do otaczających implant tkanek. Dla implantów o złożonej budowie lub skomplikowanej geometrii, małych części lub wyrobów o małej grubości nanoszenie warstwy polimerowej najczęściej następuje z wykorzystaniem metody zanurzeniowej. Metodę tę cechuje przede wszystkim prostota i łatwość wykonania [12]. Polimery biodegradowalne w większości zbudowane są z biokompatybilnych monomerów L-laktydu, glikolidu, p-dioksanonu i kaprolaktonu [11]. Poli(L-laktyd-ko-gliokolid) jest jednym z najczęściej stosowanych polimerów biodegradowalnych na powierzchnię metalowego implantu. Determinuje to powszechna dostępność tego alifatycznego poliestru w handlu, który dodatkowo zatwierdzony jest przez FDA. PLGA jest syntetyzowany z kopolimeryzacji z otwarciem pierścieni dwóch monomerów: kwasu glikolowego i kwasu mlekowego. Typowymi katalizatorami tej reakcji są: cyna (II) i etyloheksan cyny (II), alkoholany lub izopropanol [13]. Jednakże, należy zauważyć, że dostępny w handlu poliester powszechnie syntetyzuje się stosując związki cynowe jako inicjatory – zazwyczaj Sn(oct)2, który może być toksyczny [14]. 346 Ocena wpływu biodegradowalnej warstwy polimerowej (PLGA) na korozję podłoża ze stopów tytanu 2. Cel pracy Celem przeprowadzonych badań było określenie wpływu naniesionej warstwy biodegradowalnego polimeru PLGA na proces degradacji biomateriału metalowego (stopów tytanu). W pracy przedstawiono wyniki badań wpływu środowiska korozyjnego (roztworu Ringera) na proces korozji implantów metalowych pokrytych warstwą poli(D,L-laktyd-koglikolidu). Na podstawie przeprowadzonej analizy danych literaturowych można stwierdzić, że dotychczas nie analizowano tego typu zagadnienia. Ocenie poddano powierzchnię implantów, odporność korozyjną metalowego podłoża po długotrwałej ekspozycji na środowisko korozyjne oraz gęstość jonów metali przenikających do roztworu. 3. Materiał i metodyka badań Materiał: Do badań wytypowano próbki ze stopu tytanu Ti6Al4V ELI oraz Ti6Al7Nb o składzie chemicznym, strukturze i własnościach mechanicznych zgodnych odpowiednio z normami ASTM F 136-08e1 oraz ISO 5832-11. Skład chemiczny badanych stopów przedstawiono w tabeli 1. Tabela 1. Skład chemiczny stopów tytanu: Ti6Al4V ELI i Ti6Al7Nb Stop tytanu Stężenie pierwiastków, % N C H Fe O Al V Nb Ta Ti Ti6Al4V ELI max. 0,05 max. 0,08 max. 0,012 max. 0,25 max. 0,13 5,56,5 3,54,5 - - reszta Ti6Al7Nb max. 0,05 max. 0,08 max. 0,009 max. 0,25 max. 0,20 5,56,5 - 6,57,5 max. 0,5 reszta Źródło: Normy ASTM F 136-08e1 oraz ISO 5832-11 Próbki pobrano z prętów o średnicy 6 mm. Przed nałożeniem polimeru, powierzchnię stopów tytanu poddano szlifowaniu na papierach o gradacji: 120, 320 i 600 oraz utlenianiu anodowemu, w kąpieli zawierającej kwas fosforowy i siarkowy, przy napięciu U = 97 V i czasie t = 2 min. Następnie przy współpracy z Centrum Materiałów Polimerowych i Węglowych PAN w Zabrzu naniesiono warstwę PLGA, metodą zanurzeniową. Próbki zostały zanurzone w roztworze PLGA i dichlorometanu, na czas 30 sekund (w celu usunięcia nieprzereagowanych monomerów, zanieczyszczenia wytrącono z wykorzy-staniem alkoholu metylowego [15]), a następnie materiał osuszono pod ciśnieniem, do czasu odparowania rozpuszczalnika. 347 Magdalena Grygiel-Pradelok, Janusz Szewczenko, Wojciech Kajzer, Magdalena Antonowicz Część próbek została poddana ekspozycji w roztworze Ringera, o składzie przedstawionym w tabeli 2, przez okres 90 dni, w temperaturze T = 37 ± 1 oC. Tabela 2. Skład chemiczny roztworu Ringera Związek Chlorek sodu (NaCl) Chlorek wapnia (KCl) Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2*2H2O) Zawartość 8,60 g/dm3 0,30 g/dm3 0,33 g/dm3 Źródło: firma B. Braun Melsungen AG Dla każdej próbki przeprowadzono: obserwacje mikroskopowe, badania potencjodynamiczne oraz zbadano przenikalność jonów do roztworu. Obserwacje makroskopowe: W celu określenia zmian zachodzących na powierzchni implantów metalowych, dokonano obserwacji makroskopowych. Obserwacje makroskopowe przeprowadzono dla próbek przed procesem degradacji (w stanie wyjściowym), jak i po badaniach korozyjnych. Oględziny powierzchni próbek wykonano na mikroskopie stereoskopowym firmy ZEISS – SteREO Discovery V.8 z oprogramowaniem AxioVisionAxio-CamERc. Badanie przeprowadzono w zakresie powiększenia od 3x do 24x. Badania potencjodynamiczne: W celu określenia wpływu powłoki polimerowej na odporność korozyjną metalu, przeprowadzono dla próbek ze stopów tytanu badania potencjodynamiczne. Badania odporności na korozję wżerową przeprowadzono zgodnie z normą PN-EN ISO 10993-15, w roztworze Ringera (T = 37 ± 1 oC, pH = 6,8 ± 0,2), dla próbek po 90-dniowej ekspozycji na środowisko korozyjne. Do badań wykorzystano potencjostat PGP-201 firmy Radiometer Analytical SAS. Elektrodą odniesienia była nasycona elektroda kalomelowa NEK typu KP-113, natomiast elektrodą pomocniczą − drut platynowy PtP-201. W ramach badań potencjodynamicznych zarejestrowane zostały krzywe polaryzacji anodowej. Badania rozpoczęto od wyznaczenia potencjału otwarcia EOCP przez okres 2 godzin. Potencjał początkowy od którego rejestrowano krzywe polaryzacji anodowej wynosił EINIT = – 100 mV, a szybkość zmian potencjału wynosiła 3 mV/s. Krzywe rejestrowano do momentu uzyskania gęstości prądu równej 1 mA/cm2 lub do momentu osiągnięcia maksymalnej wartości zakresu pomiarowego +4094 mV, następnie zmieniano kierunek polaryzacji i rejestrowano krzywą powrotną [9]. Do wyznaczania wartości charakteryzujących odporność korozyjną badanych próbek zastosowano metodę Sterna. Wyznaczono wielkości potencjału korozyjnego Ekor oraz oporu polaryzacyjnego Rp. 348 Ocena wpływu biodegradowalnej warstwy polimerowej (PLGA) na korozję podłoża ze stopów tytanu Gęstość jonów metali przenikających do roztworu: W celu dokonania oceny szczelności nałożonej warstwy powierzchniowej z poli (D,L-laktydko-glikolidu) na powierzchnie stopów tytanu, przeprowadzono badania stężenia jonów metalowych, które przeniknęły do roztworu. Każdą z próbek w okresie 90 dni, zanurzono w 100 ml roztworu fizjologicznego Ringera. Ilość jonów przenikających do roztworu zmierzono za pomocą spektrometru JY 2000, firmy Yobin – Yvon, wykorzystujące metodę emisyjnej spektrometrii atomowej z plazmą wzbudzoną indukcyjnie (ICP-AES). Przy sporządzaniu krzywej wzorcowej wykorzystano rozcieńczone materiały wzorcowe firmy Merck. Oznaczono ilość stężenia jonów: Ti, Al, V, Nb. Stężenie jonów metalu przeliczono na masę pierwiastka przenikającego z jednostkowej powierzchni próbki (µg/cm2). 4. Analiza wyników Obserwacje makroskopowe: Na podstawie obserwacji makroskopowych próbek (w stanie wyjściowym) zaobserwowano: nierówności, nieciągłości oraz a)zróżnicowaną topografię warstwy polimerowej. Zauważalna jest również niejednorodność powłoki polimerowej oraz zniekształcenia powierzchni polimeru. Stwierdzono również występowanie nielicznych pęcherzyków powietrza. Zaobserwowane defekty występują w postaci miejscowych zacieków, wskutek zastosowania metody zanurzeniowej oraz spowodowane są także sposobem przechowywania próbek. Zauważono także uszkodzenia mechaniczne powierzchni metalowej powstałe przed nałożeniem PLGA, powstałe podczas wstępnej obróbki powierzchniowej. Wyniki obserwacji makroskopowych przedstawiono na rysunkach 1 i 2. Zróżnicowane zabarwienie badanego materiału jest wynikiem procesu utleniania anodowego. Zróżnicowana grubość warstwy polimeru PLGA naniesionego na próbki jest efektem niedoskonałości metody zanurzeniowej Największą grubość warstwy polimerowej obserwowano na brzegach próbki. 349 Magdalena Grygiel-Pradelok, Janusz Szewczenko, Wojciech Kajzer, Magdalena Antonowicz Rysunek 1. Makroskopowy obraz próbki ze stopu Ti6Al7Nb, szlifowanej i utlenianej anodowo a) obraz próbki, b) widoczne zarysowanie metalowego podłoża, c) niejednorodność w warstwie polimeru, zacieki d) obraz makroskopowy próbki przy krawędzi, widoczny ślad po uchwycie podczas procesu utleniania anodowego Rysunek 2. Wyniki obserwacji makroskopowej próbek po nałożeniu warstwy polimeru, a) widoczny pęcherz powietrza – materiał: Ti6Al4V ELI, b) zarysowania powierzchni – stop Ti6Al7Nb 350 Ocena wpływu biodegradowalnej warstwy polimerowej (PLGA) na korozję podłoża ze stopów tytanu Dokonując porównania powierzchni podłoża metalowego zauważono, że powierzchnia próbek ze stopu Ti6Al7Nb charakteryzowała się większą ilością uszkodzeń mechanicznych na powierzchni materiału bazowego w porównaniu do próbek z Ti6Al4V ELI. Powierzchnia próbek po długotrwałej ekspozycji na środowisko korozyjne wykazała wzrost, względem stanu wyjściowego, liczby uszkodzeń warstwy PLGA niezależnie od rodzaju podłoża. Wyniki obserwacji makroskopowych powierzchni próbek po ekspozycji w płynie fizjologicznym przedstawiono na rysunku 3. Rysunek 3. Powierzchni próbek metalowych z powłoką polimerową po 90-dniowej ekspozycji na środowisko korozyjne i badania potencjodynamiczne, a) roztworzenie warstwy na końcu próbki – Ti6Al4V ELI, b) przebarwienia – Ti6Al4V ELI, c) roztworzenie warstwy polimerowej na końcu próbki – Ti6Al7Nb, d) powierzchnia po ekspozycji – Ti6Al7Nb Długotrwała ekspozycja próbek w środowisku korozyjnym spowodowała częściowe przebarwienie i zmatowienie powłoki polimerowej, co wskazuje na zachodzące zmiany w warstwie polimerowej. Zaobserwowano również zwiększenie nieciągłości powłoki polimerowej, nie zaobserwowano natomiast na powierzchni zmian korozyjnych, co świadczy o dobrych właściwościach ochronnych powłoki PLGA. Badania potencjodynamiczne: Przeprowadzone badania potencjodynamiczne wykazały odporność na korozję wżerową stopów tytanu 351 Magdalena Grygiel-Pradelok, Janusz Szewczenko, Wojciech Kajzer, Magdalena Antonowicz z powłoką polimerową. Zaobserowano również zróżnicowaną wartość parametrów dla próbek o powierzchni poddanej procesowi szlifowania i utleniania anodowego oraz z nałożoną warstwą biodegradowalnego polimeru PLGA. Zarejestrowane, charakterystyczne krzywe polaryzacji próbek ze stopów Ti6Al4V ELI oraz Ti6Al7Nb z warstwą polimeru przedstawiono na rysunku 4. Na podstawie krzywych polaryzacji anodowej dla próbek Ti6Al4V ELI, Ti6Al7Nb oraz dla próbek pokrytych warstwą polimerową, wyznaczone wartości potencjału korozyjnego Ekor oraz oporu polaryzacyjnego Rp przedstawiono w tabeli 3. Rysunek 4. Typowe krzywe polaryzacji anodowej, 1) Ti6Al4V ELI + PLGA, 2) Ti6Al7Nb + PLGA Dla wszystkich badanych próbek ze stopów tytanu stwierdzono perfekcyjną pasywację w całym zakresie pomiarowym oraz nie stwierdzono występowania pętli histerezy i potencjału przebicia, co wskazuje na brak rozwoju korozji wżerowej na powierzchni badanego materiału. Zauważono znaczy wzrost oporu polaryzacyjnego, niezależnie od materiału, dla próbek pokrytych warstwą polimeru PLGA w stosunku do stanu wyjściowego, co świadczy o lepszej ochronie metalowego podłoża przed korozją. Najwyższą wartość potencjału korozyjnego uzyskano dla próbek Ti6Al4V – niepokrytych warstwą polimeru (Ekor=205 mV), natomiast najmniejszą wartość uzyskano dla tego samego rodzaju stopu, z naniesioną warstwą polimeru PLGA, (Ekor=-418 mV). Tabela 3. Wyniki badań potencjodynamicznych dla stopów tytanu: Ti6Al4V ELI i Ti6Al7Nb Ekor, mV Rp, M cm2 Ti6Al4V ELI Ti6Al4V ELI+PLGA Ti6Al7Nb +205(43) +0,582(25) -418(40) +1,96(72) +99(33) +3,41(11) 352 Ti6Al7Nb +PLGA -393(31) +4,10(27) Ocena wpływu biodegradowalnej warstwy polimerowej (PLGA) na korozję podłoża ze stopów tytanu Długotrwała ekspozycja w środowisku korozyjnym nie zainicjowała zmian korozyjnych na próbkach, co świadczy o dobrych właściwościach ochronnych polimerowej warstwy PLGA. Stężenie jonów metali przenikających do roztworu: Po 90-dniowym okresie przetrzymywania próbek w roztworze Ringera określono stężenie jonów metali przenikających do roztworu. Wyniki przenikalności jonów przedstawiono w tabeli 4 oraz na rysunku 5. Badanie wykazało, że zarówno dla próbek ze stopów tytanu, poddanych wyłącznie procesowi szlifowania i ulteniania anodowego, jak i dla próbek pokrytych warstwą polimeru PLGA, do roztworu przeniknęły jony metali. Jednakże, dla próbek z warstwą polimeru ilość jonów przenikających do roztworu jest prawie 50krotnie mniejsza, w porównaniu z próbkami bez warswy PLGA. Tabela 4. Wyniki gęstości masy jonów metali przenikających do roztworu, g/cm2 Ti6Al4V ELI Ti Al V Nb 45,68(18) 30,21(25) 23,73(21) - Ti6Al4V ELI +PLGA 0,726(19) 0,400(28) 0,345(47) - Ti6Al7Nb 19,57(24) 2,49(36) 3,41(39) Ti6Al7Nb +PLGA 0,349(99) 0,251(19) 0,587(28) Na podstawie otrzymanych wyników oceniono, iż pokrycie implantu metalowego biodegradowalnym polimerem znacząco wpływa na ilość jonów metalicznych przenikających do roztworu. Dla próbek z naniesioną powłoką biodegradowalnego PLGA znakomicie została ograniczona przenikalność jonów metali względem próbek bez warstwy Rysunek 5. Wykres przedstawiający gęstość masy jonów metali przenikających do roztworu Ringera od powierzchni próbek ze stopów Ti6Al4V ELI, Ti6Al7Nb oraz tych stopów pokrytych warstwą PLGA 353 Magdalena Grygiel-Pradelok, Janusz Szewczenko, Wojciech Kajzer, Magdalena Antonowicz 5. Podsumowanie Podsumowując, przeprowadzone badania jednoznacznie wykazały, że naniesiona powłoka biodegradowalnego polimeru PLGA na podłoże metalowe spowodowała znaczny wzrost odporności na korozję wżerową stopów tytanu Ti6Al4V ELI i Ti6Al7Nb oraz znacząco obniżyła kinetykę degradacji metalowego podłoża, wyznacznikiem czego było stężenie jonów metali przenikających z metalowego podłoża do środowiska zewnętrznego, symulującego środowisko organizmu ludzkiego. Zastosowanie warstwy polimerowej powoduje polepszenie biotolerancji badanych biomateriałów metalowych, tym samym pozwalając na bezpieczne i dłuższe wykorzystywanie implantów. W dalszej kolejności planowane jest przeprowadzenie badania wpływu warstwy polimerowej PLGA na odporność korozyjną stali Cr-Ni-Mo oraz ocena własności mechanicznych biodegradowalnych warstw polimerowych na biomateriałach metalowych. Planuje się również przeprowadzenie badania degradacji polimeru. Podziękowania Autorzy pracy kierują podziękowania dla pracowników naukowych Centrum Materiałów Polimerowych i Węglowych PAN w Zabrzu, dzięki którym naniesiono polimerową powłokę biodegradowalnego PLGA. Szczególne podziękowania kierujemy panią: dr Joannie Jaworskiej oraz dr Katarzynie Jelonek za wsparcie merytoryczne. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Marciniak J., Biomateriały, Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, 2013 Mahapatro A., Metals for Biomedical Applications and Devices, Journal of Biomaterials and Tissue Engineering, 2012, 2(4), s. 259-268 Łaskawiec J., Michalik R., Zagadnienia teoretyczne i aplikacyjne w implantach, Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, 2002, s. 77-78 Biel M., Mikrostruktura i właściwości biomateriałów tytanowych po obróbce powierzchniowej, praca doktorska, Akademia Górniczo-Hutnicza im. S. Staszica w Krakowie, 2006 Szewczenko J., Basiaga M., Kiel-Jamrozik M., Kaczmarek M., Grygiel M., Corrosion Resistance of Ti6Al7Nb Alloy after Various Surface Modifications, Solid State Phenomena, 2015 (227), s. 483-486 Argarate N., Olalde B., Atorrasagasti G., Valero J., Cifuentes S. C., Benavente R., Lieblich M., Gonzales-Carrasco J. L., Biodegradable Bi-layered coating on polymeric orthopaedic implants for controlled release of drugs, Materials Letters, 2014 (132), s. 193-195 Astete C. E., Sabliov C. M., Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles, Journal of Biomaterials Science – Polymer Edition, 2009, 17(3), s. 247-289 354 Ocena wpływu biodegradowalnej warstwy polimerowej (PLGA) na korozję podłoża ze stopów tytanu 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Sena L. A., Rocha N. C. C., Andrade M. C., Soares G. A., Bioactivity assessment of titanium sheets electrochemically coated with thick oxide film, Surface and Coating Technology, Elsevier, 2003 (166), s. 254-258 Szewczenko J., Kształtowanie właściwości fizycznych i chemicznych warstwy wierzchniej implantów ze stopu tytanu dla traumatologii i ortopedii, Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, 2014 Liu X., Chu P. K., Ding C., Surface modification of titanium, titanium alloys, and related materials for biomedical applications, Materials Science and Engineering, Elsevier, 2004, 47(3-4), s.49-121 Bartkowiak-Jowsa M., Będziński R., Chłopek J., Filipiak J., Szafraniec B., Comparative analysis of the deformation characteristics of biodegradable polymers considered as a material for vascular stents, Polimery, 2011, 56 (3) Balcerowska B., Ozgowicz W., Rydarowski H., Szota J., Tkaczyk S., Walczak K., Powłoki ochronne, Politechnika Śląska, 1997 Zini E., Scandola M., Dobrzynski P., Kasperczyk. J, Bero M., Shape memory behavior of novel (L-lactide-glycolide-trimethylene carbonate) terpolymers, Biomacromolecules, 2008, 8(11), s. 3661-3667 Fang H., Li K., Su T., Yang T., Chang J., Lin P., Chang W., Dip coating assisted polylactic acid deposition on steel surface: Film thickness affected by drag force and gravity, Materials Letters, 2008 (62), s. 3739-3741 Strona internetowa BioMatPol sp. z o.o. www.biomatpol.pl/pl/produkty/biocop/biocop-poli-laktydo-ko-glikolid, dostęp z dnia 14.12.2015 r. Ocena wpływu biodegradowalnej warstwy polimerowej (PLGA) na korozję podłoża ze stopów tytanu W pracy przedstawiono wyniki badań wpływu środowiska korozyjnego na proces degradacji implantów metalowych pokrytych warstwą biodegradowalnego polimeru. Na podstawie przeprowadzonej analizy danych literaturowych można stwierdzić, że dotychczas nie analizowano tego typu zagadnień. Oceniano odporność korozyjną metalowego podłoża po długotrwałej ekspozycji na środowisko korozyjne oraz ilość produktów degradacji. Ponadto przeprowadzono obserwacje makroskopowe powierzchni próbek. Do badań wytypowano próbki ze stopu tytanu Ti6Al4V ELI oraz Ti6Al7Nb o składzie chemicznym, strukturze i własnościach mechanicznych zgodnych odpowiednio z normami ASTM F136-08e1 oraz ISO 5832-11. Próbki metalowe poddano obróbce wstępnej (szlifowaniu, utlenianiu anodowemu), następnie naniesiono powłokę biodegradowalnego polimeru. Zastosowano biodegradowalny poli(D,L-laktyd-ko-glikolid) składający się w 85% z kwasu mlekowego i 15 % z kwasu glikolowego, o 20% stężeniu. Badania odporności na korozję wżerową w roztworze Ringera wykonano metodą potencjodynamiczną. Badania przeprowadzono dla próbek po 90 – dniowej ekspozycji na środowisko korozyjne. Ilość jonów przenikających do roztworu określano z wykorzystaniem metody emisji atomowej z plazmą wzbudzoną indukcyjnie ICP-AES. Obserwacje makroskopowe próbek po badaniach korozyjnych przeprowadzono z wykorzystaniem mikroskopu stereoskopowego. Na podstawie obserwacji makroskopowych stwierdzono niejednorodność warstwy polimerowej oraz uszkodzenia mechaniczne próbek powstałe przed nałożeniem PLGA. Powierzchnia próbek po długotrwałej ekspozycji na środowisko korozyjne wykazała wzrost, względem stanu wyjściowego, liczby uszkodzeń warstwy PLGA niezależnie od rodzaju podłoża. Naniesienie warstw polimerowych na podłoże metalowe spowodowało wzrost odporności na korozję wżerową oraz obniżenie kinetyki degradacji metalowego podłoża, wyznacznikiem czego było 355 Magdalena Grygiel-Pradelok, Janusz Szewczenko, Wojciech Kajzer, Magdalena Antonowicz stężenie jonów metali przenikających z podłoża do środowiska zewnętrznego. Długotrwała ekspozycja w środowisku korozyjnym nie zainicjowała zmian korozyjnych na próbkach, co świadczy o dobrych właściwościach ochronnych polimerowej warstwy PLGA. Podsumowując, stwierdzono, że warstwa polimeru PLGA wpływa na poprawę odporności korozyjnej stopów tytanu Ti6Al4V ELI i Ti6Al7Nb oraz ogranicza przenikanie jonów metali do roztworu symulującego środowisko organizmu ludzkiego. Zastosowanie warstwy polimerowej powoduje poprawę biotolerancji badanych biomateriałów metalowych. W dalszej kolejności zostaną przeprowadzone badania wpływu warstwy polimerowej na odporność korozyjną stali CrNiMo oraz ocena własności mechanicznych biodegradowalnych warstw polimerowych na biomateriałach metalowych. Planuje się również badania degradacji polimeru. Influence of biopolymer layer (PLGA) on degradation process of metal substrate The paper presents results of influence of a corrosive environment on degradation process of metal implants coated with a biodegradable polymer layer. Based on analysis of literature data it can be said that this type of issues has not been analysed. Metal ion concentration in solution and corrosion resistance of metal substrate were evaluated after prolonged exposure to the corrosive environment. In addition, a macroscopic observation of the samples surfaces were conducted. Ti6Al4V ELI and Ti6Al7Nb titanium alloys samples were used in the tests. Their chemical composition, structure and mechanical properties met the requirements of ASTM F136-08e1 and ISO 5832-11 standards respectively. Prior to polymer coating the surfaces of titanium alloys were ground and additionally subjected to anodic oxidation. Metal substrates were coated with biodegradable layer of poly(D,L-lactide-co-glycolide) composed of 85% lactic acid and 15% glycolic acid, at 20% concentration by the dip-coating method. Resistance to pitting corrosion in the Ringer’s solution was tested by the potentiodynamic method. Tests were conducted for samples after 90-day exposure to the corrosive environment. Metal ion concentration in the solution was measured with use of inductively coupled plasma – atomic emission spectrometry (ICP-AES). The surface observation of the samples before and after corrosion study was analysed using stereoscopic microscope. Based on the microscopic observations heterogeneity of the polymer layers and mechanical damage of samples arose prior the PLGA application were observed. Surface samples after long term exposure to the corrosive environment showed an increase (in relative to initial state) number of PLGA’s layer damage independently from the type of metal substrate. The increase in resistance to pitting corrosion and reduction of degradation kinetics were caused by application of the polymeric layers on the metal substrate. This is confirmed by low concentration of metal ions penetrating from substrate to the external environment. Long term exposure in the corrosive environment did not initiate the changes of corrosion on samples, so this indicates good protective properties of the PLGA polymer layer. In conclusion, it was found that the polymer layer positively influences corrosion resistance of the Ti6Al4V ELI and the Ti6Al7Nb alloys. Furthermore, the amount of metal ions released to the solution simulating the environment of a human body was reduced. Application a polymer layer improved biocompatibility of the studied biomaterials. Subsequently, a study of influence of polymer layer on corrosion resistance of stainless steel will be carried out. Evaluation of mechanical properties of biodegradable polymeric layers on metal biomaterials will be performed as well. Studies of polymer degradation are also planned. 356 Adrian Dubicki1 Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy 1. Wstęp Ostatnimi laty możemy spotkać się z coraz częstszymi przypadkami osób z problemami układu mięśniowo-szkieletowego, z anomaliami struktury kostnej. Mogą być one wywołane poprzez zmiany zwyrodnieniowe, onkologiczne czy też urazy. Nieustannie rosnące tempo życia sprawia, że mamy coraz mniej czasu żeby zadbać o to co jest najważniejsze - o nasze zdrowie. Pomimo wysyłanych przez organizm sygnałów, wielu ludzi bagatelizuje problem i zgłasza się do lekarza już z zaawansowanymi zaburzeniami. Medycyna w takich przypadkach wypracowała szereg standardowych rozwiązań, lecz często rozległość uszkodzeń nie pozwala na ich zastosowanie. W takich przypadkach coraz częściej stosowanym rozwiązaniem są implanty indywidualne. 2. Cel pracy Celem niniejszej pracy jest przedstawienie współcześnie stosowanych metod leczenia, mających na celu przywrócenie utraconych funkcji miednicy. Do każdej metody przypisane zostały schorzenia i uszkodzenia, przy których jest ona najczęściej stosowana. Szczególną uwagę poświęcono implantom indywidualnym, które są często jedynym ratunkiem dla pacjentów z zaawansowanymi zmianami lub uszkodzeniami. 3. Metody przywrócenia funkcji miednicy We współczesnej medycynie możemy zaobserwować wypracowane na przestrzeni lat liczne, standardowe procedury leczenia dysfunkcji miednicy. Niestety w niektórych przypadkach, zaawansowanie zmian nie pozwala na ich zastosowanie. Tacy pacjenci wymagają intensywnej, spersonalizowanej terapii. 1 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej, Wydział Mechaniczny, Politechnika Białostocka, www.pb.edu.pl 357 Adrian Dubicki Do standardowych, stosowanych w obrębie obręczy kończyny dolnej, nieinwazyjnych procedur leczenia, można zaliczyć leczenie farmakologiczne, unieruchomienie opatrunkiem gipsowym lub wyciągiem oraz rehabilitację. Każda z tych form kuracji stosowana jest w innych przypadkach [1]. Leczenie farmakologiczne stosowane jest, wraz z odciążeniem chorej kości, przy jałowej martwicy kości. Wykorzystywane niesteroidowe środki przeciwzapalne pozwalają na złagodzenie bólu i zahamowanie rozprzestrzeniania się stanu zapalnego. Niekiedy w przypadku tego schorzenia podaje się również, zapobiegające obumieraniu tkanki kostnej leki, stosowane przy leczeniu osteoporozy [2]. Farmakologiczne leczenie ma również miejsce w przypadku terapii onkologicznych, wymagających często leczenia skojarzonego. W skład takiej formy leczenia wchodzi radioterapia i chemioterapia oraz chirurgia. Mają one na celu zniszczenie komórek nowotworowych poprzez ich usunięcie (chirurgia), naświetlanie (radioterapia) oraz podanie leków (chemioterapia). Obecnie lekami o najlepszej skuteczności są bisfosfoniany, powodujące ograniczenie możliwości przerzutów komórek oraz zahamowaniem ich rozrostu w ognisku choroby. Charakteryzują się one dwutorowym działaniem - wbudowują się w kość, wzmacniając jej strukturę oraz ograniczają namnażanie i rozprzestrzenianie komórek kościogubnych. Skuteczność leczenia w przypadku choroby nowotworowej jest mocno zależna od rodzaju nowotworu i jego zaawansowania [1, 3]. Jednym ze stosowanych unieruchomień kości są opatrunki gipsowe. Obecnie wykorzystywane są coraz rzadziej, głównie przy rozejściu się spojenia łonowego oraz złamaniach kości łonowej i kulszowej, gdy nie wystąpią znaczne ich przemieszczenia i nie dojdzie do obrażeń narządów wewnętrznych. W większości przypadków wystarczające jest odciążenie miednicy poprzez leżenie pacjenta w łóżku lub stosowanie opasek elastycznych. Ze względu na kształt jaki przybierają opatrunki gipsowe, obejmując cały uszkodzony odcinek ciała, nazywane są one opatrunkami okrężnymi. Niemal zawsze posiadają podściółkę z bandaży lub waty, aby zminimalizować ryzyko wystąpienia podrażnień i otarć skóry [1]. Podczas zakładania opatrunku gipsowego, należy zawsze zwrócić szczególną uwagę na odciążanie wypukłych fragmentów kostnych (m.in. okolicy kości krzyżowej), a po jego zastosowaniu na możliwość powstania obrzęków, zaburzeń krążenia i unerwienia, które wymagają natychmiastowego jego usunięcia. Założony opatrunek unieruchamiający nie powinien być też zbyt obcisły lub luźny, gdyż nie spełni wtedy swojej roli [1]. Do nastawienia odłamów kostnych i utrzymania ich w odpowiedniej pozycji stosowane są również wyciągi. Dzieli się je na bezpośrednie i pośrednie. Bezpośrednie mocowane są do metalowych elementów 358 Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy wprowadzanych, wkręcanych w kość, a pośrednie zewnętrznie, do skóry przy pomocy klejów lub z wykorzystaniem pętli czy specjalnego obuwia [1]. W leczeniu, a dokładniej osiągnięciu optymalnego poziomu funkcjonowania fizycznego i zmniejszenia dolegliwości, często stosowana jest rehabilitacja. Dzieli się ją na opartą o wykonywanie ćwiczeń kinezyterapię oraz na wykorzystującą czynniki fizykalne fizykoterapię. Głównym celem jest przywrócenie w jak największym zakresie sprawności fizycznej, ale i psychicznej sprzed choroby. Metody fizykalne pomagają ponadto w uśmierzeniu towarzyszących chorobom kostnym silnych bóli, w zmniejszeniu odczynów zapalnych oraz zniwelowaniu napięcia mięśni [1]. Przedstawione powyżej metody stosowane są w łagodnych, nie zaawansowanych dysfunkcjach miednicy. Bardziej złożone, zaawansowane zmiany chorobowe, czy urazy wieloodłamowe wymagają bardziej skomplikowanego, często chirurgicznego leczenia. Konieczne może się okazać zastosowanie implantów kostnych (płytek, wkrętów kostnych, gwoździ śródszpikowych) lub endoprotez. Najcięższe przypadki mogą wymagać opracowania spersonalizowanych wszczepów, wykonywanych pod konkretnego pacjenta. Dostępne rozwiązania dotyczące wszczepianych podczas zabiegów chirurgicznych implantów zostały przedstawione w poniższych podrozdziałach. 3.1. Osteosynteza złamań kości Jedną z operacyjnych metod zespolenia złamań kości jest osteosynteza. Jest to proces zespolenia kości we właściwym ustawieniu, podczas zabiegu chirurgicznego, z użyciem metalowych implantów dokostnych (np. płytek, wkrętów, klamer, gwoździ), wykonanych z niewywołujących po ich wprowadzeniu do organizmu niekorzystnych reakcji (m.in. stanów zapalnych) materiałów biozgodnych [4]. Początkowe próby stosowania osteosyntezy polegały na operacyjnym nastawieniu kości i ich zespoleniu przy użyciu drutów i gwoździ, co nie było dobrym mechanicznie rozwiązaniem. Współczesne rozwiązania zostały zaprojektowane przez szwajcarską organizację Arbeitsgemeinschaft für Osteosynthesefragen (A-O), która nadal nadzoruje ich rozwój. Osteosynteza często jest nazywana zespoleniem A-O, od nazwy wspomnianej organizacji. Stabilizujące implanty dokostne pozwalają na leczenie złamania, bez konieczności stosowania unieruchomień zewnętrznych (np. gipsowych). Umożliwia to rozpoczęcie wczesnej rehabilitacji ruchowej [1]. Bezwzględnym wskazaniem do stosowania operacyjnego zespolenia kości są złamania otwarte i nienastawialne lub niezdolne do utrzymania nastawienia odłamów oraz powodujące uszkodzenie tkanek i narządów 359 Adrian Dubicki wewnętrznych. Rozwój chirurgii i anestezjologii spowodował że operacyjną stabilizację stosuje się także w przypadkach złamań: - możliwych do nastawienia, z zagrożeniem przemieszczenia odłamów, - przez stawowych z przemieszczeniami odłamów, - wielomiejscowych, wieloodłamowych (zdruzgotania kości). Takie typy uszkodzeń kości wymagają dokładnego nastawienia oraz wczesnego podjęcia procesu rehabilitacji, co pomimo ryzyka zakażenia sprawia, że osteosynteza jest w tych przypadkach chętnie stosowana [1, 5]. Podczas operacyjnego zabiegu osteosyntezy należy spełnić następujące warunki: - prawidłowe, anatomiczne nastawienie odłamów, - stabilne zespolenie, bez ruchomości odłamów, - obciążenia przenoszone przez odłamy, nie przez implanty stabilizujące, - zachowanie stabilności zespolenia do czasu zrostu kości. Przedstawione warunki są bardzo ważne, niezbędne dla prawidłowości przeprowadzanej terapii osteosyntezy, skutkującej otrzymaniem prawidłowego i wytrzymałego zrostu kostnego [1]. W zależności od tego czy elementy wchodzące w skład stabilizatora znajdują się w trakcie terapii wewnątrz organizmu czy na zewnątrz, dokonuje się podziału na osteosyntezę stabilną wewnętrzną oraz osteosyntezę zewnętrzną [1]. 3.1.1. Osteosynteza stabilna wewnętrzna W zależności od elementu pełniącego funkcję stabilizatora, osteosyntezę stabilną wewnętrzną dzieli się na zespolenia za pomocą śrub (dociskowe), płytek (osiowe) lub gwoździ śródszpikowych. Wszystkie odpowiadające sobie implanty ortopedyczne, niezależnie od firm je produkujących, charakteryzują się podobną budową, a różnią się tylko drobnymi szczegółami. Większe różnice można zaobserwować w konstrukcji dostarczanego instrumentarium, chociaż narzędzia te wykorzystywane są do tych samych celów [1, 6]. 360 Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy Rysunek 1. Stabilizacja przy użyciu płytek i długich wkrętów kaniulowanych [6] Większość przypadków złamań miednicy wymaga zastosowania zarówno śrub jak i płytek stabilizujących. Czasami zdarza się, że do zespolenia mogą być wykorzystane tylko śruby, głównie krótkie. Takie rozwiązanie stosowane jest przy nieskomplikowanych złamaniach, w których wystarczające jest przeważnie unieruchomienie, ale przy okazji operacyjnej stabilizacji poważniejszych dysfunkcji, dokonuje się również utwierdzenia takiego odłamu. Długie, dodatkowo kaniulowane (wydrążone na całej długości w celu zastosowania prowadnic z drutu Kirschner’a) śruby mogą być samodzielnie stosowane do złamań kości krzyżowej. W pozostałych przypadkach wykorzystuje się je również w połączeniu z płytkami (rys. 1) [7]. Płytki do osteosyntezy stabilnej miednicy (rys. 2) występują w różnych rozmiarach, kształtach i konfiguracjach rozmieszczenia otworów. Projektowane są w taki sposób, aby możliwe było ich zastosowanie w złamaniach występujących w każdym rejonie miednicy [6, 7, 8]. Rysunek 2. Zestawy płytek do stabilizacji wewnętrznej kości miednicy (A - Stryker, B - DePuy Synthes) [6 ,7] 361 Adrian Dubicki We współpracy z lekarzami, firmy ortopedyczne produkują płytki i wkręty tak, aby zapewnić ich odpowiedni kształt oraz możliwość jego zmiany w trakcie zabiegu (rys. 3). Wykonane implanty muszą również charakteryzować się odpowiednią wytrzymałością, odpowiednim przeniesieniem sił oraz biozgodnością [7]. Rysunek 3. Dostosowanie kształtu płytki przy użyciu wyginaka wielopłaszczyznowego [8] Wgłębienia występujące pomiędzy otworami sprawiają że płytki mają mniejszą masę, ale przede wszystkim pozwalają na ich płynne wyprofilowanie. Gdyby nie stosowano tego rozwiązania, płytka podczas jej profilowania zginałaby się w miejscu otworu. Większość oferowanych płytek posiada wewnątrz otworu nagwintowaną powierzchnię. Pozwala to, w połączeniu ze specjalnym wkrętem kostnym, na zablokowanie płytki w wybranym położeniu. Płytki takie nazywane są blokowanymi (rys. 4) [8]. Pierwszy raz takie rozwiązanie zastosowano w polskich systemach Zespol i Polfix. Pozwalają one na zablokowanie położenia płytki np. nad kością, dzięki czemu nie występuje bezpośredni nacisk na nią i nie dochodzi do uszkodzeń okostnej. Dodatkowo umożliwiają one wprowadzanie wkrętów do kości pod kątem nawet 35o [1]. 362 Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy Rysunek 4. Płytki blokowane do osteosyntezy Stryker (A - możliwość wprowadzania wkrętów do kości pod kątem, B - gwintowany otwór, umożliwiający blokowanie położenia płytki) [7] W przypadku stosowania płytek blokowanych należy unikać nadmiernego wyginania i deformowania otworów. Znaczne zniekształcenie może prowadzić do uszkodzenia gwintu w otworze i utraty możliwości blokowania płytki [8]. Jednym z rodzajów osteosyntezy stabilnej wewnętrznej jest zespolenie śródszpikowe. Polega ono na rozwierceniu jamy szpikowej i wprowadzeniu gwoździ o odpowiedniej średnicy lub bezpośrednim (bez rozwiercania) umieszczeniu w jamie prętów, np. Endera. Zespolenie śródszpikowe stosowane jest do leczenia złamań kości długich. W stabilizacji kości miednicy ta metoda nie znalazła jednak zastosowania [1, 5]. 3.1.2. Osteosynteza zewnętrzna Osteosynteza zewnętrzna jest metodą pozwalającą na działanie poza ogniskiem złamania. Przyczynia się do zmniejszenia ryzyka powstania powikłań biologicznych w przypadkach, w których interwencja chirurgiczna w miejscu urazu może pogłębić istniejące zaburzenie. Zakładany ponad skórą aparat, pozwala uniknąć wprowadzania elementów metalowych w miejsce złamania, co mogłoby przyczynić się do powstania kolejnych uszkodzeń, powstania odczynu zapalnego czy alergicznego [1, 5]. Pierwsza koncepcja tego typu stabilizacji miednicy pojawiła się w 1897 roku, a jej autorem był Clayton Parkhill. Przez lata była ona modyfikowana, aż w 1950 roku została po raz pierwszy zastosowana przez Pennalla i Sutherlanda. Na przestrzeni lat stwierdzono, że zastosowanie stabilizacji zewnętrznej przyczynia się do zmniejszenia liczby przypadków śmiertelnych u osób po urazach miednicy. Zmniejszyła się również liczba krwi potrzebna do transfuzji podczas operacyjnego nastawiania i unieruchamiania złamania [9]. 363 Adrian Dubicki Osteosynteza zewnętrzna może być wykorzystana w różnych fazach leczenia chorych ze złamaniami miednicy. Stosowana może być na etapach: - postepowania resuscytacyjnego (do kontroli krwawienia), - tymczasowej stabilizacji złamań (umożliwiająca transport chorego), - pierwotnej lub ostatecznej stabilizacji dla niektórych typów złamań. Przeciwskazaniem do stosowania metody jest rozwinięta choroba osteoporotyczna lub ryzyko uszkodzenia czy demontażu stabilizatora przez pacjenta. Wykorzystaniu stabilizatorów zewnętrznych mogą towarzyszyć problemy związane z utratą repozycji, odpowiedniego nastawienia kości i utrzymaniem stabilizatora w odpowiednim położeniu przez kilka, kilkanaście tygodni oraz powstające miejscowe infekcje wokół wszczepów i powikłania ogólnoustrojowe [9]. Do stabilizacji miednicy mogą być wykorzystane aparaty jednopłaszczyznowe lub dwupłaszczyznowe. Zbudowane są najczęściej z głowic, które są miejscem łączenia stabilizator-kość (za pomocą wkrętów kostnych, bądź drutów Kirschner’a) oraz elementów nośnych, które przenoszą obciążenia między odłamami kostnymi (belki, pierścienie). Taka budowa pozwala na dowolną konfigurację aparatu stabilizującego [1, 5]. Rysunek 5. Przykłady stabilizatorów zewnętrznych wykorzystywanych do osteosyntezy miednicy (A - ChM, B - Stryker, C - DePuy Synthes) [6, 7, 10] Większość firmy produkujących implanty, posiada w swojej ofercie aparaty do stabilizacji zewnętrznej. Wykorzystują one możliwość modułowej budowy takich stabilizatorów, projektując aparaty z możliwością ich regulacji i dostosowania do rodzaju i miejsca lokalizacji złamania. Na powyższym rysunku 5 przedstawiono przykładowe stabilizatory zewnętrzne firmy ChM, Stryker i DePuy Synthes [6, 7, 10]. Stabilizatory zewnętrzne mogą być stosowane w przypadkach przerwania ciągłości spojenia łonowego i stawu biodrowo-krzyżowego oraz złamań kości kulszowej i łonowej. Odpowiednio przestrzennie zbudowana konstrukcja stabilizatora i wprowadzone do kości wszczepy, pozwalają na 364 Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy ustabilizowanie złamania oraz wczesną jego dynamizację poprzez umożliwienie pacjentowi poruszania się [10]. 3.2. Endoprotezoplastyka Jednym z najczęściej wykonywanych zabiegów ortopedycznych jest endoprotezoplastyka stawu biodrowego, nazywana również alloplastyką. Zabieg ten polega na przywróceniu uszkodzonemu stawowi utraconych czynności, poprzez wprowadzenie do organizmu elementów obcych, tworzących zamiennik zdegradowanych powierzchni stawowych. Wszystkie elementy wchodzące w skład endoprotez, muszą być wykonywane z materiałów biozgodnych, takich jak metale i ich stopy, tworzywa sztuczne czy ceramika [11]. Koncepcja endoprotez stawu biodrowego została opracowana ok. 1890 roku przez niemieckiego lekarza, polskiego pochodzenia – Themistoklesa Glucka. Pierwsze wszczepiane przez niego protezy wykonywane były z kości słoniowej. Do lat pięćdziesiątych XX wieku, czyli do czasu kiedy to rozpoczęto próby stosowania materiałów konstrukcyjnych, przeprowadzano próby używania w endoprotezoplastyce materiałów takich jak szkło, żywice fenolowe, a nawet kauczuk. Dopiero rozwój inżynierii biomedycznej spowodował wypracowanie materiałów stosowanych (z modyfikacjami) do czasów współczesnych. Do takich materiałów należą: - stal nierdzewna (316L), - stop CoCrMo (Vitalium (obróbka plastyczna), Endocast (odlewniczy)), - stop tytanu (Ti6Al4V), - ceramiki (ZrO2, Al2O3), - tworzywa sztuczne (polimetakrylan metylu (PMMA), polietylen (PE-UHMW, HDPE). Oprócz posiadania wymaganej biozgodności, pozwalają one na otrzymanie odpowiednich właściwości tribologicznych (elementy trące endoprotez wymagają zastosowania materiałów zapewniających zarówno niski współczynnik tarcia, jak też wysoką odporność na zużycie, co jest przedmiotem badań i analiz tribologii) [12]. Głównym celem zabiegu alloplastyki jest zniesienie przewlekle trwającego bólu stawu oraz przywrócenie jego prawidłowych funkcji. Do schorzeń, które mogą doprowadzić do konieczności wykonania endoprotezoplastyki należą: - choroby zwyrodnieniowe stawu biodrowego, - choroby reumatyczne, - skomplikowane i powikłane złamania miednicy i kości udowej (bliższy koniec), - martwice w obrębie miednicy i głowy kości udowej, 365 Adrian Dubicki - nowotwory kości. Pierwszym etapem leczenia może być zastosowanie metod farmaceutycznych, rehabilitacji i ćwiczeń oraz stosowanie sprzętu pomocniczego. Jeżeli te zabiegi nie przyniosą rezultatów, przeprowadza się alloplastykę stawu [13, 14]. Od czasów powstania pierwszych endoprotez, zostały wypracowane dziesiątki rozmaitych rozwiązań, różniących się budową, materiałem i sposobem mocowania. Obecnie stosowane endoprotezy można podzielić ze względu na: - zasięg implantacji: - endoprotezy połowiczne (częściowe), - endoprotezy całkowite: - endoprotezy trzpieniowe, - endoprotezy do kapoplastyki; - konstrukcje panewki: - endoprotezy z panewką jednolitą, - endoprotezy z panewką modułową; - konstrukcje trzpienia: - endoprotezy jednolite (stałe połączenie głowa-trzpień), - endoprotezy dzielone (głowa z trzpieniem połączona na wcisk); - mocowanie w kośćcu: - endoprotezy cementowe, - endoprotezy bezcementowe. Stosowanie danego rodzaju endoprotez jest uzależnione od wielu czynników. Podstawowym jest rodzaj schorzenia, ale wpływ ma również wiek chorego czy poziom jego aktywności fizycznej [11, 14]. Endoprotezy całkowite, są najczęściej stosowanymi rodzajami implantów stawowych. Podczas zabiegu endoprotezoplastyki wymianie podlegają zarówno panewka, jak i głowa kości udowej. W skład takich implantów wchodzi trzpień z głową stałą lub nakładaną oraz panewka jednolita lub modułowa (z wkładką z tworzywa). Stosowane są one w przypadku zaawansowanych zmian zwyrodnieniowych stawów lub rzadziej, złamania szyjki kości udowej. Podczas zabiegu usuwana jest głowa i szyjka kości udowej oraz powierzchnie stawowe panewki stawu biodrowego. W jamie szpikowej kości udowej formowany jest odpowiedni otwór, odpowiadający kształtowi trzpienia. Następnie w przygotowane struktury, mocowane są elementy endoprotezy. Mocowanie może odbywać się przy udziale cementu kostnego lub poprzez wciśnięcie i późniejszą integrację, przerośnięcie tkanką kostną porowatej powierzchni implantu. Postępowanie przy całkowitej endoprotezoplastyce przedstawione zostało na rysunku 6. 366 Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy Rysunek 6. Schemat postępowania w przypadku alloplastyki całkowitej [11] Endoprotezy połowiczne (rys. 7) są stosowane głównie u osób starszych, u których nie ma znacznych uszkodzeń powierzchni stawowych panewki, a doszło do urazu i złamania szyjki kości udowej. Podczas zabiegu zachowywana jest panewka, a wymianie poddawana jest głowa kości udowej. W porównaniu do protez częściowych, głowa charakteryzuje się większym rozmiarem, zbliżonym do rzeczywistych rozmiarów głowy kości udowej pacjenta. Postępowanie w trakcie zabiegu jest podobne do wcześniej omawianej techniki operacyjnej, stosowanej w endoprotezach całkowitych. Mocowanie protez może odbywać się w sposób cementowy lub bezcementowy [11]. Rysunek 7. Przykłady protez połowicznych (A – Moore’a, B – Thompson’a, C – bipolarna Monka) [11] Stosowanie endoprotez całkowitych i połowicznych wiąże się również z problemami. Najpoważniejszymi z nich są ryzyko zwichnięcia stawu, poluzowania elementów endoprotezy, jak również zużycie materiału na 367 Adrian Dubicki powierzchni sztucznego stawu. Wprowadza to konieczność ograniczenia aktywności osób po alloplastyce, a w przypadku zużycia endoprotezy – jej wymiany. Protezy wtórne nazywane są rewizyjnymi. Niestety zużycie takiej protezy może wiązać się z koniecznością unieruchomienia stawu biodrowego, a co za tym idzie – również pacjenta [11]. Rozwiązaniem, szczególnie polecanym w przypadku młodych pacjentów jest kapoplastyka. Zaliczana jest ona do całkowitych endoprotezoplastyk. Polega ona na zastąpieniu tylko naturalnych powierzchni stawowych, przy użyciu metali o niskiej ścieralności. Postępowanie podczas zabiegu (rys. 8) jest podobne jak w przypadku poprzednich typów endoprotez. Pierwszym krokiem jest usunięcie chrząstki wraz z przylegającymi warstwami kostnymi z obrębu panewki stawowej oraz usunięcie chrząstki i uformowanie w postaci stożka głowy kości udowej. Następnie w tak przygotowanej głowie kości udowej wierci się otwór, mający za zadanie odpowiednio ustawić kapę i ją utrzymać. Część panewkowa mocowana jest zazwyczaj na wcisk, do procesu osteointegracji, natomiast część udowa na cement kostny [11]. Rysunek 8. Schemat postepowania przy kapoplastyce (z lewej – uformowanie kości, z prawej – zamocowanie na ich powierzchniach kapy) [11] Kapoplastyka umożliwia oddalenie w czasie konieczności przeprowadzenia endoprotezoplastyki całkowitej, czy też możliwość zastosowania endoprotezoplastyki połowicznej (możliwość wykorzystania panewki z kapoplastyki) [11]. 368 Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy W przypadku gdy dojdzie do obluzowania lub zwichnięcia w stawie biodrowym, powikłaniem może być przemieszczenie się panewki. Może ono być również spowodowane jej nieprawidłowym umocowaniem lub zapaleniem czy zakażeniem kości, co w rezultacie może prowadzić do zaniku kości i przemieszczeń panewki. W tym przypadku rozwiązaniem jest endoproteza rewizyjna panewki (rys. 9) [15]. Rysunek 9. Przykłady dostępnych panewek rewizyjnych (A – pressfitowa, B – indywidualna firmy Biomet, C – antyprotuzyjna) [15, 16, 17] Dużym problemem towarzyszącym przemieszczeniu panewki jest ubytek tkanki kostnej. Do takich uszkodzeń stosowane są: - panewka pressfitowa (mocowana śrubami), - panewka z siatką do mocowania wkrętami i wcementowywana panewka, - systemy antyprotruzyjne (z wypustkami i uzupełniającymi bloczkami metalowymi). Ubytek tkanki kostnej powoduje konieczność opracowania indywidualnego umocowania panewki rewizyjnej i uzupełnienia braków przeszczepami kostnymi. Takie rozwiązania nie zawsze spełniają w dostateczny sposób swoje funkcje. Lekarz podczas zabiegu musi mieć przygotowany plan, na ewentualność, gdy nie będzie w stanie dostosować standardowych implantów do zmian w obrębie miednicy [15]. W takich zaawansowanych przypadkach może być wykorzystana technika, pozwalająca na zaplanowanie operacji przy użyciu programów komputerowych lub nawet na wykonanie indywidualnego implantu dla pacjenta [15]. 3.3. Implanty indywidualne Często jedynym ratunkiem w przypadku zaawansowanych zmian w obrębie kośćca miednicy mogą okazać się implanty indywidualne. Nie są one obecnie powszechnie stosowanym rozwiązaniem, ale zyskują coraz większą przychylność. Mogą być wykorzystywane w przypadku skompli- 369 Adrian Dubicki kowanych złamań i ich powikłań, zwyrodnień, martwic i powstających z tej przyczyny deformacji oraz w chorobach onkologicznych kości. Przy obecnym stanie nauki i techniki, lekarze we współpracy z inżynierami mogą tworzyć implanty niemal każdej części ciała. Oprócz wytwarzanych z różnych materiałów wszczepów, mogących zastąpić kości, coraz częściej można spotkać się z uzupełnieniem innych tkanek. Rozwój produkcji resorbowalnych rusztowań dla rozwoju i namnażania komórek macierzystych, powoli prowadzi nas do ery „produkcji” zamiennych organów. Nad wyprodukowaniem narządów pracuje między innymi amerykańska firma Organovo, która już ma za sobą pierwsze sukcesy. Naukowcy z tej korporacji stawiają sobie za cel wszczepienie już za 10 lat pierwszych organów pochodzących z ich firmy [18]. Zaprojektowanie indywidualnego implantu oraz jego wytworzenie wymaga zastosowania kilku innowacyjnych technik. Pierwszym etapem jest otrzymanie modelu z badań diagnostycznych (inżynieria odwrotna – ang. Reverse Engineering). Następnie otrzymany model jest wykorzystany do projektowania przy użyciu oprogramowania komputerowego (projektowanie wspomagane komputerowo – ang. Com-puter Aided Design) implantu dla pacjenta. Ostatnim krokiem jest wytworzenie indywidualnego wszczepu z wirtualnego modelu, przy wykorzystaniu technik przyrostowych (szybkie prototypowanie – ang. Rapid Prototyping). Połączenie tych wszystkich kroków daje nam spersonalizowany, idealnie pasujący do pozostałych struktur organizmu implant [19, 20]. Obecnie najczęściej spotykanymi, wykonywanymi dla konkretnego pacjenta implantami są wszczepy stomatologiczne oraz płytki służące do zastąpienia ubytków kostnych czaszki. W literaturze można spotkać również przykłady trzpieni endoprotez, panewek, implantów żuchwy, głów kości ramiennej oraz stawów paliczkowych [19, 20, 21, 22]. Wybrane z nich zostały przedstawione na rysunku 10. 370 Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy Rysunek 10. Przykłady implantów indywidualnych (A – żuchwy, B – panewka biodrowa, C – implant uzupełniający ubytek czaszki) [19, 22] Świat medycyny zaczyna powoli stosować również indywidualne implanty w obrębie miednicy. W porównaniu do przedstawionych powyżej przykładowych wszczepów, implanty miednicy muszą oprócz zastąpienia struktury kostnej, przejąć jej funkcje przenoszenia ciężaru ciała na kończyny dolne. Wiąże się to z koniecznością otrzymania odpowiedniej wytrzymałości oraz odporności na uszkodzenia zmęczeniowe. Otrzymana konstrukcja indywidualnego implantu musi więc dodatkowo wytrzymać codzienną aktywność pacjenta przez długi okres czasu. Z przykładami implantów w obrębie miednicy można zapoznać się przede wszystkim na portalach internetowych, prezentujących nowinki techniczne z zakresu druku 3D. Pierwszym przykładem jest przypadek pacjenta z chińskiego szpitala Wojskowej Akademii Medycznej w Xi’an. Został zdiagnozowany u niego złośliwy nowotwór - mięsak Ewinga. W celu ratowania życia pacjenta, aby nowotwór nie dał przerzutów na inne tkanki należało usunąć objętą zmianami tkankę - większą część kości biodrowej. Zachowaniu uległa panewka stawu biodrowego [23]. Na podstawie zdjęć z rezonansu magnetycznego wykonano trójwymiarowy modeli i zaprojektowano implant (rys. 11). W celu zmniejszenia masy, wszczep w części swojej struktury ma ażurową konstrukcję. Do implantu dodane zostały również otwory umożliwiające połączenie go z pozostałymi kośćmi miednicy za pomocą wkrętów [23]. 371 Adrian Dubicki Rysunek 11. Zaprojektowany w szpitalu w Xi'an implant części kości biodrowej [23] Implant części kości biodrowej wykonany został przy użyciu techniki przyrostowej – selektywnego spiekania laserowego (SLS) z biokompatybilnych proszków tytanu. Następnie został on wszczepiony pacjentowi, który po okresie rekonwalescencji i rehabilitacji odzyskał zdrowie i sprawność [23]. Kolejnym przykładem jest piętnastoletnia szwedka, która otrzymała indywidualny implant stawu biodrowego. Cierpiała ona na łagodną odmianę nowotworu - nerwiako-włókniaka. Podczas jego usunięcia doszło do powikłań, które doprowadziły do ciężkich deformacji i w rezultacie do unieruchomienia dziewczyny na wózku inwalidzkim. Z pomocą przyszła belgijska firma Mobelife. Przy wykorzystaniu obrazów z tomografii komputerowej opracowano dokładny model i na jego podstawie zaprojektowany został implant (rys. 12). Panewka posiadała porowatą powierzchnię zewnętrzna, służącą do zmniejszenia masy implantu, ale przede wszystkim do osteointegracji z kością. Dodatkowymi elementami mocującymi były wypustki z otworami, do przymocowania implantu przy użyciu wkrętów [24]. 372 Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy Rysunek 12. Zaprojektowany przez belgijską firmę Mobelife implant panewki stawu biodrowego [24] Wydrukowany implant, już po osiemnastu miesiącach od operacji, pozwolił nastolatce na sprawne poruszanie się, nawet bez użycia sprzętu pomocniczego [24]. Z przykładami stosowania indywidualnych implantów możemy spotkać się również na terytorium Polski. Zabiegowi wszczepienia implantu na wymiar została poddana 66-letnia pacjentka krakowskiego szpitala. W wyniku poważnych zmian zwyrodnieniowych biodra, licznych operacji i powikłań doszło do przerwania ciągłości pierścienia kostnego miednicy. Implant został opracowany na podstawie zdjęć z tomografu komputerowego przez belgijską firmę. Wydrukowany wszczep pozwolił uzupełnić kostny ubytek w obrębie miednicy i zapewnił jej stabilność. Operacja zakończyła się sukcesem, a pacjentka wraca do zdrowia [25, 26]. Oprócz firm spoza granic naszego kraju, wykonywaniem indywidualnych implantów, na mniejszą skalę, zajmują się również nasi rodzimi producenci. Pracownia implantów znajduje się m.in. w łódzkim Bionanoparku oraz w białostockiej firmie ChM [27, 28]. Wytwarzanie spersonalizowanych implantów zyskuje coraz większą popularność. 4. Wytwarzanie implantów indywidualnych Wytwarzanie standardowych implantów oparte jest na procesach odlewania, kucia, cięcia, wiercenia oraz toczenia i frezowania. Opracowane przez firmy z branży ortopedycznej procesy technologiczne pozwalają na 373 Adrian Dubicki seryjną produkcję standardowych wyrobów, które będą spełniać wszystkie stawiane im wymagania, a koszty ich produkcji pozwolą na konkurencyjność z innymi korporacjami. Implanty indywidualne wymagają innego podejścia. Jednostkowa produkcja takiego wyrobu sprawia, że wykorzystanie metod stosowanych do produkcji masowej staje się nieopłacalne, a wręcz niemożliwe ze względu na konieczność dokładnego odwzorowania kształtu implantu indywidualnego. Proces projektowania indywidualnych implantów z obrazów pochodzących z urządzeń diagnostycznych zachęca, ale i wymusza zastosowanie technik wytwarzania ze wspomaganiem komputerowym (ang. Computer Aided Manufacturing – CAM). Najczęściej spotykaną formą wytwarzania implantów spersonalizowanych są techniki przyrostowe. Pozwalają one na dokładne odwzorowanie komputerowego modelu implantu i jego niemal natychmiastowe wszczepienie. Nie są one jednak jednym możliwym rozwiązaniem. Rozwój współczesnych urządzeń do wytwarzania implantów metodą ubytkową (która opiera się na sterowaniu przez system komputerowy) sprawił, że mogą być one z powodzeniem wykorzystane w produkcji nawet skomplikowanych implantów. 5. Podsumowanie Coraz szybszy tryb życia, brak troski o prawidłowe odżywianie i zdrowie sprawia, że coraz częściej możemy zaobserwować w społeczeństwie problemy zdrowotne. Dotykają one między innymi obręczy kończyny dolnej, która odgrywa w organizmie bardzo ważną rolę – podporową i lokomocyjną. Każdy rodzaj schorzenia czy uszkodzenia wymaga indywidualnego podejścia. W każdym z przypadków wdrażane są inne postępowania mające na celu przywrócenia sprawności i komfortu pacjentowi. W przypadku skomplikowanych złamań kości miednicy, wieloodłamowych oraz tych z przemieszczeniami, często stosowaną metodą jest stabilna osteosynteza wewnętrzna. Innym rozwiązaniem wykorzystywanym głównie przy przerwaniu ciągłości spojenia łonowego i stawu biodrowokrzyżowego jest osteosynteza zewnętrzna. Charakterystyczna dla tej metody jest możliwość działania poza ogniskiem złamania. Endoprotezoplastyka jest metodą stosowaną przy chorobie zwyrodnieniowej, martwicach kości, ale również przy skomplikowanych i powikłanych złamaniach miednicy i bliższego końca kości udowej oraz nowotworach. Każde z przedstawionych rozwiązań stosowane jest przy typowych złamaniach oraz innych chorobach. Szereg rodzajów implantów czy 374 Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy stabilizatorów, o dopasowanych do kości kształtach i wymiarach może być wykorzystywanych w większości przypadków. Zaawansowane zmiany wywołane wysokoenergetycznymi wypadkami komunikacyjnymi czy upadkami oraz zaawansowane zmiany onkologiczne czy powikłania często nie pozwalają na ich wykorzystanie. W takich przypadkach, przedstawionych również w niniejszej pracy, konieczne jest zastosowanie implantów indywidualnych. Nie są one obecnie powszechnie stosowanym rozwiązaniem, ale zyskują coraz większą przychylność. Do popularyzacji indywidualnych implantów przyczynia się również rozwój techniki, który umożliwia przygotowanie i wytworzenie idealnie dopasowanych wszczepów. W niedługim czasie, indywidualne wszczepy mogą być powszechnie stosowanym sposobem na przywrócenie utraconych funkcji pełnionych przez tkanki kostne. Literatura Ortopedia i traumatologia. Praca zbiorowa pod redakcją naukową T. S. Gaździka. Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2010, strony 45-48, 263-277, 433-456, 473-486 i 532-573, ISBN 978-83-200-4165-1 2. Jałowa martwica kości [online]: http://zdrowie.gazeta.pl/zdrowie/1,101580,14002449, jalowa_martwica_kosci [dostęp: 4 VI 2015 r.] 3. Rak kości [online]: www.przychodnia.pl/rbt/index.php [dostęp: 4 VI 2015 r.] 4. Nowacki J., Dobrzański L. A., Gustavo F.: Implanty śródszpikowe w osteosyntezie kości długich. Gliwice: Open Access Library – Scientiic International Journal of the World Academy of Materials and Manufacturing Engineering, 2012, numer 11 (17), ISSN 2083-5191 5. Ebeltt-Paprotny G.: Fizjoterapia. Praca pod redakcją R. Preis. Wrocław: Elsevier Urban i Partner, 2012, strony 557-591, ISBN 978-83-7609-309-3 6. Pelvic & Acetabular. Fracture Treatment Solutions [katalog]. Freiburg: Stryker, 2011 7. Pelvic Implants and Instruments. A dedicated system for reconstructive pelvic and acetabular surgery [katalog]. Oberdorf: Johnson & Johnson – DePuy Synthes, 2014 8. Płytki rekonstrukcyjne. Zespolenie miednicy [katalog]. Lewickie: ChM, 2015 9. Olszewski G., Misztal M.: Przednia stabilizacja zewnętrzna miednicy. Lublin: Nowiny lekarskie, 2006, tom 75, numer 2, strony 129-133, ISSN 2353-9801 10. Stabilizator zewnętrzny BigCharstab [katalog]. Lewickie: ChM, 2013 11. Madej T.: Modelowanie strefu ruchowej endoprotezy stawu biodrowego w aspekcie biomateriałów. Kraków: 2008, Praca doktorska, Wydział inżynierii mechanicznej i robotyki, Akademia Górniczo-Hutnicza 12. Kowalewski P.: Modelowanie tarcia w endoprotezie stawu kolanowego. Wrocław: 2007, Praca doktorska, Wydział mechaniczny, Politechnika Wrocławska 1. 375 Adrian Dubicki 13. Ortopedicum: Sztuczny staw biodrowy. Informacje dla pacjentów [broszura]. Kraków: http://www.ortopedicum.pl [dostęp: 6 VI 2015 r.] 14. Oddział Ortopedyczny Wielospecjalistycznego Szpitala w Miliczu: Endoproteza stawu biodrowego. Przewodnik dla pacjenta [broszura]. Milicz: http://www.mcm-milicz.pl [dostęp: 6 VI 2015 r.] 15. Wojciechowski P., Kopeć K., Nowak M., Borowski M., Kamiński J., Kusz D.: Zaopatrywanie ubytków dna kostnego panewki w endoprotezoplastyce rewizyjnej stawu biodrowego [prezentacja]. Ustroń Śląski: Międzynarodowe Sympozjum KOKSARTROZA, 2012 16. GRIPTION TF Acetabular Revision System[online]: https://www.depuysynthes.com/hcp/hip/ products/qs/GRIPTION- TF-AcetabularRevision [dostęp: 6 VI 2015 r.] 17. Biomet PMI Patient-matched Implants [online]: http://www.biomet.com/wps/portal/internet/ Biomet/HealthcareProfessionals/products/orthopedics [dostęp: 6 VI 2015 r.] 18. KuberaG.: Druk 3Dprzyszłością biomedycyny[online] http://www.pcworld.pl/artykuly/394433_1/Druk.3D.przyszloscia.biomedycyny.html [dostęp: 6 VI 2015 r.] 19. Trusscott M., Beer D., Vicatos G., Hosking K., Barnard L., Booysen G., Campbrll R. I.: Using RP to promote collaborative design of customised medical implants. Bloemfontein-Cape Town: Rapid Prototyping Journal, 2007, tom 13, numer 2, strony 107-114, ISSN 1355-2546 20. Markowska O., Budzik G.: Innowacyjne metody wytwarzania implantów kostnych za pomocą inżynierii odwrotnej (RE) oraz technik szybkiego prototypowania (RP). Sosnowiec: X Forum Inżynierskie ProCAx, 2011 21. Jardini A. L., Larosa M. A., Filho R. M., Zavaglia C. A., Bernardes L. F., Lambert C. S., Calderoni D. R., Kharmandayan P.: Cranial reconstruction: 3D biomodel and custom-built implant created using additive manufacturing. Campinas: Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery, 2014, tom 42, numer 8, strony 1877-1884, ISSN 1010-5182 22. Raghatate S. C., Kuthe A. M., Deshmukh T. R., Dahake S. W.: Rapid prototyping-assisted fabrication of the customized metatarsophalangeal joint implant (SamKu). Nagpur: Rapid Prototyping Journal, 2014, tom 20, numer 4, strony 270-279, ISSN 1355-2546 23. W Chinach wszczepiono pacjentom drukowane kości [online]: http://swiatdruku3d.pl/w-chinach-wszczepiono-pacjentom-drukowane-kosci [dostęp 6 VI 2015 r.] 24. Implantstawu biodrowego z drukarki 3D pozwolił 15-latce znowu chodzić [online]: http://www.benchmark.pl/aktualnosci/implant-druk-3d-stawbiodrowy-wozek-chodzi [dostęp: 6 VI 2015 r.] 25. Pionierski zabieg w Krakowie [online]: http://pulsmedycyny.pl/2848221,19711, pionierski-zabieg-w-krakowie [dostęp: 6 VI 2015 r.] 26. Nota prasowa Szpitala Specjalistycznego im. Ludwika Rydygiera w Krakowie z dnia 8.11.2012 [online]: www.rydygierkrakow.pl/str_www_x/nota_prasowa.pdf [dostęp: 6 VI 2015 r.] 376 Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy 27. Bionanopark w Technoparku w Łodzi [online]: http://technopark.lodz.pl/ bionanopark/struktura [dostęp: 6 VI 2015 r.] 28. Implanty na wymiar [online]: http://chm.eu/produkty/implant-na-wymiar [dostęp: 6 VI 2015 r.] Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy Streszczenie Obręcz kończyny dolnej odgrywa w organizmie ważną rolę - jest narządem podpory dla całego ciała i uczestniczy w lokomocji. Z tego powodu, wystąpienie w jej obrębie nawet najmniejszych dysfunkcji, może prowadzić do poważnych zaburzeń w prawidłowej realizacji statyki i dynamiki. Medycyna przy wykorzystaniu techniki wypracowała szereg rozwiązań mających na celu przywrócenie jej prawidłowej funkcji. W pracy przedstawiono współcześnie stosowane metody leczenia dysfunkcji miednicy, takich jak osteosynteza złamań, endoprotezoplastyka oraz implanty indywidualne, które są obecnie najbardziej rozwijaną z tych metod. Spersonalizowane implanty są często jedynym ratunkiem w przypadku zaawansowanych zmian. Contemporary methods of restoration of pelvic function lost due to diseases and damages Abstract The rim of the lower limb plays an important role in the body - it is an organ supporting the entire body and participates in locomotion. For this reason the occurrence of even the slightest dysfunction can lead to serious disturbance in the proper implementation of the statics and dynamics. Medicine by means of technology has developed a series of solutions in order to restore its proper function. This article presents the contemporary methods of treatment of pelvic dysfunction, such as osteosynthesis of fractures, arthroplasty and individual implants, which are currently the most expandable of these methods. Personalized implants are often the only salvation in case of advanced changes in human body. 377 Indeks autorów Antonowicz M. .......................277, 344 Bednarczyk M................................... 94 Cwynar A. .........................18, 179, 192 Dereń N. ............................................ 27 Dubicki A. .............. 141, 161, 325, 357 Dyńda M. .......................................... 47 Gadomska-Gajadhur A. ................. 254 Gawroński M. ...................35, 131, 204 Goede A. ................................... 35, 204 Grygiel-Pradelok M................277, 344 Janicka A. ..........................18, 179, 192 Kajzer A. ......................................... 277 Kajzer W. ........................................ 344 Kątska K.......................................... 121 Kimsa M.......................................... 265 Kołodziejczyk-Czepas J. ................ 223 Kosior-Jarecka E. ........................... 121 Kowalska W. .................................... 77 Kruk A............................................. 254 Lach D. ............................................ 112 Łabejszo A. ..................................... 131 Mazurek U. ....................................... 94 Mierzejewska Ż. A.7, 161, 293, 308, 325 Muc-Wierzgoń M. ............................ 94 Nowak P. ......................................... 223 Ostrowski J. .................................... 121 Posmysz A. ....................................... 66 Ruśkowski P. .................................. 254 Siemińska E. ..................................... 18 Sieradzka M. ................................... 223 Sikora B........................................... 265 Sikora J. ..................................... 18, 192 Simińska E. ....................................... 27 Skubis A. ......................................... 265 Szewczenko J.................................. 344 Waldowska M................................... 77 Wandtke T.........................35, 131, 204 Woś J. ................................................ 77 Woźniak J. ........................................ 27 Wybranowski T. ............................. 179 Ziomkowska B. ................18, 179, 192 378
