Wykład 2 - Analizy wielkosklaowe 2013
advertisement
Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny Analizy wielkoskalowe wykorzystujące mikromacierze Genotypowanie: zróżnicowane wewnątrz genów DNA RNA Komórka eukariotyczna Ekspresja genów: Które geny? Poziom ekpresji? Pracownia Analiz Mikromacierzy 3 Mikromacierze umożliwiają kompleksowe badanie genomów DNA Zróżnicowanie na obszarze całego genomu (SNP, CNV) RNA Analiza zmian poziomów ekspresji Analiza wariantów alternatywnego składania genów (ang. splicing) Zmiany wzoru metylacji i analiza regulacji genów (zmiany epigenetyczne) Zmiany poziomu miRNA Pracownia Analiz Mikromacierzy Co to jest mikromacierz ? Mikromacierz zawiera zestaw tysięcy różnych fragmentów DNA, o znanej sekwencji które umieszczone są w uporządkowany sposób na stałym podłożu – najczęściej szklanym lub plastikowym Umożliwia jednoczesną ocenę poziomu tysięcy cząsteczek DNA lub RNA w badanej próbie (nie daje możliwości dokładnego pomiaru bezwzględnego poziomu zawartości poszczególnych cząsteczek w próbce) Zasada działania mikromacierzy opiera się na hybrydyzacji komplementarnych do siebie cząsteczek kwasów nukleinowych Pracownia Analiz Mikromacierzy Typy Mikromacierzy – podział ze względu na budowę sond Mikromacierze cDNA Mikromacierze oligonukleotydowe 25 nukleotydowe sekwencje - Affymetrix 60 nukleotydowe sekwencje - Agilent Pracownia Analiz Mikromacierzy Mikromacierze - dwukolorowe i jednokolorowe Pracownia Analiz Mikromacierzy Affymetrix, NimbleGen Agilent Illumina Pracownia Analiz Mikromacierzy GeneChip® System, the Affymetrix GeneChip® Scanner 3000 Targeted Genotyping (TG) www.corelab.pl Programy do analizy danych Partek Genomics Suite Ingenuity ChAS Dwie stacje płuczące Skaner z automatycznym odczytem 48 płytek Rozbudowa Laboratorium Projektowania Molekularnego oraz Zastosowań Genomiki i Proteomiki w Centrum Doskonałości BioExploratorium. Projekt współfinansowany przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego. Pracownia Analiz Mikromacierzy Synteza oligonukleotydów sterowana światłem - Fotolitografia Feature Lamp Mask Chip Pracownia Analiz Mikromacierzy 10 Pracownia Analiz Mikromacierzy Pracownia Analiz Mikromacierzy Pracownia Analiz Mikromacierzy Pracownia Analiz Mikromacierzy Mikromacierz typu GeneChip Obszar, do którego hybrydyzują cząsteczki o komplementarnej sekwencji ***** 5 µm Miliony kopii oligonukleotydu o określonej sekwencji 1.28cm >6.500,000 różnych komplementarnych sond 1.28cm Pracownia Analiz Mikromacierzy Pracownia Analiz Mikromacierzy Mikromacierze tilingowe Genome Exon A Exon B 10 bp gap 35 bp spacing 35 bp Sekwencjonowanie Nowej Generacji NGS – Next Generation Sequencing Wspólne elementy dla wszystkich typów sekwenatorów 1. Losowa fragmentacja nici DNA, dołączanie odpowiednich dla platformy „linkerów” (konstrukcja biblioteki) 2. Amplifikacja biblioteki (na podłożu szklanym lub plastikowym) 3. Setki tysięcy reakcji sekwencjonowania przeprowadzone równocześnie odczytywane przez instrument (“massively parallel sequencing”) 4. Odczyty pozwalają na porównania ilościowe 5. Metody pozwlające na odczytywanie sekwencji z dwóch stron cząsteczki Roche 454 Konstrukcja biblioteki i emulsyjny PCR Losowa fragmentacja Doligowanie adaptorów Biblioteka jednoniciowych fragmentów DNA z dołaczonymi adaptorami Emulsyjny PCR Amplifikacja DNA na kulkach Roche 454 - pyrosekwencjonowanie Nałożenie kulek na płytkę Kulki zawierające miliony kopii pojedynczego klonalnego fragmentu DNA Dodanie złoża zawierającego odpowiednie enzymy Illumina Fragmenty DNA Illumina • • • • Fosforylacja (seryna, treonina) Acetylacja (lizyna) Metylacja (lizyna, arginina) ADP-rybozylacja • • Ubikwitynylacja (lizyna) Sumoilacja (lizyna) Modyfikacje histonów rdzeniowych monometylacja dimetylacja trimetylacja symetryczna dimetylacja asymetryczna dimetylacja monometylacja Current Opinion in Cell Biology 2003, 15:172–183 B.Turner, Cell 2002 Zmiana struktury chromatyny Hamowanie oddziaływania czynników białkowych Nowe miejsca wiązania dla czynników białkowych Uzyskanie przeciwciał specyficznych w stosunku do, poznanych potranslacyjnych modyfikacji histonów rdzeniowych zrewolucjonizowało naszą wiedzę o chromatynie Podstawowe narzędzie badawcze Immunoprecypitacja chromatyny - CHIP ChIP–chip ChIP– Seq Immunoprecypitacja Immunoprecypitacja Oczyszczanie DNA Oczyszczanie DNA Amplifikacja Dołączenie sekwencji adaptorowych Hybrydyzacja do mikromacierzy Tworzenie zbiorów Sekwencjonowanie Mapowanie rejonów w genomie nature reviews | genetics volume 9 | march 2008 | ChIP – chromatin immunoprecipitation Mapowanie rejonów w genomie Metody wielkoskalowe pozwoliły na lepsze zrozumienie roli metylacji DNA, znaczenia lokalizacji nukleosomów i funkcji potranslacyjnych modyfikacji histonów dla regulacji transkrypcji genów Przeciwciała specyficzne w stosunku do potranslacyjnych modyfikacji histonów rdzeniowych Podstawowe narzędzie badawcze Rola modyfikacji potranslacyjnych histonów w regulacji procesu transkrypcji Bing Li i wsp., Cell 128 (2007) 707-719 Badanie kombinatoryczności wzoru 39 modyfikacji histonowych w limfocytach T CD4+ za pomocą metody ChIP-seq Histon H3 H3K4me3 H3K4me2 H3K4me1 H3K4ac H3K27me3 H3K27me2 H3K27me1 H3K27ac H3K9me3 H3K9me2 H3K9me1 H3K9ac H3K79me3 H3K79me2 H3K79me1 H3R2me2 H3R2me1 H3K36me3 H3K36me1 H3K36ac H3K14ac H3K18ac H3K23ac NATURE GENETICS VOLUME 40 [ NUMBER 7 [ JULY 2008 Histon H4 H4K20me3 H4K20me1 H2BK5me1 H4K5ac H4K8ac H4K12ac H4K16ac H4K91ac Histon H2B H2BK12ac H2BK20ac H2BK120ac H2BK5ac H2BK5ac Histon H2A H2AK5ac H2AK9ac H2A.Z Wzór modyfikacji histonowych w chromatynie genu ZMND8 NATURE GENETICS VOLUME 40 [ NUMBER 7 [ JULY 2008 17 modyfikacji histonowych zwykle obecnych w obszarach promotorów genów aktywnych transkrypcyjnie NATURE GENETICS VOLUME 40 [ NUMBER 7 [ JULY 2008
