Metody oznaczania glukozy

Oznaczenia oceniające gospodarkę
węglowodanową:
glukoza, HbA1c, albumina w moczu,
ciała ketonowe
Cukrzyca
to grupa chorób metabolicznych o różnej etiologii,
charakteryzująca się przewlekłą hiperglikemią
spowodowaną zaburzeniami wydzielania lub działania
insuliny
Prawidłowy poziom glukozy na
czczo w surowicy:
dzieci-3.5-5.6 mmol/l
dorośli-4.5-5.9 mmol/l
Kryteria diagnostyczne cukrzycy
obejmują:
1.Glikemia na czczo (osocze krwi żylnej)
> 7,0 mmol/l (126 mg/dl)
2.Glikemia przygodna oznaczona w osoczu
> 11,0 mmol/l (200mg/dl)
3.OGTT po 2h > 11,0 mmol/l
Badania laboratoryjne w cukrzycy
# Badania przesiewowe (dzieci, przyszli rodzice)
# Diagnostyka w kierunku potwierdzenia cukrzycy
# Diagnostyka w kierunku ustalenia typu cukrzycy
# Badania w fazie ostrej cukrzycy
# Monitorowanie leczenia osób z cukrzycą
# Badania przesiewowe w kierunku powikłań
cukrzycy
# Diagnostyka w powikłaniach
Rola laboratorium w cukrzycy
Faza przedkliniczna:
# Markery genetyczne HLA
# Markery immunologiczne przeciwciała przeciwko GAD, IAA, fosfatazie
tyrozyny
# Stężenie glukozy (metoda zautomatyzowana)
# Stężenie insuliny (na czczo, OGTT)
Faza kliniczna:
# Stężenie glukozy
# OGTT
# Ciała ketonowe (krew, mocz)
# Insulina, peptyd C, testy stymulacyjne
Leczenie – faza ostra:
# Stężenie glukozy (krew, mocz)
# Ciała ketonowe (krew, mocz)
# równowaga kwasowo-zasadowa
# mleczany
Leczenia – faza przewlekła:
# Stężenie glukozy (krew, mocz)
# Białka glikowane – HbA1c
# Białka w moczu – wydalanie albumin  mikroalbuminuria, proteinuria
# Lipidy, kreatynina
Metody oznaczania glukozy
Metoda z heksokinazą
Glukoza pod wpływem heksokinazy ulega fosforylacji przy udziale ATP do glukozo6-fosforanu i ADP. Glukozo-6-fosforan jest utleniany do 6-fosfoglukonianu przy
jednoczesnej redukcji NAD do NADH. Powstaniu NADH towarzyszy wzrost
absorbancji przy długości fali 340nm, który jest proporcjonalny do stężenia glukozy w
badanej próbce. Metoda pozwala na oznaczanie jej stężenia w surowicy krwi, osoczu i
moczu.
heksokinaza
Glukoza +ATP
G-6-P +ADP
G-6-PDH (Dehydrogenaza G-6-P)
G-6-P +NAD
6-PG +NADH +H
Metoda z oksydazą glukozy
polega na przekształceniu glukozy przez oksydazę glukozową w kwas glukonowy przy
jednoczesnym utworzeniu nadtlenku wodoru, a następnie,
redukcji H2O2 przez peroksydazę w obecności o-dianizydyny (DH2), która ulega
utlenieniu tworząc barwny produkt końcowy (związek D):
oksydaza glukozy
glukoza + H2O + O2
kwas glukonowy + H2O2
peroksydaza
H2O2 + DH2
2H2O + D
Metoda z dehydrogenazą glukozy
Dehydrogenaza glukozy
glukoza+NAD
D-glukozo-deltalakton+NAD+H
Metoda o-toluidynowa
gorący kw. octowy
O-toluidyna+glukoza
kompleks chromogenowy
Elektrochemiczny czujnik glukozy
CZUJNIK TEN STANOWI ELEKTRODA TLENOWA ZAWIERAJĄCA ODPOWIEDNI
ENZYM W CZĘŚCI RECEPTOROWEJ. ENZYMEM TYM JEST -OKSYDAZA
GLUKOZOWA, KTÓRA KATALIZUJE REAKCJĘ UTLENIANIA GLUKOZY. TAK
SKONSTRUOWANĄ ELEKTRODĘ TLENOWĄ UCZULONĄ ENZYMATYCZNIE ZANURZA
SIĘ W ROZTWORZE NASYCONYM TLENEM Z POWIETRZA I REJESTRUJE PRĄD
POCZĄTKOWY. PO WPROWADZENIU DO BADANEGO ROZTWORU GLUKOZY CZĘŚĆ
TLENU DYFUNDUJĄCEGO DO KATODY JEST ZUŻYWANA W REAKCJI UTLENIENIA
GLUKOZY Z WYKORZYSTANIEM IMMOBILIZOWANEGO ENZYMU ZGODNIE Z
REAKCJĄ. W WYNIKU TEGO PROCESU ZMNIEJSZA SIĘ KONCENTRACJA TLENU W
ROZTWORZE I MALEJE STRUMIEŃ JEGO DYFUZJI W KIERUNKU POWIERZCHNI
KATODY. GDY PROCESY NA ELEKTRODZIE OSIĄGNĄ STAN USTALONY, WÓWCZAS
REJESTRUJE SIĘ PRĄD KOŃCOWY. OBSERWOWANY SPADEK NATĘŻENIA PRĄDU
JEST WPROST PROPORCJONALNY DO STĘŻENIA GLUKOZY.
Glukometr
PRZEPROWADZENIE POMIARU POLEGA NA POBRANIU KROPLI KRWI (NAJCZĘŚCIEJ Z PALCA),
NANIESIENIU JEJ NA TEST PASKOWY UMIESZCZONY W APARACIE I ODCZYTANIU WYNIKU.
DOSTĘPNE NA RYNKU GLUKOMETRY MIERZĄ STĘŻENIE GLUKOZY ZA POMOCĄ JEDNEJ Z
DWÓCH METOD: FOTOCHEMICZNEJ I ELEKTROCHEMICZNEJ. METODA FOTOCHEMICZNA,
NAZYWANA RÓWNIEŻ REFLEKTOMETRYCZNĄ, POLEGA NA REJESTROWANIU ILOŚCI
ODBITEGO ŚWIATŁA, ZALEŻNEGO OD ZMIANY ZABARWIENIA POLA TESTOWEGO,
NATOMIAST METODA ELEKTROCHEMICZNA MIERZY NATĘŻENIE MIKROPRĄDU
ELEKTRYCZNEGO PRZEPŁYWAJĄCEGO PRZEZ POLE REAKTYWNE TESTU PASKOWEGO (POD
WPŁYWEM GLUKOZY ZACHODZI TAM ENZYMATYCZNA REAKCJA CHEMICZNA)
CELEM GLUKOMETRII JEST MONITOROWANIE STOPNIA WYRÓWNANIA GLIKEMII U
CHORYCH NA CUKRZYCĘ, A NIE
DIAGNOSTYKA !!!
1 etap – reakcja enzymatyczna
2 etap – pomiar fotometryczny lub
elektrochemiczny
Hemoglobina glikowana
Hemoglobina glikowana - mieszanina kilku różnych pochodnych
powstających w wyniku reakcji
glukozy lub innych węglowodanów z wolnymi grupami aminowymi
dostępnymi na powierzchni makrocząsteczki Hb;
glukoza przyłącza się do waliny N-końcowego fragmentu łańcucha β.
HbA1c służy do oceny poziomu glikacji w celu
monitorowania leczenia cukrzycy.
Metodą referencyjną oznaczania glikowanej HbA1c jest metoda HPLC
(wysokosprawna chromatografia cieczowa)
Metody oznaczania
Metodą referencyjną oznaczania glikowanej HbA1c jest
metoda HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa)
Wykonanie:
1. rozpuszczoną próbkę w rozpuszczalniku
nakłada się na kolumnę wypełnioną żelem
krzemionkowym
2. zachodzą oddziaływania pomiędzy próbką a
wypełnieniem kolumny i następuje rozdział
Inne metody:
# izoelektroogniskowanie
# spektrofotometria
# spektroskopia masowa
# met. immunochemiczne
Czynniki interferujące z metodami
oznaczania glikowanej Hb:
# HbS, HbC, HbF
# pH, molalność, temperatura
# mocznica, żółtaczka, lipemia, niedokrwistość, ciąża
# penicylina, aspiryna, witamina C
# Wiek
# Rasa
Ocena wartości HbA1:
norma / cukrzyca wyrównana 5,5 – 8%
dobrze wyrównana cukrzyca 8 – 10%
częściowo wyrównana cukrzyca 10 – 12%
niewyrównana cukrzyca 12%
Ciała ketonowe
aceton
kwas acetylooctowy
kwas β-hydroksymasłowy (stanowi
najwyższą frakcję)
W przypadku cukrzycy, gdy wystąpi brak insuliny,
jako alternatywne źródło energii rozkładane są
tłuszcze, a efektem ubocznym tego jest nadmierne
gromadzenie ketonów we krwi. Nadmiar ketonów
we krwi jest przyczyną kwasicy ketonowej. Organizm
próbuje pozbyć się ich przez intensywne wydalanie z
moczem lub przez płuca
Metody oznaczania
Ciała ketonowe w moczu oznacza się przy użyciu pasków testowych, metodą
opartą na reakcji acetonu i kwasu acetooctowego z nitroprusydkiem sodu i
glicyną w środowisku alkalicznym, w wyniku której powstaje barwne
kompleksowe połączenie. Ma ona charakter półilościowy, ze wzrokową lub
reflektometryczną (czytniki pasków) oceną zmiany barwy pola reakcyjnego.
Metoda ta nie pozwala na wykrycie kwasu beta-hydroksymasłowego,
stanowiącego największą frakcję ciał ketonowych. Badanie powinno się
wykonywać w niedawno oddanej próbce moczu. Wyniki fałszywie dodatnie
mogą wystąpić u chorych zażywających leki zawierające grupy
sulfhydrylowe.Na wyniki fałszywie ujemne może
wpływać obecność w dużych stężeniach kwasu askorbinowego w moczu.
Podstawą ilościowego oznaczania stężenia kwasu betahydroksymasłowego w osoczu lub w pełnej krwi włośniczkowej jest
reakcja utleniania kwasu beta-hydroksymasłowego do acetooctowego,
katalizowana przez swoisty enzym, dehydrogenazę kwasu betahydroksymasłowego (beta-HBDH), z odczytem spektrofotometrycznym
lub amperometrycznym. Badanie to ma przewagę nad oznaczaniem
kwasu acetooctowego w moczu w rozpoznawaniu i monitorowaniu
przebiegu cukrzycowej kwasicy ketonowej.
Albumina w moczu
Pojawia się, gdy u osób chorujących na cukrzycę dochodzi do
uszkodzenia nerek
Mikroalbuminuria jest wczesnym markerem nefropatii
cukrzycowej i nadciśnieniowej niestety
jest ona niewykrywalna rutynowym paskiem testowym (próg
detekcji ok. 200-250 mg/l)
Albuminę w moczu można zmierzyć metodą RIA albo
HPLC
Dziękuję