Molekularne mechanizmy oporności na glukokortykoidy w
advertisement
180 Alergia Astma Immunologia 2012, 17 (4): 180-189 Molekularne mechanizmy oporności na glukokortykoidy w astmie oskrzelowej Molecular mechanisms of glucocorticoid resistance in bronchial asthma DOROTA PASTUSZAK-LEWANDOSKA1, EWA BRZEZIAŃSKA1, PAWEŁ GÓRSKI2 Zakład Molekularnych Podstaw Medycyny, I Katedra Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny w Łodzi 2 Klinika Pneumonologii i Alergologii, I Katedra Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny w Łodzi 1 Streszczenie Summary Glukokortykoidy (GK) to leki o najsilniejszym działaniu przeciwzapalnym, szeroko stosowane w leczeniu przewlekłych chorób o podłożu zapalnym, w tym astmy oskrzelowej. Zjawisko oporności na steroidy, choć stosunkowo rzadkie, niesie ze sobą poważne obciążenia dla pacjenta oraz problemy terapeutyczne. Jak dotąd niewiele jest dostępnych alternatywnych metod leczenia, jak również brak jest możliwości wczesnej identyfikacji pacjentów niewrażliwych na leczenie GK. Analiza molekularnych podstaw działania glukokortykoidów umożliwia rozpoznanie tych procesów, które potencjalnie mogą zakłócać przeciwzapalny wpływ leków steroidowych. W pracy opisano poznane do tej pory mechanizmy molekularne przyczyniające się do steroidooporności u pacjentów chorujących na astmę oskrzelową, ze szczególnym zwróceniem uwagi na jej wieloczynnikowe podłoże. Glucocorticoids (GCs) are the most potent anti-inflammatory agents, widely used in the therapy of chronic inflammatory diseases, including bronchial asthma. The phenomenon of steroid resistance, although relatively rare, is connected with serious burden for the patient, as well as with therapeutic problems. So far there are only few available alternative treatment strategies. Early identification of patients insensitive to GC therapy is not possible either. Analysis of molecular basis of glucocorticoid action enables the recognition of those processes that might interfere with anti-inflammatory steroid effect. This paper describes the known molecular mechanism of steroid resistance in asthmatic patients, with particular emphasis on its multifactorial background. Słowa kluczowe: astma oskrzelowa, receptor glukokortykoidowy, molekularne podłoże steroidooporności © Alergia Astma Immunologia 2012, 17 (4): 180-189 www.alergia-astma-immunologia.eu Przyjęto do druku: 24.01.2012 Keywords: bronchial asthma, glucocorticoid receptor, molecular basis of steroid resistance Adres do korespondencji / Address for correspondence Prof. nadzw. dr hab. n. med. Ewa Brzeziańska Zakład Molekularnych Podstaw Medycyny UM w Łodzi ul. Pomorska 251, 92-213 Łódź tel.: +4842 675 77 15, fax: +4842 675 77 12 e-mail: [email protected] Wykaz skrótów: AF (ang. activational function domain) – aktywacyjna domena funkcyjna AP-1 (ang. activator protein 1) – aktywatorowe białko 1 BAL (ang. bronchoalveolar lavage) – płukanie oskrzelowopęcherzykowe BMPRII (ang. bone morphogenetic protein receptor, type II) – gen receptora dla białka morfogenetycznego kości CDK (ang. cyclin-dependent kinase) – kinaza zależna od cyklin CREBP (ang. cyclic AMP response element-binding protein) – białko wiążące się z elementem odpowiedzi na cAMP Cys (ang. cysteine) – cysteina DBD (ang. DNA-binding domain) – domena wiążąca DNA ERK (ang. extracellular signal-regulated kinase) – kinaza regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym GK – glukokortykoid(-y) GKR – receptor glukokortkoidowy GRE (ang. glucocorticoid-response element) – element odpowiedzi na GK GSK3 (ang. glycogen synthase kinase 3) – kinaza 3 syntazy glikogenu HAT (ang. histone acetyltransferase) – acetylotransferaza histonowa HDAC (ang. histone deacetylase) – deacetylaza histonowa Hsp (ang. heat shock proteins) – białka szoku cieplnego IFI16 (ang. interferon-inducible protein 16) – gen białka 16 indukowanego przez interferon IPO13 (ang. importin-13) – gen kodujący importynę 13 Pastuszak-Lewandoska D i wsp. Molekularne mechanizmy oporności na glukokortykoidy... 181 JAK3 (ang. Janus kinase 3) – kinaza Janusowa 3 JNK (ang. c-Jun N-terminal kinase) – kinaza końca N białka c-Jun LBD (ang. ligand binding domain) – domena wiążąca ligand MAPK (ang. mitogen-activated protein kinase) – kinaza białkowa aktywowana mitogenami MDR1 (ang. multidrug resistance gene) – gen oporności wielolekowej MIF (ang. macrophage migration inhibitory factor) – czynnik hamujący migrację makrofagów MKP-1 (ang. MAP kinase phosphatase 1) – gen kodujący fosfatazę kinazy MAP NF-κB (ang. nuclear factor kappa B) – jądrowy czynnik kappa B NLS (ang. nuclear localisation signal) – sygnał lokalizacji jądrowej NR3C1 (nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1 /glucocorticoid receptor/) – gen dla receptora glukokortykoidowego NTD (ang. N-terminal transactivation domain) – transaktywacyjna domena N-końcowa PBMCs (ang. peripheral blood mononuclear cells) – jednojądrzaste komórki krwi obwodowej PGGR (ang. primary generalized glucocorticoid resistance) – pierwotna uogólniona oporność na glukokortykoidy PI3K-δ (ang. phosphatidylinositol-3 kinase δ) – kinaza fosfatydylo-3-inozytolu delta POChP – przewlekła obturacyjna choroba płuc RGS14 (ang. regulator of G-protein signaling 14) – gen białka regulującego przekazywanie sygnału przez białka G Ser (ang. serine) – seryna SNP (ang. single nucleotide polymorphism) – polimorfizm pojedynczych nukleotydów STAT (ang. signal transducer and activator of transcription) – przekaźnik sygnału i aktywator transkrypcji TNF-α (ang. tumor necrosis factor α) – czynnik martwicy nowotworów α Glukokortykoidy (GK), ze względu na właściwości przeciwzapalne i immunosupresyjne, należą do leków szeroko stosowanych w terapii chorób o podłożu immunologicznym i zapalnym [1]. Chorzy na astmę oskrzelową z powodzeniem reagują na wziewne bądź ogólnoustrojowe glukokortykoidy. Jednak istnieje grupa pacjentów – stanowiąca aż do 1/3 chorych cierpiących na tzw. astmę ciężką – w której odpowiedź na terapię z użyciem nawet wysokiej dawki ogólnoustrojowych GK jest niezadowalająca [2]. Oporność na glukokortykoidy, tj. brak odpowiedzi tkanek docelowych na leczenie GK, stanowi istotną barierę dla skutecznej terapii. Obserwowany w ostatnich latach na całym świecie wzrost częstości występowania astmy oskrzelowej i jej form o ciężkim przebiegu, sprawia, że oporność na GK staje się poważnym problemem zdrowotnym i terapeutycznym, obciążającym nie tylko samego pacjenta, ale również system opieki zdrowotnej i społeczeństwo. Należy ponadto pamiętać, że identyfikowane zaburzenia molekularne leżące u podstaw oporności na glukokortykoidy podlegają szeregowi różnych modulacji, związanych z jednej strony ze zwiększoną miejscową ekspresją cytokin prozapalnych u tych pacjentów, z drugiej zaś strony z bodźcami środowiskowymi, takimi jak działanie stresu oksydacyjnego czy wpływ superantygenów drobnoustrojów. Wczesna identyfikacja pacjentów niewrażliwych na leczenie glukokortykoidami umożliwiłaby wdrożenie alternatywnych metod leczenia i zmniejszyłaby poważne działania niepożądane wynikające z długotrwałego stosowania ogólnoustrojowych GK. Szacuje się, że możliwość zastosowania testu, na podstawie wyników którego istniałaby możliwość wytypowania pacjentów chorujących na astmę oskrzelową steroidooporną, zmniejszyłaby liczbę osób leczonych wysokimi dawkami steroidów o ponad 80% [3]. Steroidooporność może mieć charakter uogólniony lub miejscowy, a biorąc pod uwagę złożony charakter działania GK, może wystąpić na różnych poziomach odpowiedzi komórki na glukokortykoidy. Zidentyfikowane do tej pory zaburzenia mogą dotyczyć: 1) genu receptora dla glukokortykoidów, 2) heterokompleksu GKR, 3) czynników zaangażowanych w proces transkrypcji i remodeling chromatyny, 4) białek efektorowych glukokortykoidów, w tym cytokin i ich regulatorów, 5) innych białek, takich jak glikoproteina P, które są zaangażowane w transport i/lub metabolizm GK. W pracy przedstawiono poznane mechanizmy molekularne leżące u podstaw oporności na glukokortykoidy, z uwzględnieniem zależności związanych z samym procesem zapalnym, jak i z czynnikami zewnętrznymi, które wpływają na ten proces. Zaburzenia związane z genem receptora glukokortykoidowego (NR3C1) Mutacje genu NR3C1 Gen dla receptora glikokortykoidowego, NR3C1, u człowieka zlokalizowano na chromosomie 5 (5q31.3). W wyniku alternatywnego splicingu genu mogą powstawać dwie izoformy receptora, GKRα i GKRβ, różniące się tylko jednym spośród 9 kodujących je eksonów. Białko receptorowe zbudowane jest z trzech funkcjonalnych domen: 1) transaktywacyjnej domeny N−końcowej (ang. N-terminal transactivation domain, NTD) posiadającej sekwencje odpowiedzialne za aktywację genów docelowych i interakcje z innymi czynnikami transkrypcyjnymi (ang. activational function domain 1, domena AF1); 2) domeny środkowej, wiążącej DNA (ang. DNA-binding domain, DBD), zawierającej dwa motywy palca cynkowego; 3) domeny C-końcowej, wiążącej ligand (ang. ligand binding domain, LBD), która posiada kolejną domenę o funkcji aktywacyjnej (ang. activational function domain 2, domena AF2) [4]. GKR należy do nadrodziny jądrowych receptorów steroidowo-tyroidowo-retinoidowych i funkcjonuje jako aktywowany przez GK czynnik transkrypcyjny dla genów docelowych, wpływając na ich transkrypcję w sposób bezpośredni bądź pośredni. 182 Tak więc gen receptora dla glukokortykoidów jest jednym z pierwszych kandydatów odgrywających potencjalną rolę w zaburzeniach związanych z odpowiedzią na GK. Jednakże, jak wykazały badania, mutacje w NR3C1 są zjawiskiem stosunkowo rzadkim. Jako zaburzenia molekularne stanowią natomiast przyczynę pierwotnej uogólnionej oporności na glukokortykoidy (ang. primary generalized glucocorticoid resistance, PGGR) [5]. Ostatnio dla tej jednostki chorobowej zaproponowano nazwę zespołu Chrousos, pochodzącą od nazwiska badacza [6]. Zaburzenie to może być przekazywane w rodzinie jako cecha autosomalna dominująca lub autosomalna recesywna; zidentyfikowano również przypadki sporadyczne [5,7]. Sekwencjonowanie regionu kodującego genu dla izoformy α receptora pozwoliło zidentyfikować mutacje w domenach LBD i DBD NR3C1 u pacjentów z PGGR. Zgodnie z doniesieniami literaturowymi badań prowadzonych w latach 1975-2011 [8] poznano już 13 różnych mutacji. Zróżnicowany fenotyp pacjentów z pierwotną opornością na glukokortykoidy tłumaczony jest różnym czynnościowym wpływem poszczególnych mutacji, pomimo ich umiejscowienia w tej samej domenie genu receptora [7]. Chociaż wszystkie mutacje występujące w LBD zmniejszają zdolność wiązania liganda przez receptor, to część z nich dodatkowo opóźnia translokację aktywowanego receptora do jądra (np. mutacje V571A, D641V, V729I, G679S, L773P, F737L), inne z kolei zakłócają interakcję receptora z koaktywatorami (np. mutacje I559N, V571A, D641V, V729I, I747M) [7,8]. Natomiast w przypadku mutacji zidentyfikowanej w domenie DBD (R477H), wiązanie liganda jest prawidłowe, natomiast aktywowany receptor nie wiąże się z sekwencją GRE (ang. glucocorticoid-response element) w DNA genu docelowego [9]. Analiza mutacji przeprowadzona w grupie pacjentów chorych na astmę oskrzelową oporną na działanie GK nie wykazała jednak ich obecności [10]. Przyczyną tej obserwacji może być jednak mała liczebność grup przebadanych pacjentów (opornych i wrażliwych na działanie GK) w cytowanym badaniu oraz brak nowych badań w kierunku poszukiwania mutacji w genie NR3C1 w grupie pacjentów chorych na astmę oskrzelową steroidooporną. Polimorfizmy SNP genu NR3C1 Wrażliwość tkanek docelowych na glukokortykoidy wiąże się także z obecnością polimorfizmów w sekwencji genu NR3C1. Jak dotąd poznano kilkanaście polimorfizmów SNP (ang. single nucleotide polymorphism, polimorfizm pojedynczych nukleotydów) genu NR3C1, ale tylko część z nich ma znaczenie funkcjonalne, a nieliczne wiążą się z opornością na glukokortykoidy [11,12]. W zależności od miejsca występowania, polimorfizmy NR3C1 mogą hamować powstawanie kompleksu GKR/GK lub zmniejszać zdolność wiązania aktywowanego receptora z GRE i w konsekwencji obniżać poziom transkrypcji genów wrażliwych na GK [13]. Polimorfizm ER22/23EK jest spowodowany przez dwie mutacje punktowe w sąsiadujących kodonach w eksonie 2 NR3C1, tj. w domenie transaktywacyjnej. W pozycji 198 nukleotydu w kodonie 22 mutacja jest milcząca, tj. nie pro- Alergia Astma Immunologia 2012, 17 (4): 180-189 wadzi do zmiany aminokwasu (zamiana GAG na GAA, przy czym oba kodony kodują kwas glutaminowy /E/), natomiast mutacja w kodonie 23 (zamiana AGG na AAG) prowadzi do zastąpienia argininy (R) lizyną (K) w białku receptora. Wyniki badań in vivo udowodniły, że nosiciele tego polimorfizmu charakteryzują się mniejszą wrażliwością na działanie glukokortykoidów [14]. Dalsze badania wykazały, że polimorfizm ER22/23EK wiąże się z istotnym zmniejszeniem transaktywacyjnej funkcji glukokortykoidów, natomiast nie wpływa na ich funkcję transrepresyjną, tj. hamowanie ekspresji genów prozapalnych w sposób pośredni, w powiązaniu z innymi czynnikami transkrypcyjnymi [15]. Transrepresyjna aktywność glukokortykoidów to główny mechanizm odpowiedzialny za przeciwzapalne działanie GK, na którym opiera się ich zastosowanie w leczeniu chorób o podłożu zapalnym i autoimmunologicznych [16]. Potwierdzają to badania, w których nie stwierdzono korelacji pomiędzy polimorfizmem ER22/23EK a takimi chorobami, jak oftalmopatia w chorobie Gravesa, reumatoidalne zapalenie stawów czy nieswoiste zapalenia jelit [17]. Wpływ na transrepresyjną funkcję GK zaobserwowano natomiast w przypadku polimorfizmu GR-9β, który wiąże się z substytucją A3669G na końcu 3’ UTR eksonu 9β. Zidentyfikowano go u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów, wykazując, że przyczynia się do zwiększenia stabilności mRNA dla izoformy β receptora in vivo, a co za tym idzie do jej zwiększonej ekspresji [18]. GKRβ, który powstaje w wyniku alternatywnego splicingu NR3C1, to nieaktywna izoforma receptora, zlokalizowana w jądrze komórkowym i pozbawiona zdolności przyłączania GK oraz aktywowania genów [19]. GKRβ działa jako inhibitor aktywnej izoformy GKRα i jego zwiększona ekspresja może być przyczyną względnej oporności na GK [18], co szerzej opisano w dalszej części pracy. Badania ex vivo udowodniły obniżenie funkcji transrepresyjnej glukokortykoidów (obniżenie ekspresji IL-2), natomiast niezmienioną funkcję transaktywacyjną (niezmieniony wpływ na ekspresję GILZ) u nosicieli polimorfizmu GR-9β [20]. Brakuje jednak badań uwzględniających pacjentów chorych na astmę oskrzelową steroidoooporną w powiązaniu z analizą wariantów polimorficznych genu NR3C1. Wprawdzie, w przeprowadzonym w 2004 roku badaniu [21] zidentyfikowano polimorfizmy zarówno w obrębie eksonów 1A, 1B i 1C-9β genu NR3C1, jak i w sekwencjach flankujących, ale grupa badanych obejmowała przypadki astmy o przebiegu łagodnym i umiarkowanym. Autorzy badania nie wykluczyli jednak znaczenia tych polimorfizmów w grupie pacjentów chorych na astmą steroidooporną. Najnowsze badania, przeprowadzone w populacji polskiej, wskazują jednak na rolę polimorfizmu N363S genu NR3C1 w rozwoju astmy oskrzelowej umiarkowanej do ciężkiej postaci [22]. Polimorfizm N363S, podobnie jak ER22/23EK, dotyczy eksonu 2 i modyfikuje domenę AF1 genu receptora, wpływając na interakcje z czynnikami transkrypcyjnymi. Ekspresja genu NR3C1 Wrażliwość tkanki docelowej na glukokortykoidy jest wprost proporcjonalna do ekspresji receptorów. Zaburzenia ekspresji genu NR3C1 mogą potencjalnie stanowić mechanizm wyjaśniający steroidooporność. Pastuszak-Lewandoska D i wsp. Molekularne mechanizmy oporności na glukokortykoidy... Jak już wspomniano, w wyniku alternatywnego splicingu NR3C1 powstają dwie izoformy GKR, z których izoforma β jest inhibitorem izoformy α. Ponadto, przyczyną zwiększonej ekspresji GKRβ – jako mechanizmu względnej oporności na GK – oprócz opisanego już polimorfizmu GR-9β, może być również aktywacja ERK (ang. extracellular signal-regulated kinase), wpływ cytokin prozapalnych (IL-4, IL-2, TNF-α i IFN-γ) oraz czynników środowiskowych (superantygeny gronkowcowe) [23-25]. Zwiększoną ekspresję mRNA GKRβ zaobserwowano u pacjentów opornych na działanie GK chorych m.in. na astmę oskrzelową, reumatoidalne zapalenie stawów i nieswoiste zapalenia jelit, choć rola izoformy β receptora w modulowaniu działania GK in vivo jest nadal przedmiotem dyskusji [24,26-29]. Rozważając mechanizm oporności na glukokortykoidy związany ze zwiększoną ekspresją izoformy β receptora sugeruje się występowanie funkcjonalnej rywalizacji GKRβ z GKRα w wiązaniu z GRE lub zaburzenia translokacji GKRα do jądra komórkowego [24,30]. Drugi z wymienionych mechanizmów został potwierdzony u pacjentów chorych na astmę steroidooporną: w cytoplazmie i jądrach komórkowych makrofagów pęcherzykowych stwierdzono znacznie zwiększony poziom izoformy β receptora, a jego wyłączenie zwiększało liczbę GKRα w jądrach komórkowych, a w konsekwencji wrażliwość na GK [31]. Najnowsze badania wskazują również na inny mechanizm działania GKRβ – związany z hamowaniem aktywności promotora genu deacetylazy histonowej 2 (HDAC2) [32]. Mechanizm steroidooporności związany z obniżeniem ekspresji i aktywności HDAC2 opisano w dalszej części pracy. Alternatywnie, zmniejszenie poziomu ekspresji izoformy α receptora może się również wiązać z zaburzeniem działania GK. W jednym z najnowszych badań w materiale biopsyjnym tkanki płuc pacjentów chorych na astmę oskrzelową steroidooporną stwierdzono obniżony poziom ekspresji GKRα [33]. Podobne wyniki otrzymano analizując poziom ekspresji izoformy α receptora w neutrofilach izolowanych z dróg oddechowych u pacjentów chorych na POChP [34]. Autorzy badania wnioskują, że zwiększona liczba neutrofilów GKRα(-) może być przyczyną braku terapeutycznego wpływu GK w leczeniu tej choroby. Modyfikacje białka GKR Mechanizmem odpowiedzialnym za brak odpowiedzi na leczenie glukokortykoidami mogą być również potranslacyjne modyfikacje GKR, m.in. fosforylacja białka receptorowego przez kinazy białkowe. Potwierdzają to wyniki badań wskazujące na zwiększoną aktywność p38 MAPK (ang. mitogen-activated protein kinase p38, kinaza białkowa p38 aktywowana mitogenami) pod wpływem IL-2 i IL-4 w PBMCs (ang. peripheral blood mononuclear cells, jednojądrzaste komórki krwi obwodowej) u pacjentów chorych na astmę oskrzelową oporną na GK [35]. Z drugiej strony, glukokortykoidy mają zdolność inhibicji szlaku sygnałowego MAPK na drodze aktywacji genu MKP-1, który koduje endogenny inhibitor MAPK. Jednakże, u pacjentów chorych na astmę oskrzelową steroidooporną, stwierdzono istotnie zmniejszoną ekspresję genu MKP-1, co może stanowić przyczynę zwiększonej aktywności 183 p38MAPK [36]. Podobny mechanizm niewrażliwości na kortykosteroidy stwierdzono w przypadku POChP [37]. Wykazano, że ludzki GKR ma kilka miejsc fosforylacji (Ser113, Ser141, Ser203, Ser211, Ser226 i Ser404) w domenie aktywacyjnej i jego fosforylacja może zmieniać zdolność wiązania liganda, stabilność receptora, jego translokację do jądra, wiązanie z DNA i interakcje z innymi białkami, wchodzącymi w skład aparatu transkrypcyjnego [35]. W procesie fosforylacji GKR udział mogą brać również inne kinazy: ERK, JNK (ang. c-Jun N-terminal kinase), CDK (ang. cyclin-dependent kinase), GSK3 (ang. glycogen synthase kinase 3) [38]. Fosforylacja GKR może być spowodowana także przez superantygeny drobnoustrojów, które aktywują szlak MEK-ERK, i – jak wykazano w badaniach in vitro w limfocytach T – indukują oporność na glukokortykoidy [39]. Badania in vitro wykazały możliwość jeszcze innych modyfikacji białka receptorowego. Ubikwitynacja GKR, poprzez przyłączenie cząsteczek białka, ubikwityny, prowadzi do jego rozpoznania przez proteasom i degradacji. Nitrozylacja natomiast – w wyniku przyłączenia grupy nitrozylowej, NO – modyfikuje wiązanie liganda, co zmniejsza wrażliwość na glukokortykoidy [40]. Zaburzenia dotyczące białek ochronnych wchodzących w skład heterokompleksu GKR Obecne w cytozolu receptory glukokortykoidowe tworzą heterokompleksy z kilkoma białkami szoku cieplnego (ang. heat shock proteins, Hsp), które współdziałają w aktywowaniu GKR. Prawidłowa budowa i działanie heterokompleksu ma zasadnicze znaczenie dla odpowiedzi na glukokortykoidy: receptory sterydowe, pozbawione białek ochronnych, wykazują niestabilność czynnościową [41]. Zmieniony poziom Hsp90, jednego z białek ochronnych, został zaobserwowany w PBMCs w kilku chorobach o podłożu zapalnym, w tym w astmie oskrzelowej. Analiza ekspresji mRNA HSP90 u pacjentów chorych na astmę oskrzelową wykazała najwyższy jej poziom w przypadku astmy steroidoopornej [42]. Nie stwierdzono natomiast korelacji pomiędzy polimorfizmami genów kodujących białka ochronne (HSPCA i HSPCB) czy regulatorowe (FKBP5 i FKBP4), wchodzące w skład heterokompleksu z GKR, a odpowiedzią na GK u pacjentów chorych na astmę oskrzelową [43]. Zaburzenia związane z translokacją kompleksu GK/GKR do jądra Po związaniu z ligandem GKR ulega zmianom konformacyjnym, odłącza się od białek ochronnych, tworzy homodimer i cały kompleks (GK/GKR) przemieszcza się z cytoplazmy do jądra komórkowego przy udziale systemu białek transportujących (importyny). Funkcja genu IPO13, kodującego importynę 13, została potwierdzona w komórkach nabłonkowych układu oddechowego. Wykazano, że inhibicja ekspresji genu hamuje translokację GKR z cytoplazmy do jądra komórkowego i blokuje przeciwzapalne działanie GK [44]. Jednak wyniki tego badania – przeprowadzonego w liniach komórkowych 184 i hodowli komórek płuc – wymagają potwierdzenia roli IPO13 w kontrolowaniu przeciwzapalnego działania glukokortykoidów u osób chorych na astmę oskrzelową wrażliwą i oporną na GK. Szczególnie, kiedy u dzieci chorych na astmę oskrzelową, zidentyfikowano już 10 polimorfizmów w obrębie sekwencji genu IPO13, które korelują z odpowiedzią na GK [45]. Również zwiększona ekspresja interleukin w drogach oddechowych pacjentów chorych na astmę oskrzelową steroidooporną powoduje zmniejszoną zdolność translokacji do jądra kompleksu GK/GKR i jego wiązania z DNA [46]. Obserwacje te potwierdzono w badaniach in vitro w obecności podwyższonej ekspresji cytokin IL-2 i IL-4 w limfocytach T oraz IL-13 w monocytach [35]. Zastosowanie inhibitora kinazy p38 MAPK zahamowało wpływ cytokin na translokację GK/GKR do jądra komórkowego, co sugeruje, że aktywacja szlaku MAPK stanowi istotny mechanizm regulujący odpowiedź komórki na GK, o czym wspomniano we wcześniejszej części pracy. Z drugiej strony, interleukiny mogą również pobudzać ekspresję GKRβ receptora, co także wiąże się z zaburzeniami translokacji GKRα do jądra komórkowego. Ponadto, w eksperymentach in vitro dotyczących zaburzeń translokacji GKR do jądra, zaobserwowano udział czynnika transkrypcyjnego STAT5 i kinazy JAK3 [31], wpływ fosforylacji białka GKR w pozycji Ser 226 [35], jak również wpływ stresu oksydacyjnego na Cys 481, w obrębie sekwencji NL1 domeny NLS (ang. nuclear localisation signal) odpowiedzialnej za transport receptora do jądra [47]. Zaburzenia związane z procesem transkrypcji genów wrażliwych na działanie GK Aktywacja czynników transkrypcyjnych Czynnikami transkrypcyjnymi, które bezpośrednio wiążą się z kompleksem GK/GKR w jądrze i modulują jego aktywność transrepresyjną, są: AP-1 (ang. activator protein 1), NF-κB (ang. nuclear factor kappa B), STATs (ang. signal transducers and activators of transcription) czy CREBP (ang. cyclic AMP response element-binding protein). Są to interakcje typu białko-białko, które odgrywają ważną rolę w przeciwzapalnym działaniu glukokortykoidów, umożliwiając tłumienie ekspresji (transrepresja) genów cytokin – pobudzanych przez wymienione czynniki transkrypcyjne – bez bezpośredniego wiązania GKR z sekwencją GRE w DNA [48]. Istotne znaczenie ma fakt, że ta interakcja wywiera wzajemnie hamujący wpływ: wysokie stężenia AP-1 i NF-κB osłabiają działanie GKR. Prozapalny czynnik transkrypcyjny AP-1 pełni ważną rolę w ekspresji interleukin wydzielanych przez komórki Th2 w przebiegu astmy, takich jak: IL-4, IL-5 oraz IL-13. AP-1 jest heterodimerem złożonym z białek Jun (c-Jun, JunB i JunD) oraz Fos (c-Fos, FosB, Fra1 i Fra2), aktywowanym przez cytokiny prozapalne (np. TNFα), ulegającym fosforylacji w szlaku JNK [49]. U pacjentów chorych na astmę oskrzelową oporną na GK stwierdzono zwiększoną aktywację c-Jun i JNK oraz zwiększoną ekspresję c-Fos i brak supresji fosforylacji białka pod wpływem wysokich dawek doustnych GK, w przeciwieństwie do osób wrażliwych na działanie GK [50,51]. Badania potwierdziły zwiększony poziom AP-1 w PBMCs Alergia Astma Immunologia 2012, 17 (4): 180-189 u pacjentów chorych na astmę oskrzelową steroidooporną, a wzrost aktywności AP-1 towarzyszył zmianom w zdolności wiązania kompleksu GK/GKR z sekwencją GRE [52]. Innym czynnikiem transkrypcyjnym, którego wzrost ekspresji – zarówno na poziomie mRNA, jak i białka – obserwowany jest u pacjentów charakteryzujących się opornością na glukokortykoidy, jest NF-κB [53]. Obecny w cytoplazmie nieaktywny czynnik NF-κB – złożony z dwóch podjednostek białkowych p65 i p50 – związany jest z białkiem inhibującym IκB. Pod wpływem pobudzenia przez sygnały prozapalne, IκB ulega proteolitycznej degradacji, a uwolniony NF-κB przemieszcza się do jądra, gdzie uczestniczy w transkrypcji genów. Wiele genów kodujących cząsteczki prozapalne, takie jak interleukiny, cytokiny, cząsteczki adhezyjne, posiada w sekwencji promotora miejsca wiązania NF-κB i ekspresja tych genów jest pobudzana przez ten czynnik transkrypcyjny [49]. Jak już wspomniano, mechanizm działania glukokortykoidów wiąże się również z transrepresją aktywującej funkcji NF-κB, a to antagonistyczne działanie jest wzajemne – badania wykazały hamujący wpływ NF-κB na transaktywacyjną funkcję GK [54]. Może być to podstawą oporności na glukokortykoidy. Wzrost aktywności białek NFκB i AP-1 może zachodzić pod wpływem stresu oksydacyjnego: NF-κB i AP-1 są białkami wrażliwymi na reakcje redoks [55]. Ponadto, obserwowana w przebiegu astmy oskrzelowej zwiększona ekspresja cytokin prozapalnych, takich jak Il-2/IL-4, prowadzi do wzmożonej aktywacji czynników transkrypcyjnych, w tym AP-1 [56]. Obecnie brak jest dowodów na genetyczne podłoże (mutacje, polimorfizmy) zwiększonej aktywności AP-1. W stosunku natomiast do NF-κB stwierdzono zwiększoną ekspresję genu NFKB1 (kodującego podjednostkę NF-ĸB wiążącą DNA), który zaliczono do panelu kilkunastu genów charakteryzujących się podwyższoną ekspresją u pacjentów chorujących na astmę steroidooporną (opisany w dalszej części pracy profil ekspresji genów różnicujący astmę wrażliwą i oporną na GK) [3]. Zaburzona acetylacja histonów Histony, białka odpowiedzialne za upakowanie DNA w formie chromatyny w jądrze komórkowym, podlegają różnym modyfikacjom potranslacyjnym, takim jak fosforylacja, metylacja, ubikwitynacja czy sumoilacja [57]. Spośród nich główny wpływ na transkrypcję genów wywiera acetylacja: hiperacetylacja histonów wiąże się z dekondensacją chromatyny (remodeling chromatyny) i dostępnością DNA dla polimerazy II RNA oraz białek uczestniczących w transkrypcji genów, natomiast hipoacetylacja histonów towarzyszy kondensacji chromatyny i zahamowaniu procesu transkrypcji [58]. W acetylacji histonów uczestniczą koaktywatory transkrypcji, takie jak CBP (ang. CREB-binding protein) i p300, posiadające wewnętrzną aktywność acetylotransferazy histonowej (ang, histone acetyltransferase, HAT), tj. enzymu katalizującego proces acetylacji, oraz inne białka koaktywatorowe, w tym SRC-1 (ang. steroid receptor co-activator-1), TIF2 (ang. transcription factor intermediary factor-2), p/CIP (ang. p300/CBP co-integrator-associated protein) i GRIP-1 Pastuszak-Lewandoska D i wsp. Molekularne mechanizmy oporności na glukokortykoidy... (ang. glucocorticosteroid receptor enhancing protein-1) zwiększają miejscową aktywność HAT. Ponadto aktywność HAT koaktywatorów pobudzana jest przez przyłączenie czynników transkrypcyjnych, m.in. NF-κB, AP-1 i STATs. Taki mechanizm regulacji ekspresji dotyczy również genów uczestniczących w procesie zapalnym [41]. U pacjentów chorych na astmę oskrzelową w makrofagach pęcherzykowych stwierdzono zwiększony poziom acetylacji histonów rdzeniowych, głównie H4, co powiązano ze zwiększoną ekspresją licznych genów prozapalnych. Ponadto, w materiale biopsyjnym u tych pacjentów zaobserwowano zwiększoną aktywność acetylotransferaz histonowych, tj. CBP i PCAF (ang. p300/CBP-associated factor) [59]. Acetylacja histonów odgrywa kluczową rolę również w mechanizmie działania GK. W przypadku genów, których transkrypcja jest pobudzana przez glukokortykoidy (transaktywacja), wysokie stężenie GK powoduje związanie kompleksu GK/GKR z CBP i/lub innymi koaktywatorami, co prowadzi do acetylacji lizyn 5 i 16 (K5 i K16) histonu H4 i zwiększonej transkrypcji genu. Przykładem może być aktywacja genu MKP-1 przez GK na drodze acetylacji wymienionych lizyn (K5 i K16) histonu H4 [60]. U pacjentów chorych na astmę oskrzelową steroidooporną stwierdzono obniżony poziom acetylacji K5 w H4, co może stanowić mechanizm oporności na glukokortykoidy powiązany z zaburzeniami transaktywacyjnej funkcji GK [46]. Transrepresyjne działanie glukokortykoidów wiąże się natomiast z rekrutacją deacetylazy histonowej (ang. histone deacetylase, HDAC) – enzymu o przeciwstawnym do HAT działaniu, który powoduje deacetylację GKR. Receptor glukokortykoidowy ulega acetylacji po związaniu liganda, natomiast jego deacetylacja pod wpływem deacetylazy histonowej 2 (ang. histone deacetylase 2, HDAC2) umożliwia związanie z jądrowym czynnikiem transkrypcyjnym NF-κB i tłumienie ekspresji genów prozapalnych aktywowanych przez NF-κB [41]. Deacetylazy histonowe odgrywają zasadniczą rolę w hamowaniu ekspresji genów na drodze deacetylacji histonów rdzeniowych. Pod względem regulacji ekspresji genów uczestniczących w procesie zapalnym, największe znaczenie ma HDAC2, enzym odpowiadający za hamowanie produkcji prozapalnych cytokin w makrofagach pęcherzykowych [61]. Badania wykazały obecność w promotorze genu HDAC2 dwóch funkcjonalnych regionów pobudzanych przez GK [32]. U osób chorych na astmę oskrzelową leczonych wziewnymi kortykosteroidami stwierdzono większą aktywność HDAC niż u osób nieleczonych oraz obniżony poziom aktywności HAT [61,62]. W przypadku natomiast pacjentów chorych na astmę oskrzelową oporną na działanie GK, w PBMCs i makrofagach pęcherzykowych, zaobserwowano zmniejszoną aktywność i ekspresję HDAC2, co, ponadto, korelowało z ciężkością choroby [63]. Również w przypadku innego schorzenia o podłożu zapalnym, POChP, zaobserwowano obniżenie aktywności deacetylaz histonowych, tj. HDAC2, HDAC5 i HDAC8, korelujące ze stopniem ciężkości choroby [59]. Jak wykazano, utrata aktywności HDAC2 nie wpłynęła na translokację GKR do jądra czy wiązanie GKR z sekwencją GRE w DNA, ale uniemożliwiła związanie GKR 185 z NF-κB [41]. Rola HDAC2 w mechanizmie niewrażliwości na glukokortykoidy została potwierdzona w badaniu in vitro, w którym nadekspresja HDAC2 w makrofagach pęcherzykowych u pacjentów chorych na POChP przywróciła wrażliwość na GK [41]. Obniżoną ekspresję i aktywność HDAC zaobserwowano także u chorych na astmę oskrzelową, którzy palą papierosy [64]. Potwierdzonym mechanizmem w tym przypadku jest silny stres oksydacyjny i nitrozacyjny, powstający wskutek palenia tytoniu. Badania in vitro wykazały, że produkowane w takich warunkach m.in. jony nadtlenoazotanowe reagują z regionami białek bogatymi w tyrozynę, w tym białek HDAC2, doprowadzając do ich fosforylacji/ubikwitynacji i degradacji przez proteasomy [65,66]. Stres oksydacyjny towarzyszy przewlekłym chorobom zapalnym, w tym astmie i POChP [67]. Oprócz produkcji jonów nadtlenoazotanowych, stres oksydacyjny aktywuje kinazę fosfatydylo-3-inozytolu (PI3K)-delta /PI3K-δ/, co prowadzi do fosforylacji i inaktywacji HDAC2 [68]. Zarówno badania in vivo jak i in vitro wykazały, że zahamowanie aktywności szlaku PI3K-δ przywraca wrażliwość na GK [68]. Najnowsze badania wskazują, że innym mechanizmem odpowiedzialnym za obniżoną ekspresję HDAC2 u pacjentów chorych na astmę oskrzelową steroidooporną może być nadekspresja GKRβ, która blokuje sekwencje GRE w promotorze genu HDAC2 [32]. Mediatory procesu zapalnego Podstawowy poziom ekspresji cytokin podlega ścisłej regulacji genetycznej. Polimorfizmy w obrębie regionów regulatorowych cytokin determinują fenotypy charakteryzujące się wyższą bądź niższą produkcją cytokin, co z kolei może być przyczyną różnic pod względem stopnia ciężkości zapalenia i odpowiedzi na leczenie glukokortykoidami. Interleukina 10 (IL-10) jest cytokiną o właściwościach przeciwzapalnych i immunoregulacyjnych, wydzielaną przez limfocyty regulatorowe T (Treg) w odpowiedzi na GK. U pacjentów chorych na astmę oskrzelową oporną na działanie glukokortykoidów, w porównaniu do pacjentów wrażliwych na GK, stwierdzono zmniejszone wydzielanie IL-10 przez Treg [69]. Ponadto, polimorfizmy genu wiążące się z zaburzeniem ekspresji IL-10, korelują z cięższym przebiegiem choroby [70]. Natomiast wśród cytokin prozapalnych, zasadniczą rolę odgrywa interleukina 1 (IL-1α i β), a w szczególności IL-1β, która wyzwala kaskadę cytokin prozapalnych i podtrzymuje stan zapalny. Analiza inhibicji produkcji IL-1β w PBMC pod wpływem prednizolonu potwierdziła, że określone genotypy związane z polimorfizmami IL-1β wiążą się z odpowiedzią na GK [71]. TNF-α (ang. tumor necrosis factor α) to również cytokina o silnym wpływie prozapalnym. Wykazano, że nosiciele allelu A, związanego z polimorfizmem genu w obrębie miejsca wiązania AP-1, charakteryzują się większą podatnością na rozwój chorób o podłożu zapalnym, w tym astmy [72], a genotyp AA skorelowano z opornością na leczenie sterydami m.in. w przypadku nieswoistych zapaleń jelit [73]. Brak jest natomiast badań dotyczących czynnościowego 186 znaczenia polimorfizmów genu TNF-α w patogenezie astmy steroidoopornej. Kolejną cytokiną prozapalną jest czynnik hamujący migrację makrofagów (ang. macrophage migration inhibitory factor, MIF). MIF tłumi działanie przeciwzapalne glukokortykoidów głównie na drodze hamowania indukcji MKP-1, co może odgrywać rolę w rozwoju steroidooporności [74]. Polimorfizmy genu w obrębie sekwencji promotorowej, powodujące zwiększoną ekspresję MIF, powiązano z kilkoma chorobami o podłożu zapalnym [75]. U pacjentów chorych na astmę oskrzelową poziom MIF w płynie BAL, surowicy i plwocinie jest znacznie wyższy niż w innych chorobach zapalnych układu oddechowego [76]. Jednocześnie, jak opisano we wcześniejszej części pracy, w przypadku astmy steroidoopornej występuje istotne zmniejszenie ekspresji MKP-1. Inne przyczyny Zróżnicowane profile ekspresji genów Podłoże astmy jest wielogenowe, a wykorzystanie technik biologii molekularnej pozwoliło zidentyfikować geny sprzyjające jej rozwojowi (geny podatności). Praca przeglądowa opublikowana w 2011 roku opisuje 24 geny, które najczęściej analizowano i co do których potwierdzono związek z rozwojem astmy i atopii [77]. Badania farmakogenetyczne odpowiedzi na GK wykazały związek polimorfizmów genów podatności z parametrami czynności płuc, reaktywnością dróg oddechowych i zaostrzeniami astmy [78]. Brak jest jednak analiz łączących je ze steroidoopornością. Alternatywnym podejściem badawczym jest analiza ekspresji genów kandydatów. Badanie przeprowadzone z użyciem techniki mikromacierzy oligonukleotydowych pozwoliło zidentyfikować geny, których ekspresja różnicuje pacjentów chorych na astmę oskrzelową wrażliwą i oporną na GK [3]. Profil ekspresji 11 genów charakteryzował się 84% dokładnością pod względem przewidywania odpowiedzi na wziewne GK. Wśród genów, które znalazły się w tym panelu, są geny kodujące czynniki transkrypcyjne i cząsteczki sygnałowe zaangażowane w odpowiedź immunologiczną, np. NFKB1 (podjednostka NFĸB wiążąca DNA), IL-4R (receptor dla interleukiny 4), STAT4. Zastosowanie wytypowanych genów jako potencjalnych markerów molekularnych wymaga jednak dalszych badań, w tym walidacji w badaniu wieloośrodkowym. Ponadto, jak podkreślają autorzy badania, należy pamiętać, że odpowiedź w PBMCs na steroidy może nie odzwierciedlać oporności na steroidy w komórkach dróg oddechowych [3]. Podobne badanie dotyczące analizy profilu ekspresji genów w odpowiedzi na GK zostało przeprowadzone przez Donna i wsp. [79]. Analizą objęto osoby zdrowe, które na podstawie odpowiedzi na test z użyciem deksametazonu podzielono na dwie grupy, tj. osoby wrażliwe i oporne na działanie GK. Na podstawie otrzymanych wyników wytypo- Alergia Astma Immunologia 2012, 17 (4): 180-189 wano 20 genów, których ekspresja w sposób istotny różniła się pomiędzy badanymi grupami [79]. Kontynuacja tych badań pozwoliła poznać czynnościowy wpływ tych genów. Jako geny modulujące odpowiedź na GK zidentyfikowano, m.in., BMPRII (ang. bone morphogenetic protein receptor, type II), IFI16 (ang, interferon-inducible protein 16), RGS14 (ang. regulator of G-protein signaling 14) [80]. Zwiększona ekspresja glikoproteiny P Glikoproteina P, kodowana przez gen MDR1 (ang. multidrug resistance gene), należy do grupy białek transportujących i odpowiada za aktywny transport, tj. „wyrzucanie”, leku z komórki. Dotyczy to także glukokortykoidów. Wyniki badań wiążą zaburzenia związane z genem MDR1 – takie jak obecność polimorfizmów, zwiększony poziom ekspresji genu – z opornością na GK w przebiegu nieswoistych zapaleń jelit i reumatoidalnego zapalenia stawów [81]. Jak dotąd brak jest podobnych badań w przypadku pacjentów chorych na astmę steroidooporną. Infekcje wirusowe (białko E1A adenowirusa) Jak wykazano w badanych in vitro komórkach nabłonka układu oddechowego, infekcja adenowirusowa jest czynnikiem zwiększającym ekspresję genów białek prozapalnych. Mechanizmem odpowiedzialnym jest oddziaływanie transaktywacyjnego białka E1A adenowirusa w komórkach gospodarza z regulatorami transkrypcji, takimi jak NF-κB, czy białko p300 posiadające aktywność HAT. Istnieją doniesienia, że u pacjentów chorych na astmę i POChP zakażenie adenowirusami w stanie latencji wiąże się z mechanizmem nasilenia się procesu zapalnego oraz z rozwojem steroidooporności [82]. Podsumowanie W mechanizmie oporności na glukokortykoidy uczestniczy szereg mechanizmów molekularnych (tab. I). Prowadzą one do zmian we wrażliwości tkanki docelowej na GK, tak jak jest to obserwowane w szeregu chorób zapalnych, w tym w ciężkiej astmie oskrzelowej. Ze względu na złożony charakter steroidooporności, uwarunkowanej wieloczynnikowo – z udokumentowanym udziałem komponenty genetycznej, środowiskowej, jak również osobniczej – zjawisko to wymaga dalszych, pogłębionych badań. Oporność na glukokortykoidy prawdopodobnie modyfikuje kliniczny fenotyp tych chorób oraz ich przebieg, jak również wpływa na odpowiedź na terapię z zastosowaniem glukokortykoidów. Dlatego też identyfikowanie molekularnych mechanizmów steroidooporności ma olbrzymie znaczenie nie tylko ze względów poznawczych, ale również pod kątem możliwości opracowania skuteczniejszych strategii terapeutycznych, w przyszłości ukierunkowanych na leczenie zindywidualizowane. Pastuszak-Lewandoska D i wsp. Molekularne mechanizmy oporności na glukokortykoidy... 187 Tabela I. Molekularne mechanizmy oporności na glukokortykoidy Zaburzenia Odpowiedzialny mechanizm molekularny Genu/białka receptorowego Mutacje genu NR3C1 Polimorfizmy genu NR3C1 Zmniejszona ekspresja mRNA GKRα Zwiększona ekspresja mRNA GKRβ Potranslacyjne modyfikacje białka (fosforylacja, nitrozylacja, ubikwitynacja) Białek ochronnych heterokompleksu GKR Zmieniona ekspresja białek ochronnych wchodzących w skład heterokompleksu GKR Polimorfizm genu Hsp90 Transportu kompleksu GK-GKR do jądra komórkowego/ wiązanie z DNA Aktywacja kinazy p38 MAPK (fosforylacja GKR) Zwiększona ekspresja GKRβ Nasilenie stresu oksydacyjnego Zwiększona aktywność STAT5, JAK3 Zahamowanie ekspresji/ polimorfizm genu IPO13 Procesu transkrypcji Zwiększona aktywność czynników transkrypcyjnych: AP-1, NFκB, JNK Zmniejszona acetylacja K5H4 Zmniejszona ekspresja i aktywność HDAC Zwiększona aktywność HAT Mediatorów prozapalnych Polimorfizm i zmieniona ekspresja genów: IL-10, IL-1β, TNF-α, MIF1 Białek związanych z transportem poza komórkę i/lub metabolizmem GK Zwiększona ekspresja/polimorfizm genu MDR1 Inne Zmieniony profil ekspresji genów Transaktywacyjna funkcja białka E1A adenowirusa Piśmiennictwo 1. Coutinho AE, Chapman KE. The anti-inflammatory and immunosuppressive effects of glucocorticoids, recent developments and mechanistic insights. Mol Cell Endocrinol 2011; 335(1): 2-13. 2. Leung DY, Spahn JD, Szefler SJ. Immunologic basis and management of steroid-resistant asthma. Allergy Asthma Proc 1999; 20(1): 9-14. 3. 10. Lane SJ, Arm JP, Staynov DZ i wsp. Chemical mutational analysis of the human glucocorticoid receptor cDNA in glucocorticoid-resistant bronchial asthma. Am J Respir Cell Mol Biol 1994; 11(1): 42-8. 11. Panek M, Pietras T, Kupryś-Lipińska I i wsp. The analysis of the factors influencing the development of glucocorticoid resistance in the etiopathogenesis of severe bronchial asthma. Postepy Biochem 2010; 56(4): 373-82. Hakonarson H, Bjornsdottir US, Halapi E i wsp. Profiling of genes expressed in peripheral blood mononuclear cells predicts glucocorticoid sensitivity in asthma patients. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102(41): 14789-94. 12. van Oosten MJ, Dolhain RJ, Koper JW i wsp. Polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene that modulate glucocorticoid sensitivity are associated with rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2010; 12(4): 159. 4. Giguere V, Hollenberg SM, Rosenfeld MG i wsp. Functional domains of the human glucocorticoid receptor. Cell 1986; 46(5): 645-52. 13. 5. Charmandari E, Kino T, Ichijo T i wsp. Generalized glucocorticoid resistance: clinical aspects, molecular mechanisms, and implications of a rare genetic disorder. J Clin Endocrinol Metab 2008; 93(5): 1563-72. Maltese P, Canestrari E, Palma L i wsp. High resolution melting (HRM) analysis for the detection of ER22/23EK, BclI, and N363S polymorphisms of the glucocorticoid receptor gene. J Steroid Biochem Mol Biol. 2009;113(3-5):269-274. 14. Charmandari E, Kino T. Chrousos syndrome: a seminal report, a phylogenetic enigma and the clinical implications of glucocorticoid signalling changes. Eur J Clin Invest 2010; 40(10): 932-42. van Rossum EF, Koper JW, Huizenga NA i wsp. A polymorphism in the glucocorticoid receptor gene, which decreases sensitivity to glucocorticoids in vivo, is associated with low insulin and cholesterol levels. Diabetes. 2002;51(10):3128-3134. 15. Russcher H, Smit P, van den Akker EL i wsp. Two polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene directly affect glucocorticoid-regulated gene expression. J Clin Endocrinol Metab. 2005;90(10):5804-5810. 16. Alangari AA. Genomic and non-genomic actions of glucocorticoids in asthma. Ann Thorac Med. 2010;5(3):133-9. 17. Manenschijn L, van den Akker EL, Lamberts SW i wsp. Clinical features associated with glucocorticoid receptor polymorphisms. An overview. Ann N Y Acad Sci. 2009;1179:179-198. 18. Derijk RH, Schaaf MJ, Turner G i wsp. A human glucocorticoid receptor gene variant that increases the stability of the glucocorticoid receptor beta-isoform mRNA is associated with rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 2001;28(11):2383-2388. 6. 7. Raef H, Baitei EY, Zou M i wsp. Genotype-phenotype correlation in a family with primary cortisol resistance: possible modulating effect of the ER22/23EK polymorphism. Eur J Endocrinol 2008; 158(4): 577-82. 8. Charmandari E. Primary generalized glucocorticoid resistance and hypersensitivity. Horm Res Paediatr 2011; 76(3): 145-55. 9. Charmandari E, Kino T, Ichijo T i wsp. Functional characterization of the natural human glucocorticoid receptor (hGR) mutants hGRalphaR477H and hGRalphaG679S associated with generalized glucocorticoid resistance. J Clin Endocrinol Metab 2006; 91(4): 1535-43. 188 Alergia Astma Immunologia 2012, 17 (4): 180-189 19. Oakley RH, Jewell CM, Yudt MR i wsp. The dominant negative activity of the human glucocorticoid receptor beta isoform. Specificity and mechanisms of action. J Biol Chem. 1999;274(39): 27857-66. 36. Bhavsar P, Khorasani N, Hew M i wsp. Effect of p38 MAPK inhibition on corticosteroid suppression of cytokine release in severe asthma. Eur Respir J. 2010;35(4):750-756. 20. van den Akker EL, Russcher H, van Rossum EF i wsp. Glucocorticoid receptor polymorphism affects transrepression but not transactivation. J Clin Endocrinol Metab. 2006;91(7):28002803. 37. Armstrong J, Harbron C, Lea S i wsp. Synergistic effects of p38 mitogen-activated protein kinase inhibition with a corticosteroid in alveolar macrophages from patients with chronic obstructive pulmonary disease. J Pharmacol Exp Ther. 2011;338(3): 732-740. 21. Hawkins GA, Amelung PJ, Smith RS i wsp. Identification of polymorphisms in the human glucocorticoid receptor gene (NR3C1) in a multi-racial asthma case and control screening panel. DNA Seq. 2004;15(3):167-173. 38. Beck IM, Vanden Berghe W, Vermeulen L i wsp. Crosstalk in inflammation: the interplay of glucocorticoid receptor-based mechanisms and kinases and phosphatases. Endocr Rev. 2009;30(7):830-882. 22. Panek M, Pietras T, Antczak A i wsp. The role of functional single nucleotide polymorphisms of the human glucocorticoid receptor gene NR3C1 in Polish patients with bronchial asthma. Mol Biol Rep. 2011; Epub ahead of print 39. 23. Tliba O, Cidlowski JA, Amrani Y. CD38 expression is insensitive to steroid action in cells treated with tumor necrosis factoralpha and interferon-gamma by a mechanism involving the up-regulation of the glucocorticoid receptor beta isoform. Mol Pharmacol. 2006;69(2):588-596. Li LB, Goleva E, Hall CF i wsp. Superantigen-induced corticosteroid resistance of human T cells occurs through activation of the mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular signalregulated kinase (MEK-ERK) pathway. J Allergy Clin Immunol. 2004;114(5):1059-1069. 40. Ito K, Chung KF, Adcock IM. Update on glucocorticoid action and resistance. J Allergy Clin Immunol. 2006;117(3):522-543. 41. Pratt WB, Morishima Y, Murphy M i wsp. Chaperoning of glucocorticoid receptors. Handb Exp Pharmacol. 2006;(172):111138. 42. Qian X, Zhu Y, Xu W i wsp. Glucocorticoid receptor and heat shock protein 90 in peripheral blood mononuclear cells from asthmatics. Chin Med J (Engl). 2001;114(10):1051-1054. 43. Hawkins GA, Lazarus R, Smith RS i wsp. The glucocorticoid receptor heterocomplex gene STIP1 is associated with improved lung function in asthmatic subjects treated with inhaled corticosteroids. J Allergy Clin Immunol. 2009;123(6):1376-1383. 44. Tao T, Lan J, Lukacs GL i wsp. Importin 13 regulates nuclear import of the glucocorticoid receptor in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2006;35(6):668-680. 45. Raby BA, Van Steen K, Lasky-Su J i wsp. Importin-13 genetic variation is associated with improved airway responsiveness in childhood asthma. Respir Res. 2009;10:67. 46. Matthews JG, Ito K, Barnes PJ i wsp. Defective glucocorticoid receptor nuclear translocation and altered histone acetylation patterns in glucocorticoid-resistant patients. J Allergy Clin Immunol. 2004;113(6):1100-1108. 47. Okamoto K, Tanaka H, Ogawa H i wsp. Redox-dependent regulation of nuclear import of the glucocorticoid receptor. J Biol Chem. 1999;274(15):10363-10371. 48. Reichardt HM, Tuckermann JP, Göttlicher M i wsp. Repression of inflammatory responses in the absence of DNA binding by the glucocorticoid receptor. EMBO J. 2001;20(24):7168-7173. 49. Barnes PJ. Transcription factors in airway diseases. Lab Invest. 2006;86(9):867-872. 50. Loke TK, Mallett KH, Ratoff J i wsp. Systemic glucocorticoid reduces bronchial mucosal activation of activator protein 1 components in glucocorticoid-sensitive but not glucocorticoid-resistant asthmatic patients. J Allergy Clin Immunol. 2006;118(2): 368-375. 51. Takahashi E, Onda K, Hirano T i wsp. Expression of c-fos, rather than c-jun or glucocorticoid-receptor mRNA, correlates with decreased glucocorticoid response of peripheral blood mononuclear cells in asthma. Int Immunopharmacol. 2002;2(10): 1419-1427. 52. Adcock IM, Lane SJ, Brown CR i wsp. Differences in binding of glucocorticoid receptor to DNA in steroid-resistant asthma. J Immunol. 1995;154(7):3500-3505. 53. Bantel H, Schmitz ML, Raible A i wsp. Critical role of NF-kappaB and stress-activated protein kinases in steroid unresponsiveness. FASEB J. 2002;16(13):1832-1834. 24. Webster JC, Oakley RH, Jewell CM i wsp. Proinflammatory cytokines regulate human glucocorticoid receptor gene expression and lead to the accumulation of the dominant negative beta isoform: a mechanism for the generation of glucocorticoid resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(12):6865-6870. 25. Hauk PJ, Hamid QA, Chrousos GP i wsp. Induction of corticosteroid insensitivity in human PBMCs by microbial superantigens. J Allergy Clin Immunol. 2000;105(4):782-787. 26. Fujishima S, Takeda H, Kawata S i wsp. The relationship between the expression of the glucocorticoid receptor in biopsied colonic mucosa and the glucocorticoid responsiveness of ulcerative colitis patients. Clin Immunol. 2009;133(2):208-217. 27. Kozaci DL, Chernajovsky Y, Chikanza IC. The differential expression of corticosteroid receptor isoforms in corticosteroid-resistant and -sensitive patients with rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford). 2007;46(4):579-585. 28. Pujols L, Mullol J, Picado C. Alpha and beta glucocorticoid receptors: relevance in airway diseases. Curr Allergy Asthma Rep. 2007;7(2):93-99. 29. Sousa AR, Lane SJ, Cidlowski JA i wsp. Glucocorticoid resistance in asthma is associated with elevated in vivo expression of the glucocorticoid receptor beta-isoform. J Allergy Clin Immunol. 2000;105(5):943-950. 30. Li LB, Leung DY, Hall CF i wsp. Divergent expression and function of glucocorticoid receptor beta in human monocytes and T cells. J Leukoc Biol. 2006 Apr;79(4):818-827. 31. Goleva E, Li LB, Eves PT i wsp. Increased glucocorticoid receptor beta alters steroid response in glucocorticoid-insensitive asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2006;173(6):607-616. 32. Li LB, Leung DY, Martin RJ i wsp. Inhibition of histone deacetylase 2 expression by elevated glucocorticoid receptor beta in steroid-resistant asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2010;182(7): 877-883. 33. Vazquez-Tello A, Semlali A, Chakir J i wsp. Induction of glucocorticoid receptor-beta expression in epithelial cells of asthmatic airways by T-helper type 17 cytokines. Clin Exp Allergy. 2010;40(9):1312-1322. 34. Plumb J, Gaffey K, Kane B i wsp. Reduced glucocorticoid receptor expression and function in airway neutrophils. Int Immunopharmacol. 2011. Epub ahead of print 35. Irusen E, Matthews JG, Takahashi A i wsp. Mitogen-activated protein kinase-induced glucocorticoid receptor phosphorylation reduces its activity: role in steroid-insensitive asthma. J Allergy Clin Immunol. 2002;109(4):649-657. Pastuszak-Lewandoska D i wsp. Molekularne mechanizmy oporności na glukokortykoidy... 189 54. McKay LI, Cidlowski JA. Molecular control of immune/ inflammatory responses: interactions between nuclear factorkappa B and steroid receptor-signaling pathways. Endocr Rev. 1999;20(4):435-459. 69. Xystrakis E, Kusumakar S, Boswell S i wsp. Reversing the defective induction of IL-10-secreting regulatory T cells in glucocorticoid-resistant asthma patients. J Clin Invest. 2006 Jan;116(1): 146-55. 55. Dozor AJ. The role of oxidative stress in the pathogenesis and treatment of asthma. Ann N Y Acad Sci. 2010;1203:133-137. 70. 56. Wang CY, Bassuk AG, Boise LH i wsp. Activation of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor promoter in T cells requires cooperative binding of Elf-1 and AP-1 transcription factors. Mol Cell Biol. 1994;14(2):1153-1159. Chatterjee R, Batra J, Kumar A i wsp. Interleukin-10 promoter polymorphisms and atopic asthma in North Indians. Clin Exp Allergy. 2005;35(7):914-919. 71. Markova S, Nakamura T, Makimoto H i wsp. IL-1beta genotyperelated effect of prednisolone on IL-1beta production in human peripheral blood mononuclear cells under acute inflammation. Biol Pharm Bull. 2007;30(8):1481-1487. 72. Gao J, Shan G, Sun B i wsp. Association between polymorphism of tumour necrosis factor alpha-308 gene promoter and asthma: a meta-analysis. Thorax. 2006;61(6):466-471. 73. Cucchiara S, Latiano A, Palmieri O i wsp. Polymorphisms of tumor necrosis factor-alpha but not MDR1 influence response to medical therapy in pediatric-onset inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2007;44(2):171-179. 74. Flaster H, Bernhagen J, Calandra T i wsp. The macrophage migration inhibitory factor-glucocorticoid dyad: regulation of inflammation and immunity. Mol Endocrinol. 2007;21(6):12671280. 57. Berger SL. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 2007;447(7143):407-412. 58. Delcuve GP, Rastegar M, Davie JR. Epigenetic control. J Cell Physiol. 2009;219(2):243-250. 59. Ito K, Ito M, Elliott WM i wsp. Decreased histone deacetylase activity in chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 2005;352(19):1967-1976. 60. Ito K, Barnes PJ, Adcock IM. Glucocorticoid receptor recruitment of histone deacetylase 2 inhibits IL-1β-induced histone H4 acetylation on lysines 8 and 12. Mol Cell Biol. 2000;20(18): 6891–6903. 61. Ito K, Caramori G, Lim S i wsp. Expression and activity of histone deacetylases in human asthmatic airways. Am J Respir Crit Care Med. 2002;166(3):392-396. 75. 62. Cosío BG, Mann B, Ito K i wsp. Histone acetylase and deacetylase activity in alveolar macrophages and blood mononocytes in asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2004;170(2):141-7. Grieb G, Merk M, Bernhagen J i wsp. Macrophage migration inhibitory factor (MIF): a promising biomarker. Drug News Perspect. 2010;23(4):257-264. 76. 63. Hew M, Bhavsar P, Torrego A i wsp. Relative corticosteroid insensitivity of peripheral blood mononuclear cells in severe asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2006;174(2):134-141. Yamaguchi E, Nishihira J, Shimizu T i wsp. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) in bronchial asthma. Clin Exp Allergy. 2000;30(9):1244-1249. 77. 64. Chaudhuri R, Livingston E, McMahon AD i wsp. Cigarette smoking impairs the therapeutic response to oral corticosteroids in chronic asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2003;168(11):13081311. Bijanzadeh M, Mahesh PA, Ramachandra NB. An understanding of the genetic basis of asthma. Indian J Med Res. 2011;134(2): 149-161. 78. Lima JJ, Blake KV, Tantisira KG i wsp. Pharmacogenetics of asthma. Curr Opin Pulm Med. 2009;15(1):57-62. 79. 65. Adenuga D, Yao H, March TH i wsp. Histone deacetylase 2 is phosphorylated, ubiquitinated, and degraded by cigarette smoke. Am J Respir Cell Mol Biol. 2009;40(4):464-473. Donn R, Berry A, Stevens A i wsp. Use of gene expression profiling to identify a novel glucocorticoid sensitivity determining gene, BMPRII. FASEB J. 2007;21(2):402-414. 80. 66. Osoata GO, Yamamura S, Ito M i wsp. Nitration of distinct tyrosine residues causes inactivation of histone deacetylase 2. Biochem Biophys Res Commun. 2009;384(3):366-371. Berry A, Matthews L, Jangani M i wsp. Interferon-inducible factor 16 is a novel modulator of glucocorticoid action. FASEB J. 2010;24(6):1700-1713. 81. 67. Rahman I, Adcock IM. Oxidative stress and redox regulation of lung inflammation in COPD. Eur Respir J. 2006;28(1):219-242. 68. To Y, Ito K, Kizawa Y i wsp. Targeting phosphoinositide-3-kinase-delta with theophylline reverses corticosteroid insensitivity in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 2010;182(7):897-904. Drozdzik M, Rudas T, Pawlik A i wsp. The effect of 3435C>T MDR1 gene polymorphism on rheumatoid arthritis treatment with disease-modifying antirheumatic drugs. Eur J Clin Pharmacol. 2006;62(11):933-937. 82. Yamada K, Elliott WM, Hayashi S i wsp. Latent adenoviral infection modifies the steroid response in allergic lung inflammation. J Allergy Clin Immunol. 2000;106(5):844-851.
