Wirus to stosunkowo mały patogen zbudowany z jednego typu
advertisement
Wirus to stosunkowo mały patogen zbudowany z jednego typu kwasu nukleinowego (DNA lub RNA, chociaż są wirusy, które w swoim cyklu życiowym przechodzą przez fazę DNA oraz RNA). Są to cząstki, które nie mogą się namnażać na sztucznym podłożu. Nie posiadają własnej maszynerii przemiany materii. Wirus może istnieć pozakomórkowo, jednak wtedy nie zachodzą w nim żadne przemiany metaboliczne. Kompletna forma wirusa, wirion, jest cząsteczką zawierającą kwas nukleinowy, otoczoną przez białka i niekiedy posiadającą pewne inne komponenty makrocząsteczkowe. Oprócz wirusów istnieją inne bezkomórkowe czynniki infekcyjne - złożone tylko z RNA wiroidy, wirusoidy oraz białkowe priony. Istnieje kilka hipotez dotyczących pochodzenia wirusów. Według pierwszej, wirusy są patologicznymi czynnymi cząsteczkami makroorganizmu. Przypomina to raka. Komórki rakowe pochodzą z tego samego organizmu, ale mają zupełnie niezależne, patologiczne właściwości i zachowują się jak pasożyty. Niektórzy uważają, że wirusy roślinne mogą powstać wewnątrzkomórkowo, pod działaniem pewnych wewnętrznych bodźców, wpływających na zaburzenia procesu przemiany materii. Według drugiej hipotezy, wirus jest przedstawicielem pierwotnej, przedkomórkowej postaci życia. Wychodząc z założenia iż wirusy są zaczątkami życia na Ziemi, niektórzy badacze chcieliby je uważać za twory przejściowe między materią martwą a istotami żywymi. Wirusy wykazują pewne analogie do transpozonów. Gdyby transpozon "ubrać" w białkową otoczkę i umożliwić mu przedostawanie się do innych komórek, stałby się wirusem. Ale może być też odwrotnie transpozony to uwstecznione wirusy, które utraciły otoczki i zdolność atakowania innych komórek. Może też być tak, że nie ma między nimi żadnego związku. Inna koncepcja wywodzi wirusy od pierwotnych, bardzo prostych, ale jednak samodzielnych organizmów. Początkowo miały one korzystać z zasobów otaczającego je środowiska, a w miarę pojawiania się innych, bardziej złożonych komórek, wejść z nimi we współpracę. Efektem tego okazała się utrata samodzielności przez wirusy i przejęcie funkcji związanych z namnażaniem wirionów przez komórki-gospodarzy. BUDOWA WIRUSÓW Rys.1 Budowa wirusa Wiriony cechuje zarówno różnorodność kształtu jak i wielkości. Są one znacznie mniejsze niż komórki (około 28 - 200 nm) a ponadto mają dużo mniejsze genomy. Kwas nukleinowy znajduje się wewnątrz cząsteczki wirionu i otoczony jest przez białkowy "płaszcz" zwany kapsydem, precyzyjnie uformowany z kilku podjednostek białkowych tzw. kapsomerów. Informacja dotycząca formy kapsydu zawarta jest w strukturze kapsomerów, a Niedościgniona natura wirusów tworzenie otoczki zachodzi na zasadzie samoskładania. Kompleks otoczki z kwasem nukleinowym zwany nukleokapsydem, często jest dodatkowo otoczony dwuwarstwową błoną lipidową zawierającą glikoproteiny pochodzenia wirusowego oraz lipidy pochodzące z błony komórki gospodarza. Błona wirusa jest pierwszym elementem wchodzącym w interakcje z komórką gospodarza i jej pochodzenie wpływa na sposób infekcji oraz penetracji wirusa wewnątrz komórki. Wewnątrz wirionu mogą znajdować się specyficzne enzymy odgrywające pewną rolę w procesie infekowania komórki gospodarza. Wiele wirusów zawiera własne polimerazy, natomiast retrowirusy posiadają odwrotne transkryptazy. Ponadto w wirusach występują neuroaminidazy, które rozrywając wiązania glikozydowe glikoprotein i glikolipidów ułatwiają wirusom penetrację tkanek zwierzęcych oraz lizozym, który umożliwia wniknięcie wirusów bakteryjnych do komórki oraz powoduje jej lizę. Rys. 2 - Schemat struktury czterech cząstek wirusowych. Wirus wścieklizny (a) i HIV (c) mają ściśle przylegające osłonki, wirus Herpes simplex (d) ma słabo przylegającą osłonkę, podczas gdy adenowirus (b) nie ma osłonki. Wielkości wirusów: (a) 180 nm, (b) 45 nm, (c) 100 nm, (d) 90 nm. Wirusy posiadają pewną symetrię budowy. Symetria wirusów odnosi się do nukleokapsydu a nie do całego wirusa z błoną. Wyróżniamy dwa podstawowe typy symetrii: helikalna - podjednostki białkowe są ułożone w heliks (obrazowo można porównać do okrągłej klatki schodowej), którego długość zależy od długości kwasu nukleinowego a szerokość od wielkości i upakowania podjednostek. Przykładem jest tu wirus RNA mozaiki tytoniowej TMV 2 Niedościgniona natura wirusów ikosaedralna - jednostki białkowe tworzą dwudziestościan Rys.3 – Wirion bryłowy z otoczką. ZASADY REPRODUKCJI WIRUSA Replikacja wirusa odbywa się dopiero po wprowadzeniu jego materiału genetycznego do komórki. Gdy wirus znajdzie się w komórce rozpoczyna się jego reprodukcja. Proces ten związany jest z infekowaniem komórki gospodarza. W związku z małą wielkością wirus zawiera jedynie bardzo podstawowe informacje dotyczące jego genomu, regulacji reprodukcji oraz budowy otoczki białkowej. Wobec tego podczas procesu reprodukcji jest on w dużym stopniu zależny od metabolicznych i strukturalnych cech gospodarza, dostosowując je w pewnym stopniu do swoich potrzeb. Wirus zdolny jest do wprowadzania dziedzicznych (korzystnych lub destruktywnych) zmian w genomie gospodarza. Wirusy można sklasyfikować w oparciu o organizację posiadanego przez nie materiału genetycznego. Materiał genetyczny wirusów może występować w kilku formach: DNA jedno- lub dwuniciowe, RNA jedno- lub dwuniciowe oraz zarówno DNA jak i RNA lecz na różnym etapie istnienia wirionu. Poza tym dokonuje się podziału na grupy w zależności od rodzaju infekowanego organizmu: wirusy roślinne, zwierzęce i bakteryjne. PRZYŁĄCZENIE Pierwszy etap replikacji wirusa charakteryzuje się dużą specyficznością interakcji pomiędzy wirusem a gospodarzem. Cząsteczka wirusa posiada na swojej powierzchni białka, które oddziałują ze specyficznymi elementami powierzchniowymi na komórce zwanymi receptorami. Zwykle pełnią one w komórce normalne funkcje np. białka transportowe czy białka otoczki bakteryjnej lub w przypadku grypy jest to glikoproteina na erytrocytach. Jeśli receptor nie występuje lub jest zmieniony, wirus nie może adsorbować i infekcja nie zajdzie - gospodarz staje się odporny na wirusa, oczywiście dopóki w wirusie nie zajdzie mutacja umożliwiająca mu adsorpcję do zmutowanego receptora. 3 Niedościgniona natura wirusów Przyłączanie się wirusa może zachodzić również na niespecyficznej drodze poprzez fagocytozę lub inne procesy endocytozy (powszechne wśród wirusów zwierzęcych i roślinnych). PENETRACJA Proces penetracji wirusa do wewnątrz komórki gospodarza zależny jest od charakteru tej komórki, szczególnie od jej struktur powierzchniowych w wyniku czego penetracja zachodzi inaczej w komórkach zwierzęcych pozbawionych ściany komórkowej niż w roślinnych i bakteryjnych. Przykładem skomplikowanego mechanizmu penetracji jest infekcja komórki E.coli bakteriofagiem T4 (FIG 6.11) Wirion T4 posiada strukturę głowową, osadzoną na ogonku, który kończy się zestawem włókien ogonowych. Włókna te jako pierwsze przyłączają się do powierzchni komórki a następnie obkurczają co powoduje zbliżenie się rdzenia ogonka do powierzchni komórki. Enzym wirusowy o charakterze lizozymu powoduje powstanie niewielkiego otworu w ścianie komórkowej, przez który wnika DNA wirusowe. Na tym etapie istnieje jeszcze możliwość usunięcia kwasu nukleinowego wirusa poprzez działanie enzymów restrykcyjnych znajdujących się na terenie komórki. Jednakże wirusy "nauczyły się" przeciwdziałać temu procesowi; modyfikując kwasy nukleinowe w podobny sposób jak komórki gospodarza lub hamując działanie systemów restrykcyjnych przez specyficzne białka. Rys. 4 - Sposoby wnikania wirusów. PODZIAŁ WIRUSÓW Podział systematyczny wirusów opiera się na rodzaju występującego w nich kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) oraz na szczegółach budowy kapsydu. Ze względów metodologicznych wirusy dzieli się na: bakteryjne (bakteriofagi), roślinne i zwierzęce. Wirusy bakteryjne (fagi, bakteriofagi) zakażają bakterie. Zbudowane są z kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) otoczonego osłonką białkową, często wydłużającą się w ogonek, przez który nić kwasu nukleinowego jest wstrzykiwana do komórki bakteryjnej. 4 Niedościgniona natura wirusów Istnieje ogromna liczba wirusów bakteryjnych (bakteriofagów), wiele z nich ma skomplikowaną strukturę, tylko niektóre posiadają lipidową otoczkę. Większość badanych wirusów atakuje E. coli lub Salmonella typhimurium. Bakteriofagi RNA Ikosaedralne bakteriofagi ssDNA Bakteriofagi dsDNA Wirusy łagodne Wirusy roślinne charakteryzują się zawartością RNA (a nie DNA) i zakażają komórki roślinne (wnikają do nich po mechanicznym uszkodzeniu ściany komórkowej np. przez pocieranie lub ukłucie owada) powodując wirusowe choroby roślin. Wirusy zwierzęce mogą zawierać DNA lub RNA i mają różnorodne kształty. Zakażają komórki zwierzęce dzięki adsorbowaniu przez nie osłonek wirusowych. Do chorób wirusowych zwierząt należą m.in. nosacizna, wścieklizna, u człowieka ospa, grypa, katar, świnka. Wyróżniamy: Wirusy zwierzęce RNA (+) Wirusy zwierzęce RNA (-) Wirusy zwierzęce dsDNA Retrowirusy Wirusy onkogenne są przyczyną powstawania zmian nowotworowych. GENY WIRUSÓW Genomy RNA kilku retrowirusów. Wirus białaczki mysiej Abelsona nie może się powielać bez udziału innego wirusa, który dostarcza brakujące białka: odwrotną transkryptazę (RT) i białka osłonki (EP). Podczas infekcji wirusa HIV różne mRNA, będące transkryptami genu białka otoczki i innych zachodzących na siebie genów, podlegają alternatywnemu wycinaniu i składaniu. Rys.5 – Geny wirusów 5 Niedościgniona natura wirusów POWSTAWANIE CHOROBY WIRUSOWEJ Po wniknięciu wirusa do organizmu przestawia on za pomocą swego kwasu nukleinowego metabolizm zakażonej komórki doprowadzając do syntezy własnych (wirusowych) części składowych, z których budowane są dojrzałe cząstki wirusów. W ten sposób dochodzi do namnożenia wirusów w komórce i w konsekwencji do jej zniszczenia, a tym samym uwolnienia dużej liczby nowych potomnych wirusów. Wirusy wnikają do organizmu żywiciela przez uszkodzoną skórę i błony śluzowe. Najczęściej zakażenie wirusowe zachodzi z powodu wdychania wirusów, unoszących się w powietrzu, spożycia pokarmu i wody zanieczyszczonych wirusami oraz na skutek kontaktu bezpośredniego z osobą zakażoną (kontakty płciowe, stykanie się z powierzchnią skóry i błon śluzowych, a także z wydzielinami i wydalinami osób zakażonych). W organizmie wirusy rozprzestrzeniają się za pośrednictwem płynów ustrojowych oraz dzięki wywołaniu fuzji błon komórek sąsiadujących ze sobą. Nosicielstwo wirusów polega na wytwarzaniu wirusa przez część populacji komórek żywiciela, podczas gdy pozostała część komórek nie ulega zakażeniu. U nosicieli występują więc wirusy, ale nie pojawiają się u nich dostrzegalne objawy choroby. Pod względem czasu trwania nosicielstwo można podzielić na przejściowe, okresowe długotrwałe i przewlekłe. Nosicielstwo przejściowe jest krótkotrwałe. Nosicielstwo okresowe długotrwałe trwa wiele miesięcy. Nosicielstwo przewlekle utrzymuje się wiele lat lub przez całe życie (wirus zapalenia wątroby B, HIV). Zakażenie, czyli infekcja to wtargnięcie wirusów do organizmu. Miejsca wtargnięcia wirusów określa się jako wrota zakażenia. Gdy nie występują objawy chorobowe pomimo wtargnięcia wirusów wówczas stan taki określa się mianem infekcji subklinicznej, albo bezobjawowej.. Zakażenie bezobjawowe występuje u ludzi odpornych na danego wirusa (np. dzięki szczepionce). Ponadto niektóre wirusy nawet u nieodpornych osób nie wywołują objawów chorobowych pomimo replikacji, np. wirus polio. Niektóre wirusy przenikają przez błony płodowe z ustroju matki do płodu. Zakażenie noworodka może zaistnieć w trakcie porodu oraz karmienia mlekiem. Jest to pionowe przekazywanie wirusa. W ten sposób potomstwo ulega zakażeniu wirusem odry, cytomegalii i opryszczki. Noworodek może stać się nosicielem wirusa HIV, czy wirusa zapalenia wątroby w razie zakażenia matki tymi wirusami przed lub w czasie ciąży. Niektóre wirusy, np. różyczki, cytomegalii i opryszczki działają teratogennie. Zakażenie kobiety ciężarnej wirusem zapalenia wątroby B może spowodować poronienie, śmierć płodu lub ciężkie uszkodzenie wątroby płodu. Wirus odry i grypy może spowodować śmierć płodu. Istnieje również zakażenie wirusem utajone. Niektóre wirusy wywołują objawy chorobowe, potem następuje wyzdrowienie (zanik objawów), ale wirus nadal pozostaje w komórkach organizmu. Po pewnym czasie wirus ulega aktywacji i znów wywołuje pełne objawy choroby. Często jego aktywacja zachodzi skutek wychłodzenia organizmu, niedoboru witamin, depresji lub okresowego osłabienia układu immunologicznego. W ten sposób zachowuje się wirus herpes simplex, czyli wirus opryszczki. W okresie utajenia wirus egzystuje w tkance nerwowej, a w czasie pełnoobjawowej choroby – w skórze (nabłonki). Należy rozróżniać dwa pojęcia: zakażenie wirusem i choroba wirusowa. Zakażenie to każde wniknięcie, wtargnięcie wirusa do ustroju. Choroba wirusowa to stan zakażeniowy, w którym dochodzi do wystąpienia klinicznych objawów choroby. Zanim 6 Niedościgniona natura wirusów wystąpią objawy choroby istnieje okres inkubacji, czyli wylęgania. Okres inkubacji może być krótki (około 3 dni), średnio długi (do 2 tygodni) lub długi (ponad 2 tygodnie). Długość inkubacji zależy od odległości wrót zakażania do komórek docelowych, czyli komórek w których zachodzi replikacja wirusa. Na ogół wirusy namnażające się w nabłonkach przewodu pokarmowego (proszę odróżnić pojęcie układu pokarmowego od pojęcia przewodu pokarmowego !) czy oddechowego powodują szybkie wystąpienie objawów chorobowych, w przeciwieństwie do wirusów namnażających się w komórkach ośrodkowego układu nerwowego. AIDS Od roku 1981, kiedy po raz pierwszy zanotowano przypadek AIDS, chorobie tej towarzyszy wiele niedomówień i nieścisłości. Tymczasem szerzenie prawdziwych informacji o AIDS ma podstawowe znaczenie w zapobieganiu rozprzestrzeniania się tej „dżumy XX wieku”. Mniej więcej w 1980 roku lekarze w Ameryce Północnej i Europie zaczęli obserwować stały wzrost liczby pacjentów cierpiących na nową, tajemniczą chorobę. W czasie choroby pacjentów atakowały rozmaite infekcje, prowadzące ostatecznie do zgonu. Nie była to choroba wrodzona, ale najwyraźniej w jakimś sposób nabyta. Dziwne też było to, że właściwie nie chodziło o jedną chorobę, ale charakterystyczny zespół objawów, chorób i infekcji. Zdawało się, że głównym objawem jest osłabienie lub porażenie układu odpornościowego. W kategoriach medycznych grupa objawów i chorób, wykazujących tendencję do występowania jednocześnie, jest określana jako syndrom. Zatem nową chorobę nazwano AIDS, czyli syndromem nabytego braku odporności (ang. Acquired Immunodeficiency Syndrome). Pierwsze przypadki AIDS zostały oficjalnie zarejestrowane w Stanach Zjednoczonych w 1981 roku. Na podstawie sposobu rozszerzania się choroby i innych czynników lekarze i naukowcy zaczęli podejrzewać, że przyczyną AIDS jest mikroskopijny zarazek, jakiś rodzaj wirusa. Mniej więcej w 1983 roku badacze w Stanach Zjednoczonych i we Francji niezależnie od siebie odkryli wirusa podejrzewanego o wywołanie AIDS. Naukowcy francuscy nazwali go Lymphadenopathy Associated Virus, albo w skrócie LAV, ponieważ powodował powiększenie węzłów chłonnych - na szyi, pod pachami i w pachwinie. Amerykańscy naukowcy nazwali wirusa Human T-cell Lymphotrophic Wirus III, albo HTLV III, ze względu na sposób, w jaki atakuje on ludzkie komórki. Po początkowych sporach dotyczących nazewnictwa i ustalenia, kto był pierwszy, okazało się, że odkryte wirusy były niemal identyczne. Ostatecznie otrzymały nazwę HIV, oznaczającą Human Immunodeficiency Virus („ludzki wirus upośledzenia odporności”). Badania nad wirusem HIV Od czasu do czasu słychać głosy, że to nie HIV jest przyczyną AIDS. Niektórzy uważają, że ten wirus przypadkowo znajduje się w organizmie osoby chorej na AIDS i że jakiś inny, nieznany sprawca powoduje zarówno AIDS, jak i obecność HIV. Jednakże wśród większości lekarzy i naukowców przeważa opinia, że przyczyną AIDS jest wiru HIV. Intensywne badania naukowe prowadzone od początku lat osiemdziesiątych sprawiły, że wirus ten został zbadany tak dokładnie, jak żaden inny. Naukowcy znają jego dokładną 7 Niedościgniona natura wirusów strukturę i budowę genetyczną. Odkryli także, że istnieje nie jeden, a kilka rodzajów wirusa HIV. Różne rodzaje wirusa podlegają regularnym mutacjom, w wyniku, których powstają nowe szczepy, co utrudnia wyprodukowanie szczepionki Rys. 6 - Schemat budowy wirusa HIV: a) glikoproteina 120, b) glikoproteina 41, c) lipidowa osłonka zewnętrzna, d) białkowa osłonka rdzenia, e) proteaza, f) kapsyd, g) RNA, h) odwrotna transkryptaza, i) integraza HIV a inne wirusy W porównaniu z innymi wirusami, wirus HIV należy do stosunkowo trudno przenoszących się drobnoustrojów. Nie może on przetrwać poza organizmem nosiciela, pozbawiony ciepła i płynów, a zatem nie może unosić się w powietrzu. Oznacza to, że nie można się zarazić drogą oddechową. W normalnych okolicznościach HIV nie roznosi się podczas kaszlu i kichania, za pośrednictwem komarów i much, czy też w czasie normalnego używania tego samego ręcznika, sztućców lub innych przedmiotów gospodarstwa domowego. Sposób transmisji HIV przenosi się trzema głównymi drogami, przy czym w każdej dochodzi do wymiany krwi lub płynów ustrojowych. Do zainfekowania wirusem dochodzi wtedy, gdy krew lub płyny organizmu (na przykład sperma) zarażonej osoby bezpośrednio zetkną się z krwią lub płynami ustrojowymi ofiary wewnątrz jej organizmu. Wynika stąd, iż podstawowym sposobem przekazywania wirusa HIV są stosunki płciowe. Obejmują one kontakty hetero- i homoseksualne. Wirus przemieszcza się od jednego do drugiego partnera w płynach ustrojowych. W większości rejonów świata choroba rozprzestrzenia się w ten właśnie sposób. Drugą drogą transmisji wirusa HIV jest przekazanie go nienarodzonemu dziecku przez zarażoną matkę. Wirus może przedostać się do krwi płodu macicy lub podczas porodu. Trzecia droga zarażenia to wprowadzenie do organizmu krwi lub płynów ustrojowych najczęściej podczas wykonywania zastrzyków. Zanim zaczęto badać oddawaną przez ludzi krew, zdarzało się, że niektórzy krwiodawcy byli zarażeni wirusem HIV. Część osób, które otrzymały zakażoną krew, została zainfekowana. Obecnie w wielu krajach prowadzi się dokładne badania krwi oddawanej w stacjach krwiodawstwa, aby zapobiec transmisji wirusa 8 Niedościgniona natura wirusów HIV podczas transfuzji. Jednakże ciągle można zarazić się wirusem, korzystając z nie sterylnej strzykawki lub igły, użytych wcześniej przez nosiciela wirusa HIV. Zachowanie wirusa w organizmie HIV atakuje pewne typy białych krwinek (leukocytów). Kiedy układ immunologiczny zaczyna zawodzi, leukocyty nie są w stanie spełniać swoich normalnych zadań polegających na zwalczaniu chorób i zarazków. Mikroby, które normalnie zostałyby szybko usunięte, bez przeszkód rozmnażają się w organizmie. Objawy AIDS nie są wywołane przez samego wirusa HIV, jak dzieje się w przypadku zwykłej infekcji wirusowej - ich bezpośrednią przyczyną jest niesprawność układu immunologicznego, który nie zwalcza infekcji. Kolejną niezwykłą cechą HIV jest fakt, iż główne objawy dają o sobie znać po dłuższym czasie, kilka lat po wniknięciu wirusa do organizmu. Bywa na przykład tak, że w organizmie osoby zainfekowanej wirus zaczyna gwałtownie się rozmnażać. Można go znaleźć we krwi i płynach otaczających mózg i rdzeń kręgowy. Jednakże na tym etapie pacjent często nie odczuwa żadnych objawów albo mogą pojawić się u niego dolegliwości przypominające grypę, katar i gorączka, wysypka skórna, powiększone gruczoły limfatyczne pod pachami czy częste bóle głowy. Winę za te objawy nierzadko przypisuje się przeziębieniu lub „jakimś krążącym wirusom”. Po kilku tygodniach objawy te, jak i również wysoki poziom HIV w organizmie, mijają. Człowiek znowu czuje się zdrowy. Wirus ciągle jest obecny w jego ustroju, ale nie jest aktywny. Jednak zarażona osoba może przez cały czas przekazywać wirusa innym. W końcu, często po wielu latach, wirus HIV „budzi się” i zaczyna ponownie się rozmnażać. Właśnie wtedy rozwija się choroba AIDS. Sposób działania Bardzo intensywnie prowadzone badania naukowe mają na celu dokładne ustalenie, w jaki sposób HIV uszkadza układ immunologiczny. Wiadomo natomiast, że wirus atakuje kilka różnych komórek. Należą do nich między innymi białe krwinki, zwane komórkami pomocniczymi T4, jak również inne komórki układu odpornościowego, które normalnie pomagają chronić organizm przed bakteriami, wirusami i innymi drobnoustrojami chorobotwórczymi. Kiedy jakiś rodzaj zarazka wnika do organizmu, układ immunologiczny produkuje specjalne cząsteczki zwane przeciwciałami. Przeciwciała unoszą się we krwi i płynach ustrojowych, unieszkodliwiając zarazki na różne sposoby. Ten proces zachodzi w pewnym stopniu również wtedy, gdy organizm zostaje zaatakowany przez wirusa HIV. Układ immunologiczny wytwarza przeciwciała, dzięki czemu w tej fazie badanie krwi może wykazać, czy dana osoba jest nosicielem wirusa HIV. Test nie wykrywa samych wirusów, ale przeciwciała obecne w organizmie. Jeśli stwierdzi się obecność przeciwciał HIV, wynik badania określa się jako „pozytywny”, co wskazuje na obecność wirusa. Tymczasem wirusy stopniowo przechodzą w fazę zakażenia utajonego, podczas której materiał genetyczny komórek ulega zmianie. Po pewnym czasie wirus HIV ponownie zaczyna się mnoży - następuje faza zakażenia produktywnego, chory zdradza objawy AIDS. Gruczoły limfatyczne na szyi, w dołkach pachowych i pachwinie stają się obrzmiałe i drażliwe. Oznacz to, że układ odpornościowy zaczyna się bronić, a liczba leukocytów spada. 9 Niedościgniona natura wirusów Choroby towarzyszące AIDS W niektórych przypadkach stopniowo, w innych błyskawicznie, w ciągu kilku tygodni, zaczynają pojawiać się rozmaite choroby. Mogą być to infekcje skóry i błon śluzowych, na przykład grzybica i opryszczka. Organizm staje się podatny na infekcje, takie jak zapalenie płuc i gruźlica, a także zapalenie opon mózgowych i mózgu. Te infekcje mogą prowadzić do zaburzeń umysłowych. Pojawiają się problemy ze wzrokiem, biegunka lub zaburzenia trawienne, nieprawidłowości w krzepnięciu krwi, na przykład częste pojawienie się sińców. Innymi charakterystycznymi objawami są nowotwory. Po kilku tygodniach lub miesiącach pacjent dochodzi do końcowego etapu choroby, w którym rozmaite dolegliwości wyniszczają jego organizm. WIRUSOWE ZAPALENIE WĄTROBY (WZW) Choroba ta, niesłusznie zwana "żółtaczką zakaźną", wywoływana jest przez kilka wirusów. Nie ma zatem jednolitej przyczyny. Wirusy, wywołujące zapalenie wątroby, nie są ze sobą spokrewnione, mają więc inne właściwości biologiczne. Różnią się zakaźnością, sposobem dostawania się do organizmu człowieka, odpornością na czynniki zewnętrzne, takie jak temperatura, środki dezynfekcyjne, wysychanie, wywołują w organizmie człowieka odmienne reakcje odpornościowe i choroby, które, choć opatrzone wspólną nazwą, pod wieloma względami różnią się przebiegiem klinicznym. Jaki stąd najważniejszy wniosek? Na WZW można chorować tyle razy, ile jest typów wirusów, ponieważ nie występuje tutaj zjawisko odporności krzyżowej! Jeżeli na przykład w dzieciństwie przechorowałeś WZW, to nie oznacza to, że już więcej nie zachorujesz. Podobnie jest ze szczepieniami. Szczepienie przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B to nie jest szczepienie przeciwko "żółtaczce zakaźnej", jak często się słyszy. Jest to szczepienie tylko i wyłącznie przeciwko jednemu z zakażeń - zakażeniu wirusem typu B. Do tej pory poznano i opisano pięć najważniejszych rodzajów wirusów, wywołujących WZW. Określa się je dużymi literami alfabetu poczynając od A. Czas pokaże, czy zostaną "zagospodarowane" kolejne litery alfabetu. Wirusy A i E należą do tak zwanych enterowirusów, czyli takich zarazków, które dostają się do organizmu człowieka drogą przewodu pokarmowego. W naszej szerokości geograficznej powszechnie występuje wirus typu A (HAV), natomiast wirus E (HEV) spotykany jest sporadycznie i w zasadzie jest do naszego kraju zawlekany, głównie z krajów tropikalnych. Potocznie na chorobę, którą wywołuje wirus A mówi się "żółtaczka pokarmowa", albo jeszcze mniej szczęśliwie "choroba brudnych rąk". Fachowy termin do "nagminne zapalenie wątroby", albo WZW typu A. Już z samej nazwy wynika powszechność tego schorzenia. Mało kto w Polsce po 40 roku życia nie posiada przeciwciał przeciwko HAV. Oznacza to, że prawie każdy zetknął się, lub wcześniej czy później zetknie, z tym patogenem. W tym miejscu wielu z nas wykrzyknie - jak to możliwe!? Nigdy nie chorowałem na żadną żółtaczkę! I tu dotykamy istoty problemu, jakim jest błędne określenie wirusowego zapalenia wątroby mianem "żółtaczki zakaźnej". Otóż żółtaczka nie jest nazwą choroby. Jest to określenie objawu chorobowego, polegającego na żółtym zabarwieniu białkówek i czasami skóry, wywołanym nadmiarem barwnika, zwanego bilirubiną. Fizjologicznym zadaniem wątroby jest wydalenie tego barwnika z ustroju, który jako uboczny produkt przemian nie jest nam więcej potrzebny i musi być usunięty. Poziom bilirubiny we krwi jest miarą żółtaczki. Trzeba wiedzieć, że żółtaczka nie jest objawem koniecznym wirusowego zapalenia wątroby. Może wystąpić, ale nie musi. Co więcej, żółtaczka w przebiegu WZW występuje stosunkowo rzadko. W nagminnym zapaleniu wątroby tylko co dwunasty zakażony człowiek będzie miał pełnoobjawowy, czyli żółtaczkowy, przebieg. Wszystkie inne, poza żółtaczką, objawy WZW (każdego z typów) są 10 Niedościgniona natura wirusów bardzo mało charakterystyczne. Są to: uczucie zmęczenia, objawy grypowe, gorączka, brak apetytu, mdłości, wymioty, pobolewania brzucha, które występują u różnych chorych w różnej kombinacji, a w łagodnych zakażeniach nie występują w ogóle. Możemy więc przechorować WZW niepostrzeżenie. Bezobjawowy przebieg może wystąpić w każdym typie WZW, nie tylko w nagminnym zapaleniu wątroby, choć to ostatnie jest schorzeniem niewątpliwie najłagodniejszym. Zakażenia wirusami typu B (HBV) i C (HCV) należą do tzw. zakażeń parenteralnych, czyli pozajelitowych. Drogi zakażenia są wtedy następujące: kontakt seksualny z nosicielem wirusa - tzw. przenoszenie pionowe z matki-nosicielki na dziecko, najczęściej okołoporodowo, dużo rzadziej wewnątrzmacicznie, czyli w czasie ciąży przeszczepienie zakażonych tkanek bądź narządów od zakażonego dawcy zakażenie wskutek manipulacji i naruszenia ciągłości powłok skórnych bądź śluzówek niesterylnym sprzętem medycznym (igły, wenflony, wszelkie endoskopy, cewniki, noże, itp.) bądź niemedycznym (igły do tatuażu, kolczykowanie, golarki, szczoteczki do zębów, itp.) wstrzyknięcie zakażonej substancji medycznej (np. leku) bądź niemedycznej (narkotyku) przetoczenie zakażonej krwi i/lub produktu krwiopochodnego. Zakaźność wirusów B i C jest różna i chociaż teoretycznie każda z wymienionych dróg zakażenia jest w obu przypadkach możliwa, to powyższe przede wszystkim odnosi się do wirusa typu B, który jest bardzo zakaźny, odporny na wiele środków fizyko-chemicznych (w tym na gotowanie!) i minimalna nawet ilość materiału zakaźnego, którym są ludzkie wydzieliny i wydaliny zakażone wirusem (ślina, krew, nasienie, wydzielina pochwy i szyjki macicy), wystarczy do wywołania choroby. Wirus typu C jest natomiast mało zakaźny. Jednoznacznie nie udowodniono zakaźności pionowej (matka-dziecko) ani przenoszenia drogą seksualną. Co prawda nieco więcej zakażeń HCV notuje się u mężczyzn o orientacji homoseksualnej, ale nie można wykluczyć, że jest tak za sprawą używania dożylnych narkotyków, częstszego w tej grupie ludzi. Również ilość substancji zakażonej wirusem typu C i wprowadzonej do organizmu musi być niepomiernie większa niż przy HBV, aby doszło do zakażenia i choroby. Stąd najwięcej zakażeń typu C notuje się u ludzi, którym przetaczano krew, zwłaszcza wielokrotnie i głównie przed 1993 rokiem, i u ludzi stosujących dożylne środki odurzające. Rys. 7 – Wirus WZW 11 Niedościgniona natura wirusów OPRYSZCZKA Wirusy grupy opryszczki należą do największych spośród dwudziestościennych. Do tej grupy zaliczamy powszechnie spotykane wirusy opryszczki zwyczajnej, powodujące powstawanie drobnych pęcherzyków na wargach w wyniku przeziębień, oraz wirus ospy wietrznej (paricella), który może również wywoływać półpasiec. Wprawdzie w tym ostatnim przypadku czynnik chorobotwórczy jest taki sam, jednak obraz zakażenia jest różny. Ospa wietrzna jest łagodną chorobą, która występuje przede wszystkim u dzieci. Osobnik dorosły najczęściej nie zaraża się od chorego dziecka ospą wietrzną, prawdopodobnie wskutek krążących w jego krwi przeciwciał, ale może zachorować na półpasiec. W tym przypadku wirus powoduje miejscowe zakażenie korzonków nerwowych. Poszczególne części ciała unerwione są przez różne nerwy wychodzące z rdzenia kręgowego, pomiędzy kręgami. W typowych przypadkach wirus wywołujący półpasiec atakuje jedno tylko z tych rozgałęzień, zwykłe unerwiające centralną część ciała. Wirus wędruje wzdłuż nerwów do skóry, gdzie powoduje typową dla ospy wietrznej wysypkę plamistą. W przypadku półpaśćca obszar pokryty wysypką jest jednak ograniczony tylko do miejsc unerwionych przez zainfekowany nerw. Pozwala to neurofizjologowi na zmapowanie miejsca infekcji wirusowej w układzie nerwowym. Półpasiec występuje też często u osób, które nie miały żadnego kontaktu z wietrzną ospą. W tych przypadkach, jak się przypuszcza, przyczyną może być wirus, który przebywał w organizmie przez długi nawet czas w stanie utajonym i został zreaktywowany wskutek uszkodzenia pnia nerwowego, raka, urazu, przeziębienia lub innej choroby. Półpasiec może być bardzo bolesny, a czasem, szczególnie gdy zaatakuje nerw głowowy, może powodować okresowy paraliż. Osłonka wirusów opryszczki zbudowana jest ze 162 kapsomerów. Każdy z nich składa się z 5 lub 6 pałeczkowatych struktur z wydrążonym rdzeniem w części środkowej. Wildy porównuje je do wiązki fagotów. Wydrążenie jest widoczne w preparatach barwionych (negatywnie). Wirusy opryszczki formowane są w jądrze komórkowym, gdzie wywołują charakterystyczne zmiany. Stąd wydostają się do wakuoli, z którą przenoszone są do błony komórkowej i przez nią wydobywają się na zewnątrz jak nurek z łodzi podwodnej. Rys.8 – Wirus opryszczki. 12 Niedościgniona natura wirusów ODRA Odra (po łacinie morbili, ang. measles, rubeola) to choroba zakaźna wieku dziecięcego wywoływana przez morbilliwirus z rodziny paramyksowirusów. W okresie prodromalnym choroby dominuje ostry ból gardła, nieżyt błony śluzowej nosa i spojówek, stan zapalny górnych dróg oddechowych. Występuje często suchy kaszel. Charakterystycznym dla odry jest pojawienie się na błonie śluzowej policzków na wysokości dolnych zębów trzonowych, białawych przebarwień tzw. plamek Koplika. Pojawia się wysoka gorączka. Po kilku dniach (do 5) pojawia się wysypka o charakterze gruboplamistym, kolorze różowym, zlewająca się. Najpierw umiejscawia się na twarzy za uszami i na czole, postępuje w dół obejmując całą powierzchnię ciała. Towarzyszy jej kaszel i wysoka gorączka. Po kilku dniach (4-5) gorączka cofa się, ustępują również objawy zapalenia gardła, wysypka zmienia kolor na ceglasty, a naskórek łuszczy się "otrębiasto". Rys. 9 - Wirus odry CHOROBA HEINEGO-MEDINA Choroba Heinego-Medina (poliomyelitis, wirusowe zapalenie rogów przednich rdzenia kręgowego, H14) - wirusowa choroba zakaźna wywoływana przez wirus polio (wirus 13 Niedościgniona natura wirusów zapalenia rogów przednich rdzenia kręgowego). Nazwa tej choroby wywodzi się od nazwisk dwóch uczonych, którzy pierwsi tę chorobę opisali: Jakob Heine i Karl Oskar Medin w roku 1840. Do XIX w. występowała sporadycznie, później nastąpiła pandemia, obejmująca głównie półkulę północną. Liczba zachorowań drastycznie spadła po wynalezieniu skutecznych szczepionek. W 2001 WHO uznała Europę za wolną od tej choroby (wcześniej były plany eradykacji do tegoż roku, później data została przesunięta do roku 2005). Obecnie w związku z tymi planami należy informować służby sanitarne danego kraju i WHO o każdym przypadku. Aby rozpoznać polio, należy wyizolować i zidentyfikować wirusa, czy jest to szczep dziki, czy to zakażenie poszczepienne wirusem po rewersji do pełnej wirulencji. Rys. 10 – Wirus Polio HISTORIA BADAŃ NAD WIRUSAMI. Z historii badań nad wirusami. Odkrywcami wirusów, jako czynnika chorobotwórczego, byli Iwanowski (1892) i Beijerinck (1898), którzy stwierdzili, że mozaikę tytoniową wywołuje jakiś zarazek tak mały, że przechodzi przez filtry zatrzymujące wszelkie bakterie; powstało przypuszczenie, że jest to zarazek płynny. Dalsze badania wykazały, że choroby wirusowe są częste nie tylko u roślin, lecz także u zwierząt i człowieka; Frosch (1898) wykrył, że pryszczyca jest chorobą wirusową, a Reed (1901), że wirusową naturę ma żółta febra, natomiast Twort (1915) wykrył wirusy bakteryjne. Następnym ważnym etapem w zdobywaniu wiedzy o wirusach było otrzymanie przez Stanleya (1935) kryształów wirusa mozaiki tytoniowej; Schaffer (1955) otrzymał kryształy wirusa paraliżu dziecięcego. Ogromnym krokiem naprzód było zastosowanie mikroskopu elektronowego i specjalnych technik przygotowywania do niego preparatów. Dalszym krokiem było zastosowanie metod hodowli wirusów na tkankach żywych. Badania biochemiczne i przeprowadzone w ostatnich latach badania w zakresie genetyki molekularnej pozwalają na coraz głębsze poznanie natury wirusów, co z pewnością przyczyni się do wynalezienia skutecznych sposobów przeciwdziałania chorobom wirusowym i ich leczenia. Techniki rekombinacji DNA i metody pokrewne, włącznie z sekwencjonowaniem DNA, PCR i analizą restrykcyjną, ujawniają wiele szczegółów budowy genów i genomów. 14 Niedościgniona natura wirusów Uzyskane tą drogą dane potwierdzają fundamentalną jedność struktury informacji genetycznej, jej organizacji i ekspresji w różnych organizmach. Zwracają też uwagę na ogromne bogactwo mechanizmów biologicznych wykorzystywanych do przekładania genomów na sprawnie działający organizm. Rozmaitość strategii genetycznych wydaje się nieograniczona. Ogólnie rzecz biorąc, wszystko, co zdaje egzamin, może zostać wykorzystane w toku ewolucji. Jednak bogactwo rozwiązań genetycznych, które doprowadziły do powstania tak wielkiej różnorodności organizmów pod względem ich formy, działania, zachowań i zajmowanych środowisk, dopiero zaczynamy rozumieć. Żeby poznać je lepiej, trzeba zbadać współzależności łączące geny i ich produkty. Dzięki rozwojowi dwóch technik: metod rekombinacji DNA oraz hodowli komórkowych dysponujemy już bardzo szczegółowymi opisami molekularnymi kilku wirusów i ich cykli życiowych. Hodowle komórkowe pozwalają na badanie wirusów bez komplikacji nieodłącznie związanych z wykorzystaniem całych organizmów roślinnych i zwierzęcych. Choć ciągle pozostaje wiele do zbadania, jeśli chodzi o replikację wirusów w zainfekowanej komórce, opracowano już leki przerywające replikację niektórych wirusów chorobotwórczych. Są wśród nich AZT (azydotymidyna) i ddI (dideoksyinozyna) powszechnie stosowane do łagodzenia skutków zakażenia wirusem HIV, powodującym AIDS. Gancyclovir jest obecnie używany do zwalczania infekcji powodowanych przez wirusa opryszczki. Ciągle poszukuje się nowych substancji blokujących etapy cyklu życiowego wirusów w celu skuteczniejszego leczenia wirusowych chorób zwierząt i roślin. Jednak dla kręgowców najskuteczniejszą ochroną przed wieloma zakażeniami wirusowymi jest zapobieganie, czyli szczepionki. Techniki rekombinacji DNA odegrały wielką rolę w badaniach nad wirusem zapalenia wątroby typu B, choroby szeroko rozpowszechnionej wśród ludzi na całym świecie. W tym przypadku alternatywne metody miały wyjątkowo ograniczone zastosowanie, ponieważ jeszcze do niedawna nie znano hodowli komórkowych odpowiednich do wzrostu tego wirusa. Badania trzeba było prowadzić na materiale pobranym od chorych. Sytuację dodatkowo utrudniał fakt, że z ludzkiej krwi można było uzyskać bardzo niewielką ilość kolistego genomu wirusa. Jednak ta niewielka ilość wystarczyła do sklonowania i powielenia wirusowego DNA, umożliwiając jego charakterystykę. Wirusowy DNA wprowadzony do wektorów ekspresyjnych produkuje białka wirusa używane w produkcji szczepionek. Zsyntetyzowanie w komórkach drożdży białka płaszcza wirusa zapalenia wątroby typu B umożliwiło wyprodukowanie pierwszej szczepionki otrzymywanej metodami rekombinacji DNA, jaka została oficjalnie dopuszczona do stosowania u ludzi w Stanach Zjednoczonych. Podobne techniki doprowadziły do sklonowania genu białka płaszcza wirusa zapalenia wątroby typu C, bardzo groźnego patogenu ludzkiego, co umożliwia opracowanie szczepionki przeciwko niemu. Wyścig, mający na celu takie przekonstruowanie genów HIV, aby otrzymać białka, które mogłyby służyć do uodporniania ludzi przed tym wirusem, trwa. Zastosowanie technik rekombinacji DNA ma wyjątkowe znaczenie również w badaniu wirusów zawierających RNA, ponieważ bezpośrednie określenie sekwencji nukleotydowych dużych cząsteczek RNA jest absolutnie niemożliwe. Co więcej, geny wirusów RNA, sklonowane w formie DNA w odpowiednich zrekombinowanych wektorach, mogą być użyte do produkcji białek wirusowych w komórkach bakteryjnych i zwierzęcych, co ma duże znaczenie dla badań biochemicznych oraz prac nad nowymi szczepionkami. Na przykład wirus powodujący pryszczycę przysparza szczególnie wielu problemów badawczych, ponieważ jego genomowy DNA składa się z 8000 nukleotydów. Wwożenie tego wirusa do Stanów Zjednoczonych jest surowo zabronione. Zsyntetyzowano i sklonowano jednak cDNA kodujące białka jego kapsydu, a manipulacje takimi genami są bezpieczne. Dzięki ekspresji 15 Niedościgniona natura wirusów tych sklonowanych sekwencji w bakteriach uzyskano polipeptydy, których użyto do opracowania szczepionek. Ponieważ klonowanie dostarczyło także informacji o sekwencji aminokwasowej białka kapsydu, badano również skuteczność chemicznie zsyntetyzowanych polipeptydów jako szczepionek. Od podstawowych badań nad wirusami zawierającymi RNA, które powodują nowotwory u ptaków i ssaków, do tak naglących problemów klinicznych, jak nowotwory ludzi i zespół nabytego niedoboru odporności, AIDS, wiedzie bezpośrednia droga. AIDS wywołuje retrowirus zwany HIV, który zakaża i zabija pewną klasę limfocytów T, powodując ogromne zniszczenia w układzie odpornościowym. Inne ludzkie wirusy, HTLV-1 oraz HTLV-2 również infekują limfocyty T, ale efektem ich działań są chłoniaki i białaczki. HTLV-1 był pierwszym poznanym ludzkim retrowirusem. Ze względu na uprzednie intensywne badania nad retrowirusami kręgowców i dostępność technik rekombinacji DNA, zarówno budowę HIV i HTLV-1, jak i ich biologiczne właściwości, poznano bardzo szybko. Pozwoliło to na opracowanie odpowiednich sond molekularnych i przeciwciał – środków diagnostycznych umożliwiających analizę krwi używanej do transfuzji. Eliminowanie zakażonej krwi jest jednym z ważnych sposobów zapobiegania szerzeniu się chorób powodowanych przez te wirusy. Szczegółowa wiedza o HIV ułatwia również zaprojektowanie właściwych doświadczeń, których celem jest opracowanie skutecznych metod leczenia AIDS. Badania retrowirusów mają także ważne konsekwencje dla zrozumienia własności onkogennych niektórych wirusów zawierających DNA. Na przykład potencjał rakotwórczy wirusa SV40, niektórych papillomawirusów, adenowirusów i herpeswirusów wstrzykniętych do nowonarodzonych gryzoni jest związany z jednym lub z kilkoma genami wirusowymi. Jednak według aktualnej wiedzy onkogeny wirusów zawierających DNA nie mają normalnych odpowiedników komórkowych. Wydaje się, że są one niezbędne do namnażania wirusa w komórkach odpowiedniego gospodarza, jednak w pewnych warunkach ich ekspresja może zaburzać kontrolę wzrostu komórek i w efekcie doprowadzić do powstania raka. Porównanie ze sobą produktów różnych onkogenów – pochodzących z onkogennych wirusów DNA oraz z retrowirusów, a także produktów zmutowanych komórkowych onkogenów oraz genów supresorów nowotworów mogłoby wyjaśnić wielość dróg prowadzących do rozwoju nowotworów.2 Inną ważną konsekwencją badań retrowirusów jest ich wykorzystanie jako zrekombinowanych wektorów. Wektory te okazały się szczególnie użyteczne w przypadku wprowadzania nowych genów do zapłodnionych komórek jajowych ssaków (a więc tym samym do wszystkich komórek zwierząt doświadczalnych, włącznie z komórkami linii płciowej). Otrzymane w ten sposób zwierzęta określamy mianem transgenicznych. Rys. 11 -– Uproszczony model DNA wirusa. 16 Niedościgniona natura wirusów ZNACZENIE WIRUSÓW W PRZYRODZIE I W ŻYCIU CZŁOWIEKA. Znaczenie w przyrodzie i w życiu człowieka. Znaczenie wirusów dla człowieka ma przede wszystkim charakter negatywny, gdyż w wielu przypadkach są one czynnikiem chorobotwórczym, wywołującym różne, czasem bardzo groźne schorzenia u człowieka, roślin i zwierząt. Dlatego wiele wysiłków człowieka skierowanych jest na zwalczanie tych chorób lub zapobieganie im. Niestety, zwalczanie chorób wirusowych, ze względu na brak skutecznych leków, polega głównie na leczeniu objawowym. To samo dotyczy zwierząt i roślin. Dlatego w akcji przeciw wirusom chorobotwórczym ogromne znaczenie ma dzisiaj profilaktyka - zapobieganie zakażeniu. Realizuje się to przez izolowanie osobników chorych, likwidowanie nosicieli wirusów (np. owadów przenoszących wirusy chorobotwórcze roślin) i wreszcie stosowanie szczepionek. Ten ostatni sposób w wielu przypadkach okazał się bardzo skuteczny. Skutecznie zapobiega się ospie, paraliżowi dziecięcemu, a u zwierząt wściekliźnie i pryszczycy. Również negatywne dla człowieka w wielu przypadkach jest działanie bakteriofagów atakujących bakterie przynoszące pożytek gospodarce ludzkiej. Odczuwa się to w niektórych działach przemysłu spożywczego i fermentacyjnego, które produkcję swą opierają na działalności bakterii. Również szkodliwa dla gospodarki ludzkiej jest infekcja bakteriofagami bakterii glebowych oraz bakterii brodawkowych (asymilujących azot atmosferyczny); zachodzi wówczas zjawisko tzw. zmęczenia gleby. Bakteriofagi mogą być jednak również użyteczne dla człowieka. Stosuje się je do zwalczania niektórych bakterii chorobotwórczych, a także w diagnostyce niektórych zakażeń bakteryjnych. Warto jeszcze dodać, że wirusy, ze względu na bardzo prostą budowę i łatwość przeprowadzania na nich doświadczeń, są bardzo dobrym obiektem dla badań genetycznych. 17 Niedościgniona natura wirusów BIBLIOGRAFIA: 1. „Mikrobiologia lekarska. Podręcznik dla studentów medycyny” Zaremba Maria Lucyna, Borowski Jerzy; PZWL, 2004. 2. „Zdasz maturę z biologii .Wirusy bakterie…” Dudkiewicz - Świerzyńska Małgorzata, Olechnowicz Gworek Krystyna; Piątek Trzynastego, 2001. 3. http://www.parazyt.gower.pl/virus_virus.htm 4. Encyklopedia Multimedialna „Wiem Onet 2004”. 18
