Oznaczenie ilości DNA w roztworze metodą absorpcyjną oraz

Oznaczenie ilości DNA w roztworze metodą absorpcyjną oraz
wyznaczenie temperatury topnienia dupleksu, TM
Wprowadzenie
Za absorpcję kwasów nukleinowych, z maksimum przy 260 nm, zarówno
DNA jak i RNA, odpowiedzialne są heteroaromatyczne zasady wchodzące w ich
skład. Są to - adenina, guanina, cytozyna i tymina w DNA, a w RNA zamiast tyminy
wystepuje uracyl. Z uwagi na fakt, że w kwasach nukleinowych wystepują
oddziaływania między zasadami obserwuje się efekt tzw. hipochroizmu. To znaczy
absorpcja helisy DNA jest mniejsza od absorpcji jednoniciowego DNA czy RNA, a ta
z kolei jest mniejsza od absorpcji izolowanych nukleotydów.
Ponadto widmo absorpcji może być wykorzystane do określenia stężenia
i czystości próbki DNA. Ogólnie preparat DNA uznaje się za czysty jeżeli A260/A280
wynosi 1,8. Jeżeli próbka DNA zanieczyszczona jest RNA to wartość A260/A280 jest
bliższa 2,0, natomiast jeżeli próbka zanieczyszczona jest białkami to wartość
A260/A280 jest niższa niż 1,8 (maksimum absorpcji UV dla białek wynosi 280 nm).
W pomiarach spektroskopowych zasadnicze znaczenie ma znajomość stężeń
molowych kwasów nukleinowych. Stężenie DNA w roztworze oznacza się
korzystając z prawa Lamberta-Beera, mierząc w kuwetce 1 cm, absorbancję przy
długości fali λ = 260 nm określanej często jako OD – gęstość optyczna. Przyjmuje się,
że jeżeli A260 równa się 1 to stężenie dwuniciowego DNA (dsDNA) wynosi około 50
µg/ml,
jednoniciowego
DNA
(ssDNA)
36
µg/ml,
RNA
-
40
µg/ml,
a oligonukleotydów 30 µg/ml. Należy jednak pamiętać, że jest to wartość
przybliżona, ponieważ wartość współczynnika ekstynkcji zależy od składu zasad
azotowych w DNA. Stąd na przykład, 1 OD roztworu polyC odpowiadałoby stężeniu
39,4 µg/ml, zaś 1 OD roztworu polyA odpowiadałoby stężeniu 22,8 µg/ml.
Do wyznaczenia prawidłowego stężenia oligonukleotydu potrzebny jest dokładny
współczynnik
ekstyncji,
który
wyznacza
się
dwoma
sposobami
(www.sigmaaldrich.com/Brands/Sigma_Genosys/ dla zainteresowanych). W praktyce
laboratoryjnej do tego celu używa się tzw. „oligonukleotydowych kalkulatorów” on
line.
1
Cel ćwiczenia:
Celem ćwiczenia jest określenia wpływu składu procentowego GC helisy na
właściwości absorpcyjne oraz temperaturę topnienia DNA.
Sprzęt i materiały:
Ø Roztwór A: 100mg/ml Calf thymus DNA,
Ø Roztwór B: 100mg/ml Salomon testes DNA,
Ø
Roztwór C: próbka do analizy Calf thymus DNA,
Ø Bufor 10xTE: 100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5,
Ø Butelka szklana o pojemności 20 ml,
Ø 1 Cylinder miarowy (25 ml),
Ø 2 Kuwety kwarcowe d = 10 mm zamykane korkiem,
Ø Pipety automatyczne, końcówki do pipet
Ø Wytrząsarka typu Vortex,
Ø Spektrofotometr UV-Vis typu Cecil z przystawką temperaturową.
Wykonanie ćwiczenia:
Przed przystąpieniem do pomiarów należy przygotować 20ml 10 mM buforu TE.
1 część – oznaczenie ilośći DNA w roztworze metodą absorpcyjną
1. Umieścić 2 ml buforu TE w kuwetce.
2. Dodać 500ml roztworu DNA. Wymieszać.
3. Wykonać widma absorbcji (w temperaturze pokojowej) wszystkich roztworów
wkuwetce wobec buforu TE zgodnie z instrukcją obsługi aparatu.
4. Odczytać λmax oraz absorbancję przy λmax. Wyniki umieścić w Tabeli 1 (wzór
poniżej).
Tabela 1
Oznaczenie
c
% błąd
λmax
(mg/ml )
oznaczenia
(nm)
A
------------
B
-----------
A dla λmax
C1
2
C2
C3
C4
C5
2 część – wyznaczenie Tm dupleksów
1. Ustaw temperaturę na 35oC zgodnie z instrukcją obsługi aparatu.
2. Po osiągnięciu wybranej temperatury przystąp do pomiaru absorbancji przy
l = 260 nm (zgodnie z instrukcją obsługi aparatu).
3. UWAGA odczekaj 2 min. po wstawieniu kuwetki z odnośnikiem do komory
pomiarowej zanim wybierzesz ZERO.
4. Wstaw kuwetkę z roztworem A do komory pomiarowej i po 2 min. odczytaj
wartość absorbancji. Wynik zapisz w Tabeli 2.
5. Nie wyjmując kuwetki ustaw kolejną wartość temperatury (patrz Tabela 2).
Po osiągnięciu żadanej temperatury odczekaj 2 min. i ponownie odczytaj
wartość absorbancji (pomiń zerowanie!). Wynik zapisz w Tabeli 2.
6. Pomiary wykonaj stopniowo dla wszystkich temperatur ujętych w Tabeli 2.
7. Po skończeniu cyklu pomiarów nie wyjmuj kuwetki z komory pomiarowej
tylko ustaw temperaturę na 25oC i odczekaj 15 min.
8. Tok postępowania wg pkt 1 - 7 powtórz dla roztworu B.
Tabela 2
Pomiar
Temp.
35
45
55
65
75
80
85
90
95
98
102
(oC)
A-1
A 260
seria
A-2
A 260
seria
B-1
A 260
seria
B-2
A 260
seria
3
Opracowanie wyników:
1. Obliczyć stężenie nieznanej próbki Calf thymus DNA oraz podać procentowy
błąd oznaczenia.
2. Oblicz średnią zawartość Calf thymus DNA w próbce C i oblicz odchylenie
standardowe.
3. Wykreślić zależność absorbancji, A przy l = 260 nm od temperatury osobno
dla każdego oznaczenia.
4. Z wykresu odczytać temperaturę topnienia, Tm poszczególnych dupleksów.
Obliczyć procentowy błąd oznaczenia.
Literatura uzupełniająca:
1. L. Stryer Biochemia.
2. W. Szczepaniak Metody instrumentalne w analizie chemicznej.
3. P. Suppan Chemia i światło.
4. Przekład
zbiorowy
pod
red.
Z.
Szweykowskiej-Kulińskiej
Biologia
molekularna – krótkie wykłady.
5. http://www.chemistry.ohio-state.edu/~kohler/dnapaper.html
Zagadnienia:
1. DNA – struktura, właściwości absorpcyjne, temperatura topnienia helisy.
2. Spektrofotometria UV-Vis (prawa absorpcji i odchylenia od tych praw,
aparatura, analiza ilościowa).
4