Regulacja ekspresji genów przez wybrane onkogenne czynniki

MARTA B. WIŚNIEWSKA – AUTOREFERAT
Aktywność czynnika transkrypcyjnego β-katenina~LEF1/TCF w neuronach
– występowanie, regulacja, geny docelowe, hipotetyczna funkcja
Spis treści
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Imię i nazwisko ..............................................................................................
Dyplomy i stopnie naukowe .........................................................................
Zatrudnienie w jednostkach naukowych .......................................................
Dorobek publikacyjny przed uzyskaniem stopnia doktora ..........................
4.A. Praca magisterska – tytuł i lista publikacji
4.B. Praca doktorska – tytuł i lista publikacji
Omówienie dorobku publikacyjnego ze stażu podoktorskiego ....................
5.A. Tytuł i lista publikacji
5.B. Problematyka i cel badawczy
5.C. Podsumowanie wyników
Osiągnięcie naukowe, o którym mowa w art. 16 ust. 2 .............................
Ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym
oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.)
6.A. Tytuł osiągnięcia
6.B. Lista publikacji
6.C. Problematyka i cele badawcze
6.D. Opis i dyskusja wyników
6.E. Podsumowanie, wnioski i znaczenie badań
Udział w innych projektach – tytuły i lista publikacji ....................................
strona
2
2
2
3
3
3
4
4
4
6
9
9
9
10
13
20
23
AUTOREFERAT
1. Imię i nazwisko
Marta B. Wiśniewska
2. Dyplomy i stopnie naukowe
1994 - Magister biologii, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego; praca magisterska
wykonana pod opieką Prof. Piotra Węgleńskiego w Zakładzie Genetyki;
2000 - Doktor biologii ze specjalnością biologia molekularna, Instytut im. M. Nenckiego PAN
w Warszawie; praca wykonana pod opieką Prof. Bożeny Kamińskiej w Pracowni
Regulacji Transkrypcji
3. Zatrudnienie w jednostkach naukowych
1994-2000 - Asystent w Pracowni Regulacji Transkrypcji Instytutu im. M. Nenckiego PAN w
Warszawie; realizacja pracy doktorskiej;
2001-2004 - Postdoc w Instytucie Pasteur’a w Paryżu; praca pod kierunkiem Prof. Moshe
Yaniv'a i Dr. Jonathana B. Weitzman’a w Pracowni Ekspresji Genów i Patologii
(Unité d’Expression Génétique et Maladies); staż podoktorski;
2004-2013 - Badacz w Laboratorium Neurodegeneracji kierowanym przez Prof. Jacka
Kuxnickiego w Międzynarodowym Instytutucie Biologii Molekularnej i
Komórkowej (MIBMiK) w Warszawie; realizacja pracy habilitacyjnej;
2013 -
Adiunkt, kierownik Laboratorium Neurobiologii Molekularnej w Centrum
Nowych Technologii Uniwersytetu Warszawskiego (CeNT-UW)
2
AUTOREFERAT
4. Dorobek publikacyjny przed uzyskaniem stopnia doktora
4.A. Praca magisterska - tytuł i lista publikacji
Klonowanie i wstępna charakterystyka genu OtaA z Aspergillus nidulans
1.
Dzikowska A, Swianiewicz M, Talarczyk A, Wisniewska M, Goras M, Scazzocchio C,
Weglenski P; Cloning, characterisation and regulation of the ornithine transaminase
(otaA) gene of Aspergillus nidulans; Curr Genet 1999, 35:118-126
4.B. Praca doktorska - tytuł i lista publikacji
Regulacja aktywności czynnika transkrypcyjnego NFAT
w czasie apoptozy tymocytów indukowanej glukokortykoidami in vivo
2.
Kaminska B, Mosieniak G, Wisniewska M; Współdziałanie czynników transkrypcyjnych
AP-1 i NFAT w procesie regulacji eksprsji genów (Cross-talk between Transcription
Factors AP-1 and NFAT in the regulation of gene expression); Postępy Biochemii 1996,
42:120-128; artykuł przeglądowy po polsku;
3.
Wisniewska M, Stanczyk M, Grzelakowska-Sztabert B, Kaminska B; Nuclear Factor of
Activated T cells (NFAT) is a possible target for dexamethasone in thymocyte apoptosis;
Cell Biol Int 1997, 21:127-132;
4.
Kaminska B, Pyrzynska B, Ciechomska I, Wisniewska M; Modulation of the composition
of AP-1 complex and its impact on transcriptional activity; Acta Neurobiol Exp 2000,
60:395-402; artykuł przeglądowy;
5.
Wisniewska M, Pyrzynska B, Kaminska B; Impaired AP-1 dimers and NFAT complex
formation in immature thymocytes during in vivo glucocorticoid-induced apoptosis;
Cell Biol Int 2004,28:773-780
3
AUTOREFERAT
5. Omówienie dorobku publikacyjnego ze stażu dokotorskiego
5.A. Tytuł i lista publikacji
Współdziałanie czynników transkrypcyjnych AP-1 i NFAT
w regulacji ekspresji genów kodujących cytokiny w limfocytach T
6.
Bakiri L, Matsuo K, Wisniewska M, Wagner EF, Yaniv M; Promoter specificity and
biological activity of tethered AP-1 dimer; Mol Cell Biol 2002, 22:4952-4964; IF 9,84;
7.
Ameyar M, Wisniewska M*, Weitzman JB; A role for AP-1 in apoptosis: the case for and
against; Biochimie 2003, 20085:747-752; artykuł przeglądowy napisany na zaproszenie,
IF 3.30;
8.
Ameyar-Zazoua M, Wisniewska MB, Bakiri L, Wagner EF, Yaniv M, Weitzman JB; AP-1
dimers regulate transcription of the p14/p19ARF tumor suppressor gene; Oncogene
2005, 24:2298-2306; IF 6.31;
9.
Wisniewska MB**, Ameyar-Zazoua M, Bakiri L, Kaminska B, Yaniv M; Weitzman JB;
Dimer composition and promoter context contribute to functional cooperation
between AP-1 and NFAT; J Mol Biol 2007, 371:569-576; IF 4.89
* równy udział wszystkich autorów
** autor korespondencyjny
5.B. Problematyka i cel badawczy
AP-1 (ang. Activator Protein) jest dimerycznym czynnikiem transkrypcyjnym, w skład
którego wchodzą dwa białka JUN lub białko JUN i FOS [Ameyar i wsp., Oncogene 2003],
ewentualnie białko JUN i ATF2 [van Dam & Castellazzi, Oncogene 2001], MAF [Kerppola &
Curran, Oncogene 1994] lub BATF [Williams i wsp., Eur J Immunol 2001]. U ssaków występują
trzy białka JUN: JUN (cJUN), JUNB, JUND, i cztery białka FOS: FOS (cFOS), FOSB, ΔFOSB, FOSL1
(FRA1) i FOSL2 (FRA2). Tworzenie się kompleksu AP-1 zachodzi poprzez dimeryzację αhelikalnych struktur suwaków leucynowych (ang. leucin zipper) podjednostek białkowych, na
skutek oddziaływania równomiernie rozłożonych reszt leucynowych. AP-1 oddziałuje
bezpośrednio ze specyficzną sekwencją TRE (ang. TPA Responsive Element) poprzez domenę
zasadową (ang. basic domain) bogatą w leucyny i argininy. Ściśle rzecz biorąc, nie ma
jednego czynnika AP-1, ale ponad 20 różnych dimerów AP-1. Dimery AP-1 mogą różnić się od
4
AUTOREFERAT
siebie wieloma parametrami, ale wszystkie rozpoznają tę samą sekwencję DNA, z powodu
dużego podobieństwa w obszarze domen zasadowych podjednostek JUN i FOS.
Białka JUN i FOS zaliczane są do grupy onkogenów, ponieważ ich nadmierna aktywność
prowadzi do wzmożonej proliferacji komórek i transformacji nowotworowej [Angel & Karin,
Biochim Biophys Acta 1991]. W warunkach fizjologicznych AP-1 aktywowany jest przez
sygnały zewnątrzkomórkowe takie jak mitogeny, a także w odpowiedzi na stres komórkowy
[Wisdom, Exp Cell Res 1999]. Aktywacja AP-1 zachodzi przez syntezę de novo i fosforylację
[Karin, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1996; Lallemand i wsp., Oncogene 1997]. Ta ostatnia
dotyczy przede wszystkim białka JUN, fosforylowanego przez kinazę JNK (ang. cJUN Nterminal Kinase) należącą do kinaz MAP (ang. Mitogen Activated Protein kinases).
Dodatkowo AP-1 może współdziałać z innymi czynnikami transkrypcyjnymi, w szczególności z
NFAT (ang. Nuclear Factor of Activated T cells), który wiąże się z DNA w kompleksie z AP-1
[Kaminska i wsp., Postępy Biochemii 1996; Rao i wsp., Annu Rev Immunol 1997].
Pierwszymi odkrytymi białkami dimeru AP-1 były FOS i JUN, a właściwie ich zmutowane
formy vFOS i vJUN, sklonowane z wirusów wywołujących mięsaka odpowiednio u myszy i
ptaków [Curran i wsp., Mol Cell Biol 1983; Maki i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 1987] i zdolne
do pobudzenia proliferacji i transformacji nowotworowej komórek, jak już wspomniano.
Wkrótce sklonowano kolejne białka z tej rodziny. W latach 90-tych stwierdzono, że AP-1 nie
tylko indukuje proliferację, ale uczestniczy także w różnicowaniu komórek [Wang i wsp.,
Nature 1992; Lord i wsp., Mol Cell Biol 1993] i apoptozie [Ham i wsp., Neuron 1995; BossyWetzel i wsp., EMBO J 1997; Weitzman i wsp., Mol Cell 2000]. Tym samym obraz roli
czynnika AP-1 bardzo sie skomplikował. Białka JUN/FOS nie mogły już być traktowane
jedynie jako czynniki onkogenne. Ponadto zdano sobie sprawę, że poszczególne białka z tej
rodziny wywierają na komórki różny wpływ. Do tych odkryć przyczynił się miedzy innymi
zespół prof. Yaniva, do którego dołaczyłam w 2001 roku, po uzyskaniu stopnia doktora. W
Laboratorium Wirusów Onkogennych sklonowano gen Jund [Hirai i wsp., EMBO J 1989] i
stworzono pozbawione go myszy [Thepot i wsp., Development 2000]. Stwierdzono, że JUND,
w przeciwieństwie do białka JUN, blokuje proliferację fibroblastów indukowaną dodaniem
surowicy i hamuje transformację nowotworową wywoływaną białkiem RAS [Pfarr i wsp., Cell
1994], a także chroni fibroblasty przed apoptazą wywoływaną UV i stresem cytotoksycznym
[Weitzman i wsp., Mol Cell 2000].
5
AUTOREFERAT
W czasie kiedy dołączyłam do zespołu prof. Yaniva, w środowisku badaczy zajmujących
się AP-1 stawiano pytanie o specyficzność działania różnych białek JUN i FOS [Kaminska i
wsp., Acta Neurobiol Exp 2000; Mechta-Grigoriou i wsp., Oncogene 2001]. Moje
zainteresowania także kierowały się w tę stronę. Za cel badawczy postawiłam sobie
określenie wpływu podjednostkowego składu dimeru AP-1 na jego współdziałanie z
czynnikiem transkrypcyjnym NFAT w regulacji ekspresji cytokin w limfocytach T.
5.C. Podsumowanie wyników
AP-1 – czynnik pro- czy antyapoptyczny? (artykuł przeglądowy, nr 7)
W związku z zaangażowaniem Laboratorium w badanie roli AP-1 w apoptozie i
przeżywaniu komórek wraz z dr. Weitzmanem i dr Ameyar-Zazouą otrzymaliśmy propozycję
napisania artykułu przeglądowego na ten temat [Ameyar-Zazoua i wsp., Biochimie 2003].
Postanowiliśmy pokazać, że AP-1 nie zawsze jest aktywatorem tego procesu, jak się do
niedawna wydawało, ale może też promować przeżywanie komórek. Przeanalizowaliśmy
pod względem udziału AP-1 trzy przypadki apoptozy: śmierć neuronów pozbawionych
czynników wzrostowych, śmierć zależną od receptora Fas i jego liganda FasL, i w końcu
apoptozę hepatocytów (tutaj właściwie dwa typy apotozy – rozwojową i indukowaną przez
lipopolisacharydy imitujące sepsę). W mojej części artykułu przedstawiłam niejasności
dotyczące roli AP-1 w apoptozie zależnej od systemu Fas/FasL. Receptor Fas, zwany też
receptorem śmierci, obecny jest na błonie większości komórek, a jego aktywność ujawnia się
dopiero po związaniu liganda, błonowego białka FasL [Krammer, Nature 2000]. Wtedy
dochodzi do aktywacji kaspaz, które przeprowadzają proces samobójczej śmierci. Ekspresja
FasL aktywowana jest przez różnorodne czynniki stresowe, takie jak UV, promieniowanie γ,
stres genotoksyczny czy szok cieplny, a także w apoptozie indukowanej aktywacją (AICD, ang.
Activation Induced Apoptosis) obwodowych limfocytów T. Szereg badań in vitro pokazało
krytyczny udział kinaz JNK i AP-1 w indukcji apoptozy zależnej od FasL i w samej aktywacji
promotora FasL [Kasibhatla i wsp., Mol Cell 1998; Matsui i wsp., J Immunol 2000; Kolbus i
wsp., Mol Cell Biol 2000]. Jednakże w przypadku AICD limfocytów T, która jest głównym
mechanizmem kontrolowania populacji tych komórek, udział JNK był wątpliwy. W
doświadczeniach in vitro ekspresja dominującego negatywnego (DN) mutanta JUN lub DNJNK hamowała AICD w liniach limfocytów T [Zhang i wsp., J Exp Med 2000; Baumann i wsp.,
6
AUTOREFERAT
Oncogene 2003]. Z kolei w badaniach homeostazy komórek T in vivo, na myszach z
nadekspresja DN-JNK lub delecją JNK2, kwestia AICD dojrzałych limfocytów T została
pominięta lub wspomniano negatywne wyniki [Rincon i wsp., J Exp Med 1998; Sabapathy i
wsp., Curr Biol 1999]. Dopiero całkiem niedawno powrócono do tego tematu badając
limfocytarne białko BATF, które jest partnerem JUN i uważane jest za inhibitor aktywności
AP-1 [Williams i wsp., Eur J Immunol 2001]. U myszy z nadekspresją BATF rozwija się choroba
limfoproliferacyjna, prawdopodobnie na skutek zaburzenia apoptozy limfocytów T [Logan i
wsp., Cell Death Dis 2012]. Odkrycie to otwiera nową perspektywę badania roli AP-1 w
regulowaniu wielkości populacji limfocytów T, w tym AICD.
Podsumowując nasze rozważania stwierdziliśmy, że AP-1 może wywierać zarówno projak i anty-apoptyczny efekt, działając w różnym kontekście komórkowym, a także
postawiliśmy tezę, że działanie poszczególnych białek JUN i FOS lub ich kombinacji może być
różne czy wręcz przeciwne. Duża liczba cytowań naszej pracy przeglądowej (79) świadczy o
jej dobrym odbiorze i o wpływie, jaki wywarła na sposób widzenia regulacji procesów
komórkowych przez czynnik AP-1.
Różnicowa regulacji ekspresji cytokin przez dimery AP-1 i NFAT (artykuły nr 6, 8, 9)
Na poczatku mojej współpracy z prof. Yanivem uczestniczyłam w przygotowaniu
nowego
narzędzia
molekularnego,
które
miało
umożliwić
rozróżnianie
funkcji
poszczególnych dimerów AP-1. Narzędziem tym były konstrukty DNA kodujące dwa białka z
rodziny JUN lub białka JUN i FOS, przedzielone 18-aminokwasowym linkerem bogatym w
reszty glicynowe. Te jednołańcuchowe dimery AP-1 wykazywały zarówno specyficzność
wiązania z DNA jak i potencjał transaktywacyjny podobny naturalnym dwubiałkowym
dimerom AP-1 [Bakiri i wsp., Mol Cell Biol 2002]. Przygotowałyśmy 19 różnych dimerów AP1. Narzędzia tego użyliśmy w badaniu regulacji promotora genu supresora nowotworowego
p14/p19ARF [Amayar-Zazoua i wsp., Oncogene 2005]. Wykorzystałam je także przy realizacji
własnego projektu, do zbadania efektywności poszczególnych dimerów AP-1 w aktywacji
promotorów interleukiny 2 i 4 (IL2 i IL4) [Wisniewska i wsp., J Mol Biol 2007].
Czynniki transkrypcyjne AP-1 i NFAT, które ulegają aktywacji w limfocytach T na skutek
pobudzenia receptora TCR (ang. T Cell Receptor), są jednymi z głównych regulatorów
ekspresji cytokin. Leżące obok siebie miejsca wiązania NFAT i sekwencje podobne do
sekwencji consensus dla AP-1 występują między innymi w promotorach genów kodujących
7
AUTOREFERAT
IL2 i 4, interferon gamma (IFNγ) oraz czynnik stymulujacy powstanie kolonii granulocytów i
makrofagów (GMCSF), a więc cytokiny produkowane przez pomocnicze limfocyty T (Th, ang.
T helper cells) [Macian i wsp., Oncogene 2001]. W zależności od profilu produkowanych
cytokin, komórki Th, określane jako Th1 i Th2, pośredniczą odpowiednio w rozwoju
komórkowej lub humoralnej odpowiedzi układu odpornościowego [Kaiko i wsp.,
Immunology 2008]. Postawiłam hipotezę, że na profil ekspresji cytokin, a w konsekwencji typ
odpowiedzi odpornościowej, wpływa między innymi skład dimeru AP-1. Stwierdziłam, że
homodimery AP-1 (JUN/JUN), wykazujące w odróżnieniu od heterodimerów (JUN/FOS)
bardzo słabą aktywność w stosunku do promotorów z elementami TRE [Bakiri i wsp., Mol
Cell Biol 2002, Wisniewska i wsp., J Mol Biol 2007], we współpracy z czynnikiem NFAT
efektywnie aktywują transkrypcję [Wisniewska i wsp., J Mol Biol 2007]. Wykazałam ponadto,
że poszczególne dimery AP-1 różnicowo aktywują promotory genów Il2 i Il4. Dodatkowo,
promotor Il4 okazał się w większym stopniu zależny od współpracy AP-1 z NFAT niż promotor
Il2. Uzyskane wyniki sugerowały, że podjednostkowy skład AP-1 oraz poziom aktywacji NFAT
może wpływać na dynamikę i typ odpowiedzi odpornościowej.
Kontynuacją tych badań była wykonana przeze mnie charakterystyka komórek układu
odpornościowego myszy Jund-/- w grasicy, śledzionie i szpiku kostnym oraz analizy profilu
produkcji IL2, IL4 i IFNγ in vitro i in vivo w limfocytach Th. U myszy pozbawionych genu Jund
zaobserwowałam między innymi deficyt limfocytów B i podwyższony, w porównaniu do
myszy kontrolnych, udział aktywowanych limfocytów produkujących IFNγ w populacji
limfocytów Th. To ostatnie świadczyło o nadmiernym rozwoju odpowiedzi Th1, co było
szczególnie interesujące ze względu na fakt, że brak równowagi między profilem Th1 i Th2
obserwuje się u pacjentów z poważnymi chorobami autoimmunizacyjnymi, takimi jak
stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, atopowe zapalenie skóry i astma
oskrzelowa czy toczeń rumieniowaty układowy [Singh i wsp., J Immunol 1999]. Pod koniec
mojego pobytu w Laboratorium prof. Yaniva inna grupa badawcza opublikowała wyniki
podobnej analizy komórek T izolowanych ze śledziony myszy z nadekspresją Jund i myszy
Jund-/-, dochodząc do podobnego wniosku, że JUND działa hamująco na odpowiedź Th1
[Meixner i wsp., EMBO J 2004]. Uniemożliwiło mi to opublikowanie własnych badań
dotyczących komórek T, natomiast wątek komórek B nie był wystarczająco pogłębiony.
Prowadzenie dalszych badań w tym kierunku nie było możliwe ze względu na koniec mojego
stypendium i zamknięcie Laboratorium w związku z przejściem prof. Yaniva na emeryturę.
8
AUTOREFERAT
6. Osiągnięcie naukowe, o którym mowa w art. 16 ust. 2 Ustawy z dnia 14 marca
2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie
sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.)
Pod koniec 2004 roku dołączyłam do zespołu prof. Kuźnickiego w MIBMiK, zajmującego
się molekularnymi podstawami chorób neurodegeneracyjnych i zaburzeń poznawczych, żeby
w ramach grantu europejskiego badać rolę β-kateniny w fizjologii neuronów. Wiązało się to z
przemyślaną decyzją zmiany dziedziny badawczej na neurobiologię, przy wykorzystaniu
zdobytej wiedzy o regulacji ekspresji genów, doświadczenia w stosowaniu technik biologii
molekularnej i praktyki w pracy z modelami komórkowymi i zwierzęcymi. Badania
przeprowadzone w MIBMiK stały się podstawą mojej pracy habilitacyjnej.
6.A. Tytuł osiągnięcia
Aktywność czynnika transkrypcyjnego β-katenina~LEF1/TCF w neuronach
– występowanie, regulacja, geny docelowe, hipotetyczna funkcja
6.B. Lista publikacji
10. Wisniewska MB**, Misztal K, Michowski W, Szczot M, Purta E, Lesniak W, Klejman ME,
Dabrowski M, Filipkowski RK, Nagalski A, Mozrzymas JW, Kuznicki J; LEF1/β-catenin
complex regulates transcription of the Cav3.1 calcium channel gene (Cacna1g) in
thalamic neurons of the adult brain; J Neurosci 2010, 30:4957-4969; IF 7.18;
11. Misztal K, Wisniewska MB, Ambrozkiewicz M, Nagalski A, Kuznicki J; Wnt proteinindependent constitutive nuclear localization of β-catenin protein and its low
degradation rate in thalamic neurons; J Biol Chem 2011, 286:31781-31788; IF 5.33;
12. Nagalski A, Irimia M, Szewczyk L, Ferran JL, Misztal K, Kuznicki J, Wisniewska MB**;
Postnatal isoform switch and protein localization of LEF1 and TCF7L2 transcription
factors, in cortical, thalamic, and mesencephalic regions of the adult mouse brain;
Brain Struct Funct 2012, DOI 10.1007/s00429-012-0474-6; IF 5.63;
13. Wisniewska MB**, Nagalski A, Dabrowski M, Misztal K, Kuznicki J; 2012; Novel betacatenin target genes identified in thalamic neurons encode modulators of neuronal
excitability; BMC Genomics 13:635; IF 4.07;
14. Wisniewska MB**; Physiological role of β-catenin/TCF signaling in neurons of the adult
brain; Neurochem Res 2013, DOI: 10.1007/s11064-013-0980-9; artykuł przeglądowy
napisany na zaproszenie; IF 2.24;
** autor korespondencyjny
9
AUTOREFERAT
6.C. Problematyka i cele badawcze
Znaczenie β-kateniny w organizmie ssaków
β-katenina, kofaktor czynników transkrypcyjnych z rodziny LEF1/TCF, zaliczana jest do
onkogenów, ponieważ jej nadmierna aktywność wiąże się z rozwojem nowotworów, przede
wszystkim tych związanych z układem pokarmowym [Clevers & Nusse, Cell 2012]. W
szczególności mutacje genu kodującego białko APC, które jest odpowiedzialne za utrzymanie
w cytoplazmie niskiego poziomu β-kateniny, są przyczyną rodzinnej polipowatości jelita
grubego. Tak jak wiele innych onkogenów, β-katenina odgrywa kluczową rolę w rozwoju
organizmu [van Amerongen & Nusse, Development 2009]. Na jego wczesnych etapach
inicjuje tworzenie się osi przód-tył zarodka i uczestniczy w morfogenezie. Na dalszych
etapach odgrywa rolę w rozwoju poszczególnych tkanek i narządów, między innymi mózgu,
wpływając na procesy proliferacji, różnicowania i apoptozy. Zakłócenie aktywności
kanonicznego szlaku Wnt, którego efektorem jest β-katenina, prowadzi do letalnych
zaburzeń rozwojowych. W organizmie dorosłym w warunkach fizjologicznych β-katenina
zapewnia prawidłową homeostazę w niszach komórek macierzystych, między innymi w
nabłonku jelita oraz warstwie podziarnistej zakrętu zębatego w mózgu [Wisniewska,
Neurochem Res 2013; Kuhl & Kuhl, Biochim Biophys Acta 2013]. Badania prowadzone przeze
mnie w ramach projektu habilitacyjnego (przedstawione w rozdziale Opis wynków)
doprowadziły do wskazania nowego miejsca aktywności β-kateniny i czynników LEF1/TCF w
dorosłym organizmie oraz zaproponowania ich nowej roli w mózgu.
β-katenina pełni funkcję aktywatora ekspresji genów w odpowiedzi na sygnał (patrz
kolejny podrozdział), warto jednak wspomnieć, że powszechnie i stale występuje pod błoną
komórkową, gdzie służy do kotwiczenia białek adhezji komórkowej kadheryn w
cytoszkielecie aktynowym (Ryc. 1A) [Valenta i wsp., EMBO J 2012; Wisniewska, Neurochem
Res 2013]. Funkcje błonowej β-kateniny nie były jednak przedmiotem mojej pracy, w której
koncentrowałam się na cytoplazmatycznej i jądrowej puli β-kateniny.
10
AUTOREFERAT
Fig.1. β-katenina pełni dwie główne funkcje w komórce.
Z Wisniewska, J Neurochem 2013
A β-Katenina oddziałuje z Kadherynami
przy błonie komórkowej i kotwiczy je w
cytoszkielecie aktynowym.
B Cytoplazmatyczna β-katenina jest
mediatorem kanonicznego szlaku Wnt.
Pod nieobecność ligandów WNT, βkatenina jest fosforylowana przez
GSK3α/β a nastepnie degradowana w
proteasomie. Po stymulacji receptora
Frizzled cząsteczką Wnt, dochodzi do
dysocjacji kompleksu destrukcyjnego. βkatenina akumuluje się i przemieszcza
do jądra komórkowego, gdzie aktywuje
czynniki LtranskrypcyjneEF1/TCF.
β-katenina, czynniki transkrypcyjne LEF1/TCF i kanoniczny szlak sygnałowy Wnt
Niezwiązana z błonami β-katenina ulega fosforylacji na resztach seryn 33, 37 i 45 oraz
treoniny 41 w tzw. kompleksie destrukcyjnym, składającym się z kinaz CK1 i GSK3α/β,a także
białek rusztowania aksyny i APC [Clevers & Nusse, Cell 2012; Wisniewska, Neurochem Res
2013]. W formie ufosforylowanej β-katenina rozpoznawana jest przez receptor ligazy
ubikwityny E3, a następnie jest ubikwitowana i degradowana w proteasomie.
Klasyczną drogą aktywacji β-kateniny jest kanoniczny szlak sygnałowy Wnt, nazywany
też szlakiem Wnt/β-katenina. Po zadziałaniu sygnału Wnt, czyli przyłączeniu się sekrecyjnej
glikoproteiny WNT do receptora przezbłonowego Frizzled i koreceptora LRP5/6, dochodzi do
rozpadu kompleksu destrukcyjnego, czego wynikiem jest nagromadzanie się β-kateniny w
cytoplazmie (Ryc. 1B). β-katenina po przejściu do jądra komórkowego aktywuje czynniki z
rodziny LEF1/TCF. U ssaków rodzinę tę tworzą cztery białka: LEF1, TCF7 (TCF1), TCF7L1
(TCF3) i TCF7L2 (TCF4), wiążące się ze specyficzną sekwencją DNA - WRE (ang. Wnt
Responsive Element), poprzez domenę HMG (ang. High Mobility Group) [Archbold i wsp.,
Acta Physiol (Oxf) 2012]. β-katenina oddziałuje z czynnikami LEF1/TCF i rekrutuje do
wspólnego kompleksu szereg koaktywatorów transkrypcji, takich jak białka p300 i CBP. Na
skutek tych wydarzeń dochodzi do aktywacji ekspresji docelowych genów.
Czy β-katenina i czynniki LEF1/TCF biorą udział w regulacji działania mózgu?
Szereg
obserwacji
wskazuje
na
hipotetyczny
związek
między zaburzeniami
psychicznymi o charakterze afektywnym i psychotycznym a aktywnością szlaku Wnt/βkatenina. Gdy rozpoczynałam pracę, wiadomo było że lit, lek z wyboru w leczeniu choroby
afektywnej dwubiegunowej (ChAD), wykazuje aktywność inhibitora kinazy GSK3α/β
[Stambolic i wsp., Current Biol 1996; Klein & Melton, Proc Natl Acad Sci USA 1996], która jest
11
AUTOREFERAT
zaangażowana, jak opisano wyżej, w degradację β-kateniny. Ponadto w ciągu ostatnich kilku
lat pojawiły się nowe przesłanki wskazujące na możliwy udział β-kateniny i czynników
LEF1/TCF w etiologii ChAD, depresji i schizofrenii. Stwierdzono, że białko kodowane przez
gen DISC1 (ang. Disrupted in Schizophrenia 1) powiązany w badaniach genetycznych z
występowaniem wspomnianych chorób, bezpośrednio oddziałuje z GSK3β i hamuje jej
aktywność w neuronalnych komórkach progenitorowych, tym samym wpływając pozytywnie
na poziom cytoplazmatycznej β-kateniny [Mao i wsp., Cell 2009]. Z kolei badania genetyczne
przeprowadzone na kilkutysięcznej grupie pacjentów i ludzi zdrowych pokazały, że wariant
genu TCF7L2 jest czynnikiem ryzyka rozwoju schizofrenii [Hansen i wsp., Biol Psychiatry 2011;
Alkelai i wsp., PLOS One 2012]. Co więcej, myszy pozbawione jednej kopii tego genu
wykazywały deficyty w testach behawioralnych [Savic i wsp., PLOS One 2011].
Powiązanie β-kateniny i czynników LEF1/TCF z zaburzeniami psychicznymi wskazywało,
że białka te mogą pełnić pewne funkcje w mózgu dojrzałego organizmu, zadałam więc
pytanie o ich fizjologiczne znaczenie w neuronach. Kwestia ta nie była wcześniej
podejmowana. Wprawdzie niedługo przed rozpoczęciem mojej pracy ukazały się publikacje
opisujące udział β-kateniny w działaniu synaps [Nishimura i wsp., J Neurosci 2002; Murase i
wsp., Neuron 2002; Coussen i wsp., J Neurosci 2002], chodziło tu jednak o jej pulę
oddziałującą z białkami błony synaptycznej, pełniącą między innymi funkcję strukturalną, nic
natomiast nie było wiadomo o ewentualnej roli β-kateniny w regulacji ekspresji genów w
dojrzałych neuronach mózgu. W tym właśnie kierunku zdecydowałam się rozwinąć badania.
Szczegółowe cele badawcze
1. Pierwszym celem mojej pracy było zbadanie występowania i lokalizacji czynników
LEF1/TCF oraz β-kateniny w dorosłym mózgu myszy i szczurów. Ten cel rozbudowaliśmy
później o analizę absolutnego poziomu ekspresji Lef1 i Tcf7l2, a także analizę wariantów
splicingowych mRNA tych genów, przeprowadzoną wspólnie z mgr. Andrzejem Nagalskim
wykonującym pracę doktorską pod moją opieką.
2. Po uzyskaniu wyników świadczących o stałej akumulacji β-kateniny specyficznie w
neuronach wzgórza, kolejnym celem, jaki postawiłam, stało się wyjaśnienie mechanizmu
tego zjawiska z wykorzystaniem pierwotnych hodowli neuronalnych. Podjęłam się jego
realizacji razem z mgr Katarzyną Misztal, pełniąc rolę opiekunki jej pracy doktorskiej.
12
AUTOREFERAT
3. Zasadniczym celem mojego projektu habilitacyjnego była identyfikacja genów
regulowanych przez kompleks β-katenina~LEF1/TCF w neuronach wzgórza. Wykorzystałam
tutaj metody in silico do wstępnej identyfikacji, a następnie cały szereg metod biologii
molekularnej in vitro i in vivo do potwierdzenia regulacji wytypowanych genów. Poznanie
specyficznie wzgórzowego programu zależnego od β-kateniny miało pozwolić na
zaproponowanie nowej roli β-kateniny.
4. Jako ostatni i szczególnie ważny cel zaplanowałam weryfikację hipotetycznego
wpływu β-kateniny na fizjologię neuronów, poprzez przeprowadzenie testu funkcjonalnego.
6.D. Opis i dyskusja wyników
Występowanie i subkomórkowa lokalizacja β-kateniny i czynników LEF1/TCF 2 w mózgu
szczura i myszy (artykuły nr 10, 11, 12)
Gdy
rozpoczynałam
pracę,
w
literaturze
brakowało
kompleksowych
analiz
występowania wymienionych białek, które pozwoliłyby stwierdzić, czy w dorosłym mózgu
może dochodzić do aktywacji transkrypcji przez β-kateninę. W zróżnicowanej tkance nie
oczekiwano aktywności kompleksu β-katenina~LEF1/TCF. Dopiero w 2004 i 2009 roku
metodą hybrydyzacji in situ wykryto ekspresję genów Lef1 i Tcf7l2 we wzgórzu mózgu myszy
i małp [Jones & Rubenstein, J Comp Neurol 2004; Shimogori i wsp., J Comp Neurol 2004; Lee i
wsp., J Comp Neurol 2009].
Projekt rozpoczęłam od zbadania występowania i lokalizacji β-kateniny oraz białek LEF1
i TCF7L2 w skrawkach mózgowych myszy i szczura, stosując różne metody immunodetekcji:
immunohistochemię, immunofluorescencję (współbarwienie z przeciwciałami specyficznymi
dla markerów neuronalnych) oraz analizę Western-blot frakcji subkomórkowych izolowanych
z różnych struktur mózgu. Podobne badania przeprowadziliśmy in vitro w pierwotnych
hodowlach neuronów. Zaobserwowaliśmy, że β-katenina zlokalizowana jest przede
wszystkim w błonach cytoplazmatycznych neuronów i astrocytów w całym mózgu, co było
oczekiwane, ale także w ciele i jądrach komórkowych neuronów wzgórza [Wisniewska i wsp.,
J Neurosci 2010, Misztal i wsp.; J Biol Chem 2011]. Taka lokalizacja β-kateniny w komórkach
zróżnicowanych jest ewenementem. Równie nietypowy jest wysoki poziom czynników
13
AUTOREFERAT
transkrypcyjnych LEF1 i TCF7L2, jaki zaobserwowaliśmy we wzgórzu nie tylko w czasie
rozwoju, ale także u zwierząt dorosłych, zarówno na poziome mRNA jak i białka [Wisniewska
i wsp., J Neurosci 2010; Nagalski i wsp., Brain Struct Funct 2012]. W przypadku RNA
oszacowaliśmy, że średnio w jednej komórce wzgórza dorosłego osobnika znajduje się około
50 kopii Lef1 i 400 kopi Tcf7l2. Przeprowadziliśmy także analizę obecności izoform LEF1 i
TCF7L2 za pomocą reakcji PCR i metody Western blot. Okazało się, że we wzgórzu
embrionalnym przeważa dominująca negatywna izoforma TCF7L2, natomiast u myszy
dorosłych TCF7L2 występuje w formie zdolnej do oddziaływania z β-kateniną, a więc zdolnej
do aktywacji ekspresji genów [Nagalski i wsp., Brain Struct Funct 2012].
β-katenina i czynniki LEF1 i TCF7L2 wydają się więc odgrywać szczególną rolę w
neuronach wzgórzowych, także w dojrzałym mózgu. Czy wzgórze warto badać? Wzgórze jest
bardzo ciekawą, choć do niedawna niedocenianą, częścią mózgu. Wszystkie informacje
zmysłowe poza węchowymi docierają najpierw do wzgórza, i dopiero stamtąd kierowane są
do kory mózgowej, w której zostają poddane analizie [Guillery & Sherman, Neuron 2002].
Neurony wzgórzowe, nazywane neuronami przekaźnikowymi, nie tylko po prostu przesyłają
informacje do kory, ale w zależności od kontekstu behawioralnego są zdolne wpływać na ich
format korzystając z możliwości generowania potencjałów czynnościowych w dwóch
trybach, tonicznym i paczkowym [Sherman, Trends Neurosci 2001]. Ta szczególna
właściwość, wraz z możliwością modulacji wielkości reakcji i synchronizacji neuronów,
sprawia, że wzgórze aktywnie wpływa na procesy selektywnej uwagi, świadomej percepcji
oraz regulacji stanów snu i czuwania [Basso i wsp., Neuron 2005; Saalmann & Kastner,
Neuron 2011]. Nasze odkrycie aktywnej β-kateniny w neuronach wzgórzowych było
szczególnie interesujące z dwóch powodów. Z jednej strony neurony wzgórzowe mogą
uczestniczyć w etiologii zaburzeń afektywnych i psychotycznych. Rozwojowe zaburzenia
wzgórza, takie jak zmniejszenie objętości niektórych obszarów, załamanie systemu
neuroprzekaźnikowego, czy zaburzenie połączeń wzgórzowo-korowych, wskazuje się jako
jedną z przyczyn schizofrenii i ChAD, natomiast powiększenie wzgórza stwierdzono w
niektórych przypadkach ciężkich zaburzeń depresyjnych [Clinton i wsp., Am J Psychiatry
2005; Harms i wsp., J Neurosci 2007; Young i wsp., Br J Psychiatry 2008; Pinault, Schizophr
Bull 2011; Marenco i wsp., Neuropsychopharmacology 2012]. Z drugiej strony, jak
wspomniałam w rozdziale Problematyka i Cele badawcze, wyżej wymieniony choroby
wiązane są z nieprawidłową aktywnością β-kateniny i czynnika TCF7L2.
14
AUTOREFERAT
Mechanizm cytoplazmatyczno-jądrowej lokalizacji β-kateniny w neuronach wzgórza –
niezależność od szlaku Wnt (artykuł nr 11)
Powyżej opisane wyniki skłoniły mnie do zadania pytania o mechanizm specyficznej
lokalizacji subkomórkowej β-kateniny w neuronach wzgórzowych. W dorosłym mózgu
obserwuje się ekspresję genów kodujących białka kanonicznego szlaku Wnt [Shimogori i
wsp., J Comp Neurol 2004], między innymi receptory Frizzled we wzgórzu. Przypuszczaliśmy
więc początkowo, że przyczyną stałej aktywności β-kateniny w neuronach wzgórzowych jest
para- lub autokrynne działanie cząsteczek WNT. A jednak mimo zastosowania kilku różnych
podejść eksperymentalnych nie udało się uzyskać wyników potwierdzających tę hipotezę.
Pozbawienie neuronów wzgórzowych naturalnego mikrośrodowiska, poprzez hodowanie ich
w nieobecności neuronów korowych i astrocytów, nie wpłynęło na lokalizację β-kateniny,
wykluczając mechanizmy parakrynne [Misztal i wsp., J Biol Chem 2011]. Co więcej, na βkateninę nie wypływało ani zahamowanie koreceptora LRP5/6 antagonistą DKK1, ani
zaburzenie wewnątrzkomórkowego szlaku przekazywania sygnału Wnt poprzez nadekspresję
białka DVL z dominującą negatywną mutacją [Misztal i wsp., J Biol Chem 2011]. Mieliśmy
więc mocne podstawy, by twierdzić, że akumulacja β-kateniny w cytoplazmie i jej jądrowa
lokalizacja w neuronach wzgórzowych nie jest zależna od sygnału Wnt. Była to kolejna
nietypowa obserwacja. Nasza praca została zauważona przez edytorkę Science Signalling,
która w rubryce Editors’ Choice zamieściła na jej temat komentarz pod tytułem A Wnt-Less
Journey to the Nucelus [Adler, Science Signalling 2011].
Jaki więc mechanizm powoduje stałą akumulację β-kateniny w cytoplazmie i jądrze
neuronów wzgórza? W trakcie naszych badań okazało się, że w porównaniu z innymi
częściami mózgu, poziom białek kompleksu destrukcyjnego β-kateniny, a więc APC, Aksyny i
GSK3α/β, jest we wzgórzu około trzykrotnie niższy [Misztal i wsp., J Biol Chem 2011].
Uznaliśmy więc za możliwe, że degradacja β-kateniny nie zachodzi w tych komórkach
wystarczająco wydajnie. Faktycznie, eksperyment „pulse-chase” pokazał, że tempo
degradacji cytoplazmatycznej β-kateniny jest w neuronach wzgórzowych ponad dwukrotnie
wolniejsze niż w neuronach korowych [Misztal i wsp., J Biol Chem 2011]. Wydaje się więc, że
obecność β-kateniny w cytoplazmie i jądrach neuronów wzgórza jest cechą autonomiczną
tych komórek, związaną, przynajmniej częściowo, ze spowolnieniem jej degradacji.
15
AUTOREFERAT
Docelowe geny dla kompleksu β-katenin~LEF1/TCF w neuronach wzgórzowych (artykuły
nr 10 i 13)
Aby przybliżyć się do poznania roli β-kateniny w dorosłym mózgu postanowiłam
określić jej docelowy program genetyczny w neuronach wzgórza. Przyjęłam następujący plan
badawczy: przeprowadzenie analiz in silico w celu wytypowania potencjalnych genów,
wykonanie profilowania tych genów w mózgu aby skorelować ich ekspresję z
występowaniem czynników LEF1/TCF i jądrową lokalizacją β-kateniny, i w końcu
eksperymentalna weryfikacja regulacji danych genów przez β-kateninę.
W
pierwszej
fazie
szukaliśmy
motywów
wiązania
czynników
LEF1/TCF
w
konserwowanych regionach genów leżących w obszarach +/- 10 kB od startu transkrypcji w
genomie szczurzym i ludzkim. Grupa genów z co najmniej dwoma konserwowanymi
motywami LEF1/TCF w co najmniej jednym konserwowanym regionie (851 genów) była w
sposób statystycznie istotny wzbogacona w znane geny docelowe szlaku Wnt. Co ciekawe,
analiza ontologiczna pokazała, że grupa z motywami LEF1/TCF jest także wzbogacona w geny
kodujące białka synaptyczne i bramkowane kanały jonowe, a więc białka o kluczowej funkcji
w odbieraniu i przekazywaniu sygnału nerwowego [Wisniewska i wsp., BMC Genomics 2012].
W dalszych badaniach skupiliśmy się na tych genach (41 genów), ponieważ dawało to duże
szanse na znalezienie nowych, neuronalnych, genów docelowych dla β-kateniny przy
jednoczesnym znacznym zmniejszeniu kosztów eksperymentów.
Kolejnym etapem była analiza profilu ekspresji genów wyłonionych in silico, w której
posłużyliśmy się zaprojektowanymi przez nas macierzami PCR. Ponad 20% badanych genów
(9 genów) ulegało wyraźnie wyższej ekspresji we wzgórzu niż w korze mózgowej i
hipokampie, podczas gdy poziom ekspresji badanych genów w korze i hipokampie był
zbliżony [Wisniewska i wsp., BMC Genomics 2012]. Kontrolna grupa genów nie wykazywała
takiej preferencyjnej ekspresji we wzgórzu. Tak więc wyraźny był związek między
występowaniem potencjalnych miejsc wiązania czynników LEF1/TCF w genie, a relatywnym
poziomem jego ekspresji we wzgórzu. Został on także potwierdzony analizą statystyczną.
Dalsze eksperymenty zmierzały do weryfikacji hipotezy, że te „wzgórzowe” geny z
konserwowanymi motywami LEF1/TCF: Cacna1g, Cacna2d2, Kcna6, Kcnh8, Drd3, Gabra3,
Glra1, Grid2 i Calb2, są faktycznie regulowane przez kompleks β-katenina~LEF1/TCF.
Zastosowaliśmy dwa podejścia badawcze. Po pierwsze, wykonaliśmy eksperyment typu „loss
of function”: hamowaliśmy β-kateninę in vitro w hodowli neuronów wzgórzowych poprzez
16
AUTOREFERAT
nadekspresję Aksyny 2, białka z kompleksu destrukcyjnego, po czym badaliśmy poziom
ekspresji powyższych genów [Wisniewska i wsp., BMC Genomics 2012]. Po drugie,
przeprowadziliśmy immunoprecypitację chromatyny izolowanej ze wzgórza i innych części
mózgu przeciwciałem skierowanym przeciwko β-kateninie, a następnie wykrywaliśmy
obecność wytypowanych fragmentów genów metodą ilościowego PCR [Wisniewska i wsp., J
Neurosci 2010; Wisniewska i wsp., BMC Genomics 2012]. Cztery geny pozytywnie przeszły
oba testy: Cacna1g, Kcna6, Gabra3 i Calb2, co daje podstawy by twierdzić, że geny te są we
wzgórzu bezpośrednio regulowane przez β-kateninę.
Wymienione geny są pierwszymi poznanymi genami docelowymi β-kateniny o
specyficznie neuronalnych funkcjach. Cacna1g i Kcna6 kodują kanały jonowe bramkowane
napięciem, odpowiednio kanał wapniowy Cav3.1 i potasowy Kv1.6 [Catterall i wsp.,
Pharmacol Rev 2005; Gutman i wsp., Pharmacol Rev 2005]. Aktywność takich kanałów
wpływa na parametry przewodnictwa elektrycznego błony komórkowej neuronów. Gabra3
jest genem dla jednego z receptorów neurotransmitera GABA (kwasu γ-aminomasłowego),
który wywiera hamujący wpływ na przekazywanie sygnału elektrycznego przez neurony
[Farrant & Kaila, Prog Brain Res 2007]. Warto tutaj wspomnieć, że nokaut genu Gabra3
powoduje u myszy zaburzenia w hamowaniu czuciowo-motorycznym, co jest jedną z cech
schizofrenii [Yee i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 2005]. W końcu Calb2 koduje Calbindynę 2
(znaną także jako Calretynina), wewnątrzkomórkowy bufor wapniowy, którego jedną z
funkcji jest modulowanie odpowiedzi neuronów [Winsky & Kuznicki, J Neurochem 1995; Gall
i wsp., J Neurosci 2003]. Sugeruje to udział β-kateniny w utrzymywaniu się prawidłowej
pobudliwości neuronów wzgórza poprzez regulację ekspresji genów.
β-katenina jako regulator pobudliwości neuronów wzgórzowych – szczegółowa analiza
regulacji promotora Cacna1g i test funkcjonalny (artykuł nr 10)
Moje szczególne zainteresowanie wzbudził gen Cacna1g. Duża gęstość kodowanych
przez niego kanałów Cav3.1 [Talley i wsp., J Neurosci 1999], przez które płyną prądy
wapniowe typu T, umożliwia neuronom wzgórza przesyłanie informacji do kory mózgowej
we wspomnianych wcześniej formatach paczkowym lub tonicznym [Kim i wsp., Neuron
2001]. Znany jest także związek Cav3.1 z padaczką z napadami nieświadomości [Singh i wsp.,
Hum Mutat 2007; Ernst i wsp., J Neurosci 2009]. Zdecydowaliśmy się na pogłębioną analizę
regulacji promotora Cacna1g przez kompleks β-katenina~LEF1/TCF oraz wykonanie
17
AUTOREFERAT
wstępnych testów funkcjonalnych, mogących dostarczyć dalszych wskazówek co do roli βkateniny w neuronach wzgórza.
Sklonowaliśmy ludzki i mysi promotor genu Cacna1g. Oba promotory wykazywały
podwyższoną aktywność w komórkach z nadekspresję β-kateniny i LEF1 [Wisniewska i wsp. J
Neurosci 2010]. Analiza mutacyjna pozwoliła na wyznaczenie obszaru promotora
odpowiadającego na β-kateninę i LEF1 – był nim fragment znajdujący się pomiędzy
alternatywnymi miejscami startu transkrypcji. Aby dokładniej zmapować miejsca wiązania się
białka LEF1 z DNA promotora Cacna1g, przeprowadziliśmy „footprinting” z samodzielnie
przygotowanym rekombinowanym białkiem LEF1 i znakowanymi radioaktywnie fragmentami
promotora [Wisniewska i wsp., J Neurosci 2010]. Równoległe sekwencjonowanie pozwoliło
nam precyzyjnie wyznaczyć sekwencje DNA tych miejsc. W badanym obszarze, o długości
prawie 600 par zasad, znaleźliśmy cztery miejsca wiązania w promotorze ludzkim i
homologiczne z nimi miejsca w promotorze mysim. Wyniki te potwierdziły bezpośrednią
regulację genu Cacna1g przez kompleks β-katenina~LEF1. Dalsze nieopublikowane badania
pokazały, że również kompleks β-katenina~TCF7L2 jest aktywatorem promotora Cacna1g,
nawet o większym potencjale niż β-katenina~LEF1.
Czy udział β-kateniny w regulacji ekspresji genu dla kanału wapniowego Cav3.1 jest na
tyle istotny, że jej aktywność wpływa na właściwości elektrofizjologiczne neuronów
wzgórzowych? By się o tym przekonać, nawiązałam współpracę z elektrofizjologami, którzy
przeprowadzili rejestrację charakterystycznych dla kanału Cav3.1 prądów wapniowych T,
płynących w poprzek błon komórkowych neuronów wzgórzowych traktowanych in vitro
rekombinowanym białkiem WNT3A, posługując się techniką „patch-clamp” [Wisniewska i
wsp., J Neurosci 2010]. Pod wpływem WNT w neuronach dochodziło do wzrostu poziomu βkateniny oraz do wzrostu ekspresji Cacna1g. Rosło także istotnie natężenie prądów T w
porównaniu do neuronów kontrolnych. Tak więc w zastosowanym modelu in vitro przy
aktywacja β-kateniny dochodziło do zwiększenia prądów T, co wskazuje na udział β-kateniny
w utrzymywaniu fizjologicznych właściwości neuronów wzgórzowych. Nasze odkrycie
wzbudziło zainteresowanie; między innymi zacytowano je i zilustrowano na rycinie w
artykule przeglądowym o rozwoju wzgórza w czasopiśmie Frontiers in Neuroscience
[Hagemann & Scholpp, Front Neurosci 2012].
18
AUTOREFERAT
Rola szlaku Wnt/β-katenina w neurogenezie dorosłych (artykuł przeglądowy, nr 14)
W trakcie realizacji projektu habilitacyjnego w literaturze pojawiły się prace
podejmujące temat aktywności β-kateniny w dorosłym mózgu od innej strony niż nasze
badania. Zwrócono przede wszystkim uwagę na rolę β-kateniny w neurogenezie dorosłych w
zakręcie zębatym hipokampa i w strefie podkomorowej komór bocznych mózgu. Korzystając
z zaproszenia do napisania pracy przeglądowej do specjalnego numeru Neurochemical
Research, przedstawiłam własną interpretację tych wyników oraz wyników własnych
[Wisniewska, Neurochem Res 2013].
Badania na temat roli szlaku Wnt/β-katenina w proliferacji i różnicowaniu
pluripotencjalnych prekursorowych komórek nerwowych (NPCs, ang. Neuronal Precursor
Cells) w dorosłym mózgu wpisują się w klasyczny nurt badań nad rolą kanonicznego szlaku
Wnt w rozwoju organizmu. Wyniki większości eksperymentów wskazują na pozytywny
wpływ aktywacji szlaku Wnt/β-katenina na proliferację komórek prekursorowych i/lub ich
różnicowanie się w kierunku neuronów, można jednak znaleźć dowody świadczące o
czymś przeciwnym [Lie i wsp., Nature 2005; Yu i wsp., Mol Cell Biochem 2006; Adachi i
wsp., Stem Cells 2007; Qu i wsp., Nat Cell Biol 2010; Marinaro i wsp., Cereb Cortex 2012].
Nie musi być w tych obserwacjach sprzeczności; doskonale wiadomo, że β-katenina i
czynniki LEF1/TCF mogą aktywować różne programy genetyczne, zależnie od kontekstu
komórkowego, między innymi obecności innych współregulatorów. Na przykład rolę
swoistego „przełącznika” między programem proliferacji a programem różnicowania
mogłaby odgrywać kinaza HIPK1, która modyfikuje odpowiedź transkrypcyjną na
kompleks β-katenina~/LEF1/TCF, a której ekspresję obserwuje się w NPCs [Marinaro i
wsp., Cereb Cortex 2012].
Panuje więc przekonanie, że β-katenina bierze udział w neurogenezie dorosłych, choć
jej faktyczna rola jest nieco kontrowersyjna. Moje wątpliwości budzi jednak brak
bezpośredniego dowodu na aktywność β-kateniny i czynników LEF1/TCF w strefach
neurogenezy w dorosłym mózgu. My także nie wykryliśmy w tych obszarach ani
czynników LEF1 czy TCF7L2, ani jądrowej β-kateniny. Jeżeli więc dochodzi do aktywacji βkateniny, jest ona albo bardzo krótkotrwała albo/i na niskim poziomie. Nie jest też
wykluczone, że to nie β-katenina, ale inne białka aktywowane lub hamowane w szlaku
Wnt, wpływają na neurogenezę w dorosłym mózgu [Hirsh i wsp., Exp Cell Res 2007].
19
AUTOREFERAT
6.E. Podsumowanie, wnioski i znaczenie badań
Podsumowanie wyników
1. Stwierdziliśmy, że w neuronach dorosłych gryzoni w specyficznym obszarze mózgu,
we wzgórzu, β-katenina występuje nie tylko w błonach komórkowych ale także w
cytoplazmie i jądrach komórkowych. W neuronach tych z β-kateniną współwystępują
regulowane przez nią czynniki transkrypcyjne LEF1 i TCF7L2.
2. Wykazaliśmy, że zahamowanie aktywacji kanonicznego szlaku Wnt nie wpływa na
poziom β-kateniny w neuronach wzgórza, co wskazuje na inny, nietypowy, mechanizm
aktywacji jej cytoplazmatycznej puli. Zaobserwowaliśmy natomiast, że poziom białek
tworzących kompleks destrukcyjny β-kateniny, GSK3α/β, APC i Aksyny, jest niższy w
neuronach wzgórza niż w neuronach hipokampa czy kory mózgowej, in vivo i in vitro. Niższe
jest również tempo degradacji cytoplazmatycznej puli β-kateniny. Powodem stałej
akumulacji β-kateniny w neuronach wzgórza może być więc jej nieefektywna degradacja.
3. Znaleźliśmy nowe geny docelowe dla kompleksu β-katenina~LEF1/TCF w neuronach
wzgórzowych. Są to Cacna1g, Kcna6, Gabra3, Calb2, a możliwe, że także inne geny kodujące
kanały jonowe bramkowane napięciem, receptory neurotransmiterów, czy białka
synaptyczne. Sugeruje to udział β-kateniny w elektrofizjologii tych neuronów na poziomie
regulacji ekspresji genów.
4. Pokazaliśmy, że po podwyższeniu poziomu β-kateniny w neuronach wzgórzowych in
vitro wzrasta natężenie prądów wapniowych T płynących przez błonę komórkową. Świadczy
to o większej gestości kanałów Cav3.1, kodowanych przez jeden z nowych genów
docelowych β-kateniny Cacna1g. Jest to pierwsze funkcjonalne potwierdzenie istotnej roli βkateniny w utrzymywaniu prawidłowej pobudliwości neuronów wzgórza.
20
AUTOREFERAT
Fig. 2. Proponowane role β-kateniny w neuronach dorosłego mózgu.
Z Wisniewska 2013, Journal of Neurochemistry
A Hipotetyczny model mitogennej i neurogenicznej roli kompleksów β-katenina~LEF1/TCF w neuronalnych
komórkach prekursorowych podczas neurogenezy dorosłych, modulowanej przez białko HIPK1 [Marinaro
et al. 2012].
B Stała i niezależna od Wnt aktywność kompleksów β-katenina~LEF1/TCF we neuronach wzgórza i kontrola
ekspresji genów kodujących białka związane z przekazywaniem sygnału w neuronach [Wisniewska et al.
2010, Misztal et al. 2011, Wisniewska et al. 2012].
Wnioski i znaczenie badań
Na podstawie powyższych wyników proponuję nową funkcję β-kateniny w dorosłym
mózgu, obok jej roli w plastyczności synaptycznej (błonowa β-katenina, tutaj nie opisywana) i
w neurogenezie dorosłych (kanoniczny szlak Wnt i jądrowa β-katenina, Ryc. 2A)
[Wisniewska, Neurochem Res 2013]. W neuronach wzgórzowych w sposób niezależny od
aktywności szlaku Wnt utrzymuje sie wysoki poziom β-kateniny w cytoplazmie i jądrze
komórkowym [Wisniewska i wsp., J Neurosci 2010; Misztal i wsp., J Biol Chem 2011] oraz
wysoki poziom czynników transkrypcyjnych LEF1 i TCF7L2 [Wisniewska i wsp, J Neurosci.
2010; Nagalski i wsp., Brain Struct Funct 2012], których β-katenina jest kofaktorem.
Wszystko wskazuje na to, że jest to cecha wewnętrzna tych komórek, odróżniająca je od
innych neuronów mózgu. Uzasadnione jest więc przypuszczenie, że kompleksy βkatenina~LEF1 i β-katenina~TCF7L2 pełnią funkcję „ostatecznych selektorów” (ang. terminal
selector) dla neuronów wzgórza, czyli czynników transkrypcyjnych określający i
podtrzymujących cechy różnicowe tych komórek [Hobert, Annu Rev Cell Dev Biol 2011].
Bardzo mocno przemawia za tym fakt, że wzgórzowe geny docelowe β-kateniny kodują
białka określające właściwości elektrofizjologiczne neuronów (Ryc. 2B) [Wisniewska i wsp.,
21
AUTOREFERAT
BMC Genomics 2012], w szczególności kanał Cav3.1. Na podstawie pomiarów prądów T
przeprowadzonych
na
pierwotnych
hodowlach
neuronów
wzgórzowych,
można
przypuszczać, że β-katenina warunkuje prawidłową pobudliwość neuronów wzgórza
[Wisniewska i wsp., J Neurosci 2010]. Planowane badania in vivo na nowych modelach
zwierzęcych mają na celu zweryfikowanie tej hipotezy.
Jak wspomniałam wcześniej, postuluje się związek między zaburzeniami afektywnymi i
psychotycznymi a nieprawidłową aktywnością β-kateniny i czynnika TCF7L2. Na podstawie
naszych badań stawiam tezę, że jedną z przyczyn tych zaburzeń jest rozregulowanie ekspresji
genów zależnych od kompleksu β-katenina~LEF1/TCF7L2 we wzgórzu. Uzyskanie odpowiedzi
na pytanie, czy taki związek faktycznie istnieje i czy dotyczy on (także) funkcjonowania
wzgórza, wymaga jeszcze wielu badań, które mam nadzieje przeprowadzić.
Na koniec chcę podkreślić, że nasze badania były nowatorskie, jeżeli chodzi o stawiane
hipotezy, i wymagały zastosowania bardzo różnorodnych technik. Myślę, że między innymi z
tych powodów zespół, w którym pracowałam i którego pracą kierowałam realizując projekt
habilitacyjny, wspierana przez prof. Jacka Kuźnickiego, został wyróżniony nagrodą im.
Jerzego Konorskiego przyznaną przez Polskie Towarzystwo Badania Układu Nerwowego i
Polski Komitet Neurobiologii za najlepszą polską publikację w dziedzinie neurobiologii w roku
2010.
22