Choroby nowotworowe: wybrane zagadnienia
advertisement
Choroby nowotworowe: wybrane zagadnienia Choroby nowotworowe: wybrane zagadnienia Redakcja: Monika Olszówka Kamil Maciąg Lublin 2015 Recenzenci: dr Artur Banach dr hab. n. med. Agnieszka Bojarska-Junak dr n. med. Michał Dzik dr n. med. Edyta Gałęziowska dr hab. n. med. Ludmiła Grzybowska-Szatkowska dr hab. Krzysztof Grzywnowicz, prof. UMCS dr n. med. Anna Irzmańska-Hudziak dr n. med. Agata Jarząb dr n. med. Marta Łuczyk dr Maciej Masłyk dr hab. n med. Katarzyna Nowomiejska dr hab. Roman Paduch prof. dr hab. Wiesława Rudnicka prof. dr hab. Jolanta Rzymowska dr hab. n. med. Iwona Wertel Wszystkie opublikowane rozdziały otrzymały pozytywne recenzje. Skład i łamanie: Ilona Żuchowska Projekt okładki: Agnieszka Ciurysek © Copyright by Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL ISBN 978-83-65272-03-4 Wydawca: Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL ul. Głowackiego 35/348, 20-060 Lublin www.fundacja-tygiel.pl Spis treści Karolina Okła, Anna Wawruszak, Sylwia Bilska Glejaki – epidemiologia, klasyfikacja i etiologia................................................ 7 Weronika Bulska, Łukasz B. Pilarz, Marta Grabowska Czaszkogardlak – wyzwanie dla każdego specjalisty ..................................... 19 Barbara Wyroba Limfangiogeneza w procesach nowotworowych ............................................. 35 Artur Anisiewicz, Karolina Okła, Anna Wawruszak Makrofagi towarzyszące nowotworowi – pochodzenie, charakterystyka oraz znaczenie w raku piersi ............................................................................. 44 Marta Kucz, Barbara Łasut, Justyna Wilińska Dwa oblicza autofagii – dobry czy zły policjant w komórce nowotworowej? 61 Anna Łabejszo, Joanna Woźniak, Tomasz Wandtke Macierzyste komórki nowotworowe – wyzwania i perspektywy ................... 74 Marcin Michalik, Tomasz Kozłowski, Mateusz Klimek, Piotr Czekaj Podziały symetryczne i asymetryczne komórek macierzystych – mechanizm i rola w etiologii chorób nowotworowych .......................................................... 83 Katarzyna Barchiewicz, Karolina Jakubczyk, Ewa Boniewska-Bernacka Rola transporterów ABC w translokacji ftalocyjanin w komórkach nowotworowych .............................................................................................. 101 Joanna Woźniak, Tomasz Wandtke, Arkadiusz Goede Ekspresja interleukiny-27 w monononuklearach krwi obwodowej po ekspozycji na komórki niedrobnokomórkowego raka płuca .......................... 119 Sylwia Bilska, Karolina Okła, Anna Wawruszak Metody immunoterapeutyczne w leczeniu nowotworów............................... 127 Maciej Frant, Arkadiusz Czerwonka, Aleksandra Żurek Cytostatyki w walce z nowotworami .............................................................. 142 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska Kamptotecyna i jej pochodne. Obiecujące substancje lecznicze chorób nowotworowych na miarę XXI wieku............................................................ 152 Anna Wawruszak, Karolina Okła, Sylwia Bilska Antynowotworowe działanie Lycium barbarum w modelu raka piersi ......... 165 Hanna Pudło, Malwina Respondek,Lucyna Szefczyk-Polowczyk Wpływ diety na występowanie raka piersi ..................................................... 175 Barbara Moszczuk, Dominika Labochka, Anna Czarnecka Wpływ inhibitorów kinaz tyrozynowych stosowanych w leczeniu raka nerki na zaburzenia cukrzycowe .............................................................................. 189 Dominika Labochka, Barbara Moszczuk, Anna Czarnecka Rola cukrzycy w występowaniu i przebiegu raka nerki ................................ 198 Weronika Bulska, Łukasz B. Pilarz Choroby przyzębia ryzykiem raka trzustki ..................................................... 210 Justyna Markowicz, Anna Bzdek, Izabela Rysz, Agnieszka Szymczyk, Tomasz Roman, Ewelina Grywalska Ocena wybranych parametrów immunologicznych w grupie chorych na raka krtani – badanie wstępne ................................................................................. 220 Anna Kozioł, Katarzyna Wojewoda, Kamil Muc Analiza wybranych cech kliniczno – patomorfologicznych przypadkowo wykrytego raka stercza u pacjentów poddanych cystoprostatektomii ........... 234 Wojciech Głód, Michał Godzisz, Krzysztof Grzechnik Analiza wyników badań histopatologicznych pacjentów z guzem nerki operowanych w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej UM w Lublinie 245 Monika Sarnat-Kucharczyk, Ewa Kurzak, Ewa Mrukwa-Kominek Zastosowanie mikroperymetrii oraz badania poczucia kontrastu u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej .............................................................. 262 Indeks autorów ................................................................................................ 278 Karolina Okła1, Anna Wawruszak2, Sylwia Bilska3 Glejaki – epidemiologia, klasyfikacja i etiologia 1. Wprowadzenie Glejaki stanowią grupę najczęściej występujących pierwotnych nowotworów neuroepitelialnych (ośrodkowego układu nerwowego, OUN).Wywodzą się one z neurogleju, inaczej zwanego tkanką glejową, budującą zrąb mózgu. Komórki glejowe, obok komórek nerwowych stanowią drugi, ważny składnik budujący tkankę nerwową. Funkcją ich jest odżywianie, ochrona oraz wspieranie neuronów. Wyróżnia się sześć typów komórek glejowych: oligodendrocyty, astrocyty, ependymocyty, komórki Schwanna, mikroglej oraz komórki satelitarne [1]. Guzy pierwotne mózgu stanowią około 2% wszystkich nowotworów, z czego większość to glejaki. Od 40 do 90% glejaków jest złośliwych (zależnie od grupy wiekowej). Zmiany o szczególnie złośliwym charakterze to glejak wielopostaciowy (GBM) oraz glejak anaplastyczny. Rokowanie pacjentów jest złe. Przeciętny czas życia od diagnozy to rok do półtora roku w zależności od osobniczej złośliwości samego guza.Wśród nowotworów pochodzenia glejowego (glejaków) wyróżnia się: gwiaździaki, wyściółczaki, skąpodrzewiaki oraz postacie mieszane. Etiologia glejaków nie jest do końca poznana. Ważną rolę mogą tu odgrywać zarówno czynniki wrodzone jak i środowiskowe [1]. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie aktualnego stanu wiedzy na temat epidemiologii, klasyfikacji oraz etiologii glejaków. 2. Epidemiologia Pierwotne guzy OUN stanowią 2-3% wszystkich nowotworów [2]. Światowy współczynnik zachorowalności na nie wynosi około 3,7/100 000 osób (dla mężczyzn) oraz 2,6/100 000 osób (dla kobiet). Wyższy współczynnik zachorowalności obserwuje się w krajach wysoko rozwiniętych (mężczyźni 5,8 i kobiety 4,1/100 000 osób), w porównaniu z krajami rozwijającymi się (mężczyźni 3,0 i kobiety 2,1/100 000 osób) [3]. 1 [email protected], I Katedra i Klinika Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2 [email protected], Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 3 [email protected], Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 7 Karolina Okła, Anna Wawruszak, Sylwia Bilska Według Rejestru Nowotworów Centrum Onkologii w Warszawie w 2009 roku w Polsce odnotowano 1444 zachorowań na nowotwory złośliwe mózgu u mężczyzn (współczynnik surowy 7,84/100 000 mężczyzn) oraz 1362 zachorowań u kobiet (współczynnik surowy 6,9/100 000 kobiet) [4]. Powyższe dane jednoznacznie wskazują na wyższy współczynnik występowania pierwotnych guzów mózgu u mężczyzn niż u kobiet [5]. Wśród dzieci nowotwory OUN są najpowszechniejszym (po białaczkach) problemem onkologicznym [6]. Glejaki stanowią od 30% do 40% wszystkich guzów wewnątrzczaszkowych. Około połowę wszystkich glejaków u dorosłych stanowi glejak wielopostaciowy (IV° wg WHO) [7], często nazywany „terminatorem” [8]. Rokowania pacjentów ze zdiagnozowanym GBM nie są pomyślne. W najlepszym wypadku, tylko 5% chorych przeżywa do 3 lat od momentu postawienia diagnozy, a leczenie ma głównie charakter paliatywny. Glejaki należą również do typowych nowotworów wieku średniego i pojawiają się najczęściej między 40 a 65 rokiem życia [7]. Rozwijają się one głównie w półkulach mózgowych, jednakże mogą się również pojawiać w pniu mózgu, nerwach optycznych, rdzeniu kręgowym oraz w móżdżku. [1]. Częstość występowania poszczególnych rodzajów glejaków przedstawia Tabela 1. Tabela 1. Częstotliwość występowania glejaków* [7] Typ nowotworu Nowotwory neuroepitelialne Glejak wielopostaciowy Gwiaździak anaplastyczny Gwiaździakwłosowatokomórkowy Skąpodrzewiak Wyściółczak Glejaki mieszane Skąpodrzewiak anaplastyczny Gwiaździak rozlany Stopień wg WHO I–IV IV III I II II/III II/III III II * % wszystkich nowotworów mózgu 34,30 17,10 2,10 1,70 1,40 1,40 1,00 0,70 0,50 Central Brain Tumor Registry of the United States (CBTRUS) 8 Częstość (100000/rok) 6,46 3,17 0,40 0,33 0,27 0,26 0,19 0,12 0,09 Glejaki – epidmiologia, klasyfikacja i etiologia 3. Klasyfikacja glejaków Powszechnie stosowaną klasyfikacją glejaków jest ta, opracowana przez WHO [9], która łączy stopień złośliwości z rodzajem nowotworu. Jest ona opracowana w oparciu o pięć kryteriów histopatologicznych, związanych ze stopniem anaplazji komórek: gęstość komórek, atypia jądrowa, mitoza, śródbłonkowa proliferacja oraz nekroza [10]. 3.1. Klasyfikacja według stopnia złośliwości WHO wyróżnia cztery histologiczne stopnie złośliwości glejaków od łagodnych (stopień I), do najbardziej złośliwych (stopień IV) (Tabela 2.) [9]. Im wolniej rosnący guz i im bardziej jego komórki są podobne do pierwotnych, z których się wywodzi, tym niższy stopień złośliwości histologicznej. Nowotwory łagodne, charakteryzujące się powolnym wzrostem, mogą być usuwane operacyjnie, lub uśmiercane, z zastosowaniem różnych terapii, jeśli lokują się w łatwo dostępnym miejscu. Rokowania są pomyślne. Nowotwory złośliwe rosną gwałtownie, charakteryzują się wzrostem naciekającym i mogą niszczyć sąsiednie, zdrowe tkanki mózgu. Rokowania są złe [1,2] (Tabela 2.). Tabela 2. Klasyfikacja głównych nowotworów pochodzenie glejowego według WHO [11] Stopień złośliwości Przykłady glejaków Iº wyściółczak śluzakowatobrodawkowaty gwiaździak włosowatokomórkowy IIº IIIº IVº gwiaździak włókienkowy skąpodrzewiak, wyściółczak gwiaździak anaplastyczny glejak wielopostaciowy 3.2. Klasyfikacja ze względu na pochodzenie komórek glejowych Ze względu na pochodzenie komórek glejowych wyróżnia się: nowotwory gleju gwiaździstego (gwiaździaki, astrocytoma), nowotwory gleju wyściółkowego (wysciółczaki, ependymoma), nowotwory gleju skąpowypustkowego (skąpodrzewiaki, oligodendroglioma) oraz nowotwory glejowe mieszane [1, 12]. 3.2.1. Gwiaździaki (astrocytoma) Nowotwory gleju gwiaździstego rozwijają się z największych komórek glejowych, zwanych astrocytami i stanowią prawie 80% wszystkich glejaków. Guzy te, mogą otaczać każdą część mózgu, jednak najczęściej spotykane są w płacie czołowym, natomiast u dzieci w móżdżku i pniu 9 Karolina Okła, Anna Wawruszak, Sylwia Bilska mózgu [1, 12]. Gwiaździaki można podzielić na dwie główne grupy. Pierwszą z nich stanowi gwiaździak (odmiany: włókienkowy, protoplazmatyczny, gemistocytarny) oraz gwiaździak anaplastyczny. Należą one do guzów o niekorzystnym rokowaniu, często transformujących w kierunku glejaków o większym stopniu złośliwości, włącznie do GBM. Do drugiej grupy zaliczany jest gwiaździak włosowatokomórkowyo ograniczonych zdolnościach proliferacyjnych i dobrym rokowaniu (Tabela 2,3.). Guzy szeregu astrocytarnego mogą występować w każdym wieku, jednak szczyt zachorowań u osób dorosłych przypada najczęściej na trzecią i czwartą dekadą życia [12]. Nowotwory gleju gwiaździstego oraz ich charakterystyczne cechy przedstawiono w Tabeli 3. Tabela 3. Nowotwory gleju gwiaździstego i ich charakterystyczne cechy[1,7,12,13] Nowotwory gleju gwiaździstego Cechy charakterystyczne powolny wzrost z dobrze zaznaczonymi granicami; umiejscowiony w pniu mózgu, móżdżku lub nerwach wzrokowych; pojawia się znacznie częściej u dzieci, ale może również występować u młodych osób dorosłych, rzadko spotykany u pacjentów powyżej 30 roku życia; cechuje się bardzo dobrym rokowaniem; stanowi 2% wszystkich nowotworów mózgu powolny wzrost ze średnio zaznaczonymi granicami; rzadko rozprzestrzenia się do innych części OUN; powszechny wśród mężczyzn i kobiet od 20 do 50 roku życia zaliczany do gwiaździaków złośliwych; w wielu przypadkach może być uważany za GBM; wzrost szybszy i bardziej agresywny niż stopień II gwiaździaka; wygląd komórek guza niejednolity; Gwiaździak włosowatokomórkowy (WHO° I) Gwiaździak rozlany(WHO° II) Gwiaździak anaplastyczny (WHO° III) 10 Glejaki – epidmiologia, klasyfikacja i etiologia rozprzestrzenia się na sąsiednie tkanki; powszechny wśród mężczyzn i kobiet w wieku od 30 do 50 roku życia; stanowi 2% wszystkich pierwotnych nowotworów mózgu najbardziej inwazyjny typ glejaka, i najczęściej występujący pierwotny guz mózgu u osób dorosłych; wzrost gwałtowny, z tendencją do naciekania na rozległe tkanki mózgu (guz, który nacieka obie półkule mózgowe z zajęciem spoidła wielkiego nosi nazwę glejaka motylkowego (ang. butterflyglioma)); może zawierać kilkanaście różnych typów komórek (gwiaździaki, skąpodrzewiaki); u dorosłych rozwija się najczęściej w płacie skroniowym mózgu, u dzieci w pniu mózgu; powszechny wśród mężczyzn i kobiet w wieku od 50 do 70 roku życia, przeważającą grupą są mężczyźni; stanowi 17% wszystkich pierwotnych nowotworów mózgu; rokowania są bardzo złe Glejak wielopostaciowy(WHO° IV) 3.2.2. Wyściółczaki (ependymoma) Nowotwory gleju wyściółkowego wywodzą się z gleju wyściółkowego (ependymy) komór mózgowia oraz kanału centralnego rdzenia kręgowego. Około 60% wyściółczaków występuje nadnamiotowo, a 40% podnamiotowo [1,12]. Zajmują zazwyczaj komorę IV mózgu, co może być przyczyną ucisku na drogi przepływu płynu mózgowo- rdzeniowego, a w konsekwencji powstania wodogłowia. Należą do trzeciej, najbardziej powszechnej grupy nowotworów wewnątrzczaszkowych występujących u dzieci. U ponad 90% przypadków, guz lokalizuje się wewnątrzczaszkowo. U ponad 50% przypadków, ryzyko występowania jest wyższe u dzieci, które nie ukończyły 5 roku życia [14]. 11 Karolina Okła, Anna Wawruszak, Sylwia Bilska Tabela 4. Typy nowotworów pochodzenia wyściółkowego według WHO [15] Stopień złośliwości Nowotwory gleju wyściółkowego Iº wyściółczak śluzakowatobrodawkowaty podwyściółczak IIº IIIº wyściółczak wyściółczak anaplastyczny 3.2.3. Skąpodrzewiaki (oligodendroglioma) Nowotwory gleju skąpowypustkowego rozwijają się z komórek glejowych zwanych oligodendrocytami. Charakteryzują się one powolnym wzrostem. Pojawiają się u młodych i u dorosłych w średnim wieku, zwykle między 40 a 60 rokiem życia. Występują częściej u mężczyzn niż u kobiet [16,17]. Zwykle rozwija się w istocie białej mózg. Ponad połowa skąpodrzewiaków obejmuje płat czołowy [17]. Według WHO należy on do guzów o pośredniej złośliwości (WHO° II ), natomiast jego wariant anaplastycznyjest guzem o wysokim stopniu złośliwości (WHO° III) [18]. Skąpodrzewiaki stanowią 3% wewnątrzczaszkowych nowotworów mózgu i 20% glejaków [19]. Obraz mikroskopowy komórek gleju skąpowypustkowego stanowi cechę charakterystyczną i w neuropatologii przedstawiany jest, jako „plaster miodu”, czy „żabi skrzek” [12]. 3.2.4. Glejaki mieszane Glejaki mieszane stanowią zwykle połączenie gwiaździaków oraz skąpodrzewiaków (skąpodrzewiakogwiaździak), ale mogą również zawierać więcej typów komórek glejowych. Stanowią około 1% wszystkich nowotworów mózgu. Występują wśród mężczyzn i kobiet między 20 a 50 rokiem życia. Klasyfikacja i leczenie glejaków mieszanych opiera się na najbardziej agresywnym typie komórek glejowych tj. w przypadku guza składającego się z gwiaździaka anaplastycznego (III° WHO) i niskozłośliwego skąpodrzewiaka (II° WHO) podstawą do leczenia będzie nowotwór o wyższym stopniu złośliwości (gwiaździak anaplastyczny) [1]. 3.3. Klasyfikacja według lokalizacji zmiany nowotworowej Guzy OUN w zależności od umiejscowienia dzieli się na nadnamiotowe (40%), które rozwijają się powyżej namiotu móżdżku, obejmując półkule mózgowe i region linii środkowej mózgu, oraz guzy podnamiotowe (60%), które obejmują tylną jamę czaszki (pień mózgu i móżdżek). Większość glejaków u dzieci rośnie podnamiotowo, natomiast u dorosłych przeważają glejaki rozwijające się nadnamiotowo [20]. 12 Glejaki – epidmiologia, klasyfikacja i etiologia 4. Etiologia rozwoju glejaków Czynniki leżące u podłoża rozwoju glejaków, mimo wielu badań, wciąż pozostają niewyjaśnione. Ważną rolę mogą tu odgrywać zarówno czynniki endogenne (wrodzone), jak i czynniki egzogenne (środowiskowe). Warto zwrócić uwagę na takie aspekty, jak: wiek, płeć, położenie geograficzne, przynależność do danej grupy etnicznej, czynniki genetyczne, ekspozycja na infekcje, wirusy, promieniowanie, niektóre substancje chemiczne, rodzaj wykonywanego zawodu czy dieta [1, 21]. 4.1. Wiek i płeć Pierwotne guzy mózgu charakteryzują się bimodalnym rozkładem wieku chorych. Obserwowane jest niewielkie zwiększenie wskaźników zachorowań u dzieci, stabilny wzrost zapadalności w funkcji czasu, począwszy od 20 roku życia, oraz szczyt zachorowań w wieku od 75 do 84 lat. Średnia wieku u dorosłych, u których diagnozuje się nowotwory mózgu wynosi 57 lat. Tendencje wiekowe w dużej mierze zależą od typu i lokalizacji guza. Współczynnik nowotworów neuroepitelialnych jest prawie 1,3 razy większy u mężczyzn niż u kobiet. GBM występuje częściej u mężczyzn niż u kobiet, w odróżnieniu od oponiaków, które pojawiają się dwa razy częściej u kobiet, niż u mężczyzn. Niektóre badania sugerują że hormony żeńskie mogą wpływać protekcyjnie na rozwój niektórych typów nowotworów mózgu [1]. 4.2. Położenie geograficzne i grupy etniczne Współczynnik występowania pierwotnych złośliwych guzów mózgu jest wyższy w krajach z bardziej dostępną i wysoce rozwiniętą opieką medyczną, jak w Północnej Europie, czy w Stanach Zjednoczonych. Spowodowane jest to, lepszą diagnostyką i szybszym dostępem do informacji w tych krajach. Natomiast Indie czy Filipiny mają najniższy odnotowany wskaźnik nowotworów mózgu co może wynikać z braku dostępu do opieki medycznej. Częstość występowania złośliwych nowotworów mózgu w Japonii jest mniejsza o połowę, niż w Północnej Europie. W Stanach Zjednoczonych glejaki atakują częściej rasę białą niż czarną, ale częstość oponiaków jest prawie równa wśród białych, jak i czarnych osób. Współczynnik występowania GBM u rasy czarnej jest niższa, niż w innych grupach etnicznych [22]. Nie jest do końca wyjaśniona, przyczyna takich różnic. Potrzeba więcej badań na temat genetycznej zmienności, aby wyjaśnić różnice w częstości występowania nowotworów mózgu wśród różnych grup etnicznych [1]. 13 Karolina Okła, Anna Wawruszak, Sylwia Bilska 4.3. Czynniki dziedziczne i genetyczne Mniej niż 5% chorych na glejaki ma dodatni wywiad rodzinny odnośnie do występowania guza mózgu.Niektóre choroby genetyczne, takie jak stwardnienie guzowate, Zespół von Hippel-Lindau, siatkówczak dziedziczny, zespół Li-Fraumeni, zespół Turcota, zespół Cowdena, czy nerwiakowłóknikowatość typu 1 [1, 3] predysponują do rozwoju nowotworu mózgu. Niemniej jednak guzy zależne od wymienionych czynników wykazują tendencję do występowania u dzieci lub młodych dorosłych i zjawisko to nie dotyczy większości przypadków glejaków pojawiających się w późniejszym okresie życia. Zidentyfikowano pięć lociryzyka podatności na glejaka: 5p15.33 (TERT), 8q24.21 (CCDC26), 9p21.3 (CDKN2A-CDKN2B), 20q13.33 (RTEL1) oraz 11q23.3 (PHLDB1). Utrata heterozygotyczności na chromosomach 9p i 10q oraz delecji p16 są często obserwowane w glejakach o wysokim stopniu złośliwości, zaś glejaki o niskim stopniu złośliwości charakteryzują się mniejszą liczbą zaburzeń molekularnych. W przypadku skąpodrzewiaków obecność mutacji 1p i 19q LOH i IDH1 wiąże się ze znamienną poprawą czasu przeżycia[23]. Wydaje się być prawdopodobne, że większość nowotworów mózgu związana jest z współdziałaniem pomiędzy genami a toksynami środowiskowymi, ponieważ tylko mały odsetek nowotworów jest związana z dziedzicznością [3]. 4.4. Promieniowanie jonizujące Duże dawki promieniowania jonizującego są powiązane z uszkodzeniami DNA w komórce, co w konsekwencji może prowadzić do jej śmierci. Małe dawki promieniowania prowadzą natomiast do mutacji, przyczyniając się do rozwoju nowotworów złośliwych. Leczenie niektórych chorób z użyciem promieniowania jonizującego (włączając promieniowanie X) jest ważnym czynnikiem ryzyka dla rozwoju nowotworów mózgu. Stosunkowo niska dawka promieniowania użyta do leczenia grzybicy skóry i skórnego naczyniaka krwionośnego u dzieci lub niemowląt związana jest z ryzykiem rozwoju nowotworów osłonek nerwów, oponiaków i glejaków. Obserwuje się również wzrost ryzyka występowania glejaków lub innych nowotworów mózgu u pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną, którzy byli poddawani próbie naświetlania [1, 3, 22]. 4.5. Ekspozycja na infekcje oraz wirusy Niektóre dwuniciowe wirusy, takie jak JC, BK iSV40 zostały odkryte w ludzkich tkankach glejowych i mają zdolność indukcji nowotworów mózgu u zwierząt. W jednym z doniesień stwierdzono, że tkanki glejowe pobrane z 27 guzów wyrażają zbiorowego ludzkiego cytomegalowirusa (HCMV). Czynniki zapalne mogą aktywować transkrypcję genów HCMV, 14 Glejaki – epidmiologia, klasyfikacja i etiologia a tym samym indukować złośliwą transformację i powodować transaktywację innych wirusów onkogennych związanych z glejakami złośliwymi jak np. wirusa JC [3]. 4.6. Dieta W badaniach przeprowadzonych na zwierzętach wykazano, że N- nitrozo składniki stanowią substancje karcynogenne. Związki te są obecne w konserwowanym mięsie (azotyny), dymie papierosowym czy w kosmetykach. Niektóre badania wskazują, że N- nitrozo składniki mogą zwiększać ryzyko rozwoju nowotworów mózgu zarówno u dzieci, jak i u dorosłych. Badacze zaobserwowali, że pacjenci ze zdiagnozowanymi guzami mózgu (lub ich matki), konsumowali więcej konserwowanego jedzenia, w porównaniu z grupą kontrolną [1]. Wykazano, że etylonitrozomocznik i metylonitrozomocznik są czynnikami rakotwórczymi, powodującymi rozwój nowotworów mózgu u szczurów. Zdolność tych substancji do przenikania bariery krew- mózg, oraz ich mutagenne działanie, czynią z nich idealne czynniki inicjujące proces karcynogenezy [21]. Badania wskazują, że spożywanie owoców i warzyw, zawierających witaminę C i E może pełnić funkcję protekcyjną, przeciwko nowotworom mózgu [21]. 4.7. Substancje chemiczne w miejscu pracy i w domu Niektórzy ludzie narażeni są na działanie karcynogennych lub toksycznych substancji w miejscu pracy. Zwykle osoby wykonujące takie zawody, rzadko narażone są tylko na jedną substancję chemiczną, a niektóre chemikalia często ze sobą oddziałują. Dlatego też, trudno jest wskazać jednoznaczny, związek pomiędzy nowotworami mózgu i określonymi substancjami chemicznymi, nawet jeśli wiadomo, że posiadają one właściwości rakotwórcze.Istnieją jednak niepodważalne dowody, że osoby zatrudnione przy produkcji syntetycznych gum i chlorku poliwinylowego, oraz pracujące w pewnych działach przemysłu petrochemicznego, olejowego i ropo- naftowego są bardziej narażone na ryzyko rozwoju nowotworów mózgu. Cztery na pięć badań nad pestycydami wskazuje również, na podwyższone ryzyko rozwoju nowotworów mózgu w grupie osób pracujących przy produkcji pestycydów.Istnieje również ryzyko wystąpienia nowotworu u dzieci, których rodzice są wystawieni na ekspozycję karcynogenów w miejscu pracy. Wyższe ryzyko dziecięcych nowotworów mózgu odnotowuje się w przypadku ojców dzieci pracujących w przemyśle papierniczym i drzewnym, z rozpuszczalnikami, w malarstwie, w olejnym lub chemicznym rafinowaniu, w gospodarce, metalurgii, pracujących w powietrzu, czy przestrzeni kosmicznej. Przypuszcza się, iż chemiczne 15 Karolina Okła, Anna Wawruszak, Sylwia Bilska karcynogeny z miejsca pracy, mogą również pozostawać na rękach oraz odzieży, co powoduje przenoszenie ich na innych domowników, a tym samym narażanie rodziny na ich działanie [1]. 4.8. Telefony komórkowe Zdrowotne efekty używania telefonów komórkowych, w ostatnich latach wzbudzały szerokie zainteresowanie wśród naukowców. Rezultaty badań, sugerują brak związku między używaniem telefonów komórkowych a zwiększonym ryzykiem rozwoju nowotworów mózgu. Ważne jest jednak kontynuowanie badań, gdyż używanie telefonów komórkowych staje się coraz bardziej powszechne. Wiele badań przeprowadzono, kiedy głównym typem komórek były telefony analogowe, w porównaniu z powszechnie używanymi dzisiaj telefonami cyfrowymi. Całkowita ilość używanych telefonów była niższa, dlatego też liczba użytkowników była mniejsza. Ponadto niezwykle ważne wydają się być długoterminowe badania nad działaniem telefonów komórkowych, ponieważ niektóre nowotwory mózgu mogą się rozwijać przez dłuższy czas [1, 24]. 5. Podsumowanie Podobnie jak niezwykła jest złożoność ludzkiego mózgu, która odróżnia go w istotny sposób od innych narządów, tak i nowotwory mózgu posiadają wiele unikalnych cech. Komórki nowotworowe guzów mózgu działają często bardzo podstępnie, a liczne aspekty obejmujące ich epidemiologię, etiologię, zróżnicowanie histopatologiczne stanowią duże wyzwanie dla współczesnej nauki. Lepsze zrozumienie biologii oraz mechanizmów, leżących u podstaw powstawania glejaków staje się szansą na opracowanie nowych, skuteczniejszych metod terapeutycznych a tym samym daje nadzieję na całkowite wyleczenie pacjentów dotkniętych tą chorobą. Literatura 1. 2. 3. 4. McLean R., Lovely M., Vassall E. National Brain Tumor Society 2004, 2005, 2007, 2009, 2010, 2012 Riemenschneider M. J., Reifenberger G. Molecular Neuropathology of Gliomas 2009, Int J Mol Sci, 10(1): 184-212 Bondy M. L., Scheurer M. E., Malmer B., Barnholtz-Sloan J. S., Davis F. G., II`yasova D., Kruchko C., McCarthy B. J., Rajaraman P., Schwartzbaum J. A., Sadetzki S., Schlehofer B., Tihan T., Wiemels J. L., Wrensch M., Buffler P. A. Brain Tumor Epidemiology: Consensus from the Brain Tumor Epidemiology Consortium (BTEC) 2008, Cancer, 113(7 Suppl): 1953-1968 Didkowska J., Wojciechowska U., Zatoński W. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2009 roku. Centrum Onkologii Instytut, Warszawa 2011 16 Glejaki – epidmiologia, klasyfikacja i etiologia 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Hutter A, Schwetye KE. i wsp. Brain neoplasms: epidemiology, diagnosis, and prospects for cost-effective imaging. Neuroimaging Clin N Am 2003; 13:237-250 Ohgaki H, Kleihues P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. (Berl.) 2005;109:93-108 Schneider T., Mawrin Ch., Scherlach C., Skalej M., Firsching R. Gliomas in Adults 2010, Dtsch Arztebl Int, 107(45): 799-808 Duda K. Glejak mózgu-nowotwór, którego rozwój “wspiera” własny organizm! 2006 Louis D. N., Ohgaki H., Wiestler O. D., Cavenee W. K., Burger P. C., Jouvet A., Scheithauer B. W., Kleihues P. The 2007 WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System 2007, Acta Neuropathol,114(2): 97-109 Marquet G., Dameron O., Saikali S., Mosser J., Burgun A. Grading glioma tumorsmusing OWL-DL and NCI Thesaurus 2007, AMIA Annu Symp Proc. 2007: 508-512 Katarzyńska A. Glejaki zlośliwe mózgu- trudności diagnostyczne i terapeutyczne 2009 Mossakowski J.M., Liberski P. Guzy układu nerwowego, Wrocław 1997, wyd.1 Petalidis L. P., Oulas A., Backlund M., Wayland M. T., Liu L., Plant K., Happerfield L., Freeman T. C., Poirazi P., Collins V. P. Improved Grading and Survival Prediction of human astrocytic brain tumours by artificial neural network analysis of gene expression microarray data 2008, Mol Cancer Ther, 7(5): 1013 Peyre M., Commo F., Dantas-Barbosa C., Andreiuolo F., Puget S., Lacroix L., Drusch F., Scott ., Varlet P., Mauguen A., Dessen P., Lazar V., Vassal P., Grill J. Portrait of Ependymoma Recurrence in Children: Biomarkers of Tumor Progression Identified by Dual-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis 2010, PLoS One, 5(9) Ellison, D.W., Kocak, M., Figarella-Branger, D., Felice, G., Catherine, G., Pietsch, T., Frappaz, D., Massimino, M., Grill, J., Boyett, J.M., et al. (2011). Histopathological grading of pediatric ependymoma: reproducibility and clinical relevance in European trial cohorts. J. Negat. Results Biomed. 10, 7. Kelly J. J. P., Blough M. D., Stechishin O. D. M., Chan J. A. W., Beauchamp D., Perizzolo M., Demetrick D. J., Steele L., Auer S. T. N., Hader W. J., Westgate M., Parney I. F., Jenkins R., Cairncross J. G., Weiss S. Oligodendroglioma cell lines containing t(1;19)(q10;p10) 2010, Neuro Oncol, 23(7):745-755 Nielsen S. M., Christensen H. C., Kosteljanetz M., Johansen Ch. Incidence of and survival from oligodendroglioma in Denmark, 1943-2002 2009, Neuro Oncol, 11(3): 311-317 McCarthy B. J., Rankin K. M., Aldape K., Bondy M. L., Brännström T., Broholm H., Feychting M., Il'yasova D., Inskip P. D., Johansen Ch., Melin B. S., Ruder A. M., Butler M. A., Scheurer M. E., Schüz J., Schwartzbaum J. A., Wrensch M. R., Davis F. G.Risk factors for oligodendroglial tumors: A pooled international study 2010, Neuro Oncol, 13(2): 242-250 17 Karolina Okła, Anna Wawruszak, Sylwia Bilska 19. Guo Q., Hao J., bin Sun S., ping Xu S., Yang Q., Guo Q. I., Culi G. D. Oligodendroglioma of the ciliary body: a unique case report and the review of literature 2010, BMC Cancer, 10: 579 20. Kapczuk I., Beń-Skowronek I., Jaklińska T., Szewczyk L. Zaburzenia hormonalne w przebiegu leczenia guzów okolicy podwzgórzowo-przysadkowej 2010, Klinika Endokrynologii i Neurologii Dziecięcej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, Nr 2(31) 21. Idowu O. E., Idowu M. A. Environmental causes of childchood brain tumours 2008, Afr Health Sci. 8(1): 1-4 22. Iacob G., Dinca EB. Current data and strategy in glioblastoma multiforme 2009, J Med Life, 2(4): 386-393 23. Simon, M., Hosking, F.J., Marie, Y., Gousias, K., Boisselier, B., Carpentier, C., Schramm, J., Mokhtari, K., Hoang-Xuan, K., Idbaih, A., et al. (2010). Genetic risk profiles identify different molecular etiologies for glioma. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 16, 5252–5259. 24. Hepworth S. J., Schoemaker M. J., Muir K. R., Swerdlow A. J., van Tongeren M. J., McKinney P. A. Mobile phone use and risk of glioma in adults: casecontrol study 2006, BMJ, 332(7546): 883-887 Glejaki – epidemiologia, klasyfikacja i etiologia Streszczenie Guzy pierwotne mózgu stanowią około 2% wszystkich nowotworów złośliwych. Spośród nich najczęstszym jest glejak wielopostaciowy. Prawdopodobieństwo zapadalności rośnie z wiekiem i osiąga 50/100 000 w wieku 75 lat. Wśród nowotworów pochodzenia glejowego (glejaków) wyróżnia się: gwiaździaki (astrocytoma), wyściółczaki (ependymoma), skąpodrzewiaki (oligodendroglioma) oraz postacie mieszane. Etiologia nowotworów złośliwych ośrodkowego układu nerwowego nie jest do końca poznana. Istnieje kilka rodzajów hipotetycznych czynników powiązanych z powstawaniem nowotworu. W niniejszej pracy przedstawiono aktualny stan wiedzy na temat epidemiologii, klasyfikacji oraz etiologii glejaków. Gliomas – epidemiology, classification and etiology Abstract The primary brain tumors account for about 2% of all malignancies. Malignant gliomas, which include glioblastomas and anaplastic astrocytomas, are the most common primary tumors of the brain. Probability of morbidity rise with age, and it is 50/100 000 at the age of 75 years old. Gliomas can be divided into astrocytomas, ependymomas,oligodendrogliomas and mixed gliomas. The etiology of brain tumors is unfortunately not clear, butincreaesingly research is pointing toward genetic mutations. In this article we present up to date information on the epidemiology, classification and etiology of gliomas. 18 Weronika Bulska1, Łukasz B. Pilarz2, Marta Grabowska3 Czaszkogardlak – wyzwanie dla każdego specjalisty 1. Wstęp Czaszkogardlak (craniopharyngioma) jest nowotworem łagodnym wywodzącym się z nabłonka płaskiego pierwotnej kieszonki Rathkego, czyli kieszonki przysadki powstałej w embriogenezie. W oparciu o dane statystyczne przyjmuje się, że stanowi 5-10% wszystkich guzów mózgu występujących u dzieci oraz 1-4 % nowotworów mózgu u dorosłych. Czaszkogardlaki mogą być zlokalizowane w dowolnym miejscu, począwszy od ściany gardła, aż do rejonu blaszki granicznej. Najczęściej guz rozwija się z komórek znajdujących się w szypule przysadki oraz w guzie sinawym. Guzy wywodzące się z szypuły przysadki często naciekają gruczoł przysadkowy, podczas gdy zmiany wywodzące się z guza sinawego szerzą się w górę przez podwzgórze do trzeciej komory. Craniopharyngioma może przylegać do nerwów wzrokowych, skrzyżowania wzrokowego, naczyń koła Willisa, szypuły przysadki, przysadki, podwzgórza, stąd dla tej jednostki chorobowej przypisuje się wiele charakterystycznych objawów. Craniopharyngioma dzieli się na dwa główne podtypy histopatologiczne: szkliwiakowaty (adamantinomatous) oraz brodawkowaty (papillary). Pierwsza odmiana, nazywana postacią dziecięcą, może występować praktycznie u wszystkich dzieci i stanowi 2/3 wszystkich czaszkogardlaków u dorosłych. Z kolei druga odmiana to postać typu dorosłych, rzadko diagnozowana u osób poniżej 18 r. ż i opisywana u co trzeciego dorosłego pacjenta [1]. Pierwszy udokumentowany przypadek (klinicznie, biochemicznie, histologicznie oraz radiologicznie) agresywnego, nadsiodłowego, brodawkowatego guza objawiającego się brakiem miesiączki (amenorrhea), postępującym zaburzeniem pola widzenia oraz ciężkim bólem głowy opisano u 38-letniej kobiety [2]. 1 [email protected], Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, www.sum.edu.pl 2 [email protected], lekarz medycyny, Katedra i Oddział Kliniczny Otorynolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej w Zabrzu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, www.sum.edu.pl 3 [email protected], Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, www.sum.edu.pl 19 Weronika Bulska, Łukasz B. Pilarz, Marta Grabowska Czaszkogardlak jest jednym z największych wyzwań operacyjnych guzów okołosiodłowych dla neurochirurgów. Stąd jego około- i pooperacyjne postępowanie jest źródłem wielu kontrowersji. Spory otaczają każdy aspekt tej jednostki chorobowej: od etiologii, patofizjologii, dostępów chirurgicznych po opiekę przedoperacyjną i terapię adiuwantową. Co ciekawe, na temat craniopharyngioma wiedza była niewielka do końca XIX wieku. Celem pracy było przedstawienie historii, epidemiologii, bogatego obrazu klinicznego, diagnostyki i leczenia craniopharyngioma. 2. Historia Czaszkogardlak został opisany po raz pierwszy w 1857 roku przez Friedricha Alberta von Zenkera. Podczas badania post mortem niemiecki patomorfolog dostrzegł torbielowatą masę zbudowaną z nabłonka płaskonabłonkowego z obecnością kryształów cholesterolu. Jednak to Jakob Erdheim w 1904 r. jako pierwszy przedstawił dokładne cechy histopatologiczne guza, stąd w nazewnictwie eponimicznym zakorzenił się termin guz Erdheima. Eponim ten stosowano w medycynie aż do 1932 roku, kiedy to Harvey Cushing wprowadził nazwę craniopharyngioma [3]. Pierwszym neurologiem, który scharakteryzował obraz kliniczny pacjenta z czaszkogardlakiem był Joseph Jules Francois Felix Babinski. Chirurgiczna resekcja guza zakończona powodzeniem została po raz pierwszy wykonana przez A. E Halsteada w Chicago 21 lipca 1909 r. 3. Epidemiologia Dokładne dane epidemiologiczne na temat czaszkogardlaka nie są w pełni poznane ze względu na jego rzadkość występowania oraz według niektórych autorów na niejasną granicę pomiędzy charakterem guza – łagodnym a złośliwym. Predylekcja do zachorowalności na craniopahryngioma ma rozkład bimodalny – dotyczy dzieci pomiędzy 5 a 14 rokiem życia, a także osób dorosłych powyżej 65 r. ż. U osób dorosłych roczna zapadalność na ten nowotwór jest szacowana na 1,3 przypadki/milion, z kolei u dzieci na 1,4 przypadki/milion. W krajach Azji i Afryki zaobserwowano zwiększoną zachorowalność. Natomiast nie wykazano różnic w częstości występowania guza pomiędzy kobietami a mężczyznami. Przy aktualnym stanie wiedzy nie znamy żadnych konkretnych czynników środowiskowych wpływających na powstanie czaszkogardlaka. Przypuszcza się, że predyspozycje genetycznie nie mają wpływu na rozwój guza, jednak opisano pojedyncze przypadki występowania czaszkogardlaka w obrębie tej samej rodziny oraz w rodzinie, w której krewny chorego był dotknięty innym schorzeniem nowotworowym [4]. 20 Czaszkogardlak – wyzwanie dla każdego specjalisty 4. Obraz kliniczny Czaszkogardlak jest guzem, który stanowi wyzwanie dla wielu specjalistów, gdyż powoduje wystąpienie nie tylko czterech głównych objawów tj.: zwiększonego ciśnienia wewnątrzczaszkowego, zaburzeń widzenia, bólów głowy oraz endokrynopatii, ale także wywołuje objawy natury psychiatrycznej oraz otorynolaryngologicznej. Czas od pojawienia się pierwszych objawów do wykrycia craniopharyngioma wynosi od jednego tygodnia do 372 miesięcy [5]. Z przeprowadzonych analiz dokumentacji medycznej przez E. Rucką i wsp. [6] przyczyną rozpoznania craniopharyngioma u dzieci jest wystąpienie objawów klinicznych a rzadko przypadkowe wykrycie guza w badaniu TK przeprowadzonych z innych przyczyn np. urazu głowy. 4.1. Objawy okulistyczne Najczęstszym symptomem świadczącym o obecności czaszkogardlaka jest zaburzenie widzenia. Na podstawie naszych danych literaturowych kompresja guza na nerw wzrokowy, skrzyżowanie wzrokowe, czy pasma wzrokowe zdecydowanie częściej ujawnia się u osób dorosłych niż u osób przed osiemnastym rokiem życia. Diplopia, zredukowane pole widzenia, ślepota to główne objawy leżące u podłoża zaburzeń widzenia. Mogą one mieć również wtórny charakter do wzrostu ciśnienia wewnątrzczaszkowego [1]. 4.2. Objawy neurologiczne Drugim z kolei najczęściej pojawiającym się objawem jest nadciśnienie wewnątrzczaszkowe, które stanowi konsekwencję powiększania się masy guza oraz wodogłowia. U podłoża wodogłowia leży niedrożność otworów Moneroego lub wodociągu mózgu, fizjologicznie ułatwiających odpływ płynu mózgowo-rdzeniowego [1]. Cechy nadciśnienia śródczaszkowego uwidaczniane są w badaniu dna oka. Uzyskiwany jest obraz tarczy zastoinowej. Wg danych literaturowych u 9 z 10 badanych dzieci przyczyną podjęcia działań diagnostycznych były bóle głowy [6]. Najczęstszą przyczyną bólów głowy jest napinanie przepony siodła przez powiększającą się masę guza, natomiast znacznie rzadziej spowodowane są one niedrożnością wodociągu mózgu lub otworów Monroego [1]. Czas pojawienia się bólu głowy był różny i wynosił od kilku dni do 8 miesięcy, średnio 2 miesiące przed rozpoznaniem. Bóle te w początkowym okresie miały charakter okresowy, a w późniejszym okresie stały. Wymioty obok bólów głowy są częstym objawem, a ich wystąpienie poprzedzało rozpoznanie guza od kilku dni do 2 tygodni. 21 Weronika Bulska, Łukasz B. Pilarz, Marta Grabowska Do rzadszych objawów czaszkogardlaka należą: niedowład bądź porażenie jednego lub kilku nerwów czaszkowych takie jak porażenie n. VII [7] oraz niepewność chodu. U mężczyzn często stwierdza się występowanie zaburzeń potencji [1]. 4.3. Objawy psychiatryczne Zaburzenia psychiatryczne obejmują: omamy, zaburzenia paranoidalne, niedojrzałość emocjonalną, apatię oraz zaburzenia pamięci krótkotrwałej, u dzieci także opóźnienie rozwoju umysłowego. Spotykane są halucynacje, zarówno wzrokowe jak i słuchowe. Wymienione objawy mogą być konsekwencją znacznej objętości guza i jego kompresji na struktury układu limbicznego oraz struktur płata czołowego. Pacjenci mogą odczuwać zaniepokojenie lub przerażenie, a także ulegać maniom prześladowczym. Objawami często występującymi są także zaburzenia snu oraz zaburzenia kognitywne. Część autorów opisuje występowanie objawów psychiatrycznych także w okresie pooperacyjnym [7,8]. 4.4. Objawy endokrynologiczne Na podstawie naszego piśmiennictwa można stwierdzić, że zaburzenia endokrynologiczne średnio występują u 23,3 % pacjentów i stanowią trzecią pod względem częstości zgłaszanych przez pacjentów skarg. Największa częstość endokrynopatii występowała w grupie pacjentów z czaszkogardlakiem opisanej przez Elwatidy S.M [9], a najmniejszą wartość stwierdzono w badaniach Lopeza i wsp. [10] – tylko u 12,4 % pacjentów z craniopharyngioma. Trzeba jednak wyraźnie zaznaczyć, że u wielu chorych pogłębiony wywiad i badanie fizykalne wskazują na obecność skąpoobjawowych endokrynopatii, niekiedy utrzymujących się przez miesiące lub lata przed postawieniem rozpoznania. Mimo że objawy endokrynologiczne nie stanowią głównego problemu u wszystkich pacjentów z craniopharyngioma to na pewno są nie lada wyzwaniem dla specjalistów, gdyż pojawiają się najwcześniej w czasie trwania choroby i zwykle wyprzedzają objawy neurologiczne i okulistyczne. Najczęstszymi z objawów stwierdzanymi u dzieci są: spowolnienie wzrostu z powodu niedoboru hormonu wzrostu – GH. W literaturze także donosi się o niedobrze gonadotropin – FSH i LH, hormonu kortykotropowego – ACTH, hormonu tyreotropowego – TSH [1]. Należy zauważyć iż często występuje opóźnione dojrzewanie związane z niedoborem gonadotropin, jednak opisano nieliczne przypadki przedwczesnego dojrzewania. 22 Czaszkogardlak – wyzwanie dla każdego specjalisty 4.4.1. GH U dzieci z craniopharyngioma najczęstszy jest niedobór hormonu wzrostu i występuje u 75% badanych. Jednakże niedobór wzrostu lub zwolnienie tempa wzrastania rzadko jest przyczyną skierowania przed rozpoznaniem guza. Pomimo iż u ponad 86% pacjentów występuje spowolnienie wzrostu ulega to częstemu przeoczeniu, co przyczynia się do opóźnienia postawienia diagnozy [11]. 4.4.2. LH/FSH Najczęstszym objawem u pacjentów dorosłych jest niedobór hormonów gonadotropowych. Według L. Vries i wsp. [12] 100% młodzieży może zgłaszać cechy opóźnionego dojrzewania. Niedobór omawianych hormonów przez obserwację jest rozpoznawany u dziewcząt w 14 roku życia, a u chłopców w 13 roku życia. 4.4.3. TSH Zaburzenia czynności tarczycy zaobserwowano u 2,7-24% dzieci z craniopharyngioma. Niedobór hormonu tyreotropowego obserwowany jest także u dorosłych pacjentów. Wśród zgłaszanych objawów należą: nietolerancja zimna, suchość skóry, zaparcia, rzadkie lub łamliwe włosy, przyrost masy ciała, zmniejszenie energii i bradykardię [12, 13]. 4.4.4. ACTH Niedobór ACTH stwierdzono u 25-71 % dzieci z czaszkogardlakiem przed operacją [12], natomiast K.R. Lyen i wsp. [14] wykazali iż u 72% dzieci po zabiegu operacyjnym zaburzenia czynności ACTH po testach prowokacyjnych nie występowały. U pacjentów z zaburzeniami wydzielania tego hormonu zaleca się badanie poziomu ACTH corocznie przez okres 10-15 lat.Niedobór w zakresie ACTH może manifestować się subtelnymi objawami takimi jak: brakiem łaknienia, nudnościami, hipoglikemią, słabym przybieraniu na wadze i łatwemu męczeniu. Mogą się one nasilać w okresie stresu. Jednak niedobór ACTH może prowadzić do dramatycznych objawów tj. znacznego spadku hormonu i zgonu. 4.4.5. ADH U 9-38% chorych występuje niedobór wazopresyny [15, 16]. U dzieci z czaszkogardlakiem moczówka prosta była jedną z przyczyn śmierci. Pacjenci odczuwają uporczywe pragnienie, często preferują zimne płyny, zarówno w ciągu dnia jak i w nocy. Objawy te najczęściej pojawiają się nagle. 23 Weronika Bulska, Łukasz B. Pilarz, Marta Grabowska 4.4.6. Prolaktyna Podwyższony poziom prolaktyny odnotowano u 8-50 % [12] dzieci przed operacją. Hiperprolaktynemia wynika prawdopodobnie z zaburzenia wydzielania prolaktyny związanego z uszkodzeniem podwzgórza. Związane z hiperprolaktynemią brak miesiączki, mlekotok występują jako objawy pierwotne u dorosłych kobiet z czaszkogardlakiem. 4.4.7. Melatonina U dzieci z czaszkogardlakiem obserwowane jest zmniejszenie nocnego wydzielania melatoniny, co może prowadzić do zwiększonej senności w ciągu dnia. 4.5. Zaburzenia metaboliczne Retrospektywne badanie osób z guzem wykazało anoreksję u 11,4%, przy czym grupę tą stanowili mężczyźni. U 31,4% badanych odnotowano wymioty, występowały one znamiennie częściej u kobiet (prawie w stosunku 1:10 ) [17] . Wzrost masy ciała zaobserwowano u 5% badanych przed operacją, natomiast po operacji 14% pacjentów cierpiało z powodu ciężkiej otyłości [11]. Przyczyna powstawania otyłości po operacji wydaje się być wieloczynnikowa. Część pacjentów wykazuje zwiększony apetyt, a także zmniejszone uczucie sytości. U osób tych zmniejszona była aktywność fizyczna. Nadmierna masa ciała sprzyja powstawaniu insulinooporności, a więc w konsekwencji wzrasta ilość endogennej insuliny i dochodzi do rozwoju cukrzycy typu II [11]. 4.6. Objawy otorynolaryngologiczne Postępujący charakter objawów laryngologicznych towarzyszących craniopharyngioma wśród których należy wymienić : krwawienie z nosa, zatkanie nosa, utratę słuchu lub powonienia, zapalenie opon mózgowordzeniowych, powinien zainicjować proces diagnostyczny. Występujący również przewlekły katar wraz z niedrożnością nosa prowadzi do trudności w oddychaniu. W opisanym przez L. Podoshin i wsp. [18] przypadku objawy laryngologiczne były pierwszą manifestacją trwającej choroby. 24 Czaszkogardlak – wyzwanie dla każdego specjalisty Tabela 1. Częstość występowania objawów klinicznych Częstość występowania objawów klinicznych T.Y Jung i wsp. [22] Clark A. i wsp. [21] Jo K.W. i wsp. [20] Julow J.V. [19] Lopez Serna R. i wsp. [10] Elwatidy S.M. [9] Autorzy Ilość badanych Średni wiek Stosunek K :M Zaburzenie widzenia Wzrost ciśnienia wewnątrzczaszkowego Zaburzenia endokrynolo -giczne 11 33,7 6:5 82 % 36,4 % 36,4 % 153 32,4 74:70 66,6 % 11,7 % 12,4 % 78 33,4 38:40 55,1 % 16,6 % 20,4 % 35 8,6 16:19 37,14 % 31,4 % 20 % 531 4 288:2 43 30,32 % - 27,3 % 17 12 5:12 23,5% 76,5% 23,5 % Źródło: [9,10,19,20,21,22] 5. Diagnostyka 5.1. Metody obrazowe W diagnostyce czaszkogardlaków istotną rolę odgrywają badania obrazowe. Należą tutaj: badanie radiologiczne, tomografia komputerowa oraz rezonans magnetyczny. 25 Weronika Bulska, Łukasz B. Pilarz, Marta Grabowska 5.1.1. Zdjęcie przeglądowe czaszki Metoda ta umożliwia uwidocznienie cech wzmożonego ciśnienia śródczaszkowego. Widoczne jest pogłębienie wycisków palczastych blaszki wewnętrznej i rozstęp szwów czaszki, a także powiększenie oraz zniekształcenie siodła tureckiego. Obrazowanie tą metodą umożliwia także uwidocznienie zwapnień, które przemawiają za rozpoznaniem czaszkogardlaka. 5.1.2. Tomografia komputerowa Obok rezonansu magnetycznego stanowi główną metodę diagnostyczną. Przewyższa zdjęcia klasyczne RTG, a jednocześnie charakteryzuje się dużą dostępnością. Umożliwia zobrazowanie zwapnień o zróżnicowanej morfologii występujących w obrębie guza. 5.1.3. Rezonans magnetyczny Charakteryzuje się mniejszą dostępnością niż poprzednie metody, jednak umożliwia dokładniejsze obrazowanie. Badanie MR pozwala na uwidocznienie tkanek miękkich, stosunków anatomicznych, naczyń i komór mózgu. 5.2. Badania hormonalne 5.2.1. Somatotropina Wstępne badania diagnostyczne u dzieci z niedoborem hormonu wzrostu obejmują pomiar surowicy insulinopodobnego czynnika wzrost-1 i wieku kostnego. Opóźnienie wieku kostnego najbardziej widoczne jest u dzieci z niskim poziomem IGF-1. Jeśli poziom hormonu wzrostu u pacjenta jest prawidłowy to następnym krokiem powinno być wykonanie testów prowokacyjnych [11, 23]. 5.2.2. FSH/LH Wskazane jest wykonanie pomiaru stężenia hormonów gonadotropowych zarówno u dorosłych, u których niedobory LH/FSH są najczęstszym zaburzeniem endokrynologicznym, jak i u dzieci, u których ze względu na ograniczenia czułości metod diagnostycznych niedobór może nie zostać rozpoznany. Celem włączenia oraz monitorowania leczenia wskazane jest wykonanie RTG nadgarstka ręki niedominującej [11]. 26 Czaszkogardlak – wyzwanie dla każdego specjalisty 5.2.3. TSH W oznaczeniach uwagę zwraca nieproporcjonalnie niskie stężenie TSH przy niskim poziomie T4 i fT4. Choć część pacjentów wykazuje niski poziom wolnej tyroksyny i lekko podwyższone TSH (stopień podwyższenia TSH jest znacznie niższy niż deficyt fT4) wykazano iż jest to wynik zmniejszonej aktywności biologicznej TSH [11,24]. Należy zwrócić szczególną uwagę na TSH u dzieci do drugiego roku życia, ponieważ zaburzenia poziomu hormonu mogą powodować opóźnienie umysłowe. 5.2.4. ACTH Rozpoznanie niedoboru ACTH następuje poprzez wykazanie obniżonych wartości kortyzolu w osoczu o godzinie 8 rano w połączeniu z prawidłowym poziomem ACTH. W przypadkach granicznych następnym krokiem powinno być wykonanie testu z wywołaniem hipoglikemii, z użyciem insuliny, za wyjątkiem pacjentów z epizodem drgawek w przeszłości. Test stymulacji ACTH z użyciem niskich dawek może być pomocny w diagnostyce niedoboru ACTH, ale jego wykonywanie jest kontrowersyjne . Wartość szczytowa kortyzolu mniejsza lub równa 18 ug/dl jest uważana za cechę niedoboru ACTH [11]. 5.2.5. ADH Ocena stanu poziomu elektrolitów u pacjentów czaszkogardlakiem jest ważna, ponieważ odpowiednie leczenie moczówki prostej może zminimalizować zarówno zachorowalność jak i śmiertelność. Wskazane jest wykonanie oznaczania ciężaru właściwego moczu, osmolalności moczu i surowicy, stężenia elektrolitów w surowicy. 5.3. Badanie okulistyczne Ocenie podlega ostrość wzroku, pole widzenia oraz tarcza nerwu wzrokowego, zarówno względem oceny ciśnienia śródczaszkowego jak i wykluczenia innych patologii niż czaszkogardlak. 5.4. Badanie histopatologiczne Komórki nowotworowe są niewielkich rozmiarów i mają wygląd komórek nabłonkowych. Powstają liczne mikrotorbielowate przestrzenie, dodatkowo zwapniałe struktury, fibroblasty, komórki olbrzymie, a czasem także złogi cholesterolu [3]. Wyróżnia się dwa główne podtypy histopatologiczne: szkliwiakowaty (adamantinomatous) oraz brodawkowaty (papillary) [1]. 27 Weronika Bulska, Łukasz B. Pilarz, Marta Grabowska 6. Leczenie Pomimo znacznego postępu, jaki dokonał się w ostatnich latach na polu diagnostyki związanego ze wzrostem dostępności do nowoczesnych metod wizualizacji, a także leczenia czaszkogardlaka, jego wyniki wciąż nie są zadowalające. Głównymi metodami stosowanymi w terapii guza jest leczenie operacyjne i radioterapia, a także choć rzadziej stosowana i o mniejszym znaczeniu terapeutycznym- chemioterapia. 6.1. Leczenie chirurgiczne Leczenie operacyjne obejmuje dwie główne formy terapii czaszkogardlaka: pierwotne radykalne leczenie chirurgiczne oraz niecałkowitą resekcje guza z kontynuacją leczenia poprzez radioterapię [25]. Celem zabiegu operacyjnego guza jest uzyskanie wyleczenia przy jak najniższym odsetku uszkodzeń neurologicznych wywołanych postępowaniem terapeutycznym. Ponieważ czaszkogardlak najczęściej wywodzi się z szypuły przysadki, usunięcie guza prawie zawsze oznacza uszkodzenie w mniejszym lub większym stopniu tej struktury. Podczas wykonywania zabiegu wg zebranej literatury należy zwrócić szczególną uwagę na minimalizacje lub jeśli to możliwe uniknięcie uszkodzenia szypuły przysadki, a także niedopuszczenie do powstania zaburzeń ukrwienia skrzyżowania nerwów wzrokowych. Mniej radykalny charakter zabiegu mający na celu zmniejszenie ryzyka uszkodzenia przysadki związany jest ze zwiększonym ryzykiem nawrotów [5]. Całkowita resekcja jest możliwa u 70-90% pacjentów, 60-80% z nich pozostaje po tym leczeniu bez cech progresji. Jednak w przypadku niecałkowitej resekcji do wznowy dochodzi u blisko 70% chorych [26]. Ryzyko wystąpienia jatrogennych uszkodzeń powinno się rozważać, biorąc pod uwagę wystąpienie powikłań wynikających z postępu choroby samej w sobie. Celem leczenia chirurgicznego jest: odbarczenie nerwów wzrokowych, skrzyżowania wzrokowego i podwzgórza, a także układu komorowego w przypadku wystąpienia wodogłowia wewnętrznego. Guz pierwotny może być usunięty z różnych dostępów zależnych od umiejscowienia i rozległości nowotworu. Może to być metoda kraniotomii otwartej lub metoda z dostępu przez zatokę klinową. Drugi z wymienionych częściej jest możliwy do uzyskania u osób dorosłych niż u pacjentów pediatrycznych [27]. Większość autorów zgadza się, iż u pacjentów pediatrycznych lepszą metodą jest całkowita resekcja, ponieważ zmniejsza ryzyko występowania konieczności ponownego wykonania zabiegu oraz radioterapii i związanych z nią powikłań, co jest szczególnie ważne u młodszych pacjentów. 28 Czaszkogardlak – wyzwanie dla każdego specjalisty 6.2. Radioterapia W opinii wielu autorów radioterapia powinna być zastosowana bezpośrednio po nieradykalnej operacji lub po biopsji. Jest to również metoda z wyboru w przypadku wznowy po wcześniejszym leczeniu chirurgicznym. Dawki stosowane w tym rozpoznaniu mieszczą się w zakresie 45-55 Gy. Pięcioletnie przeżycie wynosi ponad 80% [25]. Metoda ta jest obarczona ryzykiem wystąpienia powikłań takich jak niewydolność przysadki czy neuropatia nerwu wzrokowego. Ryzyko jest wyższe u dzieci, jednak w związku z wysoką skutecznością radioterapii w leczeniu craniopharyngioma u dzieci, prowadzone są badania nad wpływem radioterapii na wzrost, rozwój intelektualny oraz umiejętności radzenia sobie w szkole i domu. Zgodnie z obserwacjami M. Chojnackiej i wsp. [26] ograniczony zabieg operacyjny w skojarzeniu z radioterapią powoduje mniejsze lub porównywalne uszkodzenia jak operacja radykalna. 6.3. Chemioterapia Część guzów można leczyć poprzez bezpośrednie podawanie związków cytotoksycznych do zmiany nowotworowej. Zastosowanie znajdują tutaj izotopy promieniotwórcze (takie jak fosfor-32 [28], itr–99 [29] i Ren-186 [19, 30]), interferon α oraz bleomycyna . Dwa ostatnie są wprowadzane przez zbiornik (zbiornik Ommaya lub Rickham) umieszczony stereotaktycznie w torbieli. Leczenie to będąc ograniczane prze liczbę ognisk przez niektórych autorów jest zalecane do leczenia nawrotów choroby. Metoda ta nie jest również pozbawiona ryzyka wystąpienia powikłań, do których należy: pogorszenie widzenia, negatywny wpływ na działanie układu hormonalnego, drgawki, chemiczne lub septyczne zapalenie opon mózgowych oraz pogorszenie zdolności neuropoznawczych. Bleomycyna używana od wielu lat i mająca wskaźnik odpowiedzi na poziomie 29%-67% [31, 32] rzadko wywołuje skutki uboczne. Jej stosowanie stanowi jednak zagrożenie związane z wynaczynieniem krwi do tkanki mózgowej, co w konsekwencji może prowadzić do wystąpienia drgawek, deficytów neurologicznych, ślepoty, a nawet śmierci . Działanie interferonu uważanego za nieneurotoksyczny oparte jest na jego wpływie na komórki nabłonka płaskiego, w efekcie dochodzi do redukcji wielkości guza nawet u 80% pacjentów [33]. Występujące skutki uboczne są raczej łagodne takie jak: bóle stawów, zmęczenie, gorączka lub zaburzenia w zakresie wydzielania hormonów, których częstość jest jednak mniejsza niż w przypadku innych metod leczenia [34]. 29 Weronika Bulska, Łukasz B. Pilarz, Marta Grabowska 6.4. Leczenie zaburzeń towarzyszących craniopharyngioma 6.4.1. Somatotropina W przypadku niedoboru wzrostu leczenie GH jest wskazane dla uzyskania wzrostu należnego (catch-up) w odniesieniu do dzieci po całkowitym usunięciu guza, gdyż wyniki takiego leczenia u osób z pozostałością nowotworu są niejasne [11]. 6.4.2. Gonadotropiny Pacjenci z niedoborem w zakresie gonadotropin wymagają terapii hormonalnej w wieku odpowiednim do dojrzewania płciowego. Moment rozpoczęcia hormonów płciowych powinien być dostosowany indywidualnie, aby zoptymalizować zarówno wzrost jak i rozwój. Steroidy płciowe (szczególnie estrogeny u obu płci ) przyczyniają się do zarastania ośrodków wzrostu kości. Zatem podawanie hormonów płciowych u niskich pacjentów pooperacyjnych może spowodować zahamowanie wzrostu, zanim odpowiedni wzrost zostanie osiągnięty. Pomimo niekorzystnego wpływu na wzrost ostateczny, niektórzy pacjenci wolą, aby kontynuować indukcję dojrzewania. Efekt leczenia estrogenów na zarastanie ośrodków wzrostu kości można monitorować przez okresowe określanie wieku kości. Oceny tej dokonuje się poprzez wykonanie RTG nadgarstka ręki niedominującej [11]. 6.4.3. TSH W leczeniu niedoczynności przysadki mózgowej lub podwzgórza stosowana jest syntetyczna postać L-T4 lewotyroksyny sodowej, ordynowana raz dziennie, doustnie. Dawka dożylna powinna stanowić połowę do 3/4 dawki doustnej. U pacjentów z niedoborami zarówno TSH jak i ACTH, podanie hydrokortyzonu powinno poprzedzać leczenie L-tyroksyną, ponieważ L-tyroksyna zwiększa klirens metaboliczny glikokortykosteroidów i może doprowadzić do przełomu nadnerczowego. 6.4.4. ACTH Niepowodzenie w leczeniu niedoboru ACTH może okazać się w skutkach śmiertelne. Niedobór ACTH może rozwinąć się podczas leczenia operacyjnego u pacjentów, którzy nie wykazywali takiego niedoboru w okresie przedoperacyjnym, dlatego u wszystkich pacjentów z czaszkogardlakiem powinny być stosowane glikokortykosteroidów bezpośrednio przed zabiegiem. Pacjenci otrzymujący deksametazon z powodów chirurgicznych nie wymagają dodatkowego zabezpieczenia, ponieważ te podawane dawki są znacznie 30 Czaszkogardlak – wyzwanie dla każdego specjalisty wyższe od dawek fizjologicznych. U dzieci małych dawka zastępcza wynosi 6 mg / m2 powierzchni ciała . U dzieci starszych i dorosłych dawka zastępcza wynosi 9 mg / m2[11]. 7. Różnicowanie Diagnostykę różnicową można podzielić na 4 grupy: wady wrodzone, nowotwory, zapalenia, malformacje naczyniowe. 7.1. Wady wrodzone W różnicowaniu należy uwzględnić torbiel pajęczynówki i torbiel kieszonki Rathke‟go. 7.2. Inne nowotwory Różnicowanie z guzem przysadki, przerzutami nowotworowymi, oponiakiem i guzem podwzgórza, i drogi wzrokowej oraz potworniakiem. 7.3. Zapalenia Należą tutaj: ziarniniak eozynofilowy, limfocytarne zapalenie przysadki mózgowej, gruźlica, kiła, sarkoidoza. 7.4. Malformacje naczyniowe W diagnostyce różnicowej w tej grupie uwzględniane są: tętniaki tętnicy szyjnej wewnętrznej i tętnicy łączącej przedniej oraz malformacje tętniczożylne [3]. 8. Podsumowanie Czaszkogardlak jest rzadko występującym guzem zarówno u dzieci jak i u dorosłych. Pomimo kazuistycznego występowania czaszkogardlaka należy pamiętać o jego szeregu objawach z różnych dziedzin specjalizacyjnych. Craniopharyngioma zasługuje na uwagę każdego lekarza, który może spotkać się z nowotworem w czasie diagnostyki i leczenia. Wiedza z zakresu objawów i rozpoznania guza może przyspieszyć proces diagnostyczny i wpłynąć na pozytywne rokowanie wobec zdrowia i życia pacjenta. 31 Weronika Bulska, Łukasz B. Pilarz, Marta Grabowska Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Krysiak R., Okopień B., Szkróbka W.Etiologia, obraz histopatologiczny i objawy kliniczneczaszkogardlaka, Polski Merkuriusz Lekarski, 25 (2008), s.175-178 Guaraldi F., Prencipe N., Giacomo V. i wsp. Association of craniopharyngioma and pituitary adenoma, Endocrine, 44 (2013), s. 59-65 Garnett M. R, Puget S., Grill J. i wsp. Craniopharyngioma, Orphanet Journal of Rare Diseases, 2(2007), s. 18 Haupt R., Magnani C., Pavanello M. i wsp. Epidemiological aspects of craniopharyngioma, The Journal of Pediatric Endocrinology and Matebolism, 19(2006), s. 289-93. Karavitaki N., Wass J.A. Non-adenomatous pituitary tumours, Best Practice and Research Clinical Endocrinology and Metabolism, 23 (2009), s. 651-665 Rucka E., Wędrychowicz A., Zygmunt-Górska A. i wsp. Clinical symptoms at the diagnosis of the craniopharyngioma, Pediatric Endocrinology, Diabetes and Metabolism, 18 (2012), s. 58-62 Hadi S. R.A., Kassim S., Saini S. M. Psychosis post craniotomy for craniopharyngioma, ASEAN Journal of Psychiatry, 14 (2013) Bellhouse J., Holland A., Pickard J. Psychiatric, cognitive and behavioural outcomes following craniopharyngioma and pituitary adenoma surgery, British Journal of Neurosurgery, 17(2003), s. 319-26 Elwatidy S.M. Adult craniopharyngioma. Clinical, radiological presentation and outcome of management, Neurosciences (Riyadh), 9(2004), s. 271-5 Lopez-Serna R., Gómez-Amador J.L., Barqes-Coll J. i wsp. Treatment of craniopharyngioma in adults: systematic analysis of a 25-year experience, Archives of Medical Research, 43(2012), s.347-55 Halac, Zimmerman D. Endocrine manifestations of craniopharyngioma, Child‟s Nervous System, 21(2005), s. 640-8 Vries L., Lazar L., Phillip M Craniopharyngioma: presentation and endocrine sequelae in 36 children, Journal of Pediatric Endocrinology and Metabolism, 16(2003), s.110-703 Thomsett M.J., Conte F.A., Kaplan S.L. Endocrine and neurologic outcome in childhood craniopharyngioma: review of effect of treatment in 42 patients, The Journal of Pediatrics, 97(1980), s. 728-35 Lyen K.R., Grant D.B. Endocrine function, morbidity, and mortality after surgery for craniopharyngioma, Archives of Disease in Childhood, 57(1982), s. 837-841 Sklar C.A. Craniopharyngioma: endocrine abnormalities at presentation, Pediatric Neurosurgery, 21 (1994), s. 18-20 Pajas M., Lucas T., Garcia- Uria J. Hypothalamic–pituitary dysfunction in patients with craniopharyngioma, Clinical Endocrinology (Oxford), 42 (1995), s. 467-473 Banna M., Hoare R.D., Stanley P. i wsp. Craniopharyngioma in children, Journal of Pediatrics 83(1973), s. 781-785 Podoshin L., Rolan L., Altman M.M. i wsp. Pharyngeal craniopharyngioma, The Journal of Laryngology and Otology, 84(1970), s. 93-99 32 Czaszkogardlak – wyzwanie dla każdego specjalisty 19. Julow J.V. Intracystic irradiation for craniopharyngiomas, Pituitary, 16(2013), s. 34-45 20. Jo K.W., Shin H.J., Kong D.S. i wsp. Treatment outcomes of pediatric craniopharyngioma: a 15-year retrospective reviewof 35 cases, Journal of Korean Neurosurgical Society, 52(2012), s.37-41 21. Clark A.J., Cage T.A., Aranda D. Treatment-related morbidity and the management of pediatric craniopharyngioma: a systematic review, Journal of Neurosurgery: Pediatrics, 10 (2012), s.293-301 22. Jung T.Y., Jung S., Moon K.S. Endocrinological outcomes of pediatricscraniopharyngiomas with anatomical pituitary stalk preservation: preliminary study, Pediatric Neurosurgery, 46 (2010), s.205-12 23. Weinzimer S.A., Homan S.A., Ferry R.J. i wsp. Serum IGF-I and IGFBP-3 concentrations do not accurately predict growth hormone deficiency in children with brain tumours, Clinical Endocrinology (Oxford), 51(1999), s. 339-45 24. Persani L., Ferretti E., Borgato S. i wsp. Circulating thyrotropin bioactivity in sporadic central hypothyroidism, The Journal of Clinical Endocrinolgy and Metabolism, 85 (2000), s.3631-3635 25. Krysiak R., Szkróbka W., Okopień B.Rozpoznawanie i leczenie czaszkogardlaka, Polski Merkuriusz Lekarski, 32(2012), s.182-186 26. Chojnacka M., Skowrońska-Gardas A. Aktualne poglądy na temat zastosowania radioterapii w nowotworach ośrodkowego układu nerwowego u dzieci,The Journal of Oncology 56 (2006) 27. Tomita T., Bowman R.M. Craniopharyngiomas in children: surgical experience at Children's Memorial Hospital, Child‟s Nervous System, 21 (2005), s. 729-746 28. Barriger R.B., Chang A., Lo S.S. Phosphorus-32 therapy for cystic craniopharyngiomas, Radiotherapy and Oncology, 98 (2011), s. 207-212 29. Blackburn T. P., Doughty D., Plowman P.N. Stereotactic intracavitary therapy of recurrent cystic craniopharyngioma by instillation of 90yttrium, British Journal of Neurosurgery, 13(1999), s. 359-365 30. Derrey S., Blond S., Reyns N. i wsp. Management of cystic craniopharyngiomas with stereotactic endocavitary irradiation using colloidal 186Re: a retrospective study of 48 consecutive patients, Neurosurgery, 63(2008), s. 1045-1053 31. Muller H.L. Childhood craniopharyngioma–current concepts in diagnosis, therapy and follow-up, Nature Reviews Endocrinology, 6 (2010), s. 609-618 32. Mottolese C., Szathma ri A., Berlier P. i wsp. Craniopharyngiomas: our experience in Lyon, Child‟s Nervous System, 21 (2005), s. 790-798 33. Bartels U., Laperriere N., Bouffet E. i wsp. Intracystic therapies for cystic craniopharyngioma in childhood, Frontiers in Endocrinology (Lausanne), 3(2012), s. 39 34. Bailey S., Parkes J. Intracystic interferon therapy in childhood craniopharyngioma: who, when and how?, Clinical Endocrinology (Oxford), 82 (2015), s. 29-34 33 Weronika Bulska, Łukasz B. Pilarz, Marta Grabowska Czaszkogardlak – wyzwanie dla każdego specjalisty Streszczenie Czaszkogardlak (craniopharyngioma) jest nowotworem łagodnym wywodzącym się z nabłonka płaskiego pierwotnej kieszonki Rathkego i stanowi 5-10% wszystkich guzów mózgu występujących u dzieci oraz 1-4 % nowotworów mózgu u dorosłych. Na temat craniopharyngioma wiedza była niewielka do końca XIX wieku. Czaszkogardlak został opisany po raz pierwszy w 1857 roku przez Friedricha Alberta von Zenkera. Jakob Erdheim w 1904 r. jako pierwszy przedstawił dokładne cechy histopatologiczne guza, stąd w nazewnictwie eponimicznym zakorzenił się termin guz Erdheima. Guz obecnie stanowi wyzwanie dla wielu specjalistów, gdyż powoduje wystąpienie zespołu objawów klinicznych nie tylko ze strony neurologicznej, ale także okulistycznej, endokrynologicznej, psychiatrycznej oraz otorynolaryngologicznej. Najczęstszy symptom świadczący o obecności craniopharyngoima to zaburzenie widzenia. Inne objawy to: nadciśnienie wewnątrzczaszkowe, zaburzenia psychiatryczne, opoźnienie rozwoju umysłowego, endokrynopatie, krwawienie z nosa, utarta słuchu, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Predylekcja do zachorowalności na craniopahryngioma ma rozkład bimodalny – dotyczy dzieci pomiędzy 5 a 14 rokiem życia a także osób dorosłych powyżej 65 r. ż. Nie wykazano różnic w częstości występowania guza pomiędzy kobietami a mężczyznami. Czaszkogardlak jest jednym z największych wyzwań operacyjnych guzów okołosiodłowych dla neurochirurgów. Stąd jego okołoi pooperacyjne zarządzanie jest źródłem wielu kontrowersji. Spory otaczają każdy aspekt tej jednostki chorobowej: od etiologii, patofizjologii, dostępów chirurgicznych po opiekę przedoperacyjną i terapię adiuwantową. Craniopharyngioma – a challenge for each specialist Abstract It is the same as polish abstract above. Just translate. If you use Google Translate be careful. In this chapter put your information how are the objectives achieved, what was the main method(s) used, what is the approach to the topic etc. Please put the information what are the main conclusions. What are the suggestions for future research? What practical implications are identified? (Styl: Streszczenie) Craniopharyngioma is a benign tumor derived from squamous epithelium of primary Rathke's pouch and covers 5-10% of all brain tumors occurring in children and 1-4% of brain tumors in adults. Knowledge of craniopharyngioma was low until the end of the nineteenth century. Craniopharyngioma was first described in 1857 by Friedrich Albert von Zenker. Jakob Erdheim in 1904 first presented detailed histopathological features of the tumor, hence the origin of the eponym tumor of Erdheim . At present this tumor is challenge for many professionals, because it causes the onset of clinical symptoms not only neurological, but also ophthalmic, endocrine, psychiatric and otorhinolaryngological. The most common symptom of tumor of Erdheim is blurred vision. Other symptoms include: intracranial hypertension, psychiatric disorders, mental retardation, endocrinopathies, epistaxis, hearing loss, inflammation of the meninges. A bimodal age distribution has been shown, with peak incidence rates in childhood-onset at 5-14 years and adult-onset craniopharyngioma over 65 years. There were no differences in tumor incidence between men and women. Craniopharyngioma is one of the biggest operational challenges for neurosurgeons. Hence the peri- and postoperative management is the source of much controversy. Disputes surround every aspect of this disease: etiology, pathophysiology, surgical approaches to caring for preoperative and adjuvant therapy. 34 Barbara Wyroba1 Limfangiogeneza w procesach nowotworowych 1. Wstęp Nowotwory są obecnie jedną z głównych przyczyn śmierci na świecie. Zgodnie z danymi Światowej Organizacji Zdrowia tylko w roku 2012 zdiagnozowano 14,1 mln przypadków nowotworów, a 8,2 miliona ludzi zmarło z przyczyn z nimi związanych. Szacuje się,że ilość nowych przypadków wzrośnie nawet o 70% w przeciągu następnych 20 lat [1]. Najczęściej jednak nie nowotwór pierwotny jest powodem zgonu, ale jego przerzuty do różnych organów. Metastaza komórek nowotworowych zachodzi poprzez układ krwionośny oraz limfatyczny, a obecność przerzutów w węzłach chłonnych stanowi jeden z najważniejszych wskaźników dotyczących prognoz przeżycia pacjenta [2]. Dlatego też poznanie roli, mechanizmów działania oraz funkcjonowania układu limfatycznego jest przedmiotem badań na całym świecie, a zahamowanie przerzutowania komórek nowotworowych zarówno przez układ limfatyczny jak i krwionośny, jednym z najważniejszych celów terapii antynowotworowych. 2. Budowa i funkcja układu limfatycznego Układ limfatyczny składa się z naczyń limfatycznych, którymi transportowana jest chłonka – płyn tkankowy wraz z komórkami immunologicznymi, zwłaszcza limfocytami, a także narządów limfatycznych: węzłów chłonnych,śledziony, migdałków i grudek chłonnych. Chłonka z tkanek, poprzez naczynia włosowate, transportowana jest układem limfatycznym do węzłów chłonnych gdzie jest filtrowana, a następnie łączy się z krwią. W przeciwieństwie do układu krwionośnego, układ limfatyczny jest otwarty, a transport zachodzi tylko w jednym kierunku, nie posiada on też centralnej pompy. Limfa przechodzi przez naczynia dzięki skurczom mięśni szkieletowych, a liczne zastawki w naczyniach limfatycznych uniemożliwiają cofanie się płynów. Funkcją układu limfatycznego jest ochrona organizmu przed zakażeniami oraz zachowywanie równowagi płynów ustrojowych [3, 4]. 1 [email protected], Zakład Biochemii Komórki, Wydział Biofizyki, Biochemii i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński 35 Barbara Wyroba Mimo iż o istnieniu naczyń limfatycznych wiadomo już od bardzo dawna, to dopiero w ostatnich dziesięcioleciach zaczęto dokładniej je badać. Było to wynikiem odkrycia specyficznych markerów naczyń limfatycznych (Tabela 1.) co umożliwiło odróżnienie ich od innych struktur komórkowych, a także komórek śródbłonka naczyń limfatycznych od krwionośnych. Pośród najważniejszych markerów naczyń limfatycznych wyróżnia się LYVE-1, podoplaninę czy neuropilinę 2 pełniacą funkcję koreceptora dla VEGFR-3, współuczestniczącą w wiązaniu VEGF-C. Tabela 1. Wybrane markery naczyń limfatycznych u człowieka Skrót 5‟NT CCL21 DSP D6 FOXC2 LYVE-1 Nrp2 PDPN Prox1 Vegfr-3 (Ftl-4) Pełna nazwa (angielska nazwa) 5‟-nukleotydaza (5‟-nucleotidase) chemokina 21 (chemokine ligand 21) desmoplakina (despoplakin) receptor chemokiny D6 (decoy chemokine receptor) czynnik transkrypcyjny z domeną forkhead (forkhead box transcription factor) receptor endocytozowy dla hialuronianu(hyaluronic acid endocytic receptor) neuropilina 2 (neuropilin2) podoplanina (podoplanin) czynnik transkrypcyjny typu homeobox pokrewny z Prospero-1 (prospero-related homeobox transcription factor 1) receptor 3 dla śródbłonkowego czynnika wzrostu (vascular endothelial growth factor receptor 3) Źródło: opracowano na podstawie [5, 6] 3. Limfangiogeneza Limfangiogeneza jest to proces tworzenia nowych naczyń limfatycznych zachodzący podczas embriogenezy. W warunkach fizjologicznych nie jest on obserwowany postnatalnie, jednak proces tworzenia i rozgałęziania już istniejących naczyń występuje podczas takich procesów chorobowych jak naprawa tkanek, stan zapalny czy wzrost nowotworów [7]. Proces limfangiogenezy jest powiązany z tworzeniem naczyń krwionośnych. Na oba te procesy działają silnie cytokiny z grupy czynników wzrostu śródbłonka naczyń. Wszystkie białka tej rodziny działają poprzez wiązane się do receptorów VEGFR, występujących na powierzchni komórek, co powoduje ich dimeryzację i aktywację. Limfangiogeneza wywołana jest przede wszystkim przez cytokiny VEGFC i -D działające przez receptor VEGFR-3 (Flt-4), obecny na komórkach śródbłonka naczyń chłonnych powodując ich rozwój i przebudowę. Natomiast głównym czynnikiem stymulującym rozwój naczyń 36 Limfangiogeneza w procesach nowotworowych krwionośnych jest VEGF-A łączący się z receptorem VEGFR-2, który występuje głównie na naczyniach krwionośnych. Badania udowadniają jednak, że VEGF-C i -D mają także powinowactwo do receptora VEGFR-2, przez co mogą indukować neowaskularyzację [7], a receptor VEGFR-3 występuje czasami na naczyniach kwionośnych [8]. Z kolei VEGF-A może odgrywać rolę w limfangiogenezie [9]. Innymi czynnikami wpływającymi na limfangiogenezę są:czynnik wzrostuhepatocytów (HGF), angiopoetyna 1 i 2 (Ang 1 i 2), czynnik wzrostu fibroblastów 1 i 2 (FGF 1 i 2), płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF) a także adrenomedullina (AND) oraz endotelina 1 (zebrane w [7, 10]). 4. Naczynia limfatyczne w nowotworach Przerzutowanie komórek nowotworowych zachodzi nie tylko przez naczynia krwionośne, ale też poprzez naczynia limfatyczne [11-13]. Układ limfatyczny służy do transportu komórek i posiada wiele cech zapewniających optymalne warunki ich przeżycia i aktywności. W porównaniu do naczyń krwionośnych charakteryzuje się mniejszą szybkością przepływu płynów w naczyniach, co redukuje naprężenie ścinające (WSS, wallshear stress)co ma znaczenie dla przeżywalności transportowanych komórek [14], a także bardzo wysokim stężeniem kwasu hialuronowego – czynnika o właściwościach ochronnych i pro- przeżyciowych dla komórek [15]. Dodatkowo, naczynia limfatyczne nie są szczelne, co ułatwia tworzenie przerzutów. Przerzutowanie drogą limfatyczną (wykryto przerzuty w węzłach chłonnych) stwierdzono w nowotworach piersi, prostaty, głowy i szyi czy u pacjentów z melanomą [16-20]. Nie jest do końca wyjaśnione, w jaki sposób komórki nowotworowe przemieszczają się do naczyń limfatycznych. Początkowo uważano, że jest to proces bierny, a komórki rosnącego guza, w momencie napotkania naczynia limfatycznego, mogą wykorzystać go do rozprzestrzeniania się [21]. Obecnie jednak badania wskazują, że pomiędzy komórkami śródbłonka naczyń limfatycznych, a komórkami nowo-tworowymi zachodzi szereg złożonych oddziaływań [22]. W wielu badaniach na modelach zwierzęcych, a także histologicznych badaniach ludzkich tkanek potwierdzono, iż naczynia wokół guza, pod wpływem czynników pro-limfangiogennych, przechodzą serię morfologicznych zmian, a przede wszystkim ich średnica ulegaja powiększeniu – poprzez proliferację komórek śródbłonka limfatycznego. Zwiększa się przez to powierzchnia naczyń mająca kontakt z komórkami nowotworowymi, co może ułatwiać ich migrację (zabrane w [23]). Limfangiogeneza może zachodzić zarówno wokół jak i w guzie, jednak powstałe naczynia, a szczególnie te wewnątrz nowotworu, często są zapadnięte lub niedrożne [7]. W badania nad komórkami czerniaka B16F10 37 Barbara Wyroba z nadekspresją VEGF-C stwierdzono, iż z wszystkich powstałych naczyń tylko 40% spośród tych wokół guza, było funkcjonalne [24]. Co więcej, niektóre badania wskazują iż limfangiogeneza związana z nowotworem nie jest wcale potrzebna do przerzutowania komórek drogą naczyń limfatycznych, jakkolwiek nie zaprzeczają możliwości, iż takie naczynia mogą promować i ułatwiać metastazę [25-26]. Zdania dotyczące tego zjawiska są jednak podzielone, co opisano w rozdziale poniżej. 5. Rola limfangiogenezy w przerzutowaniu nowotworów 5.1. Rola białek VEGF-C i -D Limfangiogeneza w nowotworach stymulowana jest przez czynniki wzrostu naczyń limfatycznych produkowanych i wydzielanych przez same komórki nowotworowe, ale także komórki zrębu, makrofagi infiltrujące guz oraz aktywowane płytki krwi [27-29]. Szczególne znaczenie podczas procesu nowotworowej limfangiogenezy mają VEGF-C i -D, których nadekspresja znacząco zwiększa tworzenie się naczyń limfatycznych, ich wielkość i częstość występowania przerzutów w węzłach chłonnych w wielu typach nowotworów [13, 30-33]. Dodatkowo, w badaniach w których używano zewnątrzkomórkowych domen receptora VEGFR-3 wyłapujących VEGF-C i -D lub przeciwciał neutralizujących VEGFR-3, stwierdzono zmniejszenie gęstości naczyń limfatycznych wokół guza, a także ilość przerzutów [34-37]. Ostatnie badania wskazują również udział neuropiliny 2 w limfangiogenezie związanej z nowotworzeniem. Białko to ulega ekspresji podczas embriogenezy, ale nie ma go na wykształconych prawidłowych naczyniach limfatycznych. Fakt, iż zaobserwowano ten marker na nowotworowych naczyniach limfatycznych czyni z niego interesujący cel terapii przeciwlimfangiogennej [38, 39]. 5.2. Rola chemokin Chemokiny to cytokiny o właściwościach chemotaktycznych, wytwarzane przez leukocyty i komórki tkanek. Substancje te powodują aktywację imigrację komórek układu odpornościowego do miejsc, w których toczy się proces zapalny [40]. Komórki nowotworowe, poprzez ekspresję na swojej powierzchni receptorów dla chemokin, przedostają się do naczyń i wykorzystują układ limfatyczny do migracji do węzłów chłonnych i dalszych organów. Przykładem jest receptor CXCR4, który jest ligandem dla chemokiny 12 (CXCL12). CXCR4 występuje na komórkach dendrytycznych, które „wabione” są do naczyń limfatycznych produkujących CXCL12. Obecność tego receptora stwierdzono nie tylko na powierzchni komórek immunologicznych, ale także na wielu typach 38 Limfangiogeneza w procesach nowotworowych komórek nowotworowych. Podejrzewa się, że jego ekspresja związana jest z występującą w guzie hipoksją, jednak mechanizm tego zjawiska nie został jeszcze wyjaśniony. Z kolei naczynia limfatyczne związane z guzem wykazują większą niż prawidłowe naczynia ekspresję CXCL12. Jest to argument, iż przerzutowanie nowotworów przez naczynia limfatyczne jest procesem aktywnym, a nie jak wcześniej podejrzewano – biernym. Innym przykładem osi sygnałowej chemokin i ich receptorów odgrywającej rolę w metastazie przez naczynia limfatyczne są chemokina 19 i 21 (CXCL19 i 21) i receptor CCR7. W prawidłowych warunkach receptor ten występuje na części limfocytów T i B, a także zaktywowanych komórkach dendrytycznych i powoduje kierowanie się tych komórek do węzłów chłonnych, gdzie produkowane są chemokiny CXCL19 i 21.Ekspresję CCR7 stwierdzono na komórkach nowotworowych raka szyjki macicy, okrężnicy, żołądka, piersi, raka przełyku, płuc i prostaty. Przy tych nowotworach stwierdzono także występowanie częstych przerzutów w węzłach chłonnych [7, 23]. 6. Naczynia limfatyczne jako cel terapii Wiele badań wykazało, że terapie mające na celu hamowanie tworzenia i niszczenie nowotworowych naczyń limfatycznych mogą znacząco zahamować przerzutowanie komórek nowotworowych. Pośród takich terapii już wykorzystywanych w leczeniu, a także będących jeszcze w badaniach przedklinicznych, można wymienić: inhibitory kinazy tyrozynowej VEGFR, przeciwciała monoklinalne blokujące lub neutralizujące czynniki wzrostu naczyń i ich receptory (Tabela 2.) [23]. Wiele badań wykonywanych było także na modelach mysich, gdzie stosując wymienione wyżej metody w różnych rodzajach nowotworów stwierdzono spowolnienie limfangiogenezy, a także zmniejszenie lub zahamowanie powstawania przerzutów w węzłach chłonnych i płucach [37]. 39 Barbara Wyroba Tabela 2. Rodzaje terapii przeciw limfangiogennych Rodzaj terapii Przeciwciała monoklonalne przeciw VEGF-C Przeciwciała monoklonalne przeciw VEGF-D Przeciwciała monoklonalne przeciw VEGFR-3 Przeciwciała monoklonalne przeciw NRP-2 Rozpuszczalny receptor VEGFR-3 Nazwa leku VGX-100 VD1, cVE199 hF4-3C5 Anti-NPR2B VGX-300 Rozpuszczalny receptor VEGFR-2 sVEGFR2 Inhibitor kinazy białkowej VEGFR-3 Sorafenib, Pazopanib, Sunitynib, Axitinib Regorafenib Inhibitor kinazy białkowej VEGFR-3 i Tie-2 Inhibitor kinazy białkowej VEGFR-3 i Tie-2 Przeciwciało monoklonalne neutralizujące angiopoetynę 1 i 2 CEP-11981 AMG-386 Faza badań I faza badań klinicznych Badania przedkliniczne I faza badań klinicznych Badania przedkliniczne Badania przedkliniczne Badania przedkliniczne Stosowane w leczeniu Stosowane w leczeniu I faza badań klinicznych II faza badań klinicznych Źródło: Opracowano na podstawie 23 7. Podsumowanie Rola jaką odgrywają naczynia limfatyczne w progresji nowotworu i jego przerzutowaniu nie jest w pełni poznana. Mimo, iż obecnie dużo łatwiej badać naczynia limfatyczne dzięki odkrytym specyficznym markerom, to wciąż trudno odpowiedzieć na pytania dotyczące roli naczyń wewnątrz guza i otaczających nowotwór. Ich funkcja i znaczenie nie są jasne, nie do końca zbadane zostały mechanizmy warunkujące migrację komórek nowotworowych przez naczynia limfatyczne do węzłów chłonnych, a następnie do dalszych organów. Badania nad limfangiogenezą związaną z nowotworami pozwoliły na stworzenie nowych terapii mających na celu ograniczenie przerzutowania komórek nowotworowych. W chwili obecnej, wyniki tych terapii nie są jednak zadowalające. Dlatego też badania nad procesami związanymi z tworzeniem się naczyń limfatycznych i metastazą komórek nowotworowych są bardzo potrzebne i ważne. Odkrycie nowych potencjalnych celów terapii, a także zwiększanie specyficzności leków, udoskonalenie sposobu ich dostarczania, specyficzności i redukcja działań niepożądanych leków, to zadania jakie czekają na naukowców w najbliższych latach. 40 Limfangiogeneza w procesach nowotworowych Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. World Cancer Report 2014 - WHO - OMS. (IARC Nonserial Publication, 2014) Tuttle T. M. Technical advances in sentinel lymph node biopsy for breast cancer.Am. Surg.70, 407-13 (2004) Hall J. E Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology 262–276 (Elsevier Saunders, 2010) Swartz M. A. & Skobe M. Lymphatic function, lymphangiogenesis, and cancer metastasis.Microsc. Res. Tech.55, 92-9 (2001) Baluk, P. & McDonald, D. M. Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann. N. Y. Acad. Sci.1131, 1-12 (2008) Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E. & Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat. Rev. Cancer2, 573-83 (2002) Christiansen, A. & Detmar, M. Lymphangiogenesis and cancer.Genes Cancer2, 1146-58 (2011) Petrova T. V et al.VEGFR-3 expression is restricted to blood and lymphatic vessels in solid tumors.Cancer Cell13, 554-6 (2008) Hirakawa S. et al. VEGF-A induces tumor and sentinel lymph node lymphangiogenesis and promotes lymphatic metastasis.J. Exp. Med.201, 1089-99 (2005) Da M.-X., Wu, Z. & Tian, H.-W. Tumor lymphangiogenesis and lymphangiogenic growth factors.Arch. Med. Res.39, 365-72 (2008) Van der Auwera I. et al.Tumor lymphangiogenesis in inflammatory breast carcinoma: a histomorphometric study.Clin. Cancer Res.11, 7637-42 (2005) Dadras S. S. et al.Tumor lymphangiogenesis: a novel prognostic indicator for cutaneous melanoma metastasis and survival.Am. J. Pathol.162, 1951-60 (2003) Hoshida T. et al.Imaging steps of lymphatic metastasis reveals that vascular endothelial growth factor-C increases metastasis by increasing delivery of cancer cells to lymph nodes: therapeutic implications.Cancer Res.66, 8065-75 (2006) Shields J. D. & Swartz M. A. w Lymphangiogenesis in Cancer Metastasis 231-243 (Springer Science & Business Media, 2009), <https://books.google.com/books?id=oIIB9NIAwFoC&pgis=1> Laurent T. C. & Fraser J. R. Hyaluronan. FASEB J.6, 2397-404 (1992) Schoppmann S. F., Horvat, R. & Birner, P.Lymphatic vessels and lymphangiogenesis in female cancer: mechanisms, clinical impact and possible implications for anti-lymphangiogenic therapies (Review). Oncol. Rep.9, 455-60 Skobe M. et al.Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.Nat. Med.7, 192-8 (2001) Jennbacken K., Vallbo C., Wang W. & Damber J.-E. Expression of vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) and VEGF receptor-3 in human prostate cancer is associated with regional lymph node metastasis. Prostate65, 110-6 (2005) Beasley N. J. P. et al.Intratumoral lymphangiogenesis and lymph node metastasis in head and neck cancer.Cancer Res.62, 1315-20 (2002) 41 Barbara Wyroba 20. Dadras S. S. et al. Tumor lymphangiogenesis predicts melanoma metastasis to sentinel lymph nodes.Mod. Pathol.18, 1232-42 (2005) 21. Pepper M. S. Lymphangiogenesis and tumor metastasis: myth or reality?Clin. Cancer Res.7, 462-8 (2001) 22. Qian F., Hanahan, D. & Weissman, I. L.L-selectin can facilitate metastasis to lymph nodes in a transgenic mouse model of carcinogenesis.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.98, 3976-81 (2001) 23. Stacker S. A. et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat. Rev. Cancer14, 159-72 (2014) 24. Isaka N., Padera, T. P., Hagendoorn, J., Fukumura, D. & Jain, R. K. Peritumor lymphatics induced by vascular endothelial growth factor-C exhibit abnormal function.Cancer Res.64, 4400-4 (2004) 25. Wong S. Y. et al.Tumor-secreted vascular endothelial growth factor-C is necessary for prostate cancer lymphangiogenesis, but lymphangiogenesis is unnecessary for lymph node metastasis.Cancer Res.65, 9789-98 (2005) 26. Padera T. P. et al.Lymphatic metastasis in the absence of functional intratumor lymphatics. Science296, 1883-6 (2002) 27. Schoppmann S. F. et al.VEGF-C expressing tumor-associated macrophages in lymph node positive breast cancer: impact on lymphangiogenesis and survival. Surgery139, 839-46 (2006) 28. Mohammed R. A. A. et al.Prognostic significance of vascular endothelial cell growth factors -A, -C and -D in breast cancer and their relationship with angio- and lymphangiogenesis. Br. J. Cancer96, 1092-100 (2007) 29. Neuchrist C. et al.Vascular endothelial growth factor C and vascular endothelial growth factor receptor 3 expression in squamous cell carcinomas of the head and neck. Head Neck25, 464-74 (2003) 30. Karpanen T. et al.Vascular endothelial growth factor C promotes tumor lymphangiogenesis and intralymphatic tumor growth.Cancer Res.61, 1786-90 (2001) 31. Stacker S. A. et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat. Med.7, 186-91 (2001) 32. Mandriota S. J. et al.Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis.EMBO J.20, 672-82 (2001) 33. Harrell M. I., Iritani, B. M. & Ruddell, A. Tumor-induced sentinel lymph node lymphangiogenesis and increased lymph flow precede melanoma metastasis.Am. J. Pathol.170, 774-86 (2007) 34. Roberts N. et al.Inhibition of VEGFR-3 activation with the antagonistic antibody more potently suppresses lymph node and distant metastases than inactivation of VEGFR-2. Cancer Res.66, 2650-7 (2006) 35. Shimizu K. et al.Suppression of VEGFR-3 signaling inhibits lymph node metastasis in gastric cancer.Cancer Sci.95, 328-33 (2004) 36. He Y. et al.Suppression of tumor lymphangiogenesis and lymph node metastasis by blocking vascular endothelial growth factor receptor 3 signaling.J. Natl. Cancer Inst.94, 819-25 (2002) 37. Duong T., Koopman, P. & Francois, M. Tumor lymphangiogenesis as a potential therapeutic target. J. Oncol.2012, 204946 (2012) 42 Limfangiogeneza w procesach nowotworowych 38. Caunt M. et al.Blocking neuropilin-2 function inhibits tumor cell metastasis. Cancer Cell13, 331-42 (2008) 39. Hirakawa S. et al.Nodal lymphangiogenesis and metastasis: Role of tumorinduced lymphatic vessel activation in extramammary Paget’s disease. Am. J. Pathol.175, 2235-48 (2009) 40. Borish L. C. & Steinke, J. W. 2. Cytokines and chemokines. J. Allergy Clin. Immunol.111, S460-75 (2003) Limfangiogeneza w procesach nowotworowych Streszczenie Nowotwory są obecnie jedną z głównych przyczyn śmierci na świecie. Często jednak nie sam nowotwór pierwotny jest powodem zgonu, ale jego przerzuty do różnych organów. Obecnie opracowuje się terapie antynowotworowe, które mają na celu nie tylko ograniczać wzrost nowotworu, ale zahamować i ograniczyć proces metastazy. Przerzutowanie komórek nowotworowych zachodzi poprzez układ krwionośny oraz limfatyczny, dlatego bardzo ważne jest poznanie mechanizmów powstawania naczyń limfatycznych wokół i w obrębie guza, a także mechanizmów kierujących migracją komórek nowotworowych do ich światła. Ważne jest także scharakteryzowanie białek na powierzchni śródbłonka naczyń, które mogłyby stanowić potencjalny cel terapii przeciwnowotworowej. Limfangiogeneza towarzysząca rozwojowi nowotworu zachodzi pod wpływem czynników prolimfangiogennych takich jak VEGF-C i -D wydzielanych przez same komórki nowotworowe, ale także komórki zrębu, czy komórki immunologiczne. Mimo, że nie wszystkie naczynia limfatyczne, powstałe podczas wzrostu guza, wydają się funkcjonalne, to wiele badań potwierdza związek między gęstością naczyń limfatycznych oraz stężeniem VEGF-C i -D, a ilością przerzutów w węzłach chłonnych i innych organach. Lymphangiogenesis and cancer Abstract Cancer is the leading cause of morbidity and mortality worldwide, mostly due to metastatic disease. Therefore, it is crucial to design and develop treatments that would not only suppress tumor growth, but also inhibit the cancer metastasis. It is well established that tumor cells utilize either blood- or lymphatic vessels to migrate to other organs, but there are still many questions regarding the biology of metastasis. Identification of molecular mechanisms and factors involved in this process and detection and characterization of new molecular targets on the surface of lymphatic endothelium can lead to design of novel therapeutics for preventing metastatic disease. The key mediators of lymphangiogenesis are the members of the VEGF family of growth factors, VEGF-C and -D, produced by tumor, stromal, and immune cells. Although it is not proved that metastasis requires new lymphatic vessel formation, it is well documented that the high levels of VEGF-C and-D correlate with the density of lymphatic vessels, and increased dissemination of tumor cells to regional lymph nodes and other organs. 43 Artur Anisiewicz1, Karolina Okła2, Anna Wawruszak3 Makrofagi towarzyszące nowotworowi – pochodzenie, charakterystyka oraz znaczenie w raku piersi 1. Wprowadzenie Rak sutka (łac. carcinoma mammae) jest wysoce heterogenną grupą chorób związaną z nadmiernym, nieprawidłowym i niekontrolowanym rozrostem komórek nabłonka organizujących struktury przewodów i zrazików. Pomimo ciągłego postępu w dziedzinie farmakologii i onkologii nadal jest to jeden z najczęściej zabijających nowotworów złośliwych. Według baz danych WHO, rak piersi jest najpowszechniejszym nowotworem występującym w grupie kobiet – w 2012 roku odnotowano ponad 1,5 mln nowych przypadków oraz ponad 0,5 mln zgonów (GLOBOCAN 2012) [1]. Wzrastające z roku na rok statystyki dotyczące zapadalności/umieralności na raka sutka wiązane są z tzw. zachodnim stylem życia (m.in. ograniczenie aktywności fizycznej, stres, nieprawidłowe odżywianie), wysoką dostępnością do antykoncepcji hormonalnej oraz coraz lepiej rozwiniętym programem badań przesiewowych (mammografia). Niestety, pomimo coraz wyższej powszechności badań skriningowych, nadal liczne przypadki wykrywane są w stadium objawowym, charakteryzującym się niepomyślnym rokowaniem [2]. Poznanie i zrozumienie molekularnego oraz komórkowego podłoża rozwoju i progresji raka sutka rodzi nadzieję na stworzenie nowych, skuteczniejszych strategii terapeutycznych. 1 [email protected], Laboratorium Doświadczalnej Terapii Przeciwnowotworowej, Zakład Onkologii Doświadczalnej, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu 2 [email protected], I Katedra i Klinika Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 3 [email protected], Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 44 Makrofagi towarzyszące nowotworowi – pochodzenie, charakterystyka oraz znaczenie w raku piersi 2. Makrofagi i odporność Komórki układu immunologicznego odgrywają niebagatelną rolę w utrzymywaniu homeostazy ustroju, a co z tym związane, w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu. Makrofagi są kluczowymi elementami wrodzonej odpowiedzi immunologicznej ze względu na ich wyjątkową zdolność rozpoznawania, pochłaniania i niszczenia obcych patogenów [3]. Wraz z monocytami i komórkami dendrytycznymi stanowią główną pulę komórek prezentujących antygen (APC), dzięki czemu uczestniczą w powstawaniu komórek immunokompetentnych [4]. 2.1. Monocyty Miejscem pochodzenia monocytów, obwodowych prekursorów dla makrofagów, jest przede wszystkim szpik kostny. W procesie mielopoezy, w wyniku różnicowania się mieloidalnej komórki progenitorowej, a następnie wspólnej komórki progenitorowej linii mieloidalnej i granulocytarnej, powstają neutrofile bądź monocyty [5]. Obecność w mikrośrodowisku czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) oraz interleukiny 3 (IL-3) stymuluje różnicowanie w kierunku monocytów. Komórki te ze szpiku kostnego trafiają do krwi, gdzie jako jednojądrzaste fagocyty pełnią funkcje obronne oczyszczając krew z mikroorganizmów oraz obumarłych bądź nieprawidłowo wykształconych czy zmienionych komórek. Po kilku dniach monocyty opuszczają łożysko naczyniowe przechodząc przez śródbłonek w procesie diapedezy. Po przeniknięciu do tkanek nabierają specyficznych cech fenotypowych oraz funkcjonalnych, różnicując się w zależności od obecności konkretnych czynników w makrofagi (GM-CSF i M-CSF) lub komórki dendrytyczne DC (GM-CSF i IL-4) [6]. W ostatnich latach dowiedziono, że obecne na obwodzie monocyty stanowią heterogenną grupę komórek wykazujących ekspresję markerów CD11b, CD11c i CD14 (dla ludzi) oraz CD11b i F4/80 w przypadku myszy [7]. Na podstawie fenotypu (markerów powierzchniowych i receptorów) zarówno mysie, jak i ludzkie monocyty mogą być podzielone na dwie grupy. W przypadku ludzi dominującą klasą monocytów są stanowiące blisko 90% wszystkich monocytów klasyczne komórki o fenotypie CD14+/CD16-/CCR2high (Rysunek 1). W modelu mysim proporcje pomiędzy monocytami klasycznymi (CCR2+/Ly6C high) a niespecyficznymi (CX3CR1+/Ly6Clow) są wyrównane [7, 8]. Fenotyp monocytów decyduje o ich funkcjach i dalszych losach. Monocyty klasyczne Ly6Chigh migrują w kierunku stanu zapalnego oraz miejsc przebudowy tkanek, gdzie przenikają do tkanek i różnicują się w kierunku komórek dendrytycznych bądź makrofagów. Główną funkcją 45 Artur Anisiewicz, Karolina Okła, Anna Wawruszak monocytów Ly6Clow jest ochrona integralności śródbłonka naczyniowego oraz udział w procesach jego naprawy (rekrutacja neutrofili) [10]. Ekstrawazacja komórek Ly6Chigh odbywa się w wyniku interakcji cząsteczek CD62L, obecnych na powierzchni monocytów klasycznych, z odpowiednimi molekułami obecnymi na endotelium objętym stanem zapalnym. Monocyty tej klasy po przedostaniu się do tkanki ulegają różnicowaniu w kierunku makrofagów o fenotypie M1. Komórki Ly6C low, nie wykazujące ekspresji CD62L, mogą przenikać do tkanek w wyniku interakcji CX3CR1/ CX3CL1 gdzie dają początek makrofagom klasy M2 [11]. Rysunek 1. Heterogenność monocytów ludzkich i mysich [9] 2.2. Charakterystyka makrofagów Monocyty trafiające do tkanek, różnicują się w kierunku makrofagów lub komórek DC. Wraz z pozostałymi komórkami układu immunologicznego koordynują procesy zapalne oraz procesy naprawcze. Jako komórki APC biorą udział w prezentacji antygenów w kontekście MHC klasy II limfocytom Th organizując lokalną oraz systemową odpowiedź na zagrożenie patogenami. Makrofagi kontrolują stan zapalny, odpowiadają za cytotoksyczność oraz fagocytozę. Ponadto uczestniczą w utrzymywaniu 46 Makrofagi towarzyszące nowotworowi – pochodzenie, charakterystyka oraz znaczenie w raku piersi homeostazy organizmu dzięki udziałowi w takich procesach jak hematopoeza, hemostaza, remodeling tkanek, gojenie ran oraz metabolizm lipidów i żelaza. Makrofagi wydzielają ponad sto nisko- i wysokocząsteczkowych związków o aktywności biologicznej. Są to m.in. enzymy (lizozym, proteazy, kwaśne hydrolazy lizosomalne), inhibitory białek (inhibitory proteaz, inhibitory fosfolipazy), czynniki kaskady krzepnięcia krwi, składowe dopełniacza, reaktywne formy, szereg cytokin i chemokin oraz metabolity kwasu arachidonowego (produkty cyklooksygenazy oraz lipooksygenazy) [6, 12]. Makrofagi charakteryzuje wysokie zróżnicowanie funkcjonalne i strukturalne. Zasadniczy podział wyróżnia obecne na błonach śluzowych makrofagi wolne, makrofagi osiadłe (tkankowe) oraz makrofagi wędrujące, aktywowane w odpowiedzi na stan zapalny [10]. Prekursory makrofagów rezydualnych pojawiają się w określonych tkankach już na etapie życia płodowego. Morfologia oraz zróżnicowanie funkcjonalne uzależnione są od miejsca ich docelowej lokalizacji. Do tej grupy makrofagów zalicza się między innymi makrofagi pęcherzyków płucnych, histiocyty, komórki Kupffera zatok wątrobowych, osteoklasty, komórki mikrogleju centralnego układu nerwowego, makrofagi przewodu pokarmowego, makrofagi szpiku kostnego czy też makrofagi występujące w tkankach limfoidalnych [13]. Makrofagi aktywne w odpowiedzi na stan zapalny trafiają do tkanek w sytuacji zagrożenia. W odpowiedzi na pojawiające się czynniki chemotaktyczne wędrują do ogniska lokalnego stanu zapalnego, gdzie ulegają aktywacji. W tkance uruchamiane są mechanizmy bójcze, m.in. fagocytoza, sekrecja peptydów, wewnątrzkomórkowa degranulacja oraz sekrecja peptydów. Jednakże rezultat aktywacji makrofagów może być całkiem odmienny i uzależniony jest od obecności sygnałów indukcyjnych bądź supresyjnych [14]. Ze względu na ekspresję markerów powierzchniowych oraz drogę aktywacji wyróżnia się makrofagi aktywowane klasycznie (M1) oraz makrofagi alternatywne o działaniu przeciwzapalnym i stymulującym (M2). Aktywatory oraz charakterystyczne markery komórek o fenotypie M1 oraz poszczególnych klas makrofagów M2 przedstawione są na Rysunku 2. Dla makrofagów mysich charakterystycznymi cząsteczkami opisującymi fenotyp komórek klasy M2 są markery FIZZ1, Arg-1 oraz YM1 [16]. Droga i skutek aktywacji makrofagów uzależnione są od występującej w danym momencie i w danym miejscu kombinacji czynników indukcyjnych i supresyjnych. Polaryzację w kierunku klasy M1 obserwuje się na wczesnych etapach odpowiedzi zapalnej, rozwijanej wskutek infekcji bakteryjnych, wirusowych i grzybiczych oraz w przypadku uszkodzenia tkanek. Komórki 47 Artur Anisiewicz, Karolina Okła, Anna Wawruszak M1 charakteryzuje podwyższona zdolność do prezentacji antygenów limfocytom Th1 i Th17, wysoka ekspresja czynników związanych ze szlakiem NFκB oraz zdolność do magazynowania żelaza [6]. Makrofagi M1 wytwarzają specyficzne cytokiny, m.in. TNFα, IL-1, IL-6, IL-12, IL-23 oraz chemokiny takie jak CCL5, CCL8, CXCL2 i CXCL4 [4]. Z drugiej strony, podczas wyciszania stanu zapalnego aktywowane są makrofagi alternatywne. Podwyższony stosunek M2/M1 obserwuje się także w przebiegu infekcji pasożytniczych, w procesach włóknienia, tworzenia blaszek miażdżycowych oraz podczas tworzenia ziarniniaków [6]. Komórki M2 aktywują limfocyty Th2 oraz limfocyty Treg, wydzielają również cytokiny oraz inne czynniki o działaniu stymulującym i przeciwzapalnym, m.in. IL-10, TGF-β, IL-1RA, CCL16, CCL18 i CCL22. Zwiększona ekspresja arginazy 1 skutkuje zmianą metabolizmu L-Argininy w kierunku wytwarzania ornitydyny i poliamin, w konsekwencji blokując indukowaną syntazę tlenku azotu (iNOS) [4]. Rysunek 2. Zróżnicowanie makrofagów – charakterystyczne aktywatory i markery. Opracowanie własne na podstawie [15] 48 Makrofagi towarzyszące nowotworowi – pochodzenie, charakterystyka oraz znaczenie w raku piersi 3. Komórki TAMs Makrofagi obecne w mikrośrodowisku guza (TAMs – tumor associated macrophages) stanowią istotną część nacieku komórek leukocytarnych. W większości typów nowotworów dominujący typ infiltrujących makrofagów stanowią komórki o fenotypie zbliżonym do makrofagów klasy M2. W związku z tym wielu naukowców stawia często znak równości pomiędzy komórkami M2 a makrofagami TAMs. Analizy fenotypu komórek naciekających nowotwór wskazują jednak, że w mikrośrodowisku guza mogą być obecne zarówno komórki klasy M1, jak i M2, zaś stosunek M1/M2 uzależniony jest m.in. od typu nowotworu, jego stadium rozwojowego oraz kombinacji czynników indukcyjnych/supresyjnych wydzielanych przez same komórki nowotworowe [6, 17]. 3.1. Polaryzacja makrofagów M1 i M2 Rozrost tkanki nowotworowej możliwy jest dzięki odpowiedniej modulacji mikrośrodowiska rozwijającego się guza. Komórki nowotworowe poprzez wydzielanie konkretnych cząsteczek wpływają na lokalną odpowiedź układu immunologicznego, prowadząc do upośledzenia jego funkcjonowania [18]. CCL2 (MCP-1 – chemotaktyczny czynnik białkowy 1) jest prawdopodobnie najsilniej działającym czynnikiem chemotaktycznym oddziałującym na znajdujące się na obwodzie monocyty. Jej nadmierną sekrecję stwierdza się m.in. w mięśniakach, glejakach, nowotworach płuc i piersi, w raku szyjki macicy, w raku jajnika oraz czerniaku złośliwym [18]. Poza rekrutacją monocytów do środowiska guza, CCL2 indukuje ich aktywność oksydacyjną, wzmaga wydzielanie IL-1 i IL-6, stymuluje także wytwarzanie urokinazowego aktywatora plazminogenu. Wśród innych czynników działających chemotaktycznie na monocyty wyróżnia się m.in. VEGF, CCL5 (RANTES), M-CSF, GM-CSF, IL-8 oraz MIP-1α (białko zapalne makrofagów) [4]. Wędrówka monocytów do środowiska guza w odpowiedzi na czynniki chemotaktyczne, migracja okolicznych makrofagów tkankowych oraz proliferacja komórek TAMs skutkują zwiększeniem procentowej zawartości komórek linii monocytarnej w nacieku leukocytarnym. W wyniku progresji choroby nowotworowej komórki o fenotypie typowym dla klasy M1 ulegają polaryzacji w kierunku pronowotworowych TAMs M2, jednakże należy zaznaczyć, że uzależnione jest to m.in. od typu nowotworu oraz występujących w jego środowisku specyficznych cytokin i chemokin. Obecne w nacieku makrofagi M2 pod względem fenotypowym są niemal identyczne z makrofagami alternatywnymi M2 występującymi w stanie fizjologicznym, jednak ich indukcja odbywa się w wyniku stymulacji IL-10, 49 Artur Anisiewicz, Karolina Okła, Anna Wawruszak TGF-β oraz prostaglandyną E2, wytwarzanymi nowotworowe (tzw. Makrofagi M2c – Rysunek 2) [19]. przez komórki 3.2. Antynowotworowe właściwości TAMs M1 W zależności od typu nowotworu oraz specyficznych sygnałów wytwarzanych przez komórki nowotworowe i komórki znajdujące się w otoczeniu guza (komórki śródbłonka, fibroblasty, komórki układu immunologicznego), makrofagi TAMs mogą wykazywać właściwości antylub pronowotworowe. Fenotyp makrofagów M1 charakteryzuje wysoka ekspresja prozapalnych cytokin, m.in. IL-1, TNF-α, IL-6, IL-12 i IL-23. Nadmierna produkcja czynników stymulujących środowisko stanu zapalnego na początkowych etapach rozwoju choroby nowotworowej oddziałuje mobilizująco na komórki układu immunologicznego [20]. Wydzielana przez makrofagi IL-12 stymuluje komórki NK do sekrecji IFN-γ [4]. Interferon działa pobudzająco na komórki immunologiczne, w tym na makrofagi, prowadząc do uruchomienia mechanizmów cytostatycznych (TNF-α i IL-1) i cytotoksycznych. Produkowany przez komórki M1 tlenek azotu (NO) wykazuje działanie toksyczne w stosunku do komórek nowotworowych, istnieją jednakże doniesienia świadczące o jego stymulującej roli w procesie neoangiogenezy [21]. Bezpośrednie niszczenie komórek nowotworowych przez makrofagi odbywa się na drodze cytotoksyczności zależnej (ADCC) lub niezależnej od przeciwciał (MTC). Pierwsza strategia polega na wytworzeniu połączenia pomiędzy makrofagem a komórką nowotworową poprzez znajdujące się na jej powierzchni przeciwciało i receptor dla fragmentu Fc. W przypadku MTC dochodzi do bezpośredniej interakcji, jednakże ten typ cytotoksyczności jest mechanizmem rozwijającym się dłużej niż ADCC. Makrofagi po pośrednim lub bezpośrednim związaniu komórki nowotworowej wydzielają m.in. aktywne formy tlenu, proteazy oraz inne czynniki prowadzące do efektu cytolitycznego [14]. Długotrwałe utrzymywanie się środowiska stanu zapalnego jest czynnikiem niekorzystnym i w dłuższej perspektywie działa stymulująco na rozwój guza. Badania wskazują, że progresji choroby nowotworowej towarzyszy postępująca polaryzacja fenotypu makrofagów TAMs w kierunku komórek M2. Jednakże w niektórych typach nowotworów (m.in. rak żołądka, czerniak, chłoniak grudkowy) obserwuje się przewagę fenotypu M1, zaś wysoki stosunek M1/M2 stanowi dobry czynnik rokowniczy dla pacjentów [4, 22, 23]. 50 Makrofagi towarzyszące nowotworowi – pochodzenie, charakterystyka oraz znaczenie w raku piersi 3.3. Pronowotworowe właściwości TAMs M2 W zaawansowanych stadiach większości złośliwych nowotworów obserwuje się zwiększenie odsetka makrofagów TAMs M2 o właściwościach immunosupresyjnych i pronowotworowych. Postęp i rozwój choroby nowotworowej możliwy jest dzięki odpowiedniej modulacji mikrośrodowiska guza. Udowodniono, że długotrwałe utrzymywanie się stanu zapalnego jest niekorzystnym czynnikiem prognostycznym, sprzyjającym progresji choroby nowotworowej. Komórki nowotworowe, fibroblasty (CAF) oraz makrofagi migrujące do środowiska guza w odpowiedzi na czynniki m.in. M-CSF i CCL2 wydzielają nadmierne ilości cytokin prozapalnych. Skutkuje to uruchomieniem szlaków sygnałowych JAK/STAT3, PI3K/Akt oraz Ras/ERK, odpowiadających m.in. za proliferację, przeżycie komórek nowotworowych, inwazję i przerzutowanie [24]. Produkowane przez komórki nowotworowe cytokiny, m.in. IL-6, IL-4, IL-10, TGF-β, prostaglandyny E2 w dłuższej perspektywie hamują aktywność cytotoksyczną makrofagów, obniżają ekspresję cząsteczek MHC klasy II na ich powierzchni, stymulują także (IL-10 i IL-4) polaryzację fenotypu w kierunku komórek M2 o właściwościach pronowotworowych [4]. 3.3.1. Neoangiogeneza Nadmierny i nieregularny wzrost komórek nowotworowych związany z przyspieszonymi podziałami komórkowymi objawia się większym zużyciem tlenu, prowadząc do rozwinięcia stanu niedotlenienia. W guzach nowotworowych o objętości 1-2 mm3 dyfuzja tlenu ulega zahamowaniu, zaś postępująca dezintegracja i niefunkcjonalność naczyń krwionośnych pogłębiają hipoksję tkanki nowotworowej. Istnieje wiele dowodów wskazujących na istotną rolę makrofagów TAMs M2 w regulacji, inicjacji i promocji procesu neoangiogenezy. Zarówno w ludzkich, jak i w mysich guzach komórki TAMs gromadzą się w słabo unaczynionych, nekrotycznych polach, znajdowane są również w okolicach naczyń krwionośnych [25]. Uważa się, że wysoki odsetek TAMs M2 skorelowany jest z wysokim poziomem hipoksji. Komórki nowotworowe znajdujące się w stanie niedotlenienia wydzielają czynniki o działaniu chemotaktycznym w stosunku do monocytów/makrofagów - VEGF, EMAP-II oraz endotelinę 2. M2 migrujące do miejsc hipoksji, przy współpracy komórek guza wydzielają szereg związków proangiogennych, stymulujących komórki śródbłonka do neowaskularyzacji tkanki guza [12]. Są to m.in. VEGF, TNF-α, TGF-β, IL-8, bFGF, COX-2 oraz PDGF [26]. Dodatkowo TAMs M2 charakteryzują się wysoką ekspresją metaloproteinaz macierzy (MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-12) oraz uPA (urokinazowy aktywator plazminogenu) uczestniczących w przebudowie macierzy zewnątrz-komórkowej [27]. 51 Artur Anisiewicz, Karolina Okła, Anna Wawruszak 3.3.2. Wzrost guza Infiltracja makrofagów TAMs M2 w obrębie tkanki nowotworowej wpływa pozytywnie na proliferację komórek, co potwierdza m.in. poziom MIB-1 w raku piersi, poziom Ki67 w raku macicy oraz indeks mitotyczny w raku nerkowokomórkowym [23]. Poza działaniem immunosupresyjnym w stosunku do środowiska guza, makrofagi towarzyszące nowotworowi wydzielają szereg czynników stymulujących wzrost, proliferację i przeżycie. Są to przede wszystkim MMP-9, Il-23, hepatocytarny czynnik wzrostu (HGF), EGF, PDGF, TGF-β oraz bFGF [26]. 3.3.3. Inwazja i przerzutowanie Makrofagi TAMs M2 promują proces przerzutowania w wyniku stymulacji angiogenezy, indukcji wzrostu guza, zwiększenia zdolności do migracji oraz inwazyjności komórek nowotworowych. W wielu typach nowotworów wysoki odsetek komórek TAMs skorelowany jest z zajęciem węzłów chłonnych oraz formowaniem przerzutów odległych. Zarówno czynnik CSF-1 uwalniany przez komórki nowotworowe, jak i epidermalny czynnik wzrostu (EGF) wydzielany przez makrofagi pobudza migrację obu typów komórek [25]. Ponadto nadmierna produkcja TNF-α zwiększa inwazyjność w wyniku stymulacji ekspresji MIF oraz EMMPRIN (czynnik indukujący metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej), indukujących wytwarzanie MMPs 1,2,3,7,9,12 [12, 19]. Metaloproteinazy macierzy wraz z innymi enzymami (m.in. plazmina, urokinazowy aktywator plazminogenu, tkankowy aktywator plazminogenu) odpowiadają za przebudowę struktury macierzy pozakomórkowej prowadząc do jej rozluźnienia, co sprzyja migracji i przerzutowaniu komórek nowotworowych do okolicznych, zdrowych tkanek [28]. Co więcej, również inne czynniki produkowane przez makrofagi, m.in. IL-1β, katepsyna B, Wnt5a, Wnt5b, MSF (czynnik stymulujący migrację) oraz semaforyna 4D promują inwazyjność komórek guza [25]. Wskazuje się także na istotną rolę cząsteczek mikroRNA w regulacji inwazyjnego fenotypu komórek nowotworowych. Na przykład, powstające w makrofagach TAMs mir-233 regulują metastazę poprzez szlak mef2c-β-kateniny [26]. 3.3.4. Immunosupresja Niezakłócony rozrost guza możliwy jest dzięki odpowiedniej modulacji mikrośrodowiska, w którym się on znajduje. Komórki nowotworowe przy współpracy makrofagów TAMs M2 działają immunosupresyjnie na układ immunologiczny gospodarza. Na etapie inicjacji choroby nowotworowej obserwowany jest podwyższony poziom cytokin prozapalnych, m.in. IL-1, IL-6 oraz TNF-α. Czynniki te działają hamująco w stosunku do 52 Makrofagi towarzyszące nowotworowi – pochodzenie, charakterystyka oraz znaczenie w raku piersi cytotoksycznej aktywności makrofagów. Równocześnie komórki nowotworowe produkują cytokiny (IL-10, IL-4) stymulujące polaryzację fenotypu w kierunku klasy M2. TAMs M2 wydzielają związki o działaniu przeciwzapalnym, tj. IL-10, IL-1RA oraz TGF-β [29]. Efektem tego jest polaryzacja odpowiedzi immunologicznej w kierunku limfocytów Th2, indukcja limfocytów T regulatorowych oraz supresja limfocytów T CD8+ i komórek NK [4]. Progresji wielu nowotworów towarzyszy wysoka ekspresja arginazy 1, metabolizującej L-argininę w kierunku poliamid i proliny. Prowadzi to do niefunkcjonalności receptorów TCR oraz upośledzenia i supresji komórek CD8+. Ponadto immunosupresja może być również związana z wydzielaniem specyficznych chemokin, m.in. CCL17, CCL18, CCL22 działających chemotaktycznie dla komórek Treg oraz Th2 [26]. 4. Makrofagi TAMs w raku piersi Liczne źródła wskazują na występowanie wysokiego odsetka makrofagów TAMs M2 w przebiegu choroby nowotworowej gruczołu sutkowego [3,4,23,26,30]. Występowanie makrofagów CD163+ (marker charakterystyczny dla fenotypu M2) w podścielisku guza u pacjentów ze stwierdzonym rakiem piersi jest niekorzystnym czynnikiem prognostycznym. Wykazano dodatnią korelację pomiędzy obecnością komórek CD163+ a większym rozmiarem guza i wyższym poziomem markera Ki67 w potrójnie negatywnym raku sutka [31]. 4.1. TAMs a progresja raka sutka TAMs uczestniczą we wzroście nowotworu, wspierają angiogenezę, promują również inwazyjny fenotyp komórek nowotworowych zwiększając ich zdolność przerzutowania. Zarówno w mysim, jak i w ludzkim modelu raka piersi stwierdza się ekspresję markerów charakterystycznych dla makrofagów klasy M2 [30]. Dodatkowo, TAMs izolowane z myszy obarczonych rakiem sutka charakteryzują się niską zdolnością cytotoksyczną z uwagi na obniżoną ekspresję i funkcjonalność czynników NF-κB i C/EBP, co skutkuje zaburzeniem w produkcji NO. W mysim modelu raka piersi MMTV-PyMT IL-4 produkowana przez naciekające limfocyty CD4+ stymuluje ekspresję czynnika EGF, prowadząc do zwiększonego przerzutowania w płucach. Również katepsyna B, której produkcję indukuje IL-4, wykazuje wpływ na zwiększoną inwazyjność komórek nowotworowych. W nowotworach gruczołu sutkowego stwierdza się często wysoki poziom czynnika M-CSF [3, 19]. Bezpośrednim efektorem szlaku sygnałowego dla tego białka jest czynnik transkrypcyjny Ets2. Jego aktywacja promuje przerzutowanie do płuc, m.in. w wyniku hamowania aktywności inhibitorów angiogenezy 53 Artur Anisiewicz, Karolina Okła, Anna Wawruszak (model PyMT). Komórki ludzkiego raka piersi produkują nadmierne ilości białka szoku cieplnego 27 (Hsp27), wspierającego różnicowanie monocytów do makrofagów. TAMs powstałe w wyniku indukcji Hsp27 działają immunosupresyjnie w stosunku do limfocytów T, wspierają angiogenezę i przerzutowanie komórek guza. Co więcej, uwalniany przez obumierające komórki nowotworowe TGF-β oraz S1P (sfingozyno-1-fosforan) indukują czynnik HIF-1 (czynnik indukujący hipoksję) o działaniu proangiogennym [3]. Rysunek 3. Pronowotworowa aktywność makrofagów TAMs w raku piersi [3] W mysim modelu raka piersi 4T1 stwierdza się także nadekspresję czynnika transkrypcyjnego Fra-1, aktywującego inny czynnik STAT3. Jego obecność wykrywa się w około 70% pierwotnych nowotworów ludzi, zaś konstytutywna aktywacja STAT3 zwiększa proliferację komórek nowotworowych [32]. Poprzez sekrecję TNF-α przez makrofagi TAMs, w komórkach raka sutka aktywowane są szlaki NF-κB oraz JNK stymulujące ich inwazyjność. Podobnym działaniem charakteryzuje się osteonektyna (SPARC), odpowiadająca za interakcje pomiędzy komórkami nowotworowymi a macierzą zewnątrzkomórkową. Ponadto, proliferacja komórek może być również stymulowana produkowanym przez TAMs M2 mitogenem Gas6 (Rysunek) [3]. 54 Makrofagi towarzyszące nowotworowi – pochodzenie, charakterystyka oraz znaczenie w raku piersi 4.2. CCL18 a metastaza Charakterystyczną cechą makrofagów klasy M2 jest wydzielanie specyficznych chemokin, m.in. CCL18 [19]. W stanie fizjologicznym białko to pełni rolę chemoatraktanta dla dziewiczych limfocytów B, T oraz niedojrzałych komórek DC. CCL18 wydaje się odgrywać ważną rolę w polaryzacji odpowiedzi immunologicznej w kierunku limfocytów Th2, działa także stymulująco na różnicowanie w kierunku komórek Treg produkujących IL-10. Wysoką ekspresję CCL18 stwierdza się w chorobach alergicznych oraz zaburzeniach o podłożu zapalnym [33]. Analiza profilu cytokin wydzielanych przez TAMs, obecne w mikrośrodowisku guza, wskazuje na wysoki poziom ekspresji CCL18, który związany jest ze złym rokowaniem oraz większym ryzykiem przerzutowania. CCL18 wydzielana przez makrofagi M2 ulega specyficznemu związaniu z obecnym na komórkach nowotworowych receptorem PITPNM3 (Nir1), należącym do rodziny białek G (GPCR) [34]. Aktywacja receptora PITPNM3 prowadzi do fosforylacji i translokacji cytoplazmatycznej kinazy tyrozynowej Pyk2 w kierunku błony komórkowej. Białko to należy do dużej rodziny kinaz FAK (focal adhesion kinase) i odpowiada za regulację adhezji komórkowej, migracji i inwazji. Badania kliniczne wskazują, że nadekspresja Pyk2, obserwowana w kilku typach nowotworów w tym w raku piersi, związana jest ze złośliwym fenotypem komórek nowotworowych wykazujących skłonności do przerzutowania oraz stanowi niekorzystny czynnik prognostyczny. Co więcej, aktywacji i translokacji Pyk2 na membranę towarzyszy indukcja innej kinazy tyrozynowej - kinazy Src [35]. Skutkuje to m.in. aktywacją białka STAT3 pomimo braku obecności czynników wzrostowych i pobudzających, co przekłada się na promowanie proliferacji i przerzutowania [36]. 4.3. Szlak WNT/β-katenina Ścieżka sygnałowa WNT/β-katenina odgrywa istotną rolę w procesie tumorogenezy. Wykazano, że niska ekspresja błonowej β-kateniny lub jej jądrowa lokalizacja są złym czynnikiem prognostycznym dla pacjentów z rakiem. Co więcej, nieprawidłowa ekspresja APC – negatywnego regulatora β-kateniny – jest jedną z głównych przyczyn raka okrężnicy [37]. Pronowotworowe właściwości szlaku związane są fosforylacją i aktywacją β-kateniny, jej translokacją do jądra komórkowego oraz związaniem z czynnikiem transkrypcyjnym Tcf. Powstały kompleks ulega przyłączeniu w miejscu promotorów genów odpowiedzialnych za proliferację i zahamowanie apoptozy [38]. Aktywacja β-kateniny możliwa jest dzięki połączeniu białka Wnt z błonowym receptorem Fzd. Efektem tego oddziaływania jest powstanie aktywnego kompleksu receptorowego, do którego następnie przyłącza się aksyna uwalniająca β-kateninę [39]. 55 Artur Anisiewicz, Karolina Okła, Anna Wawruszak Badania prowadzone na mysim modelu raka piersi MMTV-PyMT wskazują, że makrofagi TAMs posiadają ekspresję ligandów Wnt, m.in. Wnt5b oraz Wnt7b. Również w przypadku makrofagów izolowanych z podścieliska guza ludzkiego raka piersi stwierdzono nadekspresję Wnt7b. Co więcej, obecność ligandów Wnt oraz aktywacja β-kateniny wiązana jest z indukcją genów odpowiedzialnych za proliferację, inwazyjność komórek raka piersi, angiogenezę oraz przerzutowanie [37]. 5. Podsumowanie Rak piersi jest najczęściej występującym nowotworem w grupie kobiet. Według szacunkowych danych WHO, w 2035 roku ilość nowych przypadków przekroczy 2,5 milona, zaś ilość zgonów wyniesie blisko 850 tysięcy [1]. Pomimo intensywnego rozwoju w dziedzinie farmakologii chorób nowotworowych, leczenie raka sutka – szczególnie potrójnie ujemnego – jest nadal mało satysfakcjonujące. Brak możliwości zastosowania terapii celowanej w przypadku raków nie wykazujących ekspresji receptorów estrogenowych, progesteronowych oraz nadekspresji receptorów HER-2 wymusza poszukiwania nowych, terapeutycznych celów. Analiza mikrośrodowiska guza wskazuje na obecność komórek TAMs klasy M2 w nacieku leukocytarnym [4]. Ich obecność związana jest ze stymulacją neoangiogenezy, promowaniem migracji, inwazyjności oraz przerzutowania. Infiltracja TAMs M2 w raku sutka jest również niekorzystnym czynnikiem prognostycznym [31]. Pronowotworowa aktywność makrofagów TAMs sprawia, że naukowcy starają się wykorzystać je jako cel terapeutyczny. Wyróżnia się trzy kierunki badań celujących w te komórki: zahamowanie migracji monocytów do mikrośrodowiska guza, likwidacja makrofagów obecnych w tkance nowotworowej oraz neutralizacja czynników uwalnianych przez TAMs M2. Niestety, tego typu terapie związane są z wieloma niepożądanymi objawami dlatego konieczne jest lepsze zrozumienie molekularnych zależności leżących u podstaw raka piersi [25]. Literatura 1. 2. 3. 4. http://globocan.iarc.fr/Pages/online.aspx http://eu.cmkp.edu.pl/css_bart/dok_eu/Rak%20piersi%20A-II.pdf Laoui D., Movahedi K., Van Overmeire E., Van den Bossche J., Schouppe E., Mommer C., Nikolaou A., Morias Y., De Baerselier P., Van Ginderachter J.A. Tumor-associated macrophages in breast cancer: distinct subsets, distinct functions, The International Journal of Developmental Biology, 55 (2011), s. 861-867 Eljaszewicz A., Gackowska L., Kubiszewska I., Jankowski M., Urbańska M., Wiese M., Helmin- Basa A., Michałkiewicz J., Zegarski W. Aktywność makrofagów w rozwoju choroby nowotworowej, Współczesna Onkologia, 14 (2010), s. 1-6 56 Makrofagi towarzyszące nowotworowi – pochodzenie, charakterystyka oraz znaczenie w raku piersi 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. Obeid E., Nanda R., Fu Y., Olopade O.I. The role of tumor-associated macrophages in breast cancer progression, International Journal of Oncology, 43 (2013), s. 5-12 Nazimek K., Bryniarski K. Aktywność biologiczna makrofagów w zdrowiu i chorobie, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 66 (2012), s. 507-520 Geissmann F., Jung S., Littman D.R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties, Immunity, 19 (2003), s. 71-82 Ziegler-Heitbrock L., Ancuta P., Crowe S., Dalod M., Grau V., Hart D.N., P.J., Leenen, Y. Liu, G. MacPherson, G.J. Randolph, J. Scherberich, J. Schmitz, Shortman K., Sozzani S., Strobl H., Zembala M., Austyn J.M., Lutz M.B. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood, Blood, 116 (2010), s. 74-80 Zimmermann H. W., Trautwein Ch., Tacke F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury, Frontiers in Physiology, 3 (2012), s. 1-18 Ginhoux F., Jung S.Monocytes and macrophages: development al pathways and tissue homeostasis,Immunology, 14 (2014), s. 392-404 Lee H., Choi H., Ha S., Lee K., Kwon Y. Recruitment of monocytes/macrophages in different tumor microenvironments, Biochimica et Biophysica Acta, 1835 (2013), s. 170-179 Siveen K.S., Kuttan G. Role of macrophages in tumor progression, Immunology Letters, 123 (2009), s. 97-102 S. J. Galli, N. Borregaard, T.A. Wynn Phenotypic and functional plasticity of cells of inna te immunity: macrophages, Mast cells and neutrophils, Nature Immunology, 12 (2011), s.1035-1044 http://bioinfo.mol.uj.edu.pl/articles/Chorobik03 http://www.biolegend.com/NewsLegend/022311/index.htm Lin Y., Yang X., Yue W., Xu X., Li B., Zou L., He R. Chemerin aggravates DSS-induced colitis by suppressing M2 macrophage polarization, Celullar & Molecular Immunology, 11 (2014), s. 355-366 Franklin R.A., Liao W., Sarkar A., Kim M.V., Bivona M.R., Liu K., Pamer E.G., Li M.O. The Celullar and Molecular Origin of Tumor-associated Macrophages, Science, 344 (2014), s. 921-925 Mantovani A., Sozzani S., Locati M., Allavena P., Sica A. Macrophage polarization: tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes, Trend in Immunology, 23 (2002), s. 549-555 Schmieder A., Michel J., Schonhaar K., Goerdt S., Schledzewski K. Differentiation and gene expression profile of tumor-associated macrophages, Seminars in Cancer Biology 22 (2012), s. 289-297 Solinas G., Germano G., Mantovani A., Allavena P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation, Journal of Leukocyte Biology, 86 (2009), s. 1-9 Świątoniowski G., Dąbrowska M., Łacko A., Mazur G., Kłaniewski T., Molenda W. Rola makrofagów związanych z guzem nowotworowym w progresji oraz w procesach odporności przeciwnowotworowej w raku piersi, Advances in Clinical and Experimental Medicin, 13 (2004), s. 137-142 57 Artur Anisiewicz, Karolina Okła, Anna Wawruszak 22. Zhang M., He Y., Sun X., Li Q., Wang W., Zhao A., Di W. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extender survival in ovaria cancer patients, Journal of Ovarian Research, 7 (2014), s. 1-16 23. Lewis C.E., Pollard J.W. Distinct Role of Macrophages in Different Tumor Microenvironments, Cancer Research, 66 (2006), s. 605-612 24. Taniguchi K., Karin M. Il-6 and related cytokines as the critical lynchpins between inflammation and cancer, Seminars in Immunology, 26 (2014), s. 54-74 25. Coffelt S.B., Hughes R., Lewis C. E. Tumor associated macrophages: Effectors of Angiogenesis and tumor progression, Biochimica et Biophysica Acta, 1796 (2009), s. 11-18 26. Hao N., Lu M., Fan Y., Cao Y., Zhang Z., Yang S. Macrophages in Tumor Microenvironements and the Progression of Tumors, Clinical and Developmental Immunology, (2012), s. 1-11 27. Galdiero M.R., Bonavita E., Barajon I., Garlanda C., Mantovani A., Jailon S. Tumor associated macrophages and neutrophils in cancer, Immunobiology, 218 (2013), s. 1402-1410 28. Allavena P., Sica A., Solinas G., Porta Ch., Mantovani A. The inflammatory micro-environment in tumor progression: The role of tumor-associated macrophages, Critical Reviews in Oncology/Hematology, 66 (2008), s. 1-9 29. Allavena P., Mantovani A. Immunology in the clinic review series; focus on cancer: tumour-associated macrophages: undisputed stars of the inflammatory tumour micro environment, Clinical and Experimental Immunology, 167 (2012), s. 195-205 30. Obeid E., Nanda R., Fu Y., Olopade O.I. The role of tumor-associated macrophages in breast cancer progression (Review), International Journal of Oncology, 43 (2013), s. 5-12 31. Medrek C., Ponten F., Jirstrom K., Leandersson K. The presence of tumor associated macrophages in tumor stroma as a prognostic marker for breast cancer patients, Cancer, 12 (2012), s. 1-9 32. Poczęta M., Bednarek I. STAT3 – ukryty czynnik transkrypcyjny celem terapii przeciwnowotworowych, Annales Academiae Medicae Silesinesis, 67 (2013), s. 133-141 33. Chang Y., Nadai P., Azzaoui I., Morales O., Delhem N., Vorng H., Tomavo S., Yahia S.A., Zhang G., Wallaert B., Chenivesse C., Tsicopoulos A. The Chemokine CCL18 generates adaptive regulatory T cells from memory CD4+ T cells of health but not allergic subjects The FASEB Journal, 24 (2010), s. 5063-5072 34. Chen J., Yao Y., Gong Ch., Yu F., Su S., Chen J., Liu B., Deng H., Wang F., Lin L., Yao H., Su F., Anderson K.S., Liu Q., Ewen M. E., Yao X., Song E., CCL18 from Tumor-Associated Macrophages Promotes Breast Cancer Metastasis via PITPNM3, Cancer Cell, 19 (2011), s. 541-555 35. Li H., Cui X., Wu W., Yu F., Yao H., Liu Q., Song E., Chen J. Pyk2 and Src Mediate Signaling to CCL18-Induced Breast Cancer Metastasis, Journal of Cellular Biochemistry, 115 (2014), s. 596-603 36. Zhang S., Huang W., Zhang L., Zhang Ch., Lowery F. J., Ding Z., Guo H., Wang H., Huang S., Sahin A.A., Aldape K.D., Steeg P.S., Yu D. Src Family Kinases as Novel Therapeutic Targets to Treat Breast Cancer Brain Metastases, Cancer Research, 73 (2013), s. 5764-5774 58 Makrofagi towarzyszące nowotworowi – pochodzenie, charakterystyka oraz znaczenie w raku piersi 37. Yeo E., Cassetta L., Qian B.Myeloid WNT7b mediates the Angiogenic Switch and Metastasis in Breast Cancer, Cancer Research 74 (2014), s. 2962-2973 38. Starska K., Lewy-Trenda I., Woś J., Papież P., Forma E., Bryś M.Ekspresja β-kateniny w utkaniu nowotworowym raka krtani oraz znaczenie w ocenie inwazyjności zmian, Otorynolaryngologia 11 (2012), s. 155-162 39. Koziński K., Dobrzyń A. Szlak sygnałowy Wnt i jego rola w regulacji metabolizmu komórki, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 67 (2013) s. 1098-1108 Makrofagi towarzyszące nowotworowi – pochodzenie, charakterystyka oraz znaczenie w raku piersi Streszczenie Rak piersi jest najczęściej występującym nowotworem w grupie kobiet – co roku odnotowuje się ponad 1,5 mln nowych przypadków oraz ponad 0,5 mln zgonów. Dzięki zdolności rozpoznawania, pochłaniania i niszczenie obcych patogenów oraz zdolności do prezentacji antygenów makrofagi są kluczowymi elementami układu odpornościowego. Obwodowymi prekursorami dla makrofagów są powstające w szpiku kostnym monocyty. Dominującą klasą monocytów ludzkich są komórki o fenotypie CD14+/CD16-/CCR2high . W modelu mysim rozróżnia się monocyty klasyczne (CCR2+/Ly6Chigh) oraz niespecyficzne (CX3CR1+/Ly6Clow). W odpowiedzi na sygnały środowiskowe przenikają do tkanek, gdzie ulegają różnicowaniu do makrofagów. W stanie fizjologicznym komórki te odpowiadają za utrzymywanie homeostazy tkanki, organizują również lokalną i systemową odpowiedź immunologiczną. Ze względu na ekspresję markerów powierzchniowych oraz drogę aktywacji wyróżnia się makrofagi aktywowane klasycznie (M1) oraz makrofagi alternatywne o działaniu przeciwzapalnym i stymulującym (M2). Makrofagi obecne w mikrośrodowisku guza (TAMs) stanowią istotną część nacieku komórek leukocytarnych. W większości typów nowotworów dominujący typ infiltrujących makrofagów stanowią komórki o fenotypie zbliżonym do makrofagów klasy M2. TAMs M2 charakteryzują się pronowotworowymi właściwościami. Komórki te wspierają angiogenezę w obrębie guza, promują jego wzrost, stymulują inwazyjność i przerzutowanie. Istotną cechą jest również immunosupresja układu immunologiczego, m.in. polaryzacja odpowiedzi immunologicznej w kierunku Th2 oraz indukcja komórek Treg. Obecność makrofagów w podścielisku guza pacjentów z rakiem sutka jest negatywnym czynnikiem prognostycznym. TAMs M2 odpowiadają za progresję tej choroby, m.in. poprzez wydzielanie CCL18 oraz aktywację szlaku WNT/β-katenina. Tumor associated macrophages – origin, characteristic and importance in breast cancer Abstract Breast cancer is the most common tumour among women – every year over 1,5 million new cases and over 0,5 million deaths is recorded. Macrophages are key players of immunity because of their ability to recognize, engulf and destruction of pathogens and ability to presentation of antigens. Monocytes generated in the bone marrow are circulating precursors of macrophages. The dominant class of human monocytes are CD14+/CD16-/CCR2high cells. In murine model exist classic monocytes (CCR2+/Ly6Chigh) and nonspecific monocytes (CX3CR1+/Ly6Clow). In response to environmental cues, monocytes penetrate into the tissues and differentiate into macrophages. They are responsible for homeostasis maintaining and the local and systemic immunity in physiological state. In view of the expression of surface markers there are classic activated macrophages (M1) and anti-inflammatory, alternative macrophages (M2). Macrophages 59 Artur Anisiewicz, Karolina Okła, Anna Wawruszak present in microenvironment of tumour (TAMs) are important part of the leukocyte infiltration. In the most types of cancer cells similar to M2 macrophages are dominant. TAMs M2 are characterized by pro-tumour properties. They promote angiogenesis, tumour growth, invasiveness and metastasis. Moreover, they are responsible for immunosupression including polarization of immunity into Th2 cells and induction of Treg cells. Inherence of macrophages in the tumour stroma of breast cancer is negative prognostic factor for patients. TAMs M2 stimulate the progression of cancer through CCL18 production and activation of WNT/β-cathenin signalling. 60 Marta Kucz1, Barbara Łasut2, Justyna Wilińska3 Dwa oblicza autofagii – dobry czy zły policjant w komórce nowotworowej? 1. Wstęp Choroby nowotworowe stanowią nadal poważny problem współczesnego społeczeństwa, głownie z uwagi na nieskuteczność, w wielu przypadkach, dostępnych obecnie metod terapii przeciwnowotworowej. Naukowcy poszukują nowych rozwiązań terapeutycznych analizując podstawowe mechanizmy regulujące rozwój nowotworów. Jednym z procesów, który budzi w ostatnim czasie duże zainteresowanie badaczy jest autofagia, odpowiadająca za utrzymanie homeostazy organizmu [1]. Zjawisko to obserwuje się również w przypadku chorób nowotworowych, gdzie przybiera dwojaką rolę, mogąc zapewniać zarówno przeżycie (zwiększanie oporności na chemioterapię), jak i śmierć komórek nowotworowych poprzez regulację procesu apoptozy, co w konsekwencji może prowadzić do pożądanego efektu leczniczego [1, 2, 3]. Praca ma na celu przedstawienie podstawowej wiedzy na temat procesu autofagii oraz jej roli w nowotworzeniu. 2. Pojęcie autofagii 2.1. Pochodzenie słowa autofagia, definicja, historia. Słowo autofagia pochodzi z języka greckiego i oznacza „auto” – samo i „phagy” – strawienie [4]. Jest to eukariotyczny proces katabolicznej, selektywnej i nieselektywnej degradacji wielkocząsteczkowych struktur cytoplazmatycznych, zachodzący w niewielkim stopniu w większości komórek [5]. Po raz pierwszy określenie „autofagia” zostało użyte ponad 40 lat temu przez Christiana de Duve, który obserwował degradację 1 [email protected], Koło Naukowe MEDIGENET przy Katedrze i Zakładzie Genetyki Medycznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach 2 [email protected], Koło Naukowe MEDIGENET przy Katedrze i Zakładzie Genetyki Medycznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach 3 [email protected], Koło Naukowe MEDIGENET przy Katedrze i Zakładzie Genetyki Medycznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach 61 Marta Kucz, Barbara Łasut, Justyna Wilińska mitochondriów oraz innych organelli komórkowych w obrębie lizosomów wątroby szczura, perforowanej hormonami trzustki oraz glukagonem [6]. Kluczowym celem autofagocytozy jest zachowanie wewnątrzkomórkowej homeostazy [1]. 2.2. Typy autofagii Autofagia dotyczy głównie całych organelli, ale również białek, których okres połowicznego rozpadu jest bardzo długi. Selektywny rozpad komórkowych organelli umożliwia swoisty podział tego procesu na określone podtypy: agrefagię – związaną z rozpadem agregatów białkowych, mitofagię – mitochondriów, retikulofagię – retikulum endoplazmatycznego, rybofagię – rybosomów, peksofagię i ksenofagię – kolejno peroksysomów i bakterii/wirusów [1]. Innym kryterium podziału omawianego procesu jest sposób transportu elementu przeznaczonego do degradacji do lizosomów. Stąd też wyróżnia się mikroautofagię, autofagię zależną od chaperonów, a także makroautofagię [4]. W trakcie mikroautofagii degradacji ulegają drobne organella lub związki w obrębie cytoplazmy, natomiast autofagia zależna od białek opiekuńczych (CMA) charakteryzuje się trawieniem protein lub peptydów występujących pojedynczo [2]. Najlepiej poznanym typem jest jednak makroautofagia (dalej nazywana autofagią), która dotyczy zarówno organelli jak i konglomeratów białkowych i białkowo-lipidowych [2]. Rysunek 1. Podstawowa klasyfikacja procesu autofagii: makroautofagia, mikroautofagia oraz autofagia zależna od chaperonów [7] 62 Dwa oblicza autofagii – dobry czy zły policjant w komórce nowotworowej? 2.3. Funkcje procesu autofagii Proces ten pod wieloma względami jest niezbędny w prawidłowym funkcjonowaniu komórki. Nasilenie procesu autofagii jest istotne dla mechanizmu adaptacyjnego, włączanego w sytuacjach niekorzystnych dla komórki. Podstawowym aktywatorem omawianego zjawiska są warunki stresowe [6]. Przykładem mogą być czynniki zarówno wewnątrz-, jak i zewnątrzkomórkowe, do których zalicza się hipoksję, agregację niewłaściwie pofałdowanych białek [1], czy też występujące w obszarze cytoplazmy nieprawidłowe bądź uszkodzone lub zbędne elementy strukturalne ulegające degradacji na korzyść komórki, stanowiące substrat budulcowy i energetyczny [5]. Autofagia jest zaangażowana w procesy fizjologiczne m.in. dojrzewanie erytrocytów albo biogenezę surfaktantu na powierzchni pneumocytów. Ponadto proces ten, reguluje długość życia organizmów. Podczas badania na modelu mysim, wykazano iż mutacja w genie Atg5, który jest niezbędny do zapoczątkowania procesu, prowadzi do śmierci noworodków tuż po urodzeniu [8]. Degradacja wielkocząsteczkowych składników cytoplazmatycznych na jednostki monomeryczne tj. grupy aminowe, kwasy tłuszczowe, czy też nukleotydy stanowi źródło do utrzymania prawidłowego metabolizmu jak i wewnątrzkomórkowej homeostazy tym samym promując przeżycie komórek [9]. W ostatnim czasie podkreśla się istotną rolę autofagii m.in. w procesie nowotworzenia, chorobach wirusowych, bakteryjnych, neurodegeneracyjnych oraz w zaburzeniach układu sercowo-naczyniowego [9]. 2.4. Mechanizm procesu autofagii Pierwszym etapem autofagii jest utworzenie autofagosomu. Do podetapów, prowadzących do jego powstania należą: inicjacja, nukleacja oraz elongacja [1]. W rezultacie następuje formowanie fagoforu stopniowo powiększającego swoje wymiary [2]. Za inicjację omawianego procesu odpowiedzialny jest kompleks ULK1/2:mAtg13:FIP200:Atg101 [10, 11], którego aktywność jest ściśle regulowana poprzez poziom uforsforylowania mAtg13 przy udziale szlaku mTOR. Brak jego aktywności powoduje defosforylację mAtg13, a w rezultacie daje możliwość stworzenia pełnego kompleksu i formowanie błony izolującej. Kinaza mTOR wykazuje swoją aktywność jako dwuskładnikowy kompleks składający się z podjednostek mTORC1 i mTORC2. Regulacja inicjacji procesu autofagii jest ściśle skorelowana z aktywnością mTORC1. W niekorzystnych dla komórki warunkach w tym np. niedotlenieniu czy niedoborze składników odżywczych, podjednostka mTORC1 oddysocjowuje 63 Marta Kucz, Barbara Łasut, Justyna Wilińska od kompleksu, co skutkuje deforforylacją ULK1 i mAtg13, zwiększając ich powinowactwo i umożliwia zajście procesu. Nukleacja uznawana jest za kolejny z podetapów tworzenia autofagosomu. Bardzo istną rolę ogrywa tu kompleks kinazy PI3K-III: Bekliny 1:kinazy serynowej p150, których połączenie umożliwia dalsze formowanie fagoforu [2]. Regulacja tego podetapu jest możliwa poprzez wpływ określonych białek na Beklinę 1. Do pozytywnych regulatorów zalicza się m.in. białka: Atg14/Barkor (na poziomie formowania autofagosomu), UVRAG (aktywacja PI3K oraz proces dojrzewania), VMP1 czy AMBRA1. Przykładem negatywnego regulatora kompleksu jest białko Rubicon wpływające na proces dojrzewania oraz na białka z rodziny Bcl-2 [1]. Elongacja to etap zależny od dwóch sprzężonych ze sobą systemów ubiktiwynopodobnych: Atg12:Atg5 i LC3-II-PE [1, 2]. Proces tworzenia pierwszego z nich to szereg reakcji z udziałem białek Atg12, 7, 10, prowadzących do nieodwracalnego połączenia Atg12 i Atg5. W kolejnym etapie następuje nietrwałe wiązanie kompleksu z białkiem Atg16L oraz multimeryzacja, umożliwiająca wytworzenie błony izolującej, ulegającej elongacji i prowadzącej do powstania autofagosomu [1, 2]. Zarówno w strukturach preautofagosomalnych, jak i autofagosomach obecne jest białko MAPILC3 występujące w trzech postaciach. LC3-I to postać obecna w cytoplazmie, natomiast forma LC3-II to białko związane z błoną zewnętrzną i wewnętrzną autofagosomui ulegająca wiązaniu z PE-fosfatydyloetanoloaminą, dzięki aktywności Atg3. Oznaczenie poziomu obu postaci białka LC3 stanowi jedną z możliwości detekcji postępu i aktywności mechanizmów autofagii. Po uformowaniu autofagosomu następuje proces fuzji pomiędzy autofagosomem a lizosomem. Kilkuetapowe dojrzewanie polegające na łaczeniu autofagosomu z lizosomem możliwe jest dzięki transportowej funkcji endosomów, zapewniających dostarczenie substancji niezbędnych do prawidłowego utworzenia autofagolizosomu. W trakcie tego etapu następuje również optymalizacja pH, dzięki temu uzyskuje się prawidłową aktywność enzymów lizosomalnych. Ponadto odpowiednie funkcjonowanie enzymów jest umożliwione dzięki fuzji autofagosomu z endosomami. W etapie tym uczestniczą białka SNARE, NSF, LAMP-2 i GTPazy oraz elementy cytoszkieletu. Głównym regulatorem determinującym powstanie struktury fuzyjnej jest białko Rab7 [1]. Ostatecznym etapem autofagii jest proces degradacji zawartości autofagolizosomu przy udziale enzymów lizosomalnych, a za eliminację produktu w postaci ciałek resztkowych odpowiedzialne jest białko Atg15 oraz białko Atg22 [2]. 64 Dwa oblicza autofagii – dobry czy zły policjant w komórce nowotworowej? Rysunek 2. Mechanizm molekularny autofagii [2] 3. Powiązanie procesu autofagii z apoptozą Apoptoza i autofagia to procesy zróżnicowane pod wieloma względami, jednakże o wielu powiązaniach na szczeblu molekularnym. Istnieją dowody sugerujące, że autofagia w warunkach fizjologicznych pełni głównie rolę cytoochronną. Cytoprotekcyjna funkcja autofagii jest związana z ujemną modulacją procesu apoptozy. Sama apoptoza z kolei, może uczestniczyć 65 Marta Kucz, Barbara Łasut, Justyna Wilińska w hamowaniu autofagii, co sugerują pewne powiązania i zależności pomiędzy tymi procesami m.in. związanymi z obecnością białka Atg5 zaangażowanego w autofagiczny etap elongacji. Ponadto, produkt cięcia białka translokowany jest do mitochondriów i stanowi ważny czynnik proapoptotyczny. Zależność ta wskazuje na przeciwstawny antagonizm procesów apoptozy i autofagii [1,10]. Kolejnym elementem łączącym oba procesy są powiązania na poziomie białek z rodziny Bcl-2. Interakcję pomiędzy białkami antyapoptotycznymi tj. Bcl-2, Bcl-XLi proapoptotycznymi tj. Bax, Bad, Bad, Bik, Puma, Nox, są umożliwione za pośrednictwem domeny BH3 białka antyapoptotycznego/ proapoptotycznego z N- końcową domeną BH3 Bekliny 1. Oddziaływanie te jest regulowane poprzez poziom ufosforylowania tych białek i tym samym wpływa na możliwość indukcji autofagii. W przypadku białek antyapoptotycznych ma miejsce inhibicja polegająca na zmniejszeniu powinowactwa Bekliny 1 do PI3KC3 po powstaniu kompleksu Bl2/Bcl-XlBeklina1-PI3K. Zdolność utworzenia kompleksu regulowana jest przez poziom fosforylacji tych białek. Ufosforylowanie Bcl-2 umożliwia jego przyłączenie do Bax z jednoczesnym zahamowaniem apoptozy, natomiast jego hiperfosforylacja powoduje rozłączenie się białek i tym samym umożliwia zajście apoptozy. Inną zależnością pomiędzy tymi procesami jest blokada na poziomie mechanizmu receptorowego apoptozy przy udziale białka FLIP, którego nadekspresję obserwuje się w przypadku procesów nowotworowych. Ponadto białko FLIP może przyłączyć się do białka Atg3, pełniącego istotną rolę w autofagii, co powoduje zahamowanie procesu. Tym sposobem zwiększony poziom białka FLIP może hamować indukcję jednocześnie obu procesów [1, 2, 3]. 4. Proces o dwóch twarzach? – Autofagia w nowotworzeniu 4.1. Rola autofagii w procesie nowotworowym Rola autofagii w występowaniu i powstaniu nowotworu jest nadal tematem wielu dyskusji i nie jest do końca jednoznaczna. Proces autofagii jest ściśle skorelowany z procesem nowotworzenia, co wykazano już w 1999 roku dowodząc roli Bekliny 1 jako supresora kancerogenezy [4]. W przypadku komórek nowotworowych pełni funkcję zabezpieczającą je przed niekorzystnymi warunkami środowiska – tj. niedoborem składników odżywczych, czy stresem komórkowym [12]. Dziś powszechnie przyjmuje się, że autofagia może pełnić rolę supresora procesu nowotworowego, przy czym jest ona zależna od rodzaju schorzenia, stopnia zaawansowania procesu chorobowego oraz podłoża 66 Dwa oblicza autofagii – dobry czy zły policjant w komórce nowotworowej? genetycznego [3]. Istnieją dowody, które wskazują na to, że autofagia może chronić przed rozwojem transformacji nowotworowej poprzez ograniczenie martwicy i przewlekłego stanu zapalnego, który jest związany z uwalnianiem pro-zapalnego czynnika HMGB1.[4] Jednocześnie omawiany proces uczestniczy w nadawaniu komórkom tolerancji na warunki stresowe i wpływa na ich żywotność. Obniżenie aktywności transkrypcyjnej genów, które odpowiadają za autofagię może spowodować wprowadzenie komórki na drogę programowanej śmierci. Jednocześnie wzmożona proliferacja komórek nowotworowych jest powodem wysokich wymagań metabolicznych. W modelu in vivo ekspozycja na stres, który jest spowodowany brakiem metabolitów upośledza przeżywalność komórek, u których stwierdza się wejście w programowaną śmiercią komórkową. Nasilenie procesu autofagii zaobserwowano m.in. w przypadku linii komórkowych nowotworu trzustki. Hamowanie autofagii w takich komórkach prowadzi do regresji guza. Komórki, które przeżyły chemioterapię bądź radioterapię aktywują autofagię, co może umożliwiać chwilowe uśpienie komórek nowotworowych, a w późniejszych etapach przyczyniać się do nawrotu choroby. Udowodniono, że hamowanie autofagii przyczynia się do skuteczności terapii przeciwnowotworowej wykazując tym samym jej działalność cytoprotekcyjną [13]. Wykorzystując działanie protekcyjne względem komórek mające na celu utrzymanie homeostazy i stabilności genomu [4], manipulacje aktywnością tego procesu poprzez jej hamowanie bądź indukowanie mogłyby stanowić potencjalną strategię w hamowaniu rozwoju nowotworu, czy też uniemożliwianie inicjacji procesu transformacji nowotworowej [9,5]. 4.2. Przegląd wybranych mechanizmów w procesie nowotworzenia mających związek z autofagią W przypadku nowotworów obserwowane są działania prowadzące do zahamowania wzrostu komórek, inhibicji mutagenezy oraz eliminacji uszkodzeń spowodowanych przez reaktywne formy tlenu, w tym wolne rodniki. Dochodzi wówczas do degradacji nieprawidłowych mitochondriów, co minimalizuje stres oksydacyjny. Degradacji ulegać mogą nie tylko mitochondria, ale i inne organella komórkowe, a zmiany zachodzące podczas danego procesu prowadzić mogą do śmierci komórek nowotworowych. Dane mechanizmy mogą więc świadczyć o silnej roli autofagii w działalności przeciwnowotworowej, która w połączeniu z zastosowaniem leków min. rapamycyny, tamoksyfenu, inhibitorów deacetylazy histonowej, czy trójtlenku arsenu [9], może stanowić potencjalnie skuteczną strategię destrukcji komórek nowotworowych. 67 Marta Kucz, Barbara Łasut, Justyna Wilińska 4.2.1. PI3K/Akt jako regulator PI3K- kinaza 3-fosfatydyloinozytolu to białko spełniające wiele istotnych funkcji w licznych procesach komórkowych, regulujące także proces autofagii. Wyróżnia się 3 klasy PI3K mogące spełniać przeciwstawne funkcje w regulacji omawianego procesu. III klasa aktywuje autofagię, oddziałując na poziomie formowania autofagosomu poprzez interakcję z drugim pozytywnym regulatorem autofagii -Bekliną 1. Klasa I hamuje z kolei autofagię poprzez interakcję ze szlakiem Akt/PBK [4]. PI3K I jako heterodimer składa się z podjednostek p110-katalitycznej i p85-regulacyjnej. Jej aktywacja następuje po związaniu z kinazą tyrozynową RTK. Następnie zachodzi fosforylacja zlokalizowanych w obszarze błony substratów PIP2 – co generuje powstanie produktu – PIP3. Negatywnym regulatorem autofagii jest także supresor transformacji nowotworowej – białko PTEN, warunkujące defosforylację PIP3 akumulującego się i oddziałującego na PDK1. Fosforylacja PDK1 i mTORC2 aktywuje finalnie Akt, co z kolei promuje przeżycie komórek dzięki fosforylacji białek MDM2, GSK3α, GSK3P, FoxO, TSC2, BCL2, BIM i Bcl2 [2, 4]. Aktywacja Akt wpływa również na uaktywnienie mTORC2, poprzez umożliwienie gromadzenia Rheb, jak i mTORC1, które pełni bardzo istotną rolę w regulacji autofagii hamując aktywność AMPK [1]. Zaburzenia aktywności ścieżki PI3K I-Akt obserwuje się w wielu typach nowotworów m.in. mózgu, płuc czy piersi. Najczęściej występującym mechanizmem jest nieprawidłowość w obszarze aktywności kinazy tyrozynowej związana z zaburzeniami w negatywnej regulacji autofagii na poziomie Akt/PKB [4]. Zależność między autofagią, a regulującymi ją ścieżkami molekularnymi stanowi kolejny dowód na korelację danego procesu z procesami nowotworzenia. Dokładny mechanizm wpływu autofagii na rozwój nowotworu nie jest do końca jasny, jednakże fakt, iż indukcja autofagii może zależeć od supresorów nowotworowych tj. dwóch najczęściej ulegających mutacjom genów P53 i PTEN, a inhibicja tego procesu jest zależna od bezpośredniego wpływu Bcl-2 na Beclinę 1, sugeruje się jej istotną rolę przeciwnowotworową [9]. 4.2.2. Autofagia jako supresor transformacji nowotworowej i promotor rozwoju nowotworów zwiększający oporność na terapię przeciwnowotworową Niemożliwe jest jednoznaczne określenie roli autofagii w procesie nowotworzenia. Przede wszystkim autofagia jest niezbędnym procesem do zapobiegania chorobie nowotworowej. W wyniku eliminacji uszkodzonych mitochondriów autofagia przyczynia się do zniwelowania występującego 68 Dwa oblicza autofagii – dobry czy zły policjant w komórce nowotworowej? stresu oksydacyjnego i obniżenia ilości mutacji. Potwierdzeniem funkcji okazuje się, badanie na modelu mysim w którym utrata jednego z alleli Bekliny 1, czyli genu o kluczowej roli w procesie autofagii, powoduje rozwój wielu spontanicznych nowotworów, takich jak nowotwory płuc, wątroby, białaczka oraz chłoniaki [5]. Hamowanie procesu autofagii obserwuje się w przypadku wielu typów nowotworów. Na przykład w przypadku glejaka wielopostaciowego obserwuje się zmniejszenie ekspresji genu BECN1 kodującego Beklinę 1 i tym samym hamowanie omawianego procesu. Zmiany ekspresji wymienionego genu zaobserwowano również w innych typach komórek nowotworowych tj. w przypadku raka szyjki macicy, wątroby czy jelita grubego. Ponadto wskazuje się istnienie korelacji pomiędzy zmniejszeniem ekspresji BECN1, a złym rokowaniem [1]. Przykładem związku pomiędzy autofagią, a blokowaniem transformacji nowotworowej jest mutacja genu UVRAG, którego nadekspresja ogranicza proliferację komórek [1]. Białko kodowane przez ten gen uznano za pozytywny regulator autofagii, z uwagi na jego oddziaływanie z Bekliną 1, oraz zwiększanie aktywności kinazy PI3KC3, co warunkuje hamowanie rozwoju guza [4]. Mediatorem pozytywnie stymulującym autofagię pobudzającym formowanie autofagosomu i tym samym zapobiegającym inicjacji transformacji nowotworowej jest białko Bif -1. Mechanizm,w który jest zaangażowane to białko nie został w pełni wyjaśniony, jednakże interakcja białka z Bekliną 1 poprzez UVRAG stanowi dowód na jego rolę w omawianym procesie, a tym samym wskazuje na przeciwnowotworową rolę autofagii [4]. Obniżona aktywność danego procesu związana z występowaniem nowotworu oraz przytoczone przykłady zaobserwowanych zależności mogą świadczyć o roli procesu autofagii w supresji transformacji nowotworowej. Ponadto promocja rozwoju guza jest procesem ściśle związanym z procesem autofagii jako naturalnym mechanizmem obronny komórki, która została poddanna działalności niekorzystnych warunków środowiskowych tj. niedotlenienie czy stres oksydacyjny. W związku z panującym stanem hipoksji w komórkach nowotworowych, następuje aktywacja czynnika HIF-1alfa aktywującego BNIP3, który uczestniczy zarówno we wczesnych etapach inicjacji autofagii jak i tworzeniu autofagolizosomu. Działalność regulacyjna opiera się na konkurencyjnym wiązaniu przy pomocy domeny BH3 białka proapoptotycznego BNIP3 oraz Bekliny 1 do antyapoptotycznych białek. Utworzenie kompleksu BNIP3 z białkiem antyapoptotycznym powoduje uwolnienie Bekliny 1 i aktywację autofagii. 69 Marta Kucz, Barbara Łasut, Justyna Wilińska [1, 5]. Dany mechanizm zatem nie tylko umożliwia regulację i inicjację procesu autofagii, ale tym samym potwierdza wzajemną relację pomiędzy apoptozą i autofagią oraz rolę autofagii w występującym nowotworze . Należy mieć na uwadze fakt, że autofagia odgrywa także rolę w nabywaniu prze komórki nowotworowe oporności na stosowaną terapię, co jest związane z jej indukcją i zwiększoną aktywnością po podaży określonych substancji o działaniu przeciwnowotworowym m.in. rapamycyna, doksorubicyna, temozolomidu [1]. Autofagia odpowiada także za wzrost oporności komórek nowotworowych na terapię antyangiogenną poprzez ich adaptację do niekorzystnych warunków [5]. Aktywacja procesu autofagii związana z promocją przeżycia komórek nowotworowych, warunkuje także silne działanie antyapoptotyczne i umożliwia rozwój oporności oraz znacznie obniża oczekiwaną skuteczność terapii przeciwnowotworowej [5]. Myśląc o autofagii, jako potencjalnym celu terapii przeciwnowotworowej należy wziąć pod uwagę jej dwojaki charakter. Mechanizmy towarzyszące autofagii prowadzą bowiem z jednej strony do opisanych wyżej działań supresorowych i proapoptotycznych, z innej zaś do promocji rozwoju nowotworu oraz rozwoju oporności na stosowaną tradycyjnie terapię przeciwnowotworową. W zależności od molekularnych zaburzeń występujących w danym typie nowotworu modyfikacje aktywności autofagii poprzez wyciszenie genów odpowiednim siRNA w połączeniu z odpowiednimi środkami leczniczymi, czy wzmaganie jej pozytywnej regulacji może stanowić potencjalną strategię terapeutyczną [14]. 5. Podsumowanie Określenie roli autofagii w procesie nowotworowym jest bardzo istotne, ponieważ może umożliwić opracowanie skutecznych metod terapii skojarzonych poprzez manipulację aktywnością tego procesu. Może także pozwolić zapobiegać transformacji nowotworowej. Autofagia i jej powiązanie z procesem apoptozy może okazać się nowym, potencjalnym celem terapii przeciwnowotworowej[15,16]. Podziękowania Dziękujemy Pani Doktor Monice Paul-Samojedny za cenne wskazówki i oparcie, które jest dla nas niezbędne w podążaniu ścieżkami odkrywającymi zakątki nauki. 70 Dwa oblicza autofagii – dobry czy zły policjant w komórce nowotworowej? Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Polewska J. Autofagia- mechanizm molekularny, apoptoza i nowotwory, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 44 (2012), s.921-934 Lisiak N., Totoń E., Rybczyńska M. Autofagia, nowe perspektywy w terapii przeciwnowotworowej, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 48 (2014),s. 925-935 Janji B., VIry E., Baginska J., Moer K.V., Berchem G. Role of Autophagy in Cancer and Tumor Progression, In Tech, (2013), s.189-214 Liu B., Cheng Y., Liu Q., Bao J., Yang J. Autophagic pathways as new targets for cancer drug, Acta Pharmacologica Sinica, 31(9) (2010), s.1154-1164 Świderek E., Strządała L. Autofagia i białko BNIP3 w nowotworach, Postępy Higienyi Medycyny Doświadczalnej, 67 (2013), s. 63-370 Glick D., Barth S., Macleod K.F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms, Journal of Pathology, 221(1) (2010), s. 3-12 Worawan E., Berghe T.V., Lippens S., Agostinis P., Vandenabeele P. Autophagy: for better or for worse; Cell Research, 22 (2012), s.43-61 Joseph D.M i Kimmelman A.C. Targeting Autophagy Addiction in Cancer. Oncotarget. 12 (2011), s.1302-1306 Hippert M.M., O‟Toole P.S., Thorburn A.Autophagy in Cancer: Good, Bad, or Both,?,Cancer Research, 66(2006), s.9349-9351 Gordy C., He Y.The crosstalk between autophagy and apoptosis: where does this lead?, Protein Cell, 3(1) (2012), s.17-27 Behrends C., Sowa M. E., Steven P., Gygi J., Harper W. Network organization of the human autophagy system, Nature, 466(7302) (2010), s.6-76 Steeves M.A., Dorsey F.C., Cleveland J.L. Targeting the Autophagy Pathway for Cancer Chemoprevention, Current Opinion in Cell Biology, 22(2) (2010), s. 218-225 Young Z.J., Chee C.E., Huang S., Sinicrope F.A. The Role of Autophagy in Cancer: Therapeutic Implications.Mol Cancer Ther. 2011; 10(9):1533-1541 Mizushima N., Levine B., Cuervo A.M., Klionsky D.J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion, Nature, 28; 451(7182) (2008), s.1069-1075 Rudnicka K.W., Szczęstna E., Miszczyk E., Mikołajczyk-Chmiela M. Apoptoza i autofagia-mechanizmy i metody detekcji, Postępy biologii komórki, 38 (2) (2011), s.247-265 Janji B., VIry E., Baginska J., Moer K.V., Berchem G. Role of Autophagy in Cancer and Tumor Progression, In Tech, (2013), s.189-214 Wykaz skrótów: Akt/PKB – (ang. protein kinase B) – kinaza proteinowa B, AMBRA1 – (ang. Autophagy/Beclin-1 Regulator ) – gen regulujący Beklinę 1 w procesie autofagii, AMPK- (ang. 5'AMP-activated protein kinase)- kinaza aktywowana 5‟AMP, Atg 3,5,10,12,14, 16L, 22 (ang. autophagy-related ubiquitin-like protein family) – białka uczestniczące w procesie autofagii, Bad – białko Bad 71 Marta Kucz, Barbara Łasut, Justyna Wilińska należy do rodziny Bcl2, czyli białek proapoptotycznych, Barkor- (ang.Beclin1-associated autophagy-related key regulator ) białko regulatorowe autofagii oddziałujące z Bekliną 1), Bax – białko Bax należy do rodziny Bcl2, czyli białek proapoptotycznych, BCL2 (ang. BCl2 protein family)- rodzina białek proapoptotycznych Bcl2, BECN1 (ang. beclin 1, autophagy related)- gen kodujący Beklinę 1, BH3(ang. interacting-domain death agonist)/Bid - białko BH3/BID należy do rodziny Bcl2, czyli białek proapoptotycznych, Bif1 (ang. Bax-interacting factor 1) – czynnik oddziałujący z białkiem Bax, Bik (ang. Bcl-2-interacting killer)- białko Bik należy do rodziny Bcl2, czyli białek proapoptotycznych, BIM - białko Bim należy do rodziny Bcl2, czyli białek proapoptotycznych, BNIP3 (ang. Bcl-2/adenovirus E1B-19 kDa interacting protein 3)– białko opiekuńcze, białko wiążące Bcl-2 i adenowirusowe białko E1B-19 kDa 3CMA, FIP200 (ang. focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kDa)- białko wchodzące w skład kompleksu uczestniczącego w inicjacji autofagii,FLIP (ang. FADD-like interleukin-1b-converting enzymelike protease (FLICE/caspase- 8)-inhibitory protein)- białko hamujące FLICE/kaspazę 8, FoxO (ang. Forkhead box O3)- czynnik transkrypcyjny, GSK3P (ang. Glycogen synthase kinase 3p) – kinaza uczestnicząca w syntezie glikogenu, GSK3α (ang. Glycogen synthase kinase 3α) – kinaza uczestnicząca w syntezie glikogenu, GTPazy – hydrolazy GTP, HIF-1α (ang. hypoxiainducible factor 1α) czynnik transkrypcyjny indukowany hipoksją, HMGB1 (ang. High-mobility group protein B1)- amfoteryna, kodowana przez gen HMGB1, LAMP-2 (ang. Lysosome-associated membrane protein 2)- lizozym związany z białkiem błonowym 2, LC3-II (ang. protein 1 light chain 3) – homolog białka Atg8, MAPILC3 (ang. microtubule-associated protein I light chain 3) - białko związane z mikrotubulami, MDM2 (ang. Mouse double minute 2 homolog) – homolog mysiego białka MDM, mTOR (ang.mammalian target of rapamycin) - cel rapamycyny w komórkach ssaków, kinaza mTOR, Nox (ang. NADPH oxidase) – oksydaza NADPH, NSF (ang. N-ethylmaleimide sensitive fusion protein)- N-etylmaleimidu wrażliwe białko fuzyjne, P53 (ang. protein P53)- białko proapoptotyczne, supresor nowotworowy, PDK1 (ang. 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1) kinaza białkowa zależna od fosfatydyloinozytolu, PIP2 - fosfatydyloinozytolo 4,5-difosforan, PIP3 - fosfatydyloinozytolo-3,4,5-trifosforanu, PTEN (ang.3phosphoinositide-dependent protein kinase 1)- kinaza trifosforanufosfatydyloinozytolu, Puma (ang. The p53 upregulated modulator of apoptosis) – białko regulujące apoptozę, Rab7 (ang. Ras-related protein Rab-7) – białko powiązane z białkiem Ras, Rheb (ang. Ras homolog enriched in brain) – homolog białka Ras wiążący GTP, RTK (ang. receptor tyrosine kinase) – receptorowa kinaza tyrozynowa Rubicon, siRNA (ang. small RNA)- krótkie odcinki RNA, posiadają funkcję wyciszającą gen, SNARE (ang. an acronym derived from "SNAP (Soluble NSF Attachment Protein) Receptor) – grupa 72 Dwa oblicza autofagii – dobry czy zły policjant w komórce nowotworowej? białek należących do dużej rodziny białek transbłonowych.,TSC2 (ang. tuberous sclerosis complex 1) – hemartyna, ULK(ang. uncoordinated-51-like kinase-1) – kinaza serynowo-treoninowa, uczestnicząca w inicjacji autofagii,UVRAG (ang. UV irradiation resistance-associated gene) – białko oddziałujace z Bekliną 1, promujące autofagię Dwa oblicza autofagi – dobry czy zły policjant w komórce nowotworowej? Streszczenie Autofagia jest niezwykle sklomplikowanym procesem, o szczególnym znaczeniu w wewnątrzkomórkowej homeostazie. Zjawisko ma powiązanie z procesem apoptozy i odgrywa szczególne znaczenie w nowotworzeniu. Niniejsza praca ma na celu przedstawienie głównych podstaw teoretycznych na temat zjawiska autofagii oraz dwojakiej roli, jaką odgrywa w rozwoju chorób nowotworowych. Two face of autophagy – good or bad cop in tumor cell Abstract Autophagy is an extremely complicated process, with a particular importance in the intracellular homeostasis. This phenomenon has a connection with the process of apoptosis and plays a special role in tumorigenesis. This review present the main theoretical basis of the phenomenon of autophagy and the dual role that it played in the development of cancer. 73 Anna Łabejszo1, Joanna Woźniak2, Tomasz Wandtke3 Macierzyste komórki nowotworowe – wyzwania i perspektywy 1. Komórki macierzyste Komórki macierzyste charakteryzują się dwiema wyjątkowymi cechami: zdolnością do nieustannego dzielenia i różnicowania się w różne typy tkanek, budujące organizm. Występują prawdopodobnie na każdym etapie rozwoju wszystkich wielokomórkowych organizmów [1]. Na podstawie ich zdolności do różnicowania możemy wyróżnić kilka typów komórek macierzystych : totipotentne, pluripotentne, multipotentne oraz unipotentne. Pierwsze z nich mogą się różnicować w każdy typ komórek, tworzących ludzki organizm. Taką komórką jest również zygota czy komórka jajowa. Pluripotentne, podobnie jak totipotencjalne, mogą się różnicować w każdy typ komórek tworzących ludzki organizm, lecz nie mają zdolności do różnicowania się w komórki pozazarodkowe. Kolejnym typem komórek macierzystych są komórki multipotentne, które mają zdolność różnicowania się do komórek danej tkanki czy narządu, natomiast unipotentne są zdolne do różnicowania się w jeden charakterystyczny typ komórek danej tkanki, w której się znajdują [2]. Obecność komórek macierzystych w okresie pozapłodowym wydaje się być niezbędna z uwagi na fakt, iż stanowią one rezerwuar komórek zróżnicowanych, uzupełniając braki w puli komórek już wyspecjalizowanych. Mogłoby się wydawać, że dzięki nieograniczonemu potencjałowi proliferacyjnemu komórek macierzystych powinno być bardzo dużo. Rzeczywistość okazuje się inna, ponieważ z uwagi na błędy replikacji czy też mechanizm zabezpieczający przed wyczerpaniem się tych komórek, ich ilość jest stosunkowo mała (szpik kostny: około 10%). Komórki macierzyste występują również w innych narządach, takich jak: mięśnie, wątroba, czy mózg. Perspektywy wykorzystania ich „ogromnego potencjału proliferacyjnego” są duże i w związku z tym znalazło to 1 [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy 2 [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy 3 [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy 74 Macierzyste komórki nowotworowe – wyzwania i perspektywy zastosowanie m. in. w medycynie regeneracyjnej, inżynierii tkankowej, terapii genowej oraz w próbach leczenia chorób nowotworowych [4,5]. 2. Nowotworowe komórki macierzyste Dla wielu typów nowotworów udowodniono, że rozwijają się one z komórek mających cechy komórek macierzystych pluripotencjalnych, a także o właściwościach przypominających embrionalne komórki macierzyste. Komórki te noszą nazwę macierzystych komórek nowotworowych (cancer stem cells, CSCs) lub komórki inicjujące nowotwór (tumor initiating cells –TICs) [6,7]. Komórki te wykazują znacznie większą zdolność do nowotworzenia w porównaniu do zwykłej komórki nowotworowej, a także mogą być główną przyczyną powstawania przerzutów [9]. Nowotworowe komórki macierzyste mają nieograniczony potencjał proliferacyjny w przeciwieństwie do zwykłych komórek macierzystych. W związku z tym teoria, która pojawiła się stosunkowo niedawno, bo około 40 lat, o macierzystych komórkach nowotworowych rzuca nowe spojrzenie na przyczynę heterogenności nowotworów i częste przerzuty. Jest to również niewątpliwe wyzwanie dla naukowców oraz szansa na postawienie trafnej diagnozy, jak i opracowania nowych strategii terapeutycznych w onkologii [10]. Nowotworowe komórki macierzyste w procesie kancerogenezy Powszechnie uważa się, że onkogeneza jest inicjowana w zdrowych komórkach macierzystych danej tkanki lub też komórkach progenitorowych, powstałych z komórek macierzystych. Istniejące w nich mechanizmy samoodnawiania zapewniają im długowieczność w danej niszy. Kancerogeneza związana jest z nagromadzeniem się zmian w obrębie materiału genetycznego, co nosi nazwę mutacji. Ponadto, komórka, która jest elementem odnawiającej się populacji i po oddzieleniu od mikrośrodowiska, może być inicjatorem nowotworu. Aby zdrowa komórka stała się komórką nowotworową konieczne jest zajście od 3 do 7 mutacji w jej materiale genetycznym. Wówczas taka komórka osiąga zdolność do niekontrolowanych podziałów i staje się początkiem procesu kancerogenezy. Jest to tak zwana teoria somatycznych mutacji [12]. Taka zmutowana komórka posiadając odmienne cechy funkcjonalne i fenotypowe w porównaniu do zdrowej komórki, przypomina komórkę macierzystą. W literaturze można znaleźć trzy koncepcje rozwoju procesu kancerogenezy. Pierwszą z nich jest teoria stochastyczna, która zakłada, że cała pula komórek nowotworowych jest homogenna. Jednak dziś już wiemy po serii badań nad chroniczną białaczką szpikową (AML), które udowodniły heterogenność nowotworu, że teoria stochastyczna nie jest już brana pod uwagę [13]. Bardziej prawdopodobną wydaje się być koncepcja 75 Anna Łabejszo, Joanna Woźniak, Tomasz Wandtke hierarchiczna [6], według której tylko nieliczna grupa komórek nowotworowych posiada zdolność rozwoju guza i są przyczyną progresji choroby nowotworowej. Trzecia koncepcja, czyli model klonalnej ekspansji zakłada, że jedna z komórek, która nabyła najkorzystniejsze mutacje, dominuje nad innymi typami TICs i ulega aktywnej proliferacji. Następnie kiedy inna komórka nabędzie dodatkowej mutacji, która ją „wyróżni” spośród całej populacji, wówczas ona zacznie ulegać klonowej ekspansji. Mechanizm ten jest powtarzalny dla kolejnych etapów postępującej onkogenezy. Żadna z koncepcji nie wydaje się być bardziej przekonywująca, ponieważ najprawdopodobniej obie teorie współistnieją i uzupełniają się, co znacznie utrudnia poszukiwanie odpowiedniej metody zwalczania nowotworu. CSCs nabywając coraz to nowsze cechy fenotypowe, takie, jak: odporność na radio- i chemioterapię czy w przypadku raka jelita grubego zmiana poziomu cząsteczki CD133 spowodowana możliwością tworzenia przerzutu, zabezpieczają się w mechanizmy obronne, co daje im szanse na coraz to większą ekspansję [14]. Etapy rozwoju nowotworu [15]: • Preinicjacja – czynniki mutagenne powodują uszkodzenia w materiale genetycznym • Inicjacja – liczne mutacje w materiale genetycznym • Promocja – pojawienie się zmian somatycznych w komórkach potomnych komórki zmutowanej • Progersja – niekontrolowana proliferacja komórek i ich odróżnicowanie • Przerzuty – komórki powstałe w fazie progresji zdolne są do przemieszczania się 3. Markery nowotworowych komórek macierzystych Spośród markerów nowotworowych komórek macierzystych zdecydowaną większość stanowią markery zewnątrzkomórkowe. Przykładem takiej cząsteczki jest np. CD133 (białko występujące w błonie plazmatycznej, którego ekspresja zależy od fazy cyklu komórkowego. Jest ono pomocnym markerem w wykrywaniu raka płuca, jelita grubego czy mięsaka Ewinga. Często identyfikowane są również białka zaangażowane w szlak Wnt/βkatenina, który jest niezwykle istotny w rozwoju nowotworu. Badaniom podlega np. β-katenina- centralne białko ścieżki sygnałowej, wspomnianej powyżej, która definiuje CSCs raka gruczołu krokowego, piersi i żołądka. Innym białkiem zaangażowanym w szlak Wnt/β-katenina jest EpCam, którego funkcją jest stymulowanie namnażania komórek. To białko błonowe najczęściej można zidentyfikować w raku trzustki oraz jelita grubego. Niezwykle ważnymi markerami są stężenia enzymów cytoprotekcyjnych, np. dehydrogenazy aldehydowej ALDH, której wysoki poziom ekspresji 76 Macierzyste komórki nowotworowe – wyzwania i perspektywy może utrudniać elimancję guza. Markerów nowotworowych jest znacznie więcej i każdy z nich identyfikuje inne nowotworowe komórki macierzyste, bowiem badaczom nie udało się znaleźć jednego powszechnie występującego markera [16]. 4. Nowotworowe komórki macierzyste występujące w raku płuca Rak płuca jest najczęstszą przyczyną zgonów spośród zidentyfikowanych chorób nowotworowych na świecie. Wyróżniamy: niedrobnokomórkowego raka płuc (ang. non small cell lung carcinoma- NSCLC), co stanowi 80% przypadków i drobnokomórkowego raka płuc (ang. small cell lung carcinoma- SCLC), stanowiących 20% wszystkich nowotworów płuc. Najczęstsze formy NSCLC to gruczolakorak (30-50% NSCLC) i rak płaskokomórkowy (30% NSCLC). Perspektywiczne leczenie jest ukierunkowane na profil genetyczny nowotworów. Jednak ostatnie badania sekwencjonowania nowej generacji pokazują znaczny stopień niejednorodności genetycznej w każdym histologicznym podtypie, co dostarcza coraz to nowszych wyzwań dla współczesnej medycyny. Tkanka płucna składa się z różnych typów komórek, w tym podstawowych śluzowowydzielniczych komórek tchawicy i oskrzeli, oskrzelików i pęcherzyków pneumocytarnych typu I oraz II. Wszystkie te dojrzałe typy komórek pochodzą z linii komórek progenitorowych płuc, które są z kolei otrzymane z niezróżnicowanych multipotencjalnych komórek macierzystych tkanki płucnej. Podobnie jak komórki macierzyste innych tkanek, komórki macierzyste tkanki płucnej potrzebne są w celu utrzymania odpowiedniej ilości komórek i uzupełniania braków. Została zdefiniowana ich zdolność do samo-odnawiania, proliferacji i różnicowania. Populację płucnych komórek macierzystych zlokalizowano po raz pierwszy na skrzyżowaniu kanałów oskrzelowych i nazwano je odpowiednio, oskrzelowymi komórkami macierzystymi (ang. bronchio-alveolar stem cells BASCs). Hodowane BASCs wykazywały szereg właściwości komórek macierzystych, a ich zmodyfikowane odpowiedniki nawet powodowały gruczolakoraka. Tym samym dostarczyło to wskazówki, że ta linia komórkowa może posłużyć jako grupa docelowa w diagnostyce nowotworów układu oddechowego [8]. 5. Macierzyste komórki nowotworowe jako jedyna przyczyna nowotworu? Wielkie nadzieje, na rozwiązanie problemu choroby nowotworowej dało odkrycie CSCs. Testy, które wykorzystujące ksenotransplantację dostarczyły dowodów na istnienie nowotworowych komórek macierzystych. Aby zaszła proliferacja i utworzenie guza przez przeszczepione ludzkie komórki 77 Anna Łabejszo, Joanna Woźniak, Tomasz Wandtke nowotworowe, konieczna jest ich adaptacja w obcym środowisku [7]. Więc może to nie możliwość nowotworzenia, a adaptacja w nowym środowisku ma kluczowe znaczenie w rozwoju kancerogenezy? W badaniach nad nowotworami niejednokrotnie wykorzystywano model mysi i ksenotransplantację, czyli przeszczepienie tkanki lub narządu między osobnikami należącymi do różnych gatunków. Jednym z problemów jaki się pojawił przy interpretacji wyników był fakt, że organizmy zwierząt laboratoryjnych z upośledzoną odpornością nie mają limfocytów ani makrofagów. Komórki te, odgrywają znaczącą rolę w procesach wzrostu guza i angiogenezy. Stąd pojawia się pytanie czy naukowcy będą w stanie idealnie odwzorować mikrośrodowisko guza ludzi [21,22]. W trakcie badań nad nowotworowymi komórkami macierzystymi badacze natknęli się na pewne problemy i nieścisłości związane z istnieniem CSCs. Pierwszym z nich jest założenie, że CSCs od początku wykazują oporność na leczenie i tylko likwidacja ich komórek progenitorowych da efekt terapeutyczny. Kierując się tym założeniem komórki progenitorowe powinny nie być oporne na chemioterapię przez cały okres jej trwania, dopóki nie pojawi się ona nie pojawi. Oczywiście w rzeczywistości tak nie jest, ponieważ jednym z markerów CSC jest podwyższona ekspresja białek oporności wielolekowej ABCB1 czy ABCG2 [18,19]. Według teorii, CSC tylko komórki o posiadające cechy komórek macierzystych mające zdolności do samoodnawiania, natomiast pozostałe komórki nowotworowe ulegają apoptozie jeśli nie są zastępowane przez nowe. Można przez to rozumieć, że mutacje genetyczne mogą akumulować się tylko w komórkach macierzystych. Udowodniono jednak, że zróżnicowane komórki nowotworowyche nabyły mutację w obrębie genu β-kateniny [11], a w innym badaniu uległy aktywacji czynnikiem transkrypcyjnym FOXC2 [20]. Dlatego też należy odrzucić twierdzenie o stabilności genetycznej w obrębie nowotworu. Kierunki badań w celu poprawy leczenia nowotworów Aby terapia przeciwnowotworowa była efektywna, powinna likwidować zróżnicowane komórki, jak i nowotworowe komórki macierzyste. Powszechnie stosowane metody, do których należy radioterapia oraz immunoterapia, mogą co najwyżej inaktywować zróżnicowane szybko proliferujące komórki nowotworowe. W jednym z eksperymentów naukowcy zastosowali w leczeniu raka piersi zmodyfikowane, polimeryczne, micele zawierające paklitaksel oraz salinomycynę. Okazało się, że zastosowanie tej innowacyjnej metody pozwoliło zlikwidować komórki nowotworowe, w tym CSCs. Udowodniono lepszą efektywność tej metody niż leczenia konwencjonalnego [17]. 78 Macierzyste komórki nowotworowe – wyzwania i perspektywy W związku z tym, że nowotwór często wykazuje różną ekspresję mikroRNA, w subpopulacjach spróbowano wykorzystać te cząsteczki w celu wyciszenia genów. W glejakach, transfekcja macierzystych komórek nowotworowych mikroRNA-124 oraz mikroRNA-137 skutkuje zahamowaniem cyklu komórkowego i dalszym różnicowaniem komórek z cząsteczką powierzchniową CD133. Inne strategie terapeutyczne mogą zakładać zahamowanie inwazji i powstawania przerzutów przez blokowanie integryn lub markera CD44 na powierzchni komórki nowotworowej. Naukowcy w alternatywnym eksperymencie wykazali, że mikroRNA-34 jest przyczyną inhibicji zdolności do samoodnowy nowotworowych komórek macierzystych w trzustce o fenotypie CD44+/CD133+ zarówno in vivo, jak i in vitro [10]. 6. Podsumowanie Komórki macierzyste są odkryciem, dzięki któremu pojawiła się szansa na opracowanie nowych metod leczenia wielu schorzeń, takich jak choroby neurodegeneracyjne czy choroby skóry. Nie dziwi fakt, że coraz to więcej zespołów badawczych obiera za główny cel swoich badań właśnie komórki macierzyste. Choroby nowotworowe są jedną z głównych przyczyn zgonów na świecie. Stosowane jak dotąd radio- i chemioterapie są niewystarczające w całkowitym wyleczeniu. Odkrycie, iż komórki nowotworowe nabywają pod wpływem mutacji cechy komórek macierzystych naświetliło nowy kierunek poszukiwań leczenia, które zahamowałoby tak często występujące w chorobach nowotworowych przerzuty. Leczenie chirurgiczne często zawodzi, ponieważ część komórek zdążyła już migrować i zaatakować inny narząd, bądź tkankę. Ważne jest zatem opracowanie metod leczenia, które byłyby ukierunkowane na hamowanie migracji CSCs. Temat komórek macierzystych stał się w dobie dzisiejszego postępu nauki obiektem zainteresowania nie tylko naukowców i etyków, ale także budzi kontrowersje w środowisku politycznym i prawniczym. Problemem dla państw europejskich prócz kwestii bezpośrednio związanych z finansami, jest sposób przyznawania patentów związanych z metodami stosowanymi w terapii komórek macierzystych, dlatego aktualnie trwają pracę nad dyrektywami mającymi regulować proces ich przyznawania [3]. Dalsze badania nad komórkami macierzystymi za pewne rozszerzą wiedzą, jaką już dziś posiadamy i może zaczną budzić mniejsze kontrowersje, jeśli efekty tych badań udoskonalą terapię przeciwnowotworową. 79 Anna Łabejszo, Joanna Woźniak, Tomasz Wandtke Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Weissman L.: Stem cells - scientific, medical and political issues. The New England Journal of Medicine 2002;346(20): 1576-1579 Sikora M, Olszewski W:Komórki macierzyste – biologia i zastosowanie terapeutyczne. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (online) 2004;58:202-208 Salter B, Salter C. Bioethicalambition, politicalopportunity and the Europeangovernance of patenting: The case of humanembryonicstemcell science. Social Science &Medicine 2012;xxx:1-7 Magdalena Szaryńska, Zbigniew Kmieć : Rola nowotworowych komórek macierzystych w patogenezie i terapii chorób nowotworowych. Forum Medycyny Rodzinnej 2011, tom 5, nr 1, 47-56 Dorota Olszewska-Słonina, Jan Styczyński: Rodzaje i źródła komórek niezróżnicowanych oraz możliwości ich zastosowania w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. Wybrane zagadnienia z medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej: podręcznik do seminariów dla studentów kierunku biotechnologia. Pod red. Tomasza Drewy. Bydgoszcz: UMK CM, 2007 s. 21-32 Lapidot T., Sirard C., Vormoor J. i wsp.: A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature 1994,367: 645-648 Ricci-Vitiani L., Lombardi D.G., Pilozzi E. i wsp.: Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature 2007; 445: 111-115 Muhammad Alamgeer, Craig D. Peacock, William Matsui, Vinod Ganju, D. Neil Watkins: Cancer stem cells in lung cancer: Evidence and controversies. Respirology. 2013 Jul;18(5):757-64 Alison M.R., Lim S.M., Nicholson L.J.: Cancer stem cells: problems for therapy? J. Pathol., 2011; 223: 147-161 Katarzyna Wieczorek, Jolanta Niewiarowska: Nowotworowe komórki macierzyste. Postepy Hig. Med. Dosw. (online), 2012; 66: 629-636 Varnat F., Duquet A., Malerba M., Zbinden M., Mas C., Gervaz P., Altaba A.R.: Human colon cancer epithelial cells harbour active HEDGEHOG-GLI signalling that is essential for tumour growth, recurrence, metastasis and stem cell survival and expansion. EMBO Mol. Med., 2009; 1: 338-351 Salama P., Platell C.: Colorectal cancer stem cells. ANZ J. Surg. 2009; 79:697-702 Wang J.C., Dick J.E.: Cancer stem cells: lessons from leukemia. Trends Cell Biol., 2005; 15: 494-501 Takebe N., Ivy S.P. Controversies in cancer stem cells: targeting embryonic signaling pathways. Clin. Cancer Res. 2010; 16: 3106-3112 G. Drewa, oprac. T. Ferenc: Genetyka medyczna. Podręcznik dla studentów. wyd. I, 2011 Alison M.R, Islam S., Wright N.A.: Stem cells in cancer: instigators and propagators? J. Cell Sci., 2010; 123: 2357-2368 Zhang Y., Zhang H., Wang X., Wang J., Zhang X., Zhang Q.: The eradication of breast cancer and cancer stem cells using octreotide modified paclitaxel 80 Macierzyste komórki nowotworowe – wyzwania i perspektywy 18. 19. 20. 21. 22. active targeting micelles and salinomycin passive targeting micelles. Biomaterials, 2012; 33: 679-691 Nakanishi T., Ross D.D.: Breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2): its role in multidrug resistance and regulation of its gene expression. Chin. J. Cancer, 2012; 31: 73-99 Schumacher U., Nehmann N., Adam E., Mukthar D., Slotki I.N., Horny H.P., Flens M.J., Schlegelberger B., Steinemann D.: MDR-1-overexpression in HT 29 colon cancer cells grown in SCID mice. Acta Histochem., 2012; 114: 594-602 Battula V.L., Evans K.W. Hollier B.G., Shi Y., Marini F.C., Ayyanan A., Wang R.Y., Brisken C., Guerra R., Andreeff M., Mani S.A.: Epithelialmesenchymal transition-derived cells exhibit multilineage differentiation potential similar to mesenchymal stem cells. Stem Cells, 2010; 28: 1435-1445 Kelly P.N., Dakic A., Adams J.M., Nutt S.L., Strasser A.: Tumor growth need not be driven by rare cancer stem cells. Science, 2007; 317: 337-345 Shipitsin M., Polyak K.: The cancer stem cell hypothesis: in search of definitions, markers, and relevance. Lab. Invest., 2008; 88: 459-463 Macierzyste komórki nowotworowe – wyzwania i perspektywy Streszczenie Mimo poszukiwania nowych metod leczenia, choroba nowotworowa stanowi ciągle jedną z najczęstszych przyczyn zgonów na świecie. Ze względu na heterogenność guza i odmienny profil genetyczny subpopulacji komórek nowotworowych, wciąż ciężko jest ustalić uniwersalną metodę walki z progresją choroby. W związku z powyższym odkrycie istnienia nowotworowych komórek macierzystych (CSCs) ma coraz większe znaczenie w dzisiejszej medycynie. Liczne dowody badań, prowadzone zarówno w warunkach in vivo jak in vitro, wskazują, że to właśnie macierzyste komórki nowotworowe są odpowiedzialne za powstawanie przerzutów i nawrót choroby. Komórki te, podobnie jak komórki macierzyste charakteryzują się zdolnością do samoodnowy i mogą różnicować się w dany typ komórek. CSCs identyfikowane są dzięki ekspresji swoistych markerów, którymi są enzymy cytoprotekcyjne oraz białka błonowe. Proces rozwoju nowotworu w organizmie zachodzi poprzez współistnienie dwóch idei, tj. w wyniku klonalnej ekspansji, w której dochodzi do selekcji CSCs, które są potem źródłem heterogennych komórek nowotworowych. Koncepcja hierarchiczna zakłada istnienie określonej grupy komórek, które są odpowiedzialne za rozwój nowotworu. Nowe strategie terapeutyczne celują w genetykę komórek nowotworowych. Jedną z nich jest wykorzystywanie mikroRNA. Innymi strategiami jest np. blokowanie integryn czy markerów powierzchniowych CSCs. Stosuje się również polimeryczne micele, zawierające substancje terapeutyczne. Niestety badania nad nowotworowymi komórkami macierzystymi generują zbyt duże koszty, na jakie kraje europejskie nie mają odpowiednich funduszy 81 Anna Łabejszo, Joanna Woźniak, Tomasz Wandtke Cancer stem cells – challenges and prospects Abstract Although the search for new treatments, cancer is still one of the leading causes of death worldwide. Due to the heterogeneity of the tumor and a different genetic profile of tumor cell subpopulations, it is still difficult to determine a universal method for combating the progression of the disease. Therefore, the discovery of the existence of cancer stem cells (CSCs) is increasingly important in today's medicine. Strong evidence in studies carried out both in vivo and in vitro, indicates that it is Stem cells are responsible for tumor metastasis and relapse. These cells, like stem cells are characterized by their ability to self-renewal and can differentiate into a particular cell type. CSCs are identified by the expression of specific markers, which are cytoprotective enzymes and membrane proteins. The process of developing a tumor in the body occurs by the existence of two ideas, ie. as a result of clonal expansion which occurs to the selection CSCs, which are then a source of heterogeneous tumor cells. The concept of hierarchical assumes the existence of a specific group of cells, which are responsible for the development of cancer. New therapeutic strategies aiming at the genetics of cancer cells. One of them is the use of microRNA. Other strategies is, for example: integrin blocking or surface markers CSCs. Shall also apply to polymeric micelles comprising therapeutic agents. Unfortunately, research on cancer stem cells generate high costs to which European countries do not have adequate funds. 82 Marcin Michalik1, Tomasz Kozłowski2, Mateusz Klimek3, Piotr Czekaj4 Podziały symetryczne i asymetryczne komórek macierzystych – mechanizm i rola w etiologii chorób nowotworowych 1. Wstęp Komórki macierzyste mają wyjątkowo dużą zdolność do proliferacji i różnicowania. Niezależnie od tego, czy są to komórki toti-, pluri-, multiczy unipotencjalne podlegają tym samym rodzajom podziału (Rys. 1). Są to: (1) podział symetryczny, w wyniku którego mogą powstać dwie komórki o charakterze częściowo zdefiniowanym, bądź dwie komórki pozostające w dalszym stopniu komórkami macierzystymi oraz (2) podział asymetryczny, po którym powstaje jedna komórka macierzysta i jedna wykazująca cechy świadczące o różnicowaniu [1]. Dzięki podziałowi asymetrycznemu komórki macierzyste, z jednej strony utrzymują swoje populacje (samoodnowa; ang. self-renewal), a z drugiej stanowią pule wyjściowe dla komórkowych szeregów różnicowania. Rys. 1. Rodzaje mitotycznych podziałów komórkowych: A, podział symetryczny, w którym powstają dwie komórki o cechach komórki macierzystej dzielącej się; B, podział asymetryczny zapewniający samoodnowę populacji wyjściowej i jednoczesne powstanie komórki częściowo zróżnicowanej; C, podział symetryczny, w którym powstają dwie komórki zróżnicowane w stosunku do komórki wyjściowej. 1- Komórka macierzysta 2- Komórka o zdefiniowanym charakterze. 1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze Histologii i Embriologii, Wydział Lekarski, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, www.sum.edu.pl 2 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze Histologii i Embriologii, Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet Medyczny, www.sum.edu.pl 3 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze Histologii i Embriologii, Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet Medyczny, www.sum.edu.pl 4 [email protected], Zakład Cytofizjologii, Katedra Histologii i Embriologii, Wydział Lekarski w Katowicach,Śląski Uniwersytet Medyczny, http://histologia.slam.katowice.pl 83 Marcin Michalik, Tomasz Kozłowski, Mateusz Klimek, Piotr Czekaj Zakłócenia prawidłowości podziału komórkowego, m.in. utrata polarności komórek oraz zdolności do podziału asymetrycznego mają istotne znaczenie dla funkcjonowania mechanizmów leżących u podstaw zmian przedrakowych oraz transformacji nowotworowej. Obecnie, zainteresowania badaczy koncentrują się na mechanizmie podziałów komórkowych i ich efektywności w nowotworach ośrodkowego układu nerwowego(OUN), raku piersi i białaczkach. Wiadomo, że większość regulatorów podziału asymetrycznego i polaryzacji komórki to produkty protoonkogenów oraz supresory genów. Zrozumienie mechanizmów transformacji, progresji i promocji karcynogenezy ma podstawowe znaczenie dla skuteczności terapii celowanej tych schorzeń[2]. 2. Mechanizm podziału asymetrycznego Zasadę mechanizmu podziału asymetrycznego można zobrazować na przykładzie dwóch modeli badawczych: modelu podziału neuroblastów u Drosophila melanogaster (Rys. 2) oraz modelu podziału komórek w neuronalnych liniach komórkowych u myszy. W modelu D. melanogaster wykazano, że w kolejnych fazach podziału komórkowego embrionalnych neuroblastów, zachodzą charakterystyczne przemiany białkowe. W interfazie, w szczytowej części tych komórek występuje białko Bazooka. Składa się ono z dwóch podjednostek: Baz oraz Par3 [3]. Do białka Bazooka przyłącza się białko Rho należące do rodziny GTPaz, w wyniku czego aktywacji ulega atypowa kinaza białkowa C (aPKC) oraz jej podjednostka Par6 odpowiadająca za aktywność inhibitorową [4]. Powstanie kompleksu Baz/Par6/aPKC powoduje zmianę specyficzności substratowej atypowej kinazy białkowej C umożliwiając jej fosforylację białka Numb, co z kolei ułatwia jego lokalizację w bazalnej części komórki [5]. Obok białka Numb lokuje się białko adaptorowe Pon (ang. Partner of Numb protein), które swoją aktywność zawdzięcza fosforylacji przez kinazę Polo [6]. Białko Numb zapobiega samoodnowie komórek oraz jest istotnym inhibitorem ścieżek sygnalizacyjnych Notch oraz Hedgehog [7]. W profazie, powstały kompleks przyłącza się do białka adaptorowego Insc. (ang. Inscuteable). Połączenie to promuje powstawanie kolejnego kompleksu z udziałem białka Pins będącego partnerem białka Insc. Dzięki białku Mud, kompleks ten łączy się z mikrotubulami centrosomów tworzącego się wrzeciona kariokinetycznego. Za stabilizację powstającego wrzeciona odpowiadają takie czynniki Pins/Gαi/Dlg/Khc-73 [3, 8, 9]. Wrzeciono kariokinetyczne wydłuża się w metafazie. Wtedy też, mitotyczna kinaza AurA (ang. Aurora A) poprzez fosforylację białka Par6 powoduje aktywację aPKC [8]. Jednocześnie aktywna fosfataza 2A (PP2A), 84 Podziały symetryczne i asymetryczne komórek macierzystych – mechanizm i rola w etiologii chorób nowotworowych wybiórczo defosforyluje białka Par6 i Baz w bazalnej części komórki pozostawiając aktywną kinazę aPKC jedynie w części szczytowej [10]. Ryc. 2. Czynniki wpływające na ustalenie polaryzacji szczytowo-podstawnej neuroblastów D. melanogaster oraz wspomagające orientację i stabilizację wrzeciona kariokinetycznego, w poszczególnych fazach cyklu. Na podstawie [9] Jak to się dzieje, że w neuroblastach D. melanogaster jedna z komórek zaczyna się różnicować, a druga pozostaje komórką zachowującą potencjał proliferacyjny i dyferencjacyjny? Rolę tą przypisuje się m.in. białku Numb oraz współdziałającemu z nim adaptorowemu białku Miranda (Mira). Mira jest bezpośrednio fosforylowana przez aPKC [5], przez co zostaje zaktywowana i może działać regulująco na transkrypcję genów białek regulatorowych takich jak Prospero, Brat czy białka wiążącego dsRNA – Staufen. Uważa się, że białko Prospero odpowiada za zmniejszenie ekspresji genów związanych z progenitorowym charakterem komórek. Z kolei, białko Brat promuje opuszczenie cyklu komórkowego [11, 12]. Opracowując model neurogenezy mysich komórek nerwowych stwierdzono, że w szczytowych częściach gwiaździstych komórek glejowych ssaków znajdują się czynniki będące homologami kompleksu Par3/Par6/aPKC i, tak jak w przypadku embrionalnych neuroblastów muszki owocowej, odpowiadają one za wykształcenie polarności komórek [13]. Ponadto, zagadnieniem istotnym w przypadku różnicowania się mysich komórek glejowych wydaje się być długość poszczególnych faz cyklu komórkowego. Linie neuronalne komórek myszy, u których wyciszono geny kodujące kinazy zależne od cyklin 2 i 4 wykazują wydłużenie fazy G1, które z kolei wpływa na zwiększenie spontanicznego różnicowania się do neuronów in vitro. Jednocześnie, proces ten wpływa na zmniejszenie liczby komórek progenitorowych znajdujących się w podstawnej części hodowli. Kolejnym, wartym podkreślenia czynnikiem jest nierównomierna segregacja cykliny D2 pomiędzy podstawną, a szczytową częścią komórki [14]. 85 Marcin Michalik, Tomasz Kozłowski, Mateusz Klimek, Piotr Czekaj 3. Rola cząsteczek adhezyjnych i integryn w podziale komórki macierzystej. In vivo, losy komórek macierzystych są ściśle uzależnione od czynników tworzących lokalne mikrośrodowisko zwane niszą. W niszy występują komórki macierzyste, komórki towarzyszące (podporowe) oraz rozpuszczalne i nierozpuszczalne składniki macierzy pozakomórkowej (ECM). Elementy te, dzięki wzajemnym oddziaływaniom wpływają na przeżycie, proliferację, różnicowanie (Rys. 3) oraz właściwości komórek macierzystych [15]. W kontekście oddziaływań składników mikrośrodowiska, nisze można podzielić na nabłonkowe i zrębowe (stromalne). W pierwszym przypadku komórki macierzyste sąsiadują z sobą i bezpośrednio przylegają do błony podstawnej, a w drugim oddziałują z komórkami podporowymi [16]. Rys.3. Wpływ położenia płaszczyzny podziałowej wrzeciona mitotycznego (linia przerywana) na możliwości różnicowania się komórek potomnych. Po lewej: Płaszczyzna ułożona równolegle do błony podstawnej lub powierzchni komórki podporowej powoduje niejednakowy dostęp składników ECM do komórek potomnych. Komórka „górna‟ traci kontakt z błoną podstawną lub komórką podporową. Po prawej: Płaszczyzna ułożona prostopadle zapewnia jednakowy kontakt obu komórek potomnych za składnikami mikrośrodowiska, w tym z błoną podstawną lub komórką podporową. Czerwone strzałki oznaczają kierunki rozejścia się komórek potomnych 3.1. Rola kadheryn w podziale komórki macierzystej. W regulacji podziałów komórkowych symetrycznych i asymetrycznych istotną rolę odgrywają cząsteczki adhezyjne, takie jak kadheryny. Kadheryny to przezbłonowe białka tworzące obwódki zwierające między sąsiadującymi komórkami [17]. Cząsteczki adhezyjne wpływają m.in. na symetrię podziału zarodkowych komórek macierzystych (GSC) w jądrze D. melanogaster. W warunkach prawidłowych, mechanizm zależny od kadheryn prowadzi do podziału asymetrycznego w niszy zrębowej i symetrycznego w niszy nabłonkowej. W niszy stromalnej, po podziale asymetrycznym, komórka potomna będąca w kontakcie z komórką podporową za pośrednictwem obwódek 86 Podziały symetryczne i asymetryczne komórek macierzystych – mechanizm i rola w etiologii chorób nowotworowych zwierających (ang. adherens junction) pozostaje niezróżnicowana, podczas gdy druga z komórek potomnych ulega różnicowaniu. Dzieje się tak dlatego, że we wczesnej interfazie pojedynczy centrosom znajduje się w biegunie komórki macierzystej przylegającym do komórki podporowej. Po podwojeniu, centrosom matczyny pozostaje w tej lokalizacji, a centrosom potomny migruje do przeciwległego bieguna komórki. Za utrzymanie centrosomu matczynego w odpowiednim położeniu odpowiada jego interakcja z obwódką zwierającą za pośrednictwem białka APC (ang. Adenomatous Polyposis Coli) (Rys. 4A). Prowadzi to do prostopadłego ułożenia osi wrzeciona podziałowego względem płaszczyzny przylegania GSC-komórka podporowa i podziału asymetrycznego [18]. Delecja genu białka APC prowadzi do zmiany ułożenia płaszczyzny podziału GSC względem komórki podporowej i zwiększa prawdopodobieństwo podziału symetrycznego [19]. Podobny do powyższego, zależny od kadheryn mechanizm, opisano w tkankach nabłonkowych z tym, że w tym przypadku oba centrosomy są umocowane za pomocą białka APC. Prowadzi on do stabilnego, równoległego ułożenia osi wrzeciona podziałowego względem błony podstawnej i dominacji podziałów symetrycznych (Rys. 4B). W tym przypadku delecja genu APC prowadząca do zmiany ułożenia wrzeciona sprzyja podziałom asymetrycznym [20]. Rys. 4. Wpływ położenia złącza typu obwódki zwierającej i białek APC na ułożenie wrzeciona podziałowego w niszy zrębowej (A) i w niszy nabłonkowej (B). Delecja genu APC i brak łączności złącza z centrosomem spowoduje zmianę przedstawionego ułożenia wrzeciona i zmianę płaszczyzny podziału komórki. Na podstawie [18] 3.2. Rola integryn w podziale komórki macierzystej. Integryny są receptorami błonowymi odpowiadającymi, zarówno za bezpośrednią komunikację komórka-komórka, jak i za oddziaływania 87 Marcin Michalik, Tomasz Kozłowski, Mateusz Klimek, Piotr Czekaj komórka-ECM. Ich aktywacja prowadzi do transdukcji odpowiednich sygnałów i odpowiedzi w postaci zmian cyklu komórkowego, położenia wrzeciona podziałowego oraz kształtu komórki[21]. Sygnalizacja zależna od integryn wprowadza zmiany w osi podziału, co może skutkować w przełączeniu podziału symetrycznego na asymetryczny w niszach nabłonkowych [22]. W jelicie D. melanogaster adhezja do błony podstawnej z udziałem integryn przyczynia się do nierównomiernego rozmieszczenia białek Par i aPKC w komórkach macierzystych. W efekcie wrzeciono podziałowe układa się prostopadle do błony podstawnej i dochodzi do podziału asymetrycznego. Wyciszenie integryn z zastosowaniem RNAi prowadzi do zmiany orientacji wrzeciona na równoległą do błony podstawnej i podziału symetrycznego. Podobny fenotyp osiągnięto, wyciszając białka kompleksu Par [23]. Jeden ze szlaków sygnalizacji zależnej od integryn prowadzi do produkcji przekaźnika drugorzędowego – 3,4,5-trifosforanu fosfatydyloinozytolu (PIP3), utworzenia kompleksu dyneina/dynaktyna oraz odpowiedzi komórkowej na poziomie wrzeciona podziałowego. Wykazano, że w komórkach linii HeLa pobudzona podjednostka β1 integryny jest niezbędna do aktywacji kinazy 3-fosfoinozytolu (PI3K), która odpowiada za akumulację PIP3 w szkielecie błonowym komórki. Najprawdopodobniej ta akumulacja jest jedną z przyczyn rekrutacji dynaktyny do szkieletu błonowego i powstania kompleksów dyneina/dynaktyna. Następnie, kompleksy te oddziałują na mikrotubule astralne, umożliwiając prawidłowe ułożenie wrzeciona podziałowego. Wykazano, że inhibicja PI3K w komórkach linii HeLa prowadzi do zaburzenia orientacji wrzeciona podziałowego, natomiast wprowadzenie do tych komórek PIP3 powodowało przywrócenie prawidłowej orientacji wrzeciona [24]. Innym mechanizmem, za pomocą którego integryny mogą wpływać na położenie wrzeciona podziałowego jest inhibicja izoformy β kinazy syntazy glikogenu 3 (GSK3β). Jednym z substratów GSK3β jest białko APC, które po fosforylacji traci zdolność do interakcji z mikrotubulami [25]. Ostatnio wykazano, że sygnalizacja za pośrednictwem integryn może wpływać na symetrię podziału poprzez kinazę FAK (ang. Focal Adhesion Kinase). Wyciszenie genu podjednostki β1 integryny lub jej blokada przy użyciu przeciwciał monoklonalnych doprowadziły do wzrostu częstości podziałów asymetrycznych w liniach nowotworowych HCT116 i MCF7. Z drugiej strony użycie przeciwciał monoklonalnych prowadzących do konstytutywnej aktywacji podjednostki β1 w tych liniach komórkowych spowodowało zanik podziałów asymetrycznych. W badaniu tym postulowano, że blokada integryny β1 doprowadziła do spadku aktywności kinazy FAK, która odpowiada za zależną od kompleksu mTORC2 degradację kinazy AKT1. Aktywność właśnie tej kinazy ma prowadzić do wzrostu częstotliwości 88 Podziały symetryczne i asymetryczne komórek macierzystych – mechanizm i rola w etiologii chorób nowotworowych podziałów asymetrycznych w liniach komórkowych z konstytutywną aktywacją integryny β1 [26]. 4. Rodzaje podziału komórek nowotworowych Charakter podziału asymetrycznego nieco różni się w zależności od gatunku zwierzęcia i typu tkanki. Natomiast główne regulatory podziału są czynnikami niezwykle konserwatywnymi (macierz i zrąb komórkowy, zewnątrzkomórkowe sygnały, wewnętrzne szlaki sygnałowe, wrzeciono podziałowe). Ponadto, niektóre nowotwory mogą wywodzić się z tzw. komórek macierzystych nowotworów (CSC; ang. Cancer Stem Cells). CSC zachowują możliwość podziału asymetrycznego. Wśród komórek nowotworu wyróżnia się komórki nowotworowe zdolne do licznych mitoz oraz komórki stacjonarne, które utraciły możliwość podziału. Rys. 5. Sekwencja zdarzeń prowadząca do powstania zmian nowotworowych. Defektypolaryzacji komórki, wrzeciona kariokinetycznego oraz różnicowania komórek prowadzą do zakłócenia podziału asymetrycznego. W rezultacie dochodzi do nadmiernej, symetrycznej proliferacji (na przykładzie neuroblastów D. melanogaster). Na podstawie [9] Generalnie, w nowotworach obserwuje się obydwa rodzaje podziałów komórkowych. Podział asymetryczny pozwala na samoodnowę komórek propagujących guza [27]. Natomiast wielokrotne podziały symetryczne komórek nowotworowych dają komórki zejściowe, powodując szybki wzrost nowotworu. Identyfikacja wad genetycznych, poznanie mechanizmu kontroli podziału asymetrycznego w komórkach prawidłowych i nowotworowych oraz skutków jego uszkodzenia dla przebiegu cyklu komórkowego jest kluczowym zadaniem w zrozumieniu mechanizmów transformacji nowotworowej (Rys. 5). Poznanie lokalizacji mutacji genów odpowiedzialnych za regulację podziałów 89 Marcin Michalik, Tomasz Kozłowski, Mateusz Klimek, Piotr Czekaj w chromosomach jest istotne dla planowania dalszych badań skutków mutacji oraz w potencjalnej terapii.genowej. 4.1. Genetyczne podłoże podziału asymetrycznego w nowotworach Nowotwory są chorobami o podłożu genetycznym, w rozwoju których istotną rolę odgrywa kumulacja mutacji oraz czynniki epigenetyczne i środowiskowe. Dla niektórych nowotworów udało się zidentyfikować mutacje genomowe powiązane z podziałem asymetrycznym. Powstaje zatem pytanie: w jaki sposób niwelować negatywne skutki tych mutacji. Obecnie próbuje się testować metody zapobiegania skutkom mutacji genów poszczególnych regulatorów podziału asymetrycznego, które w przyszłości mogą dać początek potencjalnym terapiom przeciwnowotworowym (Tab.1). Do najczęściej spotykanych należą mutacje genów: PARD6 (PAR6) w raku płuca, PARD3 (PAR3) w raku płuca, nowotworach głowy i szyi, przełyku, prostaty i pęcherza moczowego oraz DLG2 w raku płuca i szyjki macicy. Wspólnym mianownikiem łączącym różne procesy patologiczne o charakterze rozrostowym jest mutacja genu TGF-β, jako czynnika wpływającego na polaryzację komórek [28, 29]. Tabela 1. Mutacje wybranych genów regulatorowych podziału asymetrycznego w nowotworach. Potencjalne metody naprawcze tych zmian zostały zbadane na zmodyfikowanych genetycznie myszach. Może to mieć praktyczne znaczenie w rozwoju terapii przeciwnowotworowych. Gen Locus Występowanie w nowotworach AURAK 20q13.2q13.3 Rak piersi, jajnika, żołądka, woreczka żółciowego, trzustki. HUGL-2 17q24-q25 Rak jelita grubego, piersi. MSI2 12q24.1q24.31 CML 16p12.2 Rak płuca (niedrobno komórkowy), żołądka, jajnika, prostaty, pęcherza moczowego, nowotwory PLK1 90 Wyniki badań prowadzonych na modyfikowanych myszach Potencjalna farmakoterapia za pomocą inhibitora. Lit. [30, 31] Wyindukowana ekspresja w raku piersi zmniejsza odsetek przerzutów. Potencjalny marker zaawansowania CML. [32] [33] [34, 35] Hamowanie za pomocą leków, siRNA zwalnia podziały komórek. Podziały symetryczne i asymetryczne komórek macierzystych – mechanizm i rola w etiologii chorób nowotworowych okolicy głowy i szyi oraz glejaki. PRKCI 2p21 Rak płuca (niedrobno komórkowy), piersi, jajnika i pęcherza moczowego. SCRIB1 8q24.3 Glejaki [36, 37] Inhibicja za pomocą siRNA zmniejsza rozrost guza. Utrata homozygotyczności predysponuje do mutacji cMyc. [38] 4.2. Nowotwory OUN Najczęstszymi nowotworami OUN wieku dorosłego są glejaki. Jest to zróżnicowana grupa zmian rozrostowych, do której zalicza się m.in. wyściółczaki, skąpodrzewiaki i gwiaździaki. Patologie te są złośliwe ze względu na swoją lokalizację utrudniającą dostęp i diagnostykę oraz możliwość dawania wznów. Oligodendroglioma. Powszechnie uznaje się, że komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC) nie tylko różnicują się do oligodendrocytów, ale także stanowią źródło komórek nowotworowych skąpodrzewiaka (oligodendroglioma) [39]. Skąpodrzewiak jest nowotworem o pośredniej złośliwości i w klasyfikacji WHO należy do grupy drugiego stopnia. Patomechanizm jego rozwoju jest złożony i nie do końca poznany. Duże znaczenie przypisuje się proteoglikanowi NG2 (ang. Neural/glial antygen 2) oraz zaburzeniom regulacji podziału asymetrycznego. Kluczowym etapem prawidłowego podziału asymetrycznego tych komórek jest asymetryczna agregacja proteoglikanu NG2. W efekcie następuje aktywacja receptora EGFR (ang. Epidermal Growth Factor Receptor), a następnie związanego z nim szlaku podziałowego prowadzącego do samoodnowy komórki. U myszy, obniżona ekspresja NG2 jest odpowiedzialna za przedrakową, atypową proliferację komórek (Rys. 6). 91 Marcin Michalik, Tomasz Kozłowski, Mateusz Klimek, Piotr Czekaj Rys. 6. Prawidłowe komórki OPC w mózgu dzielą się asymetrycznie w celu samoodnowy i tworzenia nowej populacji oligodendrocytów. Onkogenna mutacja powoduje dysregulację podziału asymetrycznego i hiperproliferację, prowadząc do zmian przedrakowych, które pod wpływem nieznanych czynników transformują do zmian nowotworowych, w których dochodzi do podziałów symetrycznych nowotworowych komórek macierzystych. Na podstawie [9] Aktywacja EGFR w szlaku zależnym od NG2 zmniejsza odsetek komórek zróżnicowanych wśród OPC i prowadzi do hipertrofii [40]. Odnotowano znamienne obniżenie stężenia regulatorów podziału asymetrycznego w komórkach skąpodrzewiaka stopnia II. Do tych substancji należą: TRIM32 (analog Bart) [41], PARD3 oraz domena PZD białek (z połączenia nazw: ang. PSD95 – Postsynaptic Density Protein, ZO-1 – Zonula Occludens-1 protein, Dlg1 – Drosophila disc large tumor suppressor) [42]. Ponadto obserwowano znaczne obniżenie ekspresji atypowej kinazy C, białka G oraz determinanty różnicowania Numblike [43]. W prawidłowych oligodendrocytach oraz innych komórkach OUN białka te występują we wzajemnej równowadze i odpowiadają za samoodnowę i różnicowanie komórek. Obserwowano zwiększoną liczbę podziałów symetrycznych kosztem asymetrycznych w glejakach niskiego stopnia złośliwości histopatologicznej u ludzi [44] oraz w glejakach skrajnie złośliwych u gryzoni [45]. Do badań nad skąpodrzewiakami wykorzystano modele genetycznie modyfikowanych myszy GEMM (ang. Genetically Engineered Mouse Model). Heterozygotycznym myszom pod względem genu p53 wprowadzono wirusowy onkogen verbB będący pod kontrolą promotora S100B, aby wyidukować rozrost nowotworowy. Badania te wykazały, że droga zdarzeń prowadząca do wykształcenia skąpodrzewiaka obejmuje mutację onkogenną w OPC, powodującą podział symetryczny komórek, co w konsekwencji prowadzi do powstania puli komórek przedrakowych PGP. Następnie, dotychczas niepoznane czynniki wymuszają przejście PGP w komórki nowotworowe, przy czym zachowany jest podział symetryczny 92 Podziały symetryczne i asymetryczne komórek macierzystych – mechanizm i rola w etiologii chorób nowotworowych OPC. Fakt, że skąpodrzewiaki powstają z linii komórek OPC jest bardzo ważny i ma wpływ na stopień złośliwości nowotworu. Implikuje to również skuteczność terapii, bowiem OPC są bardziej wrażliwe, niż NSC na inhibitory wzrostu, np. temozolomid [9]. Astrocytoma (gwiaździaki) są skrajnie złośliwymi nowotworami OUN. Należą do IV grupy złośliwości wg WHO. Przyczyn tego faktu doszukuje się w rodowodzie nowotworu, który wywodzi się z linii neuronalnych komórek macierzystych NSC (ang. Neural Stem Cells). Badania z wykorzystaniem metod immunofluorescencji, cytometrii przepływowej oraz mikroskopii poklatkowej dowodzą, że zwiększona proliferacja komórek idzie w parze z transformacją NSC. NSC odznaczają się też zwiększoną ekspresją glikoproteiny transbłonowej CD133, kodowanej u człowieka przez gen PROM1 [43]. Stwierdzono, że gdy ze środowiska podziału usuniemy czynniki wzrostu, to po mitozie otrzymamy komórkę potomną o zwiększonej ekspresji CD133 na jej powierzchni, wykazującą zwiększony potencjał do dalszych podziałów. Wysoce złośliwe gwiaździaki mogą powstawać zarówno z OPC, jak i NSC, w odróżnieniu do skąpodrzewiaków (niski stopień złośliwości), które powstają tylko z OPC [46, 47] (Rys. 7). Rys. 7. Onkogenna mutacja (np. w obrębie genu p53 lub Rb) w komórkach NSC prowadzi do powstania nowotworów o wysokim indeksie proliferacji i złośliwości. Komórki macierzyste nowotworu (CD133+) mają zdolność podziału asymetrycznego oraz symetrycznego. Na podstawie [9] Istotną obserwacją dotyczącą ekspresji określonych markerów w komórkach nowotworowych jest obecność hipoksji, czyli niedotlenienia, w obszarze występowania glejaka [48]. Jest ona spowodowana zwiększonym metabolizmem komórek oraz nieadekwatnym dostarczeniem substancji odżywczych i tlenu przez naczynia krwionośne [49]. W obszarach o szczególnie wysokiej hipoksji, zwłaszcza w wewnętrznych częściach guza, znajdowane są liczne komórki TPC (ang. Tumor Propaging Cell) 93 Marcin Michalik, Tomasz Kozłowski, Mateusz Klimek, Piotr Czekaj [50]. Z faktem tym związana jest zwiększona ekspresja antygenu CD133 [51]. Trudno określić jednoznacznie rolę CD133 oraz jego rozkładu w poszczególnych komórkach, aczkolwiek dostrzeżono związek z asymetrycznym podziałem TPC, który gwarantuje samoodnowę tej linii komórek [52]. 4.3. Nowotwory szpiku kostnego Podziały asymetrycznie komórek pnia hematopoetycznego szpiku gwarantują utrzymanie homeostazy organizmu oraz stałej puli komórek macierzystych szpiku. Funkcję regulacyjną prawidłowego podziału asymetrycznego przypisuje się białku Msi2 (Musashi2). Białko Msi zostało pierwotnie odkryte i badane w tkance nerwowej D. melanogaster. Zaburzenia funkcji tego białka mają istotną rolę w patomechanizmie powstawania nowotworów szpiku kostnego u człowieka. Badania nad przewlekłą białaczką szpikową (CML; ang. Chronic Myelogenous Leukemia) dowodzą, że różnicowanie komórek białaczkowych może być regulowane przez szlak Musashi-Numb, dlatego kontrola tej ścieżki sygnałowej może stanowić nową strategię leczenia [53,54]. Zwiększona ekspresja białka Msi2 (Musashi2) w komórkach białaczkowych jest związana z utratą regulacji ekspresji onkogenu NUP98-HOXA9 [55]. Krytyczna faza białaczki związana jest z niską ekspresją genu Numb w komórkach blastycznych. Wiąże się to z utratą funkcjonalnego produktu genu Msi2, który działa pobudzająco na ścieżkę Numb. Ponadto badania wskazują, że ta zmniejszona ekspresja Numb jest związana z onkogenem NUP98-HOXA9, którego produkt transkrypcji łączy się z 3‟UTR transkryptu Numb efektywnie hamując jego translację [56]. NUP98-HOXA9 może też wpływać na rodzaj podziału komórek białaczkowych promując podział symetryczny [57]. Z uwagi na ten fakt próbuje się wpłynąć na regulatory podziału asymetrycznego w obrębie niszy komórek w leczeniu zaawansowanych stadiów białaczki szpikowej. Badania skupiają się na określeniu poziomu ekspresji Numb, który determinuje podział asymetryczny. Do badań wykorzystano szczepy myszy z indukowaną przewleką białaczką szpikową oraz CML w fazie akceleracji. Wyniki ukazały, że komórki białaczkowe z wysoką ekspresją Numb charakteryzują się większym zróżnicowaniem, mniejszą zdolnością progresji choroby i małym odsetkiem przypadków zajęcia innych organów przez proces patologiczny. Fakt ten potwierdzają eksperymenty na zwierzętach, gdzie ciągła represja Numb doprowadzała do krytycznego przełomu blastycznego [57]. Powyższe obserwacje znajdują swoje odzwierciedlenie w przebiegu CML u ludzi. Podwyższona ekspresja Msi2 odpowiada wysokiej blastozie, gdzie leczenie jest nadal mało efektywne. Wysoka ekspresja Msi2 odpowiada 94 Podziały symetryczne i asymetryczne komórek macierzystych – mechanizm i rola w etiologii chorób nowotworowych wysokiemu ryzyku zgonu z powodu progresji CML, ponadto może być czułym markerem zaawansowania choroby[57]. 4.4. Nowotwory gruczołu mlekowego W patomechanizmie powstawania raka sutka przypisuje się duże znaczenie produktom genów odpowiedzialnych za polaryzację, morfologię oraz plastyczność komórki. Szczególne znaczenie ma nadekspresja genów: PARD6 (PARD6A, PARD6B, PARD6C), które są odpowiedzialne za połączenia ścisłe TJ (ang. Tight Junction) oraz polaryzację podstawnoszczytową komórki. Zmniejszenie ilości połączeń ścisłych (m.in. wskutek mutacji genu dla E-kadheryny) jest związane z powstawaniem raków nisko zróżnicowanych, które już na wczesnym etapie dają przerzuty do odległych narządów. Białka PARD6 nie tylko wpływają na polaryzację, ale również stymulują podziały asymetryczne poprzez szlak związany z EGFR oraz MAPK (ang. Mitogen Activated Protein Kinases), dlatego mutacja dotycząca tej rodziny genów prowadzi do nadmiernej proliferacji i powstawania symetrycznych komórek [57]. Mutacje genów rodziny PARD6 nie są jedynymi jakie występują w raku sutka. Powyżej opisane zaburzenia należy rozważać w powiązaniu z mutacją genów ERBB-2 oraz TGF-β, które występują w prawie wszystkich rakach sutka (mutacje onkogenne) [58]. 5. Podsumowanie Dotychczas przeprowadzone badania na takich modelach doświadczalnych, jak C. elegans, D. melanogaster, kolonie komórek in vitro (np. mysiej białaczki), czy zwierzęta modyfikowanie genetycznie, pozwoliły na poznanie czynników komórkowych, które mogą być kluczowe dla mechanizmu molekularnego symetrycznego i asymetrycznego podziału komórek. Zakłócenia podziału asymetrycznego są nieodzownie związane z mutacjami genów, ze zmianami środowiska zewnętrznego komórki, modyfikacjami szlaków wewnątrzkomórkowych lub oddziaływań komórkakomórka. W efekcie mogą przyczyniać się do transformacji nowotworowej komórki. Ważnym etapem tego procesu jest polaryzacja strukturalnofunkcjonalna, a następnie podziałowa komórki. Wciąż wiele pytań pozostaje bez odpowiedzi, jednak poznanie mechanizmu kontroli podziału asymetrycznego może mieć kluczowe znaczenie dla wprowadzenia nowoczesnych terapii nowotworów. 95 Marcin Michalik, Tomasz Kozłowski, Mateusz Klimek, Piotr Czekaj Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Molofsky A.V., Pardal R., Morrison S.J. Diverse mechanisms regulate stem cell self-renewal, Curre1nt Opinion in Cell Biology., 16 (2004), s. 700-707 Knoblich J.A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumor biology, Molecular Cell Biology., 12 (2010), s. 849-860 Schaefer M., Shevchenko A., Knoblich J.A. A protein complex containing Inscuteable and the Galpha-binding protein Pins orients asymmetric cell divisions in Drosophila, Current Biology., 10 (2000), s. 353-362 Peterson F.C., Penkert R.R., Volkman B.F., Prehoda K.E. Cdc42 regulates the Par-6 PDZ domain through an allosteric CRIB-PDZ transition. Molecular Cell., 13 (2004), s. 665-676 Wirtz-Peitz F., Nishimura T., Knoblich J.A. Linking cell cycle to asymmetric division: Aurora-A phosphorylates the Par complex to regulate Numb localization,Cell., 135 (2008), s. 161-173 Wang H., Ouyang Y., Somers W.G. Polo inhibits progenitur self-renewal and regulates Numb asymmetry by phosphorylatingPon, Nature., 449 (2007), s. 96-100 Jla Y., Wang Y., Xle J. The hedgehog pathway: rolle in cell differentiation, polarity and proliferation, Archives of Toxicology., 89 (2015), s. 179-191 Wodarz, Ramrath A. Drosophila atypical protein kinase C associates with Bazooka and controls polarity of epithelia and neuroblasts, The Journal of Cell Biology., 150 (2000), s. 1361-1374 Gomez-Lopez S., Lerner R. G., Petritsch C. Asymmentric cell division of stem and progenitor cells during homeostasis and cancer., Cellular and Molecular Life Sciences., 71 (2014), s. 575-597 Chabu, Doe C.Q. Twins/PP2A regulates aPKC to control neuroblasts cell polarity and self-renewal, Developmental Biology., 330 (2009), s. 339-405 Ikeshima-Katoka H., Skeath J.B., Nebeshima Y. Miranda directs Prospero to a daughter cell during Drosophila asymmetric divisions, Nature., 390 (1997), s. 625-629 Shen C.P., Knoblich J.A., Chan Y.M. Miranda as a multidomain adapter linking apically localized Inscuteable and basally localized Staufen and Prospero during asymmetric cell division in Drosophila, Genes & Development., 12 (1998), s. 1837-1846 Chen L., Liao G., Yang L. Cdc42 deficiency causes Sonic hedgehogindependent holoprosencephaly, Proceedings of the National Academy of Sciences., 103(2006), s. 16520-16525 Lim S., Kaldis P. Loss of Cdk 2 and Cdk 4 induces a switch from proliferation to differentiation in neural stem cells, Stem Cells., 30 (2012), s. 1509-1520 Walker M.R, Patel K.K, Stappenbeck T.S The stem cell niche, The Journal of Pathology., 217 (2009), s. 169-180 Morrison S.J, Spradling C. A. Stem Cells and Niches: Mechanisms That Promote Stem Cell Maintenance throughout Life, Cell., 132 (2008), s. 598-611 Angst D.B., Marcozzi C., Magee A. I. The cadherin superfamily: diversity in form and function, Journal of Cell Science., 114 (2001), s. 629-641 96 Podziały symetryczne i asymetryczne komórek macierzystych – mechanizm i rola w etiologii chorób nowotworowych 18. Yamashita Y.M., Mahowald A.P., Perlin J.R., Fuller M.T. Asymmetric Inheritance of Mother Versus Daughter Centrosome in Stem Cell Division, Science., 315 (2007), s. 518-521 19. YamashintaY.M., Jones D.L., Fuller M.T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome, Science.,301 (2003), s. 1547-1550 20. Marthiens V.,Kazanis I.,Moss L.,Long K.,Constant C. Adhesion molecules in the stem cell niche – more than just staying in shape?Journal of Cell Science., 123 (2010), s. 1613-1622 21. Hynes R.O. Integrins Bidirectional, Allosteric Signaling Machines, Cell., 110 (2002), s. 673-687 22. Farahani E., Patra H.K., Jangamreddy J.R., Rashedi I., Kawalec M., RaoPariti R.K., Batakis P., Wiechec E.Cell adhesion molecules and their relation to (cancer) cell stemness, Carcinogenesis., 35 (2014), s. 747-759 23. Goulas S., Conder R., Knoblich J.A. The Par complex and integrins direct asymmetric cell division in adult intestinal stem cells,Cell Stem Cell., 11 (2012), s. 529-540 24. Toyoshima F., Nishida E. Spindle Orientation in Animal Cell Mitosis: Roles of Integrin in the Control of Spindle Axis, Journal of Cellular Physiology., 213 (2007), s. 407-411 25. LaFlamme S.E., Nieves B., Colello D., Reverte C.G. Integrins as Regulators of the Mitotic Machinery, Cell Biology., 20 (2008), s. 576-582 26. Dey-Guha I., Alves C.P., Yeh A.C., Sole S. X., Darp R., Ramaswamy S. A Mechanism for Asymmetric Cell Division, molecular cancer research Resulting in Proliferative Asynchronicity, Molecular Cancer Research., 13 (2015), s. 223-233 27. Lathia J.D., Hitomi M., Gallagher J. et al. Distribution of Cd133 reveals glioma stem cells self-renew through symmetric and asymmetric cell divisions, Cell Death and Disease., 2 (2011) e200 28. Oft M., Peli J., Rudaz C. TGF-beta1 and Ha-Ras collaborate in modulating the phenotypic plasticity and invasiveness of epithelial tumor cells., (10) 1996, s. 2462-2477 29. Huber M.A., Kraut N., Beug H.Molecular requirements for epithelialmesenchymal transition during tumor progression, Current Opinion Cell Biology., (17) 2005, s. 548-558 30. D‟Assoro B., Liu T., Quatraro C. The mitotic kinase Aurora-A promotes distant metastases by inducing epithelialto-mesenchymal transition in eRα(+) breast cancer cells, Oncogene., 33 (2013), s.291-300 31. Bickel L. Aurora kinase A mediates epithelial ovarian cancer cell migration and adhesion, Oncogene., 33 (2014), s. 539-549 32. Kashyap, Zimmerman T. The human Lgl polarity gene, Hugl-2, induces MeT and suppresses Snail tumorigenesis, Oncogene., (2013), s. 1396-1407 33. Imai T. The neural RNA-binding protein Musashi1 translationally regulates mammalian numb gene expression by interacting with its mRNA Journal of Molecular Cell Biology., 35 (2001), s. 3888-3900 97 Marcin Michalik, Tomasz Kozłowski, Mateusz Klimek, Piotr Czekaj 34. Nogawa M., Yuasa T., Kimura S. Intravesical administration of small interfering RNA targeting PLK-1 successfully prevents the growth of bladder cancer, The Journal of Clinnical Investigation., 115 (2005), s. 978-985 35. Némati F., Richardson M. Polo-like kinase 1: a potential therapeutic option in combination with conventional chemotherapy for the management of patients with triple-negative breast cancer Cancer Research., 73 (2013), s. 813-823 36. Ishiguro H., Akimoto K., Nagashima Y. aPKClambda/iota promotes growth of prostate cancer cells in an autocrine manner through transcriptional activation of interleukin-6. Proceedings of the National Academy of Science., 103 (2009), s. 16369-16374 37. Regala R. P., Jamieson L. Atypical protein kinase Ciota plays a critical role in human lung cancer cell growth and tumorigenicity Journal of Biological Chemistry., 280 (2005), s. 31109-31115 38. Zhan L., Rosenberg A., Bergamiet K. C. Deregulation of scribble promotes mammary tumorigenesis and reveals a role for cell polarity in carcinomaCell., 135 (2008), s. 865-878 39. Makagiansar T., Williams S., Mustelin T. Differential phosphorylation of NG2 proteoglycan by ERK and PKCalpha helps balance cell proliferation and migration Journal of Cell Biology., 178 (2007), s. 155-165 40. Lindberg N., Kastemar M., Olofsson T., Smits A. Oligodendrocyte progenitor cells can act as cell of origin for experimental gliomaOncogene., 28 (2009), s. 2266-2275 41. Schwamborn J., Berezikov E., Knoblich J. A. The TRIM-NHL protein TRIM32 activates microRNAs and prevents self-renewal in mouse neural progenitors Cell., 136 (2009), s. 913-925 42. Bultje R. S., Castaneda-Castellanos D. R., Jan L. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortexNeuron., 63 (2009), s. 189-202 43. Sykes M., Huttner B. Prominin-1 (CD133) and the cell biology of neural progenitors and their progeny Advances in Experimental Medicine andBiology., 777 (2013), s.89-98 44. Balenci L., Fernandez M., Este`ve F., Honnorat J.NG2-expressing glial precursor cells are a new potential oligodendroglioma cell initiating population in N-ethyl-N-nitrosourea-induced gliomagenesisCarcinogenesis., 10 (2010), s. 1718-1725 45. Assanah M., Lochhead R., Ogden A., Bruce J., Goldman J. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-de rived growth factor-expressingretrovir uses Journal of Neuroscience., 26 (2006), s. 6781-6790 46. Alcantara-Llaguno S., Chen J., Kwon C. Malignant astrocytomas originate from neural stem/progenitor cells in a somatic tumor suppressor mouse model Cancer Cell., 15 (2009), s. 45-56 47. Liu C., Sage J. C., Miller M. R. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma, Cell., 146 (2011), s.209-221 98 Podziały symetryczne i asymetryczne komórek macierzystych – mechanizm i rola w etiologii chorób nowotworowych 48. Felling R. J., Snyder M. J., Rothstein R. P. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia Journal of Neuroscience., 26 (2006), s. 4359-4369 49. Scott M. L., Holliday K. F., Woodhouse N., Waterton J. C. Noninvasive tumor hypoxia measurement using magnetic resonance imaging in murine U87 glioma xenografts and in patients with glioblastoma Journal of Magnetic Resonance in Medicine., 71 (2013), s. 342-344 50. Pistollato F., Abbadi S., Rampazzo E., Persano L. Intratumoral hypoxic gradient drives stem cells distribution and MGMT expression in glioblastoma Journal of Stem Cells Research., 28 (2010), s. 851-862 51. McCord M., Jamal M., Shankavaram U. UTP hysiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro Molecular Cancer Research., 7 (2009), s.489-497 52. Takahiro, Zimdahl B., Congdon K. Regulation of myeloid leukemia by the cell fate determinantMusashiNature., 446 (2010), s. 765-768 53. Uemura T., Shepherd S., Ackerman L.Numb, a gene required in determination of cell fate during sensory organ formation in Drosophila embryos Cell., 58 (1989), s. 349-360 54. Okabe M., Imai T., Kurusu M., Hiromi Y. Translational repression determines a neuronal potential in Drosophila asymmetric cell divisionNature., 411 (2001), s. 94-98 55. Imai T. The neural RNA-binding protein Musashi1 translationally regulates mammalian numb gene expression by interacting with its mRNA Journal of Molecular Cell Biology., 35 (2001), s. 3888-3900 56. Wu M. Imaging hematopoietic precursor division in real time Journal of Cell Stem., 1 (2007), s. 541-554 57. Jiang Y., Yang F., Meltzer P. AR6B is required for tight junction formation and activated PKCζ localization in breast cancer American Journal of Cancer Research., 5 (2012), s. 478-491 58. McCaffrey L., Montalbano J., Mihai C., Macara I. Loss of the Par3 polarity protein promotes breast tumorigenesis and metastasis. Cancer Cell., 22 (2012), s. 601-614 Podziały symetryczne i asymetryczne komórek macierzystych – mechanizm i rola w etiologii chorób nowotworowych Streszczenie Komórka macierzysta, może ulegać dwóm typom podziału, symetrycznemu, prowadzącemu do powstania dwóch potomnych komórek zachowujących charakter macierzysty lub asymetrycznemu skutkującego powstaniem dwóch komórek, z których jedna pozostaje komórką macierzystą, a druga wykazuje cechy różnicowania. Badania mechanizmu podziałowego w modelu neuroblastów Drosophila melanogaster wykazały, że w profazie mitozy, w szczytowej części neuroblastów powstaje kompleks białkowy składający się z takich czynników jak: Baz, Par6, aPKC, Mud oraz Insc. Z kolei, w części podstawnej komórek powstaje kompleks złożony z białka adaptorowego Mira oraz białka Numb. To ostatnie odpowiada za inhibicję ścieżek sygnalizacyjnych Notch oraz Hedgehog i to 99 Marcin Michalik, Tomasz Kozłowski, Mateusz Klimek, Piotr Czekaj prawdopodobnie dzięki jego aktywności po podziale jedna komórka zachowuje charakter progenitorowy. Komórki macierzyste w żywym organizmie stale podlegają oddziaływaniom ze strony lokalnego mikrośrodowiska. Na to mikrośrodowisko, zwane niszą, składają się inne komórki oraz macierz pozakomórkowa. W regulacji podziałów symetrycznych i asymetrycznych kluczową rolę odgrywają cząsteczki adhezyjne, takie jak kadheryny i integryny, odpowiadające za interakcje komórek macierzystych zarówno z innymi komórkami, jak i z macierzą pozakomórkową. Wpływ tych interakcji na losy komórki na etapie wyboru charakteru podziału został już opisany nie tylko u organizmów modelowych, takich jak D. melanogaster, ale także u ssaków. Dogłębne zrozumienie mechanizmów podziału macierzystych komórek nowotworowych, tzw. Cancer Stem Cells może mieć kluczowe znaczenie dla zastosowania skutecznej, celowanej terapii przeciwnowotworowej. Szereg prac skupia się na przedstawieniu mutacji genów regulujących podział asymetryczny w poszczególnych nowotworach. Szczególnym zainteresowaniem cieszą się nowotwory ośrodkowego układu nerwowego, piersi oraz przewlekła białaczka szpikowa. Stwierdzono, że punkty zaburzeń tych podziałów są różne w wyżej wymienionych patologiach, co może mieć znaczenie rokownicze. Symmetrical and asymmetrical stem cells divisions – the mechanism and role in the etiology of cancer Abstract Stem cell can undergo two types of division: symmetrical, leading to the creation of two daughter cells that retain stemness, or asymmetrical resulting in the formation of two different cells; one of them is a stem cell, and another one has the features of differentiation. Studies on the mechanism of cell division based on a model of Drosophila melanogaster showed that in the prophase of neuroblasts‟ mitosis a protein complex consisting of Baz, Par6, aPKC, Mud and Insc is formed in the apical part of the cell. In the basal part of the cell another protein complex consisting of adaptor protein Mira and Numb protein is identified. This latter is responsible for the inhibition of Notch and Hedgehog pathways what seems to be one of the reasons for retained stem/progenitor character of the cells after asymmetrical division. Stem cells are constantly subjected to extrinsic factors. Stem cell niche refers to a microenvironment consisting of extracellular matrix and other cells. A key role in the regulation of cell divisions play adhesion molecules such as cadherins and integrins responsible for both, cell-cell and cell-extracellular matrix interactions. The impact of these interactions on the stem cell fate has already been described not only in a model of D. melanogaster, but also in mammals. Understanding the mechanism of cancer stem cells division can be crucial for the application of effective targeted anticancer therapy. A number of studies is focused on gene mutations as factors regulating asymmetrical division in various cancers. Currently, there is particular interest in an exploration of the CNS and breast tumors, as well as chronic myeloid leukemia. It was found that in these disorders cell divisions are disturbed at different stages which may have prognostic significance. 100 Katarzyna Barchiewicz1, Karolina Jakubczyk2, Ewa Boniewska-Bernacka3 Rola transporterów ABC w translokacji ftalocyjanin w komórkach nowotworowych 1. Wstęp Każdego dnia, tylko w Stanach Zjednoczonych, wykrywa się ponad milion przypadków zachorowań na różnego rodzaju nowotwory. Chemioterapia jest jedną z metod leczenia tych chorób, polegająca na podawaniu cytostatyków. Jednak komórki nowotworowe mogą wykazywać oporność na podany lek. Zjawisko to, zwane lekoopornością, polega na wyrzucaniu na zewnątrz komórki podanych chemioterapeutyków. Mechanizm tego zjawiska tkwi w błonie komórkowej komórek nowotworowych i związany jest z białkami transporterów błonowych oraz nadekspresją ich genów. Wśród przyczyn oporności wielolekowej wymienia się także indukcję lub inaktywację enzymów przez aplikowane związki, zmiany zaburzające cykl komórkowy czy też zmiany w mechanizmach naprawczych DNA 2. Terapia fotodynamiczna nowotworów Obecnie stosowane terapie przeciwnowotworowe, takie jak chemioterapia czy radioterapia, borykają się z problemami, takimi jak niska selektywność, której następstwem są liczne skutki uboczne. Ponadto stosowanie chemoterapeutyków może spowodować wystąpienie tzw. oporności wielolekowej (MDR, multidrug resistance). Zjawisko to objawia się nabytą opornością komórek nowotworowych na kilka różnych grup niezwiązanych ze sobą leków cytostatycznych, która pojawia się w odpowiedzi na stosowanie pojedynczego terapeutyku [1, 2]. Obiecującą metodą, pozwalającą ominąć powyższe ograniczenia, wydaje się być terapia fotodynamiczna (PDT, photodynamic therapy). Jest to rodzaj fotochemioterapii, wykorzystujący selektywnie wzbudzane przez światło związki – fotouczulacze (PS, photosensitizer). Terapia ta przebiega kilkuetapowo. Po podaniu leku, w odpowiednim odstępstwie czasu koniecznym do jego selektywnej akumulacji w tkance nowotworowej, 1 [email protected], Zakład Chemii Ogólnej, Wydział Chemii, Uniwersytet Opolski [email protected], Zakład Chemii Ogólnej, Wydział Chemii, Uniwersytet Opolski 3 [email protected], Samodzielna Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej, Wydział Przyrodniczo-Techniczny, Uniwersytet Opolski 2 101 Katarzyna Barchiewicz, Karolina Jakubczyk, Ewa Boniewska-Bernacka fotouczulacz aktywowany jest światłem o odpowiedniej długości fali (rys. 1) [1, 3, 4]. Rysunek 1. Kolejne etapy terapii fotodynamicznej (PDT) [3] Absorbcja fotonu przez cząsteczkę fotouczulacza skutkuje jego wzbudzeniem i przejściem z singletowego stanu podstawowego (S0) do stanu singletowego wzbudzonego (S2), a następnie – w wyniku bezpromienistego przejścia międzysystemowego – do wzbudzonego stanu trypletowego (T1). Fotosensybilizator w tym stanie może wchodzić w dwie różne ścieżki reakcji. W przypadku, gdy stężenie tlenu w środowisku reakcji jest niewielkie, reakcja przebiega z wytworzeniem form wolnorodnikowych. Powstają one wskutek przeniesienia elektronu lub atomu wodoru pomiędzy cząsteczką wzbudzonego fotouczulacza a substratem – tkanką nowotworową, w której zachodzi reakcja fotochemiczna [3, 5, 6]. Drugim i dominującym mechanizmem jest ten, w którym następuje transfer energii ze wzbudzonych cząsteczek fotouczulacza do innych cząsteczek, będących w ich bezpośrednim otoczeniu, np. tlenu. Wówczas cząsteczki tlenu przechodzą z trypletowego stanu podstawowego ( 3O2) do wzbudzonego stanu singletowego (1O2). Powstałe w tym procesie reaktywne formy tlenu (ROS, reactive oxygen species) prowadzą do śmierci komórki [3, 5, 6]. Uważa się, że za cytotoksyczność PDT odpowiada uszkodzenie błon komórkowych, błon mitochondriów, lizosomów i jądra. Wykazano ponadto, że przy dużym stężeniu fotouczulacza i krótkim czasie inkubacji, śmierć komórek zachodzi na drodze nekrozy. Przy dłuższym czasie inkubacji i mniejszych stężeniach fotouczulacza dominuje natomiast apoptoza [5]. 102 Rola transporterów ABC w translokacji ftalocyjanin w komórkach nowotworowych 3. Ftalocyjaniny jako fotouczulacze Fotosensybilizatory stosowane w terapii fotodynamicznej powinny spełniać szereg warunków: powinny być związkami chemicznie czystymi, o znanym składzie; nie powinny wykazywać toksyczności bez dostępu do światła (minimalna toksyczność ciemna), ale wykazywać toksyczność po naświetleniu (toksyczność jasna); powinny selektywnie gromadzić się w tkance nowotworowej na długi czas; nie powinny wykazywać fototoksyczności wobec zdrowych tkanek; powinny powodować możliwie jak najmniej skutków ubocznych; powinny charakteryzować się dużą wydajnością kwantową generowania tlenu singletowego; intensywne pasma absorpcji fotouczulacza powinny występować w „oknach” transmisyjnych tkanek, tj. w obszarze, w jakim nie absorbują związki endogenne (600-900 nm) [5, 7]. Wśród fotouczulaczy wyróżnić można m.in. ftalocyjaniny – grupę związków zaliczaną do fotosensybilizatorów drugiej generacji. Ftalocyjaniny (MPc) są syntetycznymi analogami porfiryn i zbudowane są z czterech pierścieni izoindolowych, połączonych mostkami azametinowymi (rys. 2). Cząsteczka taka ma wewnętrzny sprzężony system wiązań podwójnych, zawierający 18 elektronów π i spełniający regułę aromatyczności Hückla (4n+2π, gdzie n = 4), dzięki czemu tworzy bardzo stabilny makrocykliczny układ molekularny [8]. Rysunek 2. Schemat budowy cząsteczki ftalocyjaniny, MPc, gdzie: M – atom metalu, R – podstawniki peryferyjne makropierścienia[9] 103 Katarzyna Barchiewicz, Karolina Jakubczyk, Ewa Boniewska-Bernacka Strukturę cząsteczki ftalocyjaniny można modyfikować na wiele sposobów – zarówno w centrum pierścienia, jak i w jego częściach peryferyjnych. Istnieją zarówno metaloftalocyjaniny, jak i ftalocyjaniny bez metalu (pochodne H2Pc), jednak obecność atomu metalu w pierścieniu wpływa stabilizująco na cały układ. Ftalocyjaniny są związkami nierozpuszczalnymi w wodzie, ale poprzez wprowadzenie do pierścienia określonych podstawników, można wpływać na ich właściwości hydrofilowe. Spośród wielu rodzajów podstawników, najbardziej obiecujące wydają się grupy alkilowe, sulfonowe, alkoksylowe, aminowe i estrowe [5,6]. 4. Lokowanie ftalocyjanin w komórkach Wychwyt fotouczulacza przez komórki nowotworowe jest kluczowy dla skutecznej terapii fotodynamicznej. Ponadto, ponieważ czas życia ROS jest krótki, działają one w pobliżu miejsca ich powstawania. Z tego względu miejsce lokalizacji PS w komórce wpływa na efektywność terapii fotodynamicznej. Istotne cechy strukturalne fotosensybilizatora, wpływające na jego lokalizację subkomórkową to: jonowy ładunek wypadkowy, który może wynosić od -4 (anion) do +4 (kation); stopień hydrofobowości; stopień asymetrii w cząsteczce. Hydrofobowe fotouczulacze, które posiadają nie więcej niż dwa ładunki ujemne, mogą dyfundować w poprzek błony komórkowej, a następnie do kolejnych przedziałów wewnątrzkomórkowych. Takie PS wykazują duże upakowanie w komórkach in vitro, zwłaszcza gdy występują w stosunkowo małych stężeniach (<1 µM). Mniej hydrofobowe fotosensybilizatory, mające mniej niż dwa ujemne ładunki, są zwykle zbyt polarne, by móc dyfundować przez błonę – ulegają one endocytozie. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja fotouczulacza obejmować może błonę komórkową, retikulum endoplazma-tyczne, Aparat Golgiego, lizosom i mitochondria. Stwierdzono, że PS o ładunku kationowym, lokują się w mitochondriach, podczas gdy te o ładunku anionowym lokują się w lizosomach [10, 11]. 4.1. Fotouczulacze hydrofilowe Modyfikacja pierścienia ftalocyjaniny hydrofilowymi podstawnikami pozwala otrzymać fotosensibilizatory hydrofilowe. Fotouczulacze takie są rozpuszczalne w wodzie i w naczyniach krwionośnych transportowane są głównie w postaci związanej z albuminami. Z powodu swojej hydrofilowości trudno przechodzą przez domeny lipidowe – do komórki pobierane są w procesie endocytozy i dlatego lokalizują się głównie w lizosomach. Wywołują głównie efekty naczyniowe, takie jak zwężanie 104 Rola transporterów ABC w translokacji ftalocyjanin w komórkach nowotworowych i niszczenie drobnych naczyń krwionośnych zaopatrujących tkanki nowotworowe w tlen i substancje odżywcze. Przykładem takich fotosensybilizatorów są tetrasulfonowane ftalocyjaniny glinu i cynku [4, 6, 12, 13]. Innym przykładem hydrofilowego fotouczulacza jest ftalocyjanina cynku (ZnPc) z kowalencyjnie związanym N-terminalnym fragmentem (ATF, amino-terminal fragment) aktywatora plazminogenu typu urokinazowego (uPA, urokinase-type plazminogen activator). Komórki nowotworowe wykazują bowiem nadekspresję receptorów uPA (uPAR). Stwierdzono, że takie koniugaty lokują się głównie w cytoplazmie i lizosomach [14]. 4.2. Fotouczulacze amfifilowe Lipofilowe i amfifilowe fotouczulacze wykazują duże powinowactwo do lipoprotein o małej gęstości (LDL). Zwiększony katabolizm cholesterolu w intensywnie proliferujących komórkach jest wynikiem nadekspresji genów receptorów LDL. Również mniejsza wartość pH występujące w tkankach nowotworowych powoduje neutralizację ujemnych ładunków łańcuchów karboksylowych, powodując zwiększenie lipofilowości fotouczulacza [15]. Amfifilowe fotouczulacze mają pierścień asymetrycznie podstawiony grupami polarnymi, np. karboksylowymi lub sulfonowymi. Obecność hydrofobowego pierścienia w cząsteczce powoduje jej duże powinowactwo do lipidów i umożliwia wejście do błony komórkowej, podczas gdy hydrofilowe podstawniki pierścienia skierowane są do fazy wodnej. Amfifilowe PS są dość szybko transportowane z jednej warstwy podwójnej błony komórkowej do drugiej poprzez ruch flip-flop, a następnie do wnętrza komórki (rys. 3) [15]. 105 Katarzyna Barchiewicz, Karolina Jakubczyk, Ewa Boniewska-Bernacka Rysunek 3. Struktura amfifilowych fotouczulaczy (a); schemat lipoproteiny niskiej gęstości (b); schemat przejścia amfifilowego fotouczulacza przez błonę komórkową (c) [15] 4.3. Fotouczulacze hydrofobowe Lipofilowe fotouczulacze mogą być transportowane do komórek w liposomach. Liposomy fuzogenne (MFL, fusogenic liposomes) ulegają fuzji z błoną komórkową, dzięki czemu transportowany przez nie fotouczulacz może być selektywnie dostarczany do błony komórkowej (rys.4a). Konwencjonalne liposomy kationowe (NFL, non-fusogenic liposmes) wchodzą do komórki na drodze endocytozy i mogą transportować fotouczulacz do przedziałów wewnątrzkomórkowych, przede wszystkim do endosomów i lizosomów (rys. 4b). Uważa się, że dodatni ładunek tych liposomów ułatwia interakcję z ujemnie naładowaną błoną komórkową, co przekłada się na większą wydajność transportu [11]. 106 Rola transporterów ABC w translokacji ftalocyjanin w komórkach nowotworowych Rysunek 4. Schemat selektywnego dostarczania hydrofobowego fotouczulacza (czerwony) do komórki przy zastosowaniu liposomów fuzogennych (MFL) (a) lub niefuozgennych NFL (b) wg [11] Selektywność transportu hydrofobowych ftalocyjanin do komórek przy użyciu liposomów MFL i NFL badano in vitro z użyciem mikroskopii konfokalnej. W badaniu wykorzystano ftalocyjaninę cynku oraz linie ludzkiego niedrobnokomórkowego raka płuc (H460), nowotworu jelita grubego myszy (CT26) oraz glejaka ludzkiego (U87MG), których jądra komórkowe wybarwiono za pomocą Hoechst 33342. 30 minut po podaniu fotouczulacza widoczna była jego selektywna akumulacja. Ftalocyjanina cynku dostarczana w liposomach MFL gromadziła się w błonie komórkowej, natomiast ten sam związek dostarczany w liposomach NFL akumulował się we wnętrzu komórki (rys. 5). Stwierdzono, że dystrybucja tej ftalocyjaniny do komórek za pomocą liposomów jest znacznie bardziej efektywna w porównaniu do dystrybucji wolnej ftalocyjaniny bez nośnika. Co więcej, miejsce lokalizacji fotouczulacza w komórce miało bardzo duży wpływ na efektywność PDT – znacznie wyższą cytotoksyczność jasną obserwowano w przypadku, gdy fotosensybilizator dostarczany był do błony komórkowej. Potwierdza to rolę miejsca lokalizacji leku w komórce dla skuteczności terapii [11]. 107 Katarzyna Barchiewicz, Karolina Jakubczyk, Ewa Boniewska-Bernacka Rysunek 5. Selektywna dystrybucja ZnPc (czerwony) w komórce za pomocą liposomów MFL i NFL. Obraz w mikroskopii konfokalnej 30 minut od podania fotouczulacza. Jądro komórkowe wybarwione za pomocą Hoechst 33342 (niebieski) [11] 5. Transportery błonowe Transportery błonowe są białkami błonowymi, które dzięki hydrolizie ATP są w stanie przetransportować cząsteczki związków chemicznych przez błonę komórkową. W komórkach prokariotycznych, transportery mają za zadanie dostarczyć do wnętrza substancje, które nie są w stanie przejść przez błony w wyniku dyfuzji – np. witaminy czy węglowodany. W komórkach eukariotycznych transportowane są głównie ksenobiotyki na zewnątrz komórki lub do organelli komórkowych (rys. 6) [16,17]. 108 Rola transporterów ABC w translokacji ftalocyjanin w komórkach nowotworowych Rysunek 6. Transport dużych cząsteczek przez błonę (1-bierna dyfuzja substratów Pgp do komórki, 2- czynny transport na zewnątrz komórki z udziałem glikoproteiny P, 3- hamowanie działania glikoproteiny P) [18] U człowieka, transportery błonowe występują w błonach niemal każdej komórki, szczególnie dużo obserwuje się ich w komórkach wydzielniczych i nabłonkowych. Ponadto w reakcji na niektóre leki, geny kodujące białka wybranych transporterów błonowych, ulegają wzmożonej ekspresji, w efekcie czego zwiększa się ilość kodowanych przez nie białek w błonie. W nadrodzinie transporterów ABC, jak dotąd, sklasyfikowano 51 białek i podzielono na 7 podrodzin: ABC1 (ABCA), MDR/TAP (ABCB), CFTR/MRP (ABCC), ALD (ABCD), OABP (ABCE), GCN20 (ABCF), White (ABCG) [16,19,20]. Wspólną cechą wszystkich białek jest struktura, składająca się z: 6 do 11 α-helikalnych hydrofobowych transmembranowych fragmentów (TMD – trans-membrane domain) – jest to część błonowa, odpowiedzialna za transport w poprzek błony i specyficzność substratową oraz hydrofilowej domeny wiążącej nukleotyd (NBD, z ang. nucleotidebinding domain), dzięki której zachodzi hydroliza ATP. W tym fragmencie białka znajdują się tzw. motywy Walkera A i B, które są charakterystyczne dla nadrodziny transporterów ABC oraz motyw C (sekwencja: LSGGQ), znany jest jako „region podpisu”. Poszczególne białka mogą mieć różną liczbę domen transbłonowych oraz miejsc wiążących nukleotydy. Jednak aby białko było funkcjonalne, musi mieć co najmniej cztery domeny: dwie TMD oraz dwie NBD. Jest to wówczas pełny transporter [16]. 109 Katarzyna Barchiewicz, Karolina Jakubczyk, Ewa Boniewska-Bernacka 5.1. Glikoproteina P Glikoproteina P jest pierwszym zidentyfikowanym i opisanym ludzkim białkiem transportującym z nadrodziny ABC. Białko to jest kodowane przez gen MDR (Multi Drug Resistance), umiejscowiony na 21 prążku długiego ramienia chromosomu 7, stąd druga nazwa – MDR1 (Multi Drug Resistance 1). Powstałe na matrycy tego genu białko, zostało odkryte w1975 r. w komórkach nowotworowych w trakcie badań nad opornością tych komórek na cytostatyki. Glikoproteina P składa się z 1280 aminokwasów, a jej masa wynosi około 170 kDa. Budowa jej jest charakterystyczna dla białek z nadrodziny ABC: wyróżnia się domeny transbłonowe (TMD) oraz domeny wiążące ATP (NBD). Domeny NBD są ze sobą ściśle związane, leżą blisko powierzchni błony, a region do którego wiązane są leki, leży po wewnętrznej stronie błony (rys. 7) [21,23]. Rysunek 7. Schemat budowy glikoproteiny P [opracowanie własne]. Istotnymi elementami są także motywy Walkera A i B, oddzielone polipeptydowym fragmentem 90 - 120 aminokwasów, oraz sekwencja C – „region podpisu”. W przestrzeni, która znajduje się pomiędzy domenami, występują głównie aminokwasy hydrofobowe i aromatyczne. Z 73 aminokwasów tworzących TMD, 15 to aminokwasy polarne i tylko dwa (His 60 i Glu 871) znajdujące się na N-terminalnym końcu, obdarzone są ładunkiem [16]. Struktura trzeciorzędowa przypomina cylinder o średnicy około 10 nm i wysokości 8 nm, z wewnętrznym otworem o średnicy 5 nm. Duże stężenie Pgp występuje w zdrowych komórkach wydzielniczych (komórki nabłonka jelit, kory nadnerczy, kanalików żółciowych wątroby, komórki układu limfatycznego). Glikoproteina P bierze więc udział w procesach usuwania czynników endogennych, np. zbędnych metabolitów. Pgp obecne w limfocytach T transportują przez błonę komórkową cytokiny: interleukiny IL - 2, IL – 4 oraz interferon gamma [2]. Z badań Juliano i Ling [21] wynika, że Pgp wypompowuje substancje na zewnątrz komórki, obniżając ich stężenie do takiego, które jest nietoksyczne. Wysokie stężenie glikoproteiny stwierdzono w komórkach raka nerki 110 Rola transporterów ABC w translokacji ftalocyjanin w komórkach nowotworowych i jelita grubego, w komórkach czerniaka i komórkach nowotworowych układu nerwowego. Nadekspresja genu, na matrycy którego powstaje Pgp, może być pierwotna (komórki, które mają funkcje wydzielnicze, np. trzustki, jelit) i wtórna (w wyniku podawania chemioterapeutyków następuje stymulacja ekspresji glikoproteiny). Udowodniono, że podawane leki przeciwnowotworowe zwiększają poziom mRNA glikoproteiny P przez zwiększenie stężenia czynników transkrypcyjnych w jądrze (np. YB-1). Wykazano, że leki przeciwnowotworowe mogą wpływać na metylację DNA (w rejonie CpG w obrębie promotora) i acetylację histonów, co jest związane z interakcjami czynników transkrypcyjnych z regionem promotorowym MDR i w efekcie wpływa na ilość mRNA i zarazem glikoproteiny P. Komórki bardziej wyeksponowane na działanie cytostatyków są faworyzowane kosztem komórek o niższym stężeniu Pgp – występuje klonalna selekcja, efektem której jest utrudnienie zwalczenia nowotworu jako całości [24,25]. Wśród substratów glikoproteiny znajdują się antybiotyki cytostatyczne (doksorubicyna), alkaloidy (winblastyna, winkrystyna), peptydy (cyklosporyna), oraz glikozydy (digitoksyna). Mechanizm przemieszczania hydrofobowych substratów przez błonę nadal nie jest dokładnie wyjaśniony. Transporter wypompowuje cząsteczki, które leżą najbliżej wewnętrznej części błony, do środowiska zewnętrznego, najbliższego zewnętrznej części błony. Równie prawdopodobny jak model klasycznej pompy czy flipazy (phosfolipid-translocating P-type ATP-ase) jest model „odkurzacza molekularnego”. Przy transporcie współdziałają domeny transmembranowe (TMD) oraz następuje hydroliza ATP na domenach NBD. Substrat wiąże się na domenach TMD od 4 do 6 i od 10 do 12. Wiązanie ATP następuje w motywie Walkera B. Glikoproteina P transportuje substancje hydrofobowe oraz kationy i cząsteczki obojętne o masie w granicach 2 kDa. Faworyzowane są cząsteczki o odpowiednio rozmieszczonych przestrzennie grupach funkcyjnych, które mogą być donorami elektronów. Istotne są także tworzące się wiązania wodorowe – między substratem a białkiem [26,27,28,30]. Zwiększenie ilości Pgp stanowi złe rokowanie w przypadku leczenia nowotworów. Oprócz gorszej odpowiedzi na leczenie, występuje krótszy czas przeżycia i szybszy nawrót choroby. Jednocześnie odkrycie glikoproteiny P spowodowało rozwój badań nad inhibicją tego białka, co miało zwiększyć penetrację leków w komórce. 111 Katarzyna Barchiewicz, Karolina Jakubczyk, Ewa Boniewska-Bernacka 5.2. Transport cząsteczek na przykładzie modelu „odkurzacza molekularnego” Klasyczny opis transportu przez błony (np. transport bierny czy dyfuzja) nie jest odpowiedni dla transportu ftalocyjanin. Prawdopodobny wydaje się transport aktywny według modelu „odkurzacza molekularnego” lub flipazy. Model odkurzacza molekularnego (rys. 8) opiera się na założeniu, że pompa wyrzuca do środowiska zewnętrznego te cząsteczki, które znalazły się w dwuwarstwie lipidowej. Rysunek 8. Schematy transportu przez błonę; (a) flipaza; (b) model odkurzacza molekularnego; (c) transport aktywny; (d) model odkurzacza molekularnego Badania z substratem – doksorubicyną oznaczoną azydkiem jodonaftalenowym, potwierdziły tezę, że związek znajdujący się w membranie, w bliskim kontakcie z przenośnikiem, zostaje usunięty na zewnątrz. W momencie podania znakowanych fluorescencyjnie estrów acetoksymetylu, glikoproteina usunęła cząsteczki leków zanim nastąpił kontakt z esterazami, będącymi w cytozolu [16]. 5.3. Transport cząsteczek na przykładzie modelu „flipazy” Model flipazy, w przeciwieństwie do modelu „molekularnego odkurzacza” zakłada przeniesienie cząsteczki z wewnętrznej warstwy membrany do zewnętrznej warstwy. W warstwie zewnętrznej stężenie leku rośnie, maleje natomiast w warstwie wewnętrznej, w wyniku czego tworzy się gradient między środowiskiem zewnętrznym a cytoplazmą. W czasie wydalania leku, domena wiążąca białka może być skierowana do wewnętrznej warstwy błony lub na zewnątrz komórki. Dlatego substancje mogą być uwalniane w obu miejscach, zależnie od charakteru (lipofilowe lub hydrofilowe). Dla substancji hydrofobowych bardziej prawdopodobne jest osadzenie cząsteczek w błonie, niż wyrzucenie na zewnątrz. Natomiast dla substancji lipofilowych, korzystniejsze energetycznie jest usunięcie cząsteczek poza błonę. Badania wykazały, że cząsteczki hydrofobowe częściej lokują się w jednej z dwóch warstw membrany, niż w jej rdzeniu. Występują jednak spontaniczne 112 Rola transporterów ABC w translokacji ftalocyjanin w komórkach nowotworowych przejścia między warstwami, w celu wygenerowania gradientu. Przebiegają one z różną szybkością, tak samo jak ruchy flip-flop lipidów błon, w które najprawdopodobniej również zaangażowane są błonowe białka transportowe. Na przykładzie heksadecylofosfocholiny stwierdzono interakcje lipidów z transporterami. Na podstawie badań strukturalnych i biochemicznych stwierdzono, że substraty dostają się do wnętrza Pgp przez pewnego rodzaju bramkę, tworzoną przez domeny 5 i 8 oraz 2 i 11 [16]. 5.4. Prawdopodobny transport ftalocyjanin przez błony Ftalocyjaniny pod wpływem promieniowania ulegają wzbudzeniu i biorą udział w reakcji fotochemicznej, powodując zmiany biochemiczne w komórkach, w których zostały zakumulowane, doprowadzając je do śmierci. Istotną kwestią w tym zjawisku jest stężenie ftalocyjanin w komórce. Wpływa ono na wydajność reakcji fotochemicznej, a zatem na stopień zniszczenia nowotworu. Duża ilość cząsteczek ftalocyjaniny w komórkach umożliwia wytworzenie dużej ilości reaktywnych form tlenu, które niszcząc lipidy błonowe powodują zmiany przepuszczalności błon i śmierć komórki. Mechanizmy transportu dużych cząsteczek hydrofobowych przez błony, które uniemożliwiają osiągnięcie dawki terapeutycznej w komórce, nie są do końca poznane. Wiadomo jest, że ftalocyjaniny przechodzą przez błony do wnętrza komórek. To czy transportery ABC mają zdolność wyrzucania ich cząsteczek na zewnątrz komórki jest wciąż przedmiotem dyskusji. Zarówno model molekularnego odkurzacza, jak również flipazy jest możliwy dla tego typu związków, ze względu na ich hydrofobowość. Na przykładzie glikoproteiny P można stwierdzić, że hydrofobowe wnętrze kanału tego białka, może ułatwić wydostanie się związku na zewnątrz. Wiązania wodorowe wytworzone przez atomy wodoru lub azotu ftalocyjaniny z atomami wodoru lub azotu białek czy oddziaływania π-π pierścieni ftalocyjanin i aminokwasów są argumentami przybliżającymi tezę przechodzenia cząsteczek ftalocyjanin przez hydrofobowe wnętrze glikoproteiny P. Pożądanym efektem jest akumulacja ftalocyjanin w komórkach. Wykazano, że komórki E. coli DH5α po 48 godzinnej inkubacji (rys. 9 a) w podłożu z dodatkiem ftalocyjaniny iterbu, zabarwiły się na zielono i barwa nie zmieniła się po wypłukaniu w płynie fizjologicznym (rys. 9 b). Po lizie zaobserwowano, że lizat również jest zabarwiony na zielono. Absorbancja lizatu przyjmuje zdecydowanie niższe wartości niż absorbancja podłoża, co może oznaczać słaby transport do wnętrza komórki lub wzmożony transport na zewnątrz komórki [20,23,29]. 113 Katarzyna Barchiewicz, Karolina Jakubczyk, Ewa Boniewska-Bernacka Rysunek 9. Hodowla komórek E. coli z dodatkiem YbPc2 4,18 • 10-5 M (a); komórki przed lizą (b); komórki po lizie (c); [opracowanie własne] Przykładem transportu dużych cząsteczek przez błony za pośrednictwem transporterów ABC jest sekrecja protoporfiryny przez błonę ABCG2. W przypadku ftalocyjaniny iterbu, która jest cząsteczką typu „sandwich” (rys. 10), niekorzystny wpływ na transport przez błonę może mieć wielkość cząsteczki [16]. Rysunek 10. Ftalocyjanina typu sandwich, YbPc2; kolorem szarym oznaczono atomy C, niebieskim atomy N, czerwonym atom Yb [opracowanie własne] 6. Podsumowanie Ftalocyjaniny, jako związki o dużych możliwościach modyfikacji, są interesującym obiektem badań w dziedzinie transportu błonowego. Zmiana struktury chemicznej cząsteczek pozwala na kontrolę docelowego miejsca dostarczania, a tym samym zwiększenie efektywności terapii fotodynamicznej. Możliwość dołączania grup funkcyjnych, chelatowania jonów metali czy tworzenie cząsteczek diftalocyjanin otwiera nowe perspektywy w terapii 114 Rola transporterów ABC w translokacji ftalocyjanin w komórkach nowotworowych fotodynamicznej i leczeniu nowotworów. Duże nadzieje wiążą się z terapią fotodynamiczną jako sposobem ominięcia problemu lekooporności. Z tego względu w przyszłych badaniach nowych fotosensybilizatorów należy się upewnić, iż nie wywołują one efektu MDR. Literatura: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Choromańska A., Kulbacka J., Saczko J. Terapia fotodynamiczna – założenia, mechanizm, aplikacje kliniczne, Nowa Medycyna 1 (2013), s. 26-30 Lenart K., Szyda A., Kiełbasiński M., Duś D., Podolak-Dawidziak M. Kliniczne skutki oporności wielolekowej w nowotworach, Onkologia w Praktyce Klinicznej 1 (2005); s. 18-26 Mroz P., Yaroslavsky A., Kharkwal G. B., Hamblin M. R. Cell Death Pathways in Photodynamic Therapy of Cancer, Cancers 2 (2011), s. 2516-2539 Osmałek T., Gośliński T., Mielcarek J., Osmałek E. Nowe tendencje oraz bezpieczeństwo terapii fotodynamicznej, Przegląd Lekarski 69 (2012), s. 1205-1208 Osmałek T. Modyfikowane ftalocyjaniny, porfirazyny i subftalocyjaniny jako potencjalne fotosensybilizatory w terapii fotodynamicznej, praca doktorska, Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Poznań Trytek M., Makarska M., Polska K., Radzki S., Fiedurek J. Porfiryny i ftalocyjaniny. Cz.1. Właściwości i niektóre zastosowania. Biotechnologia, 71 (2005), s. 109-127 Nowak-Stępniowska A., Pergoł P., Padzik-Graczyk A.Metoda fotodynamiczna diagnostyki i leczenia nowotworów – mechanizmy i zastosowania, Postępy Biochemii 1 (2013), s. 53-63 Kinzhybalo V. Synteza, stereochemia i właściwości 4+1 i 4+2 koordynacyjnych związków kompleksowych ftalocyjaniny magnezu, praca doktorska, Instytut Niskich Temperatur i Badań Strukturalnych PAN im. Włodzimierza Trzebiatowskiego we Wrocławiu Allen C. M., Sharman W. M., Van Lier J. E. Current status of phthalocyanines in the photodynamic therapy of cancer, Journal of Porphyrins and Phthalocyanines, 5 (2001), s. 161-169 Castano A. P., Demidova T. N., Hamblin M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part one–photosensitizers, photochemistry and cellular localization, Photodiagnosis and Photodynamic Therapy 1 (2004), s. 279-293 Kima J., Santos O.A., Park J.H Selective photosensitizer delivery into plasma membrane for effective photodynamic therapy, Journal of Controlled Release, 191 (2014), 98-104 Brożek-Płuska B. Metody spektroskopowe w diagnostyce zmian nowotworu ludzkiego gruczołu piersiowego, Zeszyty Naukowe 1157 (2013), Wydawnictwo Politechniki Łódzkiej, Łódź Berlanda J., Kiesslich T., Engelhardt V., Krammer B., Plaetzer K. Comparative in vitro study on the characteristics of different photosensitizers 115 Katarzyna Barchiewicz, Karolina Jakubczyk, Ewa Boniewska-Bernacka 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. employed in PDT, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 100 (2010), s. 173-180 Chen Z., Xu P., Chen J., Chen H., Hu P., Chen X., Lin L., Huang Y., Zheng K., Zhou S., Li R., Chen S., Liu J., Xue J., Huang M. Zinc phthalocyanine conjugated with the amino-terminal fragment of urokinase for tumor-targeting photodynamic therapy, Acta Biomaterialia 10 (2014), s. 4257-4268 Bonneau S., Morlie`re P., Brault D. Dynamics of interactions of photosensitizers with lipoproteins and membrane-models: correlation with cellular incorporation and subcellular distribution, Biochemical Pharmacology 68 (2004), s. 1443-1452 Eckford P.D.W., Sharom F.J. ABC Efflux Pump-Based Resistance to Chemotherapy Drug, Chemical Review, 109 (2009), 2989-3011 Detty M.R., Gibson S.L., Wagner S.J. Current Clinical and Preclinical Photosensitizers for Use in Photodynamic Therapy, Journal of Medicinal Chemistry, 47 (2004), 16, s. 3897-3915 http://www.lekiinformacje.pl/103,interakcje_na_etapie_wydalania_lekow_cz_ ii.html Epel D., Luckenbach T., Stevenson C.N., MacManus-Spencer L. A., Tvrtko Smital Efflux Transporters: Newly Appreciated Roles in Protection against Pollutants, Environmental Science and Technology, 1(2008), s. 3914-3920 Jamroziak K., Młynarski W., Robak T. Znaczenie białek transportowych nadrodziny ABC w oporności na leczenie ostrej białaczki szpikowej, Acta Haematologica Polonica, 32 (2001), 2, s. 131-145 21. Juliano R. L., Ling V. A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants, Biochimica Biophysica Acta, 455 (1976) s. 152-162 22. Ecker G., Huber M., Schmid D., Chiba P. The Importance of a Nitrogen Atom in Modulators of Multidrug Resistance, Aspet Journal 9 (2015), s.791-796 23. Shao J., Dai Y., Zhao W., Xie J., Xue J., Ye J., Jia L. Intracellular distribution and mechanisms of actions of photosensitizer Zinc(II)-phthalocyanine solubilized in Cremophor EL against human hepatocellular carcinoma HepG2 cells, Cancer Letters, 330 (2013), s. 49-56 24. Severin E.S. New approaches to targeted drug delivery to tumour cells, Russian Chemical Reviews, 84 (2015), 1, s. 43-60 25. Pańczyk M., Sałagacka A., Mirowski M., Gen MDR1 (ABCB1) kodujący glikoproteinę P (P-gp) z rodziny transporterów błonowych ABC: znaczenie dla terapii i rozwoju nowotworów, Postępy Biochemii 53(2007), 4, s. 1-13 26. Seeleing A. A general pattern for substrate recognition by P-glycoprotein, European Journal of Biochememistry 251 (1998), s. 252-261 27. Aller S.G., Yul J., Ward A., Weng Y., Chittaboina S., Zhuo R., Harrell P.M., Trinh Y. T., Zhang Q., Urbatsch I. L., Chang G. Structure of P-glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly- Specific Drug Binding, Science 323 (2009), 5922, s. 1718-1722 28. Wu C., Hsieh C., Wu Y. The Emergence of Drug Transporter-Mediated Multidrug Resistance to Cancer Chemotherapy, Molecular Pharmaceutics, 6 (2011), s. 1996-2011 116 Rola transporterów ABC w translokacji ftalocyjanin w komórkach nowotworowych 29. Tarasova N., Seth R., Tarasov S.G., Kosakowska-Cholody T., Hrycyna C. A., Gottesman M. M., Michejda C.J. Transmembrane Inhibitors of PGlycoprotein, an ABC Transporter, Journal of Medicinal Chemistry, 48 (2005), 11, s. 3768-3775 30. Kim R. B. Transporters and Drug Discovery: Why, When, and How, Molecular Pharmaceutics, 3 (2005), 1, s. 26-32 Rola transporterów ABC w translokacji ftalocyjanin w komórkach nowotworowych Streszczenie W komórkach ludzkich obecne są transportery błonowe odpowiedzialne za przedostawanie się przez błonę komórkową egzo- i endogennych związków. Są to białka, które mają możliwość regulacji szybkości i kierunku translokacji cząsteczek. Najbardziej znaczące w komórkach ludzkich są transportery wiążące ATP (ABC - ATP-Binding Cassette). Ich zróżnicowanie w budowie i funkcjach spowodowało, że podzielono je na 7 podrodzin. Podrodzina ABCB, w której znajduje się białko MDR1 (glikoproteina P – Pgp), odpowiada głównie za procesy oporności wielolekowej (MDR – Multi Drug Resistance), która objawia się wyrzucaniem niepożądanych związków, w tym również chemioterapeutyków, na zewnątrz komórki. Mechanizmy tych procesów nie zostały jeszcze dokładnie wyjaśnione, ze względu na znaczną hydrofobowość transporterów oraz ich niską ekspresję. Najczęściej mówi się jednak o modelu klasycznej pompy, flipazy i „odkurzacza molekularnego”. Rodzaj mechanizmu zależny jest od transportera oraz od transportowanego związku. Mechanizm efflux czyli wyrzucanie z komórki niepożądanych związków, ma istotne znaczenie dla zachowania homeostazy komórki. Komórki nowotworowe posiadają szczególnie rozwinięty system pomp, ze względu na dostarczane docelowo chemioterapeutyki. Do związków, które doprowadzają do apoptozy komórki nowotworowe zaliczane są ftalocyjaniny. Po przedostaniu się do wnętrza i pochłonięciu określonej dawki promieniowania, wzbudzone molekuły ftalocyjaniny generują reaktywne formy tlenu (ROS – Reactive Oxygen Species), powodujące utlenienie kwasów tłuszczowych, co prowadzi do dezintegracji błony komórkowej. Uniemożliwienie usuwania przez transportery błonowe cząsteczek chemoterapeutyków (np. ftalocyjanin), mogłoby być skutecznym sposobem na ulepszenie procesu leczenia nowotworów, m.in. w terapii fotodynamicznej (PDT) z udziałem ftalocyjanin. The role of ABC transporters in translocation of phthalocyanines in tumor cells Abstract In human cells there are membrane transporters, which are responsible for the permeation of exo- and endogenous compounds through the cell membrane. These are proteins which have the potential to control speed and direction of translocation of molecules. In human cells, the ATP-binding cassette transporters (ABC) are the most significant ones. Because of their structural and functional diversity they were divided into 7 subfamilies. The ABCB subfamily, including the MDR1 protein (or glycoprotein P - Pgp) is mainly responsible for the multidrug resistance processes (MDR), which consists in the ejection of unwanted species, including chemotherapeutic agents, out of the cell. The mechanisms of these processes have not yet been fully explained, due to the high hydrophobicity of the transporters and their low expression. However, the most often considered models there are the classical pump, flippase and the "molecular vacuum cleaner". The mechanism type 117 Katarzyna Barchiewicz, Karolina Jakubczyk, Ewa Boniewska-Bernacka depends on the transporter and the compound being transported. The efflux mechanism, i.e. throwing undesired compounds out of the cell, is essential for the cell homeostasis. Tumor cells have a particularly well-developed pump system due to the supplied target chemotherapeutics. Phthalocyanines are ranked among the compounds which lead to apoptosis of tumor cells. After penetrating into the tumor cell followed by absorption of a specified radiation dose, excited phthalocyanine molecules produce reactive oxygen species (ROS), that subsequently do oxidize the lipid acids, what leads to disintegration of the cell membrane. Preventing the membrane transporters from removal of chemotherapeutic molecules (e.g. phthalocyanines) could be an effective way to improve the cancer treatment process, i.a. in photodynamic therapy (PDT) involving phthalocyanines. 118 Joanna Woźniak1, Tomasz Wandtke2, Arkadiusz Goede3 Ekspresja interleukiny-27 w monononuklearach krwi obwodowej po ekspozycji na komórki niedrobnokomórkowego raka płuca 1. Wstęp teoretyczny Badania nad interleukiną-27 (ang. interleukin-27, IL-27) sięgają 2002 roku, kiedy to Pflanz i wsp. po raz pierwszy opisali jej występowanie w komórkach prezentujących antygeny (ang. Antigen presenting cells, APCs). Zgodnie z definicją, omawiana cytokina występuje powszechnie w makrofagach oraz komórkach dendrytycznych, a jej profil działania dotyczy przede wszystkim ekspansji antygenowo specyficznych dziewiczych limfocytów CD4+ [1]. Niedługo po opublikowaniu cytowanej pracy okazało sięnatomiast, że IL-27 wpływa na aktywność cytotoksyczną komórek, gdyż promuje ekspresję interferonu gamma (ang. interferon gamma, IFN-γ) oraz polaryzację immunologiczną limfocytów T w kierunku Th1 [2]. Kolejne prace badawcze nad interleukiną-27 dowiodły, iżodpowiedzialna jest ona za funkcje immunosupresyjne, gdyżhamuje ekspresję prozapalnych cytokin, do których z pewnością zaliczają się interleukina-6 (IL-6), interleukina-1α (IL-1α), interleukina-1β (IL-1β), interleukina-8 (IL-8) oraz czynnik martwicy nowotworów α(ang. tumor necrosis factor α, TNFα) [3]. Powyższe stwierdzenie potwierdzono m.in. poprzez knock-out swoistego receptora dla IL-27, który stanowi WSX-1, opisywany często jako TCCR czy IL-27Rα. Opisane wyciszenie receptora skutkowało masową produkcją kaskady procesów zapalnych in vivo [4]. Omawiana cytokina stała się równieża trakcyjnym celem terapeutycznym w terapiach skierowanych przeciwko nowotworom. Większość z aktywności IL-27 opiera sięna drodze aktywacji szlaku STAT-1, a także czynników transkrypcyjnych T-bet. W wyniku aktywacji omawianych szlaków zauważa się ekspresję ICAM-1 (ang.intercellular adhesion molekule-1), które jest białkiem adhezyjnym. Następstwem jestinterakcja z czynnikiem 1 [email protected], Zakład Genoterapii, WydziałLekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy 2 [email protected], Zakład Genoterapii, WydziałLekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy [email protected], Zakład Genoterapii, WydziałLekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy 119 Joanna Woźniak, Tomasz Wandtke, Arkadiusz Goede LFA-1 (ang. lymphocyte function associated antigen-1),który stanowi swoisty ligand dla powyższej integryny. W wynikutegodochodzi do aktywacjikinazybiałkowej ERK1/2 (ang.extracellular signal-regulated kinase) iróżnicowaniu komórek efektorowych w kierunku profilu Th1 poprzez wzmożoną produkcję IFN-γw komórkach T CD8+ [5]. Interesujący okazał się fakt zaobserwowania przez inny zespółbadawczy aktywności cytotoksycznych IL-27 przebiegających niezależnie od opisywanej ścieżki zapalnej z udziałem IFN-γ. Liu i wsp. odnotowali w swoim doświadczeniu, że cytokina wzmagała aktywność komórek NK (ang. natural killers) [6]. Nie mniej istotne okazało sięzaobserwowanie wpływu cytokiny na makrofagi oraz monocyty. Badanie na ustalonej linii komórek monocytarnomakrofagowej THP-1 (ludzka białaczkowa linia monocytarna) wykazało, iżich ekspozycja na interleukinę-27 powodowała ekspresję znacznych ilości cytokin prozapalnych, w porównaniu do komórek kontrolnych, które stanowiły równieżmakrofagi i monocyty, lecz nietraktowane IL-27 [7]. Na podstawie ogólnie dostępnej wiedzy na temat walki z nowotworami złośliwymi pojawiły sięwielce prawdopodobne sugestie nad zastosowaniem IL-27 w eksperymentalnych terapiach onkologicznych. Jednąz prób było wykorzystanie komórek dendrytycznych (ang. dendriticcells, DC) do zwiększonej produkcji omawianej cytokiny pod wpływem interferonu γ[8]. Zupełnie innym mechanizmem skierowanym przeciwko komórkom raka było wzmożenie ekspresji cząsteczek głównego kompleksu tkankowego (ang.ang. major histocompatibilitycomplex, MHC) klasy I, występujących na komórkach nowotworowych, co skutkowałozwiększoną aktywnością cytotoksyczną CTL (ang.Cytotoxic T lymphocytes) [9]. 2. Cel pracy Celem niniejszej pracy była próba zbadania profilu komórek jednojądrzastych, wyizolowanych z krwi obwodowej po wykonaniu hodowli podwójnych z komórkami transfekowanymi plazmidem eskpresyjnym, kodującym IL-27, plazmidem kontrolnym oraz komórkami nietransfekowanyminiedrobnokomórkowego raka płuca. 120 Ekspresja interleukiny-27 w mononuklearach krwi obwodowej po ekspozycji na komórki niedrobnokomórkowego raka płuca 3. Materiały i metody 3.1. Ustalona linia komórkowa A549 W celu przeprowadzenia doświadczeń wykorzystano ustaloną linię komórkową niedrobnokomórkowego raka pluca - A549. Niniejszą linię stanowią pneumocyty typu II o cechach tkanki nabłonkowej, które rosnąjako monowarstwa. Opisywane komórki posiadająw swej cytoplazmie ziarnistości. Komórki A549 to linia adherentna, co oznacza, iżw kulturze in vitro obserwuje sięich przyklejanie do podłoża hodowlanego zaledwie kilka godzin po założeniu hodowli i przybieranie kształtu na rzecz nieregularnego i gwieździstego. Hodowlęlinii A549 prowadzono w pożywce hodowlanej o składzie: 88% medium DMEM (ang. Dulbecco’s modified eagle media), 10% surowicy płodowej bydlęcej (ang. fetal bovine serum, FBS), 1% ATB (ang.antibioticantimycoticsolution) oraz 1% mieszaninyinsuliny selenianu i transferynianu. Taki skład pożywki dostarczałkomórkom aminokwasów, albumin, lipidów, węglowodanów oraz czynników adhezyjnych, regulujących wzrost i różnicowanie komórek. Dodatek antybiotyków (streptomycyna, amfoterycyna i penicylina) zapobiegłzakażeniu bakteriami i grzybami. Z kolei mieszanina insuliny, transferynianu i selenianu sodu ułatwiała komórkom pobieranie glukozy, regulowała transport żelaza oraz usuwała z hodowli wolne rodniki. Po uzyskaniu przez hodowlę stanu 90% konfluencji dokonywano pasażu komórek. Linia A549, jako linia adherentna, wymagała wcześniejszego odklejenia od podłoża przy pomocy 0,25% roztworu trypsyny. Odklejone komórki wirowano, a następnie umieszczano w nowym naczyniu hodowlanym. 3.2. Plazmidy W celu wymuszenia ekspresji pożądanego białka w badanej linii niedrobnokomórkowego raka płuca wykorzystano wektor retrowirusowy pMXs-IL27, oparty o genom wirusa mysiej białaczki Moloneya (ang. Moloney Murine Leukemia Virus; MMLV), który posiadał sekwencję cDNA, kodującą interleukinę-27. Użyto również plazmidu pMXs-IG, który stanowił kontrolę. DNA plazmidowe izolowano przy pomocy zestawu Gene MATRIX Basic DNA Purification Kit (EUR), a następnie przeprowadzano proces transfekcji linii A549 za pomocą odczynnika lipidowego TransFectin™ Lipid Reagent (BioRad). 121 Joanna Woźniak, Tomasz Wandtke, Arkadiusz Goede W dalszym etapie przeprowadzano izolację całkowitego RNA z hodowli transfekowanych przy użyciu High PureIsolation Kit (Roche), które następnie mieszono spektrofotometrycznie. 3.3. Komórki jednojądrzaste W celu przeprowadzenia doświadczeń wykorzystano również komórki jednojądrzaste (mononukleary) pochodzące z krwi obwodowej. Stanowiły je monocyty oraz limfocyty, uzyskane poprzez izolacjęheparynizowanej krwi obwodowej na gradiencie gęstości przy użyciu odczynnika Lymphoprep o gęstości 1,077 g/ml. Po przeprowadzeniu procesu wirowania erytrocyty opadały na dno, natomiast komórki jednojądrzaste pozostawały w interfazie. 3.4. Kokultura komórek pochodzących z ustalonej linii komórkowej A549 z mononuklearami krwi obwodowej Hodowlę komórek linii A549 prowadzono w sześcio-dołkowych płytkach, ażosiągnęły stan konfulencji. W dalszym etapie do wcześniej założonej hodowli komórek A549 zakładano inserty, do których dodawano komórki jednojądrzaste w ilości 350 tysięcy komórek na jeden dołek. Po upływie 6 dni komórki z insertu zbierano, barwiono i liczono. Ostatnim etapem była analiza fenotypu mononuklearów pochodzących z hodowli podwójnych z komórkami niedrobnokomórkowego raka płuca transfekowanych plazmidem eskpresyjnym, transfekowanych plazmidem kontrolnym oraz nietransfekowanych. W tym celu przeprowadzono testy immunofluorescencji bezpośredniej, które następnie analizowano przy użyciu cytometrii przepływowej. Kontrolękomórek stanowiła kultura pojedynczej hodowli limfocytów, do której porównywano uzyskane wyniki. Badano molekuły powierzchniowe, które stanowiła interelekina-27 oraz jej receptor – WSX1. Doświadczenia powtórzono siedmiokrotnie. Uzyskane wyniki interpretowano przy pomocy testu Wilcoxona. 4. Wyniki Szereg testów immunofluorescencyjnych umożliwił zestawienie ekspresji interleukiny-27 zarówno w komórkach jednojądrzastych, jak i pochodzących z hodowli podwójnych, nietransfekowanych. Zgromadzono równieżistotne statystycznie dane, pochodzące z komórek transfekowanych plazmidem kontrolnym (pMXs-IG) i ekspresyjnym (pMXs-IL27) hodowli podwójnych. W przypadku komórek z hodowli podwójnych odnotowano wzrost ekspresji IL-27 w porównaniu do hodowli pojedynczej limfocytów (3,7-45% vs. 0-3,3%). Ponadto, ekspresja ta uległa wzmożeniu w przypadku komórek 122 Ekspresja interleukiny-27 w mononuklearach krwi obwodowej po ekspozycji na komórki niedrobnokomórkowego raka płuca transfekowanych plazmidem ekspresyjnym w porównaniu do komórek transfekowanych plazmidem kontrolnym (6,5-44% vs. 4,1-37%). W przypadku receptora dla interleukiny-27 odnotowano wzrost jego ekspresji w przypadku komórek wyizolowanych z hodowli podwójnych w stosunku do pojedynczej hodowli limfocytów. W przypadku limfocytów CD8+ wynik ten nieznacznie wzrósł(0-3,4% vs. 1-6,9%), natomiast w przypadku limfocytów CD4+ odnotowano znacznie wyższy wzrost ekspresji WSX-1 po ekspozycji na komórki nowotworowe (1,1-10% vs. 5,4-21%). Jednak proces transfekcji komórek nowotworowych nie wpłynąłznacznie na ekspresjęreceptora. W przypadku komórek CD4+ mediana immunofenotypowaniamononuklearów zebranych z podwójnych hodowli transfekowanych plazmidem kontrolnym wynosiła 11% (3,3% vs. 19%), natomiast po transfekcji plazmidem ekspresyjnym odnotowano medianę7,8% (2,3 vs. 22%). W przypadku limfocytów CD8+ również proces transfekcji nie wpłynąłna zmianęekspresji WSX-1 w porównaniu do komórek wyizolowanych z hodowli podwójnych nietransfekowanych. W przypadku transfekcji plazmidem pMXs-IG uzyskano 3,3-19% komórek, natomiast transfekcja plazmidem pMXs-IG spowodowała nieznaczny spadek ekspresji do poziomu 1,0-6,9%. 5. Wnioski Wykazano, że ekspozycja komórek jednojądrzastych na komórki niedrobnokomórkowego raka płuca prowadzi do wzmożenia ekspresji interleukiny-27. Ponadto, wynik ten jest wyższy w przypadku komórek transfekowanych plazmidem ekspresyjnym. Oznacza to, że pobudzone limfocyty mogąwtórnie produkowaćomawianącytokinę, co stanowi jeden z mechanizmów obronnych skierowanych przeciwko rakowi płuca. Ponadto, odnotowano wzrost ekspresji WSX-1, a więc receptora dla IL-27 w komórkach jednojądrzastych po ekspozycji na komórki raka. Może to stanowićwzmożonąodpowiedźprzeciwnowotworowąukładu limfocytów. 6. Dyskusja Analiza wyników doświadczeń nad interleukiną-27 potwierdziła ekspresję cytokiny w mononuklearach krwi obwodowej. Wynik ten jest zaskakujący, iż z definicji IL-27 wydzielana jest przez komórki prezentujące antygeny [1]. Jednak niniejsza praca sugeruje, iż komórki jednojądrzaste po wystawieniu na działanie komórek nowotworowych same zaczęły wtórnie produkować omawianą cytokinę. Z jednej strony może byćto nieswoista odpowiedź organizmu, która stanowi obronę układu immunologicznego na komórki nowotworowe. Tym samym może to zapoczątkować szereg reakcji skierowanych przeciwko progresji raka 123 Joanna Woźniak, Tomasz Wandtke, Arkadiusz Goede płuca. Z drugiej strony, ekspresja IL-27 może być jedynie odpowiedzią zapalną, powodującą ekspresję cytokiny o właściwościach wzbudzania polaryzacji immunologicznej. Jednakże ze względu na zbyt małą liczbę powtórzeń opisanych doświadczeń oraz w celu weryfikacji powyższych hipotez, niezbędne jest przeprowadzenie dalszych badań. Za pomocą testów immunofluorescencyjnych oraz badań cytometrycznych zaobserwowano wzrost receptora dla interleukiny-27 na powierzchni mononuklearów krwi obwodowej. Wynik ten był szczególnie istotny dla komórek CD4+ po ekspozycji na komórki niedrobnokomórkowego raka płuca. Odnotowane zjawisko jest zgodne z doniesieniami piśmiennictwa, gdyżwykazano, że aktywowanie limfocytów T po ekspozycji na komórki nowotworowe prowadzi do zwiększenia ekspresji receptora WSX-1 [2]. Odbywa się to poprzez połączenie z IL-27, które indukuje fosforylację białek STAT1, a w następstwie czynnika transkrypcyjnego t-bet. Skutkiem tego jest skierowanie polaryzacji immunologicznej w kierunku Th1 oraz produkcja IFN-γ [10]. Z kolei wyniki innego badania informują, że wzrost ekspresji WSX-1 powoduje supresjęprofilu Th-2 [11]. Zaobserwowane zjawisko wzmożonej ekspresji receptora dla IL-27 na powierzchni limfocytów krwi obwodowej po ekspozycji na komórki nowotworowe może byćjednym z niespecyficznych mechanizmów obrony organizmu. Tak wzbudzona odpowiedźcytotoksyczna z pomocąIFN-γskierowana jest przy pomocy komórek Th1 przeciwko nowotworowi [12]. Ciekawą obserwacją jest również niewielki spadek poziomu ekspresji receptora dla interleukiny-27 po przeprowadzeniu procesu transfekcji plazmidem eskpresyjnym. Może to oznaczać, że skonstruowany plazmid eskpresyjny prowadzi do związania receptora ze swoistą cząsteczką IL-27, zmniejszając ilość WSX-1 na powierzchni komórek mononuklearnych i prowadząc do wzmożenia odpowiedzi cytotoksycznej. Pomimo wielu badań nad IL-27, wydaje się, iż jej profil działania nie jest jasny. Z jednej strony cytokina wykazuje działanie cytotoksyczne, z drugiej jednak działa immunosupresyjnie. Oceny cytokiny nie ułatwiają również badania doświadczalne, które przede wszystkim prowadzone są jedynie na ustalonych liniach komórkowych. W świetle tych danych, niezbędne okazująsiępróby badania IL-27 na komórkach ludzkich. Literatura 1. Pflanz S., Timans J.C., Cheung J., Rosales R., Kanzler H., Gilbert J., Hibbert L., Churakova T., Travis M, Vaisberg E., Blumenschein W. M., Mattson J. D.,. Wagner J. L., To W., Zurawski S., McClanahan T. K., De Waal Malefyt R., Rennick D., and Kastelein R. A. IL-27, a Heterodimeric Cytokine Composed of EBI3 and p28 Protein, Induces Proliferation of Naive CD4 T Cells. Immunity 16 (2002), s.755-788 124 Ekspresja interleukiny-27 w mononuklearach krwi obwodowej po ekspozycji na komórki niedrobnokomórkowego raka płuca 2. Pflanz S., Hibbert L., Mattson J., Rosales R., Vaisberg E., Bazan J. F., Phillips J. H., McClanahan T. K., De Waal Malefyt R., and Kastelein R. A. WSX-1 and Glycoprotein 130 Constitute a Signal-Transducing Receptor for IL-27, The Journal of Immunology 172 (2004), s. 2225-2231 3. Hamano S., Himeno K., Miyazaki Y., Ishii K., Yamanaka A., Takeda A., Zhang M.,Hisaeda H., Mak T. W., Yoshimura A., Yoshida H. WSX-1 is required for resistance to Trypanosomacruzi infection by regulation of proinflammatory cytokine production. Immunity 19 (2003), s. 657-667 4. Villarino A., Hibbert L., Lieberman L., Wilson E., Mak T., Yoshida H. Kastelein R. A., Saris C., Hunter C. A. The IL-27R (WSX-1) is require to suppress T cell hyperactivity during infection. Immunity 19 (2003), s. 645-655 5. Mayer K. D., Mohrs K., Reiley W., Wittmer S., Kohlmeier J. E., Pearl J. E., Cooper A. M., Johnson L. L., Woodland D. L., Mohrs M. Cutting edge: T-bet and IL-27R are critical for in vivo IFN-_ production by CD8 T cells during infection. J. Immunol. 180 (2008), s. 693-697 6. Liu L., Wang S., Shan B., Shao L., Sato A., Kawamura K., Li Q., Ma G., Tagawa M. IL-27-mediated activation of natural killer cells and inflammation produced antitumor effects for human oesophageal carcinoma cells Scand. J. Immunol. 68 (2008), s. 22-29 7. Feng X. M., Liu N., Yang S. G., Hu L. Y., Chen X. L., Fang Z. H., Ren Q., Lu S. H., Liu B., Han Z. C. Regulation of the class II and class I MHC pathways in human THP-1 monocytic cells by interleukin-27. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (2008), s. 553-559 8. Molle C., Nguyen M., Flamand V., Renneson J., Trottein F., De Wit D., Willems F., Goldman M., Goriely S. IL-27 synthesis induced by TLR ligation critically depends on IFN regulatory factor 3. J. Immunol. 178 (2007), s. 7607-7615 9. Chiyo M., Shimozato O., Yu L., Kawamura K., Iizasa T., Fujisawa T., Tagawa M. Expression of IL-27 in murine carcinoma cells produces antitumor effects and induces protective immunity in inoculated host animalsInt J Cancer. 115 (2005), s. 437-442 10. Takeda A., Hamano S., Yamanaka A., Hanada T., Ishibashi T., Mak T.W., Yoshimura A., Yoshida H. Cutting edge: role of IL-27/WSX-1 signalling for induction of t-bet through activation of STAT1 during initial Th1 Commitment J Immunol. 170 (2003), s. 4886-4890 11. Takeda A., Hamano S., Shiraishi H., Yoshimura T., Ogata H., Ishii K., Ishibashi T., Yoshimura A., Yoshida H. WSX-1 over-expression in CD4(+) T cells leads to hyperproliferation and cytokine hyperproduction in response to TCR stimulation. IntImmunol 7 (2005), s. 889-897 12. Dibra D., Cutrera J., Xia X., Li S. WSX1 Expression in Tumors Induces Immune Tolerance via Suppression of Effector Immune Cells. PLoS ONE. 29 (2011),e19072. doi: 10.1371/journal.pone.0019072 125 Joanna Woźniak, Tomasz Wandtke, Arkadiusz Goede Ekspresja interleukiny-27 w monononuklearach krwi obwodowej po ekspozycji na komórki niedrobnokomórkowego raka płuca Streszczenie Wstęp: Interleukina-27 (IL-27) jest odpowiedzialna za wzbudzanie polaryzacji immunologicznej w kierunku Th1. Jej ekspresja w mononuklearach krwi obwodowej (PBMCs) może stanowić niespecyficzną odpowied źprzeciwko komórkom raka. Cel pracy: Badanie ekspresji IL-27 poprzez ekspozycję PMBCs na komórki raka płuca (ustalona linia komórkowa niedrobnokomórkowego raka płuca - A549). Materiały i metody: Mononukleary były izolowane z krwi obwodowej zdrowych dawców i poddane kokulturze z komórkami raka płuca. PBMCs były wystawione na a) komórki transfekowane plazmidem ekspresyjnym pXMs-IL-27; b) komórki transfekowane plazmidem kontrolnymp XMs-IG; c) komórki nietransfekowane. Ekspresja cytokiny zbadana została za pomocą immunofulorescencji bezpośredniej i analizowana następnie poprzez cytometrię przepływową. Wyniki: Wykazano znaczącą ekspresję IL-27 w mononuklearach krwi obwodowej po ekspozycji na komórki raka płuca. Różnica w ekspresji była znacznie wyższa w przypadku kokultur wraz z komórkami nietransfekowanymi w porównaniu z komórkami kontrolnymi, które stanowiły mononukleary z hodowli pojedynczej. Ekspresja omawianej cytokiny była ponadto wyższa w kokulturach traktowanych plazmidem ekspresyjnym pXMs-IL27 w porównaniu z kontrolnym p XMs-IG. Wnioski: Analiza mononuklearów po ekspozycji na komórki raka płuca spowodowała ekspresję interleukiny-27. Może to stanowić pierwszą linię mechanizmu niespecyficznej odpowiedzi immunologicznej. Pierwszy kontakt z antygenem nowotworowym prawdopodobnie mógł doprowadzić do wydzielania IL-27, a więc cytokiny regulującej odpowiedzi zapalne. Jednak z powodu braku doniesień literatury o podobnych wynikach ekspresji IL-27 w mononuklearach krwi obwodowej, zaobserwowane zjawisko może zostać wytłumaczone w przypadku dalszych badań. Expression of interleukin-27 in mononuclear cells after exposition to non-small cell lung cancer. Abstract Background: Interleukin-27 (IL-27) is responsible for the Th1 immune polarization. Its expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) could be a non-specific response against tumor target cells. Aim: Examination of IL-27 expression by exposing PBMCs to lung cancer cells (non-small cell lung cancer line –A549). Materials and methods: Mononuclear cells were isolated from peripheral blood of healthy volunteers and co-cultured with lung cancer cells. PBMCs were divided into a) transfected cells with plasmid pXMs-IL27; b) transfected cells with control plasmid pXMs-IG; c) nontransfected cells. It was performed to examine a cytokine expression (IL-27) by direct immunofluorescence and analyzed by flow cytometry. Results: IL-27 significant expression was found in PBMC after exposition to lung cancer cells. Its measurement was remarkably higher in co-cultured non-transfected experiments than in control mononuclear cells. Levels of the cytokine were also increased in co-cultured cells transfected with pXMs-IL27 than pXMs-IG. Conclusions: Analyze of mononuclear cells exposing to lung cancer cells showed expression of interleukin-27. It could be a first line mechanism of non-specific immune response. First contact with the tumor antigen might possibly resulted in secreting IL-27 – the cytokine that regulates inflammatory reactions. Because of no literature reporting similar results of IL-27 expression by mononuclear cells, it needs to be explained in further studies. 126 Sylwia Bilska1, Karolina Okła2, Anna Wawruszak3 Metody immunoterapeutyczne w leczeniu nowotworów 1. Wprowadzenie Od dawna aktywacja układu odpornościowego w celu uzyskania korzyści terapeutycznych u osób cierpiących na choroby nowotworowe była celem immunologów i onkologów. Po latach niepowodzeń sytuacja zmieniła się dzięki sukcesowi przeprowadzonych badań klinicznych, które udowodniły skuteczność działania środków immunoterapeutycznych. Jednym z najbardziej znanych preparatów jest ipilimumab – przeciwciało anty-CTLA4, którego zastosowanie znacznie wydłużyło czas przeżycia pacjentów z czerniakiem przerzutowym, podczas gdy standardowe terapie zawodziły. Dzięki coraz lepszemu zrozumieniu wpływu tolerancji, odporności i immunosupresji na mechanizmy regulacji przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej, możliwe jest zastosowanie skutecznej terapii celowanej. Dotychczasowe wyniki sugerują, że immunoterapia może okazać się nową metodą dla uzyskania silnej i długotrwałej odpowiedzi u pacjentów onkologicznych [1, 2]. 2. Cel pracy Celem pracy jest przegląd aktualnych metod immunoterapeutycznych, obecnie stosowanych oraz mogących w przyszłości znaleźć zastosowanie w leczeniu przeciwnowotworowym. Przeglądu dokonano na podstawie analizy najnowszych danych literaturowych z zakresu immunoterapii nowotworów. 1 [email protected], Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 2 [email protected], I Katedra i Zakład Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 3 [email protected], Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 127 Sylwia Bilska, Karolina Okła, Anna Wawruszak 3. Układ odpornościowy a nowotwory Układ odpornościowy człowieka posiada zdolność do adaptacji, co pozwala mu specyficznie rozpoznawać nawet do 10 12 różnych antygenów. Umożliwia to limfocytom T odróżnianie komórek transformowanych od prawidłowych komórek organizmu. W badaniach na zwierzętach wykazano, że sprawny układ immunologiczny potrafi wybiórczo usuwać komórki nowotworowe i chronić przed rozwojem nowotworów. U ludzi fakt ten potwierdza częstsza zapadalność na nowotwory osób z upośledzoną odpornością, np. chorych na AIDS czy biorców przeszczepów allogenicznych. Jednak mimo zdolności układu immunologicznego do usuwania nieprawidłowych komórek, nowotwory rozwijają się również u osób ze sprawnym układem odpornościowym [3, 4]. W odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom nowotworowym wyróżnia się trzy etapy: eliminację, równowagę i ucieczkę. Mają one na celu usunięcie transformowanych komórek z organizmu, zachodzą zanim nowotwór rozwinie się do postaci klinicznej. W fazie eliminacji nieprawidłowe komórki są rozpoznawane przez odpowiednie limfocyty T cytotoksyczne CD8+ (cytotoxic T-lymphocytes – CTLs) i ulegają szybkiej likwidacji w wyniku uruchomienia mechanizmów cytotoksyczności, np. interakcji Fas/FasL czy uwolnieniu granzymu/perforyn. Etap ten trwa, dopóki pewna część transformowanych komórek ewoluuje w sposób umożliwiający im uniknięcie cytotoksycznego działania CTLs. Kiedy całkowita eliminacja komórek nowotworowych staje się niemożliwa, ciągła aktywacja układu odpornościowego może utrzymywać stan równowagi. Najprawdopodobniej faza równowagi trwa od momentu powstania klonów komórek nowo transformowanych do ich efektywnego niszczenia przez CTLs. W komórkach nowotworowych zdolnych do uniknięcia cytotoksycznego działania CTLs zachodzą dalsze mutacje, w wyniku których wykształcają one zdolność do niekontrolowanego wzrostu, rozprzestrzeniania się po organizmie i dawania przerzutów. Faza ucieczki jest czasem wzrostu nowotworu, w którym nieprawidłowe komórki z powodzeniem unikają interwencji układu odpornościowego. Każdy z wymienionych etapów wiąże się z aktywną ucieczką transformowanych komórek spod kontroli układu immunologicznego [3, 5, 6]. Do rozwinięcia się efektywnej, przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej, konieczne jest zajście szeregu kolejnych etapów. Na początku antygen nowotworowy musi zostać wychwycony i przetworzony przez komórkę prezentującą antygen (antigen-presenting cell – APC). Do APCs należą makrofagi, limfocyty B oraz komórki dendrytyczne (dendritic cells – DCs). Najbardziej efektywne są DCs, ponieważ dendryty zwiększają ich zdolność do zbierania antygenów, które następnie są przez nie 128 Metody immunoterapeutyczne w leczeniu nowotworów prezentowane. Po rozpoznaniu antygenu APCs wędrują do węzłów chłonnych, gdzie prezentują przetworzony antygen związany z białkami głównego układu zgodności tkankowej (major histocompatibility complex – MHC) limfocytom T. W celu aktywacji i przygotowania limfocytów T na fazę efektorową, na przykład w odpowiedzi przeciwko antygenom nowotworowym, muszą zostać przekazane dwa sygnały. Pierwszym z nich jest związanie receptora limfocytu T (T cell receptor – TCR) z antygenem połączonym z MHC. Jednocześnie jest przekazywany drugi sygnał, który polega na interakcji między cząsteczkami kostymulującymi, takimi jak: B7 na aktywowanych APCs, a antygenem różnicowania komórkowego (cluster of differentiation – CD) 28 na limfocytach T. Połączenie tych dwóch sygnałów umożliwia proliferację i aktywację limfocytów T [5, 7]. 4. Mechanizmy ucieczki spod nadzoru układu immunologicznego Do modulacji i unikania przeciwnowotworowej odpowiedzi układu immunologicznego komórki nowotworowe wykorzystują cały genom, a ich ucieczka zwykle odbywa się wielokierunkowo. Jedną z metod ucieczki, wykorzystywaną zarówno przez nowotwory jak i przez wirusy, jest hamowanie lub inaktywacja mechanizmów komórkowych odpowiedzialnych za obróbkę i prezentację antygenu przez MHC klasy I (MHC-I). Jeśli antygeny peptydowe nowotworu nie są prezentowane przez MHC-I, CTLs nie mogą rozpoznać i zniszczyć transformowanych komórek, jakkolwiek zahamowanie MHC sprawia, że komórki nowotworowe są bardziej wrażliwe na cytotoksyczne działanie komórek NK [3, 8]. Innym częstym mechanizmem, zakłócającym odpowiedź immunologiczną, jest utrudnianie aktywacji CTLs, głównie poprzez modyfikacje DCs naciekających guza. DCs wewnątrz guza często posiadają fenotyp komórek niedojrzałych lub regulatorowych, co skutkuje prezentacją antygenów nowotworowych bez przesłania sygnału kostymulującego, a to z kolei powoduje anergię limfocytów T i powstanie tolerancji krzyżowej. Znaczenie tego mechanizmu w ucieczce komórek nowotworowych spod nadzoru układu immunologicznego obrazuje ścisła korelacja, potwierdzona przez kilka niezależnych grup badawczych. Wykazano bowiem bliski związek czasowy między stanem tolerancji limfocytów T CD4+ i CD8+ specyficznych wobec komórek nowotworowych, a rozwojem nowotworu. Dodatkowo, regulatorowe DCs (regDCs) mogą bezpośrednio wpływać na ucieczkę nowotworu spod nadzoru układu immunologicznego, ponieważ zaobserwowano, że wszczepienie regDCs myszy chorej na nowotwór stymuluje rozwój guza i przyspiesza powstawanie przerzutów [3, 9]. Prawdopodobnie najczęstszym i najbardziej skutecznym sposobem zakłócania przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej jest 129 Sylwia Bilska, Karolina Okła, Anna Wawruszak blokowanie funkcji efektorowej CTLs. Może ono zachodzić z wykorzystaniem różnych mechanizmów. Nowotwory stymulują powstawanie mikrośrodowiska immunosupresyjnego poprzez ściąganie z obwodu Tregs i komórek linii mieloidalnej – przede wszystkim makrofagów związanych z nowotworem (tumor-associated macrophages – TAMs) oraz komórek supresorowych pochodzących z linii mieloidalnej (myeloid-derived suppressor cells – MDSCs), które wydzielają TGF-β i IL-10. Te cytokiny przeciwzapalne osłabiają odporność przeciwnowotworową przez hamowanie aktywności cytolitycznej CTLs. Ponadto, TAMs i MDSCs zmieniają otoczenie metaboliczne mikrośrodowiska nowotworu produkując arginazę i NO, które zubożają pulę L-argininy – podstawowego składnika odżywczego, niezbędnego dla prawidłowego funkcjonowania limfocytów T. Powyższe supresorowe komórki mieloidalne generują też powstawanie reaktywnych form tlenu i azotu, które modyfikują receptory dla chemokin i antygenów na CTLs, zarówno w narządach limfatycznych, jak i w guzie nowotworowym. Osłabia to zdolność CTLs do kierowania się w miejsce rozwoju nowotworu i zabijania nieprawidłowych komórek [3, 10]. Ważną rolę w rozregulowaniu działania układu immunologicznego wywołanym przez nowotwór pełni unaczynienie guza. Intensywne podziały komórek nowotworowych i zwiększanie się objętości guza, którym nie towarzyszy jednoczesna angiogeneza, czyli tworzenie nowych naczyń krwionośnych lub towarzysząca angiogeneza jest niewystarczająca, prowadzą do niedokrwienia i niedotlenienia komórek nowotworowych. To z kolei zapoczątkowuje rekrutację immunosupresyjnych komórek mieloidalnych. Niska prężność tlenu w miejscu guza indukuje wytwarzanie czynnika wzbudzanego hipoksją typu 1 (hypoxia inducible factor-1 – HIF1), który stymuluje produkcję czynnika pochodzenia stromalnego typu 1 (stromal-derived factor-1 – SDF-1). SDF-1 pełni funkcję chemokiny, przyciągającej komórki pochodzenia mieloidalnego poprzez pobudzanie receptora chemokinowego CXCR4. Ponadto unaczynienie nowotworu pełni rolę strażnika na granicy krew – mikrośrodowisko guza, przez co bierze bezpośredni udział w modulacji przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej. Rekrutacja immunosupresyjnych TAMs, MDSCs, regDCs, Tregs oraz przeciwnowotworowych CTLs wymaga czynnościowego zaangażowania śródbłonka naczyń w miejscu guza. Podczas gdy gradient chemokinowy przyciąga komórki układu immunologicznego do miejsca rozwoju nowotworu, proces ich wychodzenia z naczyń wymaga ekspresji selektyn i integryn, takich jak: E-selektyna, ICAM-1 oraz VCAM-1, biorących udział w toczeniu się, aktywacji, zatrzymaniu i przechodzeniu komórek. Komórki śródbłonka potrafią nawet wybiórczo pozyskiwać subpopulacje leukocytów, na przykład Tregs, co zostało opisane w raku wątrobowokomórkowym oraz raku trzustki. Dodatkowo komórki 130 Metody immunoterapeutyczne w leczeniu nowotworów nowotworowe i komórki śródbłonka naczyń mogą bezpośrednio hamować aktywację oraz zaburzać działanie efektorowych CTLs, wytwarzając na swojej powierzchni PD-1L i aktywując receptor programowanej śmierci 1 (Programed Death-1 – PD-1). Powyższe mechanizmy są aktualnymi celami dla strategii immunoterapeutycznych, które dążą do uniemożliwienia komórkom nowotworowym ucieczki spod nadzoru układu immunologicznego oraz przywrócenia pełnej sprawności układu odpornościowego w walce z nowotworami [3, 11, 12]. 5. Immunoterapia nowotworów W ciągu ostatnich kilku lat immunoterapia przykuła uwagę wielu badaczy jako ważna metoda leczenia pacjentów onkologicznych. Początkowo nowotworami podatnymi na immunoterapię okazały się czerniak i rak nerki. Jednak ostatnie badania kliniczne wykazały, że wiele innych typów nowotworów również dobrze reaguje na wybór tej metody leczenia [13]. Immunoterapie przeciwnowotworowe ogólnie są dzielone na „bierne” lub „czynne”, w zależności od ich zdolności do aktywacji układu odpornościowego gospodarza w celu zwalczania nieprawidłowych komórek. Zgodnie z tą klasyfikacją do metod immunoterapii biernej są zaliczane m.in. przeciwciała monoklonalne (monoclonal antibodies – mAbs) specyficzne wobec komórek nowotworowych oraz transfer adoptywny limfocytów T, ponieważ posiadają one zdolność do samodzielnego działania przeciwnowotworowego. Z kolei szczepionki przeciwnowotworowe i inhibitory punktów kontrolnych cyklu komórkowego wywołują efekt przeciwnowotworowy jedynie we współpracy z układem odpornościowym gospodarza, należą więc do metod immunoterapii czynnej. Inny podział przeciwnowotworowych, immunoterapeutycznych schematów leczenia uwzględnia specyficzność antygenową. W tym przypadku mAbs zalicza się do środków wykazujących specyficzność antygenową, natomiast cytokiny stymulujące układ odpornościowy i inhibitory punktów kontrolnych cyklu komórkowego aktywują niespecyficzną przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną [14, 15]. 5.1. Immunoterapia bierna 5.1.1. mAbs swoiste wobec nowotworu Przeciwciała monoklonalne swoiste wobec nowotworu są najlepiej poznaną i prawdopodobniej najczęściej stosowaną formą immunoterapii przeciwnowotworowej. Określenie „swoiste wobec nowotworu” odnosi się do mAbs, które: specyficznie modyfikują funkcje sygnalizacyjne 131 Sylwia Bilska, Karolina Okła, Anna Wawruszak receptorów na powierzchni komórek nowotworowych; wiążą, jednocześnie neutralizując, przekaźniki sygnałów przeżyciowych, wytwarzane przez komórki nowotworowe lub przez komórki podścieliska w miejscu zmiany nowotworowej; selektywnie rozpoznają nieprawidłowe komórki na podstawie ekspresji antygenów związanych z nowotworem (tumorassociated antigens – TAAs), tzn. antygenów obecnych głównie lub też wyłącznie na komórkach nowotworowych [14, 16]. mAbs specyficzne wobec nowotworu występują w co najmniej pięciu wariantach funkcjonalnych: nagie mAbs hamujące szlaki sygnałowe konieczne do przeżycia i rozwoju komórek nowotworowych, nie wpływające na komórki prawidłowe, np. cetuksymab – mAb specyficzne wobec receptora naskórkowego czynnika wzrostu (epidermal growth factor receptor – EGFR), zatwierdzone przez amerykański Urząd ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration – FDA) do leczenia raka głowy i szyi (head and neck cancer – HNC) oraz raka jelita grubego (colorectal carcinoma – CNC); nagie mAbs aktywujące potencjalne receptory śmierci na powierzchni komórek nowotworowych, nie wpływające na komórki prawidłowe, np. tigatuzumab – mAb z grupy 10B (inne nazwy: TNFRSF.10B, TRAILR2, DR5), specyficzne wobec białek z nadrodziny receptora czynnika martwicy nowotworu (tumor necrosis factor receptor – TNFR), obecnie znajduje się na etapie badań klinicznych; immunokoniugaty, tzn. mAbs specyficzne wobec TAA, sprzężone z toksyną lub radioizotopem, np. gemtuzumab ozogamycyny – mAb anty-CD33 połączone z kalicheamycyną, stosowane dawniej w leczeniu ostrej białaczki szpikowej; nagie mAbs specyficzne wobec TAA, które opłaszczają komórki nowotworowe, tym samym aktywując cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity – ADCC), fagocytozę komórkową zależną od przeciwciał oraz cytotoksyczność zależną od układu dopełniacza (complementdependent cytotoxicity – CDC), np. rytuksymab – mAb anty-CD20, stosowane obecnie w leczeniu przewlekłej białaczki limfocytowej (chronic lymphocytic leukemia – CLL) i chłoniaków nieziarniczych (non-Hodgkin lymphoma – NHL); dwuswoiste przeciwciała mobilizujące limfocyty T (bispecific T-cell engagers – BiTEs), tzn. białka chimeryczne składające się z dwóch jednołańcuchowych regionów zmiennych, pochodzących z różnych mAbs. Jeden fragment rozpoznaje TAA, a drugi – antygen powierzchniowy limfocytów T, np. blinatumomab – BiTE 132 Metody immunoterapeutyczne w leczeniu nowotworów rozpoznające CD19 i CD3, stosowane obecnie w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek prekursorowych limfocyta B bez obecności chromosomu Filadelfia. Na chwilę obecną FDA dopuściło do użytku 18 różnych mAbs rozpoznających komórki nowotworowe. Ukazuje to niezwykły sukces tej metody immunoterapii [14, 17]. 5.1.2. Transfer adoptywny limfocytów T Określenie „transfer adoptywny limfocytów T” (adoptive cell transfer – ACT) odnosi się do metody biernej immunoterapii nowotworów, która na ogół obejmuje: zbiórkę limfocytów krążących lub naciekających guza, ich selekcję/modyfikację/rozwój/aktywację ex vivo oraz podanie limfocytów pacjentom, najczęściej poprzedzone limfodeplecją oraz w połączeniu ze środkami immunostymulującymi. W wyniku ACT wprowadzona zostaje populacja komórek wzbogaconych w efektorowe komórki immunologiczne, potencjalnie reaktywne wobec nowotworu [14, 18]. Jak dotąd opracowano kilka strategii mających na celu poprawę potencjału terapeutycznego ACT. Dzięki zastosowaniu metod inżynierii genetycznej, limfocytom krwi obwodowej (peripheral blood lymphocytes – PBLs) nadano takie cechy jak: wyjątkowa specyficzność antygenowa, wyższy potencjał proliferacyjny i dłuższa trwałość in vivo, ulepszony profil wydzielniczy, podwyższona zdolność naciekania nowotworu oraz większa cytotoksyczność. Dzięki modyfikacjom genetycznym można zmienić swoistość PBLs przed podaniem ich pacjentowi. W ten sposób pobudza się ekspresję TCRs rozpoznających TAA lub tzw. chimerycznych receptorów antygenowych (chimeric antigen receptors – CARs), czyli białek przezbłonowych, zawierających domenę immunoglobulinową wiążącą TAA połączoną z jedną lub kilkoma domenami immunostymulującymi. Druga z wymienionych modyfikacji ma tę zaletę, że czyni limfocyty T zdolnymi do rozpoznawania, a więc potencjalnie również do niszczenia komórek posiadających TAA w sposób niezależny od MHC. Potencjał terapeutyczny limfocytów T wytwarzających CARs został udowodniony w licznych badaniach klinicznych, a wyjątkowo dobrą odpowiedź uzyskano u pacjentów cierpiących na nowotwory hematologiczne. Przeciwnowotworowy efekt terapeutyczny odnotowano również po podaniu pacjentom limfocytów T wytwarzających TCRs specyficznych wobec TAA [14, 19]. W innych badaniach wykazano, że transfer adoptywny komórek NK (natural killer) przynosi niewielki efekt terapeutyczny. Z kolei transfer adoptywny limfocytów B nie został jeszcze zbadany w warunkach klinicznych. Limfocyty B, a przynajmniej niektóre z ich podtypów, mogą powodować silny efekt immunosupresyjny, co może tłumaczyć brak 133 Sylwia Bilska, Karolina Okła, Anna Wawruszak zainteresowania tą populacją komórek. Na chwilę obecną żaden z protokołów ACT nie został zatwierdzony przez FDA do leczenia przeciwnowotworowego [14, 20]. 5.1.3. Wirusy onkolityczne Określenie „wirusy onkolityczne” odnosi się do niepatogennych szczepów wirusowych, które swoiście zarażają komórki nowotworowe, powodując ich śmierć. Nie należy mylić wirusów onkolitycznych z wirusami onkotropicznymi, czyli wirusami wykazującymi preferencyjny tropizm do komórek nowotworowych, ale nie działającymi (lub w bardzo małym stopniu) cytotoksycznie. Potencjał przeciwnowotworowy wirusów onkolitycznych może być wrodzony i wynikać po prostu z efektu cytopatycznego, czyli przeciążenia metabolizmu komórkowego wynikającego z masowej produkcji wirusa, co prowadzi do śmierci komórki. Istnieje również możliwość, że te wirusy wykazują pośrednią aktywność onkolityczną, będącą skutkiem syntezy produktów endo- lub egzogennych, letalnych dla komórki gospodarza, niezależnie od zdolności wirusa do intensywnej replikacji i wywoływanego efektu cytopatycznego. Dzięki zastosowaniu metod inżynierii genetycznej do wirusów onkolitycznych wprowadzono dodatkowe, użyteczne sekwencje kodujące: enzymy, przekształcające nieszkodliwy prolek w substancję o działaniu cytotoksycznym, białka, które (przynajmniej teoretycznie) uruchamiają w komórkach nowotworowych letalne kaskady sygnałowe oraz krótkie cząsteczki RNA o strukturze spinki do włosów, które rozpoznają czynniki konieczne do przeżycia komórek nowotworowych, nie ingerując w metabolizm komórek prawidłowych. Na chwilę obecną żaden z wirusów onkolitycznych nie został zatwierdzony przez FDA do leczenia przeciwnowotworowego. Natomiast w Chinach już od 2005 roku dopuszczono do użycia rekombinowany adenowirus H101, znany pod nazwą handlową Oncorine®. H101 jest stosowany w połączeniu z chemioterapią do leczenia HNC [14, 21]. 5.2. Immunoterapia czynna 5.2.1. Immunoterapie z wykorzystaniem DCs W ciągu ostatnich 20 lat wiele uwagi poświęcono rozwojowi metod immunoterapeutycznych opartych na DCs. Większość z tych strategii opiera się na zastosowaniu komórek autologicznych. Duża liczba prowadzonych badań przedklinicznych i klinicznych odzwierciedla kluczową rolę, jaką pełnią DCs na granicy między odpornością wrodzoną a nabytą oraz zdolność części podtypów DCs do wyzwalania silnej, istotnej 134 Metody immunoterapeutyczne w leczeniu nowotworów terapeutycznie, przeciwnowotworowej odpowiedzi układu immunologicznego. Do tej pory opracowano wiele różnych metod immunoterapeutycznych wykorzystujących DCs. Większość z nich polega na izolacji krążących monocytów, pochodzących od pacjenta lub od dawcy oraz ich namnożeniu/zróżnicowaniu ex vivo, koniecznie w obecności czynników stymulujących dojrzewanie DCs, np. czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (granulocyte macrophage colony-stimulating factor – GM-CSF). Jest to niezbędny składnik, ponieważ niedojrzałe DCs wykazują działanie immunosupresyjne zamiast immunostymulującego. Zazwyczaj autologiczne DCs po ekspozycji na źródło TAA są ponownie podawane pacjentowi. Źródłem antygenów mogą być m.in.: peptydy zawierające TAA, mRNA kodujące jeden lub kilka określonych TAA, wektory ekspresyjne kodujące jeden lub kilka określonych TAA, lizaty komórek nowotworowych pochodzenia autologicznego lub heterologicznego czy też mRNA komórek nowotworowych. Można też przeprowadzić fuzję ex vivo DCs z inaktywowanymi komórkami nowotworowymi, otrzymując tzw. dendrytomy. We wszystkich powyższych metodach do DCs dostarcza się ex vivo TAAs lub cząsteczki je kodujące, dzięki czemu po ponownym podaniu komórek pacjentowi, DCs są w stanie uruchomić odpowiedź immunologiczną przeciwko TAAs. Inne strategie immunoterapii przeciwnowotworowych, wykorzystujących DCs, uwzględniają: ukierunkowanie TAAs swoistych wobec DCs in vivo, zastosowanie egzosomów pochodzących z DCs oraz podawanie pacjentom DCs autologicznych lub allogenicznych, poddanych uprzednio procesom dojrzewania, jeśli istnieje taka potrzeba również modyfikacjom genetycznym, w warunkach ex vivo. W tym przypadku jednak do DCs nie dostarcza się TAAs. Aby skierować TAAs swoiste wobec DCs, TAAs są: sprzęgane z mAbs, polipeptydami lub węglowodanami, które selektywnie wiążą się z DCs; zamykane w immunoliposomach rozpoznających DCs lub kodowane na wektorach swoistych wobec DCs. Z kolei zastosowanie DCs lub ich egzosomów jest metodą o stosunkowo niespecyficznym działaniu immunostymulującym [14, 22, 23]. Na chwilę obecną dopuszczono do użytku tylko jeden preparat komórkowy, w skład którego wchodzą DCs. Środek ten jest znany jako sipuleucel-T (nazwa handlowa Provenge®). Sipuleucel-T już w 2010 roku został zatwierdzony przez FDA i Europejską Agencję leków (European Medicines Agency – EMA) do leczenia przerzutowego raka prostaty opornego na kastrację, jednak w listopadzie 2014 roku producent preparatu ogłosił bankructwo. Odzwierciedla to niekorzystny stosunek kosztów do korzyści terapii komórkowej, której przygotowanie wymaga stosunkowo dużych ilości komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Obecnie prowadzone są badania kliniczne dotyczące bezpieczeństwa i skuteczności 135 Sylwia Bilska, Karolina Okła, Anna Wawruszak wielu preparatów komórkowych na bazie DCs, innych niż sipuleucel-T. Jak dotąd dostarczają one bardzo obiecujących wyników, co daje nadzieję na dalszy rozwój tej metody immunoterapii [14, 24]. 5.2.2. Szczepionki przeciwnowotworowe na bazie peptydów i DNA DCs i inne APCs są celami również dla szczepionek przeciwnowotworowych na bazie peptydów i DNA. W przypadku szczepionek peptydowych, pacjentom podaje się rekombinowane TAAs lub ich peptydy o pełnej długości sekwencji. Najczęściej aplikuje się je domięśniowo, podskórnie lub śródskórnie, razem z jednym lub kilkoma środkami immunostymulującymi, określanymi mianem adiuwantów, które silnie stymulują dojrzewanie DCs. Powyższa metoda wykorzystuje fakt, że osiadłe DCs i inne APCs podczas dojrzewania zyskują zdolność do prezentowania epitopów pochodzących od TAAs, dzięki czemu zapoczątkowują silną odpowiedź immunologiczną przeciwko TAAs. Mechanizmy leżące u podstaw rozwinięcia się przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej, zapoczątkowanej przez szczepionki peptydowe, a tym samym ich skuteczność, zależy (przynajmniej częściowo) od wielkości peptydu. Krótkie peptydy (8-12 reszt aminokwasowych) bezpośrednio wiążą się do cząsteczek MHC na powierzchni APCs, natomiast długie, syntetyczne peptydy (25-30 reszt aminokwasowych), aby wywołać odpowiedź immunologiczną muszą zostać wchłonięte, przetworzone i zaprezentowane przez APCs. Aktywność terapeutyczna długich, syntetycznych peptydów zwykle jest wyższa niż aktywność ich krótkich odpowiedników, szczególnie kiedy zawierają epitopy rozpoznawane zarówno przez limfocyty T cytotoksyczne, jak i limfocyty T pomocnicze oraz gdy długie peptydy są połączone z efektywnymi adiuwantami. Niedawne badania wykazały, że niektóre powszechnie używane immunostymulanty, takie jak tzw. niekompletny adiuwant Freunda, obniżają skuteczność szczepionek przeciwnowotworowych na bazie peptydów, skłaniając do stosowania alternatywnych immunostymulantów. Szczególny rodzaj szczepionek peptydowych stanowią lizaty autologicznych komórek nowotworowych, połączonych z chaperonami. Białka te wykazują działanie immunostymulujące, najczęściej należą do rodziny białek szoku cieplnego (heat-shock proteins – HSP). Główną zaletę tej metody stanowi fakt, że nie opiera się ona na pojedynczym TAA ale (przynajmniej teoretyczne) na wszystkich TAAs, które wiążą się do HSPs, również tych specyficznych dla konkretnego pacjenta, tzw. neo-TAAs. Jednak należy pamiętać, że wytwarzanie personalizowanych szczepionek przeciwnowotworowych wiąże się ze znacznym zwiększeniem kosztów produkcji [14, 25, 26]. 136 Metody immunoterapeutyczne w leczeniu nowotworów Szczepionki przeciwnowotworowe na bazie DNA opierają się na nagich lub umieszczonych w wektorach, konstruktach kodujących TAAs. Jako wektory służą cząstki wirusowe, niepatogenne bakterie lub komórki drożdży. W przypadku zastosowania wektorów bakteryjnych lub grzybowych, szczepionki na bazie DNA stanowią źródło TAA, natomiast nagie konstrukty i wektory wirusowe zmieniają APCs lub komórki mięśniowe w ten sposób, że wytwarzają one TAAs. Teoretycznie pobudza to osiadłe DCs lub inne APCs do zapoczątkowania odpowiedzi immunologicznej przeciwko TAA. Rozmiar odpowiedzi może zwiększyć obecność odpowiedniego adiuwanta. Szczególnie interesujące podejście w tym zakresie stanowią tzw. szczepionki onkolityczne, czyli wirusy onkolityczne zmienione genetycznie w ten sposób, że kodują TAA. Obiecujące wyniki uzyskano również po doustnym podaniu szczepionek na bazie DNA. W tym modelu terapeutycznym żywe, atenuowane bakterie, wytwarzające TAA o pełnej długości, są wychwytywane przez APCs w śluzówce jelita, co skutkuje rozwinięciem silnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko TAA w tkance limfatycznej związanej z błonami śluzowymi (mucosa-associated lymphoid tissue – MALT) [14, 27]. Zarówno szczepionki peptydowe, jak i szczepionki na bazie DNA, wykazały aktywność w organizmach pacjentów onkologicznych. Jednak na chwilę obecną żadna ze szczepionek przeciwnowotworowych nie została zatwierdzona przez FDA czy EMA do leczenia ludzi. Natomiast w Rosji już od 2008 roku stosuje się vitespen (nazwa handlowa Oncophage®). Jest to szczepionka przeciwnowotworowa na bazie HSP o masie 90 kDa, zatwierdzona do leczenia raka nerki (renal cell carcinoma – RCC) u pacjentów ze średnim ryzykiem nawrotu. Ponadto trzy szczepionki przeciwnowotworowe na bazie DNA zostały dopuszczone do użytku weterynaryjnego. W jednej z nich rolę TAA pełni ludzkie białko tyrozynaza [14, 28]. 5.2.3. Inne Wiele innych przeciwnowotworowych strategii immunoterapeutycznych zostało zaakceptowanych przez władze na całym świecie. Obecnie są już stosowane u pacjentów onkologicznych, część metod jest nadal testowana w badaniach przedklinicznych i klinicznych pod kątem bezpieczeństwa i skuteczności. Do pozostałych metod immunoterapii czynnej można zaliczyć m.in.: cytokiny immunostymulujące, mAbs o działaniu immunomodulującym, inhibitory metabolizmu immunosupresyjnego, agonistów receptorów rozpoznających wzorce (pattern recognition receptors – PRR), immunogenne induktory śmierci komórki czy też konkretne środki 137 Sylwia Bilska, Karolina Okła, Anna Wawruszak zatwierdzone do użytku, takie jak: Revlimid®, Pomalyst®, Ontak®, Yondelis® [14]. 6. Podsumowanie W ciągu ostatnich lat immunoterapia zyskała uznanie jako skuteczna metoda leczenia przeciwnowotworowego. Obecnie, obok chirurgii, radioterapii i chemioterapii, immunoterapia jest uznawana za czwarty filar leczenia zaawansowanych nowotworów. Metody immunoterapeutyczne reprezentują interesujące podejście do kwestii leczenia chorób nowotworowych. Głównym celem tego rodzaju leczenia jest pobudzenie i przywrócenie prawidłowej aktywności układu odpornościowego pacjenta, aby ten mógł samodzielnie i skutecznie zwalczać nieprawidłowe, transformowane komórki. Najogólniej, metody immunoterapeutyczne można podzielić na bierne, m.in.: zastosowanie mAbs swoistych wobec nowotworu, wirusów onkolitycznych i transfer adoptywny limfocytów T oraz czynne, np.: wykorzystanie DCs czy szczepionki przeciwnowotworowe na bazie peptydów i DNA. Niektóre z metod zostały już zatwierdzone do leczenia pacjentów onkologicznych, wiele innych pozostaje w fazie badań przedklinicznych i klinicznych. Głównym założeniem immunoterapii jest modyfikacja układu immunologicznego i przywrócenie jego pełnej funkcji odpornościowej, a celem leczenia nie jest nowotwór, lecz układ immunologiczny pacjenta. Do rozwoju przeciwnowotworowych strategii immunoterapeutycznych konieczne są dalsze badania nad właściwymi biomarkerami, leczeniem skojarzonym z najnowszymi środkami lub innymi immunoterapeutykami oraz optymalnym dawkowaniem i czasem trwania leczenia. Metody immunoterapeutyczne są obecnie obiektem zainteresowania wielu grup badawczych, co daje nadzieje na dalszy, efektywny rozwój tych metod leczenia, co w przyszłości może przyczynić się do poprawy skuteczności leczenia przeciwnowotworowego. Literatura 1. 2. 3. Mellman I., Coukos G., Dranoff G.Cancer immunotherapy comes of age, Nature., 480 (2011), s. 480-489 Hodi F.S., O'Day S.J., McDermott D.F., Weber R.W., Sosman J.A., Haanen J.B., Gonzalez R., Robert C., Schadendorf D., Hassel J.C., Akerley W., van den Eertwegh A.J., Lutzky J., Lorigan P., Vaubel J.M., Linette G.P., Hogg D., Ottensmeier C.H., Lebbé C., Peschel C., Quirt I., Clark J.I., Wolchok J.D., Weber J.S., Tian J., Yellin M.J., Nichol G.M., Hoos A., Urba W.J. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma, The New England Journal of Medicine., 363 (2010), s. 711-723 R.E. Vatner, B.T. Cooper, C. Vanpouille-Box, S. Demaria, S.C. Formenti Combinations of immunotherapy and radiation in cancer therapy, Frontiers in Oncology., 4 (2014), s. 1-15 138 Metody immunoterapeutyczne w leczeniu nowotworów 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Willimsky G., Blankenstein T. Sporadic immunogenic tumours avoid destruction by inducing T-cell tolerance, Nature., 437 (2005), s. 141-146 Momtaz P., Postow M.A. Immunologic checkpoints in cancer therapy: focus on the programmed death-1 (PD-1) receptor pathway, Pharmacogenomics and Personalized Medicine., 7 (2014), s. 357-365 Koebel C.M., Vermi W., Swann J.B., Zerafa N., Rodig S.J., Old L.J., Smyth M.J., Schreiber R.D. Adaptive immunity maintains occult cancer in an equilibrium state, Nature., 450 (2007), s. 903-907 Raval R.R., Sharabi A.B., Walker A.J., Drake C.G., Sharma P. Tumor immunology and cancer immunotherapy: summary of the 2013 SITC primer, Journal for ImmunoTherapy of Cancer., 2 (2014), s. 14 Poschke I., Mougiakakos D., Kiessling R. Camouflage and sabotage: tumor escape from the immune system, Cancer Immunology, Immunotherapy., 60 (2011), s. 1161-1171 Seliger B., Massa C. The dark side of dendritic cells: development and exploitation of tolerogenic activity that favor tumor outgrowth and immune escape, Frontiers in Immunology., 4 (2013), s. 419 Ostrand-Rosenberg S., Sinha P., Beury D.W., Clements V.K. Cross-talk between myeloid-derived suppressor cells (MDSC), macrophages, and dendritic cells enhances tumor-induced immune suppression, Seminars in Cancer Biology., 22 (2012), s. 275-281 Martin B.J. Inhibiting vasculogenesis after radiation: a new paradigm to improve local control by radiotherapy, Seminars in Radiation Oncology., 23 (2013), s. 281-287 Shetty S., Weston C.J., Oo Y.H., Westerlund N., Stamataki Z., Youster J., Hubscher S.G., Salmi M., Jalkanen S., Lalor P.F., Adams D.H. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium, The Journal of Immunology., 186 (2011), s. 4147-4155 Kovacsovics-Bankowski M., Chisholm L., Vercellini J., Tucker C.G., Montler R., Haley D., Newell P., Ma J., Tseng P., Wolf R., Vetto J.T., Hammill C., Hansen P., Weinberg A.D. Detailed characterization of tumor infiltrating lymphocytes in two distinct human solid malignancies show phenotypic similarities, Journal for Immunotherapy of Cancer., 2 (2014), s. 1-12 Galluzzi L., Vacchelli E., Bravo-San Pedro J.M., Buqué A., Senovilla L., Baracco E.E., Bloy N., Castoldi F., Abastado J.P., Agostinis P., Apte R.N., Aranda F., Ayyoub M., Beckhove P., Blay J.Y., Bracci L., Caignard A., Castelli C., Cavallo F., Celis E., Cerundolo V., Clayton A., Colombo M.P., Coussens L., Dhodapkar M.V., Eggermont A.M., Fearon D.T., Fridman W.H., Fučíková J., Gabrilovich D.I., Galon J., Garg A., Ghiringhelli F., Giaccone G., Gilboa E., Gnjatic S., Hoos A., Hosmalin A., Jäger D., Kalinski P., Kärre K., Kepp O., Kiessling R., Kirkwood J.M., Klein E., Knuth A., Lewis C.E., Liblau R., Lotze M.T., Lugli E., Mach J.P., Mattei F., Mavilio D., Melero I., Melief C.J., Mittendorf E.A., Moretta L., Odunsi A., Okada H., Palucka A.K., Peter M.E., Pienta K.J., Porgador A., Prendergast G.C., Rabinovich G.A., Restifo N.P., Rizvi N., Sautès-Fridman C., Schreiber H., Seliger B., Shiku H., SilvaSantos B., Smyth M.J., Speiser D.E., Spisek R., Srivastava P.K., Talmadge J.E., Tartour E., Van Der Burg S.H., Van Den Eynde B.J., Vile R., Wagner H., 139 Sylwia Bilska, Karolina Okła, Anna Wawruszak 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. Weber J.S., Whiteside T.L., Wolchok J.D., Zitvogel L., Zou W., Kroemer G. Classification of current anticancer immunotherapies, Oncotarget., 5 (2014), s. 12472-12508 Lesterhuis W.J., Haanen J.B., Punt C.J. Cancer immunotherapy – revisited, Nature Reviews Drug Discovery., 10 (2011), s. 591-600 Vacchelli E., Eggermont A., Galon J., Sautes-Fridman C., Zitvogel L., Kroemer G., Galluzzi L. Trial watch: Monoclonal antibodies in cancer therapy, Oncoimmunology., 2 (2013), s. e22789 Galluzzi L., Vacchelli E., Fridman W.H., Galon J., Sautes-Fridman C., Tartour E., Zucman-Rossi J., Zitvogel L., Kroemer G. Trial Watch: Monoclonal antibodies in cancer therapy, Oncoimmunology., 1 (2012), s. 28-37 Humphries C. Adoptive cell therapy: Honing that killer instinct, Nature., 504 (2013), s. S13-15 Vacchelli E., Eggermont A., Fridman W.H., Galon J., Tartour E., Zitvogel L., Kroemer G., Galluzzi L. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy, Oncoimmunology., 2 (2013), s. e24238 Fremd C., Schuetz F., Sohn C., Beckhove P., Domschke C. B cell-regulated immune responses in tumor models and cancer patients, Oncoimmunology., 2 (2013), s. e25443 Vacchelli E., Eggermont A., Sautes-Fridman C., Galon J., Zitvogel L., Kroemer G., Galluzzi L. Trial watch: Oncolytic viruses for cancer therapy, Oncoimmunology., 2 (2013), s. e24612 Palucka K., Banchereau J.Cancer immunotherapy via dendritic cells, Nature Reviews Cancer., 12 (2012), s. 265-277 Banchereau J., Palucka A.K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer, Nature Reviews Immunology., 5 (2005), s. 296-306 Kantoff P.W., Higano C.S., Shore N.D., Berger E.R., Small E.J., Penson D.F., Redfern C.H., Ferrari A.C., Dreicer R., Sims R.B., Xu Y., Frohlich M.W., Schellhammer P.F. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer, The New England Journal of Medicine., 363 (2010), s. 411-422 Aranda F., Vacchelli E., Eggermont A., Galon J., Sautes-Fridman C., Tartour E., Zitvogel L., Kroemer , Galluzzi L.Trial Watch: Peptide vaccines in cancer therapy, Oncoimmunology., 2 (2013), s. e26621 Melief C.J.,. van der Burg S.H Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines, Nature Reviews Cancer., 8 (2008), s. 351-360 Liu M.A. DNA vaccines: an historical perspective and view to the future, Immunological Reviews., 239 (2011), s. 62-84 Wood C., Srivastava P., Bukowski R., Lacombe L., Gorelov A.I., Gorelov S., Mulders P., Zielinski H., Hoos A., Teofilovici F., Isakov L., Flanigan R., Figlin R., Gupta R., Escudier B. An adjuvant autologous therapeutic vaccine (HSPPC-96; vitespen) versus observation alone for patients at high risk of recurrence after nephrectomy for renal cell carcinoma: a multicentre, openlabel, randomised phase III trial, Lancet., 372 (2008), s. 145-154 140 Metody immunoterapeutyczne w leczeniu nowotworów Metody immunoterapeutyczne w leczeniu nowotworów Streszczenie Jednym z zadań układu immunologicznego jest ochrona organizmu przed rozwojem nowotworów. Obniżenie sprawności układu odpornościowego niesie ze sobą ryzyko powstania nieprawidłowych, transformowanych komórek, które w normalnych warunkach są szybko rozpoznawane i usuwane. Jednak komórki nowotworowe wykształciły wiele mechanizmów umożliwiających im ucieczkę spod nadzoru nawet sprawnego układu immunologicznego. Od pewnego czasu dużo uwagi poświęca się strategii immunoterapii nowotworów, tzn. pobudzaniu układu odpornościowego do samodzielnej walki z transformowanymi komórkami. Ogólnie schematy leczenia można podzielić na immunoterapie bierne i immunoterapie czynne. Obie strategie są intensywnie badane, co daje nadzieję na rozwój nowej, skutecznej metody leczenia przeciwnowotworowego. Immunotherapeutic methods for cancers treatment Abstract One of the immune system function is to protect the organism against the development of cancers. Reduction in the immune system efficiency involves the risk of abnormal, transformed cells development, which normally are quickly recognized and removed. However, cancer cells have developed several mechanisms allowing them to escape from the surveillance even efficient immune system. From some time, a lot of attention is given to cancer immunotherapy strategies, i.e. stimulating the immune system alone to fight out transformed cells. In general, treatment regimens can be divided into passive immunotherapy and active immunotherapy. Both strategies are intensively explored, which gives hope for the development of new, efficient method of anticancer treatment. 141 Maciej Frant1, Arkadiusz Czerwonka2, Aleksandra Żurek3 Cytostatyki w walce z nowotworami 1. Wstęp Nowotwór to grupa komórek, która w wyniku nieprawidłowych podziałów nadmiernie rozrasta się w organizmie gospodarza. Cytostatyki, czyli chemiczne środki hamujące podziały komórkowe mają na celu zmniejszenie ilości proliferujących komórek guza, w wyniku czego jego masa może ulec zmniejszeniu [1]. Pozwala to na regresję nowotworu, a w konsekwencji daje szanse na wyleczenie. Cytostatyki działają głównie na komórki znajdujące się w fazie S cyklu komórkowego (fazo-zależnie – dawka cytostatyku podana w kilku porcjach działa efektywniej niż jednorazowe podanie takiej samej dawki) lub niezależnie od fazy [2, 3]. Substancje chemioterapeutyczne stosowane w terapii są toksyczne dla organizmu. W zależności od leku np. przy leczeniu raka jelita grubego, może wiązać się to między innymi z supresją szpiku kostnego, nefrotoksycznością, neurotoksycznością, kardiotoksycznością, wypadaniem włosów, nudnościami i wymiotami. Należy o tym pamiętać, aby w stosowanej terapii nie używać cytostatyków o nakładającej się na siebie toksyczności, oraz aby zastosować odpowiednie środki zapobiegawcze (terapii cisplatyną musi towarzyszyć podawanie płynów i elektrolitów). Niekiedy, wymagane jest podanie środków przeciwwymiotnych, witaminy B12 i kwasu foliowego [4]. Do często stosowanych cytostatyków możemy zaliczyć: cisplatynę, ifosfamid, mitomycynę, winblastynę, winkrystynę, windezynę, etopozyd, karboplatynę winorelbinę, paklitaksel, pemetreksed, gemcytabinę, docetaksel, tenipozyd, cyklofosfamid, doksorubicynę, metotreksat, lomustynę, topotekan oraz irynotekan. Uznaje się je za leki aktywne, czyli takie, które pozwalają uzyskać w mono terapii odpowiedzi u więcej niż 15% chorych. Leczenie odbywa się jako terapia kombinowana z udziałem kilku wybranych leków z powyższej grupy, zazwyczaj z udziałem pochodnej platyny. Długość leczenia wyznacza jego skuteczność i zdolności tolerancji organizmu [5]. 1 [email protected], Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii CurieSkłodowskiej w Lublinie, www.umcs.pl 2 [email protected], Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii CurieSkłodowskiej w Lublinie, www.umcs.pl 3 [email protected], Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii CurieSkłodowskiej w Lublinie, www.umcs.pl 142 Cytostatyki w walce z nowotworami Pomimo intensywnego rozwoju nauk medycznych, chemioterapia obok interwencji chirurgicznej pozostaje jedną z głównych metod walki z nowotworami. W związku z tym celem niniejszej pracy jest przybliżenie wybranych cytostatyków wykorzystywanych do zwalczania tych chorób. 2. Charakterystyka wybranych cytostatyków 2.1. Cisplatyna Cisplatyna (cis-diaminadichloroplatyna - DDP) jest jednym z najczęściej stosowanych związków hamujących rozwój nowotworów. DDP i jego analogi (np. karboplatyna) są obecnie używane w leczeniu między innymi: raka płuc, jajnika, głowy, szyi, pęcherza moczowego i jąder. Działanie przeciwnowotworowe DDP wykryto ponad 40 lat temu. Wkrótce po tym, Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (ang. Food and Drug Administration – FDA) uznała DDP za pierwszy lek zawierający platynę, skuteczny w terapii przeciwnowotworowej [6]. DDP wnika do komórek poprzez białko transportujące miedź (Ctr1). W cytoplazmie jon chlorkowy oddziela się od DDP. Powstały kation platyny może oddziaływać zarówno z DNA, RNA, jak i białkami [7]. DDP tworzy wiązania krzyżowe zarówno pomiędzy komplementarnymi odcinkami DNA jak i w obrębie pojedynczej nici. Doprowadza to do zatrzymania cyklu komórkowego, a w konsekwencji wywołuje apoptozę w większości komórek nowotworowych. Ograniczeniem w stosowaniu DDP jest zarówno pierwotna jak i nabyta oporność na ten lek. Wiąże się to między innymi ze wzrostem zdolności do inaktywacji cytostatyku, narastaniem procesów naprawczych DNA i zmianami w licznych szlakach sygnalnych [8]. Przyczyny oporności komórek guza na DDP mogą być bardzo różne i w wielu przypadkach mechanizm ich działania nie jest do końca poznany. W nowotworach niewrażliwych na DDP stwierdzono zmniejszoną ekspresję związanych z membraną β-tubulin i pośrednich filamentów keratyny 18 (obserwacje z mikroskopu elektronowego pokazują, że komórki oporne mają inną morfologię niż komórki wrażliwe na cisplatynę) [9]. Oporność na DDP powiązano również z: Ekspresją komórkowego onkogenu c-fos, który związany jest z modyfikacją szlaków sygnalnych poprzez kinazę białkową C i cykliczne AMP [9]; Dużą aktywnością białkowych pomp transportujących leki, (MRP-1) odpowiedzialnych za spadek stężenia DDP wewnątrz komórki [9]; 143 Maciej Frant, Arkadiusz Czerwonka, Aleksandra Żurek Dehydrogenazą dihydrodiolową (DDH - monomeryczna cytozolowa NADP(H) zależna oksyreduktaza), która katalizuje reakcję redukcji lub utleniania kilku ksenobiotyków, w tym DDP. DDH występuje w kilku izoformach, które katalizują reakcje wzajemnych przemian aldehydów i ketonów w alkohole. Transfekcja DDH do różnych typów komórek nowotworowych wywoływała ogólną oporność na DDP. Wzrost ekspresji tego enzymu został uznany jako czynnik źle rokujący w przypadku pacjentów z rakiem niedrobnokomórkowym płuc (NDRP) [9]; Białkami HO-1 i HO-2, które są indukowane przez stres komórkowy związany z chemioterapią [9]; Białkiem GRP78 w błonie retikulum endoplazmatycznego. Stwierdzono, że jego ekspresja jest indukowana stresem komórkowym wynikającym z działania cytostatyków w przypadku nowotworów płuc, prostaty i piersi. Podwyższony poziom GRP78 zazwyczaj koreluje ze słabą odpowiedzią na leczenie [9]; ERCC1, białkiem odpowiedzialnym za naprawę DNA poprzez wycięcie wiązań krzyżowych. W związku z czym, wysoka ekspresja ERCC1 powoduje wzrost oporności na DDP [9]; Glutationem (GSH), który wiąże się do cząsteczki platyny, zastępując jon chlorkowy. Zapobiega to wiązaniu się DDP z kwasami nukleinowymi. Zwiększenie wewnątrzkomórkowego stężenia GSH powoduje wzrost odporności na DDP [7]. Ograniczeniem w stosowaniu DDP jest również szereg skutków ubocznych, które wywołuje. Cisplatyna u przeszło 30% pacjentów wywołuje zaburzenia słuchu (szczególnie dźwięków o wysokiej częstotliwości i szum w uszach). Innymi skutkami ubocznymi działania mogą być drętwienie mięśni, mrowienie i skurcze kończyn. DDP jako pochodna metalu ciężkiego jest silnie neurotoksyczna [2]. DDP jest toksyczny dla kanalików proksymalnych nerek. Około jednej trzeciej leczonych pacjentów ma podwyższony poziomu mocznika we krwi lub innych związków potwierdzających uszkodzenia nerek [7]. W celu obniżenia negatywnych oddziaływań na organizm przy jednoczesnym wzroście aktywności przeciwnowotworowej, prowadzi się liczne badania mające na celu określenie wpływu łączenia DDP i różnego rodzaju związków (między innymi składników pożywienia, roślin leczniczych lub innych cytostatyków). DDP wraz z saikosaponinami może aktywować wolne rodniki (ROS) akumulowane w znacznych ilościach w komórkach nowotworowych, co powoduje silną indukcję apoptozy [8]. Terapia skojarzona DDP z alkoholem perylowym (POH – monoterpen indukujący apoptozę) lub metylem jasmonianu (MJ – hormon roślinny 144 Cytostatyki w walce z nowotworami hamujący wzrost komórek nowotworowych) pozwala na użycie mniejszego stężenia pochodnej platyny przy zachowaniu tego samego poziomu cytotoksyczności dla komórek nowotworowych. Dzięki temu można zapobiec stosowaniu nefrotoksycznych stężeń DDP [10]. 2.2. Kamptotecyna Przeszło 60% leków przeciwnowotworowych to produkty pochodzenia naturalnego. Kamptotecyna to wyizolowany po raz pierwszy w 1966 roku alkaloid roślinny pochodzący z Camptotheca acuminate. Obecnie, kamptotecyna oraz jej pochodne są stosowane w leczeniu opornego na pochodne platyny raka jajników, okrężnicy i drobnokomórkowego rak płuc (DRP). Związek ten, jak i jego pochodne, zazwyczaj słabo rozpuszczają się w roztworach wodnych. Był to powód licznych nieudanych prób klinicznych przeprowadzonych w latach 70 [11]. Niska rozpuszczalność tych związków jest spowodowana niezwykle słabymi właściwościami zasadowymi atomu azotu w rdzeniu chinoliny [12]. Dużą skutecznością działania przejawiają również analogi kamptotecyny takie jak irinotecan i topotecan. Mogą one jednak wywoływać efekty uboczne, między innymi biegunki i supresję mielocytów [11]. Oba te związki są używane w terapii przeciwnowotworowej. Pierwszy, jako lek drugiego rzutu w przypadkach raka jajników i DRP. Drugi, w leczeniu raka odbytnicy jako lek pierwszego rzutu skorelowany z 5-fluorouracylem (5-FU) oraz w przypadkach leczenia ostatniej szansy w przypadku nowotworów opornych na inne cytostatyki [12]. W celu zwiększenia rozpuszczalności kamptotecyny i jej pochodnych w roztworach wodnych podejmowane są próby modyfikacji jej struktury poprzez łączenie jej z czynnikami powierzchniowo czynnymi, łatwo rozpuszczalnymi związkami chemicznymi lub dużymi polimerami o dobrej rozpuszczalności w wodzie [11]. Kamptotecyna jest cytostatykiem zależnym od fazy S cyklu komórkowego [13]. Mechanizm działania leku polega na łączeniu się z topoizomerazą I (topo I), enzymem odpowiedzialnym za usuwanie napięć torsyjnych w superchelisie DNA podczas transkrypcji i replikacji DNA. Dzięki swojej strukturze kamptotecyna i jej pochodne łączą topoizomerazę I i DNA w trwały kompleks zapobiegając powstaniu widełek replikacyjnych. Rozpad tego kompleksu powoduje uszkodzenia DNA (przerwanie lub trwałe połączenie podwójnej nici, oraz delecje nukleotydów) [14, 15]. Kamptotecyna jest pochodną chinoliny. Rdzeń stanowi pięć pierścieni. Dwa końcowe pierścienie (D, E) posiadają grupy α-hydroksy-δ-laktonowe. Aktywność optyczną zapewnia atom węgla w pozycji 20. Naturalnie występujący izomer 20-S, jest od 10 do 100 razy bardziej aktywny 145 Maciej Frant, Arkadiusz Czerwonka, Aleksandra Żurek w inhibicji topoizomerazy I niż izomer 20-R. Bardzo ważna dla aktywności związku jest również jego struktura przestrzenna. Zdolność do inhibicji jest połączona z obecnością odpowiednich grup funkcyjnych w pozycjach C-9 i C-10 w pierwszym pierścieniu aromatycznym (A). Chemiczne właściwości β-laktonu są niezbędne do biologicznej aktywności kamptotecyny. Rozerwanie pierścienia inaktywuje związek. W pH obojętnym lub zasadowym następuje hydroliza laktonu, w wyniku której pierścień ulega otwarciu. Powstała w ten sposób grupa karboksylowa (lub jej sól) zwiększa rozpuszczalność związku w wodzie. Niestety aktywność tej formy kamptotecyny jest 10 krotnie niższa, w porównaniu z laptonem, który przeważa w środowisku kwaśnym. Kamptotecyna i jej pochodne wykazują różne powinowactwo do albumin, zależnie od obecności różnych grup funkcyjnych przy pierścieniach A i B. Połączeniu z albuminami we krwi zapobiegają między innymi γ-globuliny, α1-kwaśna glikoproteina, fibrynogen i hemoglobina. Kamptotecyna wykazuje wyższą stabilność we krwi niż wewnątrz komórek. Wynika to ze zdolności przenikania dwuwarstwy lipidowej erytrocytów, chronionej przed hydrolazami oddziaływaniami hydrofobowymi. Cytostatyk ten i jego pochodne są inaktywowane w wątrobie przy udziale cytochromu P450. Kamptotecyna wymaga długotrwałego podawania by osiągnąć odpowiedni próg aktywności w komórkach guza. Wykazuje wtedy mniejszą toksyczność w stosunku do całego organizmu i lepszą aktywność przeciwnowotworową niż krótsza, intensywniejsza terapia. Wykryto również mechanizmy cytotoksyczności niezależne od replikacji DNA. Prawdopodobnie są one związane z aktywacją proteaz serynowych i endonukleaz [12]. 2.3. 5-fluorouracyl 5-fluorouracyl (5-FU) jest analogiem uracylu, w którym atom wodoru w pozycji C-5 został zastąpiony atomem fluoru. 5-FU dostaje się do komórki za pośrednictwem tych samych białek transportujących, co uracyl. Mechanizm cytotoksyczności 5-FU polega na inhibicji syntazy tymidylanowej (TYMS) [16]. Enzym ten odgrywa kluczową rolę w biosyntezie 5'-monofosforanu deoksytymidyny (dTMP), związku niezbędnego do syntezy DNA. TYMS katalizuje metylację 5'-monofosforanu deoksyurydyny (dUMP), w wyniku czego powstaje dTMP i dihydrofolian. 5-FU i jego pochodne poprzez inhibicję TYMS powodują zatrzymanie syntezy dTMP, co doprowadza do zahamowania syntezy DNA, a w konsekwencji do śmierci komórki. Inhibicja TYMS uznana jest za główny mechanizm działania 5-FU i jego pochodnych, chociaż związki te hamują wzrost komórek również poprzez 146 Cytostatyki w walce z nowotworami wbudowywanie się w struktury RNA, przez co zaburzają syntezę białek i szereg innych procesów metabolicznych [17]. 5-FU pozostaje jednym z najczęściej stosowanych leków w chemioterapii. Podawany jest w przypadkach raka przewodu pokarmowego, piersi, głowy i szyi [18]. Jak w przypadku wielu innych cytostatyków, zastosowanie 5-FU do walki z nowotworami jest ograniczone przez toksyczność ogólnoustrojową tego związku. Powoduje on poważne zaburzenia żołądkowo-jelitowe oraz zmiany w obrazie hematologicznym krwi spowodowane ciężką supresją szpiku kostnego [19]. Natomiast 5-FU stosunkowo rzadko powoduje objawy neurotoksyczne. Choć odnotowano zdolność przekraczania bariery krew-mózg, które może wywoływać zaburzenia mowy, ataksje i oczopląs. Krwawe wybroczyny, pojawianie się przebarwień nasilających się po ekspozycji na światło słoneczne, wypadanie włosów (alopecia), wymioty i nudności to również niepożądane skutki stosowania 5-FU [2]. 80% podanego 5-FU jest rozkładane w wątrobie przez dehydrogenazę dihydropirymidyny (DPD – dihydropyrimidine dehydrogenase) do dihydrouracylu, który następnie ulega rozpadowi do α-fluoro-β-alaniny, mocznika, amoniaku i dwutlenku węgla [20]. Komórki nowotworowe o niskim poziomie aktywności i ekspresji DPD wykazują znacznie większą wrażliwość na 5-FU niż komórki o wysokim poziomie ekspresji i aktywności tego enzymu. DPD jest więc niezwykle ważnym enzymem dla aktywności 5-FU. Niestety, u pacjentów z częściowym niedoborem tego enzymu, mimo znacznie lepszych efektów osiąganych przez stosowanie 5-FU pojawia się szereg skutków ubocznych związanych ze stosowaniem tego leku [18]. Kapecytabina to prolek zaprojektowany tak, aby w wyniku jego metabolizmu powstawał 5-FU. Jest hydrolizowana w wątrobie przez karboksyloesterazę do 5'-deoksy-5-fluorocytydyny (5′-DFCR). Ten pośredni produkt reakcji jest następnie przekształcany w 5'-deoksy-5-fluorourydynę (5′-DFUR) przez deaminazę cytydyny. Trzeci i ostatni etap polega na przemianie 5'-deoksy-5-fluorourydyny do 5-FU przez fosforylazę tymidynową (TP), która zachodzi głównie w komórkach nowotworowych. Ostatni etap wydaje się być kluczowy dla skuteczności kapecytabiny. Stosunkowo wysoka ekspresja TP w komórkach NDRP uzasadnia użycie kapecytabiny u pacjentów z tego typu nowotworem płuc [21]. 147 Maciej Frant, Arkadiusz Czerwonka, Aleksandra Żurek 3. Podsumowanie Chemioterapia to jedna z głównych strategii walki z nowotworami. Wykorzystuje ona leki cytostatyczne, będące szeroką grupą substancji przeciwnowotworowych pochodzenia naturalnego i syntetycznego. Działają one toksycznie na komórki nowotworowe (szybko dzielące się) wykorzystując różne mechanizmy. Substancje te podawane w dawkach terapeutycznych mogą blokować cykl komórkowy, czy też indukować w komórkach apoptozę. Warunkiem skutecznej chemioterapii jest kojarzenie kilku cytostatyków z odmiennych klas. Pojedyncza substancja może mieć zbyt niską skuteczność, a nowotwór może stać się szybko odporny na dany cytostatyk. Podanie kilku leków zmniejsza ryzyko wystąpienia oporności na terapię, z jednoczesnym wzmocnieniem działania cytostatycznego. Pomimo szeregu zalet stosowania cytostatyków w walce z nowotworami istnieje niestety ryzyko powikłań dla organizmu człowieka. Działanie tych leków nie jest ograniczone tylko do komórek rakowych, wpływają one również toksycznie na komórki zdrowe, co może zagrażać zdrowiu, a nawet życiu pacjenta. W celu ograniczenia skutków ubocznych chemioterapii wydłuża się czas pomiędzy jej kolejnymi cyklami oraz zmniejsza dawki leku. Taka terapia obarczona jest nawrotem choroby, jednak jej działanie uzależnione jest od aktualnego stanu pacjenta. Każda terapia z użyciem cytostatyków powinna być dostosowywana do indywidualnych potrzeb chorego. Aktualnie do najważniejszych alternatyw chemioterapii zalicza się interwencję chirurgiczną oraz radioterapię. Wykaz skrótów AMP – adenozynomonofosforan, DDH – dehydrogenaza dihydrodiolowa, DDP – cisplatyna (cis-diaminadichloroplatyna), DNA – kwas deoksyrybonukleinowy, DPD – dehydrogenaza dihydropirymidyny, DRP – drobnokomórkowy rak płuc, dTMP – 5'-monofosforan deoksytymidyny, dUMP – 5'-monofosforan deoksyurydyny, FDA – Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (ang. Food and Drug Administration), GSH – glutation, MJ – metyl jasmonianu, MRP-1 – białkowe pompy transportujące leki, NADP(H) – fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego, NDRP –niedrobnokomórkowy rak płuc, 148 Cytostatyki w walce z nowotworami POH – alkohol perylowy, RNA – kwas rybonukleinowy, ROS – reaktywne formy tlenu, topo I – topoizomerazą I, TP – fosforylaza tymidynowa, TYMYS – syntaza tymidylanowa, 5-FU – 5-fluorouracyl, 5′-DFCR – 5'-deoksy-5-fluorocytydyna, 5′-DFUR – 5'-deoksy-5-fluorourydyna. Literatura 1. Marks P. A., Jiang X. Histone Deacetylase Inhibitors in Programmed Cell Death and Cancer Therapy, Cell Cycle, 4(4) (2005), s. 549-551 2. Madej G. Chemioterapia onkologiczna dorosłych i dzieci, Wydawnictwo lekarskie PZWL, Warszawa (1994), s. 17-19 3. Joensuu H. Systemic chemotherapy for cancer: from weapon to treatment, The Lancet Oncology, 9(3) (2008), s. 304 4. Hammerschmidt S., Wirtz H. Lung Cancer: Current Diagnosis and Treatment, Deutsches Arzteblatt international, 106(49) (2009), s. 809-820 5. Krzakowski M. Onkologia kliniczna, Wydawnictwo Medyczne Borgis, Warszawa, 2 (2006), s. 802-831 6. Oliver T. G., Mercer K. L., Sayles L. C., Burke J. R., Mendus D., Lovejoy K. S., Cheng M. H., Subramanian A., Mu D., Powers S., Crowley D., Bronson R. T., Whittaker C. A., Bhutkar A., Lippard S. J., Golub T., Thomale J., Jacks T., Sweet-Cordero E. A. Chronic cisplatin treatment promotes enhanced damage repair and tumor progression in a mouse model of lung cancer, Genes & Development 24(8) (2010), s. 837-852 7. Hanigan M. H., Devarajan P. Cisplatin nephrotoxicity: molecular mechanisms, Cancer Therapy Journal, 1 (2003), s. 47-61 8. Wang Q., Zheng X. L., Yang L., Shi F., Gao L. B., Zhong Y. J., Sun H., He F., Lin Y., Wang X. Reactive oxygen species-mediated apoptosis contributes to chemosensitization effect of saikosaponins on cisplatin-induced cytotoxicity in cancer cells, Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 29 (2010), s. 159 9. Chen J., Emara N., Solomides C., Parekh H., Simpkins H. Resistance to platinum-based chemotherapy in lung cancer cell lines, Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 66(6) (2010), s. 1103-1111 10. Yeruva L., Hall C., Elegbede J. A., Carper S. W. Perillyl alcohol and methyl jasmonate sensitize cancer cells to cisplatin, Anticancer Drugs, 21(1) (2010), s. 1-9 11. Morgan M. T., Nakanishi Y., Kroll D. J., Griset A. P., Carnahan M. A., Wathier M., Oberlies N. H., Manikumar G., Wani M. C., Grinstaff M. W. Dendrimer-encapsulated camptothecins: increased solubility, cellular uptake, 149 Maciej Frant, Arkadiusz Czerwonka, Aleksandra Żurek 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. and cellular retention affords enhanced anticancer activity in vitro, Cancer Research, 66(24) (2006), s. 11913-11921 Garcia-Carbonero R., Supko J. G. Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins, Clinical Cancer Research, 8(3) (2002), s. 641-661 Song L., Bevins R., Anderson B. D. Kinetics and mechanisms of activation of alpha-amino acid ester prodrugs of camptothecins, Journal of Medicinal Chemistry, 49(14) (2006), s. 4344-4355 Kanagasabai R., Liu S., Salama S., Yamasaki E. F., Zhang L., Greenchurch K. G., Snapka R. M. Ubiquitin-family modifications of topoisomerase I in camptothecin-treated human breast cancer cells, Biochemistry, 48(14) (2009), s. 3176-3185 Liu L. F., Desai S. D., Li T.K., Mao Y., Sun M., Sim S.P. Mechanism of Action of Camptothecin, Annals of the New York Academy of Sciences, 922 (2000), s. 1-10 Savva-Bordalo J., Ramalho-Carvalho J., Pinheiro M., Costa V. L., Rodrigues A., Dias P. C., Veiga I., Machado M., Teixeira M. R., Henrique R., Jerónimo C. Promoter methylation and large intragenic rearrangements of DPYD are not implicated in severe toxicity to 5-fluorouracil-based chemotherapy in gastrointestinal cancer patients, BMC Cancer, 10 (2010), s. 470 Bielas J. H., Schmitt M. W., Icreverzi A., Ericson N. G., Loeb L. A. Molecularly evolved thymidylate synthase inhibits 5-fluorodeoxyuridine toxicity in human hematopoietic cells, Human Gene Therapy, 20(12) (2009), s. 1703-1707 Van Kuilenburg A. B., Haasjes J., Richel D. J., Zoetekouw L., Van Lenthe H., De Abreu R. A., Maring J. G., Vreken P., van Gennip A. H. Clinical implications of dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) deficiency in patients with severe 5-fluorouracil-associated toxicity: identification of new mutations in the DPD gene, Clinical Cancer Research, 6(12) (2000), s. 4705-4712 Kalantarian P., Najafabadi A. R., Haririan I., Vatanara A., Yamini Y., Darabi M., Gilani K. Preparation of 5-fluorouracil nanoparticles by supercritical antisolvents for pulmonary delivery, International Journal of Nanomedicine, 5 (2010), s. 763-770 El-Sayyad H. I., Ismail M. F., Shalaby F. M., Abou-El-Magd R. F., Gaur R. L., Fernando A., Raj M. H., Ouhtit A. Histopathological effects of cisplatin, doxorubicin and 5-flurouracil (5-FU) on the liver of male albino rats, International Journal of Biological Sciences, 5(5) (2009), s. 466-473 Han J. Y., Hong E. K., Lee S. Y., Yoon S. M., Lee D. H., Lee J. S. Thymidine phosphorylase expression in tumour cells and tumour response to capecitabine plus docetaxel chemotherapy in non-small cell lung cancer, Journal of Clinical Pathology, 58(6) (2005), s. 650-654 150 Cytostatyki w walce z nowotworami Cytostatyki w walce z nowotworami Streszczenie Nowotwór to grupa komórek, która w wyniku nieprawidłowych podziałów nadmiernie rozrasta się w organizmie gospodarza. Cytostatyki, czyli chemiczne środki hamujące podziały komórkowe mają na celu zmniejszenie ilości proliferujących komórek guza, w wyniku czego jego masa może ulec zmniejszeniu. Pozwala to na regresję nowotworu, a w konsekwencji daje szanse na wyleczenie. Cytostatyki działają głównie na komórki znajdujące się w fazie S cyklu komórkowego (fazo-zależnie - dawka cytostatyku podana w kilku porcjach działa efektywniej niż jednorazowe podanie takiej samej dawki) lub też niezależnie od fazy. Niektóre substancje chemioterapeutyczne stosowane w leczeniu są toksyczne dla organizmu. W przypadku terapii raka płuc, może wiązać się to między innymi z supresją szpiku kostnego, nefrotoksycznością, neurotoksycznością, kardiotoksycznością, wypadaniem włosów, nudnościami i wymiotami. Należy o tym pamiętać, aby w stosowanej terapii nie używać cytostatyków o nakładającej się na siebie toksyczności, oraz aby zastosować odpowiednie środki zapobiegawcze (terapii cisplatyną musi towarzyszyć podawanie płynów i elektrolitów). Niekiedy, wymagane jest podanie środków przeciwwymiotnych, witaminy B12 i kwasu foliowego. Do często stosowanych cytostatyków możemy zaliczyć: cisplatynę, ifosfamid, mitomycynę, winblastynę, winkrystynę, windezynę, etopozyd, karboplatynę winorelbinę, paklitaksel, pemetreksed, gemcytabinę, docetaksel, tenipozyd, cyklofosfamid, doksorubicynę, metotreksat, lomustynę, topotekan oraz irynotekan. Uznaje się je za leki aktywne, czyli takie, które pozwalają uzyskać w mono terapii odpowiedzi u więcej niż 15% chorych. Leczenie odbywa się jako terapia kombinowana z udziałem kilku wybranych leków z powyższej grupy, zazwyczaj z udziałem pochodnej platyny. Długość leczenia wyznacza jego skuteczność i zdolności tolerancji organizmu. Cytostatics in the fight against cancer Abstract Cancer is a group of cells that as a result of abnormal proliferation grows excessively in the human organism. Cytostatics, the chemical inhibiting agents of cell proliferation are designed to reduce the amount of proliferating tumor cells what may result if the reduction of their weight. This allows to tumor regression, and consequently gives the chance for cure. The chemotherapeutic agents act mainly on cells in the S phase of the cell cycle (dose dependent of the chemotherapeutic agent administered in several portions act more efficiently than single administration of the same dose) or independently of the phase. Some chemotherapeutic agents used in the treatment are toxic to the body. In the case of lung cancer therapy may involve inter alia, bone marrow suppression, nephrotoxicity, neurotoxicity, cardiotoxicity, hair loss, nausea and vomiting. There is a need to remember that in the therapy we should not combine cytostatics which toxicity cumulate, and should take appropriate preventive measures (cisplatin therapy must be accompanied by administration of fluids and electrolytes). Sometimes, it is necessary to provide anti-emetic agents, vitamin B12 and folic acid. Commonly used cytostatics include: cisplatin, ifosfamide, mitomycin, vinblastine, vincristine, vindesine, etoposide, vinorelbine, carboplatin, paclitaxel, pemetrexed, gemcitabine, docetaxel, teniposide, cyclophosphamide, doxorubicin, methotrexate, lomustine, topotecan and irinotecan. Considered to be active agents, that is, those that allow to obtain in mono therapy response in more than 15% of patients. The treatment is carried out as a combination therapy with several drugs selected from this group, usually involving a platinum derivative. The length of treatment is determined by its efficacy and tolerance ability of the organism. 151 Alicja Janicka1, Anna Cwynar2, Blanka Ziomkowska3 Kamptotecyna i jej pochodne. Obiecujące substancje lecznicze chorób nowotworowych na miarę XXI wieku 1. Wprowadzenie Leczenie roślinami i substancjami z nich pochodzącymi określa się mianem fitoterapii. Doniesienia na temat wykorzystania związków roślinnych jako leków w terapii nowotworowej pojawiły się już u Dioskurydesa w jego dziele pt. „De Materia Medica”. Archeologiczne odkrycia szczątek ludzkich wskazują na to, że już od najdawniejszych czasów prehistoryczne ludy wykorzystywały zioła i ich dobroczynne właściwości w leczeniu różnego rodzaju schorzeń. Świadczy o tym fakt, znalezienia w otoczeniu odkryć archeologicznych pyłków kwiatowych i nasion ziół. Największy rozwój w dziedzinie fitoterapii odnotowuje się w starożytnym Egipcie, ale już wcześniej fitoterapia była wykorzystywana przez Sumerów czy przez Chińczyków. Hipokrates jak też i Galen wykorzystywali zarówno napary jak i inne wyciągi pochodzenia roślinnego w celu uzyskania substancji leczniczej. Fitoterapeutyków dla których odnotowano właściwości przeciwnowotworowe jest wiele, tak samo jak wiele jest form otrzymanego leku pochodzenia roślinnego. Ciekawym przykładem może być padofilotoksyna odkryta w 1861 roku przez Roberta Bentleya. Substancja ta została wyekstrahowana z przęśli Podophyllum peltatum, a w określeniu potocznym znana jest jako ” jabłko Majów”. Substancja wykazywała duże właściwości antymitotyczne i zaczęto ją stosować przeciwko między innymi ziarnicy złośliwej [1]. Kolejny przykład może stanowić paklitaksel. To substancja pochodząca z popularnego drzewa – cisu pospolitego (Taxus baccata). To drzewo szpilkowe, owocujące osnówką wokół nasienną, która w medycynie ludowej była wykorzystywana jako lek o działaniu rozkurczającym. Paklitaksel po opatentowaniu metody pozyskiwania substancji z kory amerykańskiej odmiany cisu (Taxus brevifolia) otrzymał 1 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Studenckie Koło Naukowe Biofizyki przy Zakładzie Biofizyki 2 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra i Zakład Patobiochemii i Chemii Klinicznej 3 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra i Zakład Biofizyki 152 Kampotecyna i jej pochodne. Obiecujące substancje lecznicze chorób nowotworowych na miarę XXI wieku nazwę handlową Taxol. Głównie znalazł zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej w leczeniu raka sutka i jajnika. Innym lekiem pochodzącym z cisu pospolitego jest docetaksel do handlu wprowadzony jako Taxotere. Jest około dwukrotnie silniejszy w działaniu antymitotycznym niż paklitaksel, a wykorzystywany jest ponadto w leczeniu miedzy innymi nowotworów płuc czy czerniaka złośliwego, a także w niektórych rodzajach białaczek [1]. 2. Cel pracy Związkiem docelowym, którego ma dotyczyć niniejsza praca jest kamptotecyna i jej pochodne. Pochodzi z drzewa Camptotheca acuminata potocznie w swojej tybetańskiej ojczyźnie zwanego „szczęśliwym drzewem”. Właściwości przeciwnowotworowe z kory tego drzewa odkryli Monroe E. Wall i Jonathan Hartwell z National Cancer Insitute w USA w 1958r. Początkowo kamptotecyna była wykorzystywana w leczeniu nowotworów przewodu pokarmowego, natomiast ze względu na efekty uboczne zaprzestano tych praktyk. Wraz z odkryciem półsyntetycznych pochodnych kamptotecyny jakimi są dwa główne tj. topotekan i irynotekan pod koniec lat osiemdziesiątych nastąpił przełom w leczeniu nowotworów jelita grubego, białaczek jak również drobnokomórkowego raka płuc [1]. 3. Omówienie 3.1. Informacje podstawowe Drzewo Camptotheca acuminata występuje obecnie w Chinach, Tybecie a także hodowane jest w Kalifornii [2,3]. Inna nazwa drzewa to Xi Shu [4]. Jak już wiemy dobroczynne przeciwnowotworowe właściwości płynące z naturalnego składnika tego drzewa zostały odkryte w 1958 roku przez dr Monroe E. Walla i dr Jonathana Hartwella, dzięki badaniu właściwości kamptotecyny przeciwko białaczce myszy [2]. Mimo, że związek pozyskiwany jest z liści, nasion i kory Camptotheca acuminata, można także uzyskać CPT poprzez proces chemicznej syntezy lub z innych roślin takich jak m.in. Ervatamia heyeano, Merilliodendron megacarpum [5,6,7,8,9]. Kamptotecyna jak już wiadomo, jest związkiem pochodzenia roślinnego. To alkaloid, który swoją wyjątkowość zawdzięcza temu, że potrafi zablokować topoizomerazę I, która jest enzymem biorącym udział w procesie replikacji DNA. Oznacza to, że związek ten potrafi zniszczyć komórki będące we wczesnej fazie rozmnażania. Na korzyść kamptotecyny przemawia fakt, iż komórki zmienne nowotworowo dzielą się o wiele szybciej od komórek zdrowych dzięki czemu są efektywnie unicestwiane [10]. W latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku zaprzestano stosowania 153 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska kamptotecyny podawanej w postaci karboksylanu sodu ze względu na takie efekty uboczne jak zahamowanie czynności szpiku kostnego czy też krwotoczne zapalenie pęcherza [11, 12, 13, 14, 15]. Stosunkowo niewielkie zainteresowanie kamptotecyną trwało, aż do 1985 roku, czyli do czasu odkrycia jej specyficznego mechanizmu działania jakim jest hamowanie enzymu topoizomerazy I (topo I) [11,12,13, 15, 16, 17,18]. 3.2. Budowa związku Kamptotecyna wraz ze swoimi pochodnymi składają się z pięciocyklicznego rdzenia. Pierścień A i B to chinolinowy fragment związku, pierścienie C i D to indolizynowe fragmenty kamptotecyny, pierścień E to fragment a- hydroksylaktanowy. Każdy z fragmentów charakteryzuje się pewnymi właściwościami i tak też do części chinolinowej można bez straty aktywności związku podstawić różne grupy funkcyjne, fragment indolizynowy odpowiada za aktywność biologiczną w stosunku do enzymu topoizomerazy I dzięki swojej grupie funkcyjnej jaką jest reszta karboksylowa i w końcu pierścień a- hydroksylaktonowy z aktywnym biologicznie centrum asymetrii (S) [10]. Można przyjąć, że aktywność biologiczna kamptotecyny jest zależna od trzech czynników: obecności enzymu topoizomerazy I, pH roztworu i sekwencji DNA [20, 21]. Jak już wiadomo, mimo licznych badań nad związkiem kamptotecyny, nie jest ona wykorzystywana jako lek w terapii przeciwnowotworej. W leczeniu klinicznym stosowane są dwie pochodne CPT jest to irinotekan i topotekan, które w odróżnieniu od związku macierzystego są łatwiej rozpuszczalne w warunkach fizjologicznych, lepiej zachowują swoje właściwości przeciwnowotworowe i są mniej toksyczne dla organizmu [22]. Wykorzystywane m.im w leczeniu drobnokomórkowego raka płuc, raka jajnika czy też odbytnicy [23, 24]. Pochodne kamptotecyny w których zastąpiono grupę wodorową w pozycjach 7,9,10 wykazują w dalszym ciągu właściwości przeciwnotworowe [7,18]. Jednak istnieją badania które wskazują, że różnorakie próby modyfikacji pierścienia laktonowego jak np. próba redukcji tej grupy, usunięcie grupy -OH z pozycji 20, czy też zastąpienie grupą amidową grupy laktonowej prowadzą do unieczynnienia cząsteczki kamptotecyny [7, 19]. 154 Kampotecyna i jej pochodne. Obiecujące substancje lecznicze chorób nowotworowych na miarę XXI wieku 3.3. Topoizomeraza I i II Kamptotecyna blokuje enzym jądrowy jakim jest topoizomeraza I (topo I). Topoizomerazy to takie enzymy, dzięki którym proces replikacji zachodzi prawidłowo. Jest to wynikiem ich działania, które polega na relaksacji cząsteczek DNA poprzez wytworzenie okresowo powtarzających się pęknięć w jednej nici DNA, za co właśnie odpowiada topoizomeraza I lub w dwóch niciach DNA za co odpowiedzialna jest topoizomeraza II. To enzymy utrzymujące fizjologiczne funkcje DNA, dzięki którym możliwe jest rozplatanie nici DNA które są do siebie komplementarne. (18,25,26,) Wyróżnia się cztery etapy relaksacji DNA przez topoizomerazę I: enzym topo I przyłącza się do cząsteczki DNA; powstanie tzw. kompleksu rozszczepialnego, czyli kompleksu nici DNA z Topo I, dzięki przecięciu jednej z nici DNA z równoczesnym przyłączeniem się Topo I; przejście nici całej przez nic przeciętą lub obrót nici przeciętej wokół nici nienaruszonej dzięki czemu dochodzi do rozluźnienia naprężeń w cząsteczce DNA; ostatni etap stanowi odłączenie enzymu topoizomerazy I z równoczesnym połączeniem się nici przeciętej [27,28]. Ewentualne problemy jakie mogą wystąpić podczas zachodzenia tego procesu, doprowadzić mogą do insercji, delecji, śmierci komórki lub aberracji chromosomowych [30]. Co ciekawe im wyższe stężenie enzymu topoizomerazy I, tym wyższe właściwości hamujące kamptotecyny na aktywność tego enzymu jądrowego. Tak więc im wyższe jest stężenie topo I w komórce tym bardziej jest ona wrażliwa na działanie leku. Wiadomym jest fakt, że stężenie enzymu w komórkach jest różne, natomiast odkryto, że w komórkach nowotworowych to stężenie jest średnio 15 razy wyższe niż w komórkach prawidłowych. Jest to bardzo pożądana cecha w terapii nowotworowej [25]. Najwyższe stężenie topoizomerazy I zauważa się w fazie S cyklu komórkowego, stąd też właśnie wynika właściwość kamptotecyny, która właśnie w fazie S powoduje zahamowanie procesu proliferacji i śmierć komórki [25, 30]. Nie ma badań które mówiłyby o tym, że kamptotecyna może oddziaływać z samą cząsteczką DNA lub z samą topoizomerazą I. Kamptotecyna oddziałuje z kompleksem rozszczepialnym czyli z połączonym enzymem topoizomerazy I z DNA. Tak więc dopiero w połączeniu z takim kompleksem kamptotecyna wykazuje swoją aktywność [11]. Kiedy kamptotecyna zostaje usunięta z kompleksu, przerwana nić DNA zostaje naprawiona. Jeżeli jednak w trakcie działania widełek replikacyjnych wystąpią błędy w czasie ich przesuwania się, w zetknięciu 155 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska z kompleksem rozszczepialnym połączonym z kamptotecyną, utworzą się nieodwracalne podwójne pęknięcia nici. W związku z powyższym poprzez akumulacje białka p53, zahamowaniu proliferacji komórek z w fazie cyklu S i indukcję białka Bax dochodzi do apoptozy[14,19,26,30] Równolegle w tym samym czasie kamptotecyna stabilizuje rozszczepialne kompleksy blisko regionu transkrypcyjnego co utrudnia w procesie tym przesuwanie się polimerazy RNA i wstrzymanie syntezy RNA już na etapie elongacji [14,19,25,30]. W skutek tego dochodzi do dalszych reakcji wynikających jedna po drogiej takich jak aktywacja TP53, indukcja p53, aktywacja p21, zatrzymanie proliferacji komórek na poziomie fazy G1, uruchamiane zostają białka śmierci i dochodzi do apoptozy [25,29]. 3.4. Fizyczne właściwości kamptotecyny Zbadano, że tak samo kamptotecyna jak i jej pochodne są związkami fluoryzującymi, dlatego też można określać ich właściwości biofizyczne dzięki metodzie spektroskopii fluoroscencyjnej [31]. Istnieją dwie formy kamptotecyny. Forma laktonowa biologicznie aktywna oraz karboksylowa forma nieaktywna. Forma laktonowa jest obojętna elektrycznie i nierozpuszczalna w wodzie, a forma karboksylowa jest rozpuszczalna i ujemnie naładowana [19, 30]. W pH fizjologicznym ok. 7,4 formy laktonowe związku poprzez hydrolizę ulegają stopniowym przemianom do formy karboksylowej. Widmo fluorescencji w irinotekanie (SN-38) jest różne w formie laktonowej i karboksylowej, a wraz z hydrolizą formy aktywnej w nieaktywną obserwuje się zmiany widm wzbudzenia fluorescencji. Dzięki wykorzystaniu różnicy w kształcie widm fluorescencji aktywnej formy laktonowej i nieaktywnej biologicznie formy karboksylowej pochodnej SN-38 możliwe jest określenie kinetyki dezaktywacji kamptotecyny[3,31]. Możliwe jest także, określenie jak zmieniają się stężenia formy laktonowej i formy karboksylowej SN-38 na przestrzeni czasu. Dzięki takim danym można już określenie czas połówkowego zaniku aktywnej formy laktonowej w nieaktywną formę karboksylową [31]. Kamptotecyna w osoczu traci swoją aktywność po około 2 godzinach. Jest to nieodwracalna i niepożądana dezaktywacja, która jest efektem wiązania się formy karboksylowej do białka osocza jakim jest albumina. Tak związany kompleks jest trwały i nie przechodzi już w formę laktonową. Z przedstawionych powodów poszukiwane są pochodne kamptotecyny, które będą wykazywały się właściwościami przeciwnowotworowymi, ale ich wiązanie się z albuminą nie będzie tak silne czy też proces nie będzie nieodwracalny. Pochodna kamptotecyny jaką jest 156 Kampotecyna i jej pochodne. Obiecujące substancje lecznicze chorób nowotworowych na miarę XXI wieku irinotekan, wykazuje zdecydowanie lepsze oddziaływanie w osoczu. Jest to spowodowane właśnie tym, że powinowactwo jego formy karboksylowej do albuminy jest ok. 200 razy mniejsze niż powinowactwo kamptotecyny. Jest to cecha pożądana, gdyż forma laktonowa związku jest bardziej stabilna co czyni go obiecującą substancją z klinicznego punktu widzenia[2]. Po 2 godzinach od momentu wprowadzenia związku kamptotecyny do organizmu w formie laktonowej, ustala się stężenie na poziomie ok. 5% [32, 33]. Jest to duży problem jeżeli chodzi o użyteczność leku w terapii przeciwnowotworowej. Problem ten stał się przyczyną do poszukiwania nowych analogów kamptotecyny, które mają zachować właściwości przeciwnowotworowe ale nie będą tak szybko ulegać dezaktywacji w organizmie. Najlepiej opisanymi w literaturze pochodnymi kamptotecyny są hydroksykamptotecyny, których cechą charakterystyczną jest podstawnik OH w miejscu wodoru przy 10 węglu macierzystego związku kamptotecyny. Ważną cechą dla pochodnych związków kamptotecyny jest wykazanie wysokiego powinowactwa formy laktonowej do membran organizmu, a także słabe wiązanie się formy karboksylowej z albuminą. Takie oczekiwania zostały postawione w poszukiwaniu pochodnej związku kamptotecyny przez to, iż ogólnie znana jest właściwość formy karboksylowej związku macierzystego do trwałego wiązania się go z albuminą prowadząc tym samym do spadku stężenia formy aktywnej [32,34,35,36]. Dopiero dzięki takim właściwościom można stwierdzić, że związek będzie stabilny we krwi, a przez to zachowa swoje właściwości przeciwnowotworowe. Jak już wiemy stężenia kamptotecyny po ustaleniu się punktu równowagi są różne w zależności od roztworu do jakiego zostały wprowadzone. I tak też we krwi jest to ok 5% [32] dla formy laktonowej po ustaleniu się równowagi, dla PBS-u stężenie to wynosi około 11%, w zawiesinie erytrocytów stężenie to wynosi ok 40%, natomiast w osoczu stężenie to ze względu na silne wiązanie formy karboksylowej związku z albuminą – głównym białkiem osocza krwi – dochodzi do zera. Jeżeli forma laktonowa połączy się z błonami komórkowymi występującymi w organizmie i spełniającymi funkcje membran, to proces hydrolizy zostaje wstrzymany, przez co następuje stabilizacja formy laktonowej i w takim środowisku właściwości przeciwnowotworowe kamptotecyny są wysokie [37, 38, 39,40,41]. Istnieje kilka metod na ustabilizowanie aktywnej formy laktonowej związku kamptotecyny w organizmie. Jedną z nich jest wprowadzenie do organizmu pacjenta ibuprofenu. Ze względu na wysokie – wyższe niż w przypadku kamptotecyny – powinowactwo albuminy do ibuprofenu uniemożliwione staje się związanie formy karboksylowej kamptotecyny 157 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska z białkiem osocza krwi [39]. Drugą godną zainteresowania metodą jest zamknięcie w dwuwarstwie liposomów cząsteczki kamptotecyny to proces tzw. Liposomowania [39,42,43]. Tak przygotowany lek z kamptotecyną jest dobrze przyswajalny, chroniony przed hydrolizą, a co najważniejsze zachowuje swoje właściwości przeciwnowotworowe [42,43]. 3.5. Pochodne kamptotecyny Topotekan (TPT, Hycamtin) to półsyntetyczna pochodna kamptotecyny, rozpuszczalność w wodzie cząsteczki jest możliwa dzięki grupie N,N-dimetyloaminoaminowej umieszczonej przy 9 węglu w cząsteczce [44]. Jak podają źródła topotekan jako lek ulega związaniu w około 35% z białkami osocza, mniej więcej połowa dawki topotekanu wydalona zostaje z moczem, a jedna piąta z kałem u osób z prawidłowym metabolizmem. Stałe te ulegają zmienie u chorych u których metabolizm jest zakłócony. Obecnie główne zastosowanie topotekanu to leczenie raka jajnika u chorych z przerzutami, gdzie chemioterapia pierwszego lub drugiego rzutu nie przyniosła oczekiwanego efektu terapeutycznego; leczenie drobnokomórkowego raka płuc, gdzie chemioterapia I rzutu była niewystarczająca; leczenie zaawansowanego nawracającego nowotworu szyjki macicy po radioterapii; leczenie w połączeniu z cisplatyną. Topotekan jest podawany chorym z właściwą rezerwą szpikową, dlatego tak ważne jest kontrolowanie morfologii krwi [45]. Irinotekan (Camptosar) to pochodna kamptotecyny utworzona dla łatwiejszego pozajelitowego stosowania SN-38 (7-etylo-10-hydroksykamptotecyny). Związek w pozycji C-10 zawiera fragment bispiperydynowy. Irinotekan jest stosowany przy nowotworach płuc i jelita grubego [45]. Analogicznie do kamptotecyny irynotekan działa jak inhibitor Topoizomerazy I DNA. W większości tkanek irynotekan jest metabolizowany do SN-38 który ma o wiele silniejsze działanie cytostatyczne wobec różnych komórkowych linii nowotworowych [47]. Exatekan (DE-310) pochodna kamptotecyny uzyskana syntetycznie, sześciocykliczna, dobrze hamuje wzrost nowotworowych linii komórkowych jak i ksenograftów, może być stosowana w hamowaniu rozwoju linii komórkowych wykazujących odporność na topotekan i irinotekan. Jako efekt uboczny zaobserwowane zostało obniżenie ilości granulocytów [46,48]. Gimatekan (Sigma-Tau) - półsyntetyczna lipofilowa pochodna kamptotecyny, wydaje się być obiecującym farmaceutykiem ze względu na swoje zróżnicowanie w leczeniu rówżnych typów nowotworów m.in. jelita grubego, nowotworów dziecięcych, płuc czy piersi [46]. Karenitecyna (BNP-1350) półsyntetyczny, lipofilny silanotekan. Wykazuje się większą biodostępnością, większą stabilnością pierścienia laktonowego, 158 Kampotecyna i jej pochodne. Obiecujące substancje lecznicze chorób nowotworowych na miarę XXI wieku a także większą cytotoksycznością niż kamptotecyna. Charakteryzuje się dużą aktywnością wobec czerniaka [46]. Lurtotekan (NeXstar Pharmaceuticals) wykorzystywany jako liposomowa kapsułka, dzięki czemu czas półtrwania leku jest wydłużony, a wartość terapeutyczna jak i stężenie substancji aktywnej w osoczu są wyższe w porównaniu z lurtotekanem i topotekanem [46]. 4. Podsumowanie Niniejsza praca dostarcza najważniejszych informacji o kamptotecynie jak i o wybranych, najważniejszych zdaniem autorów jej pochodnych. Autorzy pracy starali się jak najdokładniej opisać sam alkaloid, zarysować mechanizm działania związku i jego analogów, a także m.in. określić właściwości biofizyczne kamptotecyn. Praca donosi, że kamptotecyna to inhibitor topoizomerazy I, która pełni istotną funkcje w replikacji DNA. W związku z tym uniemożliwione jest rozmnażanie się komórek. Cecha ta jest wynikiem połączenia się kompleksu DNA i topoizomerazy I z kamptotecyną i uniemożliwieniu postępowania w dalszym procesie replikacji. Działanie kamptotecyny jest skupione na niszczeniu komórek fazy S. Jest to cecha pożądana ponieważ komórki nowotworowe poprzez to, że rozmnażają się szybciej od zdrowych więcej czasu przebywają w fazie S [2]. Na podstawie zebranych informacji w pracy można stwierdzić, iż mechanizm działania kamptotecyny opiera się na wprowadzeniu pęknięć DNA przez topo I, a dowodem potwierdzającym te słowa, może być badanie wykonane przez Johna Nittis‟a i Jamesa C. Wang‟a w którym po usunięciu z bakterii S.cerevisiae genu dla topo I występuje całkowita odporność na kamptotecynę[48]. Linie komórkowe, których mutacja obejmuje reszty dla topo I także wykazują odporność na kamptotecynę [50]. Budowa alkaloidu kamptotecyny jest pierścieniowa, składa się z pierścienia laktonowego, pirydonowego pirolowego i dwóch chinolinowych [50]. Aktywna forma kampotecyny jest stabilna tylko w środowisku kwaśnym, gdzie pH jest mniejsze niż 5,5. W środowisku powyżej pH 5,5 aktywna laktonowa forma kamptotecyny ulega procesowi hydrolizy zamieniając się przy tym w nieaktywną biologicznie karboksylową formę związku. Kiedy aktywna kamptotecyna w formie laktonowej zostanie wprowadzona w środowisko fizjologiczne o pH 7,4 związek dezaktywuje się do nieaktywnej biologicznie formy karboksylowej. Sama forma karboksylowa wykazuje stabilność w roztworach gdzie pH wynosi więcej niż 9 [31]. Kiedy wprowadzimy kamptotecynę w formie laktonowej z środowiska o pH poniżej 5,5 do środowiska o pH fizjologicznym w procesie hydrolizy po kilku godzinach ustali się stan równowagi dla obu form związku. 159 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska Oznacza to że forma laktonowa będzie przechodziła w formę karboksylową i odwrotnie, natomiast stężenie formy laktonowej jest znacznie niższe [31]. Jak już wiadomo sama kamptotecyna nie może być wykorzystywana w lecznictwie, ze względu na liczne skutki uboczne. Obecnie poszukiwane są wciąż coraz to nowsze pochodne kamptotecyny, które będą wykazywały się właściwościami przeciwno wotworowymi i mniejszym powinowactwem formy karboksylowej związku do albuminy. Powinowactwo jakim wykazuje się forma karboksylowa do albuminy, powodujące zanik formy laktonowej w warunkach fizjologicznych, jest niekorzystne w procesie leczenia klinicznego. Kiedy problem ten zostanie wyeliminowany lub też zmniejszony do minimum, pochodne kamptotecyny, zdają się być obiecującym lekarstwem w cywilizacyjnych chorobach nowotworowych XXI wieku. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Wieczorek M., Sobiak S., MEISSNER R. Rozwój badań nad wykorzystaniem substancji pochodzenia roślinnego w terapii nowotworów, Nowiny Lekarskie, 75 (2006), s. 407-413 Ziomkowska B., Kruszewski S., Cyrankiewicz M., Stolarska P., Siepielska A. Badanie oddziaływania kamptotecyny i 7-etylo-10 hydroksykamptotecyny z białkami osocza metodą pomiaru anizotropii fluorescencji, Medical and Biological Sciences, 21 (2007), s. 127-132 Ziomkowska B., Kruszewski S., Siuda R., Cyrankiewicz M. Określenie kinetyki dezaktywacji kamptotecyny metodą analizy ewolucji czasowej widm absorbancji i fluorescencji, Biocybernetyka i inżynieria biomedyczna, (2003), s. 1156-1161 Wall M.E., Wani M.C., Cook C.E., Palmer K.H., McPhail A.T, Sim G.A. Plant antitumor agents. I. The isolation and structure of camptothecin, a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor from Camptotheca acuminata, Jurnal of the America Chemical Society, 88 (1966), s. 3888-3890 Sriram D., Yoggeswari P., Thirumurugan R., Bal T.R. Camptothecin and its analogues: a review on their chemotherapeutic potential, Natural Product Research, 19 (2005), s. 93-412 Lorence A., Nessler C.L. Molecules of interest camptothecin, over four decades of surprising findings, Phytochemistry, 65 (2004), s. 2735-2749 Bailly C. Homocoamptothecins: potent topoismerase I inhibitors and promising anticancer drugs, Critical Reviews in Oncology/Hematology, 45 (2003), s. 91-108 Curran D.P., Josien H., Bom D., Gabarda A.E., Du W. The cascade radical annulation approach to new analogues of camptothecins. Combinatorial synthesis of silatecans and homosilatecans, Annals of the New York Academy of Sciences, 922 (2000), s. 112-121 160 Kampotecyna i jej pochodne. Obiecujące substancje lecznicze chorób nowotworowych na miarę XXI wieku 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. Zhang J., Yu Y., Liu D., Liu Z. Extraction and composition of three naturally occurring anti-cancer alkaloids in Camptotheca acuminata seed and leaf extracts, Phytomedicine, 14 (2007), s. 50-56 Kruszewski S., Ziomkowska B., Cyrankiewicz M., Pokrywczyńska M., Reksa M., Zarakowska E., Pacek A., Eljaszewski A. Kinetyka dezaktywacji kamptotecyny określana metodą analizy ewoluujących widm absorbcji, Annales Academiae Medicae Bydgostiensis, 18 (2004), s. 53-57 Bailly C., Lansiaux A., Dassonneville L., Demarquay D., Coulomb H., Huchet M., Lavergne O., Bigg D.C. Homocamptothecin, an E-ring-modified camptothecin analogue, generates new topoisomerase 1-mediated DNA breaks, Biochemistry, 38(1999), s. 15556 - 15563 Champoux J.J. Structure-based analysis of the effects of camptothecin on the activities of human topoisomerase I, Annals of the New York Academy of Sciences, 922(2000), s. 56-64 Liehr B., Giovanella B.The Camptothecins. Unfolding their anticancer potential. Introduction, Annals of the New York Academy of Sciences, 922(2000) s. 11-12 Liu L.F., Desai S.D., Li T.K., Mao Y., Sun M., Sim S.P. Mechanism of action of camptothecin, Annals of the New York Academy of Sciences, 922 (2000), s. 1-10 Hsiang V.H., Hertzberg R., Hecht S., Liu L. F. Camptothecin induces proteinlinked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase I, Jurnal of Biological Chemistry, 260 (1985), s. 14873-14878 Berger J. Structure of DNA topoisomerases, Biochemica et Biophysica Acta, 1400(1998), s. 3-18 Burke T.G., Bom D. Camptothecin design and delivery approaches for elevating antitopoisomerase I activities in vivo, Annals of the New York Academy of Sciences, 922(2000), s. 36-45 Stewart L., Redinbo M.R., Qiu X.H., Champoux J.J. A model of the mechanism of human topoisomerase I, Science, 279(2006), s. 1534-1542 Kohn K.W., Pommier Y. Molecular and biological determinants of the cytotoxic actions of camptothecin. Perspective for the development of new topoismerase I inhibitors, Annals of the New York Academy of Sciences, 922(2000), s. 11-26 Yang D., Strode J. T., Spielmann H. P., Wang A.H.J., Burke T. G. DNA interactions of two clinical camptothecin drugs stabilize their active lactone form s, Jurnal American Chemical Society, 120(1998), s. 2979-2980 Chourpa I., Riou J.F., Millot J.M., Pommier Y., Manfait M. Modulation in kinetics of lactone ring hydrolysis of camptothecins upon interaction with topoisomerase l cleavage sites on DNA, Biochemistry, 37(1998), s. 7284-7291 Gacia-Carbonero R., Supko J. G. Current perspectives on the clinica l experience, pharmacology and continued development of camptothecins, Clinical Cancer Research, 8(2002), s. 641-661 Łazowski J. Farmakologia kliniczna irinotekanu, Farmacja Polska, 55 (1999), s. 28-34 161 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska 24. Takimoto C.H., Wright J., Arbuck S.G. Clinical applications of the camptothecins, Biochimica et Biophysica Acta, 1400(1998), s. 107-119 25. Omyła-Staszewska J., Deptała A. Inhibitory topoizomerazy I - unikalna grupa lekówprzeciwnowotworowych, Współczesna Onkologia, 7(2003), s. 45-53 26. Staker B.L., Hjerrild K., Feese M.D., Behnke C.A., Burgin A.B., Steward L. The mechanism of topoisomerase I poisoning by a camptothecin analog, Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(2002), s. 15387-15392 27. Ciesielska E. Inhibitory topoizomerazy I - nowa klasa leków przeciwnowotworowych, Postępy biologii komórki, 25(1998), s.613-632 28. Pommier Y., Pourquier P., Fun Y., Strumberg D. Mechanism of action of eukaryotic DNA topoismerase I and drugs targeted to the enzyme, Biochemical et Biophysical Acta, 1400(1998), 83-106 29. Madej J. A. Podstawy cytopatologii. Udział topoizomeraz w patologiii DNA, Wydawnictwo Medyczne UP, (2003) 30. Li Q.Y., Zu Y.G., Shi R.Z., Yao L.P. Review camptothecin: current perspectives, Current Medical Chemistry, 13(2006), s. 2021-2039 31. Ziomkowska B., Cyrankiewicz M., Kruszewski S. Analiza czynnikowa widm wzbudzenia fluorescencji jako metoda badania kinetyki przemian biochemicznych 7- etylo-10-hydroksykamptotecyny, Medical Biological Science, 2(2005), s. 115-119 32. Burke T.G., Munshi C.B., Mi Z., Jiang Y. The important role of albumin in determining the relative human blood stabilities of the camptothecin anticancer drugs, Journal of Pharmaceutical Sciences, 4(1995), s. 518-519 33. Kruszewski S., Burke T.G. Properties of camptothecin analogues - promising topoisomerase I inhibitiors determined by fluorescence spectroscopy methods, Polish Journal of Medical Physics and Engineering, 8(2002), s. 183-192 34. Burke T.G., Mi Z. The structural basis of camptothecin interactions with human serum albumin: impact on drug stability, Journal of Medicinal Chemistry, 37(1994), s. 40-46 35. Kruszewski S., Burke T.G. Camptothecin affinity to HSA and membranes determined by fluorescence anisotropy measurements, Applied Optics, 4(2002), s. 721-730 36. Mi Z., Burke T.G. Differential interactions of camptothecin lactone and carboxylate forms with human blood components, Biochemistry, 33(1994), s. 10325-10336 37. Bom D., Curran D.P., Chavan A.J., Kruszewski S., Zimmer S.G., Fraley K.A., Burke T.G. Novel A,B,E-ring-modified camptothecins displaying high lipophilicity and markedly improved human blood stabilities, Jurnal of Medical Chemistry, 42(1999), s. 3018-3022 38. Bom D., Curran D.P., Zhang J., Zimmer S.G., Bevins R., Kruszewski S., Howe J.N., Bingcang A., Latus L.J., Burke T.G. The highly lipophilic DNA topoisomerase I inhibitor DB-67 displays elevated lactone levels in human blood and potent anticancer activity, Journal of Controlled Release, 74 (2001), s. 325-333 39. Burke T.G., Mishra A.K., Wani M.C., Wall M.E. Lipid bilayer partitioning and stability of camptothecin drugs, Biochemistry, 32(1993), s. 5352-5364 162 Kampotecyna i jej pochodne. Obiecujące substancje lecznicze chorób nowotworowych na miarę XXI wieku 40. Burke T.G., Staubus A.E., Mishra A.K., Malak H. Liposomal stabilization of camptothecin’s lactone ring, Journal of the American Chemical Society, 114(1992), s. 8318-8319 41. Kruszewski S., Ziomkowska B., Cyrankiewicz M., Latus L., Bom D. Applications of dynamic light scattering, fluorescence microscopy and fluorescence spectroscopy in DB-67 liposomal formulation studies, Proceedings of SPIE, 5945(2005), s. 419-423 42. Cortesi R., Esposito E., Maietti A., Menegatti E., Nastruzzi C. Formulation study for the antitumor drug camptothecin: liposomes,micellar solutions and microemulsion, International Journal of Pharmaceutics, 159 (1997), s.95-103 43. Cortesi R., Nastruzzi C. Liposomes, micelles and macroemulsions as new delivery systems for cytotoxic alkaloids, Pharmascentical Science and Technology Today, 2(1999), s. 288-298 44. Ulukan H., Swaan P. W. Camptothecins. A review of their chemotherapeutic potential, Drugs, 62(2002), s. 2039-2057 45. www. bazalekow. mp.pl/leki/doctor_subst.html?id=3525 46. Cragg G. M., Kingston D. G., Newman D. J., Taylor & Francis Group Anticancer agents from natural products, (2005), s. 5-127 47. Jeziorski K.Leki stosowane w farmakoterapii nowotworów przewodu pokarmowego; Gastroenterologia Kliniczna 1(2011), 9-16 48. Pommier Y.Topoisomerase I inhibitors: camptothecins and beyond, Nature Reviews Cancer, 6(2006), s. 789-802 49. Nitiss J., Wang J. C. DNA topoisomerase targeting antitumor drugs can be studied in yeast, Proceedings of the National Academy of Sciences, 85(1988), s. 7501-7505 50. Pommier Y., Pourquier P., Urasaki Y., Wu J., Laco G. S. Topoisomerase I inhibitors: selectivity and cellular resistance, Drug Resistance Updates, 2(1999), s. 307-318 Kamptotecyna i jej pochodne. Obiecujące substancje lecznicze chorób nowotworowych na miarę XXI wieku Streszczenie Kamptotecyna (CPT) to substancja pochodzenia roślinnego. Jest to alkaloid uzyskiwany z drzewa Camptotheca acuminana. Należy do grupy substancji cytostatycznych, czyli do związków, których zasada działania opiera się na ingerowaniu w fazy cyklu komórkowego, przez co dochodzi do wstrzymania rozwoju komórki i jej podziałów, a w konsekwencji do apoptozy. Kamptotecyna należy także do inhibitorów topoizomerazy I, dzięki którym dochodzi do powstania jednoniciowych fragmentów DNA, blokujących widełki replikacyjne. Pochodne CPT takie jak irinotekan czy topotekan, ze względu na lepsze wyniki w badaniach klinicznych, mniejszą toksyczność wywieraną na komórki zdrowe, jak i ze względu na bardziej swoiste działanie są używane jako leki w chemioterapii przeciwnowotworowej. Sama kamptotecyna ze względu na szereg działań niepożądanych i zbyt dużą toksyczność, nie jest bezpośrednio wykorzystywana w lecznictwie. 163 Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska Campthotecin and its derivatives. The promissing therapeutic substances of cancer in the 21st century Abstract Camptothecin is a substance of a vegetable origin. It is an alkaloid which is produced of the Camptotheca acuminata tree. It belongs to the chemotherapeutic agents, that is to the compounds which work by the interfering the cell cycle. Because of it the development of the cell and its division is suspended. The consequence of it is the apoptosis. The camptothecin also belongs to the Inhibitors of Topoisomerase I, through which singlestranded DNA fragments are produced. They block the replication forks. The derivatives of CTP such as irinotecan and topotecan decrease the toxicity which is exerted on the healthy cells. They are also used as drugs in anticancer chemotherapy. The camptothecin it self, because of the many adverse drug reactions and its toxicity, is not used directly in therapeutics. 164 Anna Wawruszak1, Karolina Okła2, Sylwia Bilska3 Antynowotworowe działanie Lycium barbarum w modelu raka piersi 1. Wstęp Choroby nowotworowe od dawna dziesiątkują ludność w większości krajów świata. Epidemiologiczne dane statystyczne wskazują na wysokie zróżnicowanie geograficzne zapadalności na tę niezwykle poważną chorobę. W ostatnich latach nastąpiła istotna zmiana w sposobie postrzegania natury samego raka. Jeszcze nie tak dawno nowotwór utożsamiany był z miejscową zmianą chorobową, z biegiem czasu pogląd ten diametralnie uległ zmianie. Aktualnie przyczyn raka doszukuje się w rozregulowaniu licznych przemian metabolicznych i szlaków sygnałowych zlokalizowanych w całym ciele chorego. Standardowa radio- i chemioterapia wykazują wiele działań niepożądanych, dlatego też poszukuje się nowych, mniej szkodliwych, profilaktycznych i leczniczych strategii terapeutycznych. Nadzieję upatruje się w szeroko pojętej chemoprewencji mającej na celu przeciwdziałanie lub zahamowanie procesu kancerogenezy we wczesnych jej etapach. Baczną uwagę zwraca się przede wszystkim na składniki naturalne, które charakteryzują się łatwą dostępnością, taniością i niską toksycznością w stosunku do komórek prawidłowych. Rak piersi jest najczęściej występującym nowotworem wśród kobiet zarówno w Polsce, jak też w większości krajów świata. Na przestrzeni dwóch ostatnich dziesięcioleci odnotowano blisko trzydziestoprocentowy wzrost współczynników zapadalności na raka gruczołu piersiowego. Jak dotąd wszystkie czynniki ryzyka zachorowania na ten nowotwór nie zostały do końca wyjaśnione [1†3]. Dlatego też poszukuje się nowych związków biologicznie aktywnych przedłużających lub ratujących życie pacjentek cierpiących na raka sutka. Jednym z obiecujących działań na rzecz zmniejszenia ryzyka wystąpienia nowotworu jest chemoprewencja. 1 [email protected], Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 2 [email protected], I Katedra i Klinika Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii, I Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 3 [email protected], Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, I Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 165 Anna Wawruszak, Karolina Okła, Sylwia Bilska Większość związków o działaniu chemoprewencyjnym to składniki ekstraktów roślinnych. 2. Cel pracy Celem poniższej pracy jest analiza i ocena antynowotworowych właściwości jagód Lycium barbarum (Goji berry)w modelu raka piersi. 3. Rak piersi – czynniki ryzyka, zróżnicowanie histologiczne, czynniki predykcyjne Wśród licznej grupy czynników ryzyka raka gruczołu sutkowego wyróżnia się między innymi płeć żeńską, starszy wiek, mutacje genów BRCA1 i BRCA2, obciążenie rodzinne (szczególnie w odniesieniu do krewnych I-stopnia z rozpoznaniem we wczesnym wieku) oraz stwierdzoną atypową hiperplazją przewodową (ADH) [4, 5]. Rak piersi w grupie mężczyzn obserwowany jest wyjątkowo rzadko i nie stanowi problemu globalnego (2,360 przypadków w USA w 2014 roku), jednakże ze względu na niską częstość występowania wykrywa się go zazwyczaj w stadiach wysoce zaawansowanych [6]. Pozostałe czynniki związane ze zwiększoną predyspozycją do rozwoju raka sutka zestawiono w Tabeli 1. 166 Antynowotworowe działanie Lycium barbarum w modelu raka piersi Tabela 1. Czynniki ryzyka rozwoju raka piersi RYZYKO WZGLĘDNE > 4.0 2.1 > 4.0 1.1 – 2.0 (czynniki związane ze „stanem hormonalnym”) 1.1 – 2.0 (inne czynniki) CZYNNIK Płeć żeńska Starszy wiek Mutacje genów BRCA1 i BRCA2 Dwie lub więcej krewne I-stopnia z rakiem piersi rozpoznanym w młodym wieku Przebyty rak piersi w wywiadzie „Wysoka gęstość” piersi Atypowa hiperplazja Jedna krewna I-stopnia z rakiem piersi w wywiadzie Ekspozycja na promieniowanie jonizujące Wysoka gęstość kości (pomenopauzalna) Późna pierwsza donoszona ciąża (>30 lat) Wczesna miesiączka (<12 lat) Późna menopauza (>55 lat) Brak donoszonej ciąży Brak karmienia piersią w wywiadzie Długotrwałe stosowanie doustnych środków antykoncepcyjnych Długotrwałe stosowanie hormonalnej terapii zastępczej (HTZ) Otyłość (pomenopauzalna) Przebyty rak endometrium, rak jajnika lub rak jelita grubego w wywiadzie Wysokie spożycie alkoholu Wysoki wzrost Wysoki status społeczny Źródło: Opracowanie własne na podstawie [2] Najczęstszym typem histologicznym raka piersi jest, stanowiący około 90% wszystkich przypadków, rak przewodowy [5]. Zarówno rak przewodowy jak i rak zrazikowy, w początkowym etapie rozwoju, to tzw. carcinoma in situ, czyli rak przedinwazyjny charakteryzujący się niskim stopniem złośliwości oraz brakiem nacieku okolicznych tkanek. Wśród pozostałych typów histologicznych o dobrym rokowaniu wyróżnia się raka rdzeniastego oraz raka śluzowatego. Rak inwazyjny jest kolejnym etapem progresji raka przewodowego i zrazikowego. Naciekanie podścieliska oraz dobrze rozwinięty system naczyń limfatycznych i krwionośnych w obrębie piersi promuje zajmowanie pobliskich węzłów chłonnych oraz przerzutowanie do odległych tkanek i narządów [2,5]. Raka z komórek sygenetowatych, raka metaplastycznego oraz raka zapalnego piersi charakteryzuje wysoka inwazyjność, a także oporność na standardowe 167 Anna Wawruszak, Karolina Okła, Sylwia Bilska strategie terapeutyczne, co przekłada się na złe rokowania dla pacjentek, u których wykryto ten typ nowotworu [4, 7, 8]. Fenotyp raka gruczołu sutkowego uzależniony jest między innymi od wieku chorych, stopnia zaawansowania choroby oraz stanu menopauzalnego [9]. Ekspresję receptorów estrogenowych (ER) oraz progesteronowych (PgR) w komórkach nowotworowych stwierdza się u około 60% pacjentów. Grupa o fenotypie ER/-/PgR/-/ stanowi około 20% wszystkich chorych. Obecność receptorów estrogenowych i progesteronowych jest ważnym czynnikiem predykcyjnym umożliwiającym włączenie terapii hormonalnej (leczenie pochodnymi tamoxifenu) z wysokim stopniem odpowiedzi [4, 9]. Innym, rutynowo oznaczanym białkiem w diagnostyce raka sutka jest receptor dla ludzkiego epidermalnego czynnika wzrostu (Her-2/neu). Nadmierną ekspresję lub mutację w obrębie genu HER-2 stwierdza się u około 25% chorych. Pomimo wskazania i możliwości leczenia trastuzumabem obecność Her-2/neu jest najprawdopodobniej złym czynnikiem rokowniczym. Fenotyp potrójnie ujemny charakteryzuje się agresywnym przebiegiem klinicznym, szybkim wzrostem guza oraz szybkimi wznowami. Gorsze rokowania w tej grupie pacjentów związane są również z brakiem możliwości zastosowania terapii hormonalnej oraz terapii skierowanej na HER-2. W tym przypadku konieczny jest odpowiedni dobór leczenia, uzależniony od konkretnych zaburzeń sygnalizacyjnych w obrębie komórki nowotworowej [4, 10, 11]. 4. Chemoprewencja. Aktywność biologiczna składników zawartych w owocach Lycium barbarum Chemoprewencja polega na stosowaniu substancji (głównie pochodzenia naturalnego) w celu opóźnienia, zahamowania lub odwrócenia procesu kancerogenezy. W ostatnich dziesięcioleciach odkryto i opisano kilkaset związków o działaniu chemoprewencyjnym. Podstawową cechą tych związków jest brak toksycznego działania w stosunku do komórek prawidłowych, co czyni je niezwykle obiecującymi związkami bioaktywnymi, mogącymi znaleźć zastosowanie w profilaktyce i leczeniu chorób nowotworowych [12†14]. Jagody goji zwane „najzdrowszymi owocami świata”, to owoce kolcowoju pospolitego (Lycium barbarum)pochodzące z obszarów Azji, wykazujące szereg korzystnych właściwości pozytywnie wpływających na organizm człowieka. W badaniach eksperymentalnych wykazano immunomodulujące, antyangiogenne, antyoksydacyjne, neuroprotekcyjne, przeciwzapalne czy antyproliferacyjne działanie substancji aktywnych zawartych w jagodach goji [12†15]. 168 Antynowotworowe działanie Lycium barbarum w modelu raka piersi 4.1. Działanie immunomodulujące Liczne dotychczas opublikowane doniesienia literaturowe potwierdziły immunomodulujące działanie bioaktywnych związków izolowanych z owoców Lycium barbarum. Gan i wsp. wykazali, że kompleks białkowopolisacharydowy (LBP3P) indukuje wzrostekspresji czynnika martwicy nowotworów (TNFα) orazinterleukiny 2 (IL-2). Interleukina 2 to peptydowy mediator tkankowy, wytwarzany przez limfocyty T pomocnicze. IL-2 stymulujeaktywność komórek NK oraz limfocytów T supresorowych. Czynnik martwicy nowotworów, to cytokina wielofunkcyjna produkowana przede wszystkim przez aktywowane limfocyty i makrofagi w miejscu stanu zapalnego. TNFα razem z interleukiną 1 i 6 bierze udział w miejscowej i układowej reakcjizapalnej. Czynnik ten wykazuje także właściwości antynowotworowe, pełniąc funkcję inhibitora neowaskularyzacji i angiogenezy, a także induktora apoptozy [16]. W badaniach wykazano, że polisacharyd Goji berry (LBP), a w szczególności jego subfrakcjeLBPF4 i LBPF5 indukują interferonγ, czynnik jądrowy aktywowanych limfocytów T (NFAT), a także stymulują limfocyty T pomocnicze do produkcji i wydzielaniaspecyficznych cytokin [16, 17]. Polisacharyd Lycium barbarum poprzez aktywację makrofagów jestw stanie ponadtozwiększać wrodzoną odporność nieswoistą. Makrofagi w procesach immunologicznych pełnią funkcję zarówno komórek efektorowych(cytotoksycznych),komórek prezentujących antygen, jak też komórek modulujących odpowiedź immunologiczną (odporność komórkowa) (Rysunek 1.) [17]. Rysunek 1. Skutki aktywacji makrofagów w organizmie [18] 169 Anna Wawruszak, Karolina Okła, Sylwia Bilska 4.2. Działanie przeciwzapalne Rozwój zaawansowanej biochemii klinicznej oraz biologii nowotworów umożliwił poznanie licznych mechanizmów zaangażowanych w powstanie stanu zapalnego mikrośrodowiska guza. Statystyczne dane epidemiologiczne potwierdziły udział przewlekłych infekcji i związanego z nimi stanu zapalnego w etiopatogenezie blisko 15% wszystkich nowotworów. W rozwój reakcji ostrej fazy zaangażowane są liczne cytokiny prozapalne, uwalniane przez makrofagi i limfocyty (interleukiny 1, 6, 8, 18, czynnik martwicy nowotworów (TNF-α). Związki te wpływają na procesy angiogenezy i proliferacji, a także uczestniczą w mechanizmach prowadzących do uzyskania inwazyjnego fenotypu czy tworzenia przerzutów odległych, a także chemooporności.Indukcja stanu zapalnego w przebiegu chorób nowotworowych wiąże się ze wzrostemsyntezy prostaglandyn, które poprzez działanie immunosupresyjne mogą indukować proces przerzutowania. Proces transformacji nowotworowej wiąże się ze zwiększeniem ekspresji cyklooksygenazy-2 (COX-2) – enzymu uczestniczącego w syntezie prostaglandyn. Wzrost ekspresji COX-2 zaobserwowano w wielu typach nowotworów, w tym w raku gruczołu piersiowego [19]. Badania w modelu in vitro wykazały hamujący wpływ ekstraktu Lucium barbarumna syntezę cyklooksygenazy-2 i powstanie stanu zapalnego[20]. 4.3. Działanie antyoksydacyjne Wolne rodniki tlenowe to indywidua chemiczne, które posiadają na swojej powłoce walencyjnej niesparowany elektron. Ich powstawanie wiąże się zarówno ze stanami fizjologicznymi, jak też patologicznymi, np. nadmierna produkacja wywołana stresem oksydacyjnym. Do reaktywnych form tlenu (RFT) należą: rodnik hydroksylowy, anionorodnik ponadtlenkowy, nadtlenek wodoru czy tlen singletowy. Wśród skutków stresu osydacyjnego wymienić można wzrost intensywności i tempa peroksydacji lipidów, wzmożony katabolizm nukleotydów adeninowych, obniżenie poziomu glutationu i ATP,uszkodzenie mitochondriów, zwiększenie przepuszczalności i depolaryzacja błon komórkowychzaburzenie wewnątrzkomórkowej homeostazy wapnia, uszkodzenie DNA czy zmiana właściwości antygenowych komórek [21, 22]. Cui i wsp. wykazali, że polisacharyd wyizolowany z owoców Lycium barbarum jest w staniehamować peroksydację lipidówspowodowaną aktywnością wolnych rodników tlenowych. Peroksydacja lipidów, to wolnorodnikowy proces utleniania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych lub reszt wielonienasyconych kwasów tłuszczowych wchodzących w skład fosfolipidów, podczas którego dochodzi do powstania toksycznychnadtlenkówuszkadzających struktury komórkowe [16, 22]. 170 Antynowotworowe działanie Lycium barbarum w modelu raka piersi Badania w modelach in vivo wykazały, że w surowicy pacjentów, którym podawano polisacharyd wyizolowany z jagód goji, odnotowano blisko 9,9% wzrost poziomu aktywności peroksydazy glutationowej oraz 8,4% wzrost poziomu stężenia dysmutazy ponadtlenkowej. Dysmutaza ponadtlenkowa jest enzymem katalizującym reakcję dysmutacji dwóch cząsteczek anionorodnika ponadtlenkowego do tlenu i nadtlenku wodoru, ktróry następnie rozkładany jest przez katalazy i peroksydazy, przez co enzym ten stanowi główny element tzw. „pierwszej linii obrony” komórek przed szkodliwym działaniem reaktywnych form tlenu [16]. 4.4. Działanie proapoptotyczne i antyangiogenne Antynowotworowe działanie związków aktywnych zawartych w jagodach Goji polega w głównej mierze na zahamowaniu proliferacji komórek, aktywacji procesów apoptotycznych,zatrzymaniu cyklu komórkowego w określonych punktach kontrolnych, regulacji szlaków transdukcji sygnałów oraz przeciwdziałaniu procesom proangiogennym [16,23]. Apoptoza jest jednym z mechanizmów obronnych, polegającym na usuwaniu uszkodzonych lub zbędnych komórek, w tym komórek nowotworowych. Proces ten wiąże się z ekspresjąlicznych genów oraz aktywacją kaskady enzymów proteolitycznych. Niemożność wejścia komórki na drogę samobójczej śmierci prowadzić może w konsekwecji do rozwoju procesu kancerogenezy. W badaniacheksperymentalnych wykazano właściwości proapoptotyczne polisacharyduwyizolowanego z jagód Goji w stosunku do wielu linii nowotworowych (rak piersi, wątrobowokomórkowy, prostaty czy jelita grubego). Odnotowano takżeznaczący spadek stosunku ekspresji genów Bcl2/Bax w komórkach traktowanych LBP [16, 24]. W badaniach na innych nowotworach wykazano, że wysokie dawki ekstraktu z jagód Goji (>5g/L) indukują apoptozę poprzez stymulację białka p53. Białko to pełni funkcję supresora nowotworowego, zaangażowanego w regulację wielu procesów komórkowych, w tym w indukcję apoptozy oraz aktywację naprawy uszkodzeń DNA. Wykazano ponadto, że skopoletyna (składnik aktywny zawarty w jagodach Goji) indukowała apoptozę w komórkach linii HL-60 poprzez aktywację kaspazy 3 oraz czynnika NFκB [16]. Antynowotworowy efekt substancji zawartych w jagodach Goji obejmuje także zdolność do hamowania cyklu komórkowego w ściśle określonych punktach. Za prawidłowy przebieg zdarzeń w każdej fazie cyklu komórkowego odpowiadają punkty kontrolne. Wykazano, że w komórkach nowotworowych prawidłowe funkcjonowanie tych punktówmoże być często zmienione lub zaburzone. Zmiany w działaniu mechanizmów kontrolnych 171 Anna Wawruszak, Karolina Okła, Sylwia Bilska regulujących progresję cyklu komórkowego przyczyniają się do stałej proliferacji komórek nowotworowych. W badaniach wykazano, że LBP hamuje ekspresję insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF-1) stymulującego proliferację komórek linii MCF-7 w sposób dawko- i czasozależny [16, 24]. Związki aktywne zawarte w Lycium barbarum hamowały także ekspresję kinazy PI3K, wpływając na szlak PI3K/Akt/mTOR. Szlak ten zaangażowany jest w procesy komórkowe związane z naciekaniem, wzrostem i proliferacją komórek nowotworowych [16]. Angiogeneza to proces prowadzący do powstawania sieci naczyń krwionośnych na bazie już istniejących. Proces angiogenezy regulowany jest przez wiele czynników o charakterze pro- i antyangiogennym. Do czynników proangiogennych należypłytkowy czynnik wzrostu (PDGF), naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF), zasadowy i kwaśny czynnik wzrostu fibroblastów (angiogenina, bFGF/aFGF oraz metaloproteinazy) [79]. W przeprowadzonych badaniach wykazano hamujący wpływ ekstraktu z jagód goji na ekspresję naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF) oraz czynnika proangiogennego HIF-1α [16]. 5. Podsumowanie Rokrocznie z powodu raka piersi umiera około 5 tysięcy Polek. Wysoka toksyczność chemio- i radioterapii, a także oporność komórek nowotworowych na powszechnie stosowane cytostatyki przyczyniła się do poszukiwania i opracowywanianowych strategii terapeutycznych w profilaktyce i leczeniu choróbnowotworowych.Nadzieję upatruje się w związkach pochodzenia naturalnego, które byłyby nie tylko w stanie wyeliminować komórki nowotworowe, a także wykazywałyby ochronny wpływ na komórki prawidłowe. Substancje aktywne wyizolowane z owoców Lycium barbarum, ze względu naswoje udokumentowane właściwości antynowotworowe, mogą stać sięw przyszłości cennym terapeutykiem w leczeniu pacjentów cierpiących na raka gruczołupiersiowego. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. Kornafel J. Rak piersi, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Warszawa, 2011 Ferlayiwsp J.. D.M. GLOBOCAN 2002: Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide IARC CancerBase. IARCPress, Lyon, 2004 Garcia M. i wsp.: Global Cancer Facts & Figures 2007; GA: American Cancer Society, Atlanta, 2007 http://eu.cmkp.edu.pl/css_bart/dok_eu/Rak%20piersi%20A-II.pdf Makowski M., Połać I., Pertyński T. Estrogeny a rak sutka, Przegląd Menopauzalny, 3 (2007), s. 150-154 Siegel R., Ma J., Zou Z., Jemal A. Cancer Statistics 2014, CA: A Cancer Journal for Clinicans, 64 (2014), s. 9-22 172 Antynowotworowe działanie Lycium barbarum w modelu raka piersi 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. Alvarez R.H., Dawood S., Cristofanilli M.Inflammatory Breast Cancer, Breast Disease: Comprehensive Management, (2015), s. 223-234 Weigelt B., Eberle C., Cowell C.F., Ng C.K., Reis-Filho J.S. Metaplastic breast carcinoma: more than a special type, Nature Reviews Cancer, 14 (2014), s. 147-148 Piekarski J. Receptory estrogenowe i progesteronowe w raku piersi – współczesny stan wiedzy, Współczesna Onkologia, 9 (2005), s. 371-379 Ryś J., Kruczak A. Potrójnie ujemny rak sutka (triple-negative breast cancer) – jednorodna czy heterogenna grupa nowotworów?, Polish Journal of Pathology, 65 (2014), s. 53-61 Nowacka-Zawisza M., Krajewska W.M. Potrójnie negatywny rak piersi: molekularna charakterystyka i potencjalne strategie terapeutyczne, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 67 (2013), s. 1090-1097 Pravin T. i wsp. Peptide Vaccines and Targeting HER and VEGF Proteins May Offer a Potentially New Paradigm in Cancer Immunotherapy, Future Oncology, 8(2012), s. 961-987 Baer-Dubowska W. Chemoprewencja – profilaktyka i terapia wspomagana raków, Postępy Chirurgii Głowy i Szyi 2 (2013), s. 3-14 Mingliang J. i wsp. Biological activities and potential health benefit effects of polysaccharides isolated from Lyciumbarbarum L, International Journal of Biological Macromolecules 54 (2013), s. 16-23 Harunobu A. i wsp. A review of botanical characteristics, phytochemistry, clinical relevance in efficacy and safety ofLyciumbarbarumfruit (Goji), Food Research International 44 (2011), s. 1702-1717 Gan L.i wsp.Biological activities and potential health benefit effects of polysaccharides isolated from Lyciumbarbarum L, European Journal of Pharmacology 407 (2003), s. 217-222 Chen Z. i wsp. Activation of macrophages by polysaccharide–protein complex from Lycium barbarum L, Phytotherapy Research 3008(2009), s. 1116-1122 http://www.staff.dtu.dk/mata/BioActivity/Antitumoractivity Badowska-Kozakiewicz A.Rola cyklooksygenazy-2 w onkologii weterynaryjnej, ŻycieWeterynaryjne, 11 (2011), s.76-82 Navindram S. Berry Fruits for Cancer Prevention: Current Status and Future Prospects,Journal of Agricultural and FoodChemistry 56 (2008), s. 630-635 Dreher D., Junod A.F. Role of oxygen free radicals in cancer development, European Journal of Cancer, 96 (1996), s. 30-38 Nianwu H. i wsp. Characterisation of antioxidant and antiproliferative acidic polysaccharides from Chinese wolfberry fruits, Food Chemistry133 (2012), s. 978-989 Harunobu A. i wsp. A review of botanical characteristics, phytochemistry, clinical relevance in efficacy and safety ofLyciumbarbarumfruit (Goji, Food Research International 44 (2011), s. 1702-1717 Lu Q. i wsp. Lyciumbarbarum polysaccharides induce apoptosis in human prostate cancer cells and inhibits prostate cancer growth in a xenograft mouse model of human prostate cancer, Journal of Medicinal Food 12 (2009), s. 695-703 Kowalewska-Celejewska M. Angiogenina i czynniki proangiogenne jako marker i cel terapii nowotworowych, Forum Medycyny Rodzinnej 6 (2011), s. 68-7 173 Anna Wawruszak, Karolina Okła, Sylwia Bilska Antynowotworowe działanie Lycium barbarum w modelu raka piersi Streszczenie Rak piersi jest najczęściej występującym nowotworem wśród kobiet zarówno w Polsce, jak też w większości krajów świata. Na przestrzeni ostatnich dwudziestu lat odnotowano blisko trzydziestoprocentowy wzrost współczynników zapadalności na raka gruczołu piersiowego. Dlatego też poszukuje się nowych rozwiązań terapeutycznych przedłużających lub ratujących życie pacjentek cierpiących na ten typ nowotworu. Jednym z obiecujących działań na rzecz zmniejszenia ryzyka wystąpienia raka piersi jest chemoprewencja.Większość związków o charakterze chemoprewencyjnym, to składniki ekstraktów roślinnych. Jagody goji, zwane „najzdrowszymi owocami świata”, to owoce kolcowoju pospolitego (Lycium barbarum)charakteryzujące się niezwykle wysoką aktywnością biologiczną. W licznych badaniach potwierdzono antyoksydacyjne, immunomodulujące i przeciwzapalne działanie związków bioaktywnych zawartych w owocach Lycium barbarum. Anti-cancer effect of Lyciumbarbarum in a model of breast cancer Abstract Breast cancer is the most common cancer among women in Poland, as well as in most of the world. Over the last twenty years there has been close 30% growth factors in the incidence of breast cancer. Therefore, is sought for new therapeutic solutions prolonge dorlife-saving patients suffering from this type of cancer.One promising measures to reduce the risk of breast cancer is chemoprevention. Most of the chemopreventic compounds are the ingredients of plant extracts. Goji berries, known as “the healthiest fruits in the world”, it is common fruits goji (Lycium barbarum), characterized by extremely high biological activity. Numerous studies have confirmed the antioxidant, immunomodulatory, andanti inflammatory effects of bioactive compoundsin fruits of Lycium barbarum. 174 Hanna Pudło1, Malwina Respondek2,Lucyna Szefczyk-Polowczyk3 Wpływ diety na występowanie raka piersi 1. Wstęp Pomimo odnotowanego w ostatnim dziesięcioleciu zmniejszenia umieralności z powodu nowotworu piersi, zachorowalność na ten nowotwór stale się zwiększa. Według raportów Światowej Organizacji Zdrowia w większości krajów, w tym w Polsce, rak piersi jest jedną z najważniejszych przyczyn przedwczesnej umieralności kobiet [1-3]. Sposób żywienia ma znaczenie w patogenenezie wielu nowotworów złośliwych [2]. Ocenia się, że około 20-30% wszystkich nowotworów złośliwych to nowotwory dietozależne, w rozwoju których istotne znaczenie mają czynniki żywieniowe [3]. Do tych nowotworów zalicza się m.in. nowotwór piersi, jelita grubego przełyku, żołądka i trzustki. Jako czynniki żywieniowe predysponujące do wystąpienia nowotworów wymienia się przede wszystkim otyłość, nadmierne spożycie tłuszczów, niedostateczną ilość błonnika pokarmowego, niskie spożycie wapnia i witamin antyoksydacyjnych oraz wysokie spożycie sodu [4]. Do czynników mających wpływ na występowanie nowotworów można zaliczyć również zanieczyszczenie żywności toksynami, metalami ciężkimi, jej nieprawidłowe przygotowanie jak i przechowywanie oraz nadmierne spożywanie alkoholu [5]. Nowotwór piersi stanowi światowy problem zdrowotny kobiet w każdym wieku. Rak piersi ma złożoną etiologię, istnieje szereg czynników mających wpływ na jego rozwój [3]. Wiek kobiety to najważniejszy, niezależny czynnik zachorowania na nowotwór piersi [3, 4]. Stwierdzono że, większa ekspozycja na żeńskie hormony płciowe zwiększa ryzyko zachorowania [3, 6]. Czynniki genetyczne odpowiadają za około 510% przypadków raka piersi [6, 7]. W patogenezie raka piersi najlepiej udokumentowana jest rola genów BRCA 1 i BRCA 2 [8]. 1 [email protected], Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Studium Doktoranckie Wydziału Zdrowia Publicznego w Bytomiu 2 [email protected], Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Studium Doktoranckie Wydziału Zdrowia Publicznego w Bytomiu http://www.slam.katowice.pl 3 [email protected] Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Studium Doktoranckie Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu 175 Hanna Pudło, Malwina Respondek,Lucyna Szefczyk-Polowczyk Wyniki większości badań epidemiologicznych wskazują, że prawidłowa dieta może chronić przed nowotworem piersi a racjonalne żywienie może również poprawić rokowania już chorujących kobiet [6, 9, 10]. Jednym z podstawowych czynników powodujących wzrost zachorowalności na nowotwory złośliwe jest otyłość [11-13]. Obserwuje się stały wzrost liczby osób otyłych, zarówno w krajach Europy Zachodniej, Stanach Zjednoczonych jak również w Polsce [12, 13]. Badania epidemiologiczne prowadzone w Polsce wskazują, że w grupie wiekowej od 35 do 64 roku życia 30-38% kobiet ma nadwagę, a otyłość 19-30% kobiet [11]. Wielu autorów badających wpływ otyłości na leczenie i rokowanie w nowotworach złośliwych podkreśla, że otyłość może mieć związek z pogorszeniem rokowań w nowotworze piersi [14-20]. Ryzyko zgonu kobiet z nowotworem piersi z wartością BMI powyżej 40 kg/m2 jest ponad trzykrotnie wyższe niż u kobiet z nowotworem piersi, których wartość wskaźnika BMI kształtuje się na poziomie 18,5-20,5 kg/m2 [17]. Badania potwierdzają również, że u chorych z cukrzycą nowotwór piersi występuje o około 50-70% częściej niż w ogólnej populacji [21-26]. Wpływ na ryzyko zachorowania na nowotwór piersi ma szczególnie ilość i jakość spożywanych tłuszczów. Wykazano protekcyjny wpływ kwasów omega-3 na rozwój raka piersi [6]. Ich spożywanie w ilości większej lub równej 40 g/dobę może zmniejszyć ryzyko raka piersi nawet o 30%. Dane te mogą w pewnym stopniu tłumaczyć różnice w zachorowalności na raka piersi w różnych populacjach na świecie, zależnie od diety [6, 27]. O wpływie na ryzyko wystąpienia raka piersi decyduje głównie ilość tłuszczów pochodzenia rybiego kwasu dokozaheksaenowego (DHA) i kwasu eikozapentaenowego (EPA) [28, 29]. W 2001 roku stwierdzono, że wielonienasycone kwasy tłuszczowe omega-6 sprzyjają rozwojowi raka piersi po menopauzie, a tłuszcze wielonienasycone omega-3 przeciwdziałają występowaniu nowotworów [20, 30]. Badania epidemiologiczne oraz eksperymenty na zwierzętach i hodowlach tkankowych udowodniły, że istnieje związek między spożyciem tłuszczów a zapadalnością na nowotwór piersi [28-30]. Wykazano, że zwiększona ilość tłuszczu w diecie wpływa na rozwijanie się nowotworów u szczurów i myszy [31-35]. Badano również wpływ na występowanie nowotworu piersi dostarczanych z dietą witamin oraz mikro i makroelementów [36]. Stwierdzono, że przy rosnącej podaży potasu, karotenoidów, kwasu foliowego, witaminy C, E, B6 w dziennej racji pokarmowej, ryzyko wystąpienia raka piersi zmniejsza się [25, 36]. Niekorzystny wpływ ma natomiast spożywanie nadmiernej ilości alkoholu. Konsumpcja powyżej 30g alkoholu etylowego dziennie zwiększa ryzyko występowanie nowotworu piersi o 30-50% [2, 37]. 176 Wpływ diety na występowanie raka piersi Strategia Walki z Rakiem w Polsce na lata 2015-2024 uznaje profilaktykę pierwotną w tym zmianę sposobu żywienia za jedno z głównych wyzwań dla zdrowia publicznego a edukacja na temat zdrowego odżywienia oraz aktywności fizycznej należy do podstawowych działań mających na celu zmniejszenie występowania nowotworów [38]. 2. Cel pracy Celem pracy jest przegląd najważniejszych żywieniowych czynników występowania raka piersi w celu identyfikacji zagrożeń wynikających z nieprawidłowej diety. 3. Najważniejsze czynniki ryzyka raka piersi Od wielu lat w Polsce obserwuje się szybki wzrost zachorowań na nowotwory. Według Krajowego Rejestru Nowotworów w 2011 roku zachorowało na nowotwory 144 300 osób i stwierdzono ponad 92 500 zgonów z tego powodu [38]. Zachorowalność na nowotwory wzrasta na całym świecie. Komitet Ekspertów WHO, podsumowując stan wiedzy o epidemiologii nowotworów złośliwych, stwierdził, że znaczna ich część jest wynikiem stylu życia i środowiska. Za występowanie blisko 30% wszystkich raków na świecie odpowiedzialne są czynniki żywieniowe [39]. Według Food, Nutrition and the Prevention of Cancer (dane z Amerykańskiego Instytutu Badań nad Rakiem) odsetek ten dochodzi nawet do 40%. Nieprawidłowe odżywianie jest – po paleniu tytoniu – drugą przyczyną chorób nowotworowych u około 20 milionów ludzi. Szacuje się, że w krajach rozwijających się zachorowalność z tego powodu wzrośnie w ciągu 20 lat o 10 milionów osób [40]. Najważniejszymi modyfikowalnymiczynnikami ryzyka nowotworów złośliwych są: kontrola masy ciała, sposób odżywiania i poziom aktywności fizycznej. Dane naukowe wskazują, że 1/3 z ponad 500 000 zgonów z powodu nowotworów złośliwych w USA można przypisać nieodpowiedniej diecie i niedostatecznej aktywności fizycznej, a przez to także nadwadze i otyłości [41]. American CancerSociety stworzyło wytyczne dotyczące żywienia i aktywności fizycznej w zapobieganiu nowotworom złośliwym oraz zalecenia dotyczące działań społecznych mających na celu ograniczenie występowania nowotworów (Tabela1). 177 Hanna Pudło, Malwina Respondek,Lucyna Szefczyk-Polowczyk Tabela 1. Wytyczne American CancerSociety dotyczące żywienia i aktywności fizycznej w zapobieganiu nowotworom złośliwym Zalecenia ACS dotyczące zachowań indywidualnych Utrzymanie właściwej masy ciała przez całe życie. • Utrzymanie spożycia kalorii odpowiedniego do aktywności fizycznej. • Wystrzeganie się nadmiernego zwiększenia masy ciała przez całe życie. • Osiągnięcie i utrzymanie właściwej masy ciała. Prowadzenie życia aktywnego fizycznie: • Dorośli: uprawiaj umiarkowany lub intensywny wysiłek fizyczny (oprócz zwykłej aktywności) co najmniej przez 30 minut dziennie, 5 lub więcej dni w tygodniu. Najlepiej uprawiać celowy wysiłek fizyczny przez 45-60 minut. • Dzieci i młodzież: uprawiaj umiarkowany lub intensywny wysiłek fizyczny co najmniej przez 60 minut dziennie, 5 lub więcej dni w tygodniu. Stosuj właściwą dietę, ze szczególnym uwzględnieniem produktów roślinnych: • Spożywaj potrawy i napoje w ilościach odpowiednich do osiągnięcia i utrzymania właściwej masy ciała. • Spożywaj codziennie 5 lub więcej porcji różnych warzyw i owoców. • Przedkładaj produkty pełnoziarniste nad przetworzone (rafinowane) ziarna. • Ogranicz spożycie przetworzonego i czerwonego mięsa. Jeśli pijesz napoje alkoholowe, ogranicz ich konsumpcję: • Nie pij więcej niż 1 porcję (kobiety) lub 2 porcje (mężczyźni) alkoholu dziennie. Zalecenia ACS dotyczące działań społecznych Organizacje publiczne, prywatne i lokalne powinny działać na rzecz tworzenia społecznego i fizycznego otoczenia wspomagającego wybór i utrzymanie właściwego odżywiania i aktywności fizycznej. • Należy poprawić dostępność odpowiedniej żywności w szkołach, zakładach pracy i społecznościach lokalnych. • Należy zapewnić bezpieczne, przyjemne i dostępne otoczenie umożliwiające aktywność fizyczną w szkołach, a transport i rekreację w społecznościach lokalnych. Źródło: Wytyczne American CancerSociety dotyczące żywienia i aktywności fizycznej w zapobieganiu nowotworomzłośliwym: zmniejszanie ryzykanowotworów przez wybór prawidłowychnawyków żywieniowych i wysiłek fizyczny [41] 178 Wpływ diety na występowanie raka piersi Rak piersi jest drugim co do częstotliwości występowania nowotworem u kobiet. Pomimo tego że, profilaktyczne badania mammograficzne, ultrasonograficzne i badanie palpacyjne pozwalają wcześnie wykryć zmiany, nadal w dużym odsetku wykrywa się chorobę zaawansowaną, a śmiertelność z powodu tego nowotworu jest duża [6]. Na ryzyko raka piersi wpływa szereg niepoddających się łatwo modyfikacji czynników: wiek pierwszej miesiączki <12 lat, bezdzietność lub pierwszy poród w wieku >30lat, późny wiek menopauzy i występowanie raka piersi w wywiadzie rodzinnym [3-8]. U jednej na dziesięć kobiet z rakiem piersi można stwierdzić występowanie rakapiersi u krewnych I i II stopnia pokrewieństwa. Zidentyfikowano 2 geny BRCA-1 i BRCA-2, których mutacja podwyższa ryzyko raka piersi o 50–80% [8]. Nowe dane wskazują, że ekspozycja na pewne czynniki dietetyczne w ciągu całego życia, może mieć wpływ na ryzyko raka piersi [6]. Do głównych czynników żywieniowych występowania raka piersi można zaliczyć: otyłość; spożycie alkoholu; niedobór kwasu foliowego; zawartość antyoksydantów w diecie; zawartość tłuszczy w diecie; spożycie akryloamidu; insulinoodporności. 3.1. Otyłość Przyczyny otyłości to głównie zbyt mała ilość wysiłku fizycznego oraz zbyt duża liczba przyjmowanych kalorii. Otyłość powoduje wzrost zachorowalności na szereg chorób, w tym także na nowotwory złośliwe, przez co jest powodem zwiększonej umieralności populacji krajów wysoko rozwiniętych [10]. Dane naukowe jednoznacznie wskazują, że zwiększona masa ciała i jej przyrost w dorosłym życiu wiążą się ze zwiększeniem ryzyka raka piersi u kobiet po menopauzie [41]. Nadmierna podaż kalorii oraz niska aktywność fizyczna powodują przyrost tkanki tłuszczowej, która istotnie wpływa na metabolizm estrogenów. W tkance tłuszczowej u kobiet po menopauzie następuje konwersja androstendionu do estrogenów, co może stymulować rozwój raka piersi [14]. Otyłość u dziewczynek może przyspieszyć pojawienie się pierwszej miesiączki, co jest czynnikiem ryzyka rozwoju raka piersi. Niekorzystny wpływ przyrostu masy ciała nie uwidacznia się tak dobrze u kobiet po menopauzie stosujących hormonalną 179 Hanna Pudło, Malwina Respondek,Lucyna Szefczyk-Polowczyk terapię zastępczą, ponieważ mogą go maskować większe stężenia egzogennych estrogenów [14, 15]. Otyłość może mieć również istotne znaczenie w procesie leczenia raka piersi, oraz negatywnie wpływać na nawroty raka oraz proces leczenia [14-16]. Badania chorych na raka piersi po menopauzie ukazują, że BMI jest złym czynnikiem rokowniczym, a ryzyko zgonu chorych z wysokim BMI jest ponad trzykrotnie wyższe niż u chorych z prawidłowym BMI [17]. W dużym opracowaniu z 2001 r. autorzy koreańscy, którzy podsumowali 12 opublikowanych prac, wykazali, że u kobiet z rakiem piersi wysoki BMI jest niezależnym czynnikiem prognostycznym pogarszającym rokowanie [18]. Otyłość zwiększała, niezależnie od innych czynników prognostycznych, ryzyko nawrotu miejscowego oraz wpływała na przeżycia bezobjawowe chorych na raka piersi bez przerzutów w węzłach chłonnych. BMI okazało się także niezależnym czynnikiem wpływającym na długość hospitalizacji. To wszystko powoduje wzrost kosztów leczenia raka piersi u kobiet otyłych [15]. Wykazano, że obniżenie masy ciała zmniejsza ryzyko występowania raka piersi. W zwalczaniu otyłości decydujące znaczenie ma ograniczenie spożywanych kalorii oraz zwiększenie strat energetycznych poprzez wysiłek fizyczny [30]. 3.2. Spożycie Alkoholu Badania ukazują niepokojące dane dotyczące stale rosnącej konsumpcji alkoholu. Alkohol zwiększa ryzyko nowotworów jamy ustnej i gardła, przełyku, krtani, wątroby oraz jelita grubego oraz piersi [11, 42]. Osoby pijące alkohol powinny ograniczyć jego spożycie do nie więcej niż 1 porcji dziennie dla kobiet. Przez porcję alkoholu rozumie się około 350 ml piwa, 140 ml wina albo 40 ml 40% alkoholu destylowanego. Regularne spożywanie nawet kilku porcji alkoholu na tydzień wiąże sięze zwiększonym ryzykiem raka piersi u kobiet szczególnie dużym ryzykiem u tych, które niespożywają wystarczającej ilości kwasu foliowego [6]. Spożywanie 2-5 porcji alkoholu dziennie podwyższa ryzyko rozwoju nowotworu gruczołu piersiowego do 1,4. Kobiety obciążone dużym ryzykiem raka piersi mogą rozważyć powstrzymanie się od spożywania alkoholu [42]. 3.3. Niedobór kwasu foliowego Kwas foliowy jest odmianą witaminy B znajdującą się w wielu warzywach, nasionachstrączkowych, owocach, pełnych ziarnach zbóż i wzbogaconych płatkach zbożowych [41]. Niedobór kwasu foliowego może zwiększać ryzyko raka piersi i jelita grubego, zwłaszcza u osób 180 Wpływ diety na występowanie raka piersi spożywających napoje alkoholowe [45]. Obecne dane wskazują, że do zmniejszania ryzyka nowotworu najlepiej przyczynia się kwas foliowy spożywany w postaci warzyw, owoców i wzbogaconych produktów zbożowych [41, 45, 46]. 3.4. Zawartość antyoksydantów w diecie Badania dowodzą, że substancje przeciwutleniające (antyoksydanty) redukują ryzyko rozwoju raka piersi. Głównymi przeciwutleniaczami są: witamina C, α-tokoferol (witamina E), β-karoten (witamina A), selen, rosweratrol, likopen i polifenole [38,46,48]. • Witamina C – duże dawki mogą wspomagać naturalną odporność na nowotwory. Ponadto witamina ta jest pomocna w odbudowie chorej komórki i tkanki, jak również sprzyja wzmożeniu aktywności leukocytów. Witamina C pewno odgrywa rolę w zapobieganiu chorobie nowotworowej, na tyle wzmacnia organizm, że potrafi on walczyć, zwłaszcza w początkowym stadium choroby [47]. Kwas askorbinowy działa jeszcze skuteczniej, jeżeli podaje się go z witaminą P (rutyna) i PP (niacyna), działając blokująco na związki azotowe. Do najbogatszych źródeł witaminy C należą: natka pietruszki, papryka czerwona, brukselka, brokuły, kalafior, owoce cytrusowe, owoc dzikiej róży, czarne porzeczki [5]; • Witamina E zawarta jest w ziarnach zbóż, zielonych warzywach liściastych, zielonym groszku, kukurydzy, oleju z kiełków pszenicy i kukurydzy. Jest odporna na działanie podwyższonej temperatury i światła. Odgrywa rolę w stabilizacji błon komórkowych i jest wewnątrzkomórkowym antyoksydantem; • β-karoten - jest prekursorem witaminy A, zawarty jest w roślinach o barwie żółtej, zielonej i pomarańczowej, a także w tranie, wątrobie, śmietanie i maśle; • Selen – znajduje się jest w rybach morskich, nieoczyszczonej soli morskiej, wątrobie cielęcej i wołowej, drożdżach, czosnku, kukurydzy. Jego przyswajanie zwiększa obecność witamin E, A i C. Jest składnikiem peroksydazy glutationowej, jako antyoksydant działa wspólnie z witaminą E; • Rosweratrol występuje w winogronach, orzechach i czerwonym winie; • Likopen – znajduje się głownie w pomidorach; • Polifenole – hamującą procesy nitrozylacji, zawarte są w zielonej herbacie i owocu granatu. 181 Hanna Pudło, Malwina Respondek,Lucyna Szefczyk-Polowczyk Niedobór witamin antyoksydacyjnych wpływa na rozwój nowotworów i w znacznej mierze może przyczynić się do zahamowania procesów oksydacyjnych. Wyniki badań wskazują, że osoby spożywające więcej warzyw i owoców będących bogatym źródłem antyoksydantów, mogą być obciążone mniejszym ryzykiem raka piersi [49]. W badaniu kliniczno-kontrolnym 36 944 japońskich kobiet (1186 z rakiem piersi), zaobserwowano np. mniejsze ryzyko tej choroby u kobiet przed menopauzą (445 kobiet) spożywających warzywa często (5 razy lub częściej) ryzyko było o 30% mniejsze w porównaniu z tymi, które spożywały je 2 razy lub rzadziej [50]. Podobne wyniki obniżenia ryzyka występowania raka piersi poprzez zwiększenie spożycia warzyw i owoców zostały uzyskane podczas badania przeprowadzonego w Polsce [49]. Przyjmowanie antyoksydantów w postaci suplementów diety jest przedmiotem trwających aktualnie badań klinicznych. Najlepszą metodą zmniejszenia ryzyka nowotworów jest spożywanie odpowiedniej ilości warzyw i owoców [35, 48]. 3.5. Zawartość tłuszczy w diecie Badania epidemiologiczne oraz eksperymenty na zwierzętach udowodniły, że istnieje związek między spożyciem tłuszczów a zapadalnością na nowotwory [19]. Zarówno w badaniach kliniczno-kontrolnych, jak i kohortowych zaobserwowano, że ryzyko raka piersi jest większe u kobiet, które spożywają więcej tłuszczów nasyconych, a mniejsze u tych, które spożywają w większych ilościach jednonienasycone kwasy tłuszczowe [27, 50]. Uważa się, że dieta z dużą zawartością oliwy z oliwek (w skład której wchodzą głównie jednonienasycone kwasy tłuszczowe) oraz innych tłuszczów roślinnych może być odpowiedzialna za zmniejszenie wskaźników zachorowalności na raka piersi w populacjach śródziemnomorskich. W przypadku kwasów tłuszczowych wielonienasyconych obserwuje się zwiększenie ryzyka zachorowania na raka gruczołu sutkowego wraz ze zwiększaniem ich konsumpcji w diecie, szczególnie zaś kwasów z rodziny n-6. Odwrotne działanie wykazują natomiast kwasy tłuszczowe wielonienasycone n-3, których bogatym źródłem są oleje rybne. Wykazano także ujemną korelację między ryzykiem zachorowania na raka piersi a poziomem długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych z rodziny n-3 w tkance tłuszczowej gruczołu piersiowego [27, 51]. Ilość tłuszczów pochodzenia rybiego, a szczególnie stosunek kwasu dokosaheksaenowego i kwasu eikosapentaenowego może tłumaczyć wyniki badań prowadzone na populacjach Eskimosów zamieszkujących 182 Wpływ diety na występowanie raka piersi Grenlandię czy Alaskę, które wykazały niewielką zapadalność na raka piersi, mimo spożywania bogatotłuszczowej diety [6, 52]. Liczne eksperymenty z udziałem zwierząt potwierdziły obserwacje dokonane na populacjach ludzkich dotyczące hamującego wpływu n-3 WNKT w procesach karcinogenezy [52]. Zaobserwowano zahamowanie wzrostu transplantowanych nowotworów sutka u szczurów, które wcześniej otrzymywały preparat zawierający długołańcuchowe kwasy z rodziny n-3 – EPA i DHA. Porównując wpływ olejów kukurydzianego, słonecznikowego i rybnego na eksperymentalną karcinogenezę gruczołu sutkowego u szczurów stwierdzono hamujące działanie oleju rybnego, a wśród powstałych guzów mniej było złośliwych [53]. Jednocześnie wydłużył się okres utajenia nowotworu, a jego wielkość i masa były mniejsze [51]. 3.6. Spożycie Alryloamidu Akryloamid powstaje w czasie termicznego przetwarzania żywności. Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem uznała akryloamid za związek prawdopodobnie rakotwórczy dla ludzi (2A). Akryloamid wykazuje również działanie neurotoksyczne i genotoksyczne [54] Nowotwór piersi jest jednym z nowotworów, którego występowanie jest łączone z zawartością akryloamidu w diecie, wstępne wyniki badań potwierdzają występującą zależność [55]. Głównym źródłem akryloamidu w diecie są produkty wysoko węglowodanowe poddane obróbce termicznej, takiej jak smażenie, pieczenie, itp. Do produktów zawierających duże ilości akryloamidu zaliczają się przede wszystkim produkty uzyskane z ziemniaków, takie jak frytki, chipsy, a także przetwory zbożowe jak chleb, płatki śniadaniowe [56]. 3.7. Insulinoodporność Insulinoodporność jest podstawowym mechanizmem powstawania cukrzycy typu 2 [22]. U chorych z nowotworem piersi stwierdza się większą częstość występowania cech insulinoodporności niż w populacji ogólnej [22, 23]. Z kolei większe ryzyko zachorowania na nowotwór piersi stwierdza się u osób z nadwagą i otyłych, u których insulinoodporność występuje częściej (ryzyko u osób z BMI>25 jest większe o 30-50%) [22, 24]. U chorych z cukrzycą nowotwór piersi występuje o około 50-70% częściej niż w ogólnej populacji [23]. Badania sposobu żywienia kobiet z wczesnym rakiem piersi przeprowadzone w porównaniu z grupą kontrolną potwierdziły, że częste spożycie przekąsek zawierających przetworzone węglowodany, charakteryzujące się wysokim IG zwiększa ryzyko zachorowania na nowotwór piersi [25, 26]. 183 Hanna Pudło, Malwina Respondek,Lucyna Szefczyk-Polowczyk 4. Podsumowanie Liczne badania potwierdzają wpływ diety na powstawanie oraz rozwój choroby nowotworowej dlatego istotna wydaje się profilaktyka chorób nowotworowych poprzez szerzenie wiedzy na temat właściwych zachowań zdrowotnych, w tym również odpowiednich nawyków żywieniowych. Na ryzyko występowania raka piersi może być modyfikowane poprzez m. in utrzymanie prawidłowej masy ciała, spożywania odpowiedniej ilości warzyw i owoców, unikanie alkoholu. Należy dążyć do wprowadzania edukacji żywieniowej już u dzieci i młodzieży co może pozwolić na ograniczenie występowania nowotworów dieto zależnych w tym raka piersi. Chociaż wybór zachowań prozdrowotnych należy do poszczególnych osób, otoczenie społeczne, może ułatwiać właściwy ich wybór. Działania społeczne na rzecz poprawy diety i zwiększenia aktywności fizycznej wymagają złożonych strategii i zdecydowanego działania – od wdrażania programów promocji zdrowia na poziomie wspólnot lokalnych, zakładów pracy i innych, do polityki regulującej lokalne planowanie, edukację żywieniową i fizyczną w szkołach i usługi żywieniowe. Szczególne wysiłki należy czynić w celu zagwarantowania wszystkim grupom społecznym dostępu do odpowiedniej żywności i sposobności do uprawiania ćwiczeń fizycznych. Badania dowodzą, że osoby z wysokim poziomem wiedzy na temat profilaktyki chorób nowotworowych podejmują korzystniejsze zachowania zdrowotne [57]. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Eheman C., Henley S.J., Ballard-Barbash R., et Annual report to the nation on the status of cancer, 1975-2008, featuring cancers associated with excess weight and lack of sufficient physical activity.Cancer., 118 (2012), s. 2338-2366 Ferlay J. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008, Intenational Journal of Cancer., 127 (2010), s. 2893-2917 Tkaczuk-Włach J., Sobstyl M., Jakiel G. Rak piersi – znaczenie profilaktyki pierwotnej i wtórnej, Przegląd Menopauzalny., 4(2012), s. 343-347 Ciok J., Dolna A. Indeks glikemiczny a choroby nowotworowe, Współczesna Onkologia., 9 (2005),s. 183-188 Nalewaj J., Markowska J. Żywienie a choroby nowotworowe, Przegląd Urologiczny., 6 (2005), s. 29 Zbucka M., Leoeoeniewska M., Knapp P, Wołczyński S Czy można wpływać na ryzyko wystąpienia raka piersi, Przegląd Menopauzalny., 6 (2005), s. 70-75 Chmielarczyk W., Wronkowski Z., Zwierko M. Zapobieganie rakowi piersi, Służba Zdrowia., 9 (2000), s. 24-26 King M.C., Marks J.H, Mandell J.B. Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2. Science., 303(2003) s. 643-646 184 Wpływ diety na występowanie raka piersi 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. Stein C.J., Colditz G.A.Modifiable risk factors for cancer. British Journal of Cancer., 90(2004), s. 299-303 Kruk J. Fruits and vegetables consumption and the risk of breast cancer. Współczesna Onkologia., 10 (2006), s. 224-230 Strategia Walki z Rakiem w Polsce 2015-2024http://www.walkazrakiem.pl Babińska Z., Hebanowski M. Otyłość –światowa epidemia. Medycyna po Dyplomie., 9 (2001), s. 12-16 Reeves G.K. Cancer incidence and mortality in relation to body mass index in the Million Women Study: cohort study.BMJ, 335 (2007), s. 1134 Frączek J., Herman K., Łobaziewicz W. Wpływ wskaźnika masy ciała na rokowanie kobiet leczonych operacyjnie z powodu raka piersi. Współczesna Onkologia., 8 (2004), s. 239-244 Frączek J., Herman K., Łobaziewicz W.Wskaźnik masy ciała a przebieg okołooperacyjny u kobiet chorych na raka piersi. Współczesna Onkologia., 8 (2004), s. 483-488 Must A., Spadano J., Coakley E.H., Field J.E., Colditz G., Dietz W.H. Nadwaga i otyłość związane z występowaniem licznych chorób współistniejących. JAMA-PL., 2(2000), s. 93-101 Petrelli J.M., Calle E.E., Rodriguez C. Body mass index, height, and postmenopausal breast cancer mortality in a prospective cohort of US women. Cancer Causes Control.,13 (2002), s. 325-332 Ryu S.Y., Kim Ch.B., Nam Ch.M. Is body mass index the prognostic factor in breast cancer? A meta-analysis. Journal of Korean Medical Science., 16 (2001), s. 610 Cleary M.P., Grossmann M.E. Obesity and breast cancer: The estrogen connection. Endocrinology., 150(2009), s. 2537-2542 Gago-Dominguez M., Yuan J.M., Sun C.L. Opposing effects of dietary n-3 and n-6 fatty acids on mammary carcinogenesis. The Singapore Chinese Health Study. British Journal of Cancer., 89 (2003), s. 1686-1692 Daling J.R., Melane K.E., Doody D.R. Relation of body mass index to tumor markers and survival among young women with invasive ductal breast carcinoma. Cancer., 92(2001), s. 720-729 Murphy T.K., Calle E.E., Rodriguez C. Body mass index and colon cancer mortality in a large prospective study. American Journal of Epidemiology., 152(2000), s. 847-854 Mink P.J., Shahar E., Rosamond W.D. Serum insulin and glucose levels and breast cancer incidence: the Atherosclerosis Risk in Communities study. American Journal of Epidemiology., 156(2002), s. 349-352 Ciok J., Dolna A.Indeks glikemiczny a choroby nowotworowe.WspółczesnaOnkologia., 9 (2005) s. 183-188 Augustin L.S., Dal Maso L., La Vecchia C. Dietary glycemic index and glycemic load, and breast cancer risk: a case-control study. Annals of Oncology., 12(2001),1533-1538 Levi F., Pasche C., Lucchini F. Glycaemic index, breast and colorectal cancer. Annals of Oncology., 13(2002), s. 1688-1689 185 Hanna Pudło, Malwina Respondek,Lucyna Szefczyk-Polowczyk 27. Merklinger-Gruchała A. Spożycie tłuszczów, stężenia steroidów jajnikowych a ryzyko zachorowania na nowotwór piersi. Ginekologia Praktyczna., 2(2009), s. 29-32 28. Smith-Warner S.A., Spiegelman D, Adami H.O. Types of dietary fat and breast cancer: a pooled analysis of cohort studies.International Journal of Cancer., 92 (2001), s. 767-774 29. Gordon R., Hunter K.W., La Merrill M., Sorense P., Threadgill D.W., Pomp D. Genotype X diet interactions in mice predisposed to mammary cancer. I. Body weight and fat. Mammalian Genome., 19 (2008), s. 163-178 30. Boyd N.F., Stone J., Vogt K.N. Dietary fat and breast cancer risk revisited: a meta-analysis of the published literature. British Journal of Cancer., 89(2003), s. 1672-1685 31. Thompson H.J., Zhu Z., Jiang W. Weight control and breast cancer prevention: are the effects of reduced energy intake equivalent to those of increased energy expenditure?.Journal of Nutrition., 134(2004), s.3407-3411 32. Welsh J., Wietzke J.A., Zinser G.M.Vitamin D-3 receptor as a target for breast cancer prevention. Journal of Nutrition., 133(2003), s. 2425-2433 33. Cho E., Spiegelman D., Hunter D.J. Premenopausal fat intake and risk of breast cancer.Journal of the National Cancer Institute., 95 (2003), s. 1079-1085 34. Larsson S.C., Kumlin M., Ingelman-Sundberg M., Wolk A. Dietary long-chain n-3 fatty acids for the prevention of cancer: a review of potential mechanisms. The American Journal of Clinical Nutrition., 79(2004), s. 935-945 35. Rohan T.E., Heo M., Choi L., Datta M., Fredenheim J.L., Kamensky V., OchsBalcom H.M. Body fat and breast cancer risk in postmenopausal women: a longitudinal study.Journal of Cancer Epidemiology., 10(2013), s.2013 36. Key T.J., Allen N.E., Spencer E.A., Travis R.C. The effect of diet on risk of cancer. Lancet., 360(2002), s. 861-868 37. Chmielarczyk W., Wronkowski Z., Zwierko M. Zapobieganie rakowi piersi. Służba Zdrowia., 24-26(2000), s. 2917-2919 38. Ditkowska J., Wojciechowska V., Tarkowski W., Zatoński W. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2011 roku.Warszwa 2013 39. Cancer: diet and physical activity‟s impact – WHO http://www.who.int/dietphysicalactivity/publications/en/ 40. Papas A.M. Chemoprevention for gynecological cancer high risk patients. International Congress on Gynecological Malignancies., 2004. s. 24-25 41. Kushi L.H., Byers T., Doyle C., Bandera E.V., McCullough M., Gansler T., Andrews K.S., Thun M.J. Wytyczne American Cancer Society dotyczące żywienia i aktywności fizycznej w zapobieganiu nowotworom złośliwym: zmniejszanie ryzyka nowotworów przez wybór prawidłowych nawyków żywieniowych i wysiłek fizyczny. CA: A Cancer Journal for Clinicians., 56 (2006), s. 254-281 42. Bury P., Godlewski D., Wojtyś P. Alkohol jako czynnik ryzyka choroby nowotworowej.WspółczesnaOnkologia., 1(2000), s. 13-15 43. Hamajima N., Hirose K., Tajima K. Alcohol, tobacco and breast cancercollaborative reanalysis of individual data from 53 epidemiological studies, 186 Wpływ diety na występowanie raka piersi 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. including 58,515 women with breast cancer and 95,067 women without the disease. British Journal of Cancer., 87 (2002), s. 1234-1245 Bayapati S.M., Bostick R.M., McGlynn K.A. Folate intake, MTHFR C677T, polymorphism, alcohol consumption and risk for sporadic colorectal adenoma (United States). Cancer Causes and Control., 15(2004), s. 493-501 Wei Q., Shen H., Wang L.E. Association between low dietary folate intake and suboptimal cellular DNA repair capacity. CancerEpidemiology, Biomarkers&Prevention.. 12 (2003), s. 963-969 Ambrosone C.B. Oxidants and antioxidants in breast cancer. Antioxid Redox Signal., 2 (2000), s.903-917 Kruk J. Jedzenie owoców i warzyw a ryzyko raka piersi. WspółczesnaOnkologia., 10 (2006), s. 224-230 Hirose K., Tajima K, Hamajima N., Inoue M., Takezaki T., Kuroishi T., Yoshida M., Tokudome S. A large-scale hospital based case – control study of risk factors of breast cancer according to menopausal status. Japanese Journal of Cancer Research., 86 (1995), s. 146-154 Jelińska M.Kwasy tłuszczowe – czynniki modyfikujące procesy nowotworowe. BiuletynWydziałuFarmaceutycznegoAkademiiMedycznej w Warszawie., 1 (2005) Hudson E. A., Beck S. A., Tisdale M. J. Kinetics of the inhibition of tumor growth in mice by eicosapentaenoic acid-reversal by linoleic acid. Biochemical Pharmacology., 45 (2003), s. 2189-2194 Gogos Ch. A., Skoutelis A., Kalfarentzos F. The effect of lipids on the immune response of patients with cancer. The Journal of Nutrition, Health and Ageing., 4 (2000), s. 172-175 Jankowska J., Helbin J., Potocki A.Akryloamid jako substancja obca w żywności. Problemy Higieny I Epidemiologii., 2 (2009), s. 171-174 Besaratinia A., Pfeifer G A review of mechanism of acrylamide carcionogenicity. Carcinogenesis., 3 (2007), s. 519-528 Mojska H, Gielecińska I., Marecka D., Szponar L., Świderska K Ogolnopolskie badania zawartości akryloamidu w żywności.Bromatologia i Chemia Toksykologiczna.,3 (2008), s. 848-853 Mrozowicz A., Dominik A., Huk J. Poziom wiedzy populacji na temat wpływu zachowań zdrowotnych na powstawanie chorób nowotworowych. Zdrowie Publiczne., 117 (2007), s. 342-345 Wpływ diety na występowanie raka piersi Streszczenie Ocenia się, że ok. 20-30 % wszystkich nowotworów złośliwych to nowotwory dietozależne, w rozwoju których istotne znaczenie mają czynniki żywieniowe. Do tych nowotworów zalicza się m.in.nowotwór jelita grubego, przełyku, żołądka i trzustki, piersi. Jako czynniki żywieniowe predysponujące do nich wymienia się przede wszystkim zbyt dużą wartość energetyczną pożywienia w stosunku do zapotrzebowania organizmu i wynikającą z tego otyłość oraz nadmierne spożycie tłuszczów. Ponadto niedostateczną ilość błonnika pokarmowego, niskie spożycie wapnia i witamin antyoksydacyjnych oraz wysokie spożycie sodu. Do czynników mających wpływ na występowanie nowotworów można zaliczyć 187 Hanna Pudło, Malwina Respondek,Lucyna Szefczyk-Polowczyk również zanieczyszczenie żywności, toksynami, metalami ciężkimi, jej nieprawidłowe przygotowanie jak i przechowywanie oraz nadmierne spożywanie alkoholu. Pomimo odnotowanego w ostatnim dziesięcioleciu zmniejszenia umieralności z powodu nowotworu piersi, zachorowalność na ten nowotwór stale się zwiększa. Według raportów WHO w większości krajów, w tym w Polsce, rak piersi jest jedną z najważniejszych przyczyn przedwczesnej umieralności kobiet. Rak piersi ma złożoną etiologię, istnieje szereg czynników mających wpływ na jego rozwój. Wśród czynników ryzyka występowania nowotworu piersi wymienia się również czynniki żywieniowe. Wyniki większości badań epidemiologicznych wskazują, że prawidłowa dieta może chronić przed nowotworem piersi a racjonalne żywienie może również poprawić rokowania już chorujących kobiet. Wpływ na ryzyko zachorowania na nowotwór piersi ma szczególnie ilość i jakość spożywanych tłuszczów. Wykazano protekcyjny wpływ kwasów omega-3 na rozwój raka piersi, wielonienasycone kwasy tłuszczowe omega-6mogą natomiast sprzyjać rozwojowi raka piersi. Stwierdzono, że przy rosnącej podaży potasu, karotenoidów, kwasu foliowego, witaminy antyoksydacyjnej w dziennej racji pokarmowej, ryzyko wystąpienia raka piersi zmniejsza się. The effect of diet on breast cancer occurrence Abstract It is estimated that approx. 20-30% of all malignant tumors are related with the diet. The nutritional factors are very important and significant to the development of these tumors. These cancers include cancer of the colon, esophagus, stomach, pancreas and breast cancer. As a dietary factors predisposing to the mentioned harmful factors primarily lists: too much food energy value in relation to the body's needs and in the consequent obesity, excessive intake of fat. Additional factors are the lack of sufficient quantity of dietary fiber, low intake of calcium and antioxidant vitamins and high sodium intake. To the factors affecting on the incidence of cancers include also: food contamination by toxins, heavy metals, improper preparation and storage, and excessive alcohol consumption. Despite the observed reduction in mortality caused by breast cancers in the last decade, the frequency of this cancer is constantly increasing. According to the WHO reports, in most countries (including Poland), breast cancer is one of the most important causes of premature mortality amongst women. Breast cancer has a complex etiology. There are numerous factors that influence on them development. Among the risk factors of breast cancer are also dietary factors. The results of most epidemiological studies show that regular diet can protect against breast cancer and moreover, rational nutrition can also improve the prognosis of diseased women. It turns out that particular impact on the risk of breast cancer is the quantity and quality of dietary fats. It has been demonstrated protective effect of omega-3 fatty acids on growth of breast cancer whereas polyunsaturated omega-6 fatty acids can encourage cancer cells growing. It has been ascertained that risk of breast cancer decreases with increasing supply of potassium, carotenoids, folic acid and antioxidant vitamins in the daily food intake. Keywords: diet, breast cancer, prevention 188 Barbara Moszczuk1, Dominika Labochka2, Anna Czarnecka3 Wpływ inhibitorów kinaz tyrozynowych stosowanych w leczeniu raka nerki na zaburzenia cukrzycowe 1. Wprowadzenie Przekaźnictwo wewnatrzkomórkowe to skomplikowany, wielostopniowy proces, angażujący wiele białek . Podstawą wpływu na ich aktywność jest reakcja fosforylacji , a wię c przyłą czenia reszty fosforanowej do danego białka, co pozwala zaktywować lub zahamować jego działanie . Za proces ten odpowiedzialne są enzymy zwa ne kinazami , przyłą czają ce reszty fosforanowe do aminokwasów: tyrozyny (kinazy tyrozynowe) lub seryny i treoniny (kinazy serynowo -treoninowe). Zaburzenia tego mechanizmu są podstawą rozwoju wielu nowotworów , dlatego najnowsze leki stosowane w ich leczeniu opierają swoje działanie na hamowaniu tych kinaz . Pierwszy i najsłynniejszy lek z tej grupy, imatynib, został wprowadzony do obrotu w 2001 roku i zrewolucjonizował terapię przewlekłej białaczki szpikowej . Od tego czasu na rynku pojawiło się wiele le ków z grupy inhibitorów kinaz tyrozynowych (TKI), które znalazły zastosowanie w walce z wieloma rodzajami nowotworów, na przykład rdzeniowego raka tarczycy , raka płuc, piersi, guzów przewodu pokarmowego i raka nerki . Jednakże, pomimo szerokiego zastosowania, nie wszystkie właściwości TKI zostały dotą d dobrze poznane. W 2004 roku M. Breccia wraz ze współpracownikami po raz pierwszy zauważył , że u diabetyków leczonych inhibitorami kinaz tyrozynowych znacznie poprawiła się kontrola cukrzycy . [1] Pomimo licznych doniesień opisują cych zmiany profilu gikemicznego pacjentów po zastosowaniu TKI, ich wpływ na zaburzenia cukrzycowe nie został jeszcze w pełni wyjaśniony . Ze wzglę du na profil jednostki badawczej , z którą współpracujemy niniejsza praca skupia się na wpływie inhibitorów kinaz tyrozynowych stosowanych w terapii raka nerki, a wię c sunitynibu, sorafenibu 1 [email protected], SKN Medycyny Molekularnej, I WL, Warszawski Uniwersytet Medyczny 2 [email protected], SKN Medycyny Molekularnej, II WL, Warszawski Uniwersytet Medyczny 3 [email protected], Klinika Onkologii Wojskowego Instytutu Medycznego, Warszawa 189 Barbara Moszczuk, Dominika Labochka, Anna Czarnecka i pazopanibu, na poziom glikemii u retrospektywnie analizowanych pacjentów oraz modeli zwierzę cych. 2. Przegląd literatury Wpływ inhibitorów receptorowych kinaz tyrozynowych na zaburzenia cukrzycowe jest coraz lepiej dokumentowany i z roku na rok uzupełniany doświadczenia kolejnych badaczy . W 2008 roku A. Templeton opisał przypadek remisji cukrzycy typu 1 u 64-letniego pacjenta podczas leczenia sunitynibem z powodu raka nerki z przerzutami (mRCC). W cią gu 9 miesięcy leczenia dawka insuliny była systematycznie zmniejszana aż do całkowitej redukcji. Stan ten utrzymał się co najmniej 7 miesięcy, licząc do daty publikacji artykułu [2]. Krótko po tym Billemont et al opublikował pracę analizują cą wpływ terapii sunitynibem na 28 pacjentów z mRCC , przy czym 19 osób miało cukrzycę, a 9 nie. Z analizy poziomu glikemii podczas 4-tygodniowej terapii wynikało, że u wszystkich diabetykow wystąpiło o dwracalne, znaczące obniżenie poziomu glukozy (średnio o 1,77 mmol/l), umożliwiające dwóm osobom całkowitą rezygnację z doustny ch leków przeciwcukrzycowych, a pięciu osobom osiągnięcie wyników określanych jako prawidłowe do czasu zakończenia terapii. Trend ten nie dotyczył pacjentów bez cukrzycy, w których spadek glikemii nie był statystycznie znaczą cy(0,17 mmol/l) [3]. W badaniu przeprowadzonym na myszach Louvet et al zdołali uzyskać remisję cukrzycy typu 1 u myszy NOD tydzień po rozpocz ęciu terapii. Ten efekt przypisali przeciwzapalnemu działaniu TKI w wyniku silnego hamowania receptora PDGF i białka c-Kit [4]. Dwa lata później Agostino et al zbadali średni poziom glukozy we krwi 80 pacjentów leczonych TKI, w tym 30 leczonych sunitynibem i 23 sorafenibem. W obydwu tych grupach, zarówno u pacjentów z cukrzycą jak i bez niej , zanotowano spadek średnieg o poziomu glukozy, kolejno o 14 mg/dL i 15 mg/dL dla sunitynibu oraz o 12 mg/dL dla sorafenibu. Co istotne, po zakończeniu leczenia poziom glukozy powrócił u tych pacjentów do poprzednich, związanych z cukrzycą wartości . W sumie 47% badanych mogło zaprzestać przyjmowania leków przeciwcukrzycowych podczas terapii TKI [5]. Poprawę kontroli glikemii opisano również w leczeniu pazopanib em: 73-letni pacjent leczony glibenklamidem zaprzestał przyjmowania go na czas podawania pazopanibu , ze wzglę du na średni spadek samodzielnie mierzonego poziomu cukru o 5mmol/l i obniżenie Hgb A 1c z 10,9% do 7%, przy niezmienionej masie ciała i funcji nerek [6]. Niebezpieczną klinicznie sytuację udokumentowali Jung et al , którzy spotkali się z przypadkiem zagrażającej życiu hipoglikemii podczas leczenia sunitynibem. W tym przypadku pacjent nie miał zdiagnozowanej 190 Wpływ inhibitorów kinaz tyrozynowych stosowanych w leczeniu raka nerki na zaburzenia cukrzycowe cukrzycy, lecz epizodu nie udało się wyjaśnić w żaden inny sposób , jak tylko ubocznym działaniem inhibitora kinazy [7]. Najnowsze doniesienia dostarczają kolejnych dowodów na wpływ TKI na gospodarkę cukrową. Badania przeprowadzone przez Hong et al wykazały znaczny spadek średnieg o poziomu glukozy u pacjentów z cukrzycą, gdzie średni wynik sprzed terapii wynosił 185.2 +/- 52.8 mg/dl, a po 4 tygodniach leczenia 76.1+/- 29.0 mg/dl. Co ważne , tak znaczne zmiany w wynikach badań krwi skutkowały zmianą dawki lub nawet odstawieniem lek ów przeciwcukrzycowych u 40% pacjentów. Inaczej jednak niż w przypadku rezultatów Agostino, u pacjentów bez cukrzycy wykazano tylko niewielki trend spadkowy jeśli chodzi o poziom glukozy . Prócz tego, w całej grupie 48 badanych nie zaobserwowano znaczących zmian BMI [8]. Także w przypadku sorafenibu spośród 10 osób leczonych insuliną , 4 pacjentów wymagało redukcji dawki w cią gu pierwszych 3 miesięcy terapii, a żadna z osób nie wymagała zwię kszenia ilości insuliny [9]. Niedawno ukazało się badanie wykonane przez polskich naukowców z uniwersytetów w Poznaniu i Gdańsku , w którym badano wpływ sunitynibu na poziom glukozy we krwi u królików . U zwierzą t z cukrzycą spadek poziomu glukozy wahał się mię dzy 14.4% a 69.6%, podczas gdy dla zdrowych osobników wynosił 15.4% do 33.6% między 6 a 12h od podania sunitynibu [10]. Listę zamyka opublikowany w 2014 roku opis przypadku kobiety z cukrzycą typu 1, która przeszła zabieg pankreoduodenektomii z powodu neuroendokrynnego guza trzustki i która leczona była 5-fluorouracylem, a nastę pnie z pow odu przerzutyów- sunitynibem. W ciągu 3 miesięcy terapii pacjentce stopniowo zmniejszało się zapotrzebowanie na insulinę ; stan ten utrzymał się do jej śmierci z powodu powikłanego sepsą zapalenia płuc 3 miesiące później. Warto zauważyc, że kobieta była chora na cukrzycę typu 1 od 40-stu lat. [11] Mniej oczywiste wyniki uzyskujemy , gdy przeanalizujemy ilość epizodów hipo- i hiperglikemii w pełnej populacji pacjentów leczonych sunitynibem lub pazopanibem, bez podziału na tych z zaburzeniami cukrzycowymi i bez nich. W informacjach podanych przez firmę Pfizer u 19% badanych zanotowano epizody hipoglikemii , natomiast hiperglikemia pojawiła się u 15% [ 12]. Guevermont et al zaliczyli podwyższony poziom cukru do toksycznych efektów ubocznych terapii sunitynibem, występującym u 15% pacjentów [13]. Także dla pazopanibu rejestrowane są zarówno przypadki hiper - jak i hipoglikemii u pacjentów z mRCC [14]. 191 Barbara Moszczuk, Dominika Labochka, Anna Czarnecka Tabela 1. Doniesienia i publikacje na temat wpływu TKI na zaburzenia cukrzycowe Autor i rok publikacji A.Templeton et al 2008 Typ badania TKI Opis przypadku sunitynib B. Billemont et al 2008 Retrospektywne:2 8 osób sunitynib Louvet et al 2008 Agostino et al 2010 Boehm et al 2010 Jung et al 2011 Hong et al 2012 Model zwierzęcy sunitynib Retrospektywne: 80 osób Opis przypadku sunitynib Opis przypadku Retrospektywne: 48 osób sunitynib sunitynib Imarisio et al 2012 Prospektywne: 10 osób sorafenib Szałek et al 2014 Huda et al 2014 Model zwierzęcy sunitynib Opis przypadku sunitynib pazopanib Wpływ TKI na glikemię Odstawienie insuliny na 7 miesiecy DM: ↓ BGL u wszystkich 19 pacjentów nieznaczny ↓ u pozostałych remisja DM typu 1 u wszystkich myszy ↓ BGL u pacjentów z i bez DM FPG ↓ >5 mmol/l ciężka hipoglikemia ↓ BGL u 10 pacjentów z DM, pozostali: nieistotny statystycznie ↓ 4/10 pacjentów wymagało redukcji dawki insuliny ↓ BGL u wszystkich zwierząt Odstawienie insuliny na 3 miesiące DM (diabetes mellitus)- cukrzyca, BGL (blood glucose level)- poziom glukozy we krwi, FGP – fasting plasma glucose Źródło: Opracowanie własne 3. Wpływ TKI na molekularne szlaki przekaźnictwa wewnątrzkomórkowego Mechanizm, w jakim inhibitory receptorowych kinazy tyrozynowych wpływają na przemiany glukozy w organizmie nie został jeszcze w pełni wyjaśniony. Włoska badaczka Patrizia O . Prada postuluje , że TKI mają wpływ na dwa główne mechanizmy rozwoju cukrzycy: insulinooporność i uszkodzenie komórek beta [15]. 192 Wpływ inhibitorów kinaz tyrozynowych stosowanych w leczeniu raka nerki na zaburzenia cukrzycowe 3.1. Wpływ TKI na subpopulacje makrofagów Wykazano, że nadmiernie rozwinięta tkanka tłuszczowa jest miejscem , w którym przebiega przewlekły proces zapalny o niewielkim nasileniu , który powoduje jednak wzrost systemowej insulinooporności . [16] Do 40% komórek infiltrują cych tkankę tłuszczową u otyłych myszy i ludzi to makrofagi [17]. Można je podzielić na dwie subpopulacje : M1, wydzielające cytokiny takie jak TNF -α, IL-6 oraz iNOS oraz M 2, wyciszające stan zapalny poprzez produkcje IL -4 i IL-10. [18] U otyłych badanych, równowaga mię dzy tymi dw oma grupami jest przesunię ta w kierunku M1 [19]. W badaniach przeprowadzonych przez Hagerkvist et al wykazano , że podawanie TKI zmiejszyło ilość krążącej IL -6 i TNF-α oraz iNOS , co sugeruje , że lek zmienił proporcje mię dzy subpopulacjami makrofagów z M1 na M2 [20]. 3.2. Wpływ na TNF-α Zarówno adipocyty jak i makrofagi tkanki tłuszczowej wykazują ekspresję receptorów TLR 4, które aktywują m .in. kaskady JNK (c-Jun Nkońcowej) i kinazy IκB (IKKβ), prowadzących do aktywacji transkrypcji białka AP -1 i ją drowego NF -κB, co z kolei skutkuje pojawieniem się z zwiększonych ilościach czynników prozapalnych , w tym TNF-α. Opisano polepszenie czułości na insulinę po neutralizacji receptorów dla TNF -α, który jest nadeksponowany w otyłości. [21] 3.3. Wpływ na obcią żenie retikulum endoplazmatycznego (ER) U osób otyłych nadmiar zwią zków odżywczych powoduje obcią żenie ER, związane ze zwiększoną produkcją białek . W badaniach przeprowadzonych przez Han et al imatynib był podawany myszom z DM 2 przez 4 tygodnie. Po tym czasie nastapiła poprawa wyników glikemii na czczo i tolerancji glukozy. Zmierzono także markery obcią żenia ER , takie jak phospho PERK czy phospho - eIF2alfa i zauważono , że ich ilość zmniejsz yła się . Próbę powtórzono na komórkach raka wą troby HepG 2, uzyskując podobne wyniki. Zmniejszeniu obcią żenia ER towarzyszył także spadek aktywności JNK oraz spadek fosforylacji IRS1(insulin receptor substrate) [22]. 3.4. Wpływ na uszkodzenie komórek beta Jak wspomniano wczesniej , imatynib i sunitynib zapobiegły śmierci komórek beta u myszy z cukrzycą typu 1. Wysunięto hipotezę , że w okolicznościach stresu białko c -Abl (obecne w znacznych ilościach w ER), łą czą c się z białkiem Alph 2 indukuje apoptozę komórek beta . Tezę tę wspiera fakt, że wyłączenie c - Abl przez siRNA (small interfering DNA ) 193 Barbara Moszczuk, Dominika Labochka, Anna Czarnecka chroni komórki beta przez smiercią . TKI hamują c -Abl, co przypuszczalnie zapobiega apoptozie. Efektowi temu towarzyszy spadek aktywacji JNK [23]. 3.5. Wpływ na NF-κB i odkładanie amyloidu Mokhtari et al wykazali , że imatynib aktywuje czynnik NF -kappaB, który ma działanie anty -apoptotyczne. Dodatkowo zaobserwowano spadek czułości komórek trzustki na cytokiny , co może zmniejszać ilość powstającego amyloidu , który ma niekorzystne działanie na wydajność wysp trzustkowych. [24, 25] 4. Podsumowanie Nie ulega wą tpliwości, że R-TKI mają wpływ na zaburzenia cukrzycowe u pacjentów w trakcie leczenia onkologicznego. Mamy świadomość , że retrospektywne analizy niewielkich grup pacjentów i stosunkowo nieliczne próby na zwierzetach nie są wystarczają ce , by wyciagać daleko idą ce wnioski. Jednakże w świetle coraz liczniejsz ej zapadalności na nowot wory w zachodnich społeczeństwach oraz powszechności cukrzycy jako choroby cywlizacyjnej uważamy , że konieczne jest poszerzenie naszej wiedzy na temat plejotropowego działania TKI na ludzki organizm . TKI są obecnie często stosowane w leczeniu wielu t ypów nowotworów, a nowe substancje z tej grupy przechodzą przez kolejne stopn ie prób klinicznych. Mokhtari i Welsh w pracy opublikowanej w2010 roku postulują przeprowadzenie prób klinicznych w celu weryfikacji nastę pują cych hipotez: TKI zapobiegają d estrukcji komórek beta u pacjentów z nowo rozwiniętą cukrzycą typu 1; TKI hamują autoimmunizacyjne i zapalne reakcje u pacjentów w stanie przedcukrzycowym , przez co moment rozwinię cia pełnowobjawowej DM1 jest odsunię ty w czasie ; TKI poprawiają funkc ję komórek bet a i wrażliwośc na insulinę w późnych, zdekompensowanym stadium DM 2, przez co terapia insuliną przestaje być konieczna . [26] Autorzy niniejszej pracy mają świadomość , że przeprowadzenie takich badań na pacjentach może spotkać si ę z trudnościami natury etycznej , dlatego podkreślają konieczność poprzedzenia szeroko zakrojonych badań klinicznych na ludziach przeprowadzeniem odpowiednich prób na zwierzętach. Uważamy, że korzy ści mogące wynikać zarówno z potwierdzenia hamującego wpływu TKI na rozwój cukrzycy, jak i z obalenia tej hipotezy byłyby znaczą ce : stajemy przed możliwością uzyskania nowej grupy leków przeciwcukrzycowych lub ostatecznego potwierdzenia bezpieczeństwa stosowania i nhibitorów kinaz tyrozynowych u diabetyków leczonych onkologicznie. 194 Wpływ inhibitorów kinaz tyrozynowych stosowanych w leczeniu raka nerki na zaburzenia cukrzycowe Podziękowania Praca była wspierana przez dotację NCN UMO-2012/05/D/NZ5/01844 Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Breccia M., Muscaritoli M., Aversa Z. et al: Imatynib mesylate may improve fasting blood glucose in diabetic Ph chronic myelogenous leukemia patients responsive to treatment. Journal of Clinical Oncology 22 (2004); s. 4653-5 Templeton A., Brandle M., Cerny T., Gillessen S.: Remission of diabetes while on sunitinib treatment for renal cell carcinoma; Annals of Oncology., Volume 19, No. 4, (2008) Billemont B, Medioni J, Taillade L: Blood glucose levels in patients with metastatic renal cell carcinoma treated with sunitinib; British Journal of Cancer., 99 (2008), s. 1380-1382 Louveta C., Szota G.L., Langa J. et al: Tyrosine kinase inhibitors reverse type 1 diabetes in nonobese diabetic mice; Proceedings of the National Academy of Sciences, December 2, (2008), vol. 105 no. 48 s. 188-99 Agostino N., Chinchilli V.M., Lynch C.J.: Effect of the tyrosine kinase inhibitors (sunitinib, sorafenib, dasatinib, and imatinib) on blood glucose; Journal of Oncology Pharmacy Practice, 08 (2010) Bohm S., Hess D., Gillessen S., Brandle M.: Improved Glycemic Control With the Multi-Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor Pazopanib; Diabetes Care, Volume 33, 06 (2010) Lee Y., Jung H.S., Choi H.J.: Life-threatening hypoglycemia induced by a tyrosine kinase inhibitor in a patient with neuroendocrine tumor: A case report; Diabetes Research and Clinical Practice., 93 (2011) s. 68-70 Oh J.J., Hong S.K., Joo Y.M. et al: Impact of Sunitinib Treatment on Blood Glucose Levels in Patients with Metastatic Renal Cell Carcinoma; Japanese Journal of Clinical Oncology 2012;42(4)314-317 Imarisio I., Paglino C., Ganini C.: The effect of sorafenib treatment on the diabetic status of patients with renal cell or hepatocellular carcinoma; Future Oncology (2012) 8(8), 1051-1057 Szałek E., Karbownik A., Sobanska K. et al: The pharmacokinetics and hypoglycaemic effect of sunitinib in the diabetic rabbits; Pharmacological Reports 66 (2014) 892-896 Huda M., Amiel S.A., Ross P., Aylwin S. Tyrosine Kinase Inhibitor Sunitinib Allows Insulin Independence in Long-standing Type 1 Diabetes Diabetes Care 2014;37:s: 87-88 Lodish M.B., Stratakis C.A.: Endocrine side effects of broad acting kinase inhibitors, Endocrine Related Cancer, 2010 September; 17 (30): s.233-244 Guevremont C., Alasker A., Karakiewicz P.I. Management of sorafenib, sunitynib and temsirolimus toxicity in metastatic renal cell carcinoma. Current Opinion in Supportive and Palliative Care 2009; 3:170-179 Sternberg C.N., Davis I.D., Mardiak J., Szczylik C. et al, Pazopanib in Locally advanced or metastatic renal cell carcinoma: results of a randomized phase III trial, Journal of Clinical Oncology, Volume 28, Number 6, February 20 2010 195 Barbara Moszczuk, Dominika Labochka, Anna Czarnecka 15. Prada P.O., Saad M.: Tyrosine kinase inhibitors as novel drugs for the treatment of diabetes; Expert Opinion on Ivestigational Drugs (2013) 22(6):751-763 16. Xu H., Barnes G.T., Yang Q., et al: Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. Journal of Clinical Investigation 2003;112:1821-30 17. Weisberg S.P, McCann D., Desai M., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation., 112(2003); s.1796-808 18. Gordon S., Martinez F.O Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity., 32(2010); s. 593-604 19. Gregor M.F, Hotamisligil G.S: Inflammatory mechanisms in obesity. Annual Revue Immunology., 29(2011); s.415-45 20. Prada P.O, Ropelle E.R, Mourao R.H, et al: EGFR tyrosine kinase inhibitor (PD153035) improves glucose tolerance and insulin action in high-fat diet-fed mice. Diabetes., 58(2009), s.2910-19 21. Hotamisligil G.S., Shargill N.S., Spiegelman B.M.: Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science 259(1993); s. 87-91 22. Han M.S., Chung K.W., Cheon H.G., et al.: Imatinib mesylate reduces endoplasmic reticulum stress and induces remission of diabetes in db/db mice. Diabetes., 58(2009); s. 329-36 23. Hagerkvist R., Makeeva N., Elliman S. et al.: Imatinib mesylate (Gleevec) protects against streptozotocin-induced diabetes and islet cell death in vitro. Cell Biolology., 30(2006); s.1013-17 24. Mokhtari D., Li T., Lu T. et al. Effects of imatinib mesylate (Gleevec) on human islet NF-kappaB activation and chemokine production in vitro. Public Library of Science (2011);6(9)e.24831 25. Welsh N.: Does the small tyrosine kinase inhibitor Imatinib mesylate counteract diabetes by affecting pancreatic islet amyloidosis and fibrosis? Expert Opinon on Investigational Drugs 21(2012);s.1743-50 26. Mokhtari D., Welsh N.: Potential utility of small tyrosine kinase inhibitors in the treatment of diabetes, Clinical Science 118(2010),s. 241-247 196 Wpływ inhibitorów kinaz tyrozynowych stosowanych w leczeniu raka nerki na zaburzenia cukrzycowe Wpływ inhibitorów kinaz tyrozynowych stosowanych w leczeniu raka nerki na zaburzenia cukrzycowe Streszczenie Ostatnia dekada przyniosła znaczą cy postę p w leczeniu przerzutowego raka nerki . Coraz lepsze zrozumienie biologii molekularnej komórki nowotworowej otworzyło drzwi nowym technologiom i umożliwiło stworzenie terapii celowanych , znacząco poprawiających rokowanie pacjentów . Obecnie do leczenia rozsianego raka nerki (mRCC) zarejestrowane są trzy grupy leków ukierunkowanych molekularnie, a jedną z nich są inhibitory receptorowych kinaz tyrozynowych (R-TKI), w tym receptorów VEGF i PDGF: sunitynib, sorafenib, pazopanib i aksytynib. Dotychczas nie zostały dokładnie scharakteryzowane wszystkie mechanizmy oddziaływania tych leków na organizm człowieka. W 2004 roku M. Breccia wraz ze współpracownikami po raz pierwszy zauważył , że u diabetyków leczonych inhibitorami kinaz tyrozynowych znacznie poprawiła się kontrola cukrzycy . Od tego czasu wcią ż pojawiają się publikacje o zna czącym wpływie tej grupy leków na poziom glukozy we krwi i status glikemiczny zarówno w modelach zwierzę cych , jak i u pacjentów . Mimo że od pierwszego doniesienia upłynę ło już ponad 10 lat, ta kwestia wcią ż nie została definitywnie wyjaśniona na po ziomie molekularnym . W naszej pracy analizujemy wpływ inhibitorów receptorowych kinaz tyrozynowych na zaburzenia cukrzycowe , przybliżamy tematykę molekularnej patogenezy cukrzycy oraz prawdopodobne mechanizmy , które powodują zmiany glikemii u pacjentów leczonych R - TKI. Mamy nadzieję , że zwiększona świadomość tego problemu nie tylko wśród lekarzy , ale i młodych naukowców z różnych dziedzin przełoży się na wzrost ilości badań klinicznych i genetycznych w tym obszarze badawczym. Praca była wspierana przez dotację NCN UMO -2012/05/D/NZ5/01844 Influence of Tyrosine Kinase Inhibitors used in treatment of renal cell carcinoma on diabetes Abstract Last decade brought a substantial development in the treatment of renal cell carcinoma. Better understanding of molecular biology of a cancer cell opened the doors for new technologies and enabled us to create targeted treatments, significantly improving prognosis for oncological patients. Currently three groups of molecular-level acting drugs are registered for the treatment of metastatic renal cell carcinoma (mRCC). One of them are receptor tyrosine kinase inhibitors (R- TKI), mainly for VEGF and PDGF receptors: sunitynib, sorafenib, pazopanib and aksytynib. The exact mechanisms of action on the human body have not been identified yet. In 2004 M. Breccia et al for the first time noticed significantly improved diabetes control in patients treated with tyrosine kinase inhibitors . Since then there have been a number of publications describing influence of these drugs on blood glucose levels and glicemic status, both on animals models and retrospectively reviewed humans. Even though more than 10 years have passed since the first report, this issue has not been thoroughly explained. In our report we analyse the influence of receptor tyrosine kinase inhibitors on diabetes, pathogenesis of diabetes on a molecular level and propose mechanisms, which could influence blood sugar levels in patients treated with RTKI. We hope that increased consciousness of this problem will have a direct impact on a number of clinical and genetic studies in this area. The paper was subsidised by NCN UMO-2012/05/D/NZ5/01844 197 Dominika Labochka1, Barbara Moszczuk2, Anna Czarnecka3 Rola cukrzycy w występowaniu i przebiegu raka nerki 1. Wprowadzenie Rak nerkowokomórkowy (renal cel carcinoma - RCC) stanowi 2-3% nowotworów złośliwych w populacji dorosłych. Największa zachorowalność występuje w krajach rozwiniętych (USA, kraje Europy Zachodniej). W ciągu ostatnich dwóch dekad systematycznie wzrasta zachorowalność na ten nowotwór, co skłoniło badaczy do poszukania przyczyn zwiększonej zapadalności we współczesnym stylu życia oraz wynikających z niego chorobach cywilizacyjnych. Tylko 5% RCC stanowią raki uwarunkowane genetycznie, będące składową dziedzicznych zespołów m.in. von Hippel-Lindau, zespołu dziedzicznego brodawkowatego RCC. Pozostałą grupę, stanowiącą zdecydowaną większość stanowią raki sporadyczne. Udowodniono związek palenia tytoniu, otyłości i nadciśnienia tętniczego ze zwiększonym ryzykiem występowania tego nowotworu złośliwego. Histologicznie wyróżnia się 3 główne rodzaje RCC: jasnokomórkowy (80-90%), brodawkowaty (10-15%) oraz chromofobny (4-5%). Mniej niż 1% stanowią podtypu rzadsze: rak z kanalików zbiorczych oraz rak rdzeniasty. Utkanie mięsakowate może towarzyszyć innym utkaniom histologicznym ale samo nie stanowi odrębnego podtypu. Podstawę leczenia stanowi leczenie chirurgiczne. Leczenie systemowe stosowane jest u chorych, u których niemożliwe jest wykonanie zabiegu radykalnego. Jako leczenie systemowe stosujemy immunoterapię cytokinami (interferon α), inhibitor receptorowych kinaz tyrozynowych (receptora VEGF – ang. vascular endothelial growth factor – czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego i PDGF – ang. plateled-derived growth factor – płytokopochodny czynnik wzrostu: sunitinib, sorafenib, pazopanib, aksytynib), inhibitory kinazy serynowo-treoninowej mTOR 1 [email protected], Interdyscyplinarne Koło Medycyny Molekularnej, Wojskowy Instytut Medyczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny 2 [email protected], Interdyscyplinarne Koło Medycyny Molekularnej, Wojskowy Instytut Medyczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny 3 [email protected], Interdyscyplinarne Koło Medycyny Molekularnej, Wojskowy Instytut Medyczny 198 Rola cukrzycy w występowaniu i przebiegu raka nerki (temsyrolimus, ewerolimus) oraz przeciwciało monoklonalne anty-VEGF (bewacyzumab). Cukrzyca (diabetes mellitus - DM) to grupa chorób metabolicznych charakteryzujących się przewlekłą hiperglikemią. Występuje u około 5-7% populacji dorosłych. Dziewięćdziesiąt procent przypadków tej choroby stanowi cukrzyca typu 2, mająca udowodniony związek z otyłością. Patomechanizmem odpowiedzialnym za jej występowanie jest insulinooporność wywołana przez wydzielane przez tkankę tłuszczową wolne kwasy tłuszczowe oraz cytokiny prozapalne. Oporność na insulinę jest początkowo kompensowana przez nadprodukcję insuliny przez trzustkę. Stopniowo jednak dochodzi do zwyrodnienia komórek β trzustki i rozwija się cukrzyca. 2. Pierwsze badania Związek między cukrzycą a rakiem nerkowokomórkowym został pierwszy raz zauważony przez Lindblada i in. w badaniu z 1999 roku na populacji Szwedzkiej.[1] W tym retrospektywnym badaniu wyłoniono grupę pacjentów z cukrzycą hospitalizowanych pomiędzy 1965 a 1983 rokiem. Wśród 153852 pacjentów wyłoniono 267 przypadków chorych z rakiem nerkowokomórkowym. Szacowana wcześniej ilość przypadków RCC wynosiła 182,4. Wynika z tego jednoznacznie, że u chorych z cukrzycą występuje zwiększony wskaźnik zachorowalności na RCC. Wskaźniki służące do oceny tego zjawiska to SIR oraz SMR. SIR (standardized incidence ratio – standaryzowany wskaźnik zapadalności, opisuje stosunek rzeczywistej ilości chorób do ilości szacowanego występowania) natomiast SMR (standardized mortality ratio – standaryzowany wskaźnik śmiertelności) opisuje rzeczywistą ilość zgonów w porównaniu do ilości przewidywanej. Oba te wskaźniki udowadniają korelację między tymi chorobami u obu płci. Dla zapadalności w populacji żeńskiej (SIR = 1,7, 95% CI = 1.4-2.0) oraz populacji męskiej (SIR = 1,3; 95% CI = 1.1-1.6) oraz dla śmiertelności u kobiet (SMR = 1,9; 95% CI = 1,7-2,2) jak i u mężczyzn (SMR = 1,7; 95% CI = 1,4-1,9). 199 Dominika Labochka, Barbara Moszczuk, Anna Czarnecka 3. Współczesne badania i wyniki w nich uzyskane 3.1. Czynniki prowadzące do cukrzycy i ich rola w kancerogenezie Najważniejszym czynnikiem ryzyka prowadzącym do cukrzycy typu drugiego jest otyłość. Największe ryzyko u pacjenta stanowi otyłość typu centralnego, która przekłada się na zwiększoną ilość tkanki tłuszczowej trzewnej. To właśnie znajdujące się tam adipocyty wydzielają substancje odpowiedzialne na insulinooporność m.in. wolne kwasy tłuszczowe. Powstaje teraz pytanie, jaka jest rola otyłości w występowaniu raka nerki. Przeprowadzono wiele badań potwierdzających związek pomiędzy nadmierną masą ciała a nowotworami. Udowodniono związek z nowotworami: piersi (u pacjentek po menopauzie), okrężnicy, endometrium, rakiem gruczołowym przełyku a nawet trzustki [2,3]. Rola nadwagi, jak i otyłości w raku nerki także została potwierdzona m.in. badaniem na populacji Stanów Zjednoczonych, gdzie wskaźnik RR (relative risk – ryzyko względne) wyniósł od 1,5 (dla BMI 25-30 kg/m2) do 2,5 (dla BMI > 30 kg/m2) [2]. Wzrost ryzyka wynikający z wzrostu BMI jest bardziej zaznaczony u kobiet. Ważne jest by podkreślić, że otyłość jest czynnikiem ryzyka niezależnym od ciśnienia krwi, co może sugerować, że zwiększają one ryzyko raka nerki oddziałując przez inne mechanizmy. U pacjentów otyłych jest znacznie większe prawdopodobieństwo rozwinięcia raka o podtypie jasnokomórkowym niż u pacjentów z prawidłowym BMI (OR = 1,48; 95% CI 1,19-1,84) [5]. W badaniu populacji japońskiej udowodniono, że BMI nie ma statystycznie istotnego (P=0,991) związku z nawrotami choroby nowotworowej nerki [6]. 3.2. Rak nerkowokomórkowy u pacjentów chorych na cukrzycę Aby dokładnie przeanalizować współwystępowanie obu tych chorób, zacznijmy najpierw od oceny skali jego zjawiska. W dostępnej literaturze odsetek pacjentów z cukrzycą wśród chorych na raka nerki wahał się od 9,1% w populacji włoskiej [7] do nawet 25,4% wśród mieszkańców stanu Texas w USA [8]. Związek ten był bardziej widoczny w populacji żeńskiej (wśród kobiet współchorobowość wykazywało 31,4% a u mężczyzn 20,8%; p=0,01) [8]. Wiele badań udowodniło, że cukrzyca jest niezależnym czynnikiem ryzyka wystąpienia raka nerkowokomórkowego [1,7-11]. Do oceny służył wskaźnik HR (hazard ratio), czyli ryzyko względne, który wyniósł 1,161 (gdzie wskaźnik ufności wyniósł 95% CI 1,19-2,18) [9], w kolejnym badaniu wskaźniki te wynosiły odpowiednio HR = 1,92 (95% CI 1,06-3,46) [11]. 200 Rola cukrzycy w występowaniu i przebiegu raka nerki Pacjenci z cukrzycą, u których rozwijał się rak nerki byli starsi od pacjentów bez DM [12, 13], częściej mieli bezobjawowy przebieg [13], głównym podtypem był rak jasnokomórkowy [8,12], zwykle niewielkich rozmiarów (1-5 cm) [8]. U chorych częściej występowała wielochorobowość [13]. Pacjenci Nowotwór Rokowanie Rysunek 1. Podsumowanie wpływu cukrzycy na kliniczną manifestację raka nerki 3.2.1. Rokowanie Skoro cukrzyca ma udowodniony związek z występowaniem raka nerki, warto się teraz przyjrzeć, jaki ma wpływ na rokowanie u pacjenta, który rozwinął obie te choroby. W badaniach na populacji tureckiej za pomocą analizy Kaplana-Meiera ustalono, że odsetek 5 letnich przeżyć w grupie z cukrzycą był krótszy (62,9% vs 77,7%), odpowiednio p=0,1 [12]. Informacje na temat wpływu cukrzycy na śmiertelność w raku nerki są podzielone. Pojawiają się głosy o całkowitym braku wpływu cukrzycy na śmiertelność [13] jak i mówiące o zwiększonej umieralności tych pacjentów [1]. Analiza wieloczynnikowa chorych populacji japońskiej wskazuje, wpływ cukrzycy na skrócenie wskaźników przeżycia, zarówno OS (overall survival – całkowite przeżycie) (HR = 1,88, 95% CI 1,09-13,23) jak i Non-cancer-related survival (przeżycie niezwiązane z nowotworem) (HR = 2,22; 95% CI 1,06-4,64) [14]. W badaniu Vavallo i in. uzyskano krótszy czas OS, zwiększone ryzyko nawrotów i wyższe ryzyko śmiertelności związanej z rakiem nerki (Cancer-specific Survival)[15]. 201 Dominika Labochka, Barbara Moszczuk, Anna Czarnecka Cukrzyca zwiększa też ryzyko nawrotów. Fukushima i in. wykazali znaczącą różnicę w 5-letnim przeżyciu wolnym od nawrotów między grupą pacjentów z cukrzycą i bez niej (75,3% vs 91,9%, odpowiednio p<0,001) [6]. Uwzględniając wszystkie powyższe dane można stwierdzić, że cukrzyca nie tylko wpływa na częstość występowania raka nerkowokomórkowego ale i ma pogarszający wpływ na rokowanie u pacjenta. 3.2.2. Inna manifestacje cukrzycy w raku nerkowokomórkowym, czyli zespoły paraneoplastyczne Cukrzyca może stanowić rzadki zespół paraneoplastyczny. W literaturze opisano dotychczas dwa takie przypadki. Pierwszym pacjentem był opisany w 1999 roku 35-letni mężczyzna, chorujący na cukrzycę od 12 lat, który został przyjęty do szpitala z powodu nagłego rozchwiania kontroli glikemii. Zapotrzebowanie na insulinę wzrosło z 80 jednostek podawanych podskórnie do 600 jednostek podawanych dożylnie! Dodatkowo w badaniu stwierdzono ból w prawym boku i zwiększony wskaźnik CRP, które to stanowiły wskazanie do badania moczu. Badanie to wykazało krwinkomocz. Po wykonanej tomografii komputerowej (TK) brzucha wykryto u pacjenta obustronnego guza nerki. W badaniu histopatologicznym okazał się obustronnym rakiem brodawkowatym. Po lewostronnej nefrektomii radykalnej i prawostronnej oszczędzającej pacjent wrócił do kontroli cukrzycy sprzed wystąpienia raka nerkowokomórkowego [16] Kolejny przypadek stanowi historia 64-letniego mężczyzny z wywiadem nefrektomii z powodu raka nerkowokomórkowego jasnokomórkowego. 9 lat po operacji ten 64-letni mężczyzna zgłasza się do szpitala z 2-tygodniowym wywiadem polidyspsji, poliurii i utraty wagi. W badaniach stwierdzono glikemię 662 mg%, HbA1c 11,5% oraz poziom przeciwciał anty-GAD 28 680 U/l (norma <9,5 U/l). W TK brzucha stwierdzono u pacjenta progresję w wyniku czego włączono mu leczenie sunitinibem. Po 9 miesiącach leczenia sunitinibem wystąpiła u pacjenta normoglikemia bez leczenia cukrzycy. Po 15 miesiącach obserwacji poziom przeciwciał anty-GAD był ciągle podniesiony [17]. 202 Rola cukrzycy w występowaniu i przebiegu raka nerki 4. Próby wytłumaczenia związku między cukrzycą a rakiem nerkowokomórkowym – patomechanizm zjawiska 4.1. Potencjalne patomechanizmy Jest wiele szlaków, których aktywacja spowodowana cukrzycą może przyczynić się do wzrost raka nerki. Wśród potencjalnych czynników prowadzących do kancerogenezy najczęściej wymienia się te, które wymienione są na grafie poniżej. Postaramy się pokrótce przedstawić wytłumaczenie tych procesów. Ponieważ hiperinsulinemia ma najlepiej zbadany związek z RCC omówimy ją na końcu. Rysunek 2. Potencjalne patomechanizmy prowadzące do kancerogenezy 4.1.1. Hiperglikemia Komórki nowotworowe, zgodnie z hipotezą Warburga przedkładają glikolizę nad łańcuch oddechowy w mitochondriach. Potrzebują przez to do prawidłowego metabolizmu zwiększonej dostawy glukozy w krwi. Zgodnie z ta teorią hiperglikemia u cukrzyka jest zjawiskiem pobudzającym metabolizm komórek nowotworowych. Hiperglikemia zwiększa także proliferację komórek nowotworowych przez wzrost stężeń kinazy białkowej C (PKC) oraz receptorów PPARs, które to mogą przyspieszać metabolizm komórkowy i stymulować proliferację [18]. 203 Dominika Labochka, Barbara Moszczuk, Anna Czarnecka 4.1.2. Hiperaktywacja szkalu Akt/mTOR Akt, czyli kinaza białkowa B reguluje większość szlaków komórkowych włączając w to szlaki odpowiedzialne za kancerogenezę. Po zbadaniu komórek pacjentów chorujących na raka nerki i drugiej grupy chorującej zarówno na raka nerki jak i na cukrzycą wykazano znacząco większą aktywność u tej drugiej grupy [19]. Tuberyna (białko kodowane przez TSC2) jest białkiem uwalniany po ostrym uszkodzeniu nerek. Jego funkcja polega na ograniczaniu proliferacji po procesach odtwórczych. Kineza Akt odpowiada za fosforyzację, czyli inaktywowanie TSC2 i prowadzi przez to do aktywacji kinazy mTOR (która odpowiedzialna jest za regulację wzrostu, proliferacji i ruchu komórki). Aktywacja kinazy mTOR powoduje fosforyzację białka p70S6K. Zwiększone stężenie fosforyzowanego białka p70S6K wykryto u pacjentów z samą cukrzycą jak i u pacjentów z nowotworem [19]. Podsumowując, u pacjentów z cukrzycą występuje wzrost aktywności kinezy białkowej B (Akt), co przekłada się na zmniejszenie stężenia Tuberyny i wzrost aktywności kinazy mTOR. Wszystkie te procesy wpływają na stymulowanie proliferacji w komórkach nerek. 4.1.3. Hiperinsulinemia i rodzina czynnika IGF Insulina promuje syntezę i aktywność insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF-1). Zarówno insulina jak i IGF-1 stymulują proliferację i powstrzymują apoptozę. Insulinopodobny czynnik wzrostu oddziałuje przez IGF-1R. Jest to przezbłonowy receptor, który posiada aktywność kinazy tyrozynowej. Aktywność ta jest niezbędna do przekazania sygnału. Przekazanie sygnału przez receptor pociąga za sobą aktywację sygnałów przez kinezę fosfatydyloinozytolu 3 (PI3K) i MAPK (ang. mitogen-activated protein kinases – kinazy aktywowane mitogenami) [20]. W warunkach prawidłowych receptor umieszczony jest w błonie zewnętrznej komórki. Występuje on także w komórkach nowotworowych, m.in. raku nerki [21]. W komórkach tych, zwłaszcza wykazujących zwiększoną proliferację, często IGF-1R znajduje się w błonie jądrowej [22]. Dzięki temu możliwy jest bezpośredni udział w regulacji transkrypcji. Znaczenie tego zjawiska dla prognozy jest sporne. Aleksic i in. twierdzą, że komórki z IGF-1R w błonie jądrowej charakteryzują się większym wskaźnikiem proliferacji i gorszą prognozą [22]. Natomiast w badaniu Lkhagvadorj wykazano zwiększoną ekspresją IGF-1R w raku nerki o mniejszym stopniu złośliwości wg Furmana, związku tego nie wykazano w rakach o wyższym stopniu złośliwości [23]. W badaniu Rasmusona 204 Rola cukrzycy w występowaniu i przebiegu raka nerki wykazano, że zwiększone stężenie IGF-1 wiąże się z lepszą prognozą (p=0,017)[24]. Do rodziny czynnika IGF należą także białka wiążące IGF-1 czyli IGFBP. Według hipotezy „insulina-nowotworzenie” przewlekła hiperinsulinemia wiąże się ze zmniejszeniem stężenia IGFBP-1 i IGFBP-2, co oznacza zwiększoną biodostępność IGF-1 [3]. Najciekawszym przedstawicielem białek wiążących jest IGFBP-3. IGF-1 posiada większe powinowactwo do tego białka wiążącego niż do receptora. Dzięki czemu IGFBP-3 może obniżać biodostępność i pośrednio aktywność tego czynnika wzrostu. Obniżone stężenie tego białka wiążącego jest związane z większym ryzykiem występowania nowotworów wielu narządów jak i gorszą ich prognozą [25]. Podsumowując rodzina czynnika IGF-1 ma wieloraki wpływ na nowotworzenie. Czynnik wzrostu ma dodatni wpływ na proliferację, jego receptor często w komórkach nowotworowych ulega translokacji do błony jądrowej, przez co może bezpośrednio oddziaływać na procesy transkrypcję. Stężenie IGFBP-3 ma odwrotną korelację z ryzykiem wystąpienia nowotworu. Jako białko wiążące zmniejsza biodostępność IGF-1. Coraz częściej prowadzone są badania nad potencjalnym wykorzystaniem powyższych szlaków jako miejsc uchwytu terapii antynowotworowej. 5. Podsumowanie Wnioski płynące z powyższej pracy wskazują, że cukrzyca jest kolejnym czynnikiem ryzyka zachorowania na sporadycznego raka nerki. Współwystępowanie obu tych chorób występuje częściej u pacjentów starszych, związek między tymi chorobami jest silniej zaznaczony w populacji kobiet. Chory mają częściej asymptotyczny przebieg i więcej chorób towarzyszących. Rak nerki u pacjentów z cukrzycą jest zwykle podtypu jasnokomórkowego, niewielkich rozmiarów (1-5 cm). Rokowanie w grupie pacjentów z cukrzycą jest gorsze niż w grupie osób chorujących tylko na raka nerki. Przyczyną tego są częstsze nawroty, większy odsetek przerzutów odległych. Wszystkie te czynniki przyczyniają się do skrócenia wskaźników przeżywalności: OC (overall survivall – przeżycie całkowite) oraz CSS (cause-specific survivall – przeżycie zależne od choroby). Cukrzyca może występować także jako zespół paraneoplastyczny, może dzięki temu przyczyniać się do wcześniejszego rozpoznania RCC. Potencjalne patomechanizmy prowadzące do rozwoju raka nerki u diabetyków pozostają ciągle niewyjaśnione. Za najważniejsze podaje się czynniki takie jak przewlekła hiperglikemia, hipertrofia nerek, hiperaktywacja szlaku Akt/mTOR oraz najważniejszy z nich hiperinsulinemia. Rola insuliny 205 Dominika Labochka, Barbara Moszczuk, Anna Czarnecka i rodziny białek insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF-1) jest najciekawszym obiektem dociekań. Pobudzanie proliferacji komórki przez insulinę i IGF-1 oraz bezpośrednie oddziaływanie na transkrypcję przez obecność IGF-1R w błonie komórkowej pozwala przypuszczać, że substancja ta ma największe znaczenie w rozwoju RCC. W powyższej pracy chcieliśmy zwrócić uwagę na szlaki komórkowe prowadzące do kancerogenezy i poszukać potencjalnych miejsc uchwytu dla nowych terapii nowotworowej. Za takie uznaje się blokowanie aktywności kinezy tyrozynowej w receptorze IGF-1R, oraz zwiększenie aktywności białka wiążącego IGF-1, czyli IGFBP-3. Potrzeba więcej badań, które mogłyby potwierdzić nasze przypuszczenia. Podziękowania Praca była wspierana przez dotację NCN UMO-2012/05/D/NZ5/01844 Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Lindblad P., Chow W.H., Chan J., Bergstrom A., Olk A. W., Gridley G., McLaughlin J.K., Nyren O., Adami H.O. The role of diabetes mellitus in the aetiology of renel cel cancer, Diabetologia, 42(1999), s 107-112 Calle E.E., Kaaks R.; Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms; Nature reviews. Cancer, 4(2004), s. 579-591 Renehan A.G., Roberts D.L., Dive C.; Obesity and cancer: Pathophysiological and biological mechanisms; Archives of Physiology and Biochemistry, 114(2008), s. 71-83 Renehan A.G., Frystyk J., Flyvbjerg A.; Obesity and cancer risk: the role of the insulin-IGF axis; TRENDS in Endocrinology and metabolism, 17(2006) 328-337 Lowrance W.T., Thompson R.H., Yee D.S., Kaag M., Donat S.M., Russo P.; Obesity is associated with a higher risk of clear-cell renal cell carcinoma than with other histologies; BJU International 105(2010), s. 1-16 Fukushima H., Masuda H., Yokoyama M.. Tatokoro M., Yoshida S., Ishioka J., Matsuoka Y., Numao N., Koga F., Saito K., Fujii Y., Kihara K.; Diabetes Mellitus with Obesity is a Predictor of Recurrence in Patients with Nonmethastatic Renall Cell Carcionoma; Japanese Journal of Clinical Oncology 43(2013), s. 740-746 Zucchetto A., Dal Maso L., Tavani A., Montella M., Ramazztti V., Talamini R., Canzonieri V., Garbeglio A., Negri E., Franceschi S., La Vecchia C.; History of treated hypertension and diabetes mellitus and risk of renal cell cancer; Annals of Oncology 18(2007), s 596-600 Habib S.L., Prihoda T.J., Luna M., Werner S.A.; Diabetes and Risk of Renal Cell Carcinoma; Journal of Cancer 3(2012) s 42-48 Hee-Kyung J., Willett W.C., Cho E.; Type 2 Diabetes and the Risk of RenalCancer in Women; Diabetes Care, 34(2011), s 1552-1556 206 Rola cukrzycy w występowaniu i przebiegu raka nerki 10. Wang G., Hou J., Ma L., Xie J., Yin J., Xu D., Chang W., Tan X., Su T., Zhang H., Cao G.; Risk factor for clear cell renal cell carcinoma In Chinese population: A case-control study; Cancer Epidemiology 36(2012) 177-182 11. Inoue M., Iwasaki M., Otani T., Sasazuki S., Noda M., Tsugane S.; Diabetes Mellitus and the Risk of Cancer. Results From a Large-Scale PopulationBased Cohort Study in Japan; Arch Intern Med. 166(2006), s. 1871-1877 12. Suer E., Ozturk E., Gulpinar O., Kayis A., Baltaci S.; Effect of Type 2 Diabetes Melliitus on Prognosis of Nnmetastatic Renal Cell Cancer; Korean Journal of Urology 54(2013), s 499-502 13. Antonelli A., Arrighi N., Corti S., Zanotelli T., Cozzoli A., Cunico S.C., Simeone C.; Pre-existing type-2 diabetes is not an adverse prognostic factor in patients with renal cell carcinoma: A single-center retrospective study; Urologic Oncology: Seminars and Origina Investigations 31(2013), s. 1310-1315 14. Lee S., Hong S.K., Kwak C., Kim H.H., Lee S.E.; Prognostic Significance of Diagetes Mellitus in Localized Renal Cell Carcinoma; Japanese Journal of Clinical Oncology 42(2012), s. 318-324 15. Vavallo A., Simone S., Lucarelli G., Rutigliano M., Galleggiante V., Grandalino G., Gesualdo L., Campagna M., Cariello M., Ranieri E., Pertosa G., Lastilla G., Selvaggi F.P., Ditonno P., Battaglia M.; Pre-existing Type 2 Diabetes Mellitus Is an Indepentent Risk Factor for Mortality and Progression in Patients With Renal Cell Carcinoma; Medicine 93(2014), s. 1-8 16. Callewaert P.R., Van Poppel H., Vanderschueren D., Baert L.; Uncontrollable diabetes mellitus: a rare paraneoplastic manifestacion of renal cell carcinoma; Nephrol Dial Transplant 14(1999), s 2263-2264 17. Templeton A., Brandle M., Cerny T., Gillessen S.; Remission of diabetes while on sunitinib treatment for renal cell carcinoma; Annals of Oncology, 19(2008), s. 824-825 18. Ryu T.Y., Park J., Scherer P.E.; Hyperglicemia as a Risk Factor for Cancer Progression; Diabetes&Metabolism Journal 38(2014), s.330-336 19. Habib S.L., Liang S.; Hyperactivation of Akt/mTOR and deficiency in tuberin increased the oxidative DNA damage in kidney cancer patients with diabetes; Oncotarget 9(2014), s.2542-2551 20. Chitnis M.M., Yuen J.S.P., Protheroe A.S., Pollak M., Macaulay V.M.; The Type 1 Insulin-Like Growth Factor Receptor Pathway; Clinical Cancer Research 14(2008), s.6364-6370 21. Ouban A., Muraca P., Yeatman T., Coppola D.; Expression and Distribution of Insulin-Like Groth Factor-1 Receptor in Human Carcinomas; Human Pathology 34(2003), s.803-808 22. Aleksic T., Chitnis M.M., Perestenko O.V., Gao S., Thomas P.H., Turner G.D., Protheroe A.S., Howarth M., Macaulay V.M.; Type 1 Insuline-Like Growth Factor Receptor Translocates to the Nucleus of Human Tumor Cells; Cancer Research70(2010), s.6412-6419 23. Lkhagvadorj S., Ch S.S., Lee M.R., Jung J.H., Chung H.C., Cha S.K.; Insulin Receptor Expression in Clear Cell Renal Cell Carcinoma and Its Relation to Prognosis; YonseiMed Journal 55(2014), s.861-870 207 Dominika Labochka, Barbara Moszczuk, Anna Czarnecka 24. Rasmuson T., Grankvist K., Jacobsen J., Olsson T., Ljungberg B.; Serum Insulin-Like Growth Factr-1 is an Independent Predictor of Prognosis in Patients with Renal Cell Carcinoma; Acta Oncologica 43(2004), s.744-748 25. Samani A.A., Yakar S., LeRoith D., Brodt P.; The Role of IGF System in Cancer Growth and Metastasis: Overview and Recent Insights; Endocrine Reviews 28(2007), s.20-47 Rola cukrzycy w występowaniu i przebiegu raka nerki Streszczenie Rak nerki to nowotwór stanowiący 2-3% nowotworów osób dorosłych. Ze względu na częstsze występowanie tego nowotworu w krajach zachodnich zaczęto doszukiwać się czynników ryzyka w występujących tam częściej chorobach cywilizacyjnych. W wielu badaniach udowodniono rolę palenia papierosów, nadciśnienia oraz innych czynników zespołu metabolicznego w występowaniu raka nerki. Cukrzyca, będąca jego składową, dotyka 5-7% populacji osób dorosłych na świecie. W grupie pacjentów z rakiem nerki ten odsetek jest znacznie większy. Waha się od 11% do nawet 25% (zarówno typ 1 jak i 2). Powstaje więc pytanie jaki wpływ tej choroby endokrynologicznej na wspomniany nowotwór? Dotychczas udowodniono, że cukrzyca zwiększa ryzyko występowania raka nerki (RCC), szczególnie raka jasnokomórkowego (ccRCC), niewielkich rozmiarów (średnica 1-5 cm), wpływa także na zmniejszenie średniego czasu przeżycia wolnego od progresji i zwiększa ilość nawrotów u chorych. Korelacje te są bardziej widoczne u kobiet. Dodatkowo cukrzyca może mieć rolę w rozpoznawaniu choroby - jako rzadko występujący zespół paraneoplastyczny. Patomechanizm wyżej opisanych korelacji nie jest do końca znany. Podejrzewa się współdziałanie wielu mechanizmów: hiperinsulinemii, hiperglikemi, hipertrofii nerek spowodowanej cukrzycą oraz wpływu uwalnianych w większej ilości cytokin pozapalnych i wolnych rodników tlenowych. Nie tylko cukrzyca, ale i czynniki prowadzące do jej rozwoju wpływają na występowanie raka nerki. Udowodniono korelację pomiędzy BMI a typem histopatologicznym raka nerki. Pacjenci otyli maja większe ryzyka rozwinięcia typu jasnokomórkowego. W literaturze można znaleźć badania zarówno potwierdzające jak i nie potwierdzające tych powiązań dlatego warto dokładniej przyjrzeć się temu zjawisku. The role of diabetes mellitus in incidence and course of renal cell carcinoma Abstract Renal cell carcinoma comprises 2-3% of all malignant tumors in adults. Due to higher incidence of this type of cancer in Western world, the scientists began to link this condition with increased number of diseases of affluence in developed countries. In many studies the key role of smoking, hypertension and other components of metabolic syndrome in occurrence with RCC was established. Diabetes mellitus (DM), one of the main consequences of metabolic syndrome, concerns 5-7% of adult population in the world. However, in patients with RCC it appears much more often, from 11% up to even 25% of patients (DM type 1 and 2). In that case, what is the impact of DM on renal cell carcinoma? It was proven that diabetes increases the incidence of RCC, especially smallsized (1-5 cm in diameter), clear-cell subtype (this link was more prominent in women). It decreases the progression free survival time and contributes to recurrences. As a rare paraneoplastic syndrome, it can play a part in early disease recognition. The mechanism 208 Rola cukrzycy w występowaniu i przebiegu raka nerki of this correlation is not fully explained. An involvement of a number of factors has been proposed: hyperinsulinemia (having a proven link with colon cancer), hyperglycemia, renal hypertrophy as a result of diabetes and an increased amount of of pro-inflammatory cytokines, reactive oxygen and lipid peroxidation. Not only diabetes, but also the factors leading to its development have an impact of RCC. There is a correlation between Body Mass Index and histological type of the tumor. Obese patients have higher incidence of clear-cell type. This phenomenon it worth taking a look at, because in medical literature research both confirming and denying this correlation can be found. 209 Weronika Bulska1, Łukasz B. Pilarz2 Choroby przyzębia ryzykiem raka trzustki 1. Wstęp Jama ustna stanowi barierę pomiędzy środowiskiem zewnętrznym i przewodem pokarmowym dzięki występującym szeregom mechanizmów zapobiegających zakażeniu, np. ochronna warstwa błony śluzowej, złuszczający się nabłonek, wydzielanie śliny oraz płynu dziąsłowego, obecność komórek żernych, takich jak : komórki NK, granulocyty obojętnochłonne, makrofagi. Brak higieny jamy ustnej i utrata zębów może potencjalnie wpływać na florę przewodu pokarmowego i stan odżywienia, a tym samym ma wpływ na rozwój chorób przewlekłych. Zły stan uzębienia, brak zębów są związane ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia nowotworów przewodu pokarmowego [1]. Duża część pacjentów cierpi na choroby przyzębia od lekkich postaci po ciężkie formy infekcji, z uszkodzeniem tkanek miękkich i kości. W literaturze donosi się o związku pomiędzy stanem zapalnym dziąseł, a chorobą wieńcową, miażdżycą, cukrzycą, ropniami wątroby, czy chorobami stawów [2]. W ostatniej dekadzie poszukuje się nowych, różnorodnych czynników, które wpływają na występowanie raka trzustki. W kilku badaniach kohortowych udowodniono zależność pomiędzy kancerogenezą trzustkową a zapaleniem przyzębia. Do udokumentowanych czynników ryzyka raka trzustki należą: palenie tytoniu, przewlekłe zapalenie trzustki, otyłość, cukrzyca 2 typu, nieprawidłowa dieta, czynniki genetyczne, związki kancerogenne, bakterie. Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w kancerogenezie trzustki, jednak nieznany jest wpływ innych, lokalnych zapaleń [3]. Celem niniejszej pracy jest zasygnalizowanie problemu chorób przyzębia jako czynnika ryzyka nowotworów złośliwych trzustki. Lepsze rozumienie biologii raka trzustki prowadzi do poszukiwania nowych metod leczniczych i zapobiegania kancerogenezie. 1 [email protected], Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, www.sum.edu.pl 2 [email protected], lekarz medycyny, Katedra i Oddział Kliniczny Otorynolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej w Zabrzu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, www.sum.edu.pl 210 Choroby przyzębia ryzykiem raka trzustki 2. Epidemiologia raka trzustki Rak trzustki stanowi 2 % wszystkich złośliwych nowotworów, wywodzących się z tkanki nabłonkowej. Nowotwory trzustki rozpoznaje się rocznie u ponad 232 000 osób na świecie, przy czym większą zachorowalność obserwuje się u mężczyzn. Liczba zachorowań na nowotwory złośliwe trzustki wynosiła w Polsce w 2010 roku 3200 (około 1600 u każdej z płci) [4]. Rak trzustki występuje najczęściej w 6 dekadzie życia, jednak w ostatnich latach granica wieku uległa obniżeniu i stwierdza się coraz większy odsetek chorych w 4 i 5 dekadzie życia [3,4]. Zapadalność częściej dotyczy rasy czarnej niż białej czy żółtej. Występowanie kancerogenezy trzustkowej jest wyższe w krajach rozwiniętych niż w krajach rozwijających się, jednak różnice te mogą wynikać z trudności w postawieniu odpowiedniej diagnozy w krajach, w których jest deficyt sprzętu. W większości przypadków rak trzustki wiążę się z wysoką śmiertelnością. Mniej niż 5 % chorych przeżywa 5 lat od rozpoznania. W Stanach Zjednoczonych rak trzustki jest czwartą wiodącą przyczyną zgonów, w Europie – szóstą [5]. Współczynnik śmiertelności: 𝐋𝐢𝐜𝐳𝐛𝐚 𝐳𝐠𝐨𝐧ó𝐰 𝐳 𝐩𝐨𝐰𝐨𝐝𝐮 𝐫𝐚𝐤𝐚 𝐭𝐫𝐳𝐮𝐬𝐭𝐤𝐢 𝐱 𝟏𝟎𝟎% 𝐋𝐢𝐜𝐳𝐛𝐚 𝐜𝐡𝐨𝐫𝐲𝐜𝐡 𝐧𝐚 𝐫𝐚𝐤𝐚 𝐭𝐫𝐳𝐮𝐬𝐭𝐤𝐢 = 98 % 3. Objawy raka trzustki Objawy raka trzustki zwykle pojawiają się w zaawansowanym stadium choroby i mogą być wynikiem reakcji ogólnoustrojowej lub miejscowego działania guza. Ból lokalizuje się w nadbrzuszu i często promieniuje do kręgosłupa. Jest wynikiem naciekania nerwów przez komórki nowotworowe i ucisku na przewód trzustkowy. W przypadku zajęcia głowy trzustki dochodzi do żółtaczki, która charakteryzuje się żółtym zabarwieniem skóry, błon śluzowych, białkówek, odbarwieniem stolca, ściemnieniem moczu, świądem skóry. Natomiast przy lokalizacji raka w trzonie lub ogonie trzustki, żółtaczka pojawia się dopiero po wystąpieniu przerzutów do wątroby lub węzłów chłonnych wnęki wątroby. Pęcherzyk żółciowy może być znacznie powiększony, wyczuwalny i niebolesny w badaniu przedmiotowym, co jest opisywane jako objaw Courvoisiera. Utrata masy ciała jest wynikiem braku apetytu, przyjmowaniem obniżonej ilości kalorii, obniżonego wydzielania enzymów trzustkowych i zaburzeń trawienia. Nudności, wymioty, objawy dyspeptyczne, biegunka są spowodowane reakcją ogólnoustrojową w chorobie nowotworowej, ale mogą być także wynikiem ucisku guza na jelita lub zaburzeń trawienia. 211 Weronika Bulska, Łukasz B. Pilarz U pacjentów z rakiem trzustki stwierdza się nietolerancję glukozy lub cukrzycę. Nowotwory trzustki wydzielają substancje prokoagulacyjne, co sprzyja zaburzeniom zakrzepowo-zatorowym, w tym: wędrującym zakrzepowym zapaleniu żył (objaw Trousseau), zatorowości płucnej, zakrzepicy żył głębokich. Zaburzenia psychiczne, przede wszystkim depresja są wtórne do utrzymujących się miesiącami: dyskomfortu w jamie brzusznej, osłabienia, chudnięcia. W zaawansowanych przypadkach stwierdza się opór w nadbrzuszu, hepatomegalię, splenomegalię, wodobrzusze, wyniszczenie, niedrożność dwunastnicy, krwawienie z przewodu pokarmowego [3,6]. W Tabeli 1. przedstawiono częstość objawów występujących w raku trzustki. Tabela 1. Częstość występowania objawów raka trzustki Częstość występowania (%) 78-82 66-84 50-86 56-80 80 64 62 54 48 Objawy raka trzustki Ból brzucha Utrata masy ciała Nudności i utrata masy ciała Żółtaczka Cukrzyca/nietolerancja glukozy Niedożywienie (anorexia) Wczesne uczucie sytości Zaburzenia snu Ból pleców Źródło: [7] 4. Czynniki ryzyka raka trzustki Czynnikami ryzyka raka trzustki nazywamy wszystkie stany, które zwiększają szansę na rozwój raka trzustki u danej osoby. Czynniki ryzyka dzielimy na poddające się wpływowi i modyfikowalne, np. palenie tytoniu, oraz niepodlegające zmianom i niemodyfikowalne, np. wiek [4]. 4.1. Palenie tytoniu Palenie tytoniu odpowiada za występowanie 25-95 % przypadków raka trzustki i jest uważane za najważniejszy czynnik kancerogenezy trzustkowej. U palaczy istnieje 2-3x większe ryzyko niż w populacji niepalącej. Predyspozycja rośnie wraz z liczbą wypalanych papierosów (>20 papierosów/24h), z czasem nadużywania tytoniu (>30 paczkolat), wiekiem, w którym rozpoczęto palenie papierosów (<18 r.ż.) [8]. 212 Choroby przyzębia ryzykiem raka trzustki 4.2. Nieprawidłowa dieta Bogatotłuszczowa i bogatobiałkowa dieta poprzez uwalnianie cholecystokininy powoduje hipertrofię miąższu trzustki, mogącą predysponować do rozwoju nowotworu. Uboga dieta w kwas foliowy sprzyja powstaniu raka trzustki. Dane dotyczące związku raka trzustki z piciem alkoholu są często kontrowersyjne. Ryzyko związane jest najpewniej z rozwojem marskości alkoholowej, przewlekłym zapaleniem trzustki i cukrzycą, a nie samego etanolu. Z kolei ochronne działanie ma prawdopodobnie spożywanie dużej ilości owoców i warzyw bogatych w witaminę C i błonnik. Opisywany był także korzystny wpływ spożywania czarnej herbaty, charakteryzującej się wysokim stężeniem polifenoli, hamujących powstawanie czynników rakotwórczych [6]. 4.3. Cukrzyca Podwyższone stężenie glukozy we krwi ma dwojakie znaczenie: może być wczesną manifestacją raka trzustki lub czynnikiem predysponującym. Ryzyko wystąpienia raka trzustki wśród chorych z cukrzycą jest dwukrotnie wyższe niż w populacji ludzi zdrowych. Cukrzyca ciężarnych także stanowi predyspozycję do nowotworzenia [3]. 4.4. Otyłość Niezależną predyspozycją kancerogenezy trzustkowej jest otyłość centralna, w której dochodzi do nadmiernego odkładania się tkanki tłuszczowej w regionie brzucha [4]. W tkance tłuszczowej wytwarzane są tzw. adipokiny (leptyna, rezystyna, czynnik martwicy nowotworu-TNF-alfa, interleukina-6), które biorą udział w insulinooporności, a zatem w cukrzycy, która jest ustalonym czynnikiem ryzyka nowotworu trzustki. W literaturze względne ryzyko raka trzustki stwierdza się u osób z BMI (Body Mass Index) >30kg/m2 [9]. 4.5. Czynniki genetyczne 10% przypadków raka trzustki jest związanych ze stwierdzoną predyspozycją genetyczną [3]. Dobrze poznane genetyczne zespoły nowotworowe, w których członkowie rodzin mają ryzyko zachorowania na nowotwór trzustki to: dziedziczny rak gruczołu sutkowego/jajnika, rodzinny atypowy wieloznamionowy zespół czerniaka, zespół PeutzJeghersa, dziedziczny rak jelita grubego niezwiązany z polipowatością, rodzinna polipowatość jelita grubego. 213 Weronika Bulska, Łukasz B. Pilarz 4.6. Helicobacter pylori Nadkwaśność soku żołądkowego i obecność gram (-) bakterii Helicobacter pylorii w żołądku może powodować wzrost ryzyka zachorowalności raka trzustki [10]. 4.7. Związki chemiczne Ekspozycja na benzydynę i betanaftylaminę są uważane za czynniki ryzyka raka trzustki [3,4,11]. 4.8. Grupa krwi Zapadalność na raka trzustki częściej dotyczy populacji, która ma grupę krwi inną niż 0 [3,4]. W piśmiennictwie dla społeczeństwa z allelami determinującymi grupę krwi A i B (w porównaniu z grupą 0) iloraz szans dla raka trzustki wynosił 1,3 do 2,43 [12]. 4.9. Choroby przyzębia Istnieje niewielka liczba badań nad wpływem stanu uzębienia i flory jamy ustnej na wzrost zachorowalności na nowotwór złośliwy trzustki. Stolzenberg-Solomon i wsp. [13] donoszą o częstszym występowaniu raka trzustki u pacjentów z całkowitą utratą zębów w porównaniu do pacjentów, którzy utracili 0-10 zębów, po analizie innych już udokumentowanych czynników. W badaniu kohortowym – NHANES (National Health and Nutrition Examination Survey ) [14] pacjenci z zapaleniem przyzębia lub brakiem zębów mieli wyższe ryzyko zgonu związane z prowadzonym leczeniem raka trzustki, po uwzględnieniu płci i wieku. W badaniu tym nie przeanalizowano ważnego czynnika predysponującego do raka – palenia tytoniu. Utrata zębów może być wskaźnikiem niezdrowego stylu życia i stanu ogólnego. Niedobór uzębienia prowadzi do ograniczonej możliwości żucia, a zatem do nieprawidłowego odżywiania. Bezzębni pacjenci spożywają większą ilość tłuszczów, w tym nasyconych oraz mniejszą ilość kwasu foliowego. Są to czynniki żywieniowe związane z ryzykiem wystąpienia raka trzustki [13]. W badaniu NHANES III (National Health and Nutrition Examination Survey III) zaobserwowano czterokrotny wzrost częstości raka trzustki u osób z ciężką postacią zapalenia przyzębia [15]. W prospektywnym badaniu - Health Professionals Follow-up Study [16] – wykazano silny związek pomiędzy chorobami przyzębia a rakiem trzustki. Obserwacja była prowadzona przez 16 lat. Po uwzględnieniu wieku, palenia tytoniu, cukrzycy, wskaźnika BMI i wielu innych 214 Choroby przyzębia ryzykiem raka trzustki czynników dietetycznych, pacjenci z chorobą przyzębia mieli 64% większe ryzyko wystąpienia raka trzustki w porównaniu z grupą, u której nie udokumentowano choroby przyzębia. Wśród osób niepalących ze schorzeniami przyzębia zaobserwowano wzrost ryzyka raka trzustki dwukrotnie. Związek pomiędzy zapaleniem przyzębia i występowaniem raka trzustki był bardziej znaczący wśród lekarzy stomatologów, którzy dokładniej zgłaszali występowanie dolegliwości w wywiadzie [17]. W ostatnich latach udowodniono związek pomiędzy niektórymi patogennymi bakteriami jamy ustnej a kancerogenezą trzustki. Jednym z takich patogennych drobnoustrojów jest Porphyromonas gingivalis, który odpowiada za choroby przyzębia. Jest to beztlenowa bakteria Gram (-) należąca do gromady Bacterioides. Zasiedla górny odcinek przewodu pokarmowego, układ oddechowy, okrężnice. W jamie ustnej odpowiada za degradację kolagenu w patogenezie schorzeń przyzębia. W badaniach in vitro wykazano, że wnika w fibroblasty dziąseł i może przetrwać w obecności znacznych stężeń antybiotyków. P. gingivalis atakuje także komórki nabłonkowate dziąseł [18]. P.gingivalis wywołuje przewlekłe zapalenie i aktywuje wrodzoną odpowiedź immunologiczną poprzez TLR2 i TLR4 (TLR-Toll-like receptor). TLR są grupą receptorów odgrywających rolę w sygnalizacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zakażenia, ponadto hamują apoptozę, pobudzają wzrost nowotworów i angiogenezę [1]. W badaniu kohortowym (European Prospective Investigation into Cancer, EPIC) przeprowadzonym na ponad 385 tys. mężczyzn i kobiet udowodniono dwukrotny wzrost ryzyka raka trzustki u pacjentów z wysokim poziomem przeciwciał przeciw patogenom Porphyromonas gingivalis, szczepu ATTC 53978. Wysokie poziomy przeciwciał dotyczyły wartości >200ng/ml. W badaniu EPIC przeanalizowano wpływ 25 antygenów bakteryjnych na ryzyko wystąpienia raka trzustki [19]. Podwyższony poziom przeciwciał przeciw P. gingivalis w badaniu NHANES III (National Health and Nutrition Examination Survey III) wiązał się ze zwiększoną śmiertelnością z powodu nowotworów przewodu pokarmowego. Nie przeprowadzono analizy pod względem śmiertelności z powodu raka trzustki i chorób przyzębia ze względu na niewystarczającą liczbę przypadków [15]. Naukowcy sugerują, że bakterie jamy ustnej, które są komensalami chronią przed inwazją drobnoustrojów patogennych. W Tabeli 2. umieszczono bakterie Gram (+) i (–) wchodzące w skład mikrobiomu jamy ustnej człowieka [19]. W badaniu EPIC pacjenci z wysokim poziomem przeciwciał przeciwko komensalom jamy ustnej wykazywali 45 % niższe ryzyko raka trzustki w porównaniu do pacjentów z niskim poziomem tych przeciwciał [19]. Farell i wsp.[20] także donoszą o odmiennym profilu mikrobiomu jamy ustnej u pacjentów z rakiem trzustki i grupy zdrowej. 215 Weronika Bulska, Łukasz B. Pilarz Neisseria elongata i Streptococcus mitis znacznie częściej występowały u osób zdrowych w porównaniu do grupy z rakiem trzustki. W badaniu kohortowym EPIC także potwierdzono odwrotną zależność pomiędzy S.mitis a kancerogenezą trzustkową [19]. Tabela 2. Mikrobiom jamy ustnej Mikrobiom jamy ustnej Gram (+) Actionmyces naeslundii Bifidobacterium Pentium Corynebacterium matruchotii Enterococcus faecalis Finegoldia magna Parvimonas micra Peptostreptococcus anaerobius Streptococcus intermedius Streptociccus mittis Streptococcus salivarius Gram (-) Captonocytophaga ochracea Eikenella corrodens Fusobacterium nucleatum Fusobacterium polymorphum Prevotella intermedia Prevotella melaninogenica Prevotella nigrescens Veillonella atypica Veillonella parvula Źródło: [19] Naukowe wytłumaczenie powiązania dwóch niezależnych jednostek chorobowych, jakimi są schorzenia przyzębia i rak trzustki, opiera się na podwyższonym poziomie markerów stanu zapalnego (CRP, Il-6, TNF-alfa, Il-1B,metaloprotezay), które mogą oddziaływać na komórki nowotworowe [21]. Stan zapalny jest kluczowym elementem rozwoju nowotworu. Nowotwory rozwijają się często w miejscach zakażenia, poddanych przewlekłym podrażnieniom i objętych stanem zapalnym. Związek pomiędzy zapaleniem a rakiem został po raz pierwszy opisany przez niemieckiego patologa Virchowa w XIX wieku. Ponadto pacjenci z chorobą przyzębia charakteryzują się nie tylko stanem zapalnym dziąseł, ale także infekcją bakteryjną, a zarazem wyższym stężeniem nitrozoamin, które są uważane za kancerogenny. Narażenie na azotany i azotyny pochodzą ze środowiska zewnętrznego, z pożywienia i wody. Szacuje się, że 45-75% nitrozoamin pochodzi z endogennej produkcji poprzez bakterie przewodu pokarmowego, które dokonują konwersji azotanu do azotynu i nitrozoamin. Pozostały odsetek substancji kancerogennej pochodzi z immunostymulacji i odpowiedzi makrofagów w wyniku pośredniej produkcji tlenku azotu. W literaturze zaobserwowano 8-krotny wzrost produkcji endogennych nitrozoamin u pacjentów z niedostateczną higieną jamy ustnej w porównaniu do grupy, utrzymującej prawidłową higienę [13]. W piśmiennictwie można również znaleźć informację o zwiększonym ryzyku występowania innych nowotworów w chorobach przyzębia. 216 Choroby przyzębia ryzykiem raka trzustki Największy wzrost ryzyka odnotowano w badaniach nad rakiem jamy ustnej i przełyku. Z powodu ograniczonej liczby badań nie potwierdzono, aby choroby przyzębia były czynnikiem ryzyka dla nowotworów hematologicznych, płuc i prostaty. Przypuszcza się, że patogenne drobnoustroje jamy ustnej mają większy związek z ryzykiem kancerogenezy u palaczy i osób nadużywających alkoholu z powodu lokalnego metabolizmu aktywnych kancerogenów przez bakterie. 5. Wnioski Brak uzębienia prowadzi do nieprawidłowego odżywienia, wzrostu spożycia kwasów tłuszczowych, które są udokumentowanym czynnikiem ryzyka raka trzustki. Choroby przyzębia poprzez stan zapalny mogą przyczyniać się do rozwoju kancerogenezy. Infekcja bakteryjna wiąże się z podwyższonym poziomem nitrozoamin, które są związkami kancerogennymi. Obecnie udowodnionymi patogenami przyczyniającymi się do nowotworzenia trzustki są bakterie gram (-): Helicobacter pylori i Porphyromonas gingivalis. Zaburzony stosunek ilościowy i jakościowy pomiędzy komensalami i patogennymi drobnoustrojami jamy ustnej wiąże się ze wzrostem ryzyka zachorowania na raka trzustki. 6. Podsumowanie Dokładny mechanizm wpływu chorób przyzębia na rozwój raka trzustki nie został jeszcze dostatecznie zbadany. Higiena jamy ustnej i zapobieganie zapaleniom przyzębia chroni nie tylko przed wczesną utratą zębów, ale także przed poważną konsekwencją, jaką jest kancerogeneza. Do czynników prewencyjnych raka trzustki należy dieta niskotłuszczowa, bogata w błonnik i witaminy, zaprzestanie palenia, aktywność fizyczna, w celu utrzymania należytej masy ciała, unikanie kontaktu z pestycydami, węglowodorami chlorowanymi oraz zapobieganie stanom zapalnym jamy ustnej, próchnicy i parodontozie. Literatura 1. 2. 3. Michaud D.S. Role of bacterial infections in pancreatic cancer, Carcinogenesis, 34 (2013), s. 2193-7 Ahmed U., Tanwir F Association of Periodontal Pathogenesis and Cardiovascular Diseases. A Literature Review, Oral Health Preventive Dentistry, (2014) Jurkowska G. Rak trzustki, W: Konturek S. red. Gastroenterologia i Hepatologia Kliniczna, PZWL, Warszawa 2006, s. 596-600 217 Weronika Bulska, Łukasz B. Pilarz 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. Krajowy rejestr nowotworów - http://onkologia.org.pl Gryniewicz-Kwiatkowska O. Rak trzustki, W: D. Perek red. Harrison Onkologia, Wydawnictwo Czelej, Lublin 2009, s. 287 Talar-Wojnarowska R., Małecka-Panas E. Objawy, diagnostyka i leczenie raka trzustki, Przewodnik Lekarza, 1(2007), s.87-93 Sharma C., Eltawil K.M., Renfrew P.D. i wsp. Advances in diagnosis, treatment and palliation of pancreatic carcinoma 1990-2010, World Journal of Gastroenterologu, 17 (2011), s.867-897 Kuzmickiene I., Everatt R., Virviciute D. i wsp. Smoking and other risk factors forpancreatic cancer: a cohort study in men in Lithuania, Cancer Epidemiology, 37(2013), s. 133-9 Zahorska-Markiewicz B., Olszanecka-Glinianowicz M. Insulinooporność, W: B. Zahorska-Markiewicz, E. Małecka-Tendera red. Patofizjologia kliniczna, wydawnictwo Elsevier, Wrocław 2009, s. 411-412 http://www.stmaryhealthcare.org/pancreaticcancerriskfactors Lowenfels A.B., Maisonneuve P. Epidemiology and Prevention of Pancreatic Cancer, Japanese Journal of Clinical Oncology, 34 (2004), s. 238-244 Yadav D., Lowenfels A.B. The Epidemiology of Pancreatitis and Pancreatic Cancer Gastroenterology, Gastroenterology, 144(2013), s. 1252-1261 Stolzenberg -Solomon R.Z., Dodd K.W., Blaser M.J. Tooth loss, pancreatic cancer, and Helicobacter pylori, The American Journal of Clinical Nutrition, 78(2003), 176-181 Hujoel P.P., Drangsholt M., Spiekerman C. An exploration of the periodontitiscancer association, Annals of Epidemiology,13(2003), s. 312-316 Ahn J., Segers S. Hayes R.B. Periodontal disease, Porphyromonas gingivalis serum antibody levels and orodigestive cancer mortality, Carcinogenesis, 33(2012), s. 1055-8 Michaud D.S., Joshipura K., Giovannucci E. i wsp. A prospective study of periodontal disease and pancreatic cancer in US male health professionals, Journal of the National Cancer Institute, 99(2007), s.171-5 Joshipura K.J., Douglass C.W., Garcia C.I. i wsp. Validity of a self-reported periodontal disease measure, Journal of Public Health Dentistry, 56 (1996), s. 205-212 Baek K.J., Ji S., Kim Y.C. i wsp. Association of the invasion ability of Porphyromonas gingivalis with the severity of periodontitis, Virulence (2015) Michaud D.S., Izard J., Wilhelm-Benartzi C.S i wsp. Plasma antibodies to oral bacteria and risk of pancreatic cancer in a large European prospective cohort study, Gut., 62 (2013), s.1764-70 Farrell J., Zhang L., Zhou H. i wsp. Variations of oral microbiota are associated with pancreatic diseases including pancreatic cancer, Gut, 61(2012), s. 582-588 Meyer M.S., Joshipura K., Giovannucci E. i wsp. A review of the relationship between tooth loss, periodontal disease, and cancer, Cancer Causes and Control, 19(2008), s. 895-907 Fitzpatrick S.G., Katz J. The association between periodontal disease and cancer: a review of the literature, Journal of Dentistry, 38(2010), s. 83-95 218 Choroby przyzębia ryzykiem raka trzustki Choroby przyzębia ryzykiem raka trzustki Streszczenie Liczba zachorowań na nowotwory złośliwe trzustki wynosi dwieście tysięcy rocznie na całym świecie, częściej u mężczyzn. W większości przypadków rak trzustki wiążę się z wysoką śmiertelnością. Mniej niż 5 % chorych przeżywa 5 lat od rozpoznania. Zabieg operacyjny jest jedynym postępowaniem dającym szanse na wyleczenie. Objawy raka trzustki to: żółtaczka, bóle brzucha, promieniujące do kręgosłupa, biegunka, nudności, wymioty, wzdęcia, spadek masy ciała, gorączka, niestrawność, depresja, złe samopoczucie, cukrzyca, wodobrzusze, wędrujące zakrzepowe zapalenie żył. Do udokumentowanych czynników ryzyka raka trzustki należą: palenie tytoniu, przewlekłe zapalenie trzustki, otyłość, cukrzyca 2 typu. Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w kancerogenezie trzustki, jednak nieznany jest wpływ innych lokalnych zapaleń. Zły stan uzębienia, brak zębów są związane ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia nowotworów przewodu pokarmowego. W ostatniej dekadzie poszukuje się innych, różnorodnych czynników, które wpływają na występowanie raka trzustki. W kilku badaniach kohortowych udowodniono zależność pomiędzy kancerogenezą trzustkową a zapaleniem przyzębia. Zaburzony stosunek pomiędzy komensalami i patogennymi drobnoustrojami jamy ustnej wiąże się z wzrostem ryzyka zachorowania na raka trzustki. Infekcja bakteryjna wiąże się z podwyższonym poziomem nitrozoamin, które są kancerogenami. Obecnie udowodnionymi bakteriami przyczyniającymi się do nowotworzenia trzustki są Helicobacter pylori i Porphyromonas gingivalis. Celem niniejszej pracy jest zasygnalizowanie problemu chorób przyzębia jako czynnika ryzyka nowotworów złośliwych trzustki. Lepsze rozumienie biologii raka trzustki prowadzi do poszukiwania nowych metod leczniczych. Periodontal disease – risk of pancreatic cancer Abstract The incidence of pancreatic cancer is two hundred thousand a year around the world, often in men. In most cases of pancreatic cancer is associated with high mortality. Less than 5% of patients survive 5 years after diagnosis. Surgery is the only investigation that opens opportunities for cure. The symptoms of pancreatic cancer include: jaundice, abdominal pain, radiating to the spine, diarrhea, nausea, vomiting, bloating, weight loss, fever, indigestion, depression, malaise, diabetes, ascites, migrating thrombophlebitis. Risk factors for pancreatic cancer include: smoking, chronic pancreatitis, obesity, diabetes type 2. Inflammation plays a key role in pancreatic carcinogenesis, but the unknown is the impact of other local inflammation. Poor condition of teeth, missing teeth are associated with an increased risk of gastrointestinal cancers. In the last decade sought other, diverse factors which influence the occurrence of pancreatic cancer. Several studies have shown a relationship between pancreatic carcinogenesis and periodontitis. Impaired relationship between commensal and pathogenic microorganisms of the oral cavity associated with an increased risk of developing pancreatic cancer. Bacterial infection is associated with elevated levels of nitrosamines, which are carcinogens. Helicobacter pylori and Porphyromonas gingivalis are bacteria contributing to pancreatic carcinogenesis. The aim of study is to signal the problem of periodontal disease as a risk factor for malignant tumors of the pancreas. Better understanding of the biology of pancreatic cancer leads to the search for new therapeutic approaches. 219 Justyna Markowicz1, Anna Bzdek2, Izabela Rysz3, Agnieszka Szymczyk4, Tomasz Roman5, Ewelina Grywalska6 Ocena wybranych parametrów immunologicznych w grupie chorych na raka krtani – badanie wstępne 1. Wstęp Rak krtani jest obecnie najczęściej występującym nowotworem złośliwym w obrębie głowy i szyi, szczególnie u mężczyzn, u których stanowi istotną przyczynę śmiertelności. Według danych pochodzących z Krajowego Rejestru Nowotworów jest on na dziewiątym miejscu, pod względem częstości występowania, nowotworem złośliwym u mężczyzn, po raku płuc, gruczołu krokowego, skóry, raku okrężnicy, pęcherza moczowego, żołądka, odbytnicy i nerki rys.1. 1 [email protected], Katedra i Zakład Immunologii Klinicznej, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 2 [email protected], Katedra i Klinika otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 3 [email protected], Katedra i Zakład Immunologii Klinicznej, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 4 [email protected], Katedra i Klinika hematoonkologii i Transplantacji szpiku, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 5 [email protected], Zakład Radiologii Zabiegowej i Neuroradiologii,, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 6 [email protected], Katedra i Zakład Immunologii Klinicznej, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl 220 Ocena wybranych parametrów immunologicznych w grupie chorych na raka krtani – badanie wstępne Rysunek 1. Zachorowania na nowotwory złośliwe u mężczyzn w Polsce w 2012 roku według częstości występowania. Opracowanie własne na podstawie [1] Dane statystyczne z ostatnich 30 lat wskazują na spadkowy trend dotyczący zarówno zachorowalność jak i umieralności z powodu rak krtani, szczególnie w populacji mężczyzn. Niestety pomimo szeroko zakrojonych działań mających na celu opracowanie nowych, bądź doskonalenia obecnie stosowanych strategii terapeutycznych, umieralność z powodu raka krtani w naszym kraju jest wciąż wyższa w porównaniu do średniej dla innych państw europejskich [1]. Przeważającym typem histologicznym wśród nowotworów złośliwych krtani jest rak płaskonabłonkowy stanowiący ponad 95% [2,3]. Najczęstszą lokalizacją anatomiczną jest głośnia, guzy te stanowią 47,3% wszystkich nowotworów złośliwych krtani [4] Ryzyko wystąpienia raka krtani wzrasta wraz z wiekiem. Większość nowotworów złośliwych krtani stwierdza się po 50 roku życia [1]. Ich etiopatogeneza jest niewątpliwie wieloczynnikowa, 221 Justyna Markowicz, Anna Bzdek, Izabela Rysz, Agnieszka Szymczyk, Tomasz Roman, Ewelina Grywalska a rozwój obejmuje wieloetapową kancerogenezę poprzedzoną zmianami dysplastycznymi w obrębie błony śluzowej górnych dróg oddechowych. Wśród czynników o najlepiej udowodnionym potencjale onkogennym na pierwszym miejscu wymienia się ekspozycję na dym tytoniowy i nadużywanie mocnych napojów alkoholowych [5,6]. Należy podkreślić, że szczególnie ryzykowna jest równoczesna ekspozycja na dym tytoniowy i alkohol, zwiększająca ryzyko zachorowania ponad 300- krotnie [7]. W ostatnim czasie coraz szerzej mówi się o roli wirusa brodawczaka ludzkiego (ang. human papilloma virus – HPV) w rozwoju nowotworów regionu głowy i szyi, w tym raka krtani. Jest to związane z zachowaniami seksualnymi takimi jak wczesna inicjacja seksualna, częsta zmiana partnerów czy seks oralny, które sprzyjają rozprzestrzenianiu się wirusa. Występowanie raków HPV – zależnych wiąże się z obserwowanym w ostatnich latach obniżeniem średniego wieku chorych, wzrostem zachorowalności wśród kobiet oraz słabiej wyrażonym związkiem pomiędzy ekspozycją na klasyczne czynniki kancerogenne a rozwojem choroby [8]. Do podstawowych metod leczenia raka krtani należą leczenie chirurgiczne i/lub radioterapia. W zaawansowanych stanach stosuje się leczenie skojarzone. Chemioterapia stosowana jako samodzielna metoda leczenia raka krtani jest nieskuteczna. Ma ona zastosowanie w połączeniu z radioterapią (chemioradioterapia) jako terapia indukcyjna lub jako leczenie uzupełniające lub leczenie paliatywne. Wybór terapii jest indywidualny i uzależniony od wielu czynników tj. stopień zaawansowania klinicznego choroby, stan ogólny chorego, choroby współistniejące czy preferencje pacjenta co do sposobu leczenia [9, 10,11]. Układ immunologiczny, inaczej zwany układ odpornościowy lub limfatyczny, to system organizmu odpowiedzialny za zwalczanie obcych antygenów, takich jak patogeny chorobotwórcze, komórki nowotworowe czy heterogenne tkanki. Niestety wszelakie zaburzenia w jego obrębie mogą skutkować rozwojem wielu poważnych schorzeń [12]. Przeprowadzone w ostatniej dekadzie badania kliniczne wskazują na istotną rolę czynników immunologicznych w przebiegu chorób nowotworowych u ludzi [13]. Odpowiedź przeciwnowotworowa obejmuje zarówno wytwarzanie przeciwciał jak i mechanizmy komórkowe. Ucieczka spod mechanizmów immunologicznych obrony przeciwnowotworowej uniemożliwia prawidłowe rozpoznawanie i eliminację neoplastycznych komórek skutkując niepohamowanym rozwojem choroby. Wyjaśnienie interakcji zachodzących pomiędzy układem immunologicznym a komórkami nowotworowymi ma szczególne znaczenie w ocenie przebiegu choroby i rokowania a także w świetle prowadzonych obecnie badaniami nad wykorzystaniem układu immunologicznego do walki z nowotworami [14]. W ostatnich latach coraz większą uwagę poświęca się immunoterapii jako nowej, obiecującej 222 Ocena wybranych parametrów immunologicznych w grupie chorych na raka krtani – badanie wstępne metodzie leczenia zaawansowanych stadiów nowotworów głowy i szyi, w tym również raków krtani. Terapia to polega na stosowaniu czynników biologicznych, wybiórczych w stosunki do komórek nowotworowych. Obecnie nie jest ona jednak stosowana w monoterapii, lecz w leczeniu skojarzonym [15]. 2. Cel pracy Głównym celem pracy była analiza wybranych parametrów immunologicznych ocenianych na subpopulacji limfocytów w grupie pacjentów z rakiem krtani oraz osób zdrowych a tym samym poszerzenie zakresu wiedzy dotyczącej zaburzeń immunologicznym w przebiegu choroby. 3. Materiały i metody 3.1. Charakterystyka pacjentów Badaniem objęta została grupa 10 osób z histopatologicznym rozpoznaniem raka płaskonabłonkowego krtani, pacjentów Katedry i Kliniki Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. Byli to pacjenci w różnych stadiach zaawansowania klinicznego wg TNM, którzy nie otrzymywali wcześniej leczenia przeciwnowotworowego. Średni wiek pacjentów w grupie badanej wynosił 66,1±11,05 lat. Grupę kontrolną stanowiło 10 osób zdrowych, w średnim wieku 65,57 ±3,23 lat. 3.2. Materiał do badań Badany materiał stanowiła krew obwodowa pobierana z żyły odłokciowej w ilości 20 ml do jałowych strzykawek zawierających heparynę sodową (Polfa, Warszawa) w ilości 20 j/ml krwi celem izolacji komórek mononuklearnych. 3.3. Izolacja komórek mononuklearnych Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej wykonana została w gradiencie gęstości, ocenie poddana była zarówno liczebność, jak i żywotność (poniżej 95% uznano za kryterium dyskwalifikujące komórki z dalszych badań). 223 Justyna Markowicz, Anna Bzdek, Izabela Rysz, Agnieszka Szymczyk, Tomasz Roman, Ewelina Grywalska 3.4. Ocena antygenów powierzchniowych limfocytów z pomocą cystometrii przepływowej Do oceny antygenów powierzchniowych limfocytów izolowanych z krwi obwodowej wykorzystana została krew pełna. Odpowiednie przeciwciała monoklonalne dodawane były w ilości po 5ul na probówkę. Do każdej z probówek zawierających przeciwciała monoklonalne dodawano krew pełna w ilości 30 ul. Mieszaninę następnie inkubowano przez 20 min w temperaturze pokojowej. Po inkubacji do każdej z probówek dodawano roztwór lizujący w ilości 2ml, a następnie poddawano 8 minutowej inkubacj w temperaturze pokojowej. Po inkubacji komórki były dwukrotnie przepłukane roztworem PBS (700 x g, 5 minut) i niezwłocznie poddawane analizie w cytometrze przepływowym FACSCalibur (BD Biosciences). Do analizy wyników i ich graficznej prezentacji wykorzystano program komputerowy CellQuest (Becton Dickinson). 3.5. Analiza statystyczna Analizę statystyczną wykonano przy użyciu programu Statistica 9.0, za poziom istotności statystycznej przyjmując wartość p<0,05. 4. Analiza wyników W badanych grupach oceniono wartości odsetkowe limfocytów T (CD3+) i ich subpopulacji tj. limfocyty pomocnicze (Th) CD4+/CD3+, limfocyty cytotoksyczne (Tc) CD8+/CD3+ oraz limfocytów B (CD19+). W obrębie wyżej wymienionych subpopulacjach komórek określono ekspresję cząsteczki PD-1. Wyniki analizy przedstawia Tabela 2. 224 Ocena wybranych parametrów immunologicznych w grupie chorych na raka krtani – badanie wstępne Tabela 2. Wyniki Grupa kontrolna (n=10) % limfocytów CD19+ CD3+ CD3+/CD 4+ CD3+/CD 8+ CD19+/P D-1+ CD3+/PD1+ CD4+/PD1+ CD8+/PD1+ średnia± SD 9,44 ± 4,52 68,70 ± 12,65 34,35 ± 7,10 30,95 ± 7,63 5,50 ± 3,86 6,65 ± 7,31 5,83 ± 6,76 5,63 ± 6,37 (min. maks.) (2,50 18,20) (39,19 81,92) (18,62 44,69) (16,32 47,11) (0,46 12,29) (0,07 24,77) (0,01 21,44) (0,11 21,61) Grupa badana (n=10) średnia (min. ± SD maks.) 11,29 (7,82 ±3,02 16,19) 65,57 (61,49 ±3,23 69,74) 45,39 (41,29 ±2,64 48,85) 31,15 (26,66 ±3,20 36,67) 1,65 ± (0,18 1,29 3,82) 7,56 ± (5,02 2,20 11,22) 4,32 ± (2,52 1,27 6,25) 3,22 ± (1,53 1,37 5,47) p NS NS 0,00 02 NS 0,00 52 NS NS NS Źródło: Opracowanie własne Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy odsetkami limfocytów CD3+ i CD19+ w badanych grupach. Wśród pacjentów z rakiem krtani odsetek komórek T CD3+/CD4+ wynosił 34,35±7,10 i był niższy w porównaniu do osób zdrowych (45,39±2,64, p= 0,000218). Odsetek komórek T CD3+/CD8+ nie różnił się istotnie pomiędzy grupą badaną i kontrolną rys. 2. 225 Justyna Markowicz, Anna Bzdek, Izabela Rysz, Agnieszka Szymczyk, Tomasz Roman, Ewelina Grywalska Rysunek 2. Odsetek wybranych sybpopulacji limfocytów w grupie badanej i kontrolnej Wykazano istotną statystycznie różnicę pomiędzy analizowanymi grupami w odniesieniu do odsetka komórek B CD19+/PD-1+ (p=0,0052). W grupie badanej wartości odsetka limfocytów B z ekspresją PD-1 (5,50±3,86) były wyższe w porównaniu do grupy kontrolnej (1,65± 1,29). Nie wykazano natomiast zależności pomiędzy odsetkiem limfocytów T CD3+/PD-1+, T CD4+/PD-1+ oraz T CD8+/PD-1+ a obecnością choroby nowotworowej rys.3. 226 Ocena wybranych parametrów immunologicznych w grupie chorych na raka krtani – badanie wstępne Rysunek Rysunek 3. Odsetek wybranych subpopulacji limfocytów z ekspresją PD-1 w grupie badanej i kontrolnej 5. Dyskusja Badania ostatnich lat donoszą o niezaprzeczalnej roli czynników immunologicznych w przebiegu chorób nowotworowych u ludzi, w tym nowotworów głowy i szyi. W światowym piśmiennictwie znaleźć można liczne prace na temat oceny mechanizmów odpowiedzi komórkowej i humoralnej wskazujące na ważną rolę, głównie limfocytów CD4+ i CD8+ oraz cytokin wydzielanych przez te komórki, w procesie rozrostu nowotworowego. Należy podkreślić, iż dysfunkcja układu odpornościowego nie tylko może leżeć u podłoża chorób nowotworowych, ale także stanowić jej bezpośredni skutek, gdyż sam nowotwór prowadzi do powstania zaburzeń immunologicznych. Zaburzenia te mogę mieć zarówno charakter ilościowy i manifestować się odchyleniami od normy w zakresie liczebności poszczególnych populacji komórek immunologicznych, ale także jakościowy związany nieprawidłową ich funkcją [14,16]. W naszej pracy oceną objęliśmy odsetek wybranych populacji limfocytów izolowanych z krwi obwodowej chorych na raka krtani oraz osób zdrowych. Zbliżoną, choć szerszą analizę w odniesieniu do raka krtani i gardła przeprowadzili Chen W. i wsp. Wykazali oni istotnie niższy 227 Justyna Markowicz, Anna Bzdek, Izabela Rysz, Agnieszka Szymczyk, Tomasz Roman, Ewelina Grywalska odsetek limfocytów T (p<0,05) i wyższy odsetek limfocytów supresorowych (nieocenianych w naszym badaniu ) w grupie badanej w porównaniu z kontrolą, jak również nieznacznie niższy, w odniesieniu do osób zdrowych, odsetek limfocytów pomocniczych. Nie była to jednak zależność istotna statystycznie [17]. W przeciwieństwie do powyższych wyników, w analizowanych przez nas grupach, wartość odsetkowa komórek CD+3 nie różniła się znaczącą pomiędzy osobami chorymi i zdrowym (p<0,05). Obserwowaliśmy natomiast, podobnie jak Chikamatsu K. i wsp., w przypadku nowotworów głowy i szyi, istotnie niższy odsetek limfocytów pomocniczych w grupie badanej (p<0,05) [18]. Ze względy na profil wytwarzanych cytokin wśród limfocytów pomocniczych wyróżnia się dwie zasadnicze subpopulacje - komórki Th1 i Th2. Największe znaczenie w obronie przeciwnowotworowej pełnią cytokiny profilu Th1: IL2, IL-12, IL-18, INF-γ, TNF-α. Predysponują one do rozwoju odporności komórkowej, w której rolę komórek efektorowych pełnią limfocyty CD8+ [14,19]. W przebiegu raka krtani obserwowano zaburzenia równowagi pomiędzy subpopulacjami Th1/Th2 oraz przesunięcie jej w kierunku limfocytów o profilu cytokinowych charakterystycznym dla Th2. Jak donosi Bleotu C. i wps. w zaawansowanych stadiach raka krtani odnotowano redukcję poziomu IL-2 i INF-γ w krwi obwodowej osób cierpiących na ten nowotwór. Wśród pacjentów, u których stwierdzono obecność przerzutów węzłowych obserwowano znaczny spadek poziomu INF-γ w porównaniu do pacjentów w stadium N0 choroby [20,21]. Zgodnie z danymi literaturowymi zmianom w liczebności poszczególnym populacji komórek immunologicznych w przebiegu raka krtani towarzyszy również zmiana ich aktywności manifestujące się min. obniżeniem aktywności komórek CD3+, CD4+ i NK [22]. Limfocyty cytotoksyczne o immunofenotypie CD3+/CD8+ stanowią jeden z elementów układu immunologicznego zaangażowany w obronę przeciwnowotworową. Komórki te zdolne są do rozpoznawania i eliminacji komórek potencjalnie nowotworowych. Niektóre z publikacji opisują zwiększoną liczebności tej populacji komórkowej w krwi obwodowej osób chorych na raka krtani, być może jako przejaw próby zwalczania choroby przez układ odpornościowy. Dworacki G. i wsp. opisali ponadto korelację pomiędzy podwyższonym poziomem komórek cytotoksycznych w tkance limfatycznej w przypadku przerzutów do obwodowych węzłów chłonnych [23]. Natomiast Żeromski J. i wsp. podają, że zwiększenie liczebności limfocytów CD8+ w tkance guza w grupie chorych na raka krtani towarzyszyło mniej zaawansowanym stadiom choroby T1 i T2 [24]. W przeprowadzonej przez nas analizie nie wykazano jednak istotnych statystycznie różnić pomiędzy badanymi grupami w odniesieniu do odsetka komórek CD3+/CD8+. Podobnie stosunek komórek CD4+/CD8+ nie różnił 228 Ocena wybranych parametrów immunologicznych w grupie chorych na raka krtani – badanie wstępne się znacząco pomiędzy osobami zdrowymi i chorymi na raka krtani. W odróżnieniu od naszych wyników Chen W. i wsp. obserwowali obniżony stosunek tych komórek wśród chorych cierpiących na raka krtani [17]. Ze względu na wciąż niezadowalające wyniki leczenia zaawansowanych postaci raka krtani, poszukuje się nowych czynników prognostycznych, które pozwolą na indywidualizację terapii, a tym samym wpłyną na poprawę rokowania w tej grupie chorych. Poszerzenie wiedzy na temat zaburzeń immunologicznych towarzyszących chorobie nowotworowej stwarza szansę na znalezienie możliwość ich leczenia. Negatywne receptory kostymulujace pełnią funkcje immunomodulujące względem limfocytów. Mogą być one wykorzystane przez komórki nowotworowe do ucieczki spod mechanizmów nadzoru immunologicznego. Wśród tych molekuł wyróżnia się min. receptor programowanej śmierci (PD-1) oraz jego ligandy, a zastosowanie skierowanych przeciwko nim przeciwciał jest przedmiotem wielu badań klinicznych [25]. Cząsteczka PD-1 (CD279) jest receptorem błonowym z rodziny receptorów sygnałowych CD28-B7. Wykazuj ona właściwości hamujące względem odpowiedzi immunologicznej ze strony limfocytów T. Receptor PD-1 ulega ekspresji przede wszystkim na aktywowanych limfocytach T oraz B, ale także aktywowanych monocytach i komórkach dendrytycznych. PD-1 jest aktywowany w momencie związania jednego z dwóch ligandów: PD-L1 i PD-L2. Ekspresję molekuły opisywano w przypadku wielu ludzkich nowotworów w tym w nowotworów głowy i szyi, gdzie wiązała się ona z niekorzystnym wpływem na przebieg kliniczny schorzenia. W przypadku raków głowy i szyi wysoką ekspresję tego markera stwierdzono na pobudzonych antygenami wirusowymi limfocytach T cytotoksycznych [26,27]. W przeprowadzonej przez nas analizie stwierdzono wyższy odsetek komórek CD8+/PD-1+ w grupie pacjentów chorych na raka krtani w porównaniu z osobami zdrowymi, lecz nie była to zależność istotna statystycznie. Wykazaliśmy natomiast istotną statystycznie różnice w ekspresji cząsteczki PD-1 na limfocytach B (p<0,05). W prezentowanym badaniu materiał do izolacji limfocytów i oceny ekspresji cząsteczki PD-1 stanowiła krew obwodowa osób chorych na raka krtani. Interesującym zagadnieniem wydaje się ocena tej molekuły na limfocytach naciekających tkankę guza czyli komórkach TIL (tumor infiltrating lymphocytes), gdyż to właśnie na tych komórkach wykazano znacznie wyższą ekspresję molekuły PD-1 w porównaniu do limfocytów krwi obwodowej. W kontekście mechanizmów odporności przeciwnowotworowej na szczególną uwagę zasługują obecność cząsteczki CD8+ w mikrośrodowisku guza nowotworowego. Jak donoszą Lyford-Pike S. i wsp. limfocyty te cechują się one wysoką ekspresją cząsteczki PD-1, lecz ich zdolność do produkcji cytokin tj. INF-γ czy TNF-α a tym samym 229 Justyna Markowicz, Anna Bzdek, Izabela Rysz, Agnieszka Szymczyk, Tomasz Roman, Ewelina Grywalska właściwości cytotoksyczne są osłabione w porównaniu do cząsteczek CD8+/PD-1+ izolowanych z krwi obwodowej pacjentów cierpiących na nowotwory złośliwe głowy i szyi [28]. Znaczenie prognostyczne nacieku limfocytarnego w mikrośrodowisku i bezpośrednio w tkance guza badano w wielu nowotworach. W ostatnim czasie coraz częściej analizuję się ekspresję molekuły PD-1 na komórkach TIL w odniesieniu do raków HPV-zależnych regionu głowy i szyi jako potencjalny, nowy czynnik prognostyczny. Dane literaturowe na ten temat są jednak rozbieżne [29,30,31,32]. W ostatnich latach PD-1 i PD-L1 stały się celem do immunoterapii z wykorzystaniem specyficznych przeciwciał monoklonalnych. Obecnie trwają badania kliniczne min. dotyczące blokadą tego szlaku przy pomocy przeciwciał anty-PD-1 i anty-PD-L1 w nowotworach głowy i szyi [26,27]. Otrzymane wyniki stanowią wstępny etap badań mających na celu poszukiwanie nowych, niezależnych czynników prognostycznych wśród chorych na raka krtani. W prezentowanej analizie nie uwzględniono stopnia zróżnicowania klinicznego i histopatologicznego choroby nowotworowej, z powodu małej liczny osób wchodzących w skład grupy badanej. Mamy jednak nadzieję iż, kontynuacja badań umożliwi weryfikację powyższych wyników oraz uwzględnienie w kolejnych analizach parametrów klinicznych. 6. Wnioski W przebiegu raka krtani dochodzi do zaburzeń mechanizmów odpornościowych manifestujących się zmiennym odsetkiem wybranych populacji limfocytów krwi obwodowej w porównaniu do osób zdrowych, jak również prawdopodobnie do hamowania odpowiedzi immunologicznej zależnej od limfocytów T poprzez wzrost ekspresję cząsteczki PD-1 na limfocytach krwi obwodowej. Literatura 1. 2. 3. http://onkologia.org.pl/wp-content/uploads/Rok2012.pdf Ren J., Zhu D., Liu M., Sun Y., Tian L. Downregulation of miR-21 modulates Ras expression to promote apoptosis and suppress invasion of Laryngeal squamous cell carcinoma, European Journal of Cancer., 43 (2010), s. 3409-3416 Kawecki A., Nawrocki S. Nowotwory nabłonkowe narządów głowy i szyi. W Zalecenia postępowania diagnostyczno-terapeutycznego w nowotworach złośliwych T1 red. Krzakowski M., Dziadziuszko R., Fijuth J., Herman K., Jarosz J., Jarząb M., Jassem J., Kawecki A., Kornafel J., Kowalski D. M., Krzemieniecki K., Litwiniuk M., Mazurkiewicz T., Mądry R., Misiak M., Nawrocki S., Polkowski W., Potemski P., Rubach M., Rutkowski P., Stelmach A., Wysocki P. J., Via Medica., (2011), s.1-5, 19-22 230 Ocena wybranych parametrów immunologicznych w grupie chorych na raka krtani – badanie wstępne 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Bień S., Kamiński B., Żyłka S., Meżyk R., Piasta Z. Evolutionof the epidemiology and clinical characteristics of larynx and hypopharynx carcinoma in Poland from 1991 to 2001, European Archives of Otorhinolaryngol., 265 (2008), s.39-46 Pantel M., Guntinas-Lichius O. Laryngeal carcinoma: Epidemiology, risk factors and survival, HNO., 2012;60:32-40 Vineis P., Alavanja M., Buffler P., et al. Tobacco and cancer: recent epidemiological evidence, Journal of the National Cancer Institute., 96 (2004), s. 99-106 Osuch-Wójcikiewicz E., Janczewski G. i wsp. Rak krtani i gardła dolnego Otolaryngologia praktyczna ViaMedica (2007)., s. 507-517 Szyfter K., Wierzbicka M. Rola wirusa brodawczaka (HPV) w nowotworach głowy i szyi Postępy w chirurgii głowy i szyi., 2 (2008), s. 41-50 Mendenenhall W.M., Amdur R.J. Treatment of laryngeal cancer, Journal of Hong Kong College of Radiologists., 4 (2001), s. 116-118 Wasilewska -Teśluk E. Leczenie chirurgiczne czy zachowawcze – aktualne pytanie w radykalnym leczeniu raka krtani, Współczesna Onkologia., 8 (2004), s. 255-258 Habl G., Jensen A.D., Potthoff K., Uhl M., Hof H., Hajda J., et al. Treatment of locally advanced carcinomas of head and neck with intensity-modulated radiation therapy (IMRT) in combination with cetuximab and chemotherapy: the REACH protocol, BioMed Cenrtal Cancer., 10 (2010), s.651 Harris T.J., Drake C.G. Primer on tumor immunology and cancer immunotherapy,Journal for ImmunoTherapy of Cance.r, (2013), s.1-12 Klatka J., Grywalska E., Wasiak M., Wdowiak P., Andrzejczak A., Trzaskowska E., Roliński J. The assessment of selected molecules belonging to B7 family on the mature dendritic cells in laryngeal cancer patients, Otolaryngologia Polska., 66 (2012), s. 413-418 Starska K., Łukomski M. Rola limfocytów Th i Tc w powstawaniu i progresji nowotworów głowy i szyi, Otolaryngologia., 4 (2004), s. 59-63 Arends M.J., Morris R.G., Wyllie A.H. Apoptosis: The role of endonuclease, American Journal of Pathology, 136 (3) (1990) s. 593 Duray A., Demoulin S., Hubert P., Delvenne P., Saussez S.Immune Suppression in Head and Neck Cancers: A Review, Clinical and Developmental Immunology.,(2010), s.701657 Chen W., Wang X., Tao R. Analysis of serum T-lymphocyte subsets and NK cell activity in patients with squamous cell carcinoma of pharynx and larynx, Lin chuang er bi yan hou tou jing wai ke za zhi., 25 (2011), s.1105-1107 Chikamatsu K., Sakakura K., Whiteside T.L. et al. Relationships between regulatory T cells and CD8+ effector populations in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck, Head & Neck., 29(2007), s.120-127 Romagnani S. Th1/Th2 cells, Inflammatory Bowel Diseases., 5 (1999), s.285-295 Bleotu C., Chifiriuc M.C., Grigore R. et al. Investigation of Th1/Th2 cytokine profiles in patients with laryngo-pharyngeal, HPV-positive cancers, European Archives of Oto-Rhino-Laryngology, 270 (2013), s. 711-718 231 Justyna Markowicz, Anna Bzdek, Izabela Rysz, Agnieszka Szymczyk, Tomasz Roman, Ewelina Grywalska 21. Eyigor M., Eyigor H., Osma Y.et al. Analysis of serum cytokine levels in larynx squamous cell carcinoma and dysplasia patient, Iranian journal of immunology., 11 (2015), s. 259-268 22. Li Y., Che Z., Liang M. Study on the immune state of patients with laryngeal carcinoma, Lin chuang er bi yan hou tou jing wai ke za zhi., 11 (1997), s.69-72 23. Dworacki G., Szczepański M., Kruk-Zagajewska A. i wsp. Cytotoxic T lymphocytes in peripheral blood and regional lymph nodes in laryngeal cancer patients, Otolaryngologia Polsk., 58 (2004), s. 1071-1076 24. Zeromski J., Pietrzak J., Szmeja Z. i wsp. Evaluation of phenotype of mononuclear host cells isolated from primary tumour and peripheral blood of patients with laryngeal carcinoma, Acta Oto-Laryngologica., 105 (1988), s.149-154 25. http://www.rsi2004.lubelskie.pl/doc/sty7/art/Grzywnowicz_Maciej_art.pdf 26. Lyford-Pike S., et al. Evidence for a Role of the PD-1:PD-L1 Pathway in Immune Resistance of HPV-Associated Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, Cancer Research, 73 (2013), s.1733-1741 27. Riella L.V., et al. Role of the PD-1 Pathway in the Immune Response American Journal of Transplantation, 12(10) (2012), s. 2575-2587 28. Lyford-Pike S., Peng S., Young G.D. et al. Evidence for a role of the PD1:PD-L1 pathway in immune resistance of HPV-associated head and neck squamous cell carcinoma, Cancer Research., 73 (2013), s. 1733-1741 29. Badoual C., Hans S., Merillon N. et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research., 73 (2013), s. 128-138 30. Hsu M.C, Hsiao J.R., Chang K.C. et al. Increase of programmed death-1expressing intratumoral CD8 T cells predicts a poor prognosis for nasopharyngeal carcinoma, Modern Pathology., 23(2010), s.1393-1403 31. Uppaluri R., Dunn G.P., Lewis J.S. Focus on TILs: prognostic significance of tumor infiltrating lymphocytes in head and neck cancers, Canncer Immunology., 4(2008), s. 8-16 32. Pai S.I. Adaptive immune resistance in HPV-associated head and neck squamous cell carcinoma, Oncoimmunology,. 2 (2013) Ocena wybranych parametrów immunologicznych w grupie chorych na raka krtani – badanie wstępne Streszczenie Wstęp: Ze względu na epidemiologię oraz niezadowalające wyniki leczenia zaawansowanych postaci raka krtani, stanowi on istotny problem medyczny. Poszerzenie wiedzy na temat zaburzeń immunologicznych towarzyszących chorobie może przyczynić się do poprawy rokowania w tej grupie pacjentów. Celem pracy była analiza wybranych parametrów immunologicznych ocenianych na subpopulacji limfocytów w grupie pacjentów z rakiem krtani oraz osób zdrowych. Materiał i metody: Badaniem objęto 10 nieleczonych chorych z rozpoznaniem płaskonabłonkowego raka krtani oraz 10 zdrowych osób dorosłych, stanowiących grupę kontrolną. Materiałem do badań była krew obwodowa. Wyizolowane limfocyty znakowano przeciwciałami monoklonalnymi z barwnikami fluorescencyjnymi oraz analizowano przy pomocy cytometru przepływowego FACSCalibur. Analizę 232 Ocena wybranych parametrów immunologicznych w grupie chorych na raka krtani – badanie wstępne statystyczną wykonano przy użyciu programu Statistica 9.0, za poziom istotności statystycznej przyjmując wartość p<0,05. Wyniki: Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy odsetkami limfocytów CD3+ i CD19+ w badanych grupach. Wśród pacjentów z rakiem krtani odsetek komórek T CD3+/CD4+ wynosił 34,35±7,10 i był niższy w porównaniu do osób zdrowych (45,39±2,64, p= 0,000218). Wykazano ponadto istotną statystycznie różnicę pomiędzy analizowanymi grupami w odniesieniu do odsetka komórek B CD19+/PD-1+ (p=0,0052). W grupie badanej wartości odsetka limfocytów B z ekspresją PD-1 (5,50±3,86) były wyższe w porównaniu do grupy kontrolnej (1,65± 1,29). Wnioski: Przeprowadzona analiza wybranych parametrów immunologicznych ocenianych na subpopulacji limfocytów w grupie pacjentów z rakiem krtani oraz osób zdrowych pozwoliła na poszerzenie zakresu wiedzy dotyczącej zaburzeń immunologicznym w przebiegu choroby. Kontynuacja badań umożliwi weryfikację powyższych wyników oraz uwzględnienie w kolejnych analizach parametrów klinicznych. Assessment of selected immune parameters of patients with laryngeal cancer - a preliminary study Abstract Introduction: Because of the high prevalence of laryngeal cancer (LC) and unsatisfactory treatment outcomes it constitutes a significant medical problem. Extending a current state of knowledge concerning immune alterations accompanying the disease, can further improve the prognosis in patients with LC. Objective: to estimate. selected immunological parameters among lymphocytes in the group of LC patients and healthy donors.M aterials and methods: The study group encompassed 10 patients with a diagnosis of primary planoepithelial LC without preoperative treatment and 10 healthy controls. Peripheral blood was collected from each person in amount of 5ml in order to isolate mononuclear cells. Isolated lymphocytes were labeled with a specific combination of antibodies and fluorochromes, and subsequently analyzed using three-color flow cytometer FACSCalibur and CellQuest program. For statistical analysis we used Statistica 9.0 program and the level of statistical significance was p<0.05. Results: Study and control group did not differ significantly regarding percentages of CD3+ and CD19+ cells. Study revealed that among patients with LC the percentage of CD3+/CD4+ cells (34,35±7,10) was lower in comparison to controls (45,39±2,64, p= 0,000218). Furthermore the differences in the percentage of B cells with CD19 expression were observed among analyzed groups. The percentage of CD19+/PD-1 B cells (5,50±3,86) was elevated in the study group compared to healthy controls (1,65± 1,29, p=0,052). Conclusions: Conducted assessment of selected immunological parameters among lymphocytes in the group of LC patients and healthy donors enabled to extend current knowledge regarding immunological disturbances occuring in the course of the disease. Our data reacquire further investigation and wider analysis considering clinical parameters. 233 Anna Kozioł1, Katarzyna Wojewoda2, Kamil Muc3 Analiza wybranych cech kliniczno – patomorfologicznych przypadkowo wykrytego raka stercza u pacjentów poddanych cystoprostatektomii 1. Rak pęcherza – wprowadzenie Rak pęcherza moczowego (ang. bladder cancer – BC) jest najczęściej występującym nowotworem układu moczowego oraz dziewiątym wśród najczęściej diagnozowanych nowotworów na świecie[1]. W Polsce standaryzowany współczynnik zachorowalności szacowany na rok 2013 wynosił 16,6 dla mężczyzn oraz 3,7 dla kobiet[2]. W około 75% przypadków nowo wykryty rak pęcherza ma charakter powierzchowny (ang. non-muscle-invasive bladder cancer – NMIBC), ograniczony jest do błony śluzowej lub podśluzowej i leczony przezcewkowo z użyciem resektoskopu[3]. W pozostałych 25%, komórki nowotworowe naciekają warstwę mięśniową ściany pęcherza (ang. muscle-invasive bladder cancer – MIBC), a metodą leczenia jest radykalna cystektomia. Wśród czynników ryzyka rozwoju raka pęcherza moczowego, na pierwszym miejscu wymienia się dym tytoniowy, przy czym częstotliwość występowania BC jest związana zarówno z czasem trwania nałogu, jak i ilością wypalanych w ciągu dnia papierosów[4]. Równie istotna wydaje się być ekspozycja zawodowa na aminy aromatyczne i pochodne benzenu, na które szczególnie narażeni są pracownicy przemysłu farbiarskiego, gumowego, tekstylnego, czy skórzanego[5]. Częstość występowania raka pęcherza zwiększa się również u pacjentów poddanych radioterapii z pól zewnętrznych i brachyterapii skierowanej na okolice miednicy mniejszej, cierpiących na przewlekłe infekcje dróg moczowych, czy schistosomiazę[6]. 1.1. Diagnostyka i objawy 1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym 2 Studenckie Koło Naukowe przy Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym 3 Klinika Urologii i Onkologii Urologicznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 234 Analiza wybranych cech kliniczno-patomorfologicznych przypadkowo wykrytego raka stercza u pacjentów poddanych cystoprostatektomii Najbardziej charakterystycznym objawem raka pęcherza moczowego jest bezobjawowy krwiomocz. Wśród pozostałych wymienia się objawy dyzuryczne, parcia naglące, częstomocz, a w zaawansowanym stadium choroby ból w miednicy mniejszej. Każdy pacjent, u którego podejrzewa się obecność guza w pęcherzu moczowym, powinien mieć wykonane badanie dwuręczne. Pozwala ono na stwierdzenie obecności patologicznej masy oraz określenie jej ruchomości względem ścian miednicy mniejszej. Badaniem nieinwazyjnym, przydatnym w diagnostyce guzów o dużym stopniu złośliwości, wywodzących się z nabłonka wyściełającego drogi moczowe, jest cytologia moczu[6]. Analizie poddaje się świeżo oddaną próbkę moczu, z drugiej lub kolejnej mikcji w ciągu dnia. Nieprawidłowości w badaniu fizykalnym, dodatni wynik cytologii moczu, albo obecność guza stwierdzona przypadkowo w badaniach obrazowych jest podstawą do rozpoczęcia diagnostyki inwazyjnej. Wziernikowanie pęcherza moczowego (cystoskopia) jest badaniem pozwalającym na dokładne obejrzenie całej powierzchni błony śluzowej pęcherza i określenie lokalizacji, wielkości, oraz wyglądu każdej znalezionej zmiany. Przezcewkowa resekcja guza pęcherza (ang. transurethral resection of bladder tumor – TURB) jest procedurą diagnostyczno – terapeutyczną, umożliwiającą uzyskanie materiału do badania histopatologicznego w celu określenia typu histologicznego guza i stopnia jego złośliwości (grading – G). Najczęściej rozpoznawanym typem raka pęcherza jest rak urotelialny (>90% przypadków), w około 5% przypadków występuje rak płaskonabłonkowy[7]. Do oceny stopnia zaawansowania (staging) niezbędne jest pobranie leżącego bezpośrednio pod guzem fragmentu ściany pęcherza moczowego wraz z włóknami mięśnia wypieracza. Dodatkowe badania obrazowe – CT lub MRI służą do oceny wielkości guza, obecności przerzutów w węzłach chłonnych i narządach odległych (klasyfikacja TNM), a ich wyniki pomagają w ocenie rokowania i wyborze opcji terapeutycznej. 1.2. Radykalna cystektomia Cystektomia radykalna jest metodą leczenia z wyboru w raku pęcherza naciekającym błonę mięśniową, w lokalnym stadium zaawansowania, przy braku przerzutów w węzłach chłonnych i narządach odległych. Operacja polega na resekcji pęcherza moczowego wraz z końcowymi odcinkami moczowodów, przylegającymi narządami, oraz regionalnymi węzłami chłonnymi, do których zalicza się wszystkie węzły chłonne miednicy poniżej rozwidlenia aorty. U mężczyzn usuwany jest gruczoł krokowy wraz z pęcherzykami nasiennymi, a u kobiet macica i cewka moczowa wraz 235 Anna Kozioł, Katarzyna Wojewoda, Kamil Muc z przylegającą do niej przednią ścianą pochwy. Ostatnim etapem zabiegu jest zapewnienie odprowadzenia moczu. Wykonywanie cystektomii zaleca się u chorych z MIBC w stadium zaawansowania T2 – T4a, N0-Nx, M0[8]. Stopień zaawansowania T2 według aktualnie stosowanej klasyfikacji TNM z 2009 oznacza, że guz nacieka błonę mięśniową, a T4a – guz nacieka stercz, macicę lub pochwę[9]. Wśród innych wskazań do zabiegu radykalnego wymienia się: wysokiego ryzyka, nawracający NMIBC; Tis (rak in situ) oporny na leczenie BCG; T1G3 – niskozróżnicowany rak naciekający tkankę łączną podnabłonkową; rozległy rozrost brodawczaka, który nie może być kontrolowany i usuwany przezewkowo[6]. 1.3. Rak gruczołu krokowego Rak prostaty jest najczęściej występującym nowotworem wśród mężczyzn w populacji Europejskiej. W Polsce, jest drugim po raku płuca najczęstszym nowotworem, a jego standaryzowany współczynnik zachorowalności szacowany na rok 2013, wynosi 36,2[2]. Wśród głównych czynników ryzyka wystąpienia raka stercza wymienia się wiek, obciążenie genetyczne oraz pochodzenie etniczne[10]. Integralną częścią analizie histopatologicznej preparatu po radykalnej cystoprostatektomii, jest badanie usuniętego gruczołu krokowego wraz z pęcherzykami nasiennymi. Patomorfolog poszukuje nacieku raka urotelialnego ognisk śródnabłonkowego nowotworzenia – PIN (ang. prostate intraepithelial neoplasia) lub ognisk raka prostaty. Po stwierdzeniu obecności komórek gruczolakoraka, ocenia stopień histologicznej złośliwości oraz stopień zaawansowania przypadkowo rozpoznanego nowotworu. W celu ewaluacji stopnia złośliwości histologicznej, używa się 10punktowej skali Gleasona. Opiera się ona na ocenie architektoniki dwóch przeważających pod względem objętości typów komórek nowotworowych. Każdy z nich klasyfikowany jest w pięciostopniowej skali, w której komórki niskozróżnicowane, atypowe są oceniane na 5, a komórki wysokozróżnicowane, najbardziej przypominające prawidłową tkankę gruczołu na 1. Określenie stopnia zaawansowania klinicznego dokonywane jest w oparciu o klasyfikację TNM z 2009, którą przedstawia tabela 1. 236 Analiza wybranych cech kliniczno-patomorfologicznych przypadkowo wykrytego raka stercza u pacjentów poddanych cystoprostatektomii Tabela 1. Rak stercza – klasyfikacja TNM 2009 T – guz pierwotny nie ma możliwości oceny guza pierwotnego Tx nie ma dowodów na istnienie guza pierwotnego T0 guz klinicznie niejawny, którego nie stwierdza się w badaniu T1 klinicznym i badaniach obrazowych T1a guz wykryty przypadkowo na podstawie badania histopatologicznego w ≤ 5% wyciętej tkanki gruczołu krokowego T1b guz wykryty przypadkowo na podstawie badania histopatologicznego w > 5% wyciętej tkanki gruczołu krokowego T1c guz zidentyfikowany na podstawie biopsji stercza (np. wykonanej z powodu podwyższonego poziomu PSA) guz ograniczony do gruczołu krokowego T2 T2a guz obejmuje mniej niż połowę jednego płata gruczołu krokowego T2b guz obejmuje więcej niż połowę jednego płata gruczołu krokowego, ale nie zajmuje drugiego płata T2c guz obejmuje oba płaty gruczołu krokowego guz nacieka poza torebkę stercza T3 T3a naciek szerzy się poza torebkę stercza jedno lub obustronnie, naciekiem objęta jest szyja pęcherza T3b guz nacieka jeden lub oba pęcherzyki nasienne nieruchomy guz nacieka na struktury otaczające inne niż pęcherzyki T4 nasienne - zwieracz zewnętrzny, odbytnicę, mięsień dźwigacz odbytnicy i/lub ścianę miednicy mniejszej N – regionalne węzły chłonne nie ma możliwości oceny węzłów chłonnych Nx brak przerzutów do węzłów chłonnych N0 przerzuty w regionalnych węzłach chłonnych N1 M – przerzuty odległe Mx nie można ocenić obecności przerzutów M0 nie ma przerzutów odległych M1 przerzuty odległe M1a – przerzuty do węzłów chłonnych innych niż regionalne M1b – przerzuty do kości M1c – przerzuty o innej lokalizacji Źródło: opracowanie własne na podstawie[10] 2. Cel pracy Celem pracy była ocena częstości występowania oraz analiza wybranych cech kliniczno – patomorfologicznych przypadkowo wykrytego raka stercza u pacjentów poddanych radykalnej cystoprostatektomii, wykonywanej z powodu naciekającego mięśniówkę raka pęcherza moczowego. 237 Anna Kozioł, Katarzyna Wojewoda, Kamil Muc 3. Materiały i metody Przeanalizowano wyniki badań histopatologicznych oraz historie choroby 143 pacjentów poddanych cystoprostatektomii w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie w latach 2004-2014. Pacjenci zostali zakwalifikowani do leczenia operacyjnego na podstawie wyniku badania histopatologicznego potwierdzającego obecność MIBC w wycinkach pobranych podczas TURT, albo mimo braku naciekania mięśnia wypieracza występowały u nich wskazania do radykalnej cystektomii określone w wytycznych EAU (ang. European Association of Urology). W celu określenia klinicznego stopnia zaawansowania choroby, oraz statusu węzłów chłonnych, przed operacją pacjenci mieli wykonaną tomografię komputerową jamy brzusznej i miednicy. Chorych przeanalizowano pod kątem wieku, typu histologicznego raka pęcherza moczowego, obecności jego naciekania na gruczoł krokowy, stanu węzłów chłonnych i marginesów chirurgicznych, poziomu stężenia PSA przedoperacyjnego oraz charakterystyki współistniejącego gruczolakoraka stercza. Do gromadzenia i analizowania danych użyto programu Microsoft Excel oraz Statistica 10. W analizie stosowano t- Studenta, przyjęto że różnice są istotne statystycznie, jeśli poziom istotności p < 0,05. 4. Analiza danych Wiek pacjentów poddanych cystoprostatektomii zawierał się w przedziale od 43 do 87 lat (średnia 63,59). Największy odsetek stanowili chorzy w szóstej dekadzie życia (wykres 1). Wykres 1. Analiza wieku pacjentów [opracowanie własne] 238 Analiza wybranych cech kliniczno-patomorfologicznych przypadkowo wykrytego raka stercza u pacjentów poddanych cystoprostatektomii Obecność nieprawidłowych komórek w obrębie gruczołu krokowego opisano u 89 pacjentów (tabela 2). 25 przypadków (17% badanych) stanowili pacjenci, u których obrębie gruczołu krokowego obecny był naciek raka pęcherza moczowego (T4a). W 16 preparatach (11%) znaleziono ogniska nowotworzenia śródnabłonkowego (PIN). U 61 chorych poddanych cystoprostatektomii (43% przypadków) stwierdzono obecność gruczolakoraka stercza. U 13 pacjentów (8,7%) potwierdzono współistnienie nacieku raka urotelialnego z ogniskami PIN lub raka stercza. Tabela 2. Nieprawidłowości w obrębie stercza stwierdzone w badaniu histopatologicznym Ilość pacjentów 12 12 52 4 9 Zmiany w gruczole krokowym naciek raka urotelialnego PIN rak stercza naciek raka urotelialnego + PIN naciek raka urotelialnego + rak stercza Źródło: Opracowanie własne W oparciu o ocenę mikroskopową preparatów pooperacyjnych, określono stopień zaawansowania patomorfologicznego raka stercza. U 52 pacjentów (85%) nowotwór był ograniczony do gruczołu krokowego, przy czym najczęściej ogniska raka znajdywano w obu płatach prostaty. U pozostałych chorych stwierdzono obecność komórek gruczolakoraka poza torebką stercza, w 3 przypadkach (5%) naciek obejmował pęcherz moczowy (wykres 2). Wykres 2. Ocena stopnia zaawansowania raka stercza [opracowanie własne] 239 Anna Kozioł, Katarzyna Wojewoda, Kamil Muc Przeanalizowano również ocenę stopnia histologicznej złośliwości raka stercza w badanym materiale. W 50 przypadkach (82%), stopień zróżnicowania został oceniony na <7 w skali Gleasona, u 5(8%) chorych wynosił 7, u pozostałych >7. Wśród pacjentów, u których zidentyfikowano ogniska nowotworzenia śródnabłonkowego, u 13 stwierdzono dysplazję dużego stopnia (high – grade PIN), u 3 pozostałych dysplazję niskiego stopnia (low – grade PIN). Dysplazja wysokiego stopnia (high – grade PIN) High – grade PIN jest traktowana jako stan przedrakowy, na jej podłożu rozwijają się prawie wszystkie przypadki raka stercza[11]. Badaniem histopatologicznym objęto dystalne fragmenty moczowodów oraz część sterczową cewki moczowej, wyścielone nabłonkiem urotelialnym. Ognisko raka in situ w moczowodzie zidentyfikowano u 5 pacjentów (3,5%), a raka inwazyjnego moczowodu w 2 przypadkach (1,4%). U 1 pacjenta (0,7%) usunięto również nerkę z moczowodem, z powodu współistniejącego raka miedniczki nerkowej G2. W cewce opisywano ogniska nieinwazyjnego brodawczaka (2 przypadki) oraz ogniska raka urotelialnego in situ (4 preparaty – 2,8%). Ocenie poddano również węzły chłonne pobrane w czasie cystoprostatektomii. Obecność przerzutów w regionalnych węzłach chłonnych stwierdzono u 38 pacjentów (27%). W 35 przypadkach w węzłach stwierdzono ogniska przerzutowe metastatyczne raka urotelialnego, a w 3 pozostałych, raka gruczołu krokowego. Istotnym elementem pozwalającym na ocenę radykalności zabiegu, jest stan marginesów chirurgicznych. O dodatnich marginesach mówimy, gdy patomorfolog stwierdzi obecność komórek nowotworowych w obwodowych skrawkach preparatu, w linii cięcia chirurgicznego. W przeanalizowanych wynikach histopatologicznych dodatnie marginesy opisano u 18 chorych (12,6%). W 12 przypadkach w linii cięcia zidentyfikowano komórki raka pęcherza moczowego, w 4 przypadkach brzegi preparatu naciekał gruczolakorak stercza, natomiast w 2 przypadkach stwierdzono obecność obu typów komórek nowotworowych na obwodzie preparatu. Specyficzny antygen sterczowy (ang. prostate specyfic antygen – PSA) jest białkiem nieswoistym dla raka stercza. Norma zawiera się w przedziale 0-4 ng/ml, a wzrost jego poziomu jest wskazaniem do poszerzenie diagnostyki. W badanej grupie, poziom PSA w surowicy wahał się w przedziale od 0,1 do 31,6 ng/ml (średnia 2,26ng/ml). Wśród pacjentów, u których nie stwierdzono zaburzeń architektoniki gruczołu krokowego średnia wartość PSA wynosiła 1,27 ng/ml, a w grupie z ogniskami PIN – 1,92 ng/ml, co okazało się istotne statystycznie (p=0,03). U chorych z rakiem stercza średni poziom PSA 240 Analiza wybranych cech kliniczno-patomorfologicznych przypadkowo wykrytego raka stercza u pacjentów poddanych cystoprostatektomii wyniósł 3,34 ng/ml, co w porównaniu do grupy z niezmienionym gruczołem krokowym, również okazało się istotne statystycznie (p=0,0003). 5. Dyskusja Przeprowadzone analizy wykazały, że u 43% pacjentów (61 osób) operowanych z powodu raka pęcherza moczowego stwierdzono współistnienie procesu nowotworowego w obrębie gruczołu krokowego. Uzyskane przez nas dane znajdują odzwierciedlenie w piśmiennictwie. Według EAU, w analizie histopatologicznej rozpoznaje się gruczolakoraka stercza u 25-46% pacjentów poddanych cystoprostatektomii [6]. Radykalne leczenie naciekającego mięśniówkę raka pęcherza moczowego stanowi coraz większe wyzwanie dla współczesnej medycyny. Jest to nowotwór mogący być potencjalną przyczyną zgonu pacjenta, a stosowane metody chirurgiczne w znaczący sposób wpływają na jakość jego życia (ang. quality of life – QoL). Ocenia się, że bardziej istotny wpływ na obniżenie QoL mają tylko zabiegi operacyjne w obrębie głowy i szyi[12]. Konieczność zastosowania leczenia radykalnego jest szczególnie kwestionowany u młodych mężczyzn, ze względu na konieczność usunięcia prostaty i pęcherzyków nasiennych. Potrzeba ograniczenia niekorzystnego wpływu operacji na jakość życia tej grupy chorych, motywuje do opracowywania technik pozwalających na zachowanie stercza lub jego części, albo samych pęczków naczyniowo – nerwowych. Taki zakres zabiegu pozwala na zachowanie funkcji seksualnych oraz prawidłową czynność zwieracza cewki, co jest szczególnie ważne przy planowanej rekonstrukcji ortotopowej. Metody te budzą jednak spore kontrowersje ze względu na trudniejsze zachowanie czystości onkologicznej. Zwolennicy zabiegów oszczędzających, wymieniają ich korzyści w postaci zachowania wzwodu prącia i pooperacyjnego trzymania moczu. Przeciwnicy wyrażają obawę o radykalność takiego zabiegu i związane z nim ryzyko wznowy i progresji. Ze względu na dużą częstość współistnienia raka stercza, zabieg ten wydaje się szczególnie ryzykowny u starszych mężczyzn. Kolejnym potencjalnym argumentem, przemawiającym przeciwko technikom oszczędzającym, jest możliwość występowania raka urotelialnego w błonie śluzowej cewki sterczowej, która szacowana jest na 20-48%[13]. Mertens et al. w oparciu o 20 – letnie doświadczenie w wykonywaniu cystoprostatektomii z zaoszczędzeniem stercza podaje, że zabiegi te są bezpieczne pod względem onkologicznym i dają dobre rezultaty czynnościowe[14]. W odstępie do 2 lat od zabiegu, w grupie 120 pacjentów, 96,2% utrzymało kontynencję w nocy i w ciągu dnia, a 89,7% zachowało erekcję z prawidłowym wytryskiem. Ten sposób leczenia, może być 241 Anna Kozioł, Katarzyna Wojewoda, Kamil Muc wykonywany tylko u starannie wyselekcjonowanej grupy chorych. Zastosowanym kryterium wykluczającym zabieg oszczędzający, była obecność guza w szyi pęcherza lub części sterczowej cewki, rak gruczołu krokowego, przedoperacyjne zaburzenia erekcji oraz decyzja pacjenta o poddaniu się cystoprostatektomii radykalnej. Z kolei operacja oszczędzająca pęczki Welscha daje efekty w postaci zachowaniu funkcji seksualnych u 60- 80% operowanych i zapewnia pełne trzymanie moczu u 90-100%[15]. Na chwilę obecną standardem nadal pozostaje dająca lepszy efekt onkologiczny cystoprostatektomia radykalna. Cystektomia z zaoszczędzeniem stercza powinna być rozważana tylko u starannie wyselekcjonowanych grup pacjentów. W praktyce klinicznej, istotnym problemem jest określenie rokowania u pacjentów z dwoma nowotworami o odmiennej etiologii. Schorzeniem dominującym, z powodu którego zostali poddani cystoprostatektomii, jest u tych chorych MIBC. Dodatkowo należy określić istotność kliniczną współistniejącego raka gruczołu krokowego. O nieistotnym klinicznie raku stercza mówimy, jeśli w badaniu histopatologicznym stwierdzi się obecność gruczolakoraka ograniczonego do narządu (stopień zaawansowania≤T2c), stopień histologicznej złośliwości oceni się na ≤6 w skali Gleasona, a objętość guza nie przekracza 0,5 cm3[16]. W naszej grupie badanych, kryteria te spełniało 49 pacjentów. Wykryty u nich rak stercza był niemy klinicznie, a o dalszym rokowaniu tych chorych przesądza stopień zaawansowania i złośliwości nowotworu urotelialnego. U pozostałych chorych, u których rak stercza naciekał torebkę gruczołu lub rozpoznano gruczolakoraka w stadium T4, rokowanie jest zdecydowanie gorsze. Należy ich monitorować pod kątem progresji obu nowotworów. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. Siegel R., Naishadham D., Jemal A. Cancer statistics 2013, CA: a cancer journal for clinicians 2013;63:11-30 Didkowska J., Wojciechowska U., Zatoński W. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2011, http://onkologia.org.pl/wpcontent/uploads/COI_Nowotwory2013_web.pdf, [dostęp 14.03.2015] Burger M., Catto J.W., Dalbagni G., Grossman H.B., Herr H. et al. Epidemiology and risk factors of urothelial bladder cancer, European Urology 2013;63(2):234-241 Brennan P., Bogillot O., Cordier S., Greiser E., Schill W. et al. Cigarette smoking and bladder cancer in men: a pooled analysis of 11 case-control studies, Interantional Journal of Cancer 2000;86(2):289-294 Pashos C.L., Botteman M.F., Laskin B.L., Redaelli A. Bladder cancer: epidemiology, diagnosis, and management, Cancer Practice 2002;10(6):311-322 242 Analiza wybranych cech kliniczno-patomorfologicznych przypadkowo wykrytego raka stercza u pacjentów poddanych cystoprostatektomii 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Stenzl A., Cowan N.C., De Santis M., Kuczyk M.A., Merseburger A.S. et al. Treatment of Muscle-invasive and Metastatic Bladder Cancer: Update of the EAU Guidelines, European Urology 2011;59(6):1009–1018 Poletajew S. Patologia raka pęcherza moczowego, Przegląd Urologiczny 2013;80(4):43-46 World Health Organization (WHO) Consensus Conference in Bladder Cancer, R.E. Hautmann, H. Abol – Enein, K. Hafez, I. Haro, et al. Urinary diversion, Urology 2007;69(1 Suppl):17-49 Sobin L.H., Gospodariwicz M., Wittekind C. TNM classification of malignant tumors. UICC International Union Against Cancer. 7th edition. Oxford: Wiley-Blackwell, 2009:262-265 Heidenreich A., Bastian P.J., Bellmunt J., Bolla M., Joniau S. et al. EAU guidelines on prostate cancer. part 1: screening, diagnosis, and local treatment with curative intent-update 2013, European Urolology 2014;65(1):124-137 Qian J., Bostwick D.G. The extent and zonal location of prostatic intraepithelial neoplasia and atypical adenomatous hyperplasia: relationship with carcinoma in radical prostatectomy specimens, Pathology, research and practice 1995;191(9):860-867 Muto G. Prostate-Sparing Cystectomy: Two Sides of the Moon, European Urology 2008;53: 237-239 Wyczółkowski M. Czy postępowanie oszczędzające stercz przy zabiegu usunięcia pęcherza moczowego jest wciąż uznawane za radykalną cystektomię? Argumenty przeciw cystektomii z oszczędzeniem stercza, Przegląd Urologiczny 2010;60(2):37 Mertens L.S., Meijer R.P., de Vries R.R., Nieuwenhuijzen J.A., van der Poel H.G. et al. Prostate sparing cystectomy for bladder cancer: 20-year single center experience, The Journal of Urology 2014;191(5):1250-1255 Antoniewicz A.A., Zapała Ł. Cystektomia radykalna - standard operacji we współczesnej uroonkologii, Przegląd Urologiczny 2011;66(2):17-23 Ploussard G., Epstein J.I., Montironi R., Carroll P.R., Wirth M. et al. The Contemporary Concept of Significant Versus Insignificant Prostate Cancer, European Urology 2011;60:291-303 Analiza wybranych cech kliniczno – patomorfologicznych przypadkowo wykrytego raka stercza u pacjentów poddanych cystoprostatektomii Streszczenie Rak pęcherza moczowego jest najczęstszym nowotworem układu moczowego oraz dziewiątym wśród najczęściej diagnozowanych nowotworów na świecie. W około 75% przypadków rak pęcherza, ograniczony jest do błony śluzowej lub podśluzowej i leczony przezcewkowo z użyciem resektoskopu. U 25% pacjentów nowotwór nacieka błonę mięśniową pęcherza moczowego, a metodą z wyboru jest radykalna cystektomia. Celem pracy była ocena częstości występowania oraz analiza wybranych cech kliniczno – patomorfologicznych przypadkowo wykrytego raka stercza wśród pacjentów poddanych radykalnej cystoprostatektomii. Przeanalizowano wyniki histopatologiczne 143 pacjentów poddanych cystoprostatektomii 243 Anna Kozioł, Katarzyna Wojewoda, Kamil Muc w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie w latach 2004-2014. Oceniono częstość współwystępowania raka stercza w uzyskanym materiale, jego grading oraz staging. Obecność raka gruczołu krokowego została stwierdzona u 43% pacjentów poddanych cystoprostatektomii (61 przypadków). U 52 pacjentów (85%) nowotwór był ograniczony do stercza, w 3 przypadkach (5%) staging określono na T4. Stopień złośliwości histologicznej w 50 przypadkach (82%) został oceniony na <7 w skali Gleasona. W 15 preparatach (10,5%) stwierdzono obecność nowotworzenia śródnabłonkowego (PIN). W 21 przypadkach (15%) na stercz naciekał rak urotelialny. Przypadkowo wykryty rak stercza jest z reguły niemy klinicznie, a o dalszym rokowaniu przesądza stopień zaawansowania i złośliwości nowotworu urotelialnego. Pacjentów poddanych cystoprostatektomii radykalnej należy monitorować pod kątem wznowy lub progresji obu nowotworów. Ze względu na duże ryzyko współistnienia raka prostaty, cystektomia z zaoszczędzeniem stercza powinna być zarezerwowana tylko dla starannie wyselekcjonowanej grupy pacjentów. Clinicopathological characterization of incidentally discovered prostate cancer in patients after cystoprostatectomy Abstract Bladder cancer is the most common malignancy of the urinary tract and the ninth most commonly diagnosed cancer worldwide. Approximately 75% of bladder cancer cases are defined as confined to the mucosa or submucosa and transurethrally treated with resectoscope. In 25% of patients, cancer invades the muscular layers of bladder and radical cystectomy is a preferred procedure. The objective of the paper was to evaluate the incidence and characterize several clinocopathological features of incidentally detected prostate cancer in patients after radical cystoprostatectomy. Medical history of 143 patients who underwent cystoprostatectomy in the Urology and Oncological Urology Department of Medical University of Lublin between 2004 and 2014 were analyzed. Prostate cancer incidence, grade and stage were recorded. Lymph nodes status was assessed. Prostate cancer was found in 43% of patients after the procedure (61 cases). 52 patients (85%) had tumor confined to the prostate, while in 3 cases (5%) staging was evaluated as T4. In 50 cases (82%) grading was assessed as <7 in Gleason score. Prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) was discovered in 15 specimens (10,5%). In 21 cases (15%) bladder cancer invades the prostate gland. Incidentally detected prostate cancer is usually clinically insignificant and prognosis is primarily determined by grading and staging of urothelial carcinoma. Patients who underwent cystoprostatectomy should be closely monitored for both cancers recurrence and progression. On account of high risk of prostate cancer concomitance, prostate – sparing cystectomy should only be reserved for conscientiously selected group of patients. 244 Wojciech Głód1, Michał Godzisz2, Krzysztof Grzechnik3 Analiza wyników badań histopatologicznych pacjentów z guzem nerki operowanych w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej UM w Lublinie 1. Wstęp 1.1. Epidemiologia nowotworów nerek Rak jasnokomórkowy (clear-cell renal-cell carcinoma – ccRCC) jest najczęstszym nowotworem nerki. Badania epidemiologiczne przeprowadzone w ciągu ostatnich lata dostarczyły dowodów wskazujących na rolę szeregu czynników ryzyka związanych ze stylem życia w etiologii tego nowotworu [1]. Częstość występowania i śmiertelność z powodu raka nerki wzrosła na całym świecie w przeciągu ostatnich 30 lat, zwłaszcza w krajach zachodnich, gdzie rak nerki należy do guzów o największym wzroście częstości występowania. Rosnącą zachorowalność częściowo można przypisać poprawie dostępu do diagnostyki obrazowej, ale skuteczniejsze wykrywanie nie wyjaśnia dużej liczby guzów zaawansowanych i wzrostu śmiertelności pacjentów z rakiem nerki [2]. Rak jasnokomórkowy nerki stanowi 2-3% wszystkich nowotworów złośliwych u osób dorosłych. Jest też najczęstszym typem nowotworu złośliwego wywodzącym się z miąższu nerek, stanowiącym 70-80% wszystkich raków tego narządu, będący jednocześnie najbardziej agresywnym z podtypów, o największym odsetku obecności inwazji miejscowej, przerzutów oraz najwyższej śmiertelności. Po raku prostaty i raku pęcherza jest trzecim najczęstszym nowotworem w urologii [3]. Szczyt zachorowań na raka jasnokomórkowego występuje w szóstej i siódmej dekadzie życia. Od 2003 do 2007 w bazie danych SEER, ok.1,3% pacjentów zostało zdiagnozowanych poniżej 20 roku życia, 1,6% w wieku pomiędzy 20 a 34 rokiem życia, 6,1 % pomiędzy 35 a 44; 16,4% pomiędzy 45 a 54; 24,9% od 55 do 64 lat ; 24,2% od 65 do 74; 19,8% pomiędzy 75 1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 3 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 245 Wojciech Głód, Michał Godzisz, Krzysztof Grzechnik i 84; i 5,8% 85+ lat [3]. Według światowych danych każdego roku rozpoznaje się blisko 270 000 nowych przypadków raka jasnokomórkowego, jednocześnie około 116 000 pacjentów umiera z powodu tej choroby. Na podstawie danych z różnych kontynentów należy zakładać, że co najmniej 20-40% pacjentów z RCC umiera z powodu nowotworu. W Europie rozpoznaje się 65 000 nowych przypadków zachorowań rocznie oraz ponad 25 000 zgonów rocznie. Najwyższe wskaźniki obserwuje się w Europie Wschodniej, najniższe w Portugalii. Mężczyźni zachorowują na raka nerkowokomórkowego (RCC) 2 razy częściej niż kobiety. Wskaźniki zachorowalności w Europie w zależności od płci kształtują się następująco: u mężczyzn 14,5/100 000, u kobiet 6,9/100 000 [4] Według Krajowego Rejestru Nowotworów w 2010 roku w Polsce odnotowano 4644 nowe zachorowania (2736 u mężczyzn i 1908 u kobiet) i 2528 zgonów (odpowiednio, 1574 i 954) spowodowanych RNK – standaryzowany współczynnik zachorowalności wyniósł 10,0 u mężczyzn i 5,4/100 000/rok u kobiet, a standaryzowany współczynnik umieralności miał wartość, odpowiednio, 5,4 i 2,1 [5]. 1.2. Czynniki ryzyka nowotworów nerek Niektóre czynniki ryzyka wystąpienia raka nerki zostały bardzo dobrze udowodnione, w tym palenie tytoniu, otyłość i nadciśnienie, chociaż złożoność tych zależności i mechanizmów nie zostały jeszcze wyjaśnione. Inne czynniki ryzyka takie jak zwyczaje żywieniowe, mała aktywność fizyczna i narażenie zawodowe również wydają się mieć wpływ na zachorowalność, ale dowody pozostają niejednoznaczne [6]. 1.2.1. Tytoń Wydaje się oczywiste, że palenie tytoniu znacząco zwiększa ryzyko raka nerki, choć nieznacznie. Ryzyko zachorowania wzrasta wraz ilością wypalanych papierosów jak i z długością okresu palenia, dotyczy to zarówno palenia czynnego jak i biernego. Wpływ palenia zaznacza się wyraźniej u mężczyzn niż u kobiet. W porównaniu do osób, które nigdy na paliły tytoniu, ryzyko wzrasta o 50% u mężczyzn i o 20% u kobiet palących. Zaprzestanie palenia zmniejsza ryzyko zachorowania w obserwacjach długoterminowych (10 lat i więcej) [7]. 246 Analiza wyników badań histopatologicznych pacjentów z guzem nerki operowanych w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej UM w Lublinie 1.2.2. Otyłość Nadmiar masy ciała został wykazany jako czynnik ryzyka dla RCC w kilku kliniczno-kontrolnych I kohortowych badaniach. Analiza wykazała ze wzrost współczynnika BMI o każde 5kg/m2 zwiększa ryzyko zachorowania na raka nerki od 1,24 u mężczyzn do 1,36 u kobiet. Wyniki wykazują nieco mocniejszy związek pomiędzy otyłością a ryzykiem raka u kobiet niż u mężczyzn [2]. 1.2.3. Nadciśnienie tętnicze Wykazano że pewne typy guzów nerek mogą wywoływać nadciśnienie tętnicze. Jednakże istnieją wystarczające dowody by dowieść, ze nadciśnienie predysponuje do rozwoju raka nerki. W porównaniu z osobami o prawidłowym ciśnieniu krwi, u pacjentów z ciśnieniem skurczowym >160mmHg lub rozkurczowym /100mmHg stwierdzono co najmniej dwukrotny wzrost ryzyka zachorowania na raka nerki. Stosowanie leków moczopędnych i innych leków przeciwnadciśnieniowych również wiąże się z podwyższonym ryzykiem, ale związek ten jest prawdopodobnie zaburzony przez nadciśnienie tętnicze [6]. 1.2.4. Pozostałe czynniki ryzyka Wiele publikacji wskazuje na związek zapadalności na raka jasnokomórkowego nerki z: dietą bogatą w tłuszcze i białka, z ograniczeniem spożycia owoców i warzyw szkodliwymi substancjami chemicznym, m.in. ekspozycja na węglowodory aromatyczne, kadm zmniejszoną aktywnością fizyczną długotrwałego przyjmowania leków przeciwbólowych będących pochodnymi fenacetyny [6]. 1.3. Objawy nowotworów nerek Wiele guzów nerek nie daje żadnych objawów aż do osiągnięcia wysokiego stopnia rozwoju. W dzisiejszych czasach więcej niż połowa nowotworów nerek rozpoznawana jest przypadkowo na podstawie badań obrazowych wykonywanych najczęściej z powodu niespecyficznych objawów, które mogą w ogóle nie mieć związku z guzem nerki [8, 9]. W przeważającej większości są to guzy we wczesnych stadiach zaawansowania i o niskim stopniu złośliwości [10]. Choroba nowotworowa nerek może manifestować się na wiele sposobów. Objawy mogą wynikać z powiększania się guza, krwawień z guza, przerzutów odległych oraz występowania zespołów paraneo- 247 Wojciech Głód, Michał Godzisz, Krzysztof Grzechnik plastycznych. Klasyczna triada Virchowa – makroskopowa hematuria, ból w okolicy lędźwiowej i wyczuwalna masa podczas badania przedmiotowego zeszła na dalszy plan. Liczba guzów manifestujących się w ten sposób stanowi 6-11% wszystkich wykrywanych, a są to nowotwory o wysokim stopniu zaawansowania i złośliwości [11]. Najczęstszym pojedynczym objawem ukierunkowującym naszą diagnostykę jest mikro lub makroskopowy krwiomocz. Ból w okolicy lędźwiowej jest następnym co do częstości ujawniającym się objawem, występuje on u około 40% pacjentów objawowych. Taka dolegliwość – kolka nerkowa wynika z okresowego utrudnienia odpływu moczu z nerki zajętej przez rozrost nowotworowy. Utrudnienie spowodowane jest blokującymi prawidłowe odprowadzenie skrzepami krwi lub bezpośrednim uciskiem raka na moczowód. Innym powodem bólu może być naciekanie guza na tkanki otaczające lub krwawienie z guza do tych tkanek z tą różnicą, że wtedy ból ma charakter tępy i ciągły [12]. Kolejnym objawem stwierdzanym w okolicy lędźwiowej jest wyczuwalny palpacyjnie guz, ale manifestuje się on u tylko około 24% pacjentów objawowych [12]. Przerzuty raka do układu chłonnego mogą objawiać się powiększonymi węzłami chłonnymi szyjnymi. Podejrzenie przerzutów nasuwają, także niedające odprowadzić się żylaki powrózka nasiennego i obustronne obrzęki kończyn dolnych. U niewielu pacjentów choroba w stadium przerzutów odległych objawia się uporczywym kaszlem i bólami kostnymi [13]. Zespoły paraneoplastyczne występują u około 30% pacjentów z objawowym rakiem nerki [14] (tabela 1). Tabela 1. Najczęstsze zespoły paraneoplastyczne [15] Nadciśnienie Wyniszczenie Utrata masy ciała Stany podgorączkowe Neuromiopatia Amyloidoza Podwyższone OB Anemia Zaburzenia funkcji wątroby Hiperkalcemia Policytemia Źródło: Opracowanie własne 248 Analiza wyników badań histopatologicznych pacjentów z guzem nerki operowanych w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej UM w Lublinie 1.4. Klasyfikacja histologiczna nowotworów nerek W źródłach istnieje wiele klasyfikacji nowotworów nerek. Dobrą klasyfikacją, dzielącą rozrosty nowotworowe tego narządu na łagodne i złośliwe jest klasyfikacja wg UICC (International Union Against Cancer) [13] (tabela 2). Tabela 2. Klasyfikacja guzów nerek wg UICC(International Union Against Cancer)[7] Guzy łagodne onkocytoma Guzy złośliwe rak nerkowo komórkowy (jasnokomórkowy) rak brodawkowy (papilarny) rak chromofobowy rak cewek zbiorczych rak nie sklasyfikowany gruczolak brodawkowy gruczolak sródnerczowy Źródło: Opracowanie własne Z klinicznego punktu widzenia najbardziej przydatnym podziałem jest obecnie używana klasyfikacja raków nerki WHO(World Health Organistion- Światowa Organizacja Zdrowia) z 2004 roku [15] (tabela 3). Tabela 3. Klasyfikacja raków nerek wg WHO z roku 2004 [9] Typ histologiczny Rak jasnokomórkwy Rak torbielowaty wielokomorowy Rak brodawkowaty Rak chromofobowy Rak z cewek zbiorczych Belliniego Rak rdzeniasty Rak śluzowo-cewkowo i wrzecionowatokomórkowy Rak związany z translokacją Xp11 Rak niesklasyfikowany Skrót ccRCC mcRCC pRCC chRCC cdRCC mRCC uRCC Źródło: Opracowanie własne Rak nerki wywodzi się z komórek macierzystych nabłonka kanalików nerkowych. Stanowi on 85-90% nowotworów złośliwych tego narządu [15]. Do oceny złośliwości histologicznej wykorzystuje się czterostopniową skalę Fuhrmana. Częstość występowania poszczególnych typów histologicznych raka nerki to [15]: Rak jasnokomórkowy (ccRCC, clear-cell renal-cell carcinoma) – 80% Rak brodawkowaty (pRCC, papillary renal-cell carcinoma) – 10-15% Rak chromofobny (chRCC, chromophobe renal-cell carcinoma) – 4-5% Pozostałe – 5% 249 Wojciech Głód, Michał Godzisz, Krzysztof Grzechnik Z klinicznego punktu widzenia najważniejsze są: rak jasnokomórkowy, brodawkowaty i chromofobny. ccRCC jest rozrostem dobrze odgraniczonym, ale najczęściej nie posiadającym torebki. Większe guzy mogą naciekać okoliczne tkanki. W swoim przekroju jest żółty, może posiadać ogniska krwotoczne i martwicę. Pacjenci z ccRCC rokują gorzej niż chorzy z pRCC lub chRCC [16]. Zachorowanie na raka jasnokomókowego powiązane zostało z utratą ramienia krótkiego chromosomu trzeciego oraz z mutacją genu VHL, także znajdującym się na tym chromosomie. pRCC makroskopowo jest dobrze odgraniczony i posiada pseudotorebkę. W przekroju jest żółty lub brązowo- żółty. Jest gorzej unaczyniony od ccRCC. Guzy brodawkowate możemy histologicznie podzielić na trzy podtypy. Pierwszy i drugi charakteryzuje się egzofitycznym wzrostem, martwicą i pseudotorebką, a komórki, z których jest zbudowany są zasadochłonne. Trzeci podtyp o kwasochłonnych komórkach nie posiada pseudotorebki i bardzo rzadko ulega martwicy. Prognoza w tym podtypie jest dużo lepsza od pozostałych [17]. W cytogenetycznym często wykrywana jest trisomia chromosomu 7 i 17 oraz brak chromosomu Y. chRCC makroskopowo w większości przypadków wygląda blado-szaro i jest dobrze odgraniczony od zdrowej tkanki nerkowej. W dotyku jest jednolity i twardy. Typowymi zmianami w kariotypie spotykanymi w komórkach raka jest utrata chromosomów 2, 13, 17 i 21 [18]. 1.5. Diagnostyka raka nerki Dawniej po wystąpieniu u pacjenta charakterystycznych objawów guza nerki nazywanych triadą Virchowa wykonywano urografie. Jeżeli badanie wykazało obecność guza w dalszej kolejności przeprowadzana była arteriografia umożliwiająca odróżnienie torbieli nerki od nowotworowego rozrostu. Obecnie dzięki rozpowszechnieniu się badań ultrasonograficznych (USG) typową triadę Virchowa obserwujemy jedynie u około 10% pacjentów, a aż 50-80% nowotworów nerki wykrywanych jest przypadkowo w badaniach USG lub tomografii komputerowej (CT) wykonywanych z innych powodów [19]. Badanie ultrasonograficzne jest zawsze pierwszym badaniem jakie wykonujemy w diagnostyce nowotworów nerki, pozwala odróżnić guz lity od torbieli prostej nerki, a także uwidocznić przerzuty w węzłach chłonnych, czy naciekanie żyły nerkowej [20]. W drugiej kolejności wykonuje się tomografie komputerową z kontrastem, pozwala ona na dalszą, dokładniejszą diagnostykę guzów i torbieli nerki, na ocenę stopnia zaawansowania nowotworu w skali TNM, a także na ocenę funkcji nerek (faza wydzielnicza) [20]. Czułość badania przy pomocy rezonansu magne-tycznego (MRI) i CT w diagnostyce guzów nerki jest porównywalne, jednak z przyczyn finansowych wykonuje się badania za pomocą CT. MRI znajduje zastosowanie u pacjentów uczulonych 250 Analiza wyników badań histopatologicznych pacjentów z guzem nerki operowanych w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej UM w Lublinie na stosowane środki kontrastowe, a także w dalszej diagnostyce przypadków, gdzie utrudnione jest postawienie diagnozy tylko na podstawie badania CT [21]. 1.6. Stopień zaawansowania raka nerki Rak nerkowokomórkowy szerzy się przez miejscowe naciekanie, a także drogą naczyń krwionośnych i chłonnych. Charakterystyczną cechą jest wrastanie nowotworu do żyły nerkowej. Rak nerkowokomórkowy najczęściej daje przerzuty do płuc, w następnej kolejności do węzłów chłonnych wątroby oraz kości [20]. Obecnie podstawą do klinicznej oceny nowotworu nerki i wyboru odpowiedniej metody leczenia jest klasyfikacja TNM (tumor, nodes and metastastases), jej prognostyczna wartość została potwierdzona w wielu badaniach [22]. Podstawę do oceny guza stanowią wyniki badań obrazowych (CT, MRI). Klasyfikacja ta opiera się na takich czynnikach jak: wielkość guza, naciekanie żyły nerkowej, naciekanie torebki nerki, przerzuty do węzłów chłonnych oraz przerzuty odległe. Tabela 4. Klasyfikacja TNM guzów nerki [20] Tx T0 T1 T1a T1b T2 T2a T2b T3 T3a T3b T3c T4 Nx N0 N1 M0 M1 Nie można ocenić guza pierwotnego. Nie stwierdza się guza pierwotnego. Guz o największym wymiarze ≤7 cm, ograniczony do nerki. Guz o największym wymiarze ≤4 cm, ograniczony do nerki. Guz o największym wymiarze >4, ale ≤7 cm, ograniczony do nerki. Guz o największym wymiarze >7 cm, ograniczony do nerki. Guz o największym wymiarze >7 cm, ale ≤10 cm, ograniczony do nerki. Guz o największym wymiarze >10 cm, ograniczony do nerki. Guz z zajęciem dużych naczyń żylnych, lub naciekający tkanki okołonerkowe, z wyjątkiem naciekania nadnercza po stronie zajętej nerki, jednocześnie nie przekracza powięzi Geroty. Guz wrastający w żyłę nerkową lub tkankę tłuszczową okołonerkową, ale nieprzekraczający powięzi Geroty guz wrasta do żyły nerkowej lub żyły głównej dolnej poniżej przepony guz wrasta do żyły głównej dolnej powyżej przepony Guz przekracza powięź Geroty (także naciekanie przez ciągłość nadnercza po stronie guza). Nie można ocenić regionalnych węzłów chłonnych Nie stwierdza się przerzutów w regionalnych węzłach chłonnych. Przerzuty w regionalnych węzłach chłonnych. Nie stwierdza się przerzutów odległych. Przerzuty odległe. Źródło: Opracowanie własne 251 Wojciech Głód, Michał Godzisz, Krzysztof Grzechnik 1.7. Czynniki prognostyczne raka nerki Czynniki prognostyczne możemy podzielić na anatomiczne, histologiczne, kliniczne i molekularne. Do anatomicznych czynników zalicza się wielkość guza, naciek poza torebkę włóknistą nerki, zajęcie nadnercza, naciek na tkankę tłuszczową okołonerkową, naciek poza powięź Geroty, czop nowotworowy w żyle nerkowej lub żyle głównej dolnej, przerzuty do regionalnych węzłów chłonnych oraz przerzuty odległe. Czynniki te zostały szczegółowo ujęte w dwóch szeroko stosowanych klasyfikacjach w praktyce klinicznej: TNM [12]. Ich prostota i właściwe stopniowanie zaawansowania klinicznego raka ułatwiają podjęcie właściwej decyzji terapeutycznej. Stopień zaawansowania nowotworu określony przy pomocy tych klasyfikacji stanowi najistotniejszy czynnik prognostyczny w raku nerkowo komórkowym. Do histologicznych czynników prognostycznych należą: typ histologiczny RCC, stopień zróżnicowania cytologicznego komórek guza wg skali Fuhrmana, martwica w guzie, ogniska o wyglądzie mięsaka[23]. Do czynników klinicznych zaliczamy stan ogólny chorego, objawy miejscowe, wyniszczenie, anemię i poziom płytek krwi [24]. Zostało zbadanych wiele markerów molekularnych, takich jak anhydraza węglanowej IX (Caix), czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), HIF – hypoxia-inducible factor, Ki67, E-kadheryna, białko C-reaktywne (CRP), osteopontyna i CD44. Żaden z tych markerów nie poprawił trafności predykcyjnej bieżących systemów prognostycznych i ich stosowanie nie jest zalecane w rutynowej praktyce. Chociaż profilowanie ekspresji genów wydaje obiecujące, nie zidentyfikowano nowych istotnych czynników prognostycznych [25]. 1.8. Leczenie raka nerki Złotym standardem leczenia raka nerki pozostaje leczenie chirurgiczne [20]. Najnowsze wytyczne wskazują że guz nerki mniejszy niż 7 cm, a wiec w stadium T1a lub T1b, położone obwodowo powinien być leczony zabiegiem oszczędzającym miąższ nerki (Nephron Sparing Surgery, NSS) [26].Najczęściej zabieg ten wykonuje się metodą otwartą z dostępu przezotrzewnowego. Guzy położone w górnym lub dolnym biegunie wycina się klasyczną techniką częściowej nefrektomii, pozostałe guzy podlegają klinowej resekcji. Wadą tej metody operacji jest duże, bo aż 10% ryzyko miejscowej wznowy, co związane jest z pozostałością mikroognisk nowotworu [27].Oprócz operacji NSS z wyboru, wykonuje się także zabiegi NSS z konieczności. Wskazaniem do nich jest: obustronny nowotwór nerki, lub guz pojedynczej nerki (anatomicznie, lub funkcjonalnie). 252 Analiza wyników badań histopatologicznych pacjentów z guzem nerki operowanych w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej UM w Lublinie Guzy większe niż 7 cm leczone są przez nefrektomie radykalną [28]. Podczas operacji nerka zostaje usunięta wraz z torebką, powięzią Geroty i regionalnymi węzłami chłonnymi [29]. Wskazaniem do usunięcia nadnercza jest wykazanie w badaniu obrazowym nieprawidłowych zmian, lub brak uwidocznienia nadnercza. Zalecane jest jego usunięcie przy dużych guzach, oraz guzach górnego bieguna [20]. Badania wykazały, że rozległa limfadenektomia nie przedłuża życia pacjenta, dlatego wykonuje się limfadenektomię ograniczoną do węzłów wnęki nerki, głównie w celu określenia zaawansowania choroby [30]. Nefrektomie radykalną wykonuje się albo z dostępu lędźwiowego, albo przez otrzewnowego. ten drugi sposób preferowany jest przy bardziej zaawansowanych zmianach, gdyż pozwala na łatwiejszy dostęp do żyły nerkowej, oraz na ocenę narządów jamy brzusznej pod kątem obecności przerzutów. Powikłania po zabiegu występują rzadko, najczęściej są to krwawienia z szypuły nerkowej, uszkodzenie jelita bądź śledziony. Śmiertelność pooperacyjna nie przekracza 2% [31]. Rokowanie zależy od stopnia zaawansowania zmiany nowotworowej. Wskaźnik 5- letniego przeżycia wynosi: w stadium T1 51-82%, w stadium T2 40-80%, a w T3 12-52% [32]. Mimo rozwoju diagnostyki obrazowej i postępów we wczesnym wykrywaniu choroby wciąż u około 30% pacjentów w momencie rozpoznania nowotworu stwierdza się już odległe przerzuty [20]. W przypadku zaawansowanego raka nerki, z przerzutami które nie mogą zostać całkowicie usunięte, wykonuje się nefrektomie cytoredukcyjną i stosuje leczenie systemowe [33]. składa się na nie chemioterapia, immunoterapia, a w przypadku raka jasnokomórkowego także terapia celowana. Większość chemioterapeutyków jest nieskuteczna w leczeniu raka nerki. Obecnie stosuje się tylko 5-fluorouracyl w połączeniu z immunoterapią. Rak nerki jest nowotworem wysoce immunologicznym, w terapii można stosować cytokiny IFN-α (Interferon α) oraz IL-2 (Interleukina 2) [34,35]. Rozwój raka jasnokomórkowego w 55-70% związany jest z inaktywacją supresorowego genu von Hippla-Lindaua (VHL). Powoduje to nadekspresję czynników indukowanych hipoksją (HIF), czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), a także aktywację szlaku mTOR. Te czynniki zwiększają angiogenezę, proliferację i progresję nowotworu. Nowe leki ukierunkowane molekularnie, do których należą między innymi sunitynib, pazopanib, bewacyzumab, oraz temsyrolismus działają poprzez hamowanie powyższych czynników. U pacjentów w grupie korzystnego i pośredniego rokowania terapią pierwszego rzutu jest sunitinib lub bevacizumab + IFN-α [20]. W przypadku niekorzystnego rokowania stosuje się temsirolismus. 253 Wojciech Głód, Michał Godzisz, Krzysztof Grzechnik 2. Cel pracy Ocena stopnia zaawansowania klinicznego i patomorfologicznego guzów nerki u chorych operowanych w Kliniki Urologii i Onkologii Urologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie w latach 2013-2014. Analiza danych klinicznych oraz ocena częstości wykonywania NSS i radykalnej nefrektomii w zależności od stopnia zawansowania procesu nowotworowego. 3. Materiał i metody Retrospektywna ocena wyników badań histopatologicznych 180 pacjentów Kliniki Urologii i Onkologii Urologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie w latach 2013-2014 zakwalifikowanych do radykalnej nefrektomii i operacji oszczędzających miąższ nerki. Ocena stopnia zaawansowania procesu nowotworowego wg skali pTNM oraz stopnia złośliwości wg skali Furhmana. Analiza przypadków pod kątem: wieku i płci pacjenta, a także występowania martwicy guza i naciekania żyły nerkowej. 4. Analiza wyników W Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej UM w Lublinie wykonano łącznie 180 zabiegów operacyjnego leczenia guza nerki. Analiza wykazała, iż w tym 158 przypadkach (88%) były to zmiany złośliwe. Najczęstszymi rodzajami histopatologicznymi raka nerki były: rak jasnokomórkowy –125 przypadków (79%), rak brodawkowaty nerki – 16 przypadków (10%), rak z nabłonka urotelialnego- 6 (3,8%), rak chromofobny- 5 (3,16%). Resztę wskazań do zabiegów operacyjnych – łącznie 22 przypadki (12%) stanowiły między innymi: gruczolak kwasochłonny nerki, odmiedniczkowe zapalenie nerki i naczyniakomięśniakotłuszczak. Wykres 1. Zależność pomiędzy ilością przypadków nowotworów złośliwych i niezłośliwych [opracowanie własne] 254 Analiza wyników badań histopatologicznych pacjentów z guzem nerki operowanych w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej UM w Lublinie Łącznie przeprowadzono 126 nefrektomii radykalnych (70%) oraz 54 operacji oszczędzających miąższ nerki (NSS- Nefron Sparing Surgery) (30%). W badanej grupie kobiety stanowiły 77 przypadków (43%), a mężczyźni 103 przypadków (57%). Do radykalnej nefrektomii zostało zakwalifikowanych 57 kobiet i 69 mężczyzn, zaś do NSS 20 kobiet i 34 mężczyzn. Średnia wieku wyniosła dla nefrektomii – 63 lata, dla NSS 60 lat. Wykres 2. Występowanie różnych typów histologicznych raka nerki u pacjentów leczonych w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie [opracowanie własne] Wykres 3. Porównanie ilości wykonanych nefrektomii radykalnych i NSS wśród kobiet i mężczyzn leczonych z powodu procesu rozrostowego w nerkach [opracowanie własne] Z analizy badań histopatologicznych wszystkich nowotworów złośliwych wynika że w stopniu zaawansowania T1 było 66 % nowotworów, w stopniu T2 10%, w T3 22%, w T4 2%. 255 Wojciech Głód, Michał Godzisz, Krzysztof Grzechnik U chorych z nowotworem w stadium T1a wykonane NSS stanowiło 52% (35 przypadków), a nefrektomia radykalna 48% (32 przypadki). W stopniu T1b NSS stanowiło 11% przypadków (4) natomiast radykalną nefrektomię przeprowadzono w 89% (32 przypadki). Wykres 4. Rodzaj stosowanego leczenia operacyjnego w przypadku nowotworów nerek w stadium T1a i T1b [opracowanie własne] Badanie histopatologiczne wykazało, że NSS w zestawieniu z nefrektomia radykalną stanowi w stopniu G1 83% wykonanych zabiegów, w stopniu G2 35%, w G3 29%, a w G4 wszyscy pacjenci zostali poddani nefrektomii radykalnej. Wykres 5. Zależność między stopniem złośliwości a wyborem leczenia operacyjnego [opracowanie własne] 256 Analiza wyników badań histopatologicznych pacjentów z guzem nerki operowanych w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej UM w Lublinie Naciekanie żyły nerkowej wystąpiło u 25 pacjentów w przypadku raka jasnokomórkowego nerki (20% przypadków). W przypadku naciekania żyły nerkowej w 100% przypadków wykonano zabieg nefrektomii radykalnej. W stadium G1 zróżnicowania nowotworu nie obserwowano naciekania żyły nerkowej, w stadium G2 w 1 przypadku, G3 – 15 przypadków, natomiast w G4 – 9 przypadków. Martwica guza w 17 przypadkach współistniała z naciekaniem żyły nerkowej. Wykres 6. Ilość przypadków naciekania żyły nerkowej w zależności od stopnia złośliwości raka nerki [opracowanie własne] 5. Podsumowanie Analiza wyników pooperacyjnych badań histopatologicznych pacjentów leczonych w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie z lat 2013-2014 wykazała, że w przeważającej większości wskazaniem do NSS i radykalnej nefrektomii były nowotwory złośliwe. Częstość występowania poszczególnych typów histopatologicznych raków nerki odnotowanych w badaniu nie różni się istotnie od danych dostępnych w literaturze światowej. W celu leczenia guzów nerki wykonano o 72 nefrektomie więcej niż operacji oszczędzających miąższ nerki. Mężczyźni częściej od kobiet zapadali na nowotwory nerek. Nie było różnicy między płciami pod względem metody operacji. Średni wiek pacjentów poddanych NSS było o 3 lata niższy niż chorych u których przeprowadzono nefrektomie radykalną. Zdecydowana większość nowotworów została wykryta we wczesnym stadium zaawansowania – T1 257 Wojciech Głód, Michał Godzisz, Krzysztof Grzechnik i T2. W stopniu T1a wykonano porównywalną ilość zabiegów nefrektomii i NSS. Było to spowodowane lokalizacją guzów. W przypadkach T1b nefrektomia radykalna wykonywana była 8 razy częściej niż NSS. Zabieg oszczędzający miąższ nerki wykonywano przede wszystkim w nowotworach wysoko zróżnicowanych (G1). Wraz ze wzrostem stopnia złośliwości wg skali Fuhrmana zdecydowanie wzrastała częstość zabiegów radykalnych. Naciekanie żyły nerkowej wiązało się z wyborem nefrektomii radykalnej jako metody leczenia, co jest zgodne z obowiązującymi zaleceniami. Naciekanie żyły nerkowej nastąpiło w przypadku nowotworu o wysokiej złośliwości (G3 i G4). Opisywane zjawisko występowało częściej w stopniu G3 (60%). Naciekanie żyły nerkowej często wiązało się z występowaniem ognisk martwicy w obrębie guza (68%). W dzisiejszych czasach guzy nerek wykrywane są we wcześniejszych stadiach zaawansowania. Prawdopodobnie dzieje się to dzięki szeroko rozpowszechnionym technikom obrazowym, takim jak ultrasonografia i tomografia komputerowa. Nowotwory w niżej zaawansowanych stadiach charakteryzują się mniejszym rozmiarem i mniejszą złośliwością. Fakty te dają pacjentowi szanse na leczenie, które może być mniej inwazyjne i bardziej skuteczne. Literatura 1. Mathew A, Devesa SS, Fraumeni JF Jr, Chow WH (2002) Global increases in kidney cancer incidence, 1973–1992. Eur J Cancer Prev 11:171-178 2. Steffen Weikert. Borje Ljungberg, World J Urol (2010) Contemporary epidemiology of renal cell carcinoma: perspectives of primary prevention 3. Priti H. Patel, Sandy Srinivas, Kidney Cancer 2012 Epidemiology of Renal Cell Carcinoma, pp 3-15 4. C. Protzel, M. Maruschke, O.W. Hakenberg. EAU - European Urology Supplements 2012 Epidemiology, aetiology and pathogenesis of renal cell carcicoma; 11: 52-59 5. Krajowy Rejestr Nowotworow strona internetowa: http://epid.coi.pl/KRN/ 6. Wong-Ho Chow, Susan S. Devesa, Contemporary Renal Cell Cancer Epidemiology, Cancer J. 2008 Sep–Oct; 14(5): 288-301 7. Wong-Ho Chow, Linda M. Dong, Susan S. Devesa, Epidemiology and risk factors for kidney cancer, Nat Rev Urol. 2010 May; 7(5): 245-257 8. Novick A.C., Campbell S.C. Renal tumors. In: Walsh PC, Retik AB, Vaughan ED, Wein AJ, eds. Campbells Urology. Philadelphia WB Saunders 2002;2672-2731 9. Pantuck AJ, Zisman A, Rauch MK, et al.: Incidental renal tumors. Urology 2000; 56:190-196 10. Kutikov A, Fossett LK, Ramchandani P, Tomaszewski JE, Siegelman ES, Banner MP, Van Arsdalen KN, Wein AJ, Malkowicz SB.: Incidence of benign pathologic findings at partial nephrectomy for solitary renal mass presumed 258 Analiza wyników badań histopatologicznych pacjentów z guzem nerki operowanych w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej UM w Lublinie 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. to be renal cell carcinoma on preoperative imaging. Urology 2006 Oct;68(4):737-40 Lee CT, Katz J, Fearn PA, Russo P.: Mode of presentation of renal cell carcinoma provides prognostic information. Urol Oncol 2002 JulAug;7(4):135-40 B. Ljungberg (chair), K. Bensalah, A. Bex (vice-chair),S. Canfield, S. Dabestani, F. Hofmann, M. Hora, M.A. Kuczyk,T. Lam, L. Marconi, A.S. Merseburger, P.F.A. Mulders,T. Powles, M. Staehler, A. Volpe: Guidelines on Renal CellCarcinoma. European Association of Urology 2014 Borkowski A., Czaplicki M.: Nowotwory i torbiele nerek, Warszawa 2002 Kim HL,Belldegrun AS, Freitas DG, etal. Paraneoplastic signs and symptoms of renalcellc arcinoma: implications for prognosis. J Urol 2003 Nov;170(5):1742-6 Eble J.N., Sauter G., Epstein J.I., Sesterhenn I.A. (Eds.): World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of the Urinary System and Male Genital Organs. IARC Press: Lyon 2004: 9-88 Capitanio U, Cloutier V, Zini L, et al. A critical assessment of the prognostic value of clear cell, papillary and chromophobe histological subtypes in renal cell carcinoma: a population-based study. BJU Int2009 Jun;103(11):1496-500 Sukov WR, Lohse CM, Leibovich BC, et al. Clinical and pathological features associated with prognosis in patients with papillary renal cell carcinoma. J Urol 2012 Jan;187(1):54-9 Volpe A, Novara G, Antonelli A, et al; Surveillance and Treatment Update on Renal Neoplasms (SATURN) Project; Leading Urological No-Profit Foundation for Advanced Research (LUNA) Foundation. Chromophobe renal cell carcinoma (RCC): oncological outcomes and prognostic factors in a large multicentre series. BJU Int 2012 Jul;110(1):76-83 Doda S.S., Mathur R.K., Buxi T.S. Role of computed tomography in staging of renal cell carcinoma. Comput Radiol 1986;10:183-8 Ljungberg B., Cowan N., Hanbury D. C. et al.: Guidelines on renal cell carcinoma. European Association of Urology 2010 Heidenreich A., Ravery V. European Society of Oncological Urology. Preoperative imaging in renal cell cancer. World J Urol 2004;22:307-15 Kim SP, Alt AL, Weight CJ, et al. Independent validation of the 2010 American Joint Committee on Cancer TNM classification for renal cell carcinoma: results from a large, single institution cohort. J Urol 2011 Jun;185(6): 2035-9 Fuhrman SA, Lasky LC, Limas C. Prognostic significance of morphologic parameters in renal cell carcinoma. Am J Surg Pathol 1982 Oct;6(7):655-63 Kim HL, Bellderun AS, Freitas DGet al. Paraneoplastic sighns and symphtoms off renal cell carcinoma: implications for prognosis. J Urol 2003 Nov;170(5):1742-6 Zhao H, Ljungberg B, Grankvist K, et al. Gene expression profiling predicts survival in conventional renal cell carcinoma. PLoS Med 2006 Jan;3(1):e13 Uzzo R.G., Novick A.C. Nephron sparing surgery for renal tumors: indications, techniques and outcomes. J Urol 2001;166:6-18. Review 259 Wojciech Głód, Michał Godzisz, Krzysztof Grzechnik 27. Hyams ES, Pierorazio PM, Mullins JP, et al. Partial nephrectomy vs. Nonsurgical management for small renal massess: a population-based comparison of disease-specific and overall survival. J Urol 2012;187(4S):e678 28. Antonelli A., Cozzoli A., Nicolai M., Zani D., Zanotelli T., Perucchini L., et al. Nephron-sparing surgery versus radical nephrectomy in the treatment of intracapsular renal cell carcinoma up to 7 cm. Eur Urol 2008;53:803-809 29. Desai MM, Strzempkowski B, Matin SF, et al. Prospective randomized comparison of transperitoneal versus retroperitoneal laparoscopic radical nephrectomy. J Urol 2005 Jan;173(1):38-41 30. Blom J.H., van Poppel H., Maréchal J.M., Jacqmin D., Schröder F.H., de Prijck L., Sylvester R.; EORTC Genitourinary Tract Cancer Group. Radical nephrectomy with and without lymph-node dissection: final results of European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) randomized phase 3 trial 30881. Eur Urol 2009;55:28-34 31. Swanson D.A., Borges P.M. Complications of transabdominal radical nephrectomy for renal cell carcinoma. J Urol 1983;129:704 32. Gettman M.T., Blute M.L., Spotts B., Bryant S.C., Zincke H. Pathologic staging of renal cell carcinoma: significance of tumor classification with the 1997 TNM staging system. Cancer 2001;15,91:354-61 33. Lamb GW, Bromwich EJ, Vasey P, et al. Management of renal masses in patients medically unsuitable for nephrectomy-natural history, complications and outcome. Urology 2004 Nov;64(5):909-13 34. Motzer R.J., Bacik J., Murphy B.A., Russo P., Mazumdar M. Interferon-alfa as a comparative treatment for clinical trials of new therapies against advanced renal cell carcinoma. J Clin Oncol 2002;20:289-96 35. Rosenberg S.A., Lotze M.T., Yang J.C., Topalian S.L., Chang A.E., Schwartzentruber D.J., Aebersold P., Leitman S., Linehan W.M., Seipp C.A, et al. Prospective randomized trial of high-dose interleukin-2 alone or in conjunction with lymphokine-activated killer cells for the treatment of patients with advanced cancer. J Natl Cancer Inst 1993;85:622-32 Analiza wyników badań histopatologicznych pacjentów z guzem nerki operowanych w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej UM w Lublinie Streszczenie Rak jasnokomórkowy jest najczęstszym guzem litym nerki. Chorują osoby w wieku 60-70 lat, najczęściej mężczyźni. Nefrektomia radykalna jest leczeniem z wyboru w przypadku guzów nerek. W ostatnich latach procedura oszczędzająca miąższ nerki (NSS) stała się popularna w przypadku guzów o średnicy mniejszej niż 7 cm. Szerokie użycie technik obrazowych spowodowało wzrost przypadkowej wykrywalności guzów nerek, a dużo z tych mas było małe. Celem badania była ocena wyników badań histopatologicznych 180 pacjentów z lat 2013-2014, którzy zostali zakwalifikowani do radykalnej nefrektomii albo NSS. Przeanalizowano retrospektywnie dokumenty szpitalne wybranych pacjentów w kierunku: diagnozy patomorfologicznej i klinicznej wieku pacjentów, rodzaju procedury, stopnia złośliwości według Fuhrmana oraz stopnia zaawansowania według TNM. Grupę pacjentów stanowiło 103 mężczyzn (57%) i 77 kobiet (43%). 70% (126) guzów leczone było przy 260 Analiza wyników badań histopatologicznych pacjentów z guzem nerki operowanych w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej UM w Lublinie pomocy radykalnej nefrektomii, a 30% (54) przy pomocy NSS. Średni wiek pacjentów wyniósł 62 lata dla nefrektomii i 60 lat dla NSS. Radykalna nefrektomia wykonywana była często w przypadkach w których doszło do nacieczenia żyły nerkowej (25,53%; 23) oraz guzów o średnicy powyżej 4 cm ograniczonych do nerki (24,44%; 22). Podsumowując, w dzisiejszych czasach guzy nerek są częściej wykrywane we wczesnych stadiach, prawdopodobnie z powodu szeroko rozpowszechnionej diagnostyki obrazowej. Masy o mniejszym stopniu zaawansowania charakteryzują się mniejszym stopniem złośliwości. Te fakty dają pacjentowi szansę na leczenie mniej inwazyjne i tak samo skuteczne. Rak jasnokomórkowy nerki przez bardzo długi okres czasu nie daje żadnych objawów. Dlatego też dalej stwarza problemy diagnostyczne. Wczesna diagnoza umożliwia usunięcie guza nerki i zachowanie funkcji nerki. Dodatkowo zmniejsza potrzebę wykonywania radykalnych nefrektomii, co może mieć znaczący pozytywny wpływ na prognozę przeżycia pacjenta. Analysis of the results of histopathological findings in patients with kidney tumor treated in the Department of Urology and Urological Oncology of Medical University of Lublin Abstract Clear cell carcinoma is the most common solid tumor of the kidney. Cancer occurs mainly at the age of 60-70 years, most frequently in men. Radical nephrectomy is the treatment of choice for renal tumors. In the last years nephron-sparing surgery (NSS) has become more popular procedure to treat the tumors under 7cm in diameter. The extensive use of imaging techniques has resulted in an increase in the number of incidentally discovered renal tumors, many of which are small. The aim of our study was to evaluate histopathological findings of 180 patients in 2013-2014, who were qualified for radical nephrectomy or NSS. Patients hospital records were retrospectively reviewed. Pathological and clinical diagnosis, age of patient, type of procedure, the degree of malignancy by Fuhrman and stage of a tumor (TNM) were analyzed. The patients were 103 men (57%) and 77 women (43%). 70% (126) of tumors were removed by radical nephrectomy, 30% (54) by the NSS. The median age was 62 years for nephrectomy and 60 years for the NSS. Radical nephrectomy was performed frequently in the cases of renal cell carcinoma with renal vein infiltration (25.53%; 23) and tumors >4cm restricted to the kidney (24.44%; 22). In conclusion, nowadays kidney‟s tumors are more often discovered in early stages, probably because of widespread imaging techniques. Masses in early stages are characterized by lower malignancy. These facts give patient a chance for treatment that can be less invasive and more successful. Clear cell carcinoma of the kidney remains asymptomatic for a long time, and therefore continues to pose diagnostic problems. Early diagnosis gives a better chance of resecting the tumor with preserving normal renal function (NSS) and reduces the need of radical nephrectomy procedures, which might have a significant positive effect on the prognosis and survival of patients. 261 Monika Sarnat-Kucharczyk1, Ewa Kurzak2, Ewa Mrukwa-Kominek3 Zastosowanie mikroperymetrii oraz badania poczucia kontrastu u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej 1. Wstęp Gruczolaki są najczęstszymi guzami przysadki mózgowej, wśród których decydowaną większość stanowią nowotwory o typie prolactinoma. Ze względu na znaczne zwiększenie dostępności do badań obrazowych w ciągu ostatnich kilkunastu lat istotnie wzrosła wykrywalność gruczolaków przysadki mózgowej, nawet wtedy, gdy nie dają one żadnych dolegliwości endokrynologicznych i okulistycznych. Ze względu na rozmiar gruczolaki przysadki mózgowej można podzielić na mikrogruczolaki (guzy o średnicy <1 cm) oraz makrogruczolaki (guzy o średnicy >1 cm). W przypadku mikroguczolaków bardzo rzadko dochodzi do zmian w polu widzenia kinetycznym Goldmanna lub statycznym w porównaniu do makrogruczolaków. Przysadka mózgowa położona jest w obrębie siodła tureckiego, na górnej powierzchni trzonu kości klinowej. Od przednich do tylnych wyrostków pochyłych kości klinowej rozpięta jest opona twarda, która tworzy przeponę siodła. Nad przeponą znajdują się nerwy wzrokowe oraz ich skrzyżowanie. Jeżeli guzy przysadki mózgowej rozrastają się 1 [email protected], Oddział Okulistyki Dorosłych, Uniwersyteckie Centrum Okulistyki i Onkologii Samodzielnego Szpitala Klinicznego Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, http://szpitalceglana.pl/, Klinika Okulistyki Katedry Okulistyki Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, Kierownik Prof. dr hab. n. med. Ewa MrukwaKominek 2 [email protected], Oddział Okulistyki Dorosłych, Uniwersyteckie Centrum Okulistyki i Onkologii Samodzielnego Szpitala Klinicznego Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, http://szpitalceglana.pl/, Klinika Okulistyki Katedry Okulistyki Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, Kierownik Prof. dr hab. n. med. Ewa MrukwaKominek 3 [email protected] , Oddział Okulistyki Dorosłych, Uniwersyteckie Centrum Okulistyki i Onkologii Samodzielnego Szpitala Klinicznego Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, http://szpitalceglana.pl/, Klinika Okulistyki Katedry Okulistyki Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, Kierownik Prof. dr hab. n. med. Ewa MrukwaKominek 262 Zastosowanie mikroperymetrii oraz badania poczucia kontrastu u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej ponadsiodłowo, prowadzi to do ucisku na struktury leżące powyżej a w konsekwencji powoduje ubytki w polu widzenia [1]. W zależności od lokalizacji oraz rozmiarów gruczolaka przysadki mózgowej dochodzi do charakterystycznych zmian w polu widzenia. Włókna nerwowe dolno-nosowe w obrębie skrzyżowania przechodzą przez jego dolno-przednią część na stronę przeciwległą. Z tego względu rozrastający się gruczolak przysadki uciska te włókna powodując zaburzenia widzenia najpierw w kwadrantach górno-skroniowych. Przez górno-tylną część skrzyżowania przechodzą włókna z rejonu górnonosowego siatkówki. Włókna pochodzące z plamki ulegają rozproszeniu w obrębie skrzyżowania, gdyż mieszają się one z włóknami obwodowymi. Włókna plamkowe układają się głównie przyśrodkowo i grzbietowo, a następnie część ich ulega skrzyżowaniu tworząc tzw. małe skrzyżowanie [2]. Klasyczne zmiany w polu widzenia w przypadku gruczolaków przysadki stanowią połowicze dwuskroniowe ubytki w polu widzenia. Jednakże czynniki takie jak m.in. lokalizacja guza, jego rozmiar, położenie skrzyżowania wzrokowego w stosunku do siodła tureckiego mają wpływ na nieprawidłowości w perymetrii. Na początku ubytki w polu widzenia mogą być niecharakterystyczne dla gruczolaków przysadki bądź występować jednoocznie. Mroczki zwykle pojawiają się najpierw w kwadrancie górno-skroniowym, co ma związek z uciskiem przez guz dolno-przedniej części skrzyżowania. Jeżeli zmiany nie dotyczą centralnej części siatkówki oraz postępują stopniowo, chory może nie zauważać zaburzeń widzenia mimo znacznych ubytków w polu widzenia. Mikrogruczolaki mogą powodować zaburzenia w polu widzenia w przypadku gdy bezpośrednio uciskają skrzyżowanie nerwów wzrokowych lub gdy powodują obrzęk przysadki mózgowej [3]. 1.1. Mikroperymetria Mikroperymetria jest typem perymetrii statycznej, charakteryzuje się jednak znacznie większą czułością w obrębie siatkówki centralnej w porównaniu do klasycznej perymetrii statycznej [4, 5]. Badanie to pozwala na wykrycie już najminejszych zmian w czułości siatkówki, nawet wtedy gdy nie są zauważanle w badaniu dna oka. [6] W niniejszym badaniu u pacjentów wykonano badanie pola widzenia techniką mikroperymetrii okolicy plamki za pomocą mikroperymetru MP-1 (Nidek Technologies, Włochy). Aparat oceniający czułość siatkówki centralnej ma zaprogramowany system śledzenia ruchów gałki ocznej, dzięki czemu utrata fiksacji powoduje automatyczne zatrzymanie badania. Po powrocie fiksacji możliwe jest kontynuowanie badania [7], przez co zmniejsza się występowanie fałszywych odpowiedzi. Urządzenie to umożliwia 263 Monika Sarnat-Kucharczyk, Ewa Kurzak, Ewa Mrukwa-Kominek przeprowadzenie badania pola widzenia z jednoczesną obserwacją dna oka [8]. Badanie jest czasochłonne i wymaga bardzo dobrej współpracy ze strony badanego. Decyzja co do usunięcia gruczolaka przysadki jest oparta na badaniach okulistycznych oceniających stan narządu wzroku oraz na cechach ucisku skrzyżowania nerwów wzrokowych w badaniach obrazowych. Mikroperymetria pozwala na wykrycie zmian w czułości siatkówki centralnej, które nie są rejestrowane przez inne badania perymetryczne. Ze względu na nieinwazyjność może być często wykonywana w celu kontroli ekspansji nowotworu i podjęcia decyzji co do jego usunięcia przy wczesnych objawach uszkodzenia drogi wzrokowej. Dzięki temu przewyższa kosztochłonne, nie bez znaczenia dla chorego badania obrazowe. 1.2. Ocena wrażliwości na kontrast Ocena wrażliwości na kontrast jest cennym badaniem określającym stan narządu wzroku. Jednym z tych badań jest test funkcjonalnej ostrości wzroku (F.A.C.T.), który został stworzony przez dr Arthura P. Ginsburga poprzez ulepszenie poprzedniej wersji testu wrażliwości na kontrast, również jego autorstwa. Terminem widzenia funkcjonalnego określa się wpływ widzenia na aktywność w życiu codziennym. Badanie ostrości wzroku na podstawie tablicy Snellena jest obecnie złotym standardem w praktyce klinicznej, niestety nie odzwierciedla w pełni stanu narządu wzroku. Polega ono na rozpoznawaniu znaków o wysokim kontraście, o stopniowo zmniejszającej się wielkości. W życiu codziennym nie obserwujemy jedynie czarno-białych obrazów o wysokim kontraście ale dostrzegamy szereg obiektów o różnym stopniu kontrastu. Dlatego też badanie ostrości wzroku na tablicach Snellena ma ograniczoną wartość [9]. W zależności od preferencji badanego wykorzystywane są różne testy do badania ostrości wzroku (test Snellena, test EDTRS). Nie tylko dokładne określenie odległości od optoptypów ale również natężenie światła w pomieszczeniu oraz kontrast pomiędzy znakami a tłem mają istotny wpływ na wynik testu. Ocena wrażliwości na kontrast powinna być wykonywana z najlepszą skorygowaną ostrością wzroku. Test polega na rozróżnianiu przez pacjenta kierunku ułożenia szeregu równoległych linii o różnym stopniu kontrastu oraz zwiększającej się częstotliwości przestrzennej, za pomocą aparatu Functional Vison Analyzer (Stereo Optical, USA). Wykonując test oceniający widzenie kontrastowe za pomocą aparatu Functional Vision Analyzer ważne jest by w badanym pomieszczeniu było 264 Zastosowanie mikroperymetrii oraz badania poczucia kontrastu u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej ciemno. Aparat ma wbudowany system podświetlający poszczególne slajdy, dlatego jest lepiej wystandaryzowany i wyniki z różnych ośrodków łatwiej jest porównać. Test F.AC.T. jest głównie stosowany do analizy funkcji widzenia u pacjentów po implantacji sztucznych soczewek wewnątrzgałkowych [10] lub po przeszczepie rogówki. [11] 2. Cel pracy Celem pracy jest ocena zastosowania mikroperymetrii oraz badania czułości na kontrast u pacjentów z gruczolakami przysadki, jako metod wspomagających diagnostykę pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej. 3. Materiały i metody Pacjenci leczeni w Klinice Endokrynologii Katedry Patofizjologii i Endokrynologii SUM w Katowicach, u których stwierdzono występowanie gruczolaków przysadki mózgowej zostali poddani badaniu okulistycznemu. Badania wykonano w grupie 50 pacjentów, w tym 24 mężczyzn oraz 26 kobiet (wiek pacjentów 21-68 lat), łącznie wykonano badania 100 oczu. U pacjentów zdiagnozowano gruczolaka przysadki mózgowej na podstawie badania rezonansu magnetycznego. Badania przeprowadzono w Uniwersyteckim Centrum Okulistyki i Onkologii Samodzielnego Szpitala Klinicznego Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, w Klinice Okulistyki Katedry Okulistyki Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Badania wykonywane były zgodnie z Deklaracją Helsińską. Badanych podzielono na następujące grupy biorąc pod uwagę wynik rezonansu magnetycznego przysadki mózgowej: Grupa I – mikrogruczolak przysadki mózgowej - 25 osób; Grupa II – makrogruczolak przysadki mózgowej (nie wykazujący ucisku oraz z uciskiem na skrzyżowanie nerwów wzrokowych stwierdzanym w badaniu MRI) - 25 osób. Kwalifikacja do grupy badanej odbyła się na podstawie wyniku rezonansu magnetycznego przysadki mózgowej, zebranego wywiadu oraz badań okulistycznych. Badania wrażliwości na kontrast zostały wykonane trzykrotnie celem oceny ich powtarzalności, oraz wyliczenia średniej arytmetycznej. Ze względu na wykazanie różnic pomiędzy wrażliwością poszczególnych części siatkówki wyniki badania mikroperymetrycznego plamki 12 stopni od centrum fiksacji podzielono na kwadranty (Rys. 1). Parametry uzyskane w badaniu mikroperymetrii: MS, Mean Sensitivity – średnia czułość siatkówki w okolicy plamkowej [dB]; 265 Monika Sarnat-Kucharczyk, Ewa Kurzak, Ewa Mrukwa-Kominek MS UT, MS UN, MS LT oraz MS LN - czułość siatkówki w kwadrancie górno-skroniowym, górno-nosowym, dolnoskroniowym, dolno-nosowym (Upper-Temporal, Upper-Nasal, Low-Temporal, Low-Nasal) [dB]. Parametry uzyskane w badaniu wrażliwości na kontrast: RA, Row A – wrażliwość na kontrast przy częstotliwości przestrzennej 1,5 cykli na stopień (Rząd A); RB, Row B – wrażliwość na kontrast przy częstotliwości przestrzennej 3 cykli na stopień (Rząd B); RC, Row C – wrażliwość na kontrast przy częstotliwości przestrzennej 6 cykli na stopień (Rząd C); RD, Row D – wrażliwość na kontrast przy częstotliwości przestrzennej 12 cykli na stopień (Rząd D); RE, Row E – wrażliwość na kontrast przy częstotliwości przestrzennej 18 cykli na stopień (Rząd E). U pacjentów wykonywane były również badania pola widzenia metodą perymetrii kinetycznej za pomocą perymetru Goldmanna (perymetr Campus) oraz perymetrii statycznej z użyciem perymetru Octopus (HaagStreit, Szwajcaria). 4. Wyniki Mikrogruczolaki zwykle nie wykazują zmian w standardowych polach widzenia jak na przykład kinetyczne Goldmanna (Rys. 2) lub perymetria statyczna Octopus. Nawet jeśli dochodzi do niewielkich zmian w obwodowych częściach pola widzenia Octopus, centralna część pola może być prawidłowa (Rys. 3). Jednakże mikroperymetria wykonana u tego samego pacjenta wykazała zmiany w czułości siatkówki centralnej najbardziej nasilone w części górno-nosowej plamki (Rys. 4). W przypadku zaawansowanych makrogruczolaków z ewidentnym uciskiem na skrzyżowanie nerwów wzrokowych u 8 pacjentów zaobserwowano połowicze dwuskroniowe ubytki zarówno w polu kinetycznym (Rys. 5) jak i statycznym Octopus (Rys. 6). Powyższe badania nie wykazywały natomiast odchyleń w plamce w części nosowej pola widzenia. Mikroperymetria wykazała bezwzględne ubytki w części skroniowej oraz względne ubytki w części nosowej pola widzenia (Rys. 7). Tabela 1 przedstawia u każdego pacjenta zakres pola kinetycznego Goldmanna, średnią czułość siatkówki (MS) w automatycznej perymetrii statycznej oraz w mikroperymetrii. Dzięki własnoręcznemu wyodrębnieniu kwadrantów w badaniu mikroperymetrycznym, które nie jest dostępne w oprogramowaniu aparatu MP-1 możliwa była dokładna ocena czułości siatkówki centralnej 266 Zastosowanie mikroperymetrii oraz badania poczucia kontrastu u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej w poszczególnych kwadrantach (Rys. 1) W obydwu grupach najmniejsza czułość występowała w kwadrancie górno-nosowym, następnie w kwadrancie dolno-nosowym, górno-skroniowym i największa w kwadrancie dolno-skroniowym (Wykres 1). Wyniki w poszczególnych kwadrantach pomiedzy grupami różniły się istotnie statystycznie. Poczucie kontrastu było obniżone u pacjentów z mikrogruczolakami przysadki mózgowej zwłaszcza w rzędach D, E a w grupie z makrogruczolakami w rzędach A, B, C, D, E (Rys. 8). Występowały istotnie statystycznie różnice pomiędzy wartościami w obydwu grupach. Wykazano dodatnią korelację pomiędzy czułością siatkówki centralnej a poczuciem kontrastu w obydwu grupach, bardziej wyrażoną w grupie 2. (Rys. 9) 5. Dyskusja W literaturze brak jest artykułów poruszających temat mikroperymetrii oraz oceny poczucia kontrastu testem F.A.C.T. u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej. Przedstawiana praca jest jednym z pierwszych doniesień związanych z zastosowaniem mikroperymetrii oraz oceny wrażliwości na kontrast u osób z gruczolakami przysadki mózgowej. Shen i wsp. wykazali, iż badanie automatycznej perymetrii statycznej jest czulszą metodą wykrywania zmian w polu widzenia niż ręczna perymetria kinetyczna Goldmana u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej. Ma to szczególne zastosowanie zwłaszcza w początkowych stadiach choroby. Zmiany w polu widzenia mogą być związane z wielkością guza oraz czasem trwania schorzenia [12]. Automatyczna perymetria statyczna jest najbardziej pomocna w diagnostyce i kontroli pacjentów głównie z niewielkimi guzami, u których nie występuje pogorszenie ostrości wzroku. W tych przypadkach, gdy dochodzi do minimalnego ucisku na skrzyżowanie nerwów wzrokowych ręczna perymetria Goldmanna zazwyczaj nie wykazuje zmnian [13]. Ocena wrażliwości na kontrast może być cennym narzędziem we wczesnym wykrywaniu oraz monitorowaniu progresji gruczolaków przysadki mózgowej [14]. W przypadku mikrogruczolaków bardzo rzadko dochodzi do zmian w poczuciu kontrastu, może ono występować jednoocznie [15]. Kupersmith i wsp. wykazali obniżenie poczucia kontrastu we wszystkich rzędach u pacjentów z guzami uciskającymi skrzyżowanie nerwów wzrokowych [16]. Brak jest natomiast obserwacji dotyczących zastosowania testu poczucia kontrastu metodą F.A.C.T. w tej grupie chorych. Badanie wrażliwości na kontrast znajduje szczególne zastosowanie zwłaszcza w początkowym zmianach, takich jak wczesny ucisk na skrzyżowanie nerwów wzrokowych, w celu wychwycenia 267 Monika Sarnat-Kucharczyk, Ewa Kurzak, Ewa Mrukwa-Kominek początkowego uszkodzenia nerwu wzrokowego. Warto jest również wykonywać to badanie w średnio zaawansowanych gruczolakach. W przypadku rozległych guzów nie tylko ostrość wzroku jest w znacznej mierze zaburzona, ale przede wszystkim wrażliwość na kontrast, która może być nawet całkowicie upośledzona, dlatego chorzy nie są w stanie wykonać tego badania. Istnieją pojedyncze opisy przypadków pacjentów z makrogruczolakiem przysadki, u których wykonano mikroperymetrię [17,18]. Z jednej strony stanowi to unikalne pole do dalszych badań schorzeń wyżej wymienionymi testami, z drugiej strony trudno porównywać obserwację grupy 50 pacjentów z pojedynczymi opisywanymi przypadkami. Brak jest również opisów zmian w mikroperymetrii u osób z makrogruczolakami, które nie powodują ewidentnego ucisku na skrzyżowanie nerwów wzrokowych stwierdzane w badaniach obrazowych takich jak rezonans magnetyczny lub tomografia komputerowa. 6. Podsumowanie Mikroperymetria w porównaniu do innych badań perymetrycznych jest wysoce czułą metodą oceniającą zmiany wrażliwości siatkówki centralnej. W niniejszej pracy u pacjentów z mikrogruczolakami przysadki jako jedyna wykazała zmiany w czułości plamki. Badanie poczucia kontrastu jest cennym testem oceny czynnościowej narządu wzroku, które wykazało odchylenia w obu grupach nawet u osób z prawidłową ostrością wzroku. Mikroperymetria i badanie wrażliwości na kontrast są nieinwazyjnymi badaniami pomocniczymi w diagnozowaniu ucisku drogi wzrokowej przez gruczolaki przysadki mózgowej oraz w ocenie progresji choroby. 6.1.1. Rysunki, wykresy Rysunek 1. Podział siatkówki w plamce na kwadranty [opracowanie własne] 268 Zastosowanie mikroperymetrii oraz badania poczucia kontrastu u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej Rysunek 2. Pole widzenia Campus (ręczna perymetria kinetyczna) u pacjenta z mikrogruczolakiem przysadki mózgowej [opracowanie własne] Rysunek 3. Pole widzenia Octopus (automatyczna perymetria statyczna) u pacjenta z mikrogruczolakiem przysadki mózgowej [opracowanie własne] 269 Monika Sarnat-Kucharczyk, Ewa Kurzak, Ewa Mrukwa-Kominek Rysunek 4. Wynik mikroperymetrii u pacjenta z mikrogruczolakiem przysadki mózgowej [opracowanie własne] Rysunek 5. Pole widzenia Campus (ręczna perymetria kinetyczna) u pacjenta z makrogruczolakiem przysadki mózgowej [opracowanie własne] Rysunek 6. Pole widzenia Octopus (automatyczna perymetria statyczna) u pacjenta z makrogruczolakiem przysadki mózgowej [opracowanie własne] 270 Zastosowanie mikroperymetrii oraz badania poczucia kontrastu u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej Rysunek 7. Wynik mikroperymetrii u pacjenta z makrogruczolakiem przysadki mózgowej [opracowanie własne] Wykres 1. Czułość siatkówki w plamce analizowana za pomocą mikroperymetru MP1 w danym kwadrancie w obu grupach [opracowanie własne] 271 Monika Sarnat-Kucharczyk, Ewa Kurzak, Ewa Mrukwa-Kominek Rysunek 8. Graficzna interpretacja średniej wartości poczucia kontrastu w obu grupach [opracowanie własne] Rysunek 9. Korelacja Pearsona pomiędzy czułością siatkówki centralnej a wrażliwością na kontrast w obu grupach [opracowanie własne] 272 Zastosowanie mikroperymetrii oraz badania poczucia kontrastu u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej 6.1.2. Tabela Tabela 1. Zakres pola kinetycznego Goldmanna, średnią czułość siatkówki (MS) w automatycznej perymetrii statycznej oraz w mikroperymetrii [opracowanie własne] 50 60 50 85 50 60 45 80 23,5 26,8 17,9 18,3 2 50 60 50 80 50 65 50 80 29,3 29,4 17,6 18,6 3 55 65 50 80 50 65 55 85 27,2 27,2 18 17,8 4 45 60 50 80 50 60 50 80 29,4 29,6 18 17,9 5 50 65 50 85 55 65 50 85 25,5 27,1 11,9 8,9 6 50 65 50 80 50 60 50 80 30,1 29,9 19,2 18,6 7 45 60 50 85 45 65 50 85 25,6 25,3 17,4 16,7 8 50 65 50 80 50 70 50 80 26,9 26,5 18,9 17 część dolna 1 część górna część skroniowa MS OP część nosowa MS OP część dolna Mikroperymetria część górna Octopus część skroniowa Campus - OL część nosowa Campus - OP MS OL MS OL mikrogruczolaki 9 50 60 50 85 50 60 50 80 27,2 28 15,9 17,7 10 55 60 55 85 55 60 50 80 29,1 28,2 18,5 18,5 11 50 65 50 80 50 60 50 80 28,1 28,2 18,5 18,9 12 50 60 50 85 50 65 50 85 27,9 27,4 18,2 17,5 13 50 65 50 80 50 60 50 80 27,9 27,6 19,2 18,8 14 50 60 50 80 50 65 50 75 23 17,3 18,6 15 50 65 50 85 50 60 50 90 26,5 27,9 18,6 19,1 16 50 60 50 80 50 65 50 80 27,2 28,1 18,9 19,2 17 50 55 50 75 50 55 50 70 27,5 28 18,4 19,2 18 50 60 50 80 50 60 50 85 25,4 26,8 16,7 17,7 19 55 65 50 85 55 60 50 80 24,2 25 17,2 17,4 20 50 60 50 80 50 65 50 85 25,4 16,8 16 15 21 50 55 45 75 50 55 45 75 22,2 21,2 15,4 14 22 55 55 50 85 55 55 50 80 23,5 24 15,1 14,8 23 50 50 50 70 50 50 50 75 24,2 22,4 14,8 14,2 24 55 60 50 90 55 65 50 90 26,4 24,2 18 16,8 25 50 55 50 80 55 65 50 85 23 22,5 13,5 12,4 273 24 Monika Sarnat-Kucharczyk, Ewa Kurzak, Ewa Mrukwa-Kominek 50 60 50 80 50 65 50 75 21,5 22,7 16,9 15,1 2 50 70 50 80 40 65 50 80 24,2 23,9 16,4 16,5 3 40 60 50 80 40 70 50 80 28 25,7 15,3 14,1 4 50 65 50 85 50 65 50 80 21,4 25,3 14,2 16,2 5 40 65 50 50 45 60 50 25 22,7 19,1 15,2 14,1 6 50 70 50 85 55 70 50 85 25,8 25,7 14,9 14,4 7 50 70 50 90 50 65 50 85 25,8 25,8 15,4 14,7 8 50 60 50 5 50 60 50 10 16,7 17,2 9,5 10,1 część dolna 1 część górna część skroniowa MS OP część nosowa MS OP część dolna Mikroperymetria część górna Octopus część skroniowa Campus - OL część nosowa Campus - OP MS OL MS OL mikrogruczolaki 9 50 70 50 30 0 0 45 3,1 11,3 0 10 50 65 50 80 50 70 50 80 26,2 22,8 16,9 16,8 11 50 60 50 80 50 65 50 80 20,8 20,9 10,8 11,7 12 45 65 50 70 50 65 50 70 21 22,1 12,2 17,5 13 30 0 35 0 45 50 50 0 8,8 15,5 0 10 14 50 55 50 0 50 60 50 0 15 45 60 50 0 50 60 50 16 50 65 50 60 50 65 50 17 50 60 50 80 50 60 50 85 21,4 18 50 55 50 0 40 45 50 -15 13,9 19 50 45 50 -5 50 45 45 -10 11,3 9,7 9,1 6,3 20 50 50 50 0 50 50 50 70 18,4 20,4 9,9 13,9 21 50 55 50 70 50 60 50 75 22,3 22,9 12,5 14,1 22 55 60 50 80 50 65 55 75 18,9 21,2 13 15,1 23 50 60 50 75 50 60 50 75 19,8 20,1 11,1 11,3 24 45 45 55 0 50 50 45 0 13,5 15,6 8,4 9,1 25 50 50 55 0 50 45 45 0 5,6 9,2 Źródło: Opracowanie własne 274 -15 19,1 -5 12,9 8,2 7,4 0 19,2 19 10,7 9,2 18 21,6 11 12,4 23 12,1 14,7 3,4 3,6 0 70 9 14,2 Zastosowanie mikroperymetrii oraz badania poczucia kontrastu u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej Tabela 2. Średnie wartości poczucia kontrastu w obu grupach w poszczególnych rzędach [opracowanie własne] Źródło: Opracowanie własne Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Lake MG, Krook LS, Cruz SV., Pituitary adenomas: an overview. American Family Physician. 2013 Sep 1;88(5):319-27. Kański J., Okulistyka kliniczna, wyd. Urban & Partner, 2007, s. 864-867 Kasputytė R, Slatkevičienė G, Liutkevičienė R, Glebauskienė B, Bernotas G, Tamašauskas A., Changes of visual functions in patients with pituitary adenoma. Medicina (Kaunas). 2013;49(3):132-7. Holz F.G, Spaide R.F, Medical Retina, wyd. Springer, 2007, s. 8-18 Hirai T., Ito Y., Arai M., Ota Y., Kojima T., Sato M., Mikyake Y., Loss of stereopsis with optic chiasmal lesions and stereoscopic tests as a differential test, Ophthalmology. 2002 Sep;109(9):1692-702. Rohrschneider K., Bültmann S., Springer C. Use of fundus perimetry (microperimetry) to quantify macular sensitivity. Progress in Retinal and Eye Research. 2008;27(5):536–548. doi: 10.1016/j.preteyeres.2008.07.003. Venugopal N, Kummararaj G, Kummararaj S., Full field perimetry in occipital lobe lesion. Indian Journal of Ophthalmology. 2014 Sep;62(9):974. doi: 10.4103/0301-4738.143969. Orzalesi N, Miglior S, Lonati C, Rosetti L., Microperimetry of localized retinal nerve fiber layer defects. Vision Research. 1998 Mar;38(5):763-71. Jędrzejczak-Młodziejewska J, Krawczyk A, Szaflik JP. Badanie wrażliwości na kontrast testerem wzroku Functional Vision Analyzer™ (FVA), Okulistyka, 3(II)/2010 (ROK XIII) Xi L, Liu Y, Zhao F, Chen C, Cheng B. Analysis of glistenings in hydrophobic acrylic intraocular lenses on visual performance, Int J Ophthalmol. 2014 Jun 18;7(3):446-51. doi: 10.3980/j.issn.2222-3959.2014.03.11. eCollection 2014. Silva CA, Schweitzer de Oliveira E, Souza de Sena Júnior MP, Barbosa de Sousa L. Contrast sensitivity in deep anterior lamellar keratoplasty versus penetrating keratoplasty. Clinics (Sao Paulo). 2007 Dec;62(6):705-8. Shen MQ, Ye W, Zhang YY, Chen J. Visual field defects in 169 cases of pituitary adenomas. Zhonghua Yan Ke Za Zhi. 2009 Dec;45(12):1074-9. Cannavó S, De Natale R, Curtó L, Li Calzi L, Trimarchi F. Effectiveness of computer-assisted perimetry in the follow-up of patients with pituitary microadenoma responsive to medical treatment. Clin Endocrinol (Oxf). 1992 Aug;37(2):157-61 275 Monika Sarnat-Kucharczyk, Ewa Kurzak, Ewa Mrukwa-Kominek 14. Porciatti V, Ciavarella P, Ghiggi MR, D'Angelo V, Padovano S, Grifa M, Moretti G., Losses of hemifield contrast sensitivity in patients with pituitary adenoma and normal visual acuity and visual field. Clinical Neurophysiology.1999 May;110(5):876-86. 15. Grochowicki M, Vighetto A, Berquet S, Sassolas G. Contrast sensitivity function and pituitary adenoma: a study of 40 cases. British Journal of Ophthalmology. 1990 Jun;74(6):358. 16. Kupersmith MJ, Siegel IM, Carr RE. Reduced contrast sensitivity in compressive lesions of the anterior visual pathway. Neurology. 1981 May;31(5):550-4. 17. Romano MR, Angi M, Romano V, Marticorena J, Romano F. Early unilateral macular sensitivity changes in microperimetry in a case of pituitary adenoma. International Ophthalmology. 2010 Dec;30(6):709-11. doi: 10.1007/s10792010-9345-4. Epub 2010 Feb 23. 18. Rathschuler F., Microperimetry and pituitary adenoma, Retinal physician, July 2010, http://www.retinalphysician.com/articleviewer.aspx?articleID=104533 Zastosowanie mikroperymetrii oraz badania poczucia kontrastu u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej Streszczenie Gruczolaki przysadki mózgowej w miarę swojego wzrostu mogą uciskać skrzyżowanie nerwów wzrokowych oraz powodować zmiany w polu widzenia. Celem artykułu jest przedstawienie użyteczności mikroperymetrii oraz badania poczucia kontrastu u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej. Grupę badaną stanowiło 50 pacjentów z rozpoznaniem gruczolaka przysadki na podstawie obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI). Pacjentów podzielono na dwie grupy na podstawie wyników MRI przysadki mózgowej w zależności od średnicy guza. U pacjentów wykonano dodatkowo badania ręcznej perymetrii kinetycznej Goldmanna oraz perymetrii statycznej Octopus. Mikroperymetria w porównaniu do innych badań perymetrycznych jest wysoce czułą metodą oceniającą zmiany wrażliwości siatkówki centralnej. Ocena wrażliwości na kontrast jest cennym badaniem określającym stan narządu wzroku. Stwierdzono zależność pomiędzy czułością siatkówki centralnej, a wrażliwością na kontrast u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej. Mikroperymetria i badanie wrażliwości na kontrast jako badania nieinwazyjne mogą stanowić dodatkowe narzędzia dla rezonansu magnetycznego w diagnozowaniu ucisku drogi wzrokowej przez gruczolaki przysadki mózgowej. The use of microperimetry and contrast sensitivity test in patients with pituitary adenomas. Abstract Pituitary adenomas with the increase in growth, can compress the optic nerves chiasm and cause changes in the visual field. The aim of this article is to present the usefulness of microperimetry and contrast sensitivity test in patients with pituitary adenomas. The analyzed group consisted of 50 patients diagnosed with pituitary adenoma based on magnetic resonance imaging (MRI). Patients were divided into two groups based on the outcome of MRI of the pituitary gland, depending on the tumor diameter. Additionally, Goldmann manual kinetic perimetry and Octopus static perimetry were performed. 276 Zastosowanie mikroperymetrii oraz badania poczucia kontrastu u pacjentów z gruczolakami przysadki mózgowej Microperimetry compared to other perimetric tests is a highly sensitive method for evaluating even the slightest changes in the sensitivity of the central retina. Contrast sensitivity testing is a valuable study that indicates the status of the eye. The relationship between the sensitivity of the central retina and the contrast sensitivity in patients with pituitary adenomas was observed. Microperimetry and contrast sensitivity testing as noninvasive tests may provide additional tools to MRI in the diagnosis of optic pathway compression by pituitary adenomas. 277 Indeks autorów: Anisiewicz A. ............................................. 44 Labochka D...................................... 189, 198 Barchiewicz K.......................................... 101 Łabejszo A. .................................................74 Bilska S. ....................................... 7, 127, 165 Łasut B. .......................................................61 Boniewska-Bernacka E. .......................... 101 Markowicz J. ........................................... 220 Bulska W. ...........................................19, 210 Michalik M. ................................................83 Bzdek A. ................................................... 220 Moszczuk B. .................................... 189, 198 Cwynar A. ................................................ 152 Mrukwa-Kominek E. .............................. 262 Czarnecka A. ................................... 189, 198 Muc K....................................................... 234 Czekaj P. ..................................................... 83 Okła K. .................................. 7, 44, 127, 165 Czerwonka A. .......................................... 142 Pilarz Ł. B. ......................................... 19, 210 Frant M. .................................................... 142 Pudło H. ................................................... 175 Głód W. .................................................... 245 Respondek M........................................... 175 Godzisz M. ............................................... 245 Roman T. ................................................. 220 Goede A. ................................................... 119 Sarnat-Kucharczyk M............................. 262 Grabowska M............................................. 19 Szefczyk-Polowczyk L. .......................... 175 Grywalska E. ............................................ 220 Szymczyk A............................................. 220 Grzechnik K. ............................................ 245 Wandtke T. ........................................ 74, 119 Jakubczyk K. ............................................ 101 Wawruszak A. ...................... 7, 44, 127, 165 Janicka A. ................................................. 152 Wilińska J....................................................61 Klimek M. .................................................. 83 Wojewoda K. ........................................... 234 Kozioł A. .................................................. 234 Woźniak J. ......................................... 74, 119 Kozłowski T. .............................................. 83 Wyroba B. ...................................................35 Kucz M. ...................................................... 61 Ziomkowska B. ....................................... 152 Kurzak E. .................................................. 262 Żurek A. ................................................... 142 278
