Rodzaje autoprzeciwciał w chorobach reumatycznych i metody ich

advertisement
diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
Diagn Lab 2015; 51(3): 235-250
Praca poglądowa • Review Article
Rodzaje autoprzeciwciał w chorobach reumatycznych
i metody ich oznaczeń
Different types of autoantibodies in rheumatic diseases
and methods of their determination
Alicja Grim1, Katarzyna Komosińska-Vassev2, Paweł Olczyk3
Śląskie Centrum Reumatologii, Rehabilitacji i Zapobiegania Niepełnosprawności im. gen. Jerzego Ziętka w Ustroniu Sp. z o. o.
Katedra i Zakład Chemii Klinicznej i Diagnostyki Laboratoryjnej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu,
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
3
Zakład Farmacji Aptecznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
1
2
Streszczenie
Choroby reumatyczne, to grupa chorób przewlekłych o zróżnicowanej, często niewyjaśnionej etiologii o podłożu autoimmunizacyjnym.
Są konsekwencją odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko własnym antygenom w procesie autoimmunizacji. Powstające
autoprzeciwciała łączą się z autoantygenem prowadząc do uszkodzenia komórek i tkanek organizmu. Choroby te cechuje występowanie
autoprzeciwciał z charakterystyczny profilem reaktywności antygenowej, pomocnym dla postawienia właściwego rozpoznania. Stwierdzono korelację występowania niektórych autoprzeciwciał, tak zwanych markerowych z określonym obrazem klinicznym. Przeciwciała
te mają dużą wartość diagnostyczną i prognostyczną. Należy podkreślić, że stwierdzenie samej obecności przeciwciała w badanej surowicy,
nie może stanowić kryterium rozpoznania choroby, bez wystąpienia objawów klinicznych. Ważną rolę w immunodiagnostyce chorób
reumatycznych odgrywają badania serologiczne, zwłaszcza metoda immunofluorescencji pośredniej, która stanowi złoty standard
w diagnostyce przeciwciał przeciwjądrowych. Praca zawiera opis przeciwciał występujących w przebiegu chorób reumatycznych wraz
z oceną przydatności klinicznej tych przeciwciał a także ich immunodiagnostykę laboratoryjną.
Summary
Rheumatic diseases are a group of chronic disorders with varied and frequently unexplained autoimmune etiology. They results from
an immune response targeted against own antigens in the autoimmune process. Arising autoantibodies bind to the autoantigen,
ultimately leading to cell and tissue damage. Rheumatic diseases are characterized by the presence of antibodies exhibiting a specific
antigenic activity which is useful for making the correct diagnosis. There is a known correlation between the certain autoantibodies,
so-called marker autoantibodies, and specific clinical findings. Autoantibodies from this group have a high diagnostic and prognostic
value. It must be emphasized that the detection of antibody in the blood serum is not in itself sufficient for diagnosis a disease, if no
clinical symptoms are present. A major role in the immune diagnostics of rheumatic diseases is played by serological tests, primarily
the indirect immunofluorescence assay, the last one being recognized as a gold standard in antinuclear antibodies detection. This
thesis contains a description of different types of antibodies found in rheumatic disorders, an evaluation of their clinical usefulness and
immunodiagnostic methods of their determination.
Słowa kluczowe: choroby reumatyczne, ANA, RF, CCP, ANCA, diagnostyka laboratoryjna
Key words:
rheumatic diseases, ANA, RF, CCP, ANCA, laboratory diagnostics.
Wstęp
obejmujący różne tkanki i narządy, mający często charakter ukła-
Choroby reumatyczne o podłożu autoimmunizacyjnym należą
do grupy chorób o zróżnicowanej, często niewyjaśnionej etiologii
i bogatej symptomatologii. Wspólną ich cechą, oprócz podłoża
łącznotkankowego, jest różna etiologia w tym infekcyjna, immunologiczna, lekowa, środowiskowa, mechaniczna zaś w obrazie
klinicznym – długotrwały przebieg z okresami remisji i zaostrzeń,
dowy. Złożoność objawów klinicznych, wahania ich nasilenia,
także częstość nakładania się jednostek chorobowych może nastręczać trudności diagnostyczne. Choroby autoimmunizacyjne
występują częściej u kobiet niż u mężczyzn, częściej także we
wczesnym okresie dorosłego życia [1, 2]. Cechują się ponadto
występowaniem autoprzeciwciał i charakterystycznym profilem
235
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
reaktywności antygenowej, pomocnym dla postawienia właściwego rozpoznania [1]. Określony profil przeciwciał nie tłumaczy
jednak, dlaczego dany narząd lub tkanka są atakowane w danym
zespole klinicznym, natomiast wskazuje, iż ich uszkodzenie jest
wynikiem procesu zapalnego, powstającego na podłożu zaburzeń
immunologicznych. Stwierdzenie obecności przeciwciał niekoniecznie ma związek przyczynowy z chorobą i nie może stanowić
kryterium rozpoznania choroby [1]. Coraz częściej podkreśla się
jednak znaczenie prognostyczne i rokownicze przeciwciał, gdyż
ich obecność koreluje z objawami klinicznymi [3].
Klasyczne zapalne choroby reumatyczne to między innymi reumatoidalne zapalenie stawów RZS (RA; rheumatoid arthritis),
seronegatywna postać zapalenia stawów kręgosłupa, toczeń
rumieniowaty układowy TRU (SLE; systemic lupus erythematosus), zespół Sjögrena (SS; Sjögren,s syndrome), zespół anty-fosfolipidowy (APS; antiphosholipid syndrome), mieszana choroba
tkanki łącznej (MCTD; mixed connective tissue disease), twardzina
układowa, różne typy zapaleń naczyń, zapalenie wielomięśniowe
(PM; polymyositis) i skórno-mięśniowe (DM; dermatomyositis) [1].
Etiopatogeneza chorób autoimmunizacyjnych
W warunkach fizjologicznych układ odpornościowy posiada
umiejętność rozróżniania własnych antygenów od zewnątrzpochodnych i nie odpowiada na własne antygeny. Mimo selekcji
limfocytów w narządach takich jak grasica (limfocyty T) i szpik
kostny (limfocyty B), w warunkach fizjologii powstają w niewielkiej
ilości limfocyty T i B potencjalnie autoreaktywne. Pomimo występowania tych komórek autoreaktywnych, nie dochodzi jednak
do aktywacji limfocytów, czemu przeciwdziałają mechanizmy
autotolerancji. Przełamanie stanu autotolerancji i uruchomienie
mechanizmów autoagresji wobec elementów własnych komórek
i tkanek, prowadzi do chorób autoimmunizacyjnych [2, 4]. Są
one konsekwencją odpowiedzi immunologicznej, skierowanej
przeciwko własnym antygenom w procesie autoimmunizacji.
Powstające autoprzeciwciała łącząc się z autoantygenem stają
się pozanaczyniowymi lub krążącymi kompleksami immunologicznymi (CIC; circulating immune complexses). Ich akumulacja
może indukować reakcje zapalne poprzez aktywację systemu
dopełniacza, wzmagać działania procesów krzepnięcia, prowadząc do agregacji płytek i erytrocytów [2, 4, 5].
Etiologia chorób autoimmunizacyjnych nie jest do końca poznana. Istotną rolę w indukcji procesu chorobowego odrywają najprawdopodobniej zarówno czynniki wewnątrzpochodne (geny
głównego układu zgodności tkankowej, inne geny, nadprodukcja
cytokin, hormony płciowe, zaburzenia apoptozy) jak i czynniki
zewnątrzpochodne (uraz, infekcje wirusowe i bakteryjne, promieniowanie UV, rozpuszczalniki organiczne, leki). Nie bez znaczenia
jest również wzajemna interakcja między tymi czynnikami [6].
Czynniki wewnątrzpochodne
Geny głównego układu zgodności tkankowej wykazują silny
związek z występowaniem wielu chorób. Najsilniejszy związek
opisano w przypadku genów dla cząsteczek (MHC; major histocompatibility complex) klasy II, co stanowi potwierdzenie głównej
roli limfocytów Th (CD4+) w rozwoju procesu autoimmunizacji.
236
Występowanie antygenów HLA-DR4 (ang. human leukocyte antigen) stwierdzono w reumatoidalnym zapaleniu stawów, a HLA-B27 w zesztywniającym zapaleniu stawów kręgosłupa [1, 4].
Ponadto genetycznie uwarunkowana nadprodukcja niektórych
cytokin, jest także wiązana z rozwojem chorób autoimmunizacyjnych. Konsekwencja defektu genu prowadzącego do nadekspresji
czynnika martwicy nowotworów α – jest destrukcyjna choroba
stawów przypominająca reumatoidalne zapalenie stawów [6].
Istotną rolę w etiopatogenezie chorób autoimmunizacyjnych
odgrywają także hormony płciowe. Kobiety stanowią bowiem 6070% chorych na RZS, zaś ponad 80% chorych na TRU i twardzinę
układową [2]. Wyjątkiem jest zesztywniające zapalenie stawów
kręgosłupa, na które częściej chorują mężczyźni [6]. Do aktywacji
procesów autoimmunizacji i rozwoju chorób z autoagresji prowadzić mogą zaburzenia szlaków apoptozy np. mutacja genu Fas
u osób chorujących na zespół podobny do tocznia. Zaburzenie
procesu apoptozy skutkuje brakiem usuwania potencjalnie autoreaktywnych limfocytów B [2].
Czynniki zewnątrzpochodne
Uraz fizyczny, termiczny lub zapalny identyfikowane są jako prawdopodobne czynniki mogące doprowadzić do przełamana bariery
tolerancji immunologicznej na własne antygeny i w konsekwencji
zapoczątkować procesy autoimmunizacyjne. Zakażenie wirusami
lub bakteriami posiadającymi epitopy wykazujące podobieństwo do antygenów gospodarza, może – poprzez mechanizm
mimikry molekularnej – prowadzić do aktywacji limfocytów autoreaktywnych. Jako przykład mogą posłużyć zakażenia retrowirusami, zakażenia wirusem Epsteina-Barr, które są egzogennymi
czynnikami ryzyka w TRU [2]. Również inne czynniki środowiska
zewnętrznego, mogą indukować szereg zaburzeń immunologicznych. I tak np. promieniowanie UV jest induktorem zmian
skórnych w toczniu, chlorek winylu i związki krzemu mają istotną
rolę w indukcji odpowiedzi immunologicznej w twardzinie układowej, zaś hydralazyna w przebiegu toczenia rumieniowatego
układowego [2]. Zależności pomiędzy mechanizmem powstania
i rozwojem schorzeń autoimmunizacyjnych, a układem immunologicznym są wielorakie. Do zasadniczych funkcji układu immunologicznego należą rozpoznanie antygenu (patogenu), przez
limfocyty T z udziałem cząstek HLA klasy I, HLA klasy II, odpowiedź
humoralna zależna od limfocytów, współdziałanie komórek immunokompetentnych, swoistość reakcji i pamięć immunologiczna.
W sytuacji, kiedy układ immunologiczny nie rozpoznaje, bądź nie
eliminuje antygenu (patogenu), np. w wyniku niedostatecznego
powstawania limfocytów TCD8 (cytotoksycznych), dochodzi do
rozwoju reakcji immunopatologicznych. Elementami procesu
autoimmunizacyjnego są autoantygeny, komórki dendrytyczne,
autoreaktywne limfocyty T i B i autoprzeciwciała [5, 6].
Autoantygeny, to antygeny związane z prawidłowymi komórkami
organizmu. Mogą nimi być receptory znajdujące się na powierzchni komórki np. antygeny komórek na płytkach krwi, antygeny
występujące we wnętrzu komórki np. antygen jąderkowy ślinianek
w zespole Sjögrena, czy też substancje wytwarzane i wydzielane
przez prawidłowe komórki np. hormon tyreotropowy przysadki
w nadczynności tarczycy [2, 6].
Diagn Lab 2015; 51(3): 235-250
Główne zagrożenie rozwojem procesu autoimmunizacji stanowi
nadmierna odpowiedź komórek T i B, a także autoreaktywne limfocyty Th /CD4+/, które kontrolują limfocyty Tc i B, prowadząc do aktywacji autoreaktywnych limfocytów B, a dalej do ich transformacji
blastycznej i produkcji autoprzeciwciał. Autoreaktywne limfocyty
B są w stanie również rozpoznać autoantygeny rozpuszczalne bez
połączenia z cząsteczkami MHC. Spełniają też funkcję komórek
prezentujących autoantygeny autoreaktywnym limfocytom T [6].
Autoprzeciwciała mogą wiązać epitopy autoantygenów rozpuszczalnych i powierzchniowych. Powstające w ten sposób kompleksy immunologiczne, odkładają się w naczyniach, prowadząc
do rozwoju stanu zapalnego, a w konsekwencji do uszkodzenia
naczyń i narządów [1].
Autoprzeciwciała i autoreaktywne limfocyty występują również
w organizmie w warunkach fizjologicznych, pomagają eliminować
z krążenia autoantygeny i w większości przypadków nie doprowadzają do rozwoju chorób autoimmunizacyjnych. Do uszkodzenia
komórek i tkanek w chorobach autoimmunologicznych dochodzi
na drodze dwóch głównych mechanizmów. Pierwszym z nich są
mechanizmy nadwrażliwości, prowadzące do uszkodzeń powstających wskutek działania przeciwciał (nadwrażliwość typu II i III) i/
lub limfocytów T (typ IV reakcji nadwrażliwości). Autoprzeciwciała
mogą także naśladować lub blokować działanie endogennych
ligandów dla własnych białek, w tym – hormonów [6].
Modele chorób autoimmunizacyjnych
Choroby autoimmunologiczne do których należą choroby reumatyczne, są schorzeniami o przebiegu przewlekłym, które prowadzą
do uszkodzenia komórek i tkanek gospodarza. Często prowadzą
do trwałego inwalidztwa, a czasami do śmierci. Choroby te charakteryzują się okresami remisji i pogorszenia stanu zdrowia osoby
chorej. Na choroby autoimmunizacyne cierpi około 5% populacji
krajów zachodnioeuropejskich [2].
Ze względu na umiejscowienie autoantygenu choroby autoimmunizacyjne można podzielić na narządowo-swoiste i układowe
[4]. W chorobach narządowo-swoistych, odpowiedź autoimmunologiczna skierowana jest przeciwko wielu antygenom, zlokalizowanym w określonym narządzie. Większość z najczęściej
występujących zaburzeń autoimmunologicznych narządowo-swoistych dotyka pojedynczego gruczołu endogennego, np.
w cukrzycy typu 1, przeciwciała skierowane są przeciwko komór-
kom β wysp trzustkowych Langerhansa. Przykładem specyficznej
narządowo choroby autoimmunizacyjnej jest także pierwotna
żółciowa marskość wątroby, definiowana przez krążące autoprzeciwciała przeciwmitochondrialne (AMA-M2). Zaburzenia
układowe dotykają z kolei wielu narządów i są związane z odpowiedzią autoimmunologiczną, skierowaną przeciwko antygenom
występującym powszechnie w organizmie. Wśród tych ostatnich
antygenów wymieniane są cząsteczki wewnątrzkomórkowe zaangażowane w transkrypcję i translację kodu genetycznego,
w tym dwuniciowe DNA i histony, przeciwko którym indukowana
jest odpowiedź autoimmunologiczna w toczniu rumieniowatym
układowym, czy też topoizomeraza I i białka centromerowe,
związane z indukcją odpowiedzi autoimmunologicznej w twardzinie [5, 6].
Autoprzeciwciała w chorobach reumatycznych
Zjawiskiem powszechnym i typowym dla chorób reumatycznych
jest pojawienie się w krążeniu autoprzeciwciał i/lub autoreaktywnych limfocytów T, skierowanych przeciwko różnym własnym
antygenom w tym składnikom jądra komórkowego i cytoplazmy,
organellom komórkowym, składnikom tkanki łącznej, chrzęstnej
i stawów. Zidentyfikowano ponad 150 autoantygenów, przeciwko
którym wytwarzane są autoprzeciwciała w przebiegu chorób reumatycznych [7]. Należy podkreślić, że stwierdzenie samej obecności przeciwciała w badanej surowicy, nie może stanowić kryterium
rozpoznania choroby, bez wystąpienia objawów klinicznych [4].
Badania serologiczne, w których wykrywa się przeciwciała, stanowią obecnie podstawę immunodiagnostyki układowych chorób
tkanki łącznej. Stwierdzono ponadto korelację występowania
niektórych autoprzeciwciał z określonym obrazem klinicznym,
a jednostką chorobową. Przeciwciała te, określa się także jako tzw.
przeciwciała markerowe. Przykłady przeciwciał markerowych
w chorobach tkanki łącznej podano w tabeli I.
Przeciwciała te obecne u osób z określonymi objawami klinicznymi mają dużą wartość diagnostyczną i prognostyczną. Cechy,
jakimi powinny oznaczać się przeciwciała markerowe w chorobach reumatycznych obejmują wysoką czułość pozwalającą na
rozpoznanie choroby w jak najwcześniejszym stadium, a także
wysoką swoistość dla danej jednostki chorobowej, co może być
pomocne w diagnostyce różnicowej z innymi chorobami reumatycznymi (cANCA w ziarniniakowatości z zapaleniem naczyń)
[4, 8]. Ponadto miano przeciwciała
Tabela I. Częstość występowania przeciwciał ANA (%) w wybranych chorobach reumatycznych z zaznaczeniem
markerowego powinno odzwiercieprzeciwciał markerowych [ 3 ].
dlać aktywność procesu chorobowego,
Jednostka chorobowa
a obecność korelować z określonymi
Autoprzeciwciała
Sjögrena
MCTD
SLE
Twardzina układowa
objawami klinicznymi. Zależność taką
anty-dsDNA
40-90
<5
<5
<5
opisano np. w stosunku do przeciwciał
anty-ssDNA
70-95
< 30
< 50
<20
anty-dsDNA w toczniu rumieniowatym
anty-histonowe
30-70
<5
<5
<5
anty– Sm
20-40
<5
<5
<5
układowym z powikłaniami nerkowymi,
anty-SS-A/Ro
20-60
<5
40-95
<5
których miano korelowało z obecnością
anty-SS-B/La
< 20
<5
40-70
<5
powikłań nerkowych [4].
ACA
anty– U1-RNP
anty-Scl-70
<5
30-40
-
pogrubione – autoprzeciwciała markerowe
80-95
75
<5
-
<5
95
-
Metody oznaczania autoprzeciwciał
Autoprzeciwciała oznaczane są przy
użyciu wielu różnych technik badaw237
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
czych, do których należą metoda immunofluorescencji, metody
immunoenzymatyczne (testy ELISA), technika Colorzyme, immunodyfuzja, immunoblot, Western-blot, pozostałe metody nefelometryczne, turbidymetryczne, chemiluminescencyjne, koagulometryczne i lateksowe [1,5]. W ostatnich latach nastąpił rozwój
różnego typu technologii multipleksowych [9,10]
1. Metoda immunofluorescencji pośredniej
Złotym standardem w immunodiagnostyce układowych chorób tkanki łącznej pozostaje wprowadzona ponad 40 lat temu
metoda immunofluorescencji pośredniej (IIF; indirect immunofluorescence), która jest kilkakrotnie bardziej czuła niż metoda
bezpośrednia (DIF; direct immunofluorescence), oparta na reakcji
antygenów ze znakowanymi fluorescencyjnie swoistymi przeciwciałami [1, 5].
W metodzie immunofluorescencji IIF, w pierwszym etapie następuje wiązanie antygenu ze swoistym przeciwciałem nieznakowanym, do którego dołącza się drugie przeciwciało, znakowane
fluorochromem, skierowane przeciwko immunoglobulinom zwierzęcia, od którego wyizolowano pierwsze przeciwciało. Jako źródło
antygenów w metodzie tej wykorzystuje się substraty komórkowe
lub tkankowe, np. skrawki wątroby, nerki i żołądka szczura lub
małpy, linię hodowlaną komórek raka krtani człowieka HEp-2,
HEp-2000, pierwotniaka Crithidium luciliae, czy też granulocyty
obojętnochłonne [1, 7]. Kompleksy powstałe w wyniku połączenia
przeciwciał z antygenami wykrywa się przy użyciu znakowanych
barwnikiem fluoryzującym przeciwciał zwierzęcych, skierowanych
przeciwko ludzkim immuglobulinom. Najpowszechniej stosowanym w niej fluorochromami są izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)
oraz rodamina B [11, 12, 13].
W miejscu związania znakowanego przeciwciała z antygenem
obserwuje się w mikroskopie fluorescencyjnym zaopatrzonym
w lampę emitującą promieniowanie UV charakterystyczne świecenie np. żółto-zieloną fluorescencję z zastosowaniem znacznika
FITC. Metoda ta jest czasochłonna i wymaga doświadczonego,
profesjonalnego personelu [12].
Właściwe rozpoznanie typów fluorescencji w metodzie IIF (tabela II), pozwala wykryć prawdopodobne spektrum przeciwciał
przeciwjądrowych ANA, skierowanych przeciwko antygenom
jądrowym i cytoplazmatycznym [14, 15, 16].
Do najczęściej rozpoznawanych rodzajów świecenia w obrębie
jądra wymienić należy: homogenne, gruboplamiste, drobnoplamiste, centromerowe i jąderkowe, zaś do świeceń cytoplazmatycznych najczęściej obserwowanych w metodzie IIF należą świecenie
rozlane, drobnoplamiste, delikatne plamiste i świecenie włókien
cytoplazmatycznych [14, 15].
W badaniu ilościowym, poprzez wykonanie kolejnych rozcieńczeń
badanej surowicy, można określić miano przeciwciał przeciwjądrowych. Mianem określa się takie rozcieńczenie surowicy, przy
którym można jeszcze rozpoznać typ świecenia. Przeciwciała ANA,
istotne klinicznie należą najczęściej do klasy IgG immunoglobulin.
Należy podkreślić, że badanie to, jest oznaczeniem wstępnym,
stwierdzającym obecność autoprzeciwciał, wymagającym dalszej
ich identyfikacji [15].
Reakcje fałszywie negatywne w testach IIF występują zazwyczaj
w przypadku nieprawidłowego utrwalania i przygotowywania
skrawków tkankowych, które może doprowadzić do zablokowania
niektórych determinant antygenowych. Najczęściej występującymi przyczynami reakcji fałszywie pozytywnych są z kolei: niespecyficzna adsorpcja przeciwciał oraz obecność kilku antygenów
pokrewnych o podobnych epitopach [12].
Rozwój nowych technologii diagnostycznych, znajdujących zastosowanie w laboratorium immunologii klinicznej, przyczynił
się do wprowadzenia nowych metod multipleksowych, w różnym stopniu zautomatyzowanych i zdolnych do jednoczesnego
pomiaru licznych przeciwciał przeciwjądrowych. Są one często
wyposażone w specjalistyczne programy ekspertowe z zakresu
cyfrowej analizy obrazu. Automatyzacja metody IIF może znacznie poprawić standaryzację oznaczeń ANA i pomóc w obniżeniu
zmienności wewnątrzlaboratoryjnej [17].
2. Metody immunoenzymatyczne fazy stałej
Testy ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) oparte na metodach
Tabela II. Najczęstsze rodzaje świecenia obserwowane w metodzie immunofluorescencji pośredniej [15]
immunoenzymatycznych pozwalają
Świecenie w obrębie jądra
Antygen
zarówno na jakościowe jak i ilościowe
Homogenne
dsDNA, histony, chromatyna/nukleosomy
oznaczenie przeciwciał we wszystkich
Gruboziarniste
U1-SnRNP, Sm
klasach immonoglobulin. Mogą służyć
Drobnoziarniste
SS-A/Ro, SS-B/La, Topo-1
do oceny dynamiki poziomu przeciwCentromerowi
CENP-A, B, C, F
ciał w przebiegu podjętej terapii [2].
Jąderkowe
PM(Scl), RNA-polimeraza I-III, fibrylaryna/U3 rybonukleoproteina,
Po raz pierwszy technika immunoenTo/Th, B23 fosfoproteina, numatryna, aneksyna II i V
zymatyczna została opisana w 1969 r.
przez Masona, a w latach następnych
Świecenie cytoplazmatyczne
Antygen
była wielokrotnie modyfikowana
Rozlane
Rib-P, Jo-1, inne syntetazy tRNA, SRP
w celu zwiększenia czułości i swoDrobnoplamiste
Jo-1, mitochondria, SRP
istości. Można wyodrębnić kilka etaDelikatne plamiste
lizosomy, endosomy
pów oznaczenia przeciwciał testami
Włókna cytoplazmatyczne
aktyna, cytokeratyna, wimentyna, tropomiozyna
ELISA, opłaszczenie mikropłytki testowej antygenem, płukanie mikropłytki,
CENP – białko centromerowe (centromere protein); dsDNA – dwuniciowe DNA (double stranded DNA); PM-Scl (polymiositis/
scleroderma); RibP – rybosomalne białko P (ribosomal P protein); SRP– cząstka rozpoznająca sygnał (signal recognition
dodanie badanych surowic i związaparticle), Topo-1 – topoizomeraza 1 (topo-isomerase-1).
nie z antygenem specyficznych prze-
238
Diagn Lab 2015; 51(3): 235-250
ciwciał obecnych w próbkach badanych, inkubacja, wypłukanie
niezwiązanego materiału i dodanie koniugatu znakowanego
enzymem (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna), kolejne płukanie i przeprowadzenie reakcji enzymatycznej poprzez
dodanie odpowiedniego substratu, jako chromogenu (tetrametylobenzydyna, paranitrofenylofosforan sodowy), zahamowanie reakcji barwnej przez zastosowanie odczynnika stopującego (NaOH,
H2SO4) i pomiar spektrofotometryczny barwnego produktu reakcji
enzymatycznej [1, 12].
Podstawowym podłożem wiążącym antygeny w oznaczeniach
immunoenzymatycznych jest polistyren. Oprócz polistyrenu powierzchnię wiążącą płytek może stanowić poliwęglan, polipropylen lub polichlorek winylu [12]. Do głównych źródeł antygenów
wykorzystywanych do identyfikacji i pomiaru autoprzeciwciał
zalicza się ekstrakty komórkowe, antygeny oczyszczone z tkanek,
antygeny rekombinowane, mieszaniny ekstraktów i antygenów
rekombinowanych oraz mieszaniny antygenów oczyszczonych
i rekombinowanych. W diagnostyce medycznej stosuje się do
oznaczeń dostępne w handlu gotowe testy, zawierające płytki
opłaszczone antygenami danego czynnika patogennego, zestaw
buforów i odczynników, koniugaty, wzorce, kontrole oraz dokładny opis procedury wykonania [12, 18].
Testy ELISA cechuje proste, choć czasochłonne wykonanie. Posiadają dużą czułość i swoistość związaną ze zastosowaniem wysoce oczyszczonych antygenów na stałym podłożu (faza stała)
i użyciem do detekcji znakowanych antygenów, połączonych
z substancją, której ilość lub aktywność można zmierzyć [1, 12].
Zaletą technik ELISA w porównaniu z technikami immufluorescencyjnymi jest wyeliminowanie czynnika subiektywnego przy
interpretacji wyników badań [1, 12].
Obecnie z punktu widzenia przydatności diagnostycznej testy
immunoenzymatyczne znalazły zastosowanie do detekcji i analizy
ilościowej wielu różnych autoprzeciwciał m.in. przeciw dsDNA,
SS-A/Ro, SS-B/La, U1-RNP, Sm, Scl-70 i Jo-1, Pm‑Scl, kardiolipinie,
aneksynie V, RNA-azie i wielu innych [12].
Istnieje jednak wiele problemów związanych z powtarzalnością tej
metody, związanych najczęściej z przygotowywaniem antygenów
służących do opłaszczenia płytek ELISA. Stosowane antygeny
mogą w czasie preparatyki ulegać denaturacji, co powoduje obniżenie wiarygodności wyników uzyskiwanych tymi metodami.
Z drugiej strony obecność nawet minimalnych zanieczyszczeń
dodatkowymi antygenami powoduje, że testy te dają fałszywie
dodatnie wyniki [12, 18].
3. Technika ‚Colorzyme’
Jest metodą peroksydazową, która stanowi połączenie metody
immunoenzymatycznej z techniką immunofluorescencji pośredniej [1]. W metodzie tej stosuje się analogiczne substraty
jak w technice IIF, ale zamiast koniugatów z fluorochromem, wykorzystuje się koniugaty antyglobulinowe, związane z peroksydazą chrzanową, stąd nazwa metody. Technika ‚Colorzyme’ daje
charakterystyczne typy wybarwienia zamiast wzorów świeceń
w metodzie IIF. Zmodyfikowaną metodę ‚Colorzyme’ stosuje się
przede wszystkim w laboratoriach bez dostępu mikroskopu fluorescencyjnego [1].
4. Immunodyfuzja
Zarówno antygeny, jak i przeciwciała mają zdolność swobodnej
dyfuzji w żelu agarowym lub agarozowym. Metoda podwójnej
immunodyfuzji polega na podwójnej dyfuzji w żelu agarozowym
badanej surowicy i ekstraktu grasicy cielęcej lub innej tkanki bogatej w materiał jądrowy, będących źródłem natywnych antygenów. W miejscu spotkania antygenu i specyficznego względem
niego przeciwciała, gdy ich proporcje są optymalne, tworzą się
kompleksy antygen-przeciwciało. Powstałe kompleksy ulegają
precypitacji i są widoczne w postaci białych, lekko opalizujących
linii precypitacyjnych, zwanych łukami. Linie precypitacyjne badanych surowic porównuje się z liniami surowic wzorcowych,
zawierających znane przeciwciało [1, 12].
Immunodyfuzja podwójna jest metodą pomocniczą w której wykrywa się i identyfikuje jakościowo autoprzeciwciała skierowane przeciw grupie rozpuszczalnych antygenów jądrowych (ENA; extractable
nuclear antigen) takich jak: SS-A/Ro, SS-B/La, nRNP, Sm, Scl-70, Jo-1
[1]. Technika podwójnej immunodyfuzji jest również czasochłonna
i wymaga dużego doświadczenia w interpretacji wyników, pomimo
to jest stosowana od lat, szczególnie w laboratoriach naukowych,
jako nieskomplikowana i prosta do wykonania [8]. Stosowana jest
w różnych modyfikacjach przy ocenie miana przeciwciał, w określaniu podobieństwa antygenowego i w wykrywaniu reakcji krzyżowych. Dzięki użyciu natywnych, nie zdenaturowanych antygenów,
cechuje ją wysoka swoistość, ale niższa czułość w porównaniu do
metod immunoblot, czy testów ELISA [1, 12].
5. Immunoblot, Western-blot
W technikach tych wykorzystuje się paski lub membranę nośnika
(nitroceluloza) z naniesionymi z rozdzielonych elektroforetycznie
na żelu poliakrylamidowym w określonych miejscach wysoko
oczyszczonymi antygenami, które inkubuje się z badaną surowicą,
a następnie z koniugatem, czyli sprzężonym z enzymem: peroksydazą chrzanową, przeciwciałem zwierzęcym, skierowanym przeciwko ludzkiej immunoglobulinie odpowiedniej klasy. Po dodaniu
substratu dla enzymu w miejscu, gdzie powstaje barwny prążek,
znajduje się antygen o odpowiedniej masie cząsteczkowej [1, 12].
Procedura immunoblotingu przebiega przez wykonanie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, transferu elektroforogramu na
wiążącą, nitrocelulozową membranę, inkubację kolejno z pierwszym
nieznakowanym przeciwciałem i drugim przeciwciałem znakowanym znacznikiem, enzymem, radioizotopem lub fluorochromem
w celu immunodetekcji [12]. Metoda Western-blotting, ze względu
na skomplikowaną technikę, służy w zasadzie jako metoda weryfikująca, potwierdzająca wyniki uzyskane metodą immunoenzymatyczną [2]. Charakteryzuje ją nieco wyższa czułość [2]. Oprócz złożonych
procedur immunoblotingu w diagnostyce medycznej stosuje się
testy dotingowe, w których odpowiednio przygotowane paski testowe zawierają nitrocelulozę z dobranym zestawem antygenów komórek ludzkich, wychwytujących w teście autoprzeciwciała [12, 19].
6. Metody koagulometryczne, nefelometryczne, turbidymetryczne, chemiluminescencyjne, lateksowe
Do oznaczania przeciwciał mogą być wykorzystywane również
inne metody diagnostyczne, tj. koagulometryczne, stosowane do
239
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
oznaczania antykoagulanta toczniowego, nefelometryczne do
oznaczania czynnika reumatoidalnego (RF; rheumatoid factor), czy
też turbidymetryczne i chemiluminescencyjne. Do wykrywania
czynnika RF stosowane są także testy lateksowe, polegające na
aglutynacji cząsteczek nośnika opłaszczonych antygenem (lateks
polistyrenowy) przez zawarty w badanej surowicy czynnik RF [1, 12].
7. Najnowsze metody i techniki multipleksowe
W immunodiagnostyce chorób reumatycznych zastosowanie znajdują również nowe technologie multilpeksowe, pozwalające na
jednoczesną detekcję w pojedynczym oznaczeniu autoprzeciwciał
przeciwko wielu różnym antygenom pochodzenia jądrowego
i cytoplazmatycznego, a tym samym określić pełen profil zaburzeń
immunologicznych u danego pacjenta [5, 10, 20].
Do najczęściej stosowanych technik multipleksowych należą:
• liniowe techniki immunoblot – pozwalają na jakościową lub
półilościową ocenę od kilku do kilkunastu autoprzeciwciał
w jednym oznaczeniu; technika wykorzystuje paski nośnika
(zwykle nitrocelulozy), z naniesionymi w określonych miejscach wysoko oczyszczonymi antygenami w postaci cienkich
linii; sposób przeprowadzenia inkubacji i interpretacji wyników jest zbliżony do powszechnie znanej techniki Western
blot [20];
• cytometria przepływowa – pozwala na równoczesny pomiar
od kilkunastu do kilkudziesięciu autoprzeciwciał w niewielkiej
ilości płynu biologicznego przy użyciu opłaszczonych autoantygenami mikrokuleczek polistyrenowych, uprzednio wyznakowanych fluorochromami [5]. W diagnostyce chorób reumatycznych technika ta znalazła również zastosowanie w ocenie
markerów stanu aktywacji komórek T (CD137, CD154), ilości
komórek B, wykazujących ekspresję receptorów dla chemokin
(CXCR3, CCR3), co może mieć znaczenie w ocenie aktywności
procesu zapalnego. Ocenie poddawano również stan aktywacji i różnicowania komórek B, odgrywających tak istotną rolę
w chorobach autoimmunologicznych, na podstawie analizy
ekspresji antygenów powierzchniowych CD69, CD23 i CD24.
Cytometria pozwala na identyfikację całej linii komórek B
takich jak dziewicze komórki B (IgM+/IgD+/CD19+/CD27−),
komórki plazmatyczne (CD19lo/CD20−/CD27hi), wczesne komórki B pamięci (IgM+/IgD+/CD19+/ CD27+), późne komórki
B pamięci (IgM−/IgD−/CD19+/CD27+) komórki B1 (CD5+/IgM+/
CD19+), a także ocenę stanu ich aktywacji w przebiegu schorzeń reumatycznych, co może być istotne dla pełniejszego poznania mechanizmów patogenetycznych tych chorób [21-24].
• mikromacierze – technika pozwala na równoczesne oznaczenie od kilkuset do nawet kilku tysięcy autoprzeciwciał na
podstawie naniesionych na fazę stałą fragmentów antygenów,
tworzących rodzaj macierzy o określonym położeniu poszczególnych swoistości [1, 10, 20];
• czipy antygenowe (antigen chip) – technologia podobna do
techniki mikromacierzy, która dzięki jeszcze większej miniaturyzacji pozwala na jednoczesne oznaczenie jeszcze większej
ilości autoprzeciwciał. W technologii tej fragmenty autoantygenów zostają za pomocą precyzyjnych robotów, zdeponowane w określonych pozycjach na cieniutkich płytkach szklanych
240
[5, 10, 20]. Te są mechanicznie dzielone na milimetrowej wielkości fragmenty (biochipy), a następnie biochipy są przyklejane do szkiełek mikroskopowych. Do przeprowadzenia pojedyńczych badań na każdym polu reakcyjnym umieszczony
jest jeden biochip. Jeśli wymagane jest badanie jednej próbki
w kierunku przeciwciał przeciwko kilku substratom (profil
przeciwciał), można umieścić wiele różnych biochipów obok
siebie na tym samym polu reakcyjnym (mozaika biochipów).
Mikrochipy są umieszczane z badanymi próbkami surowic zawierającymi autoprzeciwciała, które wiążą się ze specyficznymi
immobilizowanymi autoantygenami [12]. Stężenie badanych
autoprzeciwciał ocenia się najczęściej metodą fluorescencji
z użyciem drugich przeciwciał sprzężonych z fluorochromem.
Technologia biochip, pozwala u chorego oznaczyć jednocześnie autoprzeciwciała skierowane przeciwko wielu antygenom
jądrowym i cytoplazmatycznym, a tym samym określić pełen
profil zaburzeń immunologicznych [1]. Technologia biochip
znalazła zastosowanie w oznaczaniu przeciwciał ANA, profilu
ANA, przeciwciał przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych (ANCA; antineutrophil cytoplasmic antibodies),
a także innych autoprzeciwciał [5].
Ciągły postęp technologiczny, jaki dokonuje się w ostatnich
latach wiążę się z wprowadzeniem automatyzacji metod użytecznych w diagnostyce autoimmunologicznej, w tym techniki
immunofluorescencji pośredniej, immunologicznych technik
mono– i multipleksowych dla określania profilu autoprzeciwciał. Implementacja automatyzacji celem harmonizacji wyników,
zminimalizowania błędu i skrócenia czasu wykonania badania,
a także wprowadzenie procesów konsolidacji i integracji różnych
technologii analitycznych w jednym urządzeniu lub jednej grupie
powiązanych ze sobą urządzeń analitycznych, otworzyły nową erę
w immunodiagnostyce [25].
Znaczenie diagnostyczne autoprzeciwciał w chorobach reumatycznych
I. Czynnik reumatoidalny (RF) jako immunologiczna cecha RZS,
po raz pierwszy wzmiankowany był już w 1922 roku [26]. RF jest
przeciwciałem skierowanym przeciwko fragmentom Fc (domenie
CH2 i CH3) ludzkiej lub zwierzęcej immunoglobuliny klasy G [1,
27]. Czynnik reumatoidalny wykryty został ponad siedemdziesiąt
lat temu i należy do wielu klas immunoglobulin o różnych izotypach i powinowactwach [28]. Najczęściej, gdyż aż 85% czynnik
ten występuje w klasie IgM [2]. Poza tym czynniki reumatoidalne
mogą występować także w klasach IgG, IgA, rzadziej w IgD i IgE.
Rutynowo oznacza się RF w klasie IgM, gdyż obecność RF w innych klasach niż IgM traktowana jest jako pomocnicza [1, 24].
Czynnik reumatoidalny jest głównym serologicznym markerem
reumatoidalnego zapalenia stawów RZS, na podstawie którego
wyróżnia się postać choroby seropozytywną (obecny czynnik
RF IgM) lub seronegatywną (brak czynnika RF IgM). Czynnik RF
odgrywa główną rolę w patogenezie tej choroby. Oprócz stymulacji układu immunologicznego i tworzenia kompleksów immunologicznych bierze udział w aktywacji dopełniacza, nasilając
procesy zapalne, prowadząc w ten sposób do niszczenia chrząstki
i destrukcji stawu, a także rozwoju pozastawowej postaci RZS. RF
Diagn Lab 2015; 51(3): 235-250
w klasie IgM oznacza się za pomocą odczynu Waalera-Rose, odczynu lateksowego, przy użyciu metody nefelometrycznej lub immunoenzymatycznej. Czynnik RF wykrywa się w surowicy, płynie
stawowym, a także w płynach wysiękowych. Zwiększone miano
RF koreluje z nasileniem zmian chorobowych i służy do oceny
skuteczności farmakoterapii. RF ma znaczenie prognostyczne
obok przeciwciał przeciwko CCP. Razem w testach serologicznych,
RF z anty-CCP i wskaźnikami ostrej fazy tj. OB, CRP, jest jednym
z kryteriów klasyfikacyjnych dla RZS [29]. Występuje u 60-80%
chorych na RZS, jego specyficzność wynosi 62% [1, 7]. Czynnik RF
nie jest markerem swoistym, ponieważ może występować w innych chorobach tkanki łącznej. Jego obecność można stwierdzić
także w zespole Sjögrena, toczniu rumieniowatym układowym,
mieszanej chorobie tkanki łącznej, zapaleniu wielomięśniowym,
twardzinie układowej i w młodzieńczym idiopatycznym zapaleniu
stawów. Ponadto, jego obecność stwierdza się również u 3-5%
osób zdrowych, szczególnie po 60 r. ż. [1], wzrasta z wiekiem.
I tak pomiędzy 20 a 60 rokiem życia jest on obecny u 2-4% osób,
między 60 a 70 rokiem życia u 5%, natomiast u osób powyżej 70
roku życia u 10-25% populacji [7].
Nie stwierdza się natomiast jego obecności w chorobie Stilla, dnawym zapaleniu stawów, enteropatiach, gorączce reumatycznej,
łuszczycowym zapaleniu stawów, zespole Reitera, zesztywniającym zapaleniu stawów kręgosłupa, chorobie zwyrodnieniowej
stawów i w ropnym zapaleniu stawów [1,28].
II. Krążące kompleksy immunologiczne (CIC; circulating immune
complexses) są agregatami białkowymi powstającymi w skutek
wiązania przeciwciał do antygenów. Nie są specyficzne dla konkretnej choroby, a ich udział chorobach autoimmunologicznych
został potwierdzony w TRU, RZS, zespole Sjögrena, MCTD, a także w kłębuszkowym zapaleniu nerek. CIC wykrywa się u 80%
chorych na RZS i 54% chorych na TRU, a ich obecność świadczy
o wysokiej aktywności choroby. Ich podwyższone stężenie pojawia się w infekcjach bakteryjnych, wirusowych i pasożytniczych,
alergiach, nowotworach, przewlekłych chorobach skóry i wątroby.
Oznaczanie ich poziomu może służyć do monitorowania terapii,
przebiegu, aktywności choroby i rokowań, a stały wzrost CIC wskazuje na przewlekłą, aktywną postać choroby. Metodą oznaczenia
pierwszego wyboru jest test ELISA. Można je oznaczać nefelometrycznie, turbidymetrycznie [15].
III. Przeciwciała przeciw cytrulinowanym białkom (ACPAs; anti-citrullinated protein antibodies) należą do grupy autoprzeciwciał
reagujących z determinantami antygenowymi, zawierającymi cytrulinę powstałą w wyniku potranslacyjnej modyfikacji reszt argininy, katalizowanej przez enzym deiminazę peptydyloargininową
[30]. Cytrulina jest niestandardowym aminokwasem, występującym
w takich białkach jak filagryna, wimentyna, mielina. Przeciwciała
ACPAs mają znaczenie prognostyczne w RZS, a także predykcyjne
dla agresywnej, nadżerkowej postaci tej choroby [31, 32].
Przeciwciała przeciw czynnikowi okołojądrowemu (APF; anti-perinuclear factor) opisane zostały po raz pierwszy w 1964 r.
APF były pierwszymi spośród nowej grupy przeciwciał skierowa-
nych przeciw białkom cytrulinowanym. Głównym antygenem dla
APF jest białko o ciężarze cząsteczkowym 200-400 kDa związane
z ludzką naskórkową profilagryną. Przeciwciała APF w większości występują u 49-91% chorych na RZS, głównie w klasie IgG,
rzadziej w IgA i IgM. Ich miano koreluje ze stopniem zaawansowania choroby, a ich obecność może nawet poprzedzać objawy
kliniczne RZS [26]. Oznaczanie APF cechuje wysoka specyficzność
(73-99%), a mimo to, nie znalazły zastosowania w rutynowej diagnostyce zapaleń stawów, ze względu na trudności z uzyskaniem
odpowiedniego substratu dla oznaczania i brakiem standaryzacji
wyników [1].
Przeciwciała przeciwkeratynowe (AKA; antikeratin antibodies)
zostały wykryte w 1979 r. w metodzie immunofluorescencji IIF,
na podstawie świecenia zewnętrznej warstwy rogowej nabłonka
przełyku szczurzego. Później okazało się, że antygenem dla AKA
nie jest keratyna, lecz antygeny należące do grupy niekeratynowych białek późnego różnicowania, o ciężarze cząsteczkowym
60-130, 90-120 i 210 kDa, w tym również białka związane z ludzką
naskórkową filagryną [1].Przeciwciała AKA występują u 36-59%
chorych na RZS, a także u 25-30% chorych na seronegatywną
postać RZS. Ich obecność może poprzedzać objawy kliniczne RZS
i nie zależy od czasu trwania choroby. Wykazano, że miana AKA
korelują z innymi przeciwciałami w tym z czynnikiem RF, a ponadto z aktywnością i ciężkością choroby. Podstawową metodą
oznaczania AKA jest nadal metoda IIF z wykorzystaniem skrawków przełyku szczurzego. Przeciwciała AKA można też oznaczać
techniką ‚Colorzyme’ [1, 7, 15].
Przeciwciała przeciw filagrynie (AFA; anti-filaggrin antibodies)
reagują z filagryną, związaną z filamentami pośrednimi, uczestniczącymi w agregacji filamentów cytokeratynowych w procesie
rogowacenia naskórka. Filagryna odkryta w latach osiemdziesiątych ubiegłego stulecia, składa się z dwóch izoform o ciężarze
cząsteczkowym 37 i 40 kDa. Syntetyzowana jest z białka prekursorowego, jakim jest profilagryna, magazynowanego w ziarnistościach keratohialiny. Przeciwciała AFA stwierdza się u 41% chorych na RZS. Ponadto obecność AFA wykrywa się we wczesnym
RZS. Przeciwciała AFA wykazują wysoką specyficzność (>90%)
dla RZS [26]. Stąd też oznaczanie przeciwciał przeciw filagrynie
z zastosowaniem metod immunoblotingu lub ELISA z użyciem
rekombinowanej filagryny, może zwiększyć czułość tych metod do
52%, a ty samym być przydatnym narzędziem w diagnozowaniu
reumatoidalnego zapalenia stawów [1].
Przeciwciała przeciw cyklicznemu cytrulinowanemu peptydowi
(anty-CCP; anti-cyclic cytrullinated peptide) najczęściej należą do
IgG i są produkowane miejscowo w reumatoidalnie zmienionej
błonie maziowej stawu. Przeciwciała te zostały włączone do najnowszych kryteriów klasyfikacyjnych RZS według ACR/EULAR
z 2010 roku [33]. Cechuje je wysoka czułość, specyficzność dla
RZS i wyższa wartość diagnostyczna we wczesnym i niezróżnicowanym zapaleniu stawów [1, 33]. Mają zastosowanie dla rozpoznania RZS we wczesnym stadium choroby, a ich miano wyjściowe w czasie rozpoznania, może być czynnikiem predykcyjnym
241
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
późniejszego rozwoju choroby, jej agresywnej postaci i ciężkości
zmian radiologicznych [34-36]. W grupie chorych na reumatoidalne zapalenie stawów, anty-CCP z pośród grupy przeciwciał ACPAs,
są niezależnym, niekorzystnym czynnikiem rokowniczym [13]. Ich
czułość i specyficzność wynosi odpowiednio 75-82% i 98% [1].
Przeciwciała anty-CCP obserwuje się u 70% chorych z serologicznie dodatnią postacią RZS i u 33% z seronegatywną [7]. Przeciwciała anty-CCP mogą być także używane jako marker w diagnostyce
różnicowej, np. w różnicowaniu zapalenia wątroby związanego
z artropatią z RZS [37]. Praktycznie nie wykrywa się przeciwciał
anty-CCP u osób zdrowych (0-1%) i tylko w kilku procentach występują w innych chorobach reumatycznych, najczęściej w zespołach nakładania RZS z innymi chorobami układowymi tkanki
łącznej [18].
Jako metodę oznaczania przeciwciał anty-CCP stosuje się testy
ELISA drugiej (CCP2) bądź trzeciej generacji (CCP3) z użyciem
wysoko oczyszczonych, syntetycznych, zmodyfikowanych cytrulinowanych peptydów, jako źródło antygenu, co pozwoliło na
uzyskanie czułości w zakresie 75-82% i specyficzności 98% [1, 24,
38]. Badania przeprowadzone przez Demoruelle i wsp. wykazały,
iż u pacjentów z pełnoobjawowym RZS, CCP2 były bardziej specyficzne, podczas gdy u pacjentów z niezróżnicowanym zapaleniem
stawów, CCP3 miały większą wartość predykcyjną dla rozwinięcia
się RZS [39].
Przeciwciała przeciw zmutowanej, cytrulinowanej wimentynie, anty-Sa (anty-MCV; anti-mutated citrullinated vimentin
antibodies, anti-Sa) reagują z antygenem Sa, odkrytym w 1994
r. Antygen ten, o ciężarze cząsteczkowym 48-50 kDa, jest prawdopodobnie cytrulinową formą przejściową filamentów białka
wimentyny [1, 26]. Przeciwciała anty-MCV są wysoce swoistymi i czułymi markerami RZS. Ich specyficzność dla RZS wynosi
około 98% [26]. Miano przeciwciał jest wprost proporcjonalne
do następujących u pacjenta zmian klinicznych. Dzięki temu,
oznaczanie przeciwciał anty-MCV, staje się dobrym narzędziem
do monitorowania przebiegu terapii [1]. Przeciwciała anty-MCV
oznaczane są metodą ELISA z zastosowaniem rekombinowanej,
zmutowanej cytrulinowanej wimentyny, co może zwiększyć czułość tej metody [1, 26].
IV. Przeciwciała przeciw karbamylowanym białkom (anty-carP;
Anti Carbamylated Protein Antibodies) są skierowane przeciwko posttranslacyjnie zmodyfikowanym w wyniku karbamylacji białkom.
Wykryto je u około 45% pacjentów chorych na RZS, a także, co
ważne, u 30% pacjentów z RZS, u których nie wykryto przeciwciał
przeciw cytrulinowanym białkom (ACPA) [40, 41].
Karbamylacja jest nieenzymatyczną modyfikacją chemiczną,
w wyniku której cyjanian wiąże się z cząsteczkami zawierającym grupy aminowe lub tiolowe i tworzy grupy karbamylowe.
Cyjanian występuje naturalnie w organizmie i pozostaje w równowadze z mocznikiem. Wzmożoną reakcję karbamylacji po raz
pierwszy zaobserwowano u pacjentów z podwyższonym stężeniem mocznika, tj. pacjentów z chorobami nerek, a następnie
w przebiegu chorób układu sercowo-naczyniowego. Nasilenie
reakcji karbamylacji stwierdzono także w zaburzeniach tolerancji
242
immunologicznej [42]. Nieznany jest bezpośredni udział przeciwciał anty-carP w patogenezie reumatoidalnego zapalenia stawów,
lecz wykazano, iż u pacjentów ACPA-ujemnych, występowanie
przeciwciał anty-carP jest związane z bardziej zaawansowaną
progresją zmian radiologicznych. Ponadto, przeciwciała anty-carP mogą pojawić się na wiele lat przed rozpoznaniem choroby i można w oparciu o ich stwierdzenie przewidzieć rozwój
choroby u pacjentów z bólem stawów, niezależnie od obecności
przeciwciał anty-CCP oraz RF w klasie IgM. Wykazano ponadto,
że obecność przeciwciał anty-carP u pacjentów z bólem stawów
wiąże się z podwyższonym ryzykiem zachorowania na RZS. Co
więcej, przeciwciała anty-carP mogą być czynnikiem predykcyjnym uszkodzenia stawów, a także przyszłego rozwoju RZS nie
tylko u chorych z bólem stawów, ale również u potencjalnie zdrowych osób. Pomimo, że czułość tych przeciwciał jest dość niska
(2-29%), cechują się one bardzo wysoką swoistością (95-100%).
Stąd też ich oznaczanie wydaje się mieć znaczenie w diagnostyce
niezróżnicowanych zapaleń stawów oraz u pacjentów seronegatywnych. Jednoczesna ocena przeciwciał anty-carP i ACPA może
okazać się pomocna w identyfikacji pacjentów z grupy ryzyka
i tych z wczesną postacią RZS [40-43].
V. Przeciwciała przeciw składowej dopełniacza C1q (ang. anti-complement component C1q antibodies) występują w wielu chorobach autoimmunizacyjnych – w tym pokrzywkowym zapaleniu
naczyń z hipokomplementemią (HUV; hypocomplementemic urticarial vasculitis), TRU, zespole Sjögrena, MCTD, a także w przebiegu
chorób infekcyjnych oraz u 4-18% zdrowej populacji [44, 45].
W przebiegu TRU podkreśla się ich wysoką negatywną wartość
predykcyjną (87-100%) w diagnozowaniu, ocenie aktywności
i przewidywaniu zaostrzeń nefropatii toczniowej [45]. Początkowo wykrywano je za pomocą metod radioimmunologicznych.
Obecnie w powszechnym użyciu są komercyjne testy ELISA [46].
VI. Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA; antinuclear antibodies) są
istotnym elementem rozpoznania i klasyfikacji układowych chorób tkanki łącznej [47]. Obejmują heterogenną grupę przeciwciał,
skierowanych przeciwko stałym i rozpuszczalnym antygenom
zlokalizowanym w obrębie komórki. ANA należą do przeciwciał
klasy głównie G immuglobulin.
Do przeciwciał przeciwjądrowych zalicza się przeciwciała przeciw
DNA, histonom, centromerom, nukleosomom, rybosomom, cyklinom i przeciwciała przeciw rozpuszczalnym antygenom jądra
komórkowego (ENA) [1, 48].
Do przeciwciał grupy ENA należą przeciwciała przeciw Sm, RNP,
SS-A/Ro, SS-B/La, Scl-70, Jo-1, Pm (Scl), Mi-1, Mi-2 [1, 7, 18].
Metoda IIF jest badaniem wstępnym obecności ANA, określanym
jako “złoty standard” diagnostyki serologicznej chorób autoimmunologicznych [1]. Metodą tą można określić zarówno miana ANA,
jak i typy fluorescencji w obrębie jądra i cytoplazmy (tabela II),
a tym samym powiązać z wystąpieniem określonej jednostki chorobowej (tabela III). Najczęściej stwierdzanym typem fluorescencji
jest plamiste świecenie jąder komórkowych [15]. Nie jest ono
swoiste dla żadnej z układowych chorób tkanki łącznej, wykazuje
jedynie obecność ANA. Ocenę swoistości dokonuje się z wyko-
Diagn Lab 2015; 51(3): 235-250
rzystaniem metody ELISA lub immunoblot. Obecnie dostępne są
zestawy komercyjne do szczegółowej oceny autoprzeciwciał, np.
ANA-profil. Ponadto wykorzystuje się gotowe profile, oceniające
swoistość ANA w poszczególnych chorobach reumatycznych,
w tym np. profil twardziny (sclerosis profil), obejmujący testowanie przeciwciał przeciw Scl-70, centromerom A, centromerom
B, RNA polimerazie 3, fibrylarynie, NOR-90, Th/To, PM-Scl-100,
PM-Scl-75, Ku, PDGFR, Ro-52 [49], czy też profil zapalenia mięśni
[50]. W przypadku stwierdzenia plamistego typu fluorescencji
lub gdy nie stwierdza się ANA, a objawy wskazują na układową
chorobę tkanki łącznej, należy przeprowadzić badanie w kierunku
obecności przeciwciał przeciw rozpuszczalnym antygenom jądra
komórkowego (ENA) z zastosowaniem metod ELISA, podwójnej
dyfuzji lub Western-blot [15].
Należy jednak podkreślić, że poza układowymi chorobami tkanki
łącznej, dla których występowanie przeciwciał przeciwjądrowych
jest cechą charakterystyczną, przeciwciała ANA można wykryć
również w innych chorobach autoimmunologicznych, takich, jak
pierwotna żółciowa marskość wątroby (przeciwciała SS-A/Ro), czy
autoimmunologiczne zapalenie wątroby / przeciwciała SS-A/Ro),
a także w okresie ciąży lub u członków rodzin chorych na choroby
reumatyczne. Przeciwciała ANA mogą występować również w niskich mianach u zdrowej populacji w 8%, zaś u dzieci w 15%. Ich
miana są wyższe u kobiet i wzrastają wraz z wiekiem [48]. ANA
w niskim mianie występują także u chorych na infekcję wirusową
lub bakteryjną, u osób z chorobami rozrostowymi układu krwiotwórczego [51-53].
W przypadku, gdy miano jest wyższe niż 1/160, należy rozważyć obecność układowej choroby tkanki łącznej, miano powyżej
1/5120 stwierdza się zwykle u pacjentów z mieszaną chorobą
tkanki łącznej [50]. Ponadto ciąża oraz leki np. immunoglobuliny,
inhibitory TNFα mogą indukować wytwarzanie przeciwciał ANA
[7, 54, 55].
Podkreśla się, iż stwierdzenie obecności przeciwciał ANA metodą
IIF ma większą wartość diagnostyczną dla wykluczenia układowych chorób tkanki łącznej, niż dla potwierdzenia takiego rozpoznania [18].
wemu denaturowanemu DNA (ssDNA – single structure DNA)
– reszty zasad purynowych i pirymidynowych [56].
Najistotniejszą rolę odgrywają przeciwciała anty-dsDNA, które
uważane są za swoisty marker tocznia rumieniowaty układowego, a w szczególności ciężkiej jego postaci, przebiegającej
z zajęciem nerek. Przeciwciała te występują u pacjentów chorych
na TRU z częstością 40-90%. Są więc jednym z najważniejszych
kryteriów diagnostycznych TRU, a ich miano koreluje z aktywnością procesu chorobowego i może służyć do monitorowania
skuteczności zastosowanego leczenia [1, 45]. Kompleksy anty-DNA-DNA mogą ulegać kumulacji w macierzy mezangium
nerek, prowadząc do kłębuszkowe zapalenie nerek w przebiegu
tocznia układowego. Przeciwciała anty-dsDNA mogą również
przyczynić się do schyłkowej postaci toczniowego zapalenia
nerek przez bezpośrednie wiązanie odsłoniętych fragmentów
chromatyny w błonie podstawnej kłębuszków nerkowych [45].
Oznaczanie przeciwciał dla ds-DNA powinno być uzupełnione
o badanie awidności przeciwciał. Stadium choroby i stopień
zajęcia narządów wewnętrznych koreluje z obecnością przeciwciał anty-dsDNA o wysokiej awidności. Niewątpliwą wartość diagnostyczną przeciwciał anty-dsDNA obniżają trudności
związane z utrzymaniem struktury drugorzędowej DNA podczas
konstruowania testów, jak również istotne różnice w czułości
stosowanych testów W ocenie przeciwciał anty-dsDNA znalazły zastosowanie metoda IIF z użyciem Crithidia luciliae, testy
radioimmunologiczne oraz ELISA [56].
Oznaczanie przeciwciał anty-ssDNA nie ma dużej wartości diagnostycznej. Przeciwciała te mogą występować oprócz TRU, także
w zespole Sjögrena, twardzinie układowej, MCTD, zapaleniu wielomięśniowym i skórnomięśniowym, czy też w RZS [18].
Przeciwciała przeciwhistonowe (ang. anti-histone antibodies)
reagują z kompleksem nuklesomu obecnym w chromatynie jądrowej. Skierowane są przeciwko pięciu białkom histonowym
H1, H2A, H2B, H3 i H4. Są ważnym i swoistym markerem w TRU
idukowanym lekami, takimi jak prokainamid, izoniazyd czy hydralazyna i występują w tym schorzeniu w prawie 100% przypadków.
Spotyka się je także w toczniu rumieniowatym układowym (30Przeciwciała przeciw DNA (ang. anti-DNA antibodies) obejmują
70%) oraz w RZS (15– 20%), w zespole Felty’ego, zespole Sjögrena,
dwie populacje przeciwciał, różniące się epitopem docelowym.
twardzinie układową, pierwotnej żółciowej marskości wątroby,
Dla przeciwciał przeciw dwuniciowemu natywnemu DNA (dsDNA
w chorobach zakaźnych (włącznie z infekcją wirusem HIV), a nawet
– double structure DNA) epitopem jest wyeksponowany w dsDNA
w zaburzeniach neurologicznych, włączając chorobę Alzheimera
szkielet fosforo-cukrowy, zaś dla przeciwciał przeciw jednonicio[2, 45]. Kompleksy białek histonowych z przeciwciałami przeciwko
tym białkom mogą odgrywać istotną
rolę w rozwoju toczniowego zapalenia
Tabela III. Występowanie przeciwciał ANA w wybranych chorobach reumatycznych [3].
nerek. W swoich badaniach Sui i wsp.
Autoprzeciwciała ważne diagnostycznie
Jednostka chorobowa
wykazali silny związek pomiędzy jedanty-dsDNA, anty-Sm, anty-SS-A/Ro, antyrybosomalne
TRU
noczesnym występowaniem przeciwanty-ssDNA, przeciwhistonowe
Polekowy TRU
ciał przeciw-DNA, przeciw nukleosoanty-U1-RNP
MCTD
mom i przeciw histonom, a stopniem
anty-SS-A/Ro, anty-SS-B/La
Zespół Sjögrena
zaawansowania zmian w nerkach,
anty-Scl-70, ACA, anty-U3-RNP
Twardzina układowa
zwłaszcza w proliferacyjnym kłębuszkowym zapaleniu nerek [57]. NajbarJo-1
Zapalenie wielomięśniowe
dziej wiarygodną metodą detekcji tych
Jo-1, Mi-2
Zapalenie skórno-mięśniowe
przeciwciał jest technika ELISA [45].
243
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
Przeciwciała antycentromerowe (ACA; anti-centromere protein
antibodies) są skierowane przeciwko licznym konstytutywnym
białkom centromerowym – CENPs (centromere proteins), takim
jak CENP-A, CENP-B, CENP-C, CENP-D, CENP-G i CENP-H oraz przeciwko grupie białek przejściowych, ujawniających się w określonym stadium cyklu podziałowego komórki: CENP-E i CENP-F [58].
Głównymi autoantygenami są białka: A, B, C, znacznie rzadziej
białka: D, E, H [58].
W metodzie immunofluorescencji pośredniej przeciwciała te dają
centromerowy typ fluorescencji, charakteryzujący się obecnością
małych, jednakowej wielkości ziarnistości, równomiernie rozłożonych w jądrze komórkowym. Przeciwciała antycentromerowe
występują u 20-30% chorych na twardzinę układową. Uważa się
je za swoiste dla twardziny układowej typu limited – występują
u 60 -80% chorych z tą postacią [59]. Rzadko są obecne u chorych
z postacią uogólnioną twardziny (2-5%). Przeciwciała przeciwko
centromerowemu białku A mogą wyprzedzać pojawienie się przeciwciał anty-CENP-B. Mogą one zatem stanowić użyteczne narzędzie do wczesnego wykrywania twardziny [60, 61]. Ich obecność
koreluje z obecnością objawu Raynaud i jest związana z lepszym
rokowaniem niż w przypadku wykrycia innych przeciwciał związanych z chorobą. W niskich mianach są obecne w RZS, toczniu,
czy zespole Sjögrena [1]. Obecność tych przeciwciał u pacjentów
z toczniem rumieniowatym układowym może być związana z zajęciem stawów i zespołem antyfosfolipidowym [1].
Przeciwciała przeciw nukleosomom (AnuA; anti-nucleosome antibodies) są wykrywane u 60% pacjentów z TRU i tylko w niewielkim
procencie w twardzinie układowej i zapaleniu wielomięśniowym
[1]. Są uważane za patognomoniczne dla TRU, wykazując swoistość wobec TRU bliską 85%, porównywalną z przeciwciałami dla
dsDNA [2]. Mogą stanowić najbardziej czuły marker do diagnozowania TRU, zwłaszcza u pacjentów, u których nie stwierdza się
obecności przeciwciał anty-ds-DNA. Stwierdzono ponadto silną
zależność pomiędzy stężeniem przeciwciał przeciw nukleosomom a ciężkością choroby. Omawiane przeciwciała pozwalają
także lepiej przewidzieć okresy zaostrzenia objawów klinicznych
w toczniu [45].
Przeciwciała antyrybosomalne (ang. anti-ribosomal antibodies)
do których zalicza się przeciwciała przeciw rybosomalnemu
białku P (ARPA; anti-ribosomal P protein antibodies) reagują z antygenami rybosomalnymi, tj. białkami P0, P1 i P2 podjednostki 60
S rybosomów [1]. Obecność przeciwciał przeciw rybosomalnemu
białku P u chorych na toczeń rumieniowaty układowy nie stanowi
pewnej wskazówki na zajęcie ośrodkowego układu nerwowego,
nerek, wątroby, czy obecność powikłań hematologicznych [62].
Nie ma zgodnych badań potwierdzających jednoznacznie jakoby
przeciwciała te miały wysoką specyficzność wobec neuropsychiatrycznej postaci tocznia [1, 63]. ARPA wydają się mieć potencjalne
znaczenie w patogenezie chorób autoimmunologicznych, gdyż
poprzez wiązanie się z powierzchnią limfocytów T, monocytów
czy komórek śródbłonka, mogą oddziaływać na komórki. Ponadto
przeciwciała te mogą wnikać do wnętrza żywych komórek, prowadząc do ich dysfunkcji na drodze hamowania syntezy białek,
244
indukcji wytwarzania cytokin prozapalnych i nasilania procesu
apoptozy [45]. Wykazano ponadto, iż ARPA mogą wykazywać
reaktywność krzyżową z kardiolipiną, ssDNA, dsDNA i nukleosomami, co może być przyczyną przeszacowania ilości tych przeciwciał u osób z TRU, posiadających inne autoprzeciwciała często
stwierdzane w przebiegu choroby [45].
Przeciwciała przeciw Sm (ang. anti-Smith antibodies). Antygen
Sm składa się z co najmniej 4 białek: B (28 kDa), B1(29 kDa), D (19
kDa), i E (13 kDa). Przeciwciała przeciw-Sm są wysoce specyficznym markerem TRU. Obok przeciwciał anty-dsDNA są zaliczane
do przeciwciał patognomonicznych dla tej choroby, mimo że
występują tylko u 15-30% pacjentów. Obok anty-dsDNA, mają najwyższą swoistość dla rozpoznania tocznia [2]. Nie potwierdzono
związku przeciwciał z objawami klinicznymi choroby. Wykazano
co prawda, iż miano anty-Sm zmienia się w zależności od aktywności choroby i podjętego leczenia, ale nie jest jasne, czy ocena
dynamiki zmian tych przeciwciał może określić ryzyko zaostrzenia
objawów klinicznych [45].
Przeciwciała przeciw rybonukleoproteinie RNP (ang. anti-ribonucleoprotein antibodies) Antygen RNP należy do grupy małocząsteczkowych rybonukleoprotein (snRNP; small nuclear ribonecleoprotein), zawierających niskocząsteczkowy RNA o dużej
zawartości urydyny (U-RNA) oraz różne białka rdzenia o ciężarze
cząsteczkowym 70kDa (U1), 33kDa (białko A) i 22 kDa (białko
C). Komponenty RNA oznaczone są jako U1 do U6. Przeciwciało
RNP jest niejednorodne skierowane przeciw różnym epitopom,
z których najważniejszy ma masę cząsteczkową 70 kDa [1, 45].
Przeciwciała anty U1-snRNP w wysokich mianach występują
w mieszanej chorobie tkanki łącznej (MCTD) u 95-100% pacjentów. We wszystkich kryteriach diagnostycznych MCTD wymagana
jest obecność w surowicy przeciwciał anty-U1 RNP. Przeciwciała
te stwierdzane u wszystkich chorych często w wysokich mianach, nie zawsze są obecne od początku choroby, miana ich mogą
ulegać wahaniom, utrzymują się w okresie aktywności choroby, a często i w okresach klinicznej remisji, ale też w okresach
poprawy mogą występować w niższych mianach, bądź znikać
całkowicie. Mogą być także obecne u 30-40% chorych na TRU,
oraz pacjentów z RZS i zespołem Sjögrena [1, 45]. Miano ich nie
koreluje jednak z aktywnością choroby [45]. Przeciwciała przeciw
jądrowej rybonukleoproteinie (nRNP; nuclear ribonucleoprotein)
wykrywane metodą pośredniej immunofluorescencji (substraty
antygenowe-tkankowe i komórki HEp 2) dają plamisty (ziarnisty)
typ świecenia. Do precyzyjniejszej identyfikacji poszczególnych
autoprzeciwciał stosuje się metodę immunoenzymatyczną (ELISA) oraz technikę Western-blotting, która pozwala na uzyskanie
dodatkowych danych jak ciężar cząsteczkowy antygenów i skład
subfrakcji poszczególnych antygenów [1, 12, 45].
Przeciwciała przeciw SS-A/Ro (ang. anti-Rose antibodies) są skierowane przeciwko kompleksowi małocząsteczkowego RNA (micro-RNA) i białek o ciężarze cząsteczkowym 45, 52, 54 i 60 kDa.
W rutynowej diagnostyce chorób autoimmunologicznych zastosowanie znalazły przeciwciała przeciwko SS-A(Ro52)/TRIM21
Diagn Lab 2015; 51(3): 235-250
i SS-A(Ro60) [45, 64]. Są to jedne z najczęściej wykrywanych
autoprzeciwciał i występują w wielu chorobach reumatycznych
m.in. TRU, toczniu skórnym, zespole Sjögrena, twardzinie układowej, zapaleniach mięśni, wrodzonym bloku serca oraz autoimmunologicznych chorobach wątroby jak pierwotna żółciowa
marskość wątroby i autoimmunologiczne zapalenie wątroby.
Ich znaczenie diagnostyczne polega głównie na współistnieniu
tych przeciwciał z innymi bardziej swoistymi chorobowo przeciwciałami [64, 65].
Najbardziej czułą i specyficzną techniką ich detekcji jest metoda
ELISA. Można je wykryć także metodą IIF, wykorzystując jako substrat ludzkie komórki nowotworowe transfekowane antygenem
SSA /Ro.
Sugerowano istnienie ścisłej korelacji pomiędzy przeciwciałami
przeciw SSA/Ro i toczniem rumieniowatym układowym o późnym
początku (średnia wieku 50 lat). Obecność omawianych przeciwciał korelowała także z nadwrażliwością na promieniowanie UV,
zapaleniem naczyń skórnych i zaburzeniami hematologicznymi,
wliczając niedokrwistość, leukopenię i trombocytopenię [65].
Przeciwciała przeciw SS-A/Ro przenikając przez łożysko mogą
spowodować rozwój tocznia noworodkowego lub wrodzony blok
serca u noworodka. W przypadku tocznia noworodkowego ich
obecność stwierdza się niemal w 100% przypadków [1, 2, 7, 45].
Przeciwciała przeciw SSA/Ro60 są częściej wykrywane u osób
z TRU oraz toczniem skórnym. Obecność obydwu rodzajów przeciwciał tj. przeciw SSA/Ro60 jak i przeciw SSA/Ro52/TRIM21 jest
częstsza w podostrej postaci tocznia rumieniowatego układowego
(SCLE – subacute cutaneus lupus erythematosus), zaś izolowana
obecność przeciwciał przeciw podjednostce Ro52/TRIM21 jest silniej związana z całkowitym blokiem przedsionkowo-komorowym
w przebiegu tocznia noworodkowego [1, 2, 7, 45].
Przeciwciała przeciw SS-B/La (ang. anti-Lane antibodies) są skierowane przeciwko fosfoproteinie o ciężarze cząsteczkowym 48
kDa (La), wspomagającą RNA-polimerazę 3 [7]. Występują niemal
wyłącznie u kobiet z zespołem Sjögrena (80%), a także chorych
na TRU (10-20%) [1]. W zespole Sjögrena przeciwciała przeciw
SS-B/La występują prawie zawsze łącznie z przeciwciałami przeciw
SS-A/Ro [45]. Obecność omawianych przeciwciał we krwi matki
jest silnie związana z rozwojem tocznia noworodkowego i bloku
przedsionkowo-komorowego [66].
Przeciwciała przeciw topoizomerazie I (Scl-70) reagują swoiście
z katalitycznym, karboksylowym regionem DNA topoizomerazy
I, enzymu uczestniczącego w replikacji DNA [7]. Scl-70 wspólnie
z przeciwciałami przeciw centromerom znalazły zastosowanie
w diagnostyce różnicowej twardziny układowej i miejscowej.
Chorzy z obecnością przeciwciał anty-Scl70 zazwyczaj rozwijają
postać uogólnioną twardziny i wiąże się to z gorszym rokowaniem [1, 67]. Uważa się, że przeciwciała te są odpowiedzialne
za uogólnione stwardnienie skóry, zmiany włókniste w tkance
płucnej oraz zajęcie mięśnia sercowego w przebiegu choroby [7].
W niektórych badaniach wykazano również ich związek z występowaniem przełomów nerkowych [68]. Około 40% chorych na
twardzinę układową uogólnioną nie posiada jednak przeciwciał
Scl-70. Należy także pamiętać, iż zarówno przeciwciała przeciw
Scl-70 jak i przeciw centromerom występują także u chorych na
inne układowe choroby tkanki łącznej [69].
Przeciwciała przeciw Jo-1 – antygenem dla tych przeciwciał jest
syntetaza histydylo-tRNA. Są swoistym markerem zapalenia wielomięśniowego i skórno-mięśniowego u 25-35% chorych [1]. Ich
obecność koreluje ze zmianami śródmiąższowymi płuc, objawem
Raynauda oraz zapaleniem stawów w przebiegu choroby [7].
Przeciwciała przeciw Pm (Scl) są skierowane przeciwko kompleksom polipeptydowym o ciężarze cząsteczkowym 20-110 kDa
zlokalizowanym w jąderku. Docelowym antygenem jest jednak
białko jąderkowe o ciężarze cząsteczkowym 100 kDa. Przeciwciała
przeciw Pm (Scl) są swoiste dla zespołu nakładania, zapalenia
wielomięśniowego i skórno-mięśniowego [1], mogą także występować u chorych na twardzinę układową.
Przeciwciała przeciw Mi-2. Antygenem dla tych przeciwciał jest
kompleks pięciu białek o ciężarze cząsteczkowym 30-220 kDa.
Przeciwciała przeciw Mi-2 są charakterystyczne dla zapalenia skórno-mięśniowego [7, 15]. Częstość ich występowania dla zapalenia
skórno-mięśniowego wynosi 15-20% [7].
VII. Przeciwciała antyfosfolipidowe (APLA; antiphosholipid antibodies) są heterogenną grupą przeciwciał klasy IgM, IgG, IgA skierowanych przeciwko fosfolipidom, głównym składnikom błon komórkowych, odgrywającym istotną rolę w procesach krzepnięcia
krwi [1, 4]. Przeciwciała te reagują z różnymi antygenami, do których zalicza się fosfatydyloserynę, fosfatydylocholinę, kardiolipinę,
czy kofaktory reakcji antygen-przeciwciało, jak β2-glikoproteina
1, protrombina, białko C i białko S, czynnik krzepnięcia XI, czy też
aneksyna V [15].
Do przeciwciał antyfosfolipidowych, które mają istotną wartość
diagnostyczną zaliczane są przeciwciała antykardiolipinowe
(aCL; anti-cardiolipin antibodies), antykoagulant toczniowy (LA;
lupus anticoagulant) i przeciwciała przeciwko β2 -glikoproteinie
1 (anty-β2 GP1; anti-β2 glycoprotein I antibodies) [1, 70].
Dla oznaczania przeciwciał APA znalazły zastosowanie dwie podstawowe metody: koagulometryczna (związana z oznaczaniem
APTT – czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji, czasu
krzepnięcia osocza po dodaniu jadu węża Russela oraz czasu protrombinowego) – dla wykrywania antykoagulanta toczniowego
i immunoenzymatyczna ELISA – dla wykrycia przeciwciał aCL, czy
też przeciwciał przeciwko β2-glikoproteinie1.
Przeciwciała antyfosfolipidowe występują u około 8% osób zdrowych [7]. Stwierdzenie obecności przeciwciał antyfosfolipidowych jest jednym z laboratoryjnych kryteriów klasyfikacyjnych
pierwotnego lub wtórnego zespołu antyfosfolipidowego (APS;
antiphospholipid syndrome), występującego, jako odrębna jednostka chorobowa lub towarzyszącego innym chorobom, takim
jak TRU, RZS, czy też toczeń indukowany lekami [15].
Najważniejszą i najczęściej występującą kliniczną manifestacją
APS, włączoną do kryteriów diagnostycznych rozpoznania zespołu antyfosfolipidowego jest zakrzepica w obrębie naczyń tętni245
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
czych, żylnych albo włosowatych, w obrębie jakiejkolwiek tkanki
lub narządu, potwierdzona metodami diagnostyki obrazowej,
metodą Dopplera lub histopatologicznie. Zmiany zakrzepowe
zazwyczaj przyjmują postać zakrzepicy żylnej kończyn dolnych
i często współistnieją z zatorowością płucną. Niepowodzenia położnicze, stanowią – poza zakrzepicą naczyń, drugą grupę klinicznych kryteriów klasyfikacyjnych APS. Najczęstszymi powikłaniami
ciąż u pacjentek z APS są: obumarcie płodu, poród przedwczesny
w związku ze stanem przedrzucawkowym, rzucawką lub ciężką niewydolnością łożyska oraz nawracające poronienia samoistne [71].
Do rozpoznania APS upoważnia spełnienie jednego z wyżej wymienionych kryteriów klinicznych (zakrzepicy naczyń lub powikłań położniczych) oraz stwierdzenie, co najmniej dwukrotne
w odstępie 12 tygodni, obecności przeciwciał antyfosfolipidowych: antykoagulantu tocznia lub przeciwciał antykardiolipinowych lub przeciwciał przeciw β2-GPI.
Konieczność potwierdzenia obecności APLA w odstępie minimum
12 tygodni wynika z faktu, że w przebiegu infekcji wirusowych,
bakteryjnych i pasożytniczych mogą się pojawić przeciwciała
o właściwościach APLA, które zanikają po kilku tygodniach i najczęściej nie dają żadnych objawów klinicznych [15, 71, 72].
Wykazano, że obecność wszystkich trzech przeciwciał antyfosfolipidowych (aCL, anty-β2-GPI, LA) silniej wiąże się z nawracającymi
późnymi (>10 tygodnia ciąży) utratami płodu i epizodami zakrzepicy niż obecność dwóch lub jednego przeciwciała, pozwalając na
identyfikację pacjentek z wysokim ryzykiem nawrotu poronienia.
Obecność LA silnie koreluje z późnymi poronieniami, natomiast
obecność aCL wiąże się zarówno z wczesnymi, jak i późnymi poronieniami nawracającymi. Wzrost miana tych przeciwciał w czasie
ciąży jest złym czynnikiem rokowniczym [45, 72].
Przeciwciała antykardiolipinowe (aCL; anti-cardiolipin antibodies)
Oznaczanie przeciwciała aCL jest najczęściej wykonywanym
oznaczeniem w diagnostyce zespołu antyfosfolipidowego. Należy jednak pamiętać, że wykluczenie APS wymaga wykonania
oznaczeń LA i przeciwciał przeciw β2-glikoproteinie I. Duże ryzyko
powikłań APS związane jest z występowaniem przeciwciał antykardiolipinowych w średnich lub wysokich mianach [72]. Proces
wiązania przeciwciał z antygenem wymaga obecności kofaktora
– β2-glikoproteiny I (β2GPI), która jest białkiem o masie cząsteczkowej 50kDa, należącym do β2 globulin osocza, odgrywającym
istotną rolę w procesach krzepnięcia krwi.
Przeciwciała aCL występują od 0,2-10% pacjentów z zakrzepicą
tętniczą. W niskim mianie obecne są u 2 do 7% zdrowych dawców
krwi, a w wysokim mianie u 0,2% zdrowej populacji, przy czym
odsetek ten wzrasta wraz z wiekiem badanych [7]. Przeciwciała
antykardiolipinowe mogą także być obecne w chorobach reumatycznych, jak: TRU, RZS, twardzina układowa, zespół Sjögrena.
Wykazano, że wysokie miano przeciwciał antykardiolipinowych
w klasie IgG lub IgG2, jest złym czynnikiem prognostycznym
[7, 45].
Antykoagulant toczniowy LA (LA; lupus anticoagulant)
Antykoagulant toczniowy (LA) stanowi heterogenną grupę
przeciwciał skierowanych przeciw fosfolipidom, uczestniczącym
246
w procesie krzepnięcia krwi. Ich obecność wydłuża czasy krzepnięcia osocza zależne od fosfolipidów, w tym: APTT (ang. Activated
Partial Thromboplastin Time) – czas częściowej tromboplastyny po
aktywacji, czas krzepnięcia osocza po dodaniu jadu węża Russella
(dRVVT; dilute Russell viper venom time) lub czas protrombinowy.
Wydłużenie jednego z wymienionych wyżej czasów krzepnięcia
zalecanych przez Międzynarodowe Towarzystwo Zakrzepicy i Hemostazy, oznaczonych dwukrotnie w odstępie nie krótszym niż 12
tygodni, wystarczy do stwierdzenia LA [72, 73]. Należy pamiętać,
że dla diagnostyki antykoagulantu toczniowego bardzo ważna
jest faza przedlaboratoryjna, w tym właściwe pobieranie materiału
oraz wirowanie próbki.
Wielu badaczy uważa, że LA jest bardziej specyficznym, ale mniej
czułym wykładnikiem zmian zakrzepowych w porównaniu do
przeciwciał antykardiolipinowych. W ogólnej populacji antykoagulant toczniowy występuje u około 1% osób zdrowych [5, 73].
Przeciwciała przeciw β2-glikoproteinie I w klasie IgG i IgM (anty
β2-GPI; anti-β2 glycoprotein I antibodies)
β2-glikoproteina I jest właściwym epitopem dla przeciwciał antyfosfolipidowo-białkowych. Uważa się, że test ten jest bardziej
specyficzny, ale mniej czuły w odniesieniu do obecności objawów
APS od testu na obecność przeciwciał aCL, natomiast ich korelacja z objawami choroby jest bardzo podobna. Wydaje się, że
najważniejszym wskazaniem do oznaczenia tych przeciwciał jest
mocne podejrzenie APS przy ujemnych wynikach przeciwciał aCL
w klasach IgG i IgM oraz antykoagulantu toczniowego. U 3-10%
chorych z APS są one jedynym dodatnim testem wykrywającym
APLA. Wykazano ponadto, że istnieje korelacja pomiędzy obecnością przeciwciał anty β2-GPI, a pierwszym zachorowaniem na
zakrzepicę żył głębokich. Obecność omawianych przeciwciał jest
także niezależnie związana z podwyższonym ryzykiem utraty
kolejnej ciąży, a wzrost ich miana w przebiegu ciąży jest złym
czynnikiem rokowniczym [45, 72, 73]
Inne przeciwciała antyfosfolipidowe
Rzadziej przeciwciała APLA mogą być skierowane przeciw innym
antygenom, takim jak protrombina, kompleks fosfatydyloseryny
z protrombiną, heparyna, aktywne białko C, białko S, czynnik XI,
czynnik V, kompleks czynnika VII z czynnikiem VIIa, tkankowy
aktywator plazminogenu (t-PA), aneksyna II (A2) lub aneksyna
V (A5) [72, 73].
Sądzi się, iż protrombina jest drugim, obok β2-glikoproteiny 1,
kofaktorem przeciwciał antyfosfolipidowych. Przeciwciała przeciw
protrombinie w klasie IgG i IgM są w niektórych przypadkach
związane z występowaniem LA, chociaż korelacja tych przeciwciał
z objawami klinicznymi zespołu antyfosfolipidowego jest słabsza.
W praktyce klinicznej oznaczać można także przeciwciała przeciw
fosfatydyloserynie w klasie IgG i IgM oraz przeciw fosfatydyloinozytolowi w klasie IgG i lgM, często współistniejące z obecnością innych przeciwciał antyfosfolipidowych. Do testów, których
przydatność diagnostyczna jest w trakcie badań, należą między
innymi test oporności na aneksynę V (A5R), oznaczanie przeciwciał przeciw domenie I B2-GPI, przeciwciał przeciw protrombinie
i przeciwciał przeciw fosfatydyloserynie [72,73].
Diagn Lab 2015; 51(3): 235-250
VIII. Przeciwciała przeciwko cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych (ANCA; antineutrophil cytoplasmic antibodies)
ANCA w metodzie immunofluorescencji pośredniej, dają dwa
typy fluorescencji, klasyczny cytoplazmatyczny (cANCA – cytoplasmic), charakterystyczny dla przeciwciał przeciwko proteinazie
3 (PR-3) i okołojądrowy (pANCA – perinuklear), który wykazują
przeciwciała przeciwko mieloperoksydazie (MPO), katepsynie G
(KT), elastazie (EL), lizozymowi (LIZ), azurocydynie (AZ), enolazie
(EN), aktynie (AK) [74].
Metoda IIF jest badaniem wstępnym, w którym w zależności od
lokalizacji antygenu różnicowany jest typ przeciwciał (c-ANCA lub
p-ANCA). Typ cytoplazmatyczny, charakteryzuje się gruboziarnistym „świeceniem” całej cytoplazmy komórki ze szczególnym
nasileniem w obszarze między płatami jądra. P-ANCA wywołują
z kolei intensywne „świecenie” wokoło jądra komórkowego. Jako
standardowy substrat, służący do identyfikacji ANCA stosowane
są ludzkie granulocyty. Antygenami reagującymi z surowicą pacjenta są mieloperoksydaza, elastaza, laktoferyna, lizozym lub
katepsyna G dyfundujące do błony jądrowej granulocytów [74].
Dla określenia swoistości antygenowej przeciwciał ANCA służą
testy immunoezymatyczne ELISA [7]. Najczęściej w testach tych
oznacza się przeciwciała przeciw mieloperoksydazie cytoplazmy granulocytów (MPO-ANCA), przeciw proteinazie 3
cytoplazmy granulocytów (PR3-ANCA), jak również profil ANCA
o różnej swoistości (MPO, PR3, laktoferyna, katepsyna, elastaza)
[7, 74].
Istotna rola przeciwciał przeciwko cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych w patogenezie grupy zapaleń naczyń, obejmujących głównie małe naczynia, stała się ważnym argumentem za
wprowadzeniem nowego nazewnictwa i podziału zapaleń naczyń,
uzgodnionego podczas Międzynarodowej Konferencji w Chapel
Hill w 2012 roku. Wprowadzono nowe kategorie zapaleń naczyń,
w tym zapalenia związane z ANCA (AAV – ANCA-asssociated vasculitis), do których należą mikroskopowe zapalenie naczyń (MPA;
microscopic polyangiitis), ziarniniakowatość z zapaleniem naczyń
(GPA; granulomatosis with polyangiitis, dawniej ziarniniakowatość
Wegenera) oraz eozynofilowa ziarniniakowatość z zapaleniem naczyń (EGPA; eosinophilic granulomatosis with polyangiitis, dawniej
zespół Churga i Strauss) [8].
Obecność przeciwciał przeciwgranulocytowych skierowanych
przeciwko proteinazie 3 (PR3-ANCA) częściej stwierdza się u chorych z GPA, w przeciwieństwie do przeciwciał przeciwko mieloperoksydazie (MPO-ANCA), które są głównie związane z występowaniem zapaleń małych naczyń, sklasyfikowanych jako MPA
i EGPA [75].
Badania ostatnich lat podkreślają silny związek PR3-ANCA z konkretnymi polimorfizmami w locus dla HLA-DP oraz w genie kodującym α1-antytrypsynę (SERPINA1), która jest inhibitorem
proteinazy 3. Z kolei MPO-ANCA są silniej związane z HLD-DQ
[76]. Pojawiła się też propozycja wprowadzenia nowej klasyfikacji zapaleń naczyń związanych z ANCA, uwzględniającej zajęcie
odpowiednio: przewodu pokarmowego lub układu sercowo-naczyniowego, bądź nerek, a w tym ostatnim przypadku – obecność
przeciwciał PR3-ANCA [76, 77, 78].
IX. Przeciwciała przeciw mitochondrium (AMA; anti-mitochondrial antibodies) mogą być wykrywane w wielu chorobach, najczęściej wraz z innymi autoprzeciwciałami. Wartość diagnostyczną dla
chorób autoimmunologicznych posiadają AMA, tj. od M1 do M9,
a szczególnie znacząca jest dla pierwotnej żółciowej marskości wątroby [2, 15]. Przeciwciała przeciwko mitochodriom (AMA) mogą
być wykrywane przy użyciu różnych histologicznych substratów
oraz komórek HEp-2. Jako standardowe substraty do identyfikacji
tych przeciwciał stosowane są mrożone skrawki nerki szczura
bądź myszy. Cytoplazma kanalików proksymalnych i dystalnych
wykazuje ziarnistą fluorescencję wzmożoną u podstawy. Wzór
fluorescencji odpowiada obrazowi uzyskanemu dla pozytywnej
surowicy kontrolnej. Metodą immunofluorescencji pośredniej
z zastosowaniem substratów tkankowych można dokładnie określić miano AMA [2, 4].
Przeciwciała AMA-M1 występują w 5-15% u chorych na TRU,
twardzinę układową, RZS, zespół Sjögrena.
Przeciwciała AMA-M2 występują u 96% chorych na pierwotną
żółciową marskości wątroby i są swoistym markerem tej choroby [2,4]. W niższych mianach mogą być wykrywane w innych
przewlekłych schorzeniach wątroby w 30% przypadków, a także
w postępującej twardzinie układowej w 7-25%. U pacjentów z TRU,
którzy wykazują te przeciwciała, może występować zespół nakładania z pierwotną żółciową marskością wątroby [2, 15].
X. Przeciwciała przeciw mięśniom gładkim (ASMA; anti-smooth muscles antibodies) występują w różnych chorobach wątroby
w tym autoimmunizacyjne zapalenie wątroby, czy też marskość
wątroby. W 70% przypadkach ich wysokie miano jest oznaką
autoimmunologicznego zapalenia wątroby i może korelować
z aktywnością choroby. Oznaczanie metodą immunofluorescencji
pośredniej ANA i miana ASMA wraz z innymi przeciwciałami, takimi jak przeciwciała przeciw mikrosomom nerki i wątroby LKM-1
(ang. anti-liver kidney microsomal antibodies), pozwala na różnicowanie autoimmunizacyjnego zapalenia wątroby z wirusowym
zapaleniem, bądź zaburzeń hepatologicznych związanych ze TRU,
czy twardziną układową [2, 4]. Przeciwciała przeciwko mięśniom
gładkim reagują z mrożonymi skrawkami żołądka szczura, myszy,
dając wyraźną fluorescencję cytoplazmy błony mięśniowej, jak
również międzykłębuszkowych włókien i torebki surowiczej. Zasadniczo taki sam obraz fluorescencji uzyskuje się dla pozytywnej
surowicy kontrolnej [2, 15].
Podsumowanie i wnioski
Choroby reumatyczne nie dotyczą jednego narządu, lecz są niejednokrotnie odzwierciedleniem zmian chorobowych całego
ustroju.
Badania laboratoryjne stosowane w chorobach reumatycznych, są
bardzo cennym elementem uzupełniającym obserwacje kliniczne
i wspomagającym rozpoznanie. Służą one do oceny aktywności
i dynamiki procesu zapalnego, pozwalają ocenić skuteczność
zastosowanej terapii. Ułatwiają również ocenę stopnia remisji.
Mogą też być sygnałem rozpoczynającego się zaostrzenia, czy też
247
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
nawrotu procesu chorobowego w monitorowaniu jego przebiegu.
Mają również znaczenie prognostyczne przez ocenę czynników
ostrej fazy, jak i serologicznych]. Stanowią więc bardzo użyteczne narzędzie i źródło informacji, jakimi powinien posługiwać się
współczesny klinicysta w diagnostyce różnicowej chorób autoimmunologicznych. Badania laboratoryjne pełnią ciągle rolę pomocniczą, a ich wyniki należy rozpatrywać w połączeniu z danymi
klinicznymi.
Obserwowany w ostatnich latach rozwój nowych technologii
badawczych, w tym technik multipleksowych, a także ich automatyzacja – diametralnie zmienia oblicze diagnostyki laboratoryjnej, czyniąc ją istotną składową medycyny personalizowanej.
Ciągły postęp w serodiagnostyce autoprzeciwciał oraz antygenów, polegający na wprowadzeniu niezwykle czułych, złożonych
technicznie i coraz częściej zautomatyzowanych metod, obliguje do szczegółowego przestrzegania standardowych warunków
oznaczeń oraz rozwinięcia szerokiego programu standaryzacji,
obejmującego metodykę, stosowane odczynniki, jak i surowice
wzorcowe [25, 79].
18. Castro Ch, Gourley M. Diagnostic testing and interpretation of tests for autoimmunity. Allergy Clin Immunol 2010; 125 (2 Suppl 2): S238–S247.
19. Stott DI. Immunoblotting, dot-blotting, and elispot assays: methods and applications. J Immunoassay 2000; 21: 273-296.
20. Hrycaj P. Nowe testy serologiczne w diagnostyce reumatologicznej. Reumatologia 2007; 45: 369-373.
21. Soloski M, Chrest F. Multi-parameter flow cytometry for discovery of disease
mechanisms In rheumatic diseases.Arthritis Rheum 2013; 65: 1148-1156.
22. Blair PA, Norena LY, Flores-Borja F, et al. CD19(+)CD24(hi)CD38(hi) B cells exhibit
regulatory capacity in healthy individuals but are functionally impaired in systemic Lupus Erythematosus patients. Immunity 2010; 32:129-140.
23. Wei Ch, Jenks S, Sanz I. Polychromatic flow cytometry In evaluating rheumatic
disease patients. Arthritis Res Ther 2015; 17: 46.
24. Foti DP, Greco M, Palella E, Gulletta E. New laboratory markers for the management of rheumatoid arthritis patients. Clin Chem Lab Med 2014; 52: 1729-1737.
25. Tozzoli R, D’Aurizio F, Villalta D, Bizzaro N. Automation, consolidation, and integration in autoimmune diagnostics. Autoimmun Highlights 2015; 6: 1-6.
26. Farid S, Azizi G, Mirshafiey A. Anti-citrullinated protein antibodies and their
clinical utility in rheumatoid arthritis. Int J Rheumat Dis 2013; 16: 379-386.
27. Ingegnoli F, Castelli R, Gualtierotti R. Rhematoid factors: clinical applications.
Dis Markers 2013; 35, 6: 727-734.
28. Dörner T, Egerer K, Feist E, et al. Rheumatoid factor revisited. Curr Opin Rheumatol 2004; 16, 3: 246-253.
29. Aletaha D, Neogi T, Silman AJ, et al. Rheumatoid arthritis classification criteria:
an American College of Rheumatology/Eurropean League Against Rheumatism
Piśmiennictwo
1.
Odrowąż-Sypniewska G. Diagnostyka laboratoryjna wybranych chorób reumatycznych. MedPharm Polska, Wrocław, 2011.
2.
Ząbek J. Wsparcie diagnostyczne w rozpoznaniu schorzeń z autoimmunizacją.
Medyk, Warszawa, 2013.
3.
Damoiseaux J, Andrade L, Fritzler M, Shoenfeld Y. Autoantibodies 2015: From
diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimm
Rev 2015; 14: 555-563.
4.
Anyszek T, Obtułowicz K, Furgał J. Diagnostyka dysfunkcji układu immunologicznego. Dembińska-Kieć A, Naskalski JW. Diagnostyka laboratoryjna z elementami
biochemii klinicznej. Urban and Partner, Wrocław, 2010: 823-862.
5.
6.
8.
disease outcome in rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev 2010; (9)3: 140-143.
31. Jilani AA, Mackworth-Yong CG. The role of citrullinated protein antibodies in
predicting erosive disease in rheumatoid arthritis: a systematic literature review
and meta-analysis. Int J Rheumatol 2015; 1-8.
32. Valesini G, Gerardi M, Ianuccelli C, et al. Citrullination and autoimmunity. Autoimmunity Rev 2015; 14: 490-497.
33. Aletaha D., Neogi T, Silman A, et al. Rheumatoid arthritis classification criteria.
Arthritis Rheum 2010; 62: 2569-2581.
34. Shovman O, Gilburd B, Shoenfeld Y, et al. The diagnostic utility of anti-cyclic citrullinated peptide antibodes, matrix metalloproteinase-3, rheumatoid
old dilemmas. Biochemia Medica 2010; 20: 45-56.
factor, erythrocyte sedimentation rate, and C-reactive protein in patiens with
Chapel H, Heaney M, Misbah S, Snowden N. Immunologia kliniczna, Wydaw-
erosive and non-erosive rheumatoid arthritis. Clin Devel Immunol 2005; (12)
3: 197-202.
Puszczewicz M, Białkowska-Puszczewicz G, Majewski D. Znaczenie autoprze-
35. Syversen SW, Gaarder PI, Goll GL, et al. High anti-cyclic citrullinated peptide
ciwciał w rozpoznaniu chorób reumatycznych. Post Nauk Med 2012; 2: 156-163.
levels and an algorithm of four variables predict radiographic progression in
Jennette JC, Falk RJ, Bacon PA, et al. 2012 revised International Chapel Hill Con-
patients with rheumatoid arthritis: results from a 10-year longitudinal study.
sensus Conference Nomenclature of Vasculitides. Arthritis Rheum 2013; 65: 1-11.
9.
tibodies in association with genetic and environmental factors as indicators of
Salamunić I. Laboratory diagnosis of autoimmune diseases – new technologies,
nictwo Czelej, Lublin, 2009.
7.
collaborative initiative. Ann Rheum Dis 2010; 69: 1580-1588.
30. Szodoray P, Szabo Z, Kapitany A, et al. Anti-citrullinated protein/peptide autoan-
Kumble S, Lopez-Muedano C, Kumble K. Microarray ELISA screening In connective tissue disease. J Clin Diagn Res 2012; 6: 200-206.
10. Kingsmore S. Multiplexed protein measurement: technologies and applications
of protein and antibody arrays. Nat Rev Drug Discov 2006; 5: 310-320.
Ann Rheum Dis 2008; 67, 2: 212-217.
36. Syversen SW, Goll GL, van der Heijde D, et al. Prediction of radiographic progression in rheumatoid arthritis and the role of antibodies against mutated
citrullinated vimentin: results from a 10-year prospective study. Ann Rheum
Dis 2010; 69, 2: 345-351.
11. American College of Rheumatology. Guidelines for immunologic laboratory
37. Lienesch D, Morris R, Metzger A, et al. Absence of cyclic citrullinated peptide
testing in the rheumatic diseases: an introduction. Arthritis Care Res, 2002;
antibody in nonarthritic patients with chronic hepatitis C infection. J Rheumatol
47: 429-433.
12. Kątnik-Prastowska I. Immunochemia w biologii medycznej. PWN, Warszawa,
2009: 127-144, 245-261.
13. Ząbek J. Podstawowe zasady racjonalnej serodiagnostyki autoprzeciwciał
markerowych w układowych chorobach tkanki łącznej. Reumatologia 2005;
43: 335-340.
14. Agmon-Levin N, Damoiseaux J, Kallenberg C, et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as
anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis 2014; 73: 17-23.
15. Zimmermann-Górska I. Postępy reumatologii klinicznej, Wydawnictwo Lekarskie
PZWL, Warszawa, 2014.
16. Ząbek J, Palacz A, Pyka J, Krzewska I. Przeciwciała przeciwjąderkowe w serodiagnostyce zespołu antyfosfolipidowego. Pol Arch Med Wewn. 2008; 118
(Suppl): 25-30.
17. Tozzoli R, Bonaguri Ch, Melegari A et al. Current state of diagnostics technologies
in the autoimmunology laboratory. Clin Chem Lab Med 2013; 51: 129-138.
248
2005; 32: 489-493.
38. Whiting PF, Smidt N, Sterne JA, et al. Systematic review: accuracy of anticitrullinated peptide antibodies for diagnosing rheumatoid arthritis. Ann Intern Med
2010; 152: 155-166,456-464.
39. Demoruelle M, Parish M, Derber L, et al. Performance of anti-cyclic citrullinated
peptide assays differs in subjects at increased risk of rheumatoid arthritis and
subjects with established disease. Arthritis Rheum 2013; 65: 2243-2252.
40. Shi J, van Veelen PA, Mahler M, et al. Carbamylation and antibodies against
carbamylated proteins in autoimmunity and other pathologies. Autoimmun
Rev 2014; 13: 225-230;
41. Shi J, van de Stadt LA, Levarht EW, et al. Anti-carbamylated protein (anti-CarP)
antibodies precede the onset of rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2014;
73: A21.
42. Stoop JN, Liu B-S, Shi J, et al. Antibodies specific for carbamylated proteins
precede the onset of clinical symptoms in mice with collagen induced arthritis.
PLoS ONE 2014; 9: e102163
Diagn Lab 2015; 51(3): 235-250
43. Shi J, van de Stadt LA, Levarht EW, et al. Anti-carbamylated protein antibodies
70. Mahler M, Norman GL, Meroni PL, et al. Autoantibodies to domain 1 of beta
are present in arthralgia patients and predict the development of rheumatoid
2 glycoprotein 1: a promising candidate biomarker for risk management in
arthritis. Arthritis Rheum 2013; 65: 911-915.
44. Trendelenburg M. Antibodies against C1q in patients with systemic lupus erythematosus. Springer Semin Immun 2005; 27: 276-285.
45. Cozzani E, Drosera M, Gasparini G, Parodi A. Serology of lupus erythematosus:
correlation between immunopathological features and clinical aspects. Autoimmune Dis 2014, Article ID 321359, 13 pages.
antiphospholipid sydrome. Autoimmun Rev 2012; 12, 2: 313-317.
71. Miyakis S, Lockshin MD, Atsumi T, et al. International consensus statement on
an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome
(APS). J Thromb Haemost 2006; 4: 295-306.
72. Zawilska K, I. Zimmermann-Górska, J. Skrzypczak. Zespół antyfosfolipidowy, rozdział 8, strona 173-187, Postępy reumatologii klinicznej, PZWL, Warszawa 2014.
46. Mok C, Ho L, Leung H, Wong L. Performance of anti-C1q, antinucleosome, and
73. Brandt JT, Triplett DA, Alving B, et al. Criteria for the diagnosis of lupus antico-
anti-dsDNA antibodies for detecting concurrent disease acrivity in systemic
agulants: an update. On behalf of the Subcommittee on Lupus Anticoagulant/
lupus erythematosus. Translat Res 2010; 156: 320-325.
Antiphospholipid Antibody of the Scientific and Standardisation Committee
47. Mahler M, Meroni PL, Bossuyt X, Fritzler MJ. Clinical and serological features of
patients referred through a Rheumatology Triage System because of positive
antinuclear antibodies, PLoS ONE 2014; 9(4).
48. Wiik AS, Bizzaro N. Missing links in high quality diagnostics of inflammatory
systemic rheumatic diseases. It is all about the patient! Autoimmun Highlights
2010; 3: 35-49.
49. Mehra S, Walker J, Patterson K, et al. Autoantibodies in systemic sclerosis. Autoimmun Rev 2013; 12: 340-354.
50. Puszczewicz M. Przeciwciała przeciwjądrowe – cóż z nimi począć? Reumatologia
2013; 51, 3: 172-178.
51. Satoh M, Chan EKL, Ho LA, et al. Prevelence and sociodemographic correlates of
of the ISTH. Thromb Haemost. 1995; 74: 1185-1190.
74. Csernok E, Moosig F. Current and emerging techniques for ANCA detection in
vasculitis. Nat Rev Rheumatol 2014; 10: 494-501.
75. Alberici F, Martorana D, Vaglio A. Genetic aspects of anti-neutrophil cytoplasmic
antibody-associated vasculitis. Nephrol Dial Transplant 2015; 30 Suppl 1: i37-45.
76. Millet A, Pederzoli-Ribeil M, Guillevin L, et al. Republished: Antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitides: is it time to split up the group?
Postgrad Med J 2014; 90: 290-296.
77. Mahr A, Katsahian S, Varet H, et al. Revisiting the classification of clinical phenotypes of anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis: a cluster
analysis. Ann Rheum Dis 2013; 72: 1003-1010.
antinuclear antibodies in the united states. Arthr Rheum 2012; 64: 2319-2327.
78. Hazebroek MR, Kemna MJ, Schalla S, et al. Prevalence and prognostic relevance
52. Cabiedes J, Nunez-Alvarez CA. Antinuclear antibodies. Rheumatol Clin 2010;
of cardiac involvement in ANCA-associated vasculitis: Eosinophilic granulo-
6: 224-300.
53. Wiik AS, Holer-Madsen M, Forslid J, et al. Antinuclear antibodies: A contemporary
nomenclature using Hep-2 cells. J Autoimmunol 2010; 35: 276-290.
54. Atzeni F, Talotta R, Salaffi F, et al. Immunogenicity and autoimmunity during
matosis with polyangiitis and granulomatosis with polyangiitis. Int J Cardiol
2015; 199: 170-179.
79. Satoh M, Tanaka S, Chan E. The uses and misuses of multiplex autoantibody
assays in systemic autoimmune rheumatic diseases. Front Immunol 2015; 6: 181.
anti-TNF therapy. Autoimmun Rev 2013; 12: 703-708.
55. Meroni PL, Schur PH. ANA screening: an old test with new recommendations.
Ann Rheum Dis 2010; 69: 1420-1422.
56. Ząbek J, Palacz A, Horbacz I, Pyka J. Ocena wiarygodności oznaczania niektórych typów swoistości przeciwciał przeciwjądrowych. Rematologia 2009;
47(6): 311-318
57. Sui M, Lin Q, Xu Z et al. Simultaneous positivity for anti-DNA, anti-nucleosome
and anti-histone antibodies is a marker for more severe lupus nephritis. J Clin
Immunol 2013; 33: 378-387.
58. Pyka J, Horbacz I, Biernacka E, et al. Znaczenie przeciwciał antycentromerowych
w diagnostyce chorób reumatycznych i nowotworowych. Reumatologia 2012;
Adres do korespondencji:
dr hab. n. med. Katarzyna Komosińska-Vassev
Katedra i Zakład Chemii Klinicznej i Diagnostyki Laboratoryjnej
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
w Sosnowcu
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Tel. +48 32 3641158; 602 638 668
email: [email protected]
50, 1: 52-56.
59. Ho KT, Reveille JD. The clinical relevance of autoantibodies in scleroderma.
Arthritis Res Ther. 2003; 5: 80-93.
Zaakceptowano do druku: 7.10.2015
60. Fritzler MJ, Rattner JB, Luft LM, et al. Historical perspectives on the discovery and
elucidation of autoantibodies to centromere proteins (CENP) and the emerging
importance of antibodies to CENP-F. Autoimmun Rev 2011; 10: 194-200.
61. Mahler M, Mierau R, Genth E, et al. Development of a CENP-A/CENP-B – specific
immune response in a patient with systemic sclerosis. Arthr Rheum 2002; 46:
1866-1872.
62. Olesińska M. Przeciwciała przeciwko rybosomalnemu białku P – znaczenie
kliniczne i udział w patogenezie tocznia rumieniowatego układowego. Reumatologia 2005; 43, 5: 274-279.
63. Massardo L, Burgos P, Martinez ME, et al. Antiribosomal P protein antibodies in
Chilean SLE patients: no association with renal disease. Lupus 2002; 11: 379-383.
64. Defendenti C, Atzeni F, Spina MF, et al. Clinical and laboratory aspects of Ro/
SSA-52 autoantibodies. Autoimmun Rev 2011; 10: 150-154
65. Yoshimi R, Ueda A, Ozato K, et al. Clinical and pathological roles of Ro/SSA
autoantibody system. Clin Dev Immunol 2012 Article ID 606195, 12 pages.
66. Shiboski S, Shiboski C, Criswell L, et al. American College of Rheumatology
classification criteria for Sjogren’s syndrome: a data-driven, expert consensus
approach in the Sjogren’s International Collaborative Clinical Alliance cohort.
Arthritis Care and Research 2012; 64, 475-487.
67. Hanke K, Dahnrich C, Bruckner CS, et al. Diagnostic value of anti-topoisomerase
I antibodies in a large monocentric cohort. Arthritis Res Ther 2009; 11: R28.
68. Nishijima C, Sato S, Hasegawa M, et al. Renal vascular damage in Japanese
patients with systemic sclerosis. Rheumatology (Oxford) 2001; 40: 406-409.
69. Spencer-Green G, Alter D, Welch HG. Test performance in systemic sclerosis:
anti-centromere and anti-Scl-70 antibodies. Am J Med. 1997; 103: 242-248.
249
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
250
Download