Odczyny immunologiczne dla przeciwciał i

DIAGNOSTYKA SEROLOGICZNA
Elektroforeza rakietowa
Podwójna immunodyfuzja
Żel zawierający przeciwciała
Antygen
a
a
Przeciwciała:
anty-a
Identyczność
A
17
a
b
anty-a + anty-b
Nieidentyczność
a+b
a
–
anty-a + anty-b
Częściowa
identyczność
+
D
Immunoelektroforeza
Elektroforeza przeciwprądowa
–
Szczelina zawierająca przeciwciała
–
+
Antygen
B
Przeciwciało
+
E
Pojedyncza immunodyfuzja radialna
Żel zawierający przeciwciała
C
Rycina 17–1. Analiza antygenów i przeciwciał w reakcji immunoprecypitacji. Precypitacja białek pojawia się w punkcie równowagi, w którym monoklonalne przeciwciało najmocniej wiąże się w kompleks z antygenem. A. Podwójna immunodyfuzja w żelu wg Ouchterlony’ego. Antygen i przeciwciało dyfunduje z dołków, spotykają się i tworzą linię precypitacyjną. Jeśli antygeny są identyczne, ich stężenie w żelu podwaja się między dołkami
z antygenem i w tym rejonie nie pojawia się linia precypitacyjna (odgina się w kierunku przeciwciała). W przypadku różnych antygenów możliwe
są dwa warianty linii precypitacyjnych. Dla zupełnie różnych antygenów i poliwalentnej surowicy widoczne będą skrzyżowane linie ze szczytami
skierowanymi w stronę antygenów, przy częściowej zgodności wzór linii precypitacyjnych będzie wypadkową obu wariantów. B. Elektroforeza przeciwprądowa. Technika ta jest podobna do odczynu podwójnej immunodyfuzji, jednak ruch antygenu i przeciwciała jest ułatwiony (przyśpieszony)
dzięki elektroforezie w polu elektrycznym. C. Pojedyncza immunodyfuzja radialna. Ta technika pozwala na dyfuzję antygenu do żelu zawierającego
przeciwciała. Pierścienie precypitacyjne wskazują na reakcję immunologiczną, a średnica pierścienia jest proporcjonalna do stężenia antygenu.
D. Elektroforeza rakietowa. Antygeny wędrują pod wpływem prądu w żelu zawierającym przeciwciała. Długość „rakietowatych” linii precypitacyjnych
obrazuje stężenie antygenu. E. Immunoelektroforeza. Antygeny są umieszczone w dołkach i wędrują w polu elektrycznym, przeciwciała umieszczone
są w wyciętej szczelinie, a kształty linii precypitacyjnych są zagięte w stronę poszczególnych antygenów.
Dane uzyskane z cytometru przepływowego są zazwyczaj
przedstawiane w postaci histogramów, z intensywnością fluorescencji na osi x i liczbą komórek na osi y lub w postaci dot-plot, w której dla każdej komórki porównywany jest
więcej niż jeden parametr.
Używając cytometru przepływowego, można przeprowadzić różne analizy białych krwinek i porównać jednocześnie
populacje CD4 i CD8 limfocytów T (ryc. 17-4). Cytometr
przepływowy jest również użyteczny przy analizowaniu
wzrostu komórek po fluorescencyjnym wyznakowaniu kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) oraz do innych zastosowań metody fluorescencyjnej.
Odczyny immunologiczne dla przeciwciał
i rozpuszczalnych antygenów
W teście immunoenzymatycznym (ELISA) używane są
antygeny osadzone na powierzchni z tworzywa, kulkach lub
filtrze w celu wychwycenia i oznaczenia swoistych przeciwciał spośród innych przeciwciał w surowicy pacjenta (ryc.
17-5). Przeciwciała antyludzkie z kowalencyjnie związanym
enzymem (np. peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna,
β-galaktozydaza) wykrywają wtedy przyłączone do antygenu przeciwciała pacjenta. Oznaczenie spektrofotometryczne
opierające się na intensywności koloru powstającego w wyniku przekształcenia odpowiedniego substratu przez enzym,
pozwala na ocenę poziomu swoistych przeciwciał. Różne
odmiany metody ELISA różnią się sposobem, w jaki wychwytują lub wykrywają antygen lub przeciwciało.
Metoda ELISA może być również użyta do ilościowego
określenia rozpuszczalnego antygenu w próbce pobranej od
pacjenta. W tych testach rozpuszczalny antygen jest wychwytywany i zagęszczany przez umieszczone w fazie stałej przeciwciała, a następnie wykrywany za pomocą innego przeciwciała oznaczonego enzymem. Przykładem powszechnie
używanej metody ELISA jest domowy test ciążowy oznaczający hormon ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej.
Analiza western-blot jest odmianą metody ELISA.
W metodzie tej białka drobnoustroju rozdzielone elektroforetycznie na podstawie ich masy cząsteczkowej lub ładunku
są przenoszone na odpowiednią membranę (np. nitroceluloza, nylon).
Po ekspozycji na surowicę pacjenta unieruchomione białka wiążą swoiste przeciwciała i są uwidoczniane z użyciem
związanego z enzymem przeciwciała antyludzkiego. Techni167
165_172_R17_Mikrobiologia-med.indd 167
2011-09-22 17:41:25