Instrukcja do ćwiczeń Temat: Analiza sanitarna gleby – Cz.1/Cz.2.
advertisement
Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Mikrobiologia ogólna o Biotechnologia medyczna II rok / I Instrukcja do ćwiczeń Temat: Analiza sanitarna gleby – Cz.1/Cz.2. CZEŚĆ TEORETYCZNA 1. Źródła zanieczyszczenia mikrobiologicznego gleby. 2. Bakterie chorobotwórcze bytujące w glebie. 3. Badanie bakteriologiczne gleby do celów sanitarnych. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA I. Sporządzenie zawiesiny wyjściowej i szeregu rozcieńczeń gleby · · · odważyć 10 g badanej gleby i zawiesić w 90 mi sterylnej soli fizjologicznej. wytrząsać przez min. 5 min. i pozostawić do opadnięcia większych cząstek. -2 -6 z tak przygotowanej zawiesiny sporządzić szereg rozcieńczeń w roztworze soli fizjologicznej od 10 do 10 , a następnie wykonać poniższe oznaczenia. II. Oznaczanie ogólnej liczby mikroorganizmów w glebie metodą płytkową Przygotować zawiesinę wyjściową próbki, a jako rozcieńczalnika użyć soli fizjologicznej Przygotować kolejne dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny wyjściowej przy użyciu soli fizjologicznej Przenieść do sterylnych płytek Petriego po 1 ml z rozcieńczeń 10 -4 – 10-6. Następnie wlać po ok. 15 ml pożywki (Agar M), schłodzonej do temp. 44-47oC i delikatnie wymieszać materiał z pożywką. Inkubacja: płytki odwrócone denkiem do góry 30 ± 1oC / 72 ± 3h Odczyt – policzyć wszystkie kolonie, a w przypadku uzyskania wzrostu zlewnego traktować go jako pojedyncze kolonie Podawanie wyników Wynik końcowy podać jako liczbę mikroorganizmów w 1 g badanej próbki. 1 III. Oznaczanie liczby bakterii z grupy coli w glebie metodą płytkową Przygotować zawiesinę wyjściową próbki, a jako rozcieńczalnika użyć soli fizjologicznej Przygotować kolejne dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny wyjściowej przy użyciu soli fizjologicznej Przenieść po 1 ml z rozcieńczeń 10-1 – 10-3 do płytek Petriego i zalać 15 ml podłoża VRBL. Po zestaleniu wlać po ok. 4 ml pożywki VRBL Inkubacja: 37 oC / 24 ± 2 h Odczyt – policzyć wszystkie kolonie barwy ciemnopurpurowej na każdej płytce zawierającej mniej niż 150 charakterystycznych kolonii. Podawanie wyników Wynik końcowy podać jako liczba bakterii z grupy coli w 1 g badanej próbki. IV. Oznaczanie najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) bakterii z grupy coli i bakterii z grupy coli typ fekalny w glebie metodą probówkową Przygotować zawiesinę wyjściową próbki, a jako rozcieńczalnika użyć soli fizjologicznej Przygotować kolejne dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny wyjściowej przy użyciu soli fizjologicznej W zależności od systemu posiewu: 3x1g , 3x0,1g, 3x0,01g itd. lub 5x1g, 5x0,1g, 5x0,01g itd. przenieść po 10 ml zawiesiny wyjściowej do 2xstężonej pożywki namnażająco-selektywnej (z siarczanem laurylowym i peptonem tryptose). W przypadku posiewu 1 ml zawiesiny wyjściowej i kolejnych jej rozcieńczeń zastosować należy pożywkę 1xstężoną. Inkubacja: 30 lub 37 ± 1oC / 24 ± 2 h (48 ± 2 h) Po inkubacji z każdej dodatniej probówki (zmętnienie/gaz) pobrać hodowlę i przenieść do probówek z pożywką potwierdzająca (Pożywka z laktozą, żółcią i zielenią brylantową) Inkubacja: 30 lub 37 ± 1oC / 24 ± 2 h (48 ± 2 h) Odczyt – za dodatni wynik należy uznać obecność zmętnienia lub gazu (obecność bakterii z grupy coli) W celu potwierdzenia obecności bakterii z grupy coli typ fekalny należy przenieść hodowlę z każdej dodatniej probówki z pożywką potwierdzającą grupę coli na agar Endo Inkubacja: 44 ± 1oC / 24 ± 2 h (48 ± 2 h) Odczyt – za dodatni wynik należy uznać obecność ciemnoczerwonych kolonii często z metalicznym zielonozłotym połyskiem (obecność bakterii z grupy coli typ fekalny) Podawanie wyników Wynik końcowy podać jako NPL bakterii z grupy coli w 1 g badanej próbki na podstawie tablic NPL. 2 V. Oznaczanie liczby enterokoków kałowych w glebie metodą płytkową Przygotować zawiesinę wyjściową próbki, a jako rozcieńczalnika użyć soli fizjologicznej Przygotować kolejne dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny wyjściowej przy użyciu soli fizjologicznej Przenieść po 0,1 ml z rozcieńczeń 10-1 – 10-3 do płytek Petriego z podłożem Slanetza Bartleya i rozprowadzić inokulum na całej powierzchni podłoża przy użyciu sterylnej głaszczki. W celu zwiększenia granicy oznaczalności można posiać 1 ml zawiesiny wyjściowej (w dwóch powtórzeniach) na trzy płytki Petriego z podłożem Slanetza Bartleya. Inkubacja: 37oC±1oC / 24 - 48 h ±2 h Odczyt – do liczenia wybrać płytki na których jest od 15 do 300 kolonii. Za typowe należy uznać wszystkie kolonie, wykazujące w środku lub w całości barwę czerwoną, kasztanową lub różową. Podawanie wyników Wynik podać jako liczbę enterokoków w 1 g badanej próbki. VI. Oznaczanie liczby Clostridium perfringens w glebie Przygotować zawiesinę wyjściową próbki, a jako rozcieńczalnika użyć soli fizjologicznej Przygotować kolejne dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny wyjściowej przy użyciu soli fizjologicznej Przenieść po 1 ml z rozcieńczeń 10-1 – 10-3 do płytek Petriego i zalać 1015 ml podłoża TSC. Po zestaleniu wlać 10 ml pożywki TSC Inkubacja: w warunkach beztlenowych 37oC±1oC / 20 ±2 h Odczyt – do liczenia wybrać płytki na których jest poniżej 150 kolonii i policzyć wszystkie czarne kolonie Podawanie wyników Wynik podać jako liczbę Clostridium perfringens w 1 g badanej próbki. 3 VII. Wykrywanie pałeczek Salmonella spp. w glebie Przednamnażanie Odważyć 25 g badanej próbki i przenieść do 225 ml zbuforowanej wody peptonowej (lub jej wielokrotność przy zachowaniu stosunku 1:9). Inkubacja: 37oC±1oC / 18±2 h Selektywne namnażanie Po inkubacji przenieś 0,1 i 1 ml zawiesiny, odpowiednio, do pożywki RVS i MKTTn Inkubacja: Pożywka RVS: 41,5oC±1oC / 24±3 h Pożywka MKTTn: 37oC±1oC / 24±3 h Posiew na selektywne podłoża agarowe Po inkubacji przy pomocy ezy przenieś hodowlę z każdej pożywki płynnej na podłoże BGA i podłoże XLD i dokonać posiewu redukcyjnego, tak aby uzyskać pojedyncze kolonie Inkubacja: 37oC±1oC / 24±3 h Odczyt: Kolonie na BGA: typowe kolonie są różowe, wypukłe i drobne otoczone strefą czerwono zabarwionej pożywki. Kolonie na XLD: typowe kolonie mają czarny zabarwiony środek oraz lekko przezroczyste obrzeże czerwonawej barwy spowodowane zmianą zabarwienia wskaźnika Uwaga!: Szczepy Salmonella nie produkujące siarkowodoru rosną na XLD w postaci różowych kolonii z ciemniejszymi środkami. Szczepy Salmonella laktozo-dodatnie rosną w postaci żółtych kolonii z charakterystycznym zaczernieniem lub bez takiego czarnienia. Dokonać posiewu charakterystycznych i podejrzanych kolonii na agar odżywczy (co najmniej jedną z każdej płytki (w przypadku wyniku negatywnego do potwierdzenia wybrać dalsze cztery kolonie) Inkubacja: 37oC±1oC / 24±3 h Potwierdzenie Potwierdzenie serologiczne: wykonać aglutynację szkiełkową z wykorzystaniem surowic O, Vi, H, przy czym w pierwszej kolejności należy sprawdzić możliwość wystąpienia autoaglutynacji (w przypadku pozytywnej reakcji nie należy wykonywać testu z pozostałymi surowicami) Potwierdzenie biochemiczne: użyć gotowych testów API 20E i postępować zgodnie z zaleceniami producenta, a odczytu dokonać przy pomocy specjalnej ksiązki kodowej. Podawanie wyników Wynik podać jako obecność lub nieobecność Salmonella spp. w 25 g próbki gleby. 4
