PCR/RFLP

Polymerase Chain Reaction

Another way to copy DNA is a technique called
polymerase chain reaction (PCR)


It was developed by Kary Mullis in 1985
Unlike gene cloning, PCR can copy DNA without
the aid of vectors and host cells
Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display
18-38
Hot water bacteria:
Thermus aquaticus
Taq DNA polymerase
Life at High Temperatures
by Thomas D. Brock
Biotechnology in Yellowstone
© 1994 Yellowstone Association for Natural Science
http://www.bact.wisc.edu/Bact303/b27

The starting material for PCR includes

1. Template DNA
• Contains the region that needs to be amplified

2. Oligonucleotide primers
• Complementary to sequences at the ends of the DNA fragment to
be amplified
• These are synthetic and about 15-20 nucleotides long

3. Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs)
• Provide the precursors for DNA synthesis

4. Taq polymerase
• DNA polymerase isolated from the bacterium Thermus aquaticus
• This thermostable enzyme is necessary because PCR involves
heating steps that inactivate most other DNA polymerases
Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display
18-39
Example thermal cycler protocol used in lab:
Step 1 7 min at 94˚C
Initial Denature
Step 2 45 cycles of:
20 sec at 94˚C
20 sec at 52˚C
1 min at 72˚C
Denature
Anneal
Extension
Step 3 7 min at 72˚C
Final Extension
Step 4 Infinite hold at 4˚C
Storage
BIOL 362 samples processed in:
MJ Research DNA Engine Dyad
DNA primers for PCR
5’-AAGCGATGACAAGATCAACAGCTGATCGATCGT-3’
3’-TTCGCTACTGTTCTAGTTGTCGACTAGCTAGCA-5’
CTAGCTAGCA-5’
Primer 1 (sense)
Primer 2 (antisense)
• Primers are generally designed to
have a Tm of ~55°C
- Tm = temperature at which 50%
of duplex is denatured.
- More G/C base pairs = higher Tm
% single stranded
5’-AAGCGATGA
100%
50%
Tm
~95° C
temperature
Binding of the primers to the
DNA is called annealing



PCR is carried out in a thermocycler,
which automates the timing of
each cycle
All the ingredients are placed in
one tube
The experimenter sets the
machine to operate within a
defined temperature range and
number of cycles
18-40

The sequential process of
denaturing-annealingsynthesis is then repeated for
many cycles
With each successive cycle the relative amount of
this type of DNA fragment increases.
Therefore, after many cycles, the vast majority of
DNA fragments only contain the region that is
flanked by the two primers

A typical PCR run is likely to involve 20 to 30 cycles of replication



This takes a few hours to complete
After 20 cycles, a DNA sample will increase 220-fold (~ 1 million-fold)
After 30 cycles, a DNA sample will increase 230-fold (~ 1 billion-fold)
18-41

The PCR reaction shown in Figure 18.6 seeks to
amplify a specific DNA segment

For this type of experiment, a researcher must have prior
knowledge about the sequence of the template DNA
• This, in order, to construct the synthetic primers

PCR can also be used to amplify chromosomal DNA
semispecifically or nonspecifically

1. Semispecific approach
• Primers recognize a repetitive DNA sequence found at several
sites within the genome


Therefore, many different DNA fragments will be amplified
2. Nonspecific approach
• A mixture of primers with many different random sequences is used

These will anneal randomly throughout the genome and amplify most
of the chromosomal DNA
Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display
18-42

PCR is also used to detect and quantitate the
amount of RNA in living cells


The method is called reverse transcriptase PCR (RT-PCR)
RT-PCR is carried out in the following manner




RNA is isolated from a sample
It is mixed with reverse transcriptase and a primer that will
anneal to the 3’ end of the RNA of interest
This generates a single-stranded cDNA which can be used
as template DNA in conventional PCR
RT-PCR is extraordinarily sensitive
• It can detect the expression of small amounts of RNA in a single
cell
Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display
18-43
Diagnostyka molekularna
w wykrywaniu czynników
infekcyjnych i badaniach
epidemiologicznych
 Powszechnie
stosowane metody
wykrywania i identyfikacji drobnoustrojów
opierają się głównie na badaniu cech
morfologicznych, serologicznych i
biochemicznych.

Ostatnie osiągnięcia biologii molekularnej i
biotechnologii szybko zmieniają procedury
diagnostyczne stosowane w analizie mikrobiologicznej.

Bakterie chorobotwórcze, a także wirusy, grzyby i
pasożyty, wcześniej izolowane i identyfikowane
pracochłonnymi i długotrwałymi metodami klasycznej
mikrobiologii mogą dzisiaj być wykrywane przez
zastosowanie testów opartych na analizie kwasów
nukleinowych. Jedną z najbardziej eksploatowanych
metod w tych próbach, opartych na analizie materiału
genetycznego, jest technika PCR (łańcuchowa reakcja
polimerazy), która w ciągu kilku lat stała się jedną z
podstawowych technik zarówno badawczych, jak i
diagnostycznych.
Zasady reakcji PCR
Technika łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR)
pozwala na selektywną amplifikację DNA in vitro
przez naśladowanie zjawiska replikacji DNA in
vivo. Wymaga następujących czynników reakcji:
 jednoniciowej matrycy DNA,
 starterów (sekwencji oligonukleotydów
komplementarnych do końców zdefiniowanej
sekwencji matrycowego DNA),
 trójfosforanów deoksynukleozydów (dNTP) i
 enzymu termostabilnej polimerazy DNA.
Reakcja PCR przebiega cyklicznie, a każdy
cykl złożony jest z trzech etapów:



denaturacji dupleksu DNA (92-960C),
dołączania starterów do miejsca
komplementarnego matrycy (30-720C),
wydłużania startera od końca 3'-OH
przez sukcesywne dosyntetyzowanie
dNTP w temperaturze 720C.
W większości zastosowań techniki PCR,
takie czynniki jak:
 odpowiedni wybór,
 charakter sekwencji i
 kombinacje stosowanych starterów
odgrywają zasadniczą rolę w osiągnięciu
pozytywnych rezultatów amplifikacji
pożądanego produktu.
 W zależności od celu, użyteczna długość
starterów wynosi od 14 do 40 nt, z
zawartością par G+C w zakresie 40-75%.
Ogólne zasady projektowania specyficznych
starterów w reakcjach diagnostycznych dotyczą:
startery powinny być komplementarne do sekwencji genomu
zlokalizowanych wewnątrz regionów wysoce konserwatywnych
dla analizowanego rodzaju;

3' końce starterów powinny zawierać kodony niezdegenerowane
(np., dla Trp i Met);

3' końce starterów powinny być niekomplementarne w stosunku
do siebie (brak możliwości tworzenia dimerów);

poszczególne startery nie powinny zawierać sekwencji
palindromicznych;

nie powinny tworzyć struktur drugorzędowych;

należy unikać w sekwencjach starterów nierównej dystrybucji
rejonów bogatych w G/C lub A/T.
Większość zastosowań reakcji PCR kontrolowana jest głównie przez
odpowiednie projektowanie oraz wybór kombinacji starterów.

Zastosowania techniki PCR w
diagnostyce molekularnej
Diagnostyka molekularna, oparta o metody analizy
materiału genetycznego (w tym na technice PCR),
znajduje praktyczne zastosowania w wielu dziedzinach
medycyny między innymi takich jak:






diagnostyka chorób uwarunkowanych
genetycznie,
diagnostyka chorób infekcyjnych,
wczesne wykrywanie nowotworów,
diagnostyka sanitarna,
diagnostyka w medycynie sądowej,
transplantologia.
Gwałtowny rozwój biologii molekularnej, w szczególności w
ostatnich 20 latach, otworzył nowe możliwości dla diagnostyki
mikrobiologicznej.
Klasyczne metody identyfikacji i różnicowania drobnoustrojów
opierają się głównie na obserwacji cech fenotypowych, czyli na ocenie
poziomu ekspresji cech biochemicznych, morfologii kolonii,
barwieniu komórek, otoczek, przetrwalników oraz określaniu
wrażliwości na antybiotyki i bakteriofagi.
Wysoki poziom zmienności fenotypowej wśród populacji
bakteryjnej może jednak prowadzić do zafałszowania wyników
przeprowadzanych analiz, co w niektórych przypadkach może okazać
się katastrofalne w skutkach.
Drugą połowę dwudziestego wieku cechuje bardzo
dynamiczny rozwój technik biologii molekularnej. W sytuacji, gdy
stwierdza się niewystarczalność metod fenotypowych pomocne mogą
okazać się techniki typowania mikroorganizmów oparte na analizie
materiału genetycznego - metody genotypowe.
Materiał genetyczny jest unikalny i stały (niezmienny w
porównaniu do cech fenotypowych) dla każdego organizmu. Z tego
względu metody genotypowe znajdują coraz szersze zastosowanie w
diagnostyce mikrobiologicznej (identyfikacji, wykrywaniu,
różnicowaniu).
Jedną z najbardziej eksploatowanych metod opartych na
analizie materiału genetycznego jest technika PCR (łańcuchowa
reakcja polimerazy), która w ciągu kilku lat stała się jedną z
podstawowych technik zarówno badawczych, jak i diagnostycznych.
Dzięki technice PCR uległa zwiększeniu czułość i
specyficzność badań diagnostycznych. Wprowadzenie do diagnostyki
medycznej techniki PCR uprościło również procedury badawcze
umożliwiając ich automatyzację i powstanie szeregu handlowo
dostępnych testów.
Metody biologii molekularnej i inżynierii genetycznej, w tym
także technika PCR, znalazły także szerokie zastosowanie do
różnicowania mikroorganizmów, np. w badaniach
epidemiologicznych zakażeń szpitalnych.

Metodami analizy DNA można skutecznie
rozpoznawać szereg chorób infekcyjnych.
Szczególny postęp zanotowano w diagnostyce
patogenów wolno rosnących lub trudnych do
hodowli. Wszędzie tam gdzie jest to możliwe i
opłacalne, diagnostyka klasyczna zostaje
zastąpiona lub uzupełniona przez amplifikację
charakterystycznego dla patogenu fragmentu
DNA w tzw diagnostyce molekularnej.
 Metody
biologii molekularnej, w tym także
technika PCR, znalazły szerokie
zastosowanie do różnicowania
mikroorganizmów np. w badaniach
epidemiologicznych.
Różnicowanie lub inaczej typowanie
mikroorganizmów ma ogromne znaczenie w
mikrobiologii medycznej.
 Służy ono badaniu ich epidemiologii, czyli m. in.
ekologicznych zachowań drobnoustrojów i dróg
ich rozprzestrzeniania.
 Określanie unikalnych cech organizmów za
pomocą typowania umożliwia badanie
kolonizacji i zakażeń szpitalnych, a także
pozwala na wyznaczanie powiązań
filogenetycznych między mikroorganizmami.

Zagrożenia w metodach amplifikacji
kwasów nukleinowych
Wyniki fałszywie pozytywne
 Kontaminacja postamplifikacyjnym
produktem
 Kontaminacja reagentów
 Kontaminacja organizmem podczas
przygotowywania kontroli pozytywnej lub
próbek dodatnich
Zagrożenia w metodach amplifikacji
kwasów nukleinowych
Wyniki fałszywie nagatywne
 Inhibitory reakcji
 Błąd w objętości próbek
 Błąd wykonawcy
 Zła izolacja kwasów nukleinowych
 Zepsucie aparatury (termocykler)
 Problemy związane z reagentami
(stężenie magnezu, synteza primerów)
Zagrożenia w metodach amplifikacji
kwasów nukleinowych
Zbyt duża czułość
 Przypadkowe pojawienie się patogena,
wykrywanie martwych organizmów
PROBLEM SZCZEPÓW OPORNYCH NA
PRZYKŁADZIE STAPHYLOCOCCUS AUREUS









1940r. wprowadzenie penicyliny do terapii – wszystkie izolowane
szczepy wrażliwe;
5 lat później, 50% izolatów opornych na penicylinę (ekspresja blaktamaz);
1960r. wprowadzenie metycyliny do terapii – wszystkie izolowane
szczepy wrażliwe (w tym szczepy oporne na penicylinę);
rok później, izolacja szczepów opornych w Europie (MRSA), inny
mechanizm oporności – gen mecA kodujący białko PBP2a;
1970r. zakażenia szpitalne MRSA w wielu szpitalach europejskich;
lata 80, szczepy MRSA oporne na wszystkie nowe antybiotyki blaktamowe;
1958r. wprowadzenie vankomycyny do terapii – szczepy MRSA
wrażliwe;
1987r. izolacja pierwszych vankomycyno-opornych szczepów
gronkowców koagulazo-ujemnych;
1988r. izolacja pierwszych vankomycyno-opornych szczepów
enterokoków (VRE).
ALARM!
 Pytanie.
Czy geny oporności na
vankomycynę mogą być przeniesione z
stosunkowo avirulentnych szczepów
enterokoków do bardzo virulentnych
szczepów Staphylococcus aureus?
Odpowiedź pozytywna, świadczą o tym:
1992r. opublikowane eksperymenty transferu oporności
na vankomycynę in vitro i in vivo z enterokoków do S.
aureus;
 doniesienia o nieskuteczności każdej terapii
antybiotykowej infekcji spowodowanych koagulazoujemnymi gronkowcami lub enterokokamii;
 1997r. doniesienia o izolacji szczepów S. aureus z
umiarkowaną opornością na vankomycynę (MIC, 8
mg/mL) w Japonii i USA;
 koniec 1997r., informacja, że około 20% izolatów MRSA
wykazywało umiarkowaną oporność na vankomycynę
(MIC, od 2-9 mg/mL);
 koniec 1997r., uzyskano laboratoryjny mutant S. aureus
z wysoką opornością na vankomycynę (MIC, 100
mg/mL).

PRZYKŁAD
Wykrywanie Staphylococcus aureus i oznaczanie jego oporności na
antybiotyki laktamoweprzy użyciu metody Multiplex PCR
Barski, P., Piechowicz, L.,
Galiński, J and Kur, J.: Rapid
assay for detection of
methicillin-resistant
Staphylococcus aureus using
multiplex PCR. Mol. Cell.
Probes 10 (1996) 471-475.
Wykrywanie
Staphylococcus
aureus i oznaczanie
jego oporności na
antybiotyki
laktamowe
przy użyciu metody
Multiplex PCR
WNIOSKI
Opracowano nową metodę oznaczania oporności na
antybiotyki b-laktamowe, którą można polecić jako
referencyjną.
Metoda ta opiera się na technice PCR i odpowiada na
dwa podstawowe pytania formułowane przy stawianiu
diagnozy dotyczącej zakażeń gronkowcowych. Pytania te
brzmią następująco:
1. Czy czynnikiem zakaźnym jest S. aureus ?
2. Czy czynnik zakaźny jest oporny na
antybiotyki -laktamowe ?
Opracowana metoda wykazuje szereg przewag
względem konwencjonalnych metod oznaczania oporności na
metycylinę:
1. Większa czułość (wykrywa się szczepy, których oporność
na antybiotyki -laktamowe została potwierdzona tylko reakcją
MPCR).
2. Znacznie krótszy czas wykonania testu (ok. 4 godzin).
3. Pewność wyników oparta o racjonalne rozpoznanie
genetycznej natury oporności na antybiotyki -laktamowe
(układ nuc/mec MPCR unika wszystkich problemów
diagnostycznych związanych z fenotypową ekspresją
oporności, jest bowiem metodą genotypową).
Zastosowanie opracowanej metody może
mieć szersze skutki w lecznictwie (antybiotyki
glikopeptydowe są nadużywane w leczeniu zakażeń
gronkowcowych w przypadkach błędnej identyfikacji
szczepów wrażliwych na metycylinę jako szczepów
opornych).
Oparte na rzetelnej diagnozie, ograniczenie użycia
antybiotyków glikopeptydowych, tylko do przypadków
zakażeń faktycznie wywołanych przez szczepy MRSA, może
spowolnić rozwój oporności na te antybiotyki, pozostające
jedynymi jak dotąd skutecznymi lekami przeciwko
gronkowcom opornym na - laktamy.
Przykład rozwiązań diagnostycznych
identyfikacji czynników etiologicznych chorób
rozpowszechnianych drogą płciową
Chlamydia trachomatis, jeden z częstszych czynników etiologicznych
chorób rozpowszechnianych drogą płciową
Oferta diagnostyki Chlamydia trachomatis jednego z
amerykańskich laboratoriów diagnostycznych obejmuje:

hodowlę in vitro;

analizę mikroskopową po znakowaniu fluoryzującym
przeciwciałem monoklonalnym (ang. direct fluorescent antibody, DFA);

wykrywanie antygenu przy pomocy testów
immunoenzymatycznych (ang. enzyme linked immunosorbent
assay, ELISA);

test hybrydyzacyjny wykrywający rybosomalny RNA;

wykrywanie techniką PCR specyficznego plazmidu, obecnego w
bakteriach.
Ten ostatni test (PCR) jest znacznie bardziej czuły (97 - 100%),
niż hodowla (70- 85%),
DFA (85%),
ELISA (60 - 93%) i
hybrydyzacja (64 - 93%).
Specyficzność i czułość (ang. positive predictive value,
PPV) testów wykorzystujących metodę PCR wynosi ponad 99%,
a więc znacznie przewyższa wartość tego parametru dla
pozostałych metod.
Należy się spodziewać, że w najbliższym czasie wiele
czołowych laboratoriów referencyjnych zaadaptuje metody
diagnostyki molekularnej, zwłaszcza gdy powstanie możliwość
rutynowego badania wielu różnych patogenów jednocześnie.
Metody typowania mikroorganizmów
oparte o analizę kwasów nukleinowych
Określanie unikalnych cech organizmów za pomocą
typowania umożliwia badanie kolonizacji i zakażeń
szpitalnych, a także pozwala na wyznaczanie powiązań
filogenetycznych między mikroorganizmami.
Wyniki takich badań mogą być podstawą do
wprowadzenia środków zapobiegawczych i działań
sanitarnych, mających ograniczyć rozprzestrzenianie się
zakażeń szpitalnych i związanej z nimi lekooporności.
Metody genotypowe najczęściej stosowane do badań
epidemiologicznych to: rybotypowanie, elektroforeza pulsacyjna
genomu ciętego rzadko tnącymi enzymami restrykcyjnymi
(PFGE), ustalanie sekwencji nukleotydowej specyficznego
regionu w genomie, różne odmiany techniki PCR fingerprinting.
Z wymienionych największą moc dyskryminacyjną mają
techniki polegające na analizie całego materiału genetycznego
komórki. Nawet dwaj przedstawiciele tego samego gatunku, i
spokrewnieni ze sobą, różnią się od siebie na poziomie materiału
genetycznego, tak jak ludzie różnią się układami linii papilarnych
popularnie nazywanymi odciskami palców (stąd nazwa tej
metody, fingerprinting).
Cechy efektywnej metody typowania szczepów:
• Wysoki stopień dyskryminacji
• Powtarzalność
• Zdolność do typowania wszystkich szczepów
• Prosta w użyciu
• Szybkość
• Mało kosztowna
• Wystandaryzowana
„Złoty standard”
w typowaniu mikroorganizmów”
Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA połączona z elektroforezą pulsową
(RFLP-PFGE)
Technika ta polega na poddaniu nienaruszonego totalnego
DNA genomowego trawieniu enzymatycznemu z zastosowaniem
restryktaz.
Liczba i wielkość otrzymanych fragmentów DNA
determinowana jest przez długość sekwencji rozpoznawanej
przez określony enzym restrykcyjny oraz charakter trawionego
DNA (% zawartości par zasad GC w stosunku do AT).
W wyniku trawienia otrzymujemy fragmenty DNA
o wielkościach od ok. 0.5 kpz do 1000 kpz.
Rozdziału otrzymanych fragmentów restrykcyjnych
dokonuje się w agarozowej elektroforezie pulsowej (ang.
PFGE – Pulsed Field Gel Elektrophresis).
Analiza polimorfizmu długości fragmentów
restrykcyjnych możliwa dzięki elektroforezie pulsowej
powoli staje się metodą standardową w epidemiologii
szpitalnej.
WADY
Trudna w wykonaniu, kosztowna, wymaga
skomplikowanej aparatury i zachowania stałych warunków
analizy.
Częste zachodzenie i pokrywanie się fragmentów
DNA o zbliżonej wielkości, co powoduje, iż otrzymany
obraz elektroforetyczny staje się trudny do interpretacji.
Otrzymane wzory restrykcyjne mogą również zostać
zafałszowane przez fragmenty pochodzące z plazmidowego
DNA, izolującego się łącznie z DNA chromosomalnym.
ZALETY
Wszystkie szczepy są typowalne.
Pozwala na
całkowitą dyskryminację
szczepów bakteryjnych.
Rybotypowanie
W związku z funkcją rybosomów w każdym organizmie, a
także ich kompleksową naturą, geny kodujące rRNA, ułożone w
operon rrn, obecne są we wszystkich organizmach bakteryjnych i są
wysoko konserwowane ewolucyjnie.
Geny te odpowiedzialne są za syntezę 16S, 23S i 5S rRNA. Ich
wysoka konserwacja przejawia się w sekwencji nukleotydowej, a także
w strukturze pierwszo- i drugorzędowej.
Geny kodujące poszczególne rodzaje rRNA rozdzielone są
regionami polimorficznymi, które charakteryzują się wysokim
zróżnicowaniem pod względem sekwencji i wielkości.
Rybotypowanie – c.d.
Te cechy genów rDNA czynią z nich dobry molekularny zegar
do studiów nad pokrewieństwem filogenetycznym, nawet odległych od
siebie organizmów.
Różnicowanie bakterii z zastosowaniem metod rybotypowania
można przeprowadzić przy użyciu różnych technik, z
wykorzystaniem głównie metod hybrydyzacyjnych lub PCR.
Komórka bakterii
Izolacja genomowego DNA
METODY HYBRYDYZACYJNE
 Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi.
 Elektroforeza i transfer rozdzielonych fragmentów DNA na filtr.
 Hybrydyzacja z sondą komplementarną do rDNA.
RFLP zhybrydyzowanego
z sondą rDNA (rrn loci)
rrn RFLP
METODY OPARTE NA TECHNICE PCR
METODY OPARTE NA TECHNICE PCR
 PCR regionu
zmiennego między rrsrrl rDNA.
 Elektroforetyczny
rozdział produktów
PCR.
 Obserwacja
produktów
wybarwionych
bromkiem
etydyny w świetle UV.
 PCR regionu
 Amplifikacja określonego fragmentu operonu zawierającego gen
kodujący 16S rRNA
rrn:
-regionu zmiennego pomiędzy genami
 Sekwencjonowanie
kodującymi 16S i 23S rRNA,
otrzymanych
-regionu zmiennego wewnątrz genu kodującego produktów PCR.
16S RNA,
-regionu zawierającego geny kodujące 16S i 23S
rRNA oraz fragment polimorficzny
pomiędzy nimi,
- regionu zawierającego geny kodujące tRNA.
 Trawienie otrzymanych produktów enzymami
restrykcyjnymi.
Polimorfizm długości
 Elektroforetyczny rozdział produktów PCR.
produktów PCR
 Obserwacja produktów wybarwionych
bromkiem etydyny w świetle UV.
ITS PCR
RFLP produktów amplifikacji regionów
operonu rrn
ARDRA
1. Nowak, A., Burkiewicz, A. and Kur, J.: PCR differentiation of
seventeen genospecies of Acinetobacter. FEMS Microbiol. Lett.
126 (1995) 181-188.
2. Kur, J., Burkiewicz, A., Zabłocka, A. and Gospodarek, E.:
Identification of Pseudomonas aeruginosa on the basis of
polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA spacer
polymorphisms. Acta Biochim. Polon. 44 (1995) 111-117.
3.
Kur, J., Burkiewicz, A., Samet, A. and Sienkiewicz, I.:
Identification of Serratia marcescens on the basis of Polymerase
Chain Reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms.
Acta Microbiol. Polon. 44 (1995) 219-225.
Amplifikacja znanych regionów genomu
połączona z analizą restrykcyjną (PCR/RFLP)
Jako cel molekularny w łańcuchowej reakcji polimerazy stosuje
się fragment DNA specyficzny dla danego gatunku lub kilku gatunków
spokrewnionych o podobnym znaczeniu klinicznym.
Uzyskane produkty amplifikacji można następnie poddać
trawieniu enzymami restrykcyjnymi. W wyniku restrykcyjnego cięcia
produktów PCR otrzymuje się specyficzny polimorfizm długości
fragmentów restrykcyjnych dla danego DNA (RFLP).
Połączenie obu technik (PCR i RFLP) pozwala na różnicowanie
blisko spokrewnionych organizmów lub szczepów. Wybór
odpowiedniej restryktazy jest podyktowany przez charakter produktu
amplifikacji.
Amplifikacja fragmentu genu recA Acinetobacter sp.
M - marker wielkości DNA
(501, 489,404, 331, 242,
190, 147, 111 i 110 pz);
K - kontrola negatywna
reakcji;
1,7, 12,15, 16,17 - produkty
PCR otrzymane na
matrycach szczepów
Acinetobacter sp.
Amplifikacja fragmentu genu recA dla sześciu genotypów Acinetobacter.
Elektroforogram w 2% żelu agarozowym.
Elektroforogram produktów
amplifikacji referencyjnych
szczepów Acinetobacter trawionych
endonukleazą restrykcyjną Tsp5091.
M – marker wielkości DNA
(501,489,404,331,242,190,147,11 i 110 pz);
Numery studzienek odpowiadają
produktom PCR otrzymanym dla szczepów
referencyjnych
Elektroforogram produktów
PCR trawionych endonukleazą
Tsp5091 klinicznych szczepów
Acinetobacter.
M – marker wielkości DNA
(501,489,404,331,242,190,147,11 i
110 pz)
Nowak, A. and Kur, J.: Genomic species typing of
acinetobacters by polymerase chain reaction amplification
of the recA gene. FEMS Mikrobiol. Lett. 130 (1995) 327-332.
Nowak, A. and Kur, J.: Differentiation of seventeen
genospecies of Acinetobacter by multiplex polymerase chain reaction
and rstriction fragment length polymorphism analysis. Mol. Cel.
Probes 10 (1996) 405-411.
Krawczyk, B., Lewandowski, K., Kur, J.: Comparative studies
of the Acinetobacter genus and the species identification method
based on the recA sequences. Mol. Cell. Probes 16 (2002) 1-11.
PCR fingerprinting
•
Istnieje wiele różnorodnych metod PCR fingerprinting, ale
zasadniczo ich wspólnym celem jest powielenie polimorficznego
regionu DNA w reakcji PCR z zastosowaniem odpowiednio dobranych
starterów.
•
Jedna ż metod PCR fingerprinting wykorzystuje istnienie
repetytywnych sekwencji w genomach mikroorganizmów (bakterii,
grzybów i pasożytów). Sekwencje te charakteryzują się określoną
długością i są szeroko rozpowszechnione w genomie. U bakterii zostały
one najwcześniej wykryte i dobrze scharakteryzowane dla Escherichia
coli i Salmonella typhimurium. Przykładem tego typu sekwencji są
REP (ang. Repetitive Chromosomal Elemets) o długości 38 pz i ERIC
(ang. Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) o długości 124127 pz, występujące u bakterii Gram ujemnych.
Samet, A., Bronk, M., Hellmann, A., Kur, J. (1999) Isolation and epidemic
logical study of vancomycin -resistant Enterococcus faecium from patients
of a Haematological Unit in Poland. J. Hosp.Intec.41. 137-143.
AFLP (ang. Amplified Fragment Length
Polymorphism)
AFLP, łączy w sobie dwie metody:RFLP i selektywną amplifikację PCR.
Strategia metody złożona jest z czterech podstawowych etapów:

trawienie totalnego DNA komórkowego z zastosowaniem dwóch
racjonalnie dobranych enzymów restrykcyjnych;

reakcja ligacji otrzymanych fragmentów z odpowiednio
zaprojektowanymi adaptorami;

selektywna amplifikacja produktów ligacji z zastosowaniem
dwóch starterów homologicznych do sekwencji adaptor-miejsce
restrykcyjne;

elektroforeza produktów amplifikacji i autoradiografia
otrzymanych rozdziałów elektroforetycznych.
W odróżnieniu od metod rybotypowania i analizy RFLP produktów
PCR, AFLP opiera się na analizie całego genomu bakteryjnego.
Zaletami metody AFLP są powtarzalność i wysoki stopień
dyskryminacji badanych organizmów.
AFLP okazała się niezmiernie przydatnym narzędziem
taksonomicznym ze względu na możliwość komputerowej analizy
otrzymanych wyników oraz stworzenia na ich podstawie
komputerowej bazy danych.
Jednakże, AFLP nie jest użyteczna w szybkiej identyfikacji
szczepów, ale jest niezmiernie przydatna w studiach dotyczących
fundamentalnych pytań odnośnie pokrewieństwa klonalnego
szczepów.
...cdn
ADSRRS fingerprinting (ang. Amplification of
DNA Surrounding Rare Restriction Sites)
Masny, A. and
Płucienniczak, A. (2001)
Fingerprinting of bacterial
genomes by amplification
of DNA fragments
surrounding rare restriction
sites.
BioTechniques 31, 930936.
1.
Krawczyk, B., Lewandowski, K., Bronk, M., Samet, A.,
Myjak, P., Kur, J.: Evaluation of a novel method based on
amplification of DNA fragments surrounding rare restriction
sites (ADSRRS fingerprinting) for typing strains of
vancomycin-resistant Enterococcus faecium. J. Microbiol.
Meth. 52/3 (2003) 341-351.
2.
Krawczyk, B., Naumiuk, Ł., Lewandowski, K., Baraniak, A.,
Gniadkowski, M., Samet, A., Kur, J.: Evaluation and
comparison of random amplification of polymorphic DNA,
pulse field gel electrophoresis and amplification of DNA
fragments surrounding rare restriction sites methods for
typing Serratia marcescens outbreaks. FEMS Immunol. Med.
Microbiol. (2003).
Outbreak 1
M2
-
K
A1
B1
D1
Outbreak 2
G1
C
B
A
A2
C2
D2
Outbreak 1
Outbreak 3
A3
B3
D3
-
M2 K
a1
b1
c1
d1
Outbreak 2
e1
f1 a2 b2
c2
Outbreak 1
Outbreak 3
d2
a3 b3
c3
d3
e3 M1
M
a1
b1
c1
d1
Outbreaak 2
e1
f1
a2
b2
c2
Outbreak 3
d2
a3
b3
c3
d3
e3
Zadaniami na najbliższą przyszłość dla
bakteriologii klinicznej wydają się być:
(1)
wprowadzanie nowych technik mikrobiologicznych
i nowych podłóż wybiórczych dla szybkiej identyfikacji
bakterii endemicznych (wywołujących zakażenia szpitalne),
a także szybkich testów różnicujących z ustaleniem wzorca
oporności;
(2) stworzenie ośrodków referencyjnych zajmujących się
drobnoustrojami mającymi zasadnicze znaczenie w
zakażeniach szpitalnych (ustalanie genotypów szczepów
endemicznych);
(3)
wprowadzanie nowych technik mikrobiologicznych
służących do bezpośredniego wykrywania drobnoustrojów z
materiałów diagnostycznych w rutynowej praktyce (np.,
PCR);
(4)
badania technikami genetyki molekularnej izolatów
w celu identyfikacji szczepów endemicznych
występujących w szpitalu (regionie).
Fili_P
Dziękuję
za uwagę.
Józef Kur
[email protected]
Katedra Mikrobiologii
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej,
80-952 Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12.