komórki macierzyste - Postępy Biologii Komórki
advertisement
POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 42 2015 NR 3 (417–430) KOMÓRKI MACIERZYSTE – ROZPOZNAWANIE ORAZ ZNACZENIE W HOMEOSTAZIE PŁUC STEM CELLS – RECOGNITION AND SIGNIFICANCE IN LUNG HOMEOSTASIS Mateusz BICZYSKO1, Wiesława BICZYSKO2 Szpital Kliniczny im. Heliodora Święcickiego Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu 2 Katedra i Zakład Patomorfologii Klinicznej Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu 1 Streszczenie: Płuco jest narządem w znacznym stopniu narażonym na uszkodzenia przez toksyczne, fizyczne i biologiczne czynniki zewnętrzne. Utrzymanie integralności tkanek płuc jest wielkim wyzwaniem dla organizmu ludzkiego. W odnowie populacji komórkowej biorą udział komórki niżej wyspecjalizowane i niżej zróżnicowane niż ich formy ostateczne budujące nabłonki i zrąb płucny. Ich identyfikacja, poznanie warunków potrzebnych dla rozwoju i potencjału do różnicowania mogą być pomocne w klinicznym stosowaniu celem naprawy uszkodzonej tkanki. Komórki macierzyste, bo o nich mowa, występują w wielu niszach naszego organizmu jednak nie wszystkie są przystosowane do podjęcia odnowy tkanki płucnej. W pracy podjęto próbę przedstawienia fenotypów komórek macierzystych, występujących w różnych lokalizacjach, w różnych stadiach rozwoju człowieka. Różnią się one fenotypem oraz zdolnością różnicowania w odpowiednio szersze lub węższe populacje komórkowe. W pracy wykonano porównanie komórek pluripotencjalnych i tkankowo specyficznych komórek macierzystych. Przedstawiono charakterystykę molekularną grup komórek biorących udział w odnowie tkanki płucnej. Słowa kluczowe: komórki macierzyste, tkanka płucna, różnicowanie, fenotyp Summary: Lung is an organ that is highly exposed for toxic, physical and biological external factors that cause trauma. Maintaining the integrity of lung tissue is a great challenge for human organism. Less specialized and less differentiated cells take part in renewal of cell population forming final morphological structure of various lung epithelia and stroma. Their identification and knowledge about environment necessary for its development as well as definig potential for differentiation might be helpful in clinical use in repair of damaged tissue. Stem cells can be found in several niches located in our organism however not all of them have the potential to repair lung tissue. In 418 M. BICZYSKO, W. BICZYSKO this paper we tried to describe the phenotype of the stem cells, that occupy different locations, in different states of human development. These cells vary in case of their phenotype and potential to differentiate into wider or narrower cell populations. In this paper we compared pluripotent cells and tissue-specific stem cells. We review progress in molecular characterization of groups of stem cells that take part in lung tissue repair. Key words: stem cells, lung tissue, differentiation, phenotype WSTĘP Od dawna ludzie interesują się tematem komórek macierzystych. Już pod koniec XIX wieku badacze próbując wytłumaczyć fenomen naprawy organów ciała ludzkiego zastanawiali się nad możliwością istnienia komórek mogących dać początek innym, obwodowym, wysoko wyspecjalizowanym narządom i tkankom[8]. Płuca są jednym z narządów najbardziej narażonych na działanie egzogennych substancji toksycznych i czynników zakaźnych z racji wielkiej powierzchni z jaką mają kontakt ze światem zewnętrznym. Łączna powierzchnia wymiany gazowej pęcherzyków płucnych u dorosłego człowieka to około 70m2 [27], co w połączeniu z wciąż rosnącym zanieczyszczeniem środowiska wszelkiego rodzaju dymami i pyłami stawia ludzki układ oddechowy przed trudnym zadaniem utrzymania integralności, i zachowania funkcji narządu [17]. Stała i dynamiczna utrata zasobów tkankowych wymaga aktywności wielu linii komórkowych prowadzących do odnowy. Jednym z największych czynników ryzyka chorób płuc jest narażenie na dym papierosowy oraz dymy ze spalania węgla (benzopiren). Mimo spadku odsetka ludzi dorosłych uzależnionych od nikotyny z 43% w 1965 roku do około 18% w 2012 roku palenie jest wciąż znaczącym populacyjnym problemem zdrowotnym [9]. Dym papierosowy ma negatywny wpływ na zmiany w górnych i dolnych drogach oddechowych, jak i na końcowe ich odcinki – pęcherzyki płucne. Zmiany w tchawicy, czy oskrzelach dużego kalibru które charakteryzują się powiększeniem gruczołów śluzowych i przybytkiem komórek kubkowych w nabłonku pokrywającym drogi oddechowe, prowadzą do znacznego wzrostu produkcji śluzu i zaburzeń w jego usuwaniu [24]. Kaszel, obfita plwocina, skłonność do infekcji to cechy rozwijających się przewlekłych zapaleń oskrzeli, którym towarzyszą zmiany struktury komórek urzęsionych [22]. W takich warunkach dochodzi do przerostu błony mięśniowej oraz nadreaktywności oskrzeli czego efektem jest zwężenie światła dróg oddechowych. Zmiany w oskrzelikach o małej średnicy prowadzą do szerzenia się zmian w kierunku obwodowym co w konsekwencji powoduje włóknienie przegród pęcherzyków płucnych i upośledzenie wymian gazowych w obrębie bariery krew-powietrze. Obserwujemy metaplastyczne przekształcanie się komórek Clara w komórki kubkowe wydzielające śluz [7]. Napływ makrofagów płucnych KOMÓRKI MACIERZYSTE – ROZPOZNAWANIE ORAZ ZNACZENIE W HOMEOSTAZIE... 419 poprzez swój czynnościowy związek z komórkami nabłonka pęcherzykowego II typu wpływa na powstawanie odczynu zapalnego połączonego ze stałą aktywacją pneumocytów typu II. W rezultacie dochodzi do rozległych uszkodzeń nabłonka oskrzelowego. U części chorych widoczne są odczyny regeneracyjne komórek pluripotencjalnych – małych, wielkości małego limfocyta o centralnie położonych jądrach, skąpej cytoplazmie z nielicznymi mitochondriami, pojedynczymi kanałami szorstkimi siateczki endoplazmatycznej, licznymi wolnymi polirybosomami. Opisane komórki różnią się od limfocytów obecnością pojedynczych półdesmosomów od strony błony podstawnej i pojedynczych złączy typu przylegania [obserwacje własne]. Zasiedlają one błony podstawne. Dochodzi także do znacznego przybytku pneumocytów II typu. Opisany schemat zmian dotyczy także genetycznie uwarunkowanych chorób takich jak: mukowiscydoza i zespoły dyskinezy rzęsek [22, 24]. Opisywane zmiany drastycznie zmniejszają średnicę małych dróg oddechwoych. Dym tytoniowy ma wpływ destrukcyjny także na tkankę śródmiąższową płuc. Rozedma charakteryzująca się zniszczeniem powierzchni wymiany gazowej, dotyczy oskrzelików oddechowych, przewodów pęcherzykowych oraz samych pęcherzyków. W ich ścianach dochodzi do patologicznych perforacji czego wynikiem jest powstawanie nienaturalnie dużych przestrzeni powietrznych. Wiąże się to z utratą powierzchni wymian gazowych [11]. Ważną rolę w patogenezie odgrywają makrofagi płucne których dużą ilość zawierały popłuczyny oskrzelowe palaczy. Wydzielane z lizosomów proteazy powodują enzymatyczną destrukcję włókien kolagenowych i elastynowych niszcząc ściany oskrzeli [25]. Poszerzanie się przestrzeni wypełnionych powietrzem i stała utrata kompleksów pęcherzykowych powodują zaniki zarówno elementów nabłonkowych jak i śródbłonkowych. W połączeniu z ograniczoną możliwością naprawy tkanki płucnej u dorosłego człowieka prowadzi to do nieodwracalnych zmian strukturalnych. CHARAKTERYSTYKA KOMÓREK MACIERZYSTYCH Komórki macierzyste dzięki swej nieograniczonej możliwości odnowy mogłyby zmienić rokowanie w stosunku do wielu chorych, co sprawia że są obiektem zainteresowania naukowców wszystkich dziedzin biologii i medycyny. Ściślejsze niż dotychczas określenie cech tych komórek, oraz potencjalne zastosowania kliniczne stanowią jedno z większych wyzwań współczesnej medycyny[15]. Ich możliwości nie ograniczają się jedynie do terapii licznych schorzeń, duże nadzieje budzi zastosowanie komórek multipotencjalnych jako modeli badań chorób oraz różnych strategii ich leczenia. Nie ulega wątpliwości, iż stanowią podstawę zachowania homeostazy i odnowy tkankowej, które ściśle wiążą się z zagadnieniami „choroby” oraz starzenia [19]. 420 M. BICZYSKO, W. BICZYSKO Najprostszą definicję komórek macierzystych przedstawił A. L. Kierszenbaum w podręczniku „Histology and cell biology. An introduction to pathology”. Brzmi ona: „komórki macierzyste to te charakteryzujące się: samoodnową, proliferacją i różnicowaniem”. Inne definicje komórek macierzystych są podobne. Identyfikuje się je jako niespecyficzne i niezróżnicowane komórki zapewniające źródło dla odbudowy tkanek w ciągu życia [14, 20, 29]. Wyróżniono także komórki macierzyste miejscowe/tkankowe, rozpoznawane w różnych organach na podstawie charakterystycznej lokalizacji, morfologii (także ultrastrukturalnej), oraz markerów biochemicznych. Jednoznaczna identyfikacja komórek macierzystych wymaga ich oddzielenia i oczyszczenia z zawiesiny komórkowej, oraz oznaczenia za pomocą specyficznych błonowych i cytoplazmatycznych markerów [13]. Tak otrzymane komórki mogą być dokładnie poznawane a później wykorzystane w celach klinicznych, podobnie jak stało się z multipotencjalnymi komórkami hematopoetycznymi, mającymi zastosowanie w coraz powszechniejszych przeszczepach szpiku [12, 23]. Dla wielu linii tkankowych a właściwie komórek pluripotencjalnych będących progenitorami dla narządowych nie skompletowano w pełni charakterystycznych markerów. Trudna jest ich izolacja i namnażanie [2]. Wyszukiwanie w tkance i oznaczanie komórek wykonuje się w oparciu o swoiste identyfikacyjne wyznaczniki komórek [13]. Wykonano wiele badań na zwierzętach i na materiałach pochodzących od ludzi z których wynika, że markery dla różnych narządowo swoistych typów komórek macierzystych różnią się [6, 13, 26]. Pomocne było wyszukiwanie komórek macierzystych izolowanych z różnych tkanek przy pomocy sorterów po barwieniu odczynnikiem Hoechst 33342 dla mikroskopu fluorescencyjnego [12, 18]. Izolowane tą techniką komórki macierzyste badano w większych populacjach stosując odpowiednie hodowle komórkowe z uwzględnieniem właściwego środowiska tkankowego w kierunku w którym się różnicują, oraz przeszczepiając je na modele zwierzęce. Hodowla wymaga poznania niezbędnych dla rozwoju czynników wzrostu a także warunków imitujących te panujące w środowisku gdzie komórki macierzyste naturalnie bytują. Umiejętność hodowli komórek macierzystych in vitro jest niezbędna dla możliwości oceny potencjalnego zastosowania terapeutycznego. Pomimo że sprawia to wciąż wiele kłopotów technicznych, prowadzone są hodowle coraz większej liczby rodzajów linii komórkowych. Wyróżnione zostały dojrzałe komórki macierzyste uzyskane z narządów i tkanek dorosłych osobników z których niektóre były tkankowo specyficzne [4, 14, 27, 28]. Porównano je z komórkami macierzystymi embrionalnymi z których się wywodzą [5, 13, 15, 28]. Najszerzej akceptowaną definicją komórek macierzystych jest ich niespotykana zdolność do produkcji identycznych komórek potomnych, a także do różnicowania i dojrzewania w kierunku komórek narządowo specyficznych [A. L. Kierszenbaum, 20, 27]. W związku z tym wyróżniono dwa typy podziału tych komórek. Pierwszy polega na podziale asymetrycznym którego wynikiem jest powstanie jednej komórki potomnej identycznej – do macierzy- KOMÓRKI MACIERZYSTE – ROZPOZNAWANIE ORAZ ZNACZENIE W HOMEOSTAZIE... 421 stej i drugiej ukierunkowanej na różnicowanie do konkretnej tkanki. Drugi typ to podział symetryczny którego celem jest zwiększanie puli komórek macierzystych a w wyniku którego powstają dwie bliźniacze, niezmienione i nieróżniące się komórki potomne [14]. Różne komórki mają różny potencjał do różnicowania się. Pod tym względem stosuje się podział na linie totipotencjalną, pluripotencjalną, multipotencjalną, oraz unipotencjalną. Komórki totipotencjalne mają zdolność do samodzielnego formowania całego organizmu włącznie z tkankami pozaembrionalnymi (łożysko), występują one (według aktualnej wiedzy) jedynie w zygocie [12, 28]. Komórki pluripotencjalne mogą dać początek wszystkim liniom komórkowym organizmu wywodzącym się z endodermy, mezodermy lub ektodermy i są reprezentowane przez embrionalne komórki macierzyste [21, 28]. Komórki o mniejszym potencjale różnicowania nazywamy multipotencjalnymi, zdolnymi kreować wiele typów komórek jednej linii komórkowej [1, 28]. Na samym końcu tej klasyfikacji znajdują się komórki unipotentne, które dają początek ściśle określonym typom komórek, jak na przykład komórki urzęsione [28]. Klasyfikacja komórek macierzystych jest skomplikowana. Znajdowano wiele różnych ich podtypów. Najbardziej prymitywne z nich nazywane są komórkami totipotencjalnymi, których cechą szczególną jest bycie prekursorem zarówno dla zarodka jak i łożyska. W fazie blastocysty wchodzą w kolejny etap rozwoju i stają się komórkami pluripotencjalnymi dającymi początek każdej tkance wywodzącej się z listków zarodkowych. Utraciły one jednak zdolność do formowania łożyska co świadczy o ich mniejszej uniwersalności. Sądzono, że w procesie gastrulacji wszystkie komórki tracą swoją pluripotencjalność stając się komórkami ukierunkowanymi na specyficzne linie komórkowe. W ostatnich latach dokonano próby identyfikacji macierzystych komórek pluripotencjalnych w tkankach dorosłego człowieka. Wyróżniono w ten sposób populacje takie jak m.in.: multipotencjalne dojrzałe komórki progenitorowe (MAPCs), multipotencjalne dojrzałe komórki macierzyste (MASCs), somatyczne komórki macierzyste (USSCs), czy bardzo małe zarodkowopodobne komórki macierzyste (VSELs). Ostatnie z wyżej wymienionych stanowią rezerwuar komórek pluripotencjalnych dla tkankowo swoistych komórek macierzystych w ludzkim organizmie które z nich powstają. Dla VSELs wykazano ekspresję genów typowych dla komórek pluripotencjalnych jak na przykład Oct4, czy NANOG [15]. IDENTYFIKACJA NARZĄDOWO SWOISTYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH Jak wykazały ostatnie doniesienia naukowe możliwa jest identyfikacja niezróżnicowanych komórek macierzystych w końcowych odcinkach ludzkich płuc. Miały one zdolność do samoodnowy i nieograniczonej proliferacji co zostało 422 M. BICZYSKO, W. BICZYSKO potwierdzone dzięki seryjnym przeszczepom do kolejnych biorców. Klonalny charakter oraz multipotencjalność – formowanie pełnowartościowej i w pełni funkcjonalnej tkanki płucnej pod postacią oskrzelików, pęcherzyków, czy naczyń płucnych dopełnia zestaw cech które powinna mieć komórka macierzysta[14]. Wykazano to w modelach zwierzęcych uszkadzając narząd oddechowy szczura, a następnie przeszczepiając ludzkie płucne komórki macierzyste. Kolejnym krokiem było oznaczenie w odnowionej tkance płucnej szczura ludzkich transkryptów dla nabłonków i naczyń co wiarygodnie potwierdziło ich pochodzenie. Opisano wiele grup komórek o różnej anatomicznej lokalizacji. Posiadały one niektóre cechy właściwe dla komórek macierzystych [4, 14, 16]. Udowodniono, że te komórki miały znaczny poziom ukierunkowania rozwoju i posiadały specyficzne funkcje. W ludzkich płucach są to na przykład komórki podstawne nabłonka tchawicy i dalszych odcinków dróg oddechowych. Niewątpliwie ich rola w utrzymaniu homeostazy i struktury w płucach jest wielka, nie są one jednak klonalne a ich różnicowanie ograniczone jest do komórek nabłonkowych. Oznacza to kolejny etap różnicowania i wyklucza ich przynależność do jednej z klas komórek macierzystych. Komórki Clara występujące w nabłonku od tchawicy po drobne oskrzeliki ulegają podziałom i biorą czynny udział w naprawie oraz odnowie struktur płucnych. W drogach oddechowy jedną z ich ról jest produkcja oraz sekrecja mucyn co jest zgodne ze zróżnicowanym charakterem komórek i nie można nazywać ich macierzystymi. Jedną z cech którymi charakteryzują się komórki macierzyste oskrzelikowo-pęcherzykowe jest ekspresja markerów molekularnych typowych dla komórek Clara oraz równolegle nabłonkowych II typu pęcherzyków płucnych (białka surfaktantu) w hodowlach in vitro [4]. Progenitory nabłonka pęcherzyków płucnych którymi są pneumocyty II typu, mające zdolność do różnicowania się także w kierunku pneumocytów typu I co znaczy, że są mocno ograniczone w możliwościach dojrzewania w kierunku wielu linii komórkowych [3]. Pozwala to sądzić, że komórki podstawne nabłonka dróg oddechowych są ukierunkowane na różnicowanie określonych rodzin komórek w ograniczeniu do nabłonka dróg oddechowych. MEZENCHYMALNE KOMÓRKI MACIERZYSTE N. Gupta i wsp.[10] w swoim doświadczeniu zastosowali mezenchymalne komórki macierzyste bytujące w szpiku kostnym podając je bezpośrednio do przestrzeni powietrznych uszkodzonego płuca doświadczalnych myszy. Okazało się, że inicjowały one nie tylko odnowę funkcjonalnej tkanki ale także działały przeciwzapalnie. Stwierdzono ich oddziaływanie parakrynowe powodujące obniżenie poziomu TNFα, czy MIP-2 (ang. Macrophage Inflammatory Protein), oraz podwyższenie poziomu przeciwzapalnej IL-10. Myszom którym zaaplikowano KOMÓRKI MACIERZYSTE – ROZPOZNAWANIE ORAZ ZNACZENIE W HOMEOSTAZIE... 423 komórki macierzyste do płuc stwierdzono wyższą przeżywalność. Komórki te nie miały na powierzchni markerów oznaczanych w błonach komórek hematopoetycznych, jak CD45 czy CD11b, nie posiadały również antygenów CD34 i CD31. Z kolei w pracy D. Urbaniak-Kujdy i wsp.[26] wykazano obecność markerów na komórkach pobranych ze szpiku nazywanych mezenchymalnymi komórkami macierzystymi, podobnie jak w pracy N. Gupty[10]. Charakteryzowały się one fenotypem: CD44[+], CD105[+], CD166[+], CD73 [+], CD90 [+], CD44[+], CD117[+], Stro-1[+], CD14[-], CD34[-], CD45[-], CD11b[-], CD31[-], MHC II [-]. Antygen CD34 był oznaczany w błonach komórkowych mezenchymalnych komórek macierzystych pobranych z płuc płodu co sugerowało jego obecność w puli pierwotnych komórek macierzystych które tracą CD34 w procesie dojrzewania. Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku posiadały ponadto na swojej powierzchni cząstki adhezyjne. Brały one także czynny udział w tworzeniu mikrośrodowiska dla siebie, prekursorów hematopoetycznych a także komórek zrębu. Zaobserwowano wydzielanie szeregu cytokin takich jak IL1a, IL1b, IL6, IL7, IL8, IL11, IL14, IL15, M-CSF, GM-CSF, LIF (ang. Leukemia Inhibitory Factor), SCF (ang. Stem Cell Factor), Fit-3 (ang. Fetal liver tyrosine factor), TPO (ang. Thrombopoietin), przez niektóre komórki spoczynkowe, a przez inne po ich stymulacji. Cechowała je duża aktywność podziałowa oraz potencjał do różnicowania się w szereg komórek tkanki łącznej jak na przykład fibroblasty, adipocyty, komórki mięśniowe i inne. W pracy K. Bieback i wsp.[5] wykazano obecność mezenchymalnych komórek macierzystych w krwi pępowinowej pobranej od zdrowych noworodków. Jako wzorzec dla poszukiwanej komórki wykorzystano mezenchymalną komórkę macierzystą uzyskaną ze szpiku kostnego osoby dorosłej. Okazało się, że obie populacje były bardzo podobne zarówno pod względem ekspresji markerów na powierzchni jak również potencjału do różnicowania się w różne linie komórkowe. Wobec żadnej z tych dwóch grup nie wykazano obecności antygenów CD14, CD34, CD45, CD133, czy HLA II. Jako potwierdzenie podobnego fenotypu można uznać ekspresję markerów CD29, CD44, CD73, CD90 u obu grup komórek. Różniły się one nieznacznie procentem komórek prezentujących antygen CD105 – wykazano większe ich zagęszczenie w komórkach pobranych ze szpiku dorosłych, oraz antygen CD106 – dla którego większe zagęszczenie komórek wykazano wśród komórek z krwi pępowinowej. W pracy P.S. in‘t Anker i wsp. przedstawiono mezenchymalne komórki macierzyste uzyskane z różnych tkanek płodu pochodzącego z drugiego trymestru ciąży[13]. Stwierdzono, że niezależnie od tkanki z której pobierano komórki macierzyste, charakteryzowały się one podobnym fenotypem. (CD90[+], CD105[+], CD166[+], SH3[+], SH4[+].W tkance płucnej wykazano większe zagęszczenie komórek CD34[+], CD45[-], z kolei w szpiku gdzie znajdowano najwięcej mezenchymalnych komórek macierzystych większość z nich opisano jako CD34[+], 424 M. BICZYSKO, W. BICZYSKO CD45[+]. Mezenchymalne komórki macierzyste wyizolowane z płodowej śledziony w połowie charakteryzowały się ekspresją CD45[+] a w połowie brakiem tego antygenu na powierzchni. Pomimo podobnego zestawu markerów powierzchniowych komórki macierzyste znalezione w różnych organach różniły się pod względem potencjału do różnicowania w wyspecjalizowane linie komórkowe. OSKRZELIKOWO PĘCHERZYKOWE KOMÓRKI MACIERZYSTE We wcześniej wykonanych badaniach podjęto próbę identyfikacji komórek które nazwano oskrzelowo-pęcherzykowymi komórkami macierzystymi (BASCs). Autorzy [4] wykazali, że komórki te były odporne na uszkodzenia, posiadały zdolność do samoodnowy i multipotencjalny charakter wyrażający się różnicowaniem w kierunku komórek Clara oraz pneumocytów. Selekcję komórek rozpoczynano od poszukiwania przy pomocy immunofluorescencji tych które posiadały markery SP-C oraz CC10 będące charakterystycznymi dla pneumocytów i komórek Clara sądząc, że ich progenitory będą posiadały oba. Stosując kolejno sekwencje izolacji komórek posiadających charakterystykę typową dla komórek macierzystych oskrzelikowo-pęcherzykowych, autorzy zaproponowali fenotyp (Sca-1[+], CD45[-], PECAM [-], CD34[+]) odpowiadający komórkom posiadającym wspomnianie powyżej markery SP-C i CC10[4]. PŁUCNE KOMÓRKI MACIERZYSTE Istotne dla rozumienia różnic między komórkami macierzystymi o umiejscowieniu płucnym, a innymi mającymi wyższy poziom różnicowania są badania Kajstury [14]. Wykorzystano w nich marker c-kit aby wyróżnić komórki macierzyste od innych obecnych w pobranych wycinkach tkanki płucnej. Okazało się, że komórki c-kit (+) nie posiadały na swojej powierzchni markerów typowych dla linii hematopoetycznej (CD34[-], CD45[-], CD133[-]), czy mezenchymalnej (CD44[-], CD90[-], CD105[-]). Uznano więc, iż c-kit jest markerem swoistym dla komórek macierzystych płucnych. Komórki te nie posiadały białek, ani czynników transkrypcyjnych obecnych w innych komórkach tkanki płucnej (śródbłonka, nabłonka oraz mięśni gładkich) co potwierdzałoby ich prymitywny charakter i niski stopień różnicowania. Potwierdzenia ekspresji markera komórek macierzystych c-kit dokonywano przy pomocy metod qRT-PCR oraz Western blot. Ponadto istotne było wykrycie śladowych ale jednak diagnostycznych ilości transkryptów KOMÓRKI MACIERZYSTE – ROZPOZNAWANIE ORAZ ZNACZENIE W HOMEOSTAZIE... 425 informacyjnego RNA (mRNA) dla genów które kodowały białka takie jak CC10 (białko sekrecyjne komórek Clara), SP-C (białko C surfaktantu), czy CFTR (błonowy regulator przewodnictwa) i innych (TTF1, p63, CK5). Uznano to za cechę bardzo niskiego zróżnicowania nie nadającego badanym komórkom specyficznych funkcji, co wpisuje się w naturę poszukiwanych komórek macierzystych. Zaobserwowano również, że po stymulacji rozwoju tkanki płucnej sterydami (deksametazon) komórki te traciły charakterystyczny epitop c-kit, natomiast pojawiały się powierzchniowe markery nabłonkowe i naczyniowe. Widoczne było również dalsze ukierunkowywanie się dojrzewania tych komórek w wysoce wyspecjalizowane, przygotowywane do pełnienia określonej funkcji jak na przykład budowanie struktury ścian oskrzeli czy naczyń krwionośnych. NARZĄDOWE UWARUNKOWANIA KOMÓREK MACIERZYSTYCH Kajstura i wsp. [14] zastanawiali się czy komórki progenitorowe są uniwersalne dla różnych tkanek. W ich kolejnym eksperymencie wyizolowano komórki macierzyste z płuc oraz serca, a następnie przeszczepiono je do wymienionych narządów i dokonano obserwacji. Komórki płucne dawały początek prawidłowej tkance – oskrzelom, pęcherzykom i naczyniom po przeniesieniu ich do uszkodzonego płuca natomiast nie obserwowano takiego zjawiska po umiejscowieniu ich w sercu. Podobnie komórki macierzyste sercowe pozwalały na odnowę prawidłowej i funkcjonalnej tkanki jedynie po przeszczepieniu ich do uszkodzonego serca. Wynika z tego, że komórki macierzyste pobrane z tkanek obwodowych są już zaprogramowane na różnicowanie w kierunku specyficznych linii komórkowych w granicach w których naturalnie bytują i gdzie występują odpowiednie warunki dla ich rozwoju. Ich potencjał jest więc w pewnym stopniu ukierunkowany. ZDOLNOŚĆ ODTWARZANIA PULI NARZĄDOWEJ Autorzy cytowanych badań poszli krok dalej, obserwowali jak będzie reagowała pojedyncza klonalna komórka macierzysta płuc w uszkodzonym eksperymentalnie narządzie oddechowym. Okazało się, że również ona potrafiła generować kompletne i funkcjonalne jednostki strukturalne płuc. Co więcej po dokonaniu naprawy organu komórki macierzyste c-kit (+) były ponownie izolowane oraz przenoszone w liczbie pojedynczej do kolejnych biorców z dokonanym uszkodzeniem. Po zaobserwowaniu powtórnej odnowy i ponownym wykryciu komó- 426 M. BICZYSKO, W. BICZYSKO rek c-kit(+) stwierdzono ponad wszelką wątpliwość, że komórki macierzyste płuc mają zdolność do zwiększania swojej własnej puli, czysto teoretycznie znaczy to iż ich linia jest nieśmiertelna [14]. Badano zachowanie kolonii komórkowych klonalnych i nieklonalnych. Nie zaobserwowano znaczących różnic w ich potencjale do odnowy tkanek. Obie grupy w podobnym stopniu tworzyły struktury płucne miały więc zdolność do różnicowania się w wyspecjalizowane komórki, jak również obie grupy potrafiły dokonywać podziałów symetrycznych, co umożliwia rozrost puli komórek macierzystych. Jest to niezmiernie ważne z punktu widzenia klinicznego. Niemożliwym, a na pewno bardzo mało efektywnym wydaje się być stosowanie w terapii jedynie klonalnych linii komórkowych. Dużo łatwiej jest w tym celu używać mieszanek jednego i drugiego typu zwłaszcza gdy nie zmniejsza to ich potencjału regeneracyjnego jako grupy [14]. PODSUMOWANIE Komórki macierzyste są rodziną rzadko spotykaną w tkankach, dla przykładu na jedną komórkę progenitorową w pęcherzyku płucnym przypada 30 000 innych komórek. Zauważono większą ich kondensację w oskrzelikach gdzie występowała 1 komórka macierzysta na 6000 innego typu. Stwierdzono również znacznie większe ich ilości w małych drogach oddechowych w porównaniu z dużymi oskrzelami czy tchawicą [14]. Podsumowując przytoczone prace można uznać, że w dzisiejszych czasach możliwa jest coraz sprawniejsza i dokładniejsza identyfikacja komórek macierzystych. Okazało się, że komórki wspomagające odnowę uszkodzonej tkanki płucnej pochodzą nie tylko z nisz obecnych w drogach oddechowych ale z innych miejsc organizmu ludzkiego. Charakteryzują się one dużym zróżnicowaniem pod względem swojej morfologii oraz potencjałów do różnicowania się w zależności od lokalizacji, oraz okresu rozwoju ontogenetycznego. Rozwinęły się także techniki pozwalające na identyfikację komórek macierzystych co po izolacji umożliwia ich ocenę i selekcję. Otwiera to nowe pole badań nad przydatnością komórek macierzystych w procesach naprawy uszkodzonego płuca. Dla łatwiejszego wykorzystania tekstu pracy sporządzono tabele: - + Stro-1 c-kit - SP-C Sca-1 MHC II MHC I CD90 + + + + - + - + + - CD45 CD73 (SH3, SH4) - - + + + - + - - - - - + + - - + + CD44 - - - + CD34 CD31 CD29 CD166 CD14 CD133 CD11b CD117 CD106 CD105 CC10 - + + + - + - + - - + + Mezenchymalne Mezenchymalne Mezenchymalne Mezenchymalne Oskrzelikowo-pęcheKomórki maciekomórki macierzyste komórki macierzyste komórki macierzyste komórki marzykowe komórki marzyste płuc [14] tkanek płodu w II szpiku kostnego oso- szpiku kostnego cierzyste z krwi cierzyste (BASC) [4] osoby dorosłej [26] pępowinowej [5] trymestrze ciąży [13] by dorosłej [10] TABELA 1. Markery grup komórek opisanych w pracy TABLE 1. Markers of groups of cells described in the article KOMÓRKI MACIERZYSTE – ROZPOZNAWANIE ORAZ ZNACZENIE W HOMEOSTAZIE... 427 428 M. BICZYSKO, W. BICZYSKO ROZWINIĘCIE SKRÓTÓW CC10 – białko sekrecyjne komórek Clara CD105 – endoglina CD106 – naczyniowe białko adhezyjne (VCAM-1) CD117 – receptor c-kit CD11b – αM integryna CD133 – prominina 1 CD14 – antygen monocytów CD166 – aktywowana cząstka adhezyjna leukocytów (ALCAM) CD29 – β1 integryna CD31 – płytkowo-śródbłonkowa cząstka adhezyjna (PECAM) CD34 – antygen hematopoetycznych komórek progenitorowych CD44 – samonaprowadzająca komórkowa cząstka adhezyjna CD45 – wspólny antygen leukocytów (LCA, PTPRC) CD73 (SH3,SH4) – 5’-nukleotydaza CD90 – antygen tymocytów (Thy-1) c-kit – czynnik komórek macierzystych MHC I – główny układ zgodności tkankowej klasy I MHC II – główny układ zgodności tkankowej klasy II Sca-1 – antygen komórek macierzystych SP-C – ludzkie białko surfaktantu C Stro-1 – marker mezenchymalnych komórek macierzystych LITERATURA [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] Ahrari I, Zarandi N, Purhabibi, Maharlooei MK et all. Adipose Tissue Derived Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Can Be Isolated Using Serum-free Media, Iran Red Crescent Med J. 2013 Apr; 15(4): 324-329. Baer PC, Geiger H. Adipose-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells: Tissue Localization, Characterization, and Heterogeneity, Stem Cells International Volume 2012 (2012), Article ID 812693. Barkauskas CHE, Cronce MJ, Rackley CR et all. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung, J Clin Invest. 2013 Jul 1; 123(7): 3025-3036. Bender KCF, Jackson EL, Woolfenden AE et all. Identification of Bronchioalveolar Stem Cells in Normal Lung and Lung Cancer, Cell, 17 June 2005; 121(6): 823-835. Bieback K, Kern S, Klüter H et all. Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood, Stem Cells. 2004; 22(4): 625-34. Bourin P, Bunnell BA, Casteilla L et all. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT), The Journal of Cell Therapy, June 2013; 15(6): 641-648. Curran DR, Cohn L. Advances in Mucous Cell Metaplasia, A Plug for Mucus as a Therapeutic Focus in Chronic Airway Disease, Am J Respir Cell Mol Biol. 2010 Mar; 42(3): 268-275. Falanga V. Stem Cells in Tissue Repair and Regeneration, Journal of Investigative Dermatology (2012); 132: 1538-1541. Fiore MC, Schroeder SA, Baker TB. Smoke, the Chief Killer – Strategies for Targeting Combustible Tobacco Use, N Engl J Med 2014; 370: 297-299 January 23, 2014. KOMÓRKI MACIERZYSTE – ROZPOZNAWANIE ORAZ ZNACZENIE W HOMEOSTAZIE... 429 [10] Gupta N, Su X, Popov B et all. Intrapulmonary Delivery of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Survival and Attenuates Endotoxin-Induced Acute Lung Injury in Mice, The Journal of Immunology August 1, 2007; 179(3): 1855-1863. [11] He Z, Chen P, Chen Y et all. Comparison between cigarette smoke-induced emphysema and cigarette smoke extract-induced emphysema, Tob Induc Dis. 2015; 13(1): 6. [12] Herzog EL, Chai L, Krause DS. Plasticity of marrow-derived stem cells, Blood, 15 November 2003; 102(10). [13] in’t Anker PS, Noort WA, Scherjon SA et all. Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar immunophenotype but a heterogeneous multilineage differentiation potential, Haematologica. 2003 Aug; 88(8): 845-52. [14] Kajstura J, Marcello R, Sean RH et all. Evidence for Human Lung Stem Cells, N Engl J Med. 2011 May 12; 364(19): 1795-1806. [15] Kim Y, Jeong J, Kang H et all. The molecular nature of very small embryonic-like stem cells in adult tissues, Int J Stem Cells. 2014 Nov; 7(2): 55-62. [16] Kotton DN, Fine A. Lung stem cells, Cell and Tissue Research, January 2008; 331(1): 145-156. [17] Leem JH, Kim ST, Kim HC. Public-health impact of outdoor air pollution for 2(nd) air pollution management policy in Seoul metropolitan area, Korea, Ann Occup Environ Med. 2015 Feb 27; 27: 7. [18] Mayle A, Luo M, Jeong M et all. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells, Journal of the International Society for Advancement of Cytometry, January 2013; 83A(1): 27-37. [19] Orive G, Cobos R, Gorriti J et all. Drug delivery technologies and stem cells for tissue repair and regeneration, Curr Pharm Biotechnol. 2015; 16(7): 646-54 [20] Pastrana E, Silva-Vargas V, Doetsch F. Eyes Wide Open: A Critical Review of Sphere-Formation as an Assay for Stem Cells, Cell Stem Cell, 6 May 2011; 8(5): 486-498. [21] Patterson M, Chan DN, Ha I et all. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny, Cell Research (2012); 22: 178-193. [22] Piorunek T. Kompleksowa ocena zaawansowania zmian w układzie oddechowym u dorosłych chorych na mukowiscydozę na podstawie badań klinicznych, mikrobiologicznych i histopatologicznych, Rozprawa habilitacyjna, Wydawnictwo Naukowe Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego, 2013. [23] Raimondi R, Tosetto A, Oneto R et all. Validation of the Hematopoietic Cell Transplantation-Specific Comorbidity Index: a prospective, multicenter GITMO study, August 9, 2012; Blood: 120(6). [24] Seget M. „Ocena zmian w błonie śluzowej oskrzeli u chorych z zespołem dyskinezy rzęsek”, Rozprawa doktorska, UMP, 2007. [25] Szabari MV, Tolnai J, Maár BA et all. Lung structure and function in elastase-treated rats: A follow-up study, Respir Physiol Neurobiol. 2015 Apr 18. [26] Urbaniak-Kujda D. Wołowlec D, Tomaszewska-Toporska B. Mezenchymalne komórki macierzyste: ich biologia i perspektywy zastosowań klinicznych, Acta Haematologica Polonica, 2005; 36: 2. [27] Warburton D, Perin L, De Filippo R et all. Stem/Progenitor Cells in Lung Development, Injury Repair, and Regeneration, Proc Am Thorac Soc. 2008 Aug 15; 5(6): 703-706. [28] Weiss DJ, Bertoncello I, Borok Z. Stem Cells and Cell Therapies in Lung Biology and Lung Diseases, Proc Am Thorac Soc, 8: 223-272, 2011. [29] Yong KW, Pingguan-Murphy B, Xu F et all. Phenotypic and Functional Characterization of LongTerm Cryopreserved Human Adipose-derived Stem Cells, Sci Rep. 2015; 5: 9596. Redaktor prowadzący – Maciej Zabel Otrzymano: 10.05.2015 Przyjęto: 18.05.2015 Mateusz Biczysko ul. Solskiego 43, 60-184 Poznań email: [email protected]
