Komórki macierzyste II. ród³a pochodzenia komórek macierzystych

Nr 11-12/2007
Komórki
macierzyste
– RodzajeAKTYWNY
i w³aœciwoœci
KWAS
FOLIOWY
– SK£ADNIK
KOSMETYKÓW
Komórki macierzyste
i w³aœciwoœci
Kaszel – Rodzaje
klasyfikacja
i leczenie
Komórki macierzyste II.
ród³a pochodzenia komórek macierzystych
Stem cells II.
Sources of stem cells
dr hab. n. med. Zdzis³awa Kondera-Anasz
student Robert Kubina
dr n. med. Aleksandra Mielczarek-Palacz
mgr Justyna Sikora
Katedra i Zak³ad Immunologii i Serologii, Œl¹ski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Kierownik Katedry i Zak³adu: dr hab. n. med. Zdzis³awa Kondera-Anasz
Streszczenie
W ostatnich latach obserwuje się rosnące zainteresowanie komórkami macierzystymi. Prowadzone badania mają na celu znalezienie materiału biologicznego przydatnego do izolacji tych komórek.
Obecnie komórki macierzyste do celów transplantacyjnych pobiera się ze szpiku kostnego, krwi obwodowej, skóry, wątroby, miazgi zębów. Można
pozyskać je również z krwi pępowinowej, płynu
owodniowego lub embrionów. Istnieją także doniesienia o izolacji komórek macierzystych z siatkówki
i rogówki oka, macicy, mięśnie szkieletowych,
trzustki, a także nabłonka jelit. Komórki macierzyste muszą zostać następnie oddzielone od innych
komórek. Izolację można przeprowadzić przy użyciu cytofluorymetru przepływowego, a także metod
immunopowinowactwa.
Słowa kluczowe: źródła pochodzenia,
izolacja komórek macierzystych
W ostatnich latach obserwuje się rosnące zainteresowanie komórkami macierzystymi (ang. stem cells,
SC), wynikające ze zdolności tych komórek do samoodnawiania, oraz różnicowania w komórki potomne
o wielorakich funkcjach. Pozyskanie materiału biologicznego, opracowanie metod izolacji, a w konsekwencji zastosowanie kliniczne komórek macierzystych jest
celem prowadzonych badań. Obecnie do celów transplantacyjnych komórki macierzyste pobiera się ze szpiku kostnego, krwi obwodowej, skóry, wątroby, miazgi zębów. Można pozyskać je również z krwi pępowinowej, płynu owodniowego lub embrionów. Znane
są także doniesienia o izolacji komórek macierzystych
Abstract
In recent years there has been a significant rise
of scientific interest in stem cells. The objective of
current research is to find biological material suitable for the isolation of these cells. At present, stem
cells for transplants are taken from bone marrow,
peripheral blood, skin, liver and dental pulp. They
can also be obtained from umbilical cord blood,
amniotic fluid and embryos. Furthermore, stem
cells have been reported to be obtained from retina, cornea, uterus, skeletal muscle, pancreas and
intestinal epithelium. Such cells have to be subsequently separated from other cells. The isolation of
stem cells can be achieved with the use of flow cytometry and immunoaffinity methods.
Key words
words: sources of stem cells,
isolation of stem cells
z siatkówki i rogówki oka, macicy, mięśni szkieletowych, trzustki, a także nabłonka jelit.
Jednym z najlepiej poznanych źródeł komórek
ostny
macierzystych jest szpik kkostny
ostny. Potencjał samoodnawiania komórek szpiku jest praktycznie nieograniczony, mimo iż na około 15000 komórek szpiku przypada tylko jedna hemopoetyczna komórka macierzysta (hemopoietic stem cells, HSC). Wiadomo, że wraz
z wiekiem osobnika liczba tych komórek zmniejsza
się, a zwiększa się natomiast ryzyko uszkodzenia ich
DNA. Szpik kostny przeszczepiany jest głównie pacjentom z chorobami rozrostowymi układu krwiotwórczego oraz chorobami autoimmunologicznymi [1,2].
Farmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
#
Komórki macierzyste – ród³a pochodzenia komórek macierzystych
Kolejnym źródłem komórek macierzystych jest
obwodowa. W warunkach fizjologicznych krew
krew obwodowa
zawiera ok. 100-krotnie mniej komórek HSC niż
szpik, jednak liczbę tę można wielokrotnie zwiększyć,
podając czynniki wzrostu takie jak: granulocytarny
czynnik pobudzający wzrost kolonii (G-CSF), granulocytowo/makrofagowy czynnik pobudzający wzrost
kolonii (GM-CSF) oraz cytokiny. Czynniki wzrostowe
powodują uwolnienie komórek hematopoetycznych ze
szpiku do krwi. Po stymulacji komórki HSC stanowią od 5 do 10% wszystkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Przeszczep komórek macierzystych krwi obwodowej jest mało inwazyjny i nie
wymaga znieczulenia ogólnego. W konsekwencji jest
metodą bezpieczniejszą i mniej bolesną dla dawcy niż
przeszczep szpiku, co spowodowało, że stał się on
alternatywą dla transplantacji komórek macierzystych
szpiku kostnego [3,4,5].
Innym, dobrze poznanym źródłem, z którego można pobierać komórki macierzyste jest skóra
skóra. Olbrzymia zdolność regeneracji jej zewnętrznej warstwynaskórka świadczy o obecności komórek macierzystych. Są one stosunkowo łatwe do uzyskania, a ich
izolacja i hodowla nie wymaga stosowania technik
molekularnych. Do wyhodowania naskórka wystarczającego do pokrycia powierzchni równej powierzchni
ciała wystarczy skrawek surowej skóry o wielkości 1x1
cm. Naskórek podaje się na uszkodzoną skórę w formie zawiesiny komórek z dodatkiem fibrynogenu oraz
jonów wapnia [6].
Wątroba jest narządem, w którym nieustannie
zachodzą procesy regeneracyjne. Jej olbrzymia zdolność samoodnowy wynika z obecności dużej liczby
komórek macierzystych. Obecnie komórki te nie są
wykorzystywane w praktyce klinicznej. Trwają jednak
badania mające na celu opracowanie metod pobierania, izolacji oraz hodowli tych komórek. Być może
w przyszłości umożliwi to przeszczep wątrobowych
komórek macierzystych [7,8].
Nowym źródłem komórek macierzystych jest miazga zębów
zębów. Odkryto, że komórki te obecne są w centralnej części miazgi, wokół naczyń i nerwów. Komórki budujące miazgę zębów mlecznych stanowią pośredni typ komórek macierzystych i są stosunkowo
łatwe w pozyskiwaniu. Komórki te rosną szybko i mają
duży potencjał różnicowania w inne typy komórek.
Odkryto, że miazga pozyskana z jednego siecznego
zęba mlecznego zawiera 12-20 komórek macierzystych, a tracone naturalnie zęby mleczne mogą być
źródłem tych komórek [9,10].
$
Farmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
Nr 11-12/2007
Krew pępowinowa jest źródłem komórek macierzystych pochodzenia płodowego. Uzyskiwana jest ona
z łożyska lub z tętnicy pępowinowej. Badania wykazały, że komórki macierzyste pozyskane w ten sposób
wykazują znaczny potencjał proliferacyjny, posiadają
długie telomery, co umożliwia ich hodowlę i pasażowanie w celu namnożenia oraz różnicowania pozaustrojowego przez długi okres czasu. Komórki wyizolowane z krwi pępowinowej są łatwo dostępne, ich
pobieranie jest całkowicie bezpieczne dla dawcy, a ryzyko przeniesienia infekcji i rozwoju choroby „przeszczep przeciw gospodarzowi” (ang. graft-versus-host
GvH) jest mniejsze niż w przypadku szpiku kostnego, czy krwi obwodowej. Spowodowane to jest występowaniem komórek macierzystych w obecności niedojrzałych limfocytów T.
Krew pępowinowa zawiera dwie populacje komórek macierzystych: krwiotwórcze i niekrwiotwórcze.
Znajdujące się w niej krwiotwórcze komórki macierzyste stanowią 0,1-0,5% komórek jednojądrzastych.
Komórki te posiadają fenotyp odpowiadający hemopoetycznej komórce macierzystej. Komórki HSC pobrane z tętnicy pępowinowej charakteryzują się mniejszymi wymaganiami hodowlanymi oraz większą zdolnością do tworzenia kolonii niż komórki pobrane ze
szpiku czy krwi obwodowej. Ilość pozyskanych komórek macierzystych z krwi pępowinowej jest mała,
a wykonany przeszczep wiąże się z pewnym ryzykiem,
gdyż nie można wykluczyć, że zawarte w krwi komórki nie posiadają wad genetycznych. W krwi pępowinowej występują także komórki HPP-CFC (high proliferative potential colony forming cells), wykazujące
podobnie jak komórki HSC duży potencjał proliferacyjny, odpowiadający za sprawną odnowę hemopoezy. Natomiast do niekrwiotwórczych komórek macierzystych należą: mezenchymalne komórki macierzyste oraz komórki o właściwościach neurogennych
[11,12,13,14].
Komórki macierzyste płynu owodniowego są komórkami pochodzącymi od płodów. Mogą one zostać
pobrane od kobiety ciężarnej, podczas badań prenatalnych. Stanowią ok. 1% wszystkich komórek obecnych w płynie owodniowym. Uzyskane komórki są
multipotencjalne. Nie mogą zmieniać się one w komórki nowotworowe, a jednocześnie zdolne są do
przekształcania w wiele typów komórek. W warunkach optymalnych komórki te rosną bardzo szybko
i podwajają swą liczbę w ciągu 36 godzin. Przez okres
potrzebny do 250 podziałów komórkowych zachowują
prawidłową długość telomerów oraz prawidłowy kariotyp [15,16,17].
Nr 11-12/2007
Komórki macierzyste – ród³a pochodzenia komórek macierzystych
Embrionalne kkomórki
omórki macierzyste można izolować z wewnętrznej masy blastocysty embrionów
niewykorzystanych w leczeniu bezpłodności. W przypadku poronień, komórki te można również izolować z tkanek płodu, najczęściej z zawiązków jąder
lub jajników. Niestety z powodów etycznych embriony
ludzkie są materiałem o ograniczonej dostępności
[18,19,20].
Kolejnym etapem na drodze do klinicznego zastosowania komórek macierzystych jest ich izolacja. Komórki macierzyste pobrane ze szpiku, krwi obwodowej, czy krwi pępowinowej należy następnie oddzielić od innych komórek. Izolację można przeprowadzić przy użyciu cytofluorymetru przepływowego,
a także za pomocą metod immunopowinowactwa.
Częściej frakcje komórek macierzystych uzyskuje się
za pomocą cytofluorymetru przepływowego. Wykorzystuje się tu trzy sposoby izolacji komórek: izolację
z sorterem komórkowym, izolację z obszaru tzw. małych bezziarnistych limfocytów, a także izolację z kulkami paramagnetycznymi. Użycie cytofluorymetru
przepływowego sprzężonego z sorterami jest bardzo
szybką i wydajną metodą izolowania komórek macierzystych. Komórki jednojądrowe otrzymane po wirowaniu na gradiencie wielocukrów (ficoll-histopaque)
są znakowane przeciwciałami anty-CD34 i anty-c-kit
w obecności rodaminy 123. Kolejny sposób polega
na izolacji komórek macierzystych z obszaru tzw.
małych bezziarnistych limfocytów, komórek słabo
gromadzących rodaminę 123 oraz barwnik Hoechst
33342, czyli barwnik DNA. Do izolowania komórek
CD34+ z zawiesiny jednojądrzastych komórek krwiotwórczych stosuje się także kulki paraimmunomagnetyczne opłaszczone przeciwciałami anty-CD34. Wyznakowane w czasie inkubacji komórki CD34+ są
izolowane w polu magnetycznym na specjalnych kolumnach wypełnionych metalową siatką [technika
MACS], lub na kolumnach awidynowych. Metoda ta
pozwala uzyskać komórki CD34+, których czystość
przekracza 98% [21,22].
W przyszłości przeszczepy komórek macierzystych
zaspokoją wciąż rosnące zapotrzebowanie na tkanki
do transplantacji. Odnalezienie nowych źródeł komórek macierzystych, opracowanie metod ich izolacji oraz hodowli pozwoli na skuteczne przeprowadzanie przeszczepów tych komórek. Niesie to ze sobą
zmniejszenie możliwości odrzucenia przeszczepu oraz
powstania choroby „przeszczep przeciw gospodarzowi”. Komórki macierzyste wiążą się z olbrzymią nadzieją transplantologów na pozyskanie narządów do
przeszczepów.
Piœmiennictwo
1. Dimarakis I., Levicar N.: Cell culture medium composition and
translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem
Cells. 2006,24:1407-1408.
2. Sotiropoulou P. i wsp.: Cell culture medium composition and
translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem
Cells. 2006, 24:1409-1410.
3. Elli E. i wsp.: Successful treatment with t depleted autologous
peripheral blood stem cell transplantation of refractory chronic
autoimmune thrombocytopenic purpura. Haematologica 2007,
92: 7-8.
4. Jansen J. i wsp.:Transplantation of hematopoietic stem cells from
the peripheral blood. J. Cell. Mol. Med. 2005; 9(1): 37-50.
5. Hołowiecki J.: Współczesne wskazania do transplantacji szpiku.
Wsp. Onkol. 2001; 5(5): 201-209.
6. Alonso L., Fuchs E.: Stem cells of the skin epithelium. PNAS
2003, 100: 11830-11835.
7. Vessey C., de la Hall P.: Hepatic stem cells: a review. Pathology
2001;33: 130-140.
8. Zhang Y., Bai X., Huang C.: Hepatic stem cells: existence and
orgin. World J. Gastroenterol. 2005; 9: 201-204.
9. Wojtowicz A., Kisłowska-Syryczyńska M.: Miazga zębów mlecznych-potencjalne źródło komórek macierzystych. Możliwości
augmentacji kości w chirurgii stomatologicznej. Med Dydak
Wychow 2003; 35: 27-30.
10. Zhang W, i wsp.: Multilineage differentiation potential of stem
cells derived from human dental pulp after cryopreservation.
Tissue Eng 2006;12:2813-2823.
11. Stojko R., Witek A.: Krew pępowinowa – doskonałe źródło komórek macierzystych. Gin. Pol. 2005; 6: 491-497.
12. Kortyczko E., Dyduch A.: Krew pępowinowa - bezcenne źródło
komórek macierzystych. Wiad. Lek. 2003; 56(7-8): 359-361.
13. Kucia M., Drukała J.: Postęp w metodach hodowli komórek dla
transplantologii – komórki macierzyste. Post. Biol. Kom. 2002;
29(2): 257-268.
14. Stolarek M., Myśliwski A.: Komórki macierzyste krwi pępowinowej. Post. Biol. Kom. 2005; 32: 375-390.
15. Savarese T. i wsp.: Correlation of umbilical cord blood hormones
and growth factors with stem cell potential: implications for the
prenatal origin of breast cancer hypothesis.Breast Cancer Res.
2007;9:R29.
16. Kim S. i wsp.: Successful stem cell therapy using umbilical
cord blood-derived multipotent stem cells for Buerger’s disease and ischemic limb disease animal model. Stem Cells. 2006
24(6):1620-1626.
17. Prusa A. i wsp.: Oct-4-expressing cells in human amniotic fluid:
a new source for stem cell research? Hum Reprod.
2003;18(7):1489-1493.
18. Gearhart J.: New potential for human embryonic stem cells.
Science 1998; 282 (5391): 1061-1062.
19. Shamblott M., Axelman J., Littlefield J. i wsp.: Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro. PNAS
2001; 98(1): 113-118.
20. Thomson J. i wsp.: Embryonic stem cell lines derived for human
blastocystes. Science 1998; 282(5391): 1145-1147.
21. Ratajczak M: Biologia, metody izolacji oraz ex vivo ekspansji
wczesnych komórek krwiotwórczych człowieka. Implikacje kliniczne. Acta Haematol. Pol. 1997; 28(2), 132-137.
22. Kekarainen T. i wsp. Optimalization of immunomagnetic separation for cord blood-derived hemopoietic stem cells. BMC Cell
Biology 2006; 7: 30-40.
Farmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
%