Biologia M - Wydział Biologii

Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii
Biologia i Biologia medyczna II rok
Katedra Biologii Molekularnej
Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią
=================================================================
Ćwiczenie 5
Badanie aktywności promotora w fuzjach transkrypcyjnych z genami reporterowymi
lacZ oraz lux
Prowadzący: dr Barbara Kędzierska, mgr Aleksandra Urban,
mgr Joanna Morcinek-Orłowska
Celem ćwiczenia jest zbadanie aktywności promotora paxe dzięki zastosowaniu fuzji
transkrypcyjnych z genami reporterowymi lacZ oraz lux, a także sprawdzenie, jaki wpływ na
aktywność tego promotora mają mutacje wprowadzone w obrębie sekwencji „-10”.
Gen reporterowy to gen kodujący białko, którego obecność lub aktywność biochemiczną
można w łatwy sposób oznaczyć w komórce (in vivo) poprzez wykorzystanie technik
autoradiograficznych, spektrofotometrycznych lub bio- i chemiluminescencyjnych. Geny
reporterowe służą do określania wydajności ekspresji innych genów lub badania aktywności
różnych promotorów. W tym celu konstruuje się fuzje genowe lub operonowe (transkrypcyjne), w
których gen reporterowy jest przyłączony do innego genu przy zachowaniu zgodności ramki
odczytu lub też znajduje się pod kontrolą badanego promotora. Geny reporterowe zwykle kodują
białko, którego aktywność może być wykryta bezpośrednio (np. emisja światła), lub jest
rozpoznawana w wyniku reakcji enzymatycznej prowadzącej do powstania łatwo wykrywalnego
produktu (np. zmiana koloru).
Jednymi z najpowszechniej wykorzystywanych bakteryjnych genów reporterowych są geny:
lacZ, kodujący enzym β-galaktozydazę i lux, kodujący lucyferazę.
Enzym β-galaktozydaza, kodowany przez jeden z genów struktury operonu laktozowego
(lacZ) u Escherichia coli, hydrolizuje laktozę na dwa cukry proste: glukozę i galaktozę.
Ryc 1. Budowa operonu laktozowego.
Ryc 2. Reakcja hydrolizy laktozy przez β-galaktozydazę.
Istnieją chromogenne (sztuczne) analogi strukturalne laktozy hydrolizowane przez βgalaktozydazę. Najczęściej stosowane są ONPG (o-nitrofenyl-β-D-galaktopiranozyd) w hodowlach
płynnych oraz X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopiranozyd) w hodowlach stałych. βgalaktozydaza katalizuje rozkład ONPG, a jednym z produktów reakcji jest nitrofenol mający żółte
zabarwienie. Intensywność tego zabarwienia mierzy się spektrofotometrycznie. Aktywność βgalaktozydazy w komórce jest wprost proporcjonalna do ilości tego enzymu, a ilość ta jest wprost
proporcjonalna do ilości i aktywności translacyjnej odpowiednich transkryptów RNA. Mierząc
aktywność β-galaktozydazy w szczepach bakteryjnych zawierających odpowiednie fuzje można
wnioskować o wydajności ekspresji badanego genu lub aktywności badanego promotora.
Doświadczenia te należy oczywiście wykonywać w szczepach zawierających unieczynniony gen
lacZ, tak aby aktywne cząsteczki β-galaktozydazy powstawały tylko w oparciu o odpowiednią fuzję
genową lub operonową. Fuzje te mogą być ulokowane na chromosomie bakteryjnym (fuzje
jednokopijne) lub na plazmidzie (fuzje wielokopijne). Aktywność β-galaktozydazy mierzy się po
lizie komórek i oznacza w tzw. jednostkach Millera.
Ryc 3. Wzory strukturalne sztucznych substratów operonu laktozowego.
Ryc 4. Reakcja hydrolizy ONPG przez β-galaktozydazę.
Gen lux, kodujący lucyferazę, jest odpowiedzialny za bioluminescencję, czyli wytwarzanie
światła przez organizmy żywe takie jak np: bakterie Vibrio harveyi, robaczek świętojański Photinus
pyralis czy jamochłon morski Renilla reniformis. Proces ten zachodzi w wyniku enzymatycznej
reakcji chemicznej polegającej na utlenieniu tlenem atmosferycznym związku zwanego lucyferyną,
w obecności enzymu lucyferazy. Lucyferaza łącząc się z kofaktorem - zredukowanym
mononukleotydem flawinowym (FMNH2), przy pomocy tlenu, przekształca aldehyd w kwas
tłuszczowy, a sama ulega wzbudzeniu przechodząc na poziom wyższy energetycznie. Reakcja ta
wymaga udziału ATP i jonów magnezu. W wyniku utleniania powstaje cząsteczka w stanie
wzbudzonym - oksylucyferyna, której przejście do stanu podstawowego wiąże się z emisją kwantu
światła o długości fali 478-505nm. Kofaktor zostaje utleniony do mononukleotydu flawinowego
(FMN). Reakcja przebiega następująco:
FMNH2 + RCHO + O2 → FMN + RCOOH + H2O + hν (490nm)
Ryc 5. Schemat reakcji luminescencji.
Istotną zaletą tego procesu jest możliwość dokładnego pomiaru ilości wyemitowanych
fotonów za pomocą urządzenia zwanego luminometrem.
Ryc 6. Schemat przedstawiający wynik transformacji bakterii plazmidem kodującym geny operonu
lux (po lewej) oraz luminometr (po prawej).
Bakterie wykazujące bioluminescencję posiadają zestaw genów nazwany operonem lux.
Komórki bakterii emitują światło w wyniku syntezy białek kompleksu lucyferazy, kodowanych przez
pięć genów strukturalnych luxCDABE. Geny luxA i luxB kodują podjednostki α i β lucyferazy; luxC,
luxD i luxE to geny kompleksu reduktazy kwasów tłuszczowych.
Ryc 7. Struktura operonu lux.
Jednostka transkrypcyjna to fragment DNA, który ulega transkrypcji na cząsteczkę RNA;
może nią być pojedynczy gen lub operon, czyli zbiór wspólnie transkrybowanych i regulowanych
genów. W skład jednostki transkrypcyjnej wchodzą:
 promotor
 sekwencja genu/genów
 terminator
 sekwencje regulatorowe
Inicjacja transkrypcji u organizmów prokariotycznych polega na związaniu się polimerazy RNA z
odpowiednim odcinkiem matrycowego DNA, który zawiera informacje o miejscu startu transkrypcji
- tzw. promotorem. Podjednostka σ polimerazy rozpoznaje sekwencje „-35” i „-10” promotora, a
transkrypcja zaczyna się od nukleotydu +1.
Sekwencja consensus promotora - sekwencja najwyższej zgodności - sekwencja
nukleotydów o najwyższym prawdopodobieństwie wystąpienia określonej reszty nukleotydowej w
danej pozycji DNA (graficznie przedstawiona w postaci LOGO), powstała po optymalnym
nałożeniu na siebie wielu sekwencji promotorowych i odnalezieniu reszt występujących w danej
pozycji w większości analizowanych sekwencji. Przyjmuje się, że im silniejszy promotor, tym jego
sekwencja w pozycjach „-10” i „-35” jest bardziej zbliżona do sekwencji consensus (Ryc 8).
TATA-box
+1 – zawsze puryna
(G lub A)
16-18 pz
5-6 pz
paxe
paxe-mut
Ryc 8. Budowa typowego promotora bakteryjnego (na górze); LOGO dla sekwencji
konsensusowych promotora rozpoznawanego przez podjednostkę σ polimerazy RNA Escherichia
coli (pokazuje, które nukleotydy występują najczęściej w danych pozycjach promotora) (po
środku); sekwencja promotora paxe i paxe-mut (z zaznaczonymi na czerwono wprowadzonymi
mutacjami w obrębie rejonu „-10”) (na dole).
Materiały:
- szczepy E. coli: MG1655Δlac/pRS415/
MG1655 Δlac /pRS-axe
MG1655 Δlac /pRS-axe-mut/
MG1655 Δlac /pBBRlux/
MG1655 Δlac /pBBRlux-axe/
MG1655 Δlac /pBBRlux-axe-mut/
-
o plazmid pRS-axe jest pochodną plazmidu pRS415 i zawiera fuzję promotora paxe z
genem reporterowym lacZ; niesie oporność na ampicylinę.
o plazmid pBBRlux-axe jest pochodną plazmidu pBBRlux i zawiera fuzję promotora
paxe z genem reporterowym lux; niesie oporność na ampicylinę
o konstrukty axe-mut zawierają mutacje w rejonie „-10” promotora paxe,
pożywka LB z ampicyliną
chloroform
bufor Z (bufor fosforanowy z KCl, MgSO4, SDS i β-merkaptoetanolem)
substrat reakcji - roztwór ONPG (roztwór 0.4% O-nitrofenylo- β-galaktozydu w buforze
fosforanowym)
roztwór stopujący - 1M Na2CO3
Badanie aktywności β-galaktozydazy
Wykonanie:
1. Rozcieńczyć hodowle nocne (przygotowane przez prowadzącego) w 3 ml świeżej pożywki LB
w stosunku 1:10
2. Zmierzyć i zapisać wartości OD600
3. Do probówek zawierających 100 μl chloroformu i 1,5 ml buforu Z dodać po 100 μl
rozcieńczonej hodowli
4. Zawartość każdej z tych probówek wymieszać przez worteksowanie przez 15 sekund
5. Inkubować na stole przez 10 minut
6. Do każdej próbki dodać 400 μl roztworu ONPG i włączyć stoper
7. Inkubować na stole do momentu pojawienia się żółtej barwy roztworu
8. Dodać 1 ml 1M Na2CO3 i wyłączyć stoper. Zanotować dokładny czas, jaki upłynął od momentu
dodania ONPG
9. Po skończeniu eksperymentu zmierzyć wartość OD420 wszystkich prób
10. Obliczyć aktywność β-galaktozydazy (w jednostkach Millera) wg wzoru:
gdzie:
Abs600 – gęstość optyczna hodowli
Abs420 – absorbancja żółtego O-nitrofenolu
Abs550 – współczynnik zmętnienia roztworu
t = czas (w min.) od momentu dodania ONPG do momentu dodania Na2CO3
V = objętość hodowli bakteryjnej w próbce
Mapa plazmidu pRS415
Fragment DNA zawierający badany
promotor został wklonowany pomiędzy
miejsca restrykcyjne EcoRI i BamHI, tak
aby kontrolować ekspresję genu lacZ.
Badanie aktywności lucyferazy
Wykonanie:
1. Rozcieńczyć hodowle nocne (przygotowane przez prowadzącego) w 3 ml LB w stosunku 1:10
2. Zmierzyć i zapisać wartość OD600
3. Pobierać po 0.2 ml rozcieńczonej hodowli bakteryjnej do specjalnych szklanych probówek i
zmierzyć luminescencję za pomocą luminometru. Przeliczyć otrzymane wartości względem OD 600
bakterii
4. Zinterpretować otrzymane wyniki
m ob/rep
cm R
Mapa plazmidu pBBRlux
term inator
rep
luxE
pBBRlux
10851 bp
AP053 (prim er pBBRMCSseq1)
Spe I (3246)
luxB
Bam HI (3252)
AP052 (prim er pCS26s eq2)
luxC
luxA
luxD
Plazmidy pochodzące od
pBBRlux zawierają rejon
badanego
promotora
wklonowany
pomiędzy
miejsca restrykcyjne SpeIBamHI,
tak
aby
kontrolował on ekspresję
operonu lux.
Zagadnienia do samodzielnego przygotowania:
1. Teoria operonu na przykładzie operonu laktozowego; regulacja aktywności tego operonu.
2. Fuzje genowe i operonowe - sposoby konstrukcji i zastosowanie w badaniu ekspresji genów.
3. Geny reporterowe - przykłady, charakterystyka, wykorzystanie.
4. Gen lacZ - charakterystyka produktu tego genu, oznaczanie aktywności β-galaktozydazy,
podłoża, na których można testować aktywność β-galaktozydazy.
5. Gen lux jako gen reporterowy.
6. Budowa promotora bakteryjnego.
7. Inicjacja transkrypcji u bakterii.
Literatura:
1. Gajewski W. „Genetyka ogólna i molekularna”
2. Węgleński P. „Genetyka molekularna”
3. Kotełko K., Sedlaczek L., Lachowicz T.M. „Biologia bakterii”
4. Kunicki-Goldfinger W.J.H. „Życie bakterii”
5. Kur J. „Podstawy inżynierii genetycznej: teoria, ćwiczenia, testy”