Przegląd piśmiennictwa • Journal Club Biochemiczne markery

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2011 • Volume 47 • Number 1 • 101-106
Przegląd piśmiennictwa • Journal Club
Biochemiczne markery uszkodzenia mięśni
Do bezpośredniego uszkodzenia mięśni może dojść m.in.
w wyniku zmiażdżenia, porażenia prądem, uderzenia, nadmiernego wysiłku fizycznego następstwie może to prowadzić
do rozwoju zaburzeń zarówno metabolicznych, jak i mechanicznych. W wyniku uszkodzenia błony mięśniowej dochodzi
do uwolnienia składników komórki do przestrzeni pozakomórkowej. Głównymi objawami uszkodzenia mięśni są bóle
mięśniowe, obrzęk, skurcze. Te objawy są wynikiem bezpośredniego uszkodzenia tkanki, bądź zwiększonym metabolizmem komórek mięśniowych. Lokalne uszkodzenie tkanki
mięśniowej jest wynikiem degradacji sarkomeru będącego
podstawową jednostką czynnościową mięśni poprzecznie
prążkowanych. Uszkodzenie błony mięśniowej prowadzi do
uwolnienia składników cytoplazmatycznych, głównie składników białek kurczliwych i jonów.
Rabdomioliza może być wywołana przez szereg czynników, takich jak: leki, toksyny, endokrynopatie, złośliwy zespół neuroleptyczny, złośliwa hipertermia, oparzenia, zespół
zmiażdżenia, zaburzenia elektrolitowe, kwasica ketonowa,
nieketonowa śpiączka hiperosmolarna, ciężka niedoczynność i nadczynność tarczycy. Zaburzenia metabolizmu węglowodanów lub zwiększone zapotrzebowanie energetyczne
prowadzi do redukcji dostępności ATP i osłabienia aktywności ATP-azy Na-K. Skutkiem tego jest spadek oporności błony komórkowej, aktywacja kanałów potasowych i aktywacja
proteaz wewnątrzkomórkowych.
Surowicze markery bezpośredniego uszkodzenia mięśni, do
których należą enzymy i białka występują w szerokim zakresie zarówno w stanach patologicznych, jak i fizjologicznych.
Kinaza kreatynowa jest dimerycznym białkiem zbudowanym z dwóch podjednostek. Występuje w postaci pięciu
izoform: trzech cytoplazmatycznych (CK-MM, CK-MB, CKBB) i dwóch mitochondrialnych. Może również występować
w postaci tzw. makro-CK w wyniku polimeryzacji izoenzymów z immunoglobuliną IgG. Obecność makro-CK ma wartość prognostyczną w chorobach sercowo-naczyniowych
i chorobach o podłożu autoimmunologicznym. Aktywność
CK w surowicy jest uzależniona od szeregu czynników: wielkość i rodzaju wysiłku fizycznego, typ uprawianego sportu.
Szczyt aktywności CK sięgającej około dwukrotnej wartości
wyjściowej występuje po 8 godzinach po zakończeniu treningu. Nadmierny wysiłek może wywołać wzrost aktywności CK
między 2 a 7 dniem. Oznaczanie poziomu CK jest szeroko
stosowane w diagnostyce miopatii, kardiomiopatii i encefalopatii. W dystrofiach męśniowych aktywność CK osiąga różny
poziom w zależności od stopnia zaawansowania choroby.
Dehydrogenaza mleczanowa jest enzymem szlaku gliko-
litycznego. Bierze udział w odwracalnej reakcji przekształcenia pirogronianu w mleczan. Występuje w postaci pięciu
izoenzymów. Poziom aktywności LDH jest markerem uszkodzenia komórek i może być pomocny w diagnostyce ostrej
rabdomiolizy. Wzrost aktywności obserwuje się podczas wysiłku fizycznego, a jej poziom jest uzależniony od natężenia
i czasu trwania wysiłku.
Aldolaza należy podobnie jak LDH do enzymów szlaku gikolitycznego. Katalizuje przemianę fruktozo-1-6-dwufosforanów
do aldehydu 3-fosfoglicerynowego i fosfodihydroksyacetonu. Występuje w postaci trzech izoenzymów (A, B i C). Jej
aktywność wzrasta w zawale mięśnia sercowego. Stosowana jest do diagnostyki i monitorowania chorób mięśniowych.
U starszych osób niska aktywność aldolazy jest wskaźnikiem niskiej aktywności fizycznej.
Aminotransferaza asparaginianowa jest, co prawda głównym markerem chorób wątroby, ale wzrost jej aktywności
obserwuje się również po wysiłku fizycznym i w przewlekłych
stanach uszkodzenia mięśni.
Mioglobina jest monomerycznym białkiem zbudowanym
ze 153 aminokwasów. Bierze udział w procesie transportu
i magazynowania tlenu. Masywne uszkodzenie mięśni może
doprowadzić do wzrostu stężenia mioglobiny w surowicy
i w moczu, co może skutkować ryzykiem rozwoju ostrej
niewydolności nerek. Jest użytecznym markerem do oceny
efektywności pracy mięśni podczas treningu.
W trakcie wzmożonego wysiłku fizycznego można również
zaobserwować podwyższone stężenia troponin (cTnI, cTNT).
Specyficznym markerem uszkodzenia mięśni szkieletowych
jest anhydraza węglanowa III (CA III), która jest obecna tylko
w mięśniach szkieletowych i nie występuje w miokardium.
Pośrednimi markerami uszkodzenia mięśni mogą być związki będące produktami powstającymi w wyniku stresu oksydacyjnego bądź substancje będące odpowiedzią na towarzyszący uszkodzeniu mięśni proces zapalny.
W moczu najczęściej oznacza się stężenie mioglobiny,
szczególnie w przypadku podejrzenia ostrego zapalenia nerek. Pomocnym badaniem może być oznaczenie hydroksyproliny i hydroksylizyny oraz innych metabolitów białek.
Badania składników surowicy i moczu mogą być pomocne
w ocenie stopnia uszkodzenia mięśni, jak również ocenie
natężenia stresu oksydacyjnego towarzyszącego uszkodzeniu mięśni.
Według: Brancaccio P, Lippi G, Maffulli N. Biochemical markers of muscular damage. Clin Chem Lab Med 2010; 48: 75767.
opracowała: Ewa Leporowska
Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, WCO, Poznań
101
Przegląd piśmiennictwa
Zastosowanie oznaczania stężenia mieloperoksydazy w ocenie ryzyka wystąpienia
zawału mięśnia sercowego u pacjentów
z wdrożonym leczeniem chorych na chorobę wieńcową
Mieloperoksydaza (MPO) uznawana jest za wskaźnik predykcyjny wystąpienia zawału mięśnia sercowego, czy też
niewydolności serca, ale wartość prognostyczna wyników jej
oznaczeń u stabilnych pacjentów z miażdżycą nie jest wciąż
poznana. Najnowsze dane wskazują, że podwyższone stężenie MPO u zdrowych osób może świadczyć o powstawaniu
blaszek miażdżycowych, prowadzących do rozwoju choroby
wieńcowej oraz zawału mięśnia sercowego. W Klinice w Cleveland (USA) przeprowadzono trzyletnie badania kohortowe
na grupie 2460 osób z miażdżycą (≥50% zamknięta tętnica
wieńcowa) bez zawału mięśnia sercowego (sercowa troponina I<0,03µg/L). Pacjenci rekrutowani do badania byli poddani leczeniu zapobiegającemu rozwojowi choroby wieńcowej
oraz w ciągu ostatnich 30 dni nie mieli wykonywanej przezskórnej lub operacyjnej rewaskularyzacji. Zebrane zostały
dane dotyczące płci, wieku, cukrzycy palenia papierosów,
ciśnienia krwi oraz panelu lipidowego oraz funkcji nerek –
klirensu kreatyniny, wyliczanego wg. wzoru Cockcroft-Gaulta. Punktem końcowym badania była śmierć pacjenta, zawał
mięśnia sercowego lub udar mózgu. Stężenie MPO zostało
mierzone metodą chemiluminescencji przy użyciu przeciwciał monoklonalnych na aparacie Abbott Architect. Na podstawie krzywej ROC wyznaczono punkt odcięcia, który dla
MPO wynosił 322 pmol/l. U pacjentów z podwyższonym
stężeniem MPO (>322 pmol/l, 14,6% przypadków) częściej
występował zawał mięśnia sercowego (p=0,016), obniżone
ciśnienie skurczowe mięśnia sercowego (p=0,012), niższe
stężenie trójglicerydów (p=0,021) oraz oszacowany klirens
kreatyniny (p=0,027) niż pacjenci z niższym stężeniem MPO
(<322 pmol/l). Podczas 3 letniej obserwacji zanotowano 184
zgony, 87 zawały mięśnia sercowego, 22 udary. Po wystandaryzowaniu na wiek, płeć, stężenie LDL i HDL, ciśnienie
skurczowe krwi, palenie papierosów, cukrzycę, historię incydentów sercowo-naczyniowych badanie wykazało istotną
zależność pomiędzy stężeniem MPO a zgonem pacjentów
(p<0,001) oraz stężeniem MPO a zawałem mięśnia sercowego nie zakończonym zgonem pacjenta (p=0,015). Korelacja pomiędzy stężeniem MPO, a stężeniem hsCRP była
słaba. U pacjentów ze stężeniem hsCRP niższym od 2mg/l,
a podwyższonym stężeniem MPO (wyższym od 322pmol/l)
zaobserwowano częstsze występowanie zgonów nie spowodowanych zawałem mięśnia sercowego oraz udarem
mózgu niż u pacjentów z obniżonym MPO (<322pmol/l).
Zaobserwowano również, że ryzyko wystąpienia zgonu jest
porównywalne w grupie z podwyższonym hsCRP (>2mg/l)
i obniżonym MPO (<322pmol/l) i w grupie pacjentów z obniżonym hsCRP (>2mg/l) i podwyższonym MPO (>322pmol/l). Badanie skupiało się na użyteczności stężenia MPO
102
w przewidywaniu długoterminowego ryzyka wystąpienia
zgonu spowodowanego zawałem mięśnia sercowego oraz
udarem mózgu pacjentów chorych na chorobę wieńcową,
ale nie stwierdzono świeżego zawału mięśnia sercowego.
Wyniki potwierdziły, że MPO może być wskaźnikiem ryzyka
zgonu z powodu zawału serca oraz wystąpienia ryzyka udaru, zawału mięśnia sercowego nie zakończonego zgonem,
niezależnym od specyficznych markerów zawału mięśnia
sercowego, czynników ryzyka oraz markerów zapalenia.
Wyniki badania wskazują że u pacjentów z podwyższonym
stężeniem hsCRP zaobserwowano mniejsze ryzyko zgonu, kiedy stężenie MPO było niskie niż w grupie pacjentów
z podwyższonym stężeniem hsCRP i podwyższonym stężeniem MPO. Kolejnym wnioskiem jest brak silnego związku
pomiędzy stężeniem MPO, a stężeniem hsCRP. Najnowsze
badania pokazują, że stężenie MPO wykazuje silną korelacje ze stopniem dysfunkcji śródbłonka tętnic wieńcowych,
niezależną od poziomu CRP oraz stopnia zaawansowania choroby wieńcowej. Równoczesne oznaczenie stężeń
hsCRP i MPO może być przydatne do lepszej długoterminowej oceny rozwoju choroby wieńcowej oraz ryzyka zawału
mięśnia sercowego.
Według: Tang W,Wu Y, Nicholls SJ, Hazen SL. Plasma Myeloperoxidase Predicts Incident Cardiovascular Risks in Stable Patients Undergoing Medical Management for Coronary
Artery Disease, Clin Chem 2011, 57(1): 33-39
opracowała: Dorota Pawlica
Katedra i Zakład Biochemii Klinicznej, CMUJ, Kraków
Związek między troponiną T oznaczaną metodą o wysokiej czułości a budową serca i śmiertelnością w populacji
ogólnej
W rozpoznawaniu ostrego zawału mięśnia sercowego złotym
standardem jest oznaczenie sercowych troponin T (cTnT)
lub I. Podwyższone stężenie troponin obserwowano także
w innych klinicznych sytuacjach, w których może mieć miejsce ostre uszkodzenie mięśnia sercowego oraz w niektórych
stanach przewlekłych, takich jak: stabilna choroba wieńcowa, niewydolność serca i przewlekła niewydolność nerek.
W populacji osób zdrowych troponiny występują w bardzo
niskich stężeniach, a ich obecność ściśle wiąże się ze zmianami strukturalnymi w sercu, wzrostem ryzyka zgonu i niepomyślnych incydentów sercowo-naczyniowych. cTnT jest
niewykrywalna w populacji ogólnej przy zastosowaniu metod standardowych, dlatego oznaczanie jej stężenia metodą
o wysokiej czułości może być użyteczne w wykrywaniu subklinicznej choroby sercowo-naczyniowej i szacowaniu wystąpienia choroby sercowo-naczyniowej w populacji ogólnej.
Przegląd piśmiennictwa
W ostatnim czasie opracowano metodę oznaczania cTnT,
która umożliwia wykrycie stężenia około 10-krotnie niższego
niż z zastosowaniem standardowych metod czyli stężenia
0,003 ng/mL. U pacjentów z podejrzeniem ostrych zespołów wieńcowych zastosowanie tej metody pozwala na dokładniejsze zdiagnozowanie zawału mięśnia sercowego.
U pacjentów z przewlekłą niewydolnością serca i przewlekłą
chorobą wieńcową krążąca we krwi cTnT jest wykrywana
u prawie wszystkich pacjentów, a podwyższone stężenie koreluje silnie z wzrostem umieralności z powodu chorób sercowo-naczyniowych.
W przeprowadzonych badaniach wykazano, że stężenie
cTnT ≥0,003 ng/ml stwierdzono u 25% pacjentów (95%
przedział ufności, 22,7%–27,4%) przy zastosowaniu metody
wysokoczułej, natomiast tylko u 0,7% (95% przedział ufności, 0,3%–1,1%) przy oznaczeniu metodą standardową. Występowanie hipertrofii lewej komory wzrastało z 7.5% (95%
przedział ufności, 6.4%–8.8%) jeśli stężenie cTnT wynosiło <0.003 ng/ml do 48.1% (95% przedział ufności, 36.7%–
59.6%) przy najwyższym stężeniu ≥0.014 ng/ml (P<0.001);
podobnie częstość dysfunkcji skurczowej lewej komory
i przewleklej choroby nerek wzrastała ze wzrostem stężenia
cTnT (P<0.001).
Przeprowadzone badania wskazują także na istnienie zależności między stężeniem cTnT oznaczonej metodą wysokoczułą a nieprawidłowościami w budowie i czynności serca
(ocenianymi metodą magnetycznego rezonansu jądrowego)
oraz wynikające z tego ryzyko umieralności.
Według: de Lemos JA, Drazner MH, Omland T, Ayers CR,
Khera A, Rohatgi A, Hashim I, Berry JD, Das SR, Morrow
DA, McGuire DK..: Association of troponin T detected with
a highly sensitive assay and cardiac structure and mortality
risk in the general population. JAMA. 2010; 304: 2503-12
opracowała: Agnieszka Pater
Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, SU, Bydgoszcz
Cholesterol „nie HDL” wykazuje większą
dokładność przy ocenie ryzyka sercowonaczyniowego w porównaniu do wyliczanego oraz oznaczanego metodami bezpośrednimi cholesterolu LDL
Lipoproteiny o małej gęstości (LDL) są jedną z frakcji lipoprotein, czyli kompleksów białkowo-lipidowych, których rola sprowadza się do transportu cholesterolu we krwi. LDL są uważane za niekorzystne, gdyż odkładają nadmiar cholesterolu
w ścianach naczyń krwionośnych, przez co przyczyniają się do
powstawania miażdżycy oraz choroby niedokrwiennej serca.
W związku z tym badanie poziomu LDL wykorzystuje się do
oceny ryzyka rozwoju choroby niedokrwiennej serca (CVD
- cardiovascular disease), a osoby z podwyższonym stężeniem LDL są zagrożone występowaniem tej choroby.
Referencyjna metoda oznaczania LDL (rLDL - reference
LDL) oparta jest na ultrawirowaniu próbki z następującą precypitacją heparynowo-magnezową. Jest ona pracochłonna
oraz kosztowna, dlatego też znajduje zastosowanie głównie
w badaniach naukowych. Zwykle w ramach oceny profilu
lipidowego stężenie cholesterolu LDL wylicza się z równania Friedewald’a (cLDL - calculated LDL) używając przy tym
wyników oznaczeń cholesterolu całkowitego, cholesterolu
HDL i triglicerydów. Wynika to zarówno z pobudek praktycznych jak również finansowych, gdyż zmniejsza się dzięki
temu ilość wykonywanych badań. Istnieją jednak sytuacje
w których wyliczone z równania stężenie LDL obarczone jest
znacznym błędem. Należą do nich: podwyższone stężenie
lipidów oraz brak możliwości uzyskania badanej próbki na
czczo. W wymienionych przypadkach cholesterol LDL oznaczany jest metodą bezpośrednią (dLDL - direct LDL).
W omawianym badaniu udział wzięło 175 osób w tym 138
z chorobą niedokrwienną serca, bądź stanem mogącym
mieć wpływ na poziom cholesterolu LDL. W pracy porównano dostępne metody służące do bezpośredniego pomiaru LDL, a następnie na podstawie uzyskanych wyników
oszacowano ryzyko rozwoju choroby niedokrwiennej serca
i odniesiono je do ryzyka obliczonego z wyników otrzymanych metodą referencyjną. Do bezpośredniego oznaczenia
LDL wykorzystano gotowe zestawy Denka, Kyowa, Sekisui,
Serotec, Sysmex, UMA i Wako. cLDL wyliczano z równania Fiedewald’a używając wyników HDL otrzymanych przy
użyciu bezpośrednich testów poszczególnych producentów
oraz cholesterolu całkowitego i triglicerydów oznaczonych
przy użyciu zestawów Roche i Siemens. Ryzyko wystąpienia choroby niedokrwiennej serca oszacowano również na
podstawie wyliczonego cholesterolu „nie HDL”.
Wyniki niniejszej pracy wykazały, iż wśród osób u których
poziom triglicerydów był >2,26 mmol/l błędna ocena ryzyka
wystąpienia choroby niedokrwiennej serca, w odniesieniu
do wyników otrzymanych na podstawie metod referencyjnych wynosiła 5% do 17% w przypadku cLDL oraz 8% do
26% w przypadku dLDL. Odwrotna sytuacja miała miejsce wśród osób u których poziom triglicerydów mieścił się
w przedziale ≥2,26 mmol/l i <4,52 mmol/l. W tym przypadku
w ocenie ryzyka wystąpienia CVD lepiej sprawdzał się dLDL
a wyższość bezpośredniego pomiaru stężenia LDL nad „wyliczanym” wynika z faktu, że u osób z wysokimi triglicerydami
błąd w wyliczaniu cLDL jest stosunkowo duży. Wyróżnia się
dwie przyczyny błędów wpływających na wynik cLDL: pierwsza dotycząca nieprawidłowego oznaczenia frakcji HDL oraz
druga - pojawiająca się znacznie częściej - związana z błędnym wyliczeniem frakcji VLDL. Lipoproteiny VLDL służące
wchodzące w skład równania Friedewald’a nie są oznaczane, lecz wyliczane zgodnie z formułą: {TG (mmol/l)/2,22}. Ze
względu na dużą zmienność biologiczną triglicerydów, często wartość wyliczonych VLDL jest różna od ich rzeczywistego stężenia. W niniejszej pracy zbadano związek pomiędzy
103
Przegląd piśmiennictwa
wyliczonymi a oznaczonymi VLDL i okazał się stosunkowo
słaby (R2=0,65).
Badanie użyteczności cholesterolu „nie HDL” w ocenie ryzyka wystąpienia choroby niedokrwiennej serca wykazało, iż
parametr ten jest najbliższy ocenie ryzyka otrzymanego przy
użyciu metody referencyjnej, zarówno u pacjentów z prawidłowym jak i podwyższonym stężeniem triglicerydów. Procent
osób nieprawidłowo zaklasyfikowanych do grupy niskiego
ryzyka wystąpienia choroby niedokrwiennej serca u osób
z triglicerydami >2,26 mmol/l wynosił 0%-11%, natomiast do
wysokiego 1%-8%. U osób mających triglicerydy ≥2.26 mmol/l i <4.52 mmol/l wartość wyliczonego „nie HDL” była bliska
wartości obliczonej na podstawie metod referencyjnych, czego nie można było powiedzieć o dLDL oraz cLDL.
U osób z podwyższonymi triglicerydami nieprawidłowa
klasyfikacja do grupy niskiego ryzyka wystąpienia choroby niedokrwiennej serca wynosiła na podstawie „nie HDL”
0%-7%, natomiast do wysokiego ryzyka 0%-18%. Porównując trafność klasyfikacji do określonej grupy ryzyka przy
pomocy dLDL, cLDL oraz „nie HDL”, ten ostatni parametr
wypadł zdecydowanie najlepiej. Na podstawie omawianej
pracy można rozważyć oznaczenie cholesterolu „nie HDL”
jako alternatywę dla oceny ryzyka choroby niedokrwiennej
serca. Wyliczając „nie HDL” uniezależniamy się od poziomu
triglicerydów, a także unikamy błędów związanych z nieprawidłowym wyliczeniem VLDL oraz błędów związanych z różną swoistością metod służących do oznaczania dLDL.
Według: van Deventer HE, Miller WG, Myers GL at al: NonHDL cholesterol shows improved accuracy for cardiovascular risk score classification compared to direct or calculated
LDL cholesterol in a dyslipidemic population. Clin Chem.
2011; 57(3):490-501.
opracowała: Katarzyna Gawlik
Katedra i Zakład Biochemii Klinicznej, CMUJ, Kraków
Wpływ 8- i 24-godzinnego przechowywania krwi pełnej w temperaturze pokojowej
na czas protrombinowy, czas częściowej
tromboplastyny po aktywacji, fibrynogen,
czas trombinowy, antytrombinę i D-dimer
Coraz częściej instytucje kliniczne stają pod przymusem
wprowadzenia oszczędności kosztów laboratoryjnych.
W związku z tym wprowadza się centralizację laboratoriów.
Zdecentralizowanie natomiast punktów pobrań, wymaga
odpowiednich warunków transportu i przechowywania krwi
przed dostarczeniem jej do laboratorium i odwirowaniem.
Obecne zalecenia CLSI dotyczące fazy przedanalitycznej
próbek pobieranych do badań układu krzepnięcia akceptują
czas przechowywania krwi pełnej przeznaczonej do ozna104
czenia PT, do 24 godzin i do 4 godzin dla APTT i innych
oznaczeń koagulologicznych. Wiele badań klinicznych potwierdza, że PT może być oznaczane nawet po 24 godzinach przechowywania krwi pełnej. Akceptowalny czas przechowywania krwi pełnej do oznaczeń APTT i innych badań
układu krzepnięcia to 6-24 h. W niektórych badaniach wykazano, że APTT, fibrynogen, czynniki krzepnięcia: II, VII,
IX, X, XI, AT, białko C, białko S, czynnik von Willebranda,
kompleks TAT, D-dimery są stabilne przez co najmniej 24 h
przechowywania w temperaturze pokojowej.
W przytaczanej pracy analizowano rutynowe badania układu krzepnięcia ( PT, APTT, TT, AT III, D-dimery i fibrynogen)
w ciągu 4 godzin od pobrania krwi oraz po 8 i 24 godzinach
przechowywania krwi pełnej w temperaturze pokojowej.
Badania przeprowadzono w grupie 147 pacjentów. Krew
pobierano do probówek typu „Monovette” z cytrynianem trisodowym (3,2%). Z pobranej próbki krwi przenoszono 1 ml
do innej probówki i wirowano 10 minut (1500g). Uzyskane
osocze poddano analizie. Pozostałą pierwotną próbkę krwi
przechowywano w temperaturze pokojowej, w pozycji pionowej. Po 8 i 24 godzinach próbkę mieszano ręcznie i postępowano jak uprzednio.
Na podstawie przeprowadzonej analizy statystycznej stwierdzono, że średnie procentowe zmiany po 8 i 24 godzinach
przechowywania krwi były mniejsze niż 10% dla wszystkich
oznaczanych parametrów. Dla PT zmiany były istotne statystycznie, ale mniejsze niż 15% dla każdej z dwóch prób. Tylko
w dwóch przypadkach zmiany przekraczały 15% i prawdopodobnie nie było to związane z przechowywaniem próbki.
APTT rosło w trakcie przechowywania, ale zmiany po 8 godzinach nie były istotne z klinicznego punktu widzenia, ponieważ były niższe niż 10% w większości próbek i niższe
niż 15% we wszystkich badanych próbkach. Zmiany po 24
godzinach były wyraźniej zaznaczone. Stężenie fibrynogenu również nieznacznie wzrastało w trakcie przechowywania. Zmiany po 8 godzinach były niewielkie. Po 24 godzinach zaobserwowano zmiany powyżej 15% w 45 badanych
próbach. W czterech przypadkach czas przechowywania
wpłynął na zmianę kwalifikacji próbki badanej poza zakres
wartości referencyjnych. TT był stabilny przez cały okres
przechowywania, po wyłączeniu próbek pacjentów leczonych heparyną. W przypadku AT stwierdzono małe zmiany
po 8, po 24 godzinach zmiany były istotne statystycznie. Tylko w 3 z 49 próbek stwierdzono wzrost AT powyżej 15%, po
24 godzinach przechowywania. W przypadku D-dimerów nie
wykazano istotnych statystycznie zmian stężenia po 8 i 24
godzinach. Nieznaczny wzrost po 24 godzinach zaobserwowano jedynie w próbkach, w których stężenie początkowe
znajdowało się poniżej wartości referencyjnych.
Badania te wykazały, że takie oznaczenia jak: PT, APTT, Fibrynogen, TT, AT, D-dimery mogą być wykonane z zachowaniem wiarygodności wyników w ciągu 8 godzin od pobrania
próbki, przechowywanej w temperaturze pokojowej. W większości testów (oprócz APTT) czas przechowywania próbek
może być wydłużony do 24 godzin.
Przegląd piśmiennictwa
Według: Kemkes-Matthes B, Fischer R, Peetz D. Influence
of 8 and 24-h storage of whole blood at ambient temperature
on prothrombin time, activated partial thromboplastin time,
fibrinogen, thrombin time, antithrombin and D-dimer. Blood
Coagul Fibrinolysis. 2011 Feb 3. [Epub ahead of print]
opracowała: Ewa Leporowska
Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, WCO, Poznań
Jak poprawić diagnostykę i terapię
chorych poddawanych doustnej antykoagulacji? Trzynaście nowych mutacji
genu oksydazy-reduktazy witaminy K powiązanych z opornością na pochodne kumaryny
Pochodne 4-hydroksykumaryny, włączając warfarynę, acenokumarol i nie stosowany w Polsce fenoprokumon, wciąż
są najczęściej stosowanymi doustnymi lekami o działaniu
przeciwzakrzepowym OACs (oral anticoagulants). Pochodne te blokują aktywność podjednostki 1 enzymu oksydazyreduktazy witaminy K (VKORC1; EC 1.1.4.1), która uczestniczy w „regeneracji” (redukcji) utlenionej witaminy K. Tym
samym pochodne kumaryny hamują syntezę de novo tzw.
zależnych od witaminy K czynników krzepnięcia, która zachodzi na drodze γ-karboksylacji. Ze względu na wąski indeks terapeutyczny, terapeutyczny wskaźnik INR waha się
od 2,0 do 3,0 (2,5-3,5 dla chorych z mechanicznymi zastawkami serca), w leczeniu OACs wymagane jest regularne monitorowanie wskaźnika INR. Aby uzyskać i utrzymać pożądaną wartość wskaźnika INR, konieczny jest indywidualny
dobór odpowiedniej dawki leku, co w przypadku niektórych
chorych oznacza stosowanie od 1 do 15 mg warfaryny do
2 do 40 mg acenokumarolu dziennie. Na tak dużą zmienność w dawkowaniu VKA największy wpływ mają czynniki
osobnicze, przy czym komponenta genetyczna (genetyczny
polimorfizm) odgrywa decydującą rolę. Polimorfizmy dwóch
enzymów bezpośrednio uczestniczących w metabolizmie
witaminy K (VKORC1) i biotransformacji pochodnych 4-hydroksy-kumaryny (CYP2C9) mają znaczący wpływ na dobór
odpowiedniej dawki leku.
Grupa naukowców z Niemiec, pod kierunkiem prof. Johannesa Oldenburga zanalizowała genotyp u 624 chorych, których
skierowano do badań genetycznych z powodu słabej odpowiedzi na leczenie lub oporności na leczenie OACs. Chorzy
byli rekrutowani z różnych krajów i kierowani do badania na
podstawie zróżnicowanych kryteriów tzw. „zwiększonej wymaganej dawki OACs”. Ponadto przeprowadzono retrospektywną analizę dawki leku i terapeutycznego wskaźnika INR.
Chorzy zostali podzieleni na podgrupy pod względem występowania: (1) mutacji zmiany sensu regionów kodujących
genu VKORC1; (2) bez mutacji zmiany sensu, lecz z mutacją
VKORC1 -1639 GG i genotypem CYP2C9*1*1 (chorzy wymagający dużej dawki OACs); (3) chorzy bez wymienionych
mutacji. Autorzy zanalizowali sekwencję promotora oraz
flankujących sekwencji intronowych genu VKORC1 oraz
dodatkowo egzony 3 i 7 genu CYP2C9 przy użyciu automatycznego sekwenatora (ABI Prism 3100 genetic analyzer,
Applied Biosystems). Wyliczono progową wartość wysokiej
dawki (HDT; and. high-dosage threshold) dla poszczególnych leków: acenokumarol – 24,3 mg/tyg, warfaryna – 49,8
mg/tyg i fenoprokumon – 21,1 mg/tyg.
U 23 chorych wykryto mutacje o charakterze podstawienia (substytucji) w genie VKORC1, z czego 3 mutacje były
wcześniej opisane: Asp36→Tyr (c.106C>T); Val66→Met
(c.196G>A) i Val29→Leu (c.85G>T). Wszyscy chorzy, za
wyjątkiem jednego z mutacją c.106C>T, byli heterozygotami pod względem zmutowanego allelu. Mutacja Asp36→Tyr,
charakterystyczna dla populacji Żydów pochodzenia etiopskiego i aszkenazyjskiego, występowała u 25% badanych
chorych i wiązała się z całkowitą opornością na warfarynę
lub fenoprokumon. Ponadto autorzy odkryli nowy wariant
mutacji Asp36→Gly (c. 107A>G). Drugą pod względem
częstości była mutacja Val66→Met występująca u chorych
pochodzenia afro-karaibskiego, która wiązała się z wysokimi dawkami warfaryny i fenoprokumonu. Ponadto autorzy
opisali następujące mutacje w pozycjach: Ala26, Ser52
i Val66 (VKORC1: c.75G>A, VKORC1: c.155C>G i VKORC1:c.197T>G, odpowiednio) powodujące zmiany w sekwencji białka: Thr26, Trp52 i Gly66. Wymiany: Asn77→Tyr,
Asn77→Ser (VKORC1: c.229A>T i VKORC1: c.230A>G), dwie nowe mutacje Trp59: Trp59→Leu i Trp59→Cys
(VKORC1: c.176G>T i VKORC1:c.177G>T), ponadto:
Trp59→Arg (VKORC1: c.175T>C). Wszystkie powyższe
mutacje wymagały znacznego zwiększenia dawki OACs
lub wiązały się z opornością na leczenie, co w niektórych
przypadkach skutkowało zaprzestaniem stosowania OACs.
Stwierdzono nowe mutacje genu VKORC1: His28→Gln,
Asp36→Gly, Ser52→Trp, Ser56→Phe, Gly71→Ala,
Asn77→Ser, Asn77→Tyr, Ile123→Asn i Tyr139→His.
Wszystkie mutacje, które mają związek z opornością lub
słabą odpowiedzią na OACs są zlokalizowane w obrębie
pętli enzymu, w świetle siateczki wewnatrzplazmatycznej
lub w błonie siateczki. Zdaniem autorów, obecność mutacji
powoduje zmianę aktywności enzymu VKORC1, co sprzyja
powstawaniu przy redukcji epoksychinonu witaminy K produktów ubocznych, które hamują aktywność enzymu. Autorzy postulują, że badania genetyczne u chorych, dla których
leczenie pochodnymi kumaryny jest nieskuteczne, pozwolą
na zastosowanie niestandardowej terapii z zastosowaniem
nowych doustnych leków przeciwkrzepliwych. Zaproponowali też nowy schemat klasyfikacji odpowiedzi na leczenie
OACs, obejmujący stosowane powszechnie leki i proponujący poziomy referencyjne dawki. Pozwoli to na usystematyzowanie definicji: „słabej odpowiedzi na leczenie OACs”
i „oporności na leczenie OACs”.
105
Przegląd piśmiennictwa
Według: Watzka M, Geisen C, Bevans CG, Sittinger K,
Spohn G, Rost S, Seifried E, Müller CR, Oldenburg J. Thirteen novel VKORC1 mutations associated with oral anticoagulant resistance: insights into improved patient diagnosis
and treatment. J Thromb Haemost 2011; 9: 109-18. doi:
10.1111/j.1538-7836.2010.04095.x.; Stępień E, Wypasek E,
Branicka A, Undas A. Optymalizacja leczenia antagonistami
witaminy K - rola polimorfizmów genowych. Kardiologia Polska 2010; 68 (supl. V): 428–435.
opracowała: Ewa Stępień
Katedra i Zakład Biochemii Klinicznej CMUJ, Kraków
Kliniczny przedlaboratoryjny model oceny prawdopodobieństwa występowania
małopłytkowości indukowanej heparyną
(HEP) oparty o opinię grupy ekspertów
Małopłytkowość indukowana heparyną HIT (heparin-induced
thrombocythopenia) jest groźnym prozakrzepowym powikłaniem jakie występuje u 0,5 do 3% chorych otrzymujących
heparynę niefrakcjonowana UFH (unfractionated heparyn)
i w mniejszym stopniu u chorych poddanych leczeniu drobnocząsteczkowa heparyną LMWH (low molecular weight
heparin). Diagnostyka HIT jest dużym wyzwaniem, zarówno
dla diagnosty laboratoryjnego jak i klinicysty. Rozpoznanie
HIT opiera się o wystąpienie dwóch podstawowych objawów: (1) spadek liczby płytek >50% między 5 a 14. dniem od
zabiegu z podaniem heparyny, lub po rozpoczęciu leczenia
heparyną; (2) epizod zakrzepowo-zatorowy, zmiany skórne
(martwica) w okolicach podania heparyny lub ostra reakcja
ogólna. Diagnostyka laboratoryjna opiera się o metody immunoenzymatyczne (ELISA), które charakteryzują się wysoką czułością, natomiast ich swoistość jest względnie niska,
co stanowi duże ograniczenie metody. Swoistość metod laboratoryjnych wzrasta znacząco po zastosowaniu metody
funkcjonalnej: pomiar serotoniny uwalnianej z płytek SRA
(serotonine releasing assay). W celu poprawy wiarygodności i standaryzacji diagnostyki klinicznej w rozpoznaniu HIT,
grupa ekspertów pod kierunkiem prof. Adama Cukera z USA
badała dwa modele oceny ryzyka HIT służące do szacunkowego lub ilościowego pomiaru prawdopodobieństwa HIT
u chorych: (1) model 4T’s i (2) model Lillo-Le Louët. Model
4T’s opiera się o ocenę 4 kryteriów klinicznych w skali 0-8
punktów: (1) małopłytkowość; (2) czas po jakim do niej doszło; (3) wystąpienie incydentów zakrzepowych; (4) występowanie innych czynników sprzyjających małopłytkowości
(skala negatywna). Model Lillo-Le Louët jest dedykowany
głównie do oceny ryzyka HIT u chorych po operacjach pomostowania secowo-naczyniowego CPB (cardiopulmonary
by-pass), opiera się o skalę 6 punktową i wyróżnia 3 kryteria:
106
(1) liczba płytek (PLT) w ocenie czasu od wykonania CPB;
(2) czas od wykonania CPB; (3) czas trwania CPB.
Celem badania było porównanie tych modeli i zaproponowanie nowego obiektywnego modelu klinicznej oceny
prawdopodobieństwa wystąpienia HIT (HEP) (HIT expert
probability), co po zastosowaniu testów laboratoryjnych,
przyczyniłoby się do zwiększenia parametrów testów w diagnostyce HIT.
Zaproponowany model HEP opierał się o ocenę 6 cech klinicznych w zróżnicowanej skali od -2 do 3 punktów za każdy parametr cechy: (1) wielkość spadku PLT w procentach;
(2) czas po jakim wystąpił spadek PLT; (3) najniższa wartość
PLT; (4) zakrzepica; (5) martwica skóry; (6) ostra reakcja
ogólna; (7) krwawienia; (8) inne przyczyny małopłytkowości
(skala ujemna).
Badaniu poddano 50 chorych ze wskazaniem do laboratoryjnej diagnostyki HIT, u których wykonano testy ELISA na
obecność przeciwciał anty-PF4 indukowanych heparyną
(GTI Diagnostics, Waukesha, WI, USA) i ocenę uwalniania serotoniny (SRA) przy użyciu metody własnej. Analizę
statystyczną wykonano przy użyciu metod: współczynnik
korelacji Pearsona do porównania modelu oceny klinicznej
z wynikami HIT ELISA; test t dla nierównych wariancji do
oceny zalewności między modelami klinicznymi a wynikami
SRA; porównanie czułości i swoistości metod diagnostycznych wykonano przez zastosowanie metody analizy krzywej
nadawca-odbiorca ROC (reciver-operating curve).
Zaproponowany model HEP wykazywał większą zgodność
i korelację miedzy testami laboratoryjnymi i oceną stanu klinicznego niż model 4T’s: współczynnik korelacji 0,88 (95%
CI 0,80-0,93) vs. 0,71 (95% CI 0,54-0,83). Podobnie analiza
powierzchni pola pod krzywą ROC pokazała lepszą przydatność diagnostyczną modelu HEP w porównaniu do modelu
4T’s: 0,91 vs. 0.74 (p=0,017). Model HEP wykazywał się
100% czułością i 60% swoistością diagnostyczną w ocenie
klinicznej małopłytkowości indukowanej heparyną (HIT), co
pozwoliło na 41% zmniejszenie liczby chorych otrzymujących bezpośrednie inhibitory trombiny w leczeniu powikłań
HIT. Autorzy sugerują, że zastosowanie modelu HEP, w połączeniu z oceną wyników badań laboratoryjnych, pozwoli
lekarzom na postawienie trafnej diagnozy HIT i zmniejszy
liczbę fałszywie-dodatnich rozpoznań.
Według: Cuker A, Arepally G, Crowther MA, Rice L, Datko
F, Hook K, Propert KJ, Kuter DJ, Ortel TL, Konkle BA, Cines
DB. The HIT Expert Probability (HEP) Score: a novel pretest probability model for heparin-induced thrombocytopenia
based on broad expert opinion. J Thromb Haemost. 2010; 8:
2642-50. doi: 10.1111/j.1538-7836.2010.04059.x.
opracowała: Ewa Stępień
Katedra i Zakład Biochemii Klinicznej CMUJ, Kraków