Spis treści
advertisement
1
Spis treści
Spis treści...............................................................................................................................1
Wstęp......................................................................................................................................4
1.1. Pochodzenie i historia genomu mitochondrialnego................................................................5
1.2. Różnorodność mtDNA współczesnych eukariontów............................................................11
1.3. Genetyka mitochondrialna drożdży......................................................................................14
1.3.1. Drożdże jako organizm modelowy..................................................................................................14
1.3.2. Klasyczna analiza genomu mitochondrialnego drożdży i oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych..
17
1.3.3. Struktura i funkcjonowanie mtDNA S. cerevisiae – zarys...............................................................19
1.3.4. Oddziaływania jądrowo-mitochondrialne u S. cerevisiae- zarys.....................................................23
1.4. Podsumowanie.........................................................................................................................25
Badania nad funkcją i ewolucją genu SUV3.......................................................................26
2.1. Wprowadzenie. Porównawcza analiza sekwencji białka suv3p..........................................27
2.1.1. Rola oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych w regulacji stabilności mitochondrialnych RNA. .27
2.1.2. Klonowanie i wstępna analiza fenotypowa różnych alleli genu SUV3............................................29
2.1.3. Analiza sekwencji produktu genu SUV3 .......................................................................................33
2.1.4. Białka współdziałające z suv3p – hipotetyczny kompleks białkowy degradosomu
mitochondrialnego....................................................................................................................................43
2.1.5. Cele badań......................................................................................................................................48
2.2. Analiza fenotypowa szczepów niosących delecję genu SUV3 Saccharomyces cerevisiae –
gen SUV3 jest konieczny dla utrzymania stabilności transkryptów mitochondrialnych
zawierających introny....................................................................................................................49
2.2.1. Wprowadzenie................................................................................................................................49
2.2.2. Wpływ inaktywacji genu SUV3 na ekspresję bezintronowych alleli genów cytb oraz cox1...........52
2.2.3. Obróbka transkryptów genów cytb i cox1 zawierających różne kombinacje intronów w szczepie z
inaktywacją genu SUV3 w kontekście mutacji suB9................................................................................ 54
2.2.3. Dyskusja.........................................................................................................................................60
2.3. Porównanie genów SUV3 S. cerevisiae i S. douglasii – wpływ zależnej od zmian DNA
mitochondrialnego specjacji na ewolucję oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych.............63
2.3.1. Wprowadzenie................................................................................................................................63
2.3.2. Klonowanie i sekwencjonowanie genu SUV3 Saccharomyces douglasii.......................................67
2.3.3. Analiza sekwencji genu SUV3 S. douglasii....................................................................................69
2.3.4. Gen SUV3 jest niezbędny do funkcjonowania mitochondrialnego aparatu genetycznego S.
douglasii ..................................................................................................................................................72
2.3.5. Geny SUV3 S. cerevisiae i S. douglasii są w pełni wymienialnymi odpowiednikami
funkcjonalnymi.........................................................................................................................................74
2.4. Podsumowanie i dyskusja ogólna..........................................................................................81
2
Inżynieria genomu mitochondrialnego. Relokalizacja aktywnego genu jądrowego RIP1 do
mitochondriów drożdży S. cerevisiae...................................................................................84
3.1. Wstęp........................................................................................................................................85
3.1.1. Wprowadzenie................................................................................................................................85
3.1.2. Dotychczasowe doświadczenia nad relokalizacją genów mitochondrialnych i jądrowych.............86
3.1.3. Wybór relokalizowanego genu – gen RIP1 Saccharomyces cerevisiae...........................................89
3.1.4. Transformacja balistyczna mitochondriów drożdżowych – technika i strategia..............................91
3.1.5. Założenia i cele projektu – podsumowanie......................................................................................95
3.2. Wyniki......................................................................................................................................97
3.2.1. Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych dla wyrażania genu RIP1 w mitochondriach S. cerevisiae....
97
3.2.2. Transformacja balistyczna i selekcja syntetycznych – ...............................................................101
3.2.3. Komplementacja dysrupcji genu RIP1 w jądrze przez gen relokalizowany do mitochondriów.....102
3.3.4. Badanie stabilności szczepów eksprymujących gen relokalizowany do mitochondriów...............105
3.3.5. Uzyskanie genomu + zawierającego wrekombinowany gen RIP1...............................................108
3.3. Dyskusja.................................................................................................................................113
Prace nad bazą danych sekwencji mitochondrialnych (MitBASE)..................................118
4.1. Wstęp......................................................................................................................................119
4.1.1. Banki i bazy danych. Założenia projektu MitBASE......................................................................119
4.2.2. Techniczna i organizacyjna struktura projektu MitBASE.............................................................122
4.1.3. Cele projektu.................................................................................................................................126
4.2. Wyniki....................................................................................................................................127
4.2.1. Dane sekwencyjne mtDNA grzybów pochodzące z pierwotnych banków danych .......................127
4.2.2. Struktura i narzędzia bazy danych wariantów sekwencyjnych......................................................130
4.2.3. Zawartość bazy danych wariantów sekwencji mtDNA grzybów...................................................133
4.3. Dyskusja i podsumowanie....................................................................................................136
Podsumowanie wyników....................................................................................................138
Materiały i metody.............................................................................................................140
5.1. Podłoża i hodowle..................................................................................................................141
5.2. Szczepy...................................................................................................................................141
5.3. Plazmidy i oligonukleotydy..................................................................................................144
5.4. Metody....................................................................................................................................145
5.4.1. Techniki genetyki klasycznej........................................................................................................145
5.4.2. Transformacja...............................................................................................................................147
5.4.3. Techniki molekularne...................................................................................... .............................147
5.4.4. Metody bioinformatyczne.............................................................................................................150
Dodatek A ....................................................................................................................................151
VI. Bibliografia..................................................................................................................154
3
Część I.
Wstęp
Rozdział 1. Wstęp
5
1.1. Pochodzenie i historia genomu mitochondrialnego
Różnorodne formy życia spotykane na Ziemi można najogólniej podzielić na trzy
równorzędne domeny, stanowiące najwyższy poziom taksonomii: Bacteria, Archaea i
Eukarya (Woese i wsp., 1990). Każda z tych domen obejmuje kilka różnych królestw,
stanowiących w tradycyjnej taksonomii najwyższe jednostki. Dwie pierwsze z
wymienionych trzech domen określane są często wspólnym mianem Prokaryota, ze względu
na strukturę ich komórek, odróżniającą je od tworzących trzecią domenę eukariontów.
Należy jednak pamiętać, że jak wynika z badań przy użyciu metod filogenetyki
molekularnej, dwie domeny zaliczane do Prokaryota są w istocie równorzędne i oddzieliły
się od wspólnego przodka (Progenota) na najwcześniejszym etapie ewolucji, być może
wcześniej, niż nastąpiło oddzielenie przodka dzisiejszych Eukaryota od gałęzi Archaea.
Komórki eukariontów są bardziej skomplikowane od prokariotycznych – zawierają
szereg oddzielonych systemem błon kompartmentów (organelli), wśród których wyróżniają
się mitochondria i plastydy. Struktura tych dwóch typów organelli swym poziomem
złożoności przypomina
proste komórki prokariotyczne, w szczególności posiadają one
własny, niezależny od jądrowego materiał genetyczny w postaci genomu zbudowanego z
DNA. Mitochondria obecne są w nieomal wszystkich liniach ewolucyjnych eukariontów, ich
brak u niektórych beztlenowych Protista jest przypuszczalnie wtórny. Plastydy obecne są u
wszystkich fotosyntetyzujących eukariontów, wielo i jednokomórkowych. Zasadniczą rolą
mitochondriów jest dostarczanie komórkom ATP w procesie oddychania tlenowego, oprócz
tego pełnią one istotną rolę w procesach metabolizmu, np. niektórych aminokwasów i
kwasów tłuszczowych.
Zagadnienie pochodzenia tych organelli, a ogólniej problem powstania złożonej
struktury
komórkowej
współczesnych
eukariontów
jest
od
dawna
przedmiotem
zainteresowania badaczy (patrz Gray, 1992). Problem ten można rozpatrywać w kontekście
ogólniejszego pytania, dotyczącego drogi, na której proces ewolucji prowadzi ogólnie do
wzrostu złożoności. Każdy system biologiczny ma bowiem określony poziom inherentnej
złożoności, ograniczonej zasadniczo jego możliwościami przechowywania i odczytywania
informacji. Musi jednak istnieć mechanizm ewolucyjny pozwalający na przekroczenie tej
bariery i osiągnięcie kolejnego, wyższego poziomu złożoności.
Jedną z możliwych dróg jest wytwarzanie złożoności przez opartą na współdziałaniu
fuzję systemów niższego poziomu. Mechanizm taki został zaproponowany dla
najwcześniejszej fazy ewolucji prebiotycznej w świecie RNA. Według koncepcji hipercyklu
(Eigen i Schuster, 1977), pierwotne replikatory RNA, których złożoność była silnie
Rozdział 1. Wstęp
6
ograniczona przez niską dokładność mechanizmu powielania informacji łączyły się we
współzależne sieci wyższego rzędu (zwane hipercyklami). Współdziałanie większej liczby
niezależnych początkowo replikatorów pozwoliło na pokonanie bariery zawartości
informacyjnej pojedynczego systemu.
Motyw współdziałania niezależnych początkowo systemów pojawia się również w
koncepcji
endosymbiontycznego
pochodzenia
struktury
komórki
eukariotycznej,
sformułowanej po raz pierwszy przez Lynn Margulis (Margulis, 1970). Teoria ta zakłada, że
współczesne komórki eukariotyczne powstały przez fuzję pierwotnej komórki („urkarionta”),
pochodzącej najprawdopodobniej od Archaea z komórkami z linii Bacteria, które dały
początek mitochondriom i plastydom.
W klasycznej wersji teorii endosymbiontycznej anaerobowa komórka będąca
przodkiem dzisiejszych eukariontów wchłonęła (aktywnie, lub została zainfekowana)
aerobową komórkę z linii Bacteria (prawdopodobnie zbliżoną do dzisiejszych proteobakterii), przy czym wytworzyła się endosymbioza oparta na oddychaniu tlenowym,
jako głównej dla gospodarza korzyści z symbiozy. Obecnie proponuje się również kilka
różnych
alternatywnych
scenariuszy
endosymbiontycznego
pochodzenia
komórki
eukariotycznej. W hipotezie wodorowej (Martin i Muller, 1998) w najwcześniejszych
etapach endosymbioza opierała się nie na korzyściach z oddychania, lecz na wykorzystaniu
przez gospodarza wydzielanego przez oddychającego symbionta wodoru i dwutlenku węgla
(te uboczne produkty metabolizmu zaobserwowano także u niektórych współczesnych proteobakterii). Gospodarz wykorzystywał wodór i dwutlenek węgla jako źródła energii i
węgla, podobnie jak niektóre współczesne Archaea. Dopiero później nastąpiło przejście
gospodarza na heterotrofię i uzależnienie symbionta od dostarczanych przez niego związków
organicznych. Symbiont stał się mitochondrium, a zależność została przypieczętowana
transferem genów z genomu symbionta do genomu gospodarza, czyli jądra. Niektórzy
badacze uważają też, że niezależnie od endosymbiozy prowadzącej do powstania
mitochondriów, wcześniej zaszła endosymbioza komórki pochodzącej z linii Archaea z
komórką linii Bacteria, która dała początek systemowi jądra i błon retikulum (Gupta i
Golding, 1996). W myśl tej koncepcji gospodarz, który przyjął przodka mitochondriów sam
był już wynikiem wcześniejszego procesu endosymbiontycznego.
Niezależnie od tego, który ze scenariuszy endosymbiontycznej eukariogenezy jest
prawdziwy, pochodzenie mitochondriów od endosymbiontycznych -proteobakterii wydaje
się dobrze ugruntowane. Genom mitochondrialny byłby w myśl tej koncepcji resztką
genomu symbionta. Analizy sekwencji, głównie SSU-rRNA umieszczają (Gray, 1993)
Rozdział 1. Wstęp
7
genomy mitochondrialne na jednej gałęzi drzewa filogenetycznego, co sugeruje ich
monofiletyzm. Badania te wskazują, że najbliższymi mitochondriom współczesnymi
bakteriami jest
grupa
-proteobakterii
obejmująca
wewnątrzkomórkowe pasożyty
eukariontów takie, jak Rickettsia, Ehrlichia i Anaplasma. Interesujące w tym kontekście jest
częste wśród -proteobakterii występowanie zjawisk endosymbiozy i endopasożytnictwa
(np. Agrobacterium, Rhizobium, Rickettsia). Oczywiście pamiętać należy, że współczesne
endopasożytnicze lub endosymbiontyczne -proteobakterie nie są przodkami mitochondriów,
dzielą jednak z nimi wspólnego przodka, który musiał być szczególnie predysponowany do
wchodzenia w ścisłe relacje z komórkami innych organizmów.
Obecnie uważa się (Palmer, 1997; Germot i wsp., 1996), że wspólny przodek
wszystkich współczesnych eukariontów posiadał mitochondria, zaś amitochondrialne
eukarionty żyjące obecnie (Diplomonadina, Trichomonadina, Microsporidia) utraciły je
wtórnie w wyniku przejścia na metabolizm beztlenowy. Hydrogenosomy, organella
spotykane w komórkach tych organizmów pochodzą najprawdopodobniej właśnie od
mitochondriów. Nie można jednak wykluczyć, że przynajmniej niektóre amitochondrialne
eukarionty (np. Giardia lamblia z grupy Diplomonadina) nigdy mitochondriów nie
posiadały i pochodzą bezpośrednio od pozbawionych mitochondriów urkariontów (Gray
1992),
choć
przeczy
temu
obecność
w
nich
niektórych
białek
pochodzenia
mitochondrialnego, np. Hsp60 (Palmer, 1997). Obecność tego białka tłumaczyć jednak
można (Henze i wsp., 1995) zajściem „kryptycznej”, abortywnej endosymbiozy, która nie
doprowadziła do trwałego wykształcenia organelli. Pozycja amitochondrialnych eukariontów
w ewolucji wciąż jest przedmiotem ożywionej dyskusji (Palmer, 1997; Leblanc i wsp., 1997;
Horner i wsp., 1996; Henze i wsp., 1995).
Zawiązanie się trwałego związku endosymbiontycznego między mitochondriami a
ich gospodarzami pociągnęło za sobą redukcję genomu symbionta i transfer genów do jądra.
Ewolucja miała więc tutaj przebieg degeneratywny (Andersson i Kurland, 1998), redukujący
autonomię organellum. Przykładem wcześniejszego stadium takiej ewolucji może być
genom Rickettsia prowazekii, wewnątrzkomórkowego pasożyta z grupy -proteobakterii
(Andersson i wsp., 1998). Utracił on częściowo autonomię, zachowując jedynie około 900
genów, prawdopodobnie około połowy wyjściowej liczby. Co ciekawe, zachowały się w nim
wszystkie geny odpowiadające za procesy oddychania tlenowego, takie jak geny białek z
kompleksów łańcucha oddechowego, enzymów cyklu kwasów trójkarboksylowych itp.
Rickettsia straciła jednak wszystkie geny kodujące enzymy wcześniejszych, beztlenowych
etapów katabolizmu związków organicznych, np. glikolizy a także geny, których produkty
Rozdział 1. Wstęp
odpowiadają
za
8
procesy
syntezy
aminokwasów
i
nukleotydów.
Pasożytnictwo
wewnątrzkomórkowe upodobniło ją zatem z metabolicznego i genetycznego punktu
widzenia do mitochondrium. Można spekulować, że podobnie mogły wyglądać
najwcześniejsze etapy procesu prowadzącego do powstania mitochondriów.
U współczesnych eukariontów, mimo ogromnej różnorodności organizacji ich
genomów mitochondrialnych liczba zachowanych w nich genów jest bardzo nieduża.
Większość genomów mitochondrialnych zawiera około kilkudziesięciu genów, z czego
kilkanaście zaledwie koduje białka (wszystkie genomy mitochondrialne kodują komplet
tRNA i przynajmniej dwa typy rRNA). Wyjątkową pozycję ma tutaj genom mitochondrialny
Reclinomonas americana, dosyć prymitywnego słodkowodnego heterotroficznego wiciowca
(Lang i wsp., 1997). Spośród wszystkich znanych genomów mitochondrialnych zachował on
najwięcej cech genomu eubakteryjnego. Zawiera największą liczbę genów – 97, z czego 44
geny kodujące białka. Są wśród nich wszystkie geny występujące w mtDNA innych
organizmów a ponadto kilkanaście genów nie występujących w żadnych innych genomach
mitochondrialnych. Są wśród nich geny wielopodjednostkowej polimerazy RNA typu
eubakteryjnego, nie przypominającej polimeraz mitochondrialnych innych organizmów,
liczne geny białek rybosomalnych, trzy rRNA (LSU, SSU i 5S rRNA) oraz podjednostka
RNA RNazy P. Mitochondria R. americana zachowały standardowy kod genetyczny oraz
oddziaływanie SSU rRNA z mRNA typu Shine-Dalgarno. Ponadto widoczne są ślady
organizacji operonowej, z zachowanymi u różnych bakterii grupami genów. Porównanie
mtDNA R. americana z innymi stosunkowo prymitywnymi genomami mitochondrialnymi,
np. Marchantia polymorpha i Acanthoamoeba castellani sugeruje, że pochodzi on z tej
samej linii ewolucyjnej, co inne genomy mitochondrialne, zgodnie z koncepcją ich
monofiletyzmu, wykazuje jedynie wyjątkowo silnie zachowane cechy pierwotne,
przypominające przodka eubakteryjnego.
Porównanie
genomów
wewnątrzkomórkowego
pasożyta
o
zbliżonym
do
mitochondrialnego metabolizmie (Rickettsia), pierwotnego genomu mitochondrialnego o
wyraźnych cechach bakteryjnych (Reclinomonas) oraz współczesnych, silnie zredukowanych
genomów mitochondrialnych wykazuje, że ewolucja mtDNA przebiegała drogą postępującej
redukcji zawartości informacyjnej, upraszczania systemów regulacyjnych (zwłaszcza na
poziomie transkrypcyjnym) oraz pojawiania się odstępstw od powszechnych mechanizmów
genetycznych (np. zmienionego kodu genetycznego). W przypadku endosymbiontów proces
ten połączony jest z transferem genów symbionta do jądra, u endopasożytów, których
obecność nie jest dla komórki niezbędna ani korzystna, procesu takiego się nie obserwuje.
Rozdział 1. Wstęp
9
W przypadku genomów mitochondrialnych, podobnie jak i endopasożytów mamy do
czynienia z reduktywną ewolucją, zmniejszającą zawartość informacyjną genomu. Głównym
mechanizmem odpowiedzialnym za tę tendencję jest tzw. „zapadka Mullera” (Muller, 1964;
Felsenstein, 1974; Andersson i Kurland, 1998). Jest to mechanizm działający na populacje o
niskiej liczebności i pozbawione mechanizmów rekombinacji polegający na nagromadzaniu
w nich niekorzystnych mutacji, czyli nieodwracalnej degeneracji informacji genetycznej.
Mutacje o niekorzystnym adaptacyjnie efekcie są statystycznie znacznie częstsze od mutacji
korzystnych. W dużych populacjach nagromadzanie się niekorzystnych mutacji jest
równoważone przez dobór naturalny i wytwarza się równowaga. Przy znacznej redukcji
liczebności („wąskie gardło” populacyjne) na skutek fluktuacji może zdarzyć się, że w
określonym momencie wszystkie osobniki będą obciążone mutacją. Przy braku rekombinacji
(która pozwoliłaby na odtworzenie „prawidłowego” allelu z dwóch różnych alleli
zmutowanych) takie obniżenie wartości przystosowawczej populacji będzie nieodwracalne
(gdyż mutacje powrotne są dużo mniej częste). Na tym polega nieodwracalność mechanizmu
zapadkowego – obciążenie populacji mutacjami nieuchronnie będzie wzrastać.
Efekty działania zapadki Mullera obserwuje się w wielu przypadkach populacji
endopasożytów, np. wirusów (Chao, 1990, 1997; Chao i Tran, 1997). Wyraźne też są ślady
działania tego mechanizmu w genomie Rickettsia prowazekii (Andersson i wsp., 1998).
Geny, których produkty nie są niezbędne dla funkcjonowania tej bakterii zostały usunięte z
genomu, część z nich pozostaje w DNA w postaci rozpoznawalnych pseudogenów. Gen
metK jest przykładem początkowych faz tego procesu – pewne szczepy Rickettsia posiadają
jego funkcjonalny allel, w innych zawiera on już mutacje uniemożliwiające ekspresję. Zanik
tego genu dopiero się rozpoczął. Efekty niedawnego działania zapadki Mullera można
również obserwować w genomie mitochondrialnym drożdży z rodzaju Saccharomyces na
przykładzie genu ens2 oraz ORF intronów bi2 i ai4 (omówione dokładniej w rozdziale 1.3).
Genomy mitochondrialne stanowią końcowy etap reduktywnej ewolucji, w której
jednym z głównych mechanizmów jest omówiona powyżej zapadka Mullera. Endosymbioza,
która dała początek mitochondriom była pierwszym i najważniejszym etapem znacznego
zawężenia populacji endosymbionta. Wszystkie dzisiejsze eukarionty są pod względem
mitochondrialnym monofiletyczne, a zatem powstały w wyniku jednej skutecznej
endosymbiozy, która dała im przewagę selekcyjną. Wąskie gardło liczebności populacji
związane z tym wydarzeniem musiało zainicjować proces degeneratywnej ewolucji mtDNA.
U wielu, chociaż nie wszystkich współczesnych eukariontów mitochondria są zasadniczo
aseksualne i nie zachodzi w nich rekombinacja (najprawdopodobniej tak jest u wszystkich
Rozdział 1. Wstęp
10
Metazoa). U grzybów i roślin stwierdzono rekombinację mtDNA, lecz nadal przez większą
część trwania mitochondria tworzą małe i odizolowane populacje. Pojawiają się w związku z
tym zasadnicze pytania: w jaki sposób możliwe jest utrzymanie funkcjonalnego mtDNA i
dlaczego redukcja genomu mitochondrialnego nie doprowadziła do jego całkowitego zaniku?
Za utrzymywanie się funkcjonalnego mtDNA w komórkach współczesnych
eukariontów, mimo presji zapadki Mullera mogą odpowiadać silne mechanizmy selekcyjne
(Bergstrom i Pritchard, 1998), związane z tym, ze produkty genów mitochondrialnych są w
tej chwili absolutnie niezbędne dla funkcjonowania całego organizmu. U niższych
eukariontów (np. grzybów) mtDNA może rekombinować, co również może przyczynić się
do uniknięcia efektu zapadki. Utrzymywanie się mitochondrialnych genów kodujących
niektóre białka kompleksów łańcucha oddechowego tłumaczyć można tym, że ich silnie
hydrofobowy charakter może uniemożliwić ich prawidłowy posttranslacyjny transport i
osadzanie w kompleksach (Saccone, 1994). Wiadomo jednak, że niektóre geny mtDNA, np.
atp8 i atp9 (Law i wsp., 1988) można przenieść do genomu jądrowego (patrz rozdział 3.1)
bez utraty aktywności kodowanych przez nie białek. Inna teoria mówi, że istnienie genomu
mitochondrialnego umożliwia koordynację funkcjonowania organellum i komórki, poprzez
dwustronną wymianę sygnałów (Parikh i wsp., 1987; Liao i Butow, 1993; Saccone, 1994).
Przykładem regulacyjnej funkcji mtDNA jest też uczestnictwo produktu mitochondrialnego
genu nd1 u ssaków w tworzeniu kompleksu antygenów zgodności tkankowej (Lindahl i
wsp.,
1991).
Prawdopodobnie
za
utrzymywanie
się
szczątkowego
genomu
mitochondrialnego u współczesnych eukariontów odpowiedzialne są zarówno czynniki
biochemiczne, związane z fizykochemicznymi właściwościami kodowanych w mtDNA
białek, jak i jego rola regulacyjna.
Końcowym etapem reduktywnej ewolucji endosymbiontów są spotykane u
amitotycznych
eukariontów
hydrogenosomy
(Palmer,
1997),
które
są
zapewne
pozbawionymi mtDNA potomkami mitochondriów. Utraciły one jednak również funkcję
oddechową i pełnią odmienną rolę w metabolizmie. Genom mitochondrialny towarzyszy
wszystkim oddychającym tlenem eukariontom.
Podsumowując: mitochondria (podobnie jak plastydy) powstały w wyniku
endosymbiozy przodka eukariontów, którego genom zbliżony był do Archaea z bakterią z
grupy
-proteobakterii.
W
wyniku
reduktywnej
ewolucji
endosymbiont
utracił
samodzielność, zaś jego genom posiada obecnie formę szczątkową, o zawartości
informacyjnej nie przekraczającej 100 genów.
Rozdział 1. Wstęp
11
1.2. Różnorodność mtDNA współczesnych eukariontów
Pomimo tego, że mitochondria współczesnych eukariontów są najprawdopodobniej
monofiletyczne ich różnorodność pod względem organizacji i ekspresji zawartego w nich
materiału genetycznego jest zdumiewająca. Dotyczy to zwłaszcza obszarów niekodujących i
różnych mechanizmów ekspresji genów, gdyż zawartość informacyjna wszystkich mtDNA
jest stosunkowo niewielka – w najbardziej rozbudowanym genomie mitochondrialnym
(Reclinomonas americana) nie przekracza 100 genów.
Wielkość mtDNA różnych organizmów waha się w bardzo szerokim zakresie,
którego granice wyznaczają z jednej strony rośliny wyższe (do 2400 kb), zaś z drugiej strony
Metazoa (14–42 kb). Najmniejszym znanym genomem mitochondrialnym jest mtDNA
pierwotniaka Plasmodium falciparum o długości 6 kb (Feagin, 1992).
Na jednym krańcu spektrum umieścić można genomy mitochondrialne zwierząt
(Metazoa) (Wolstenholme, 1992). Są to małe koliste genomy o wielkości od 14 kb (C.
elegans) do 42 kb (Plactopen magellanicus), najczęściej spotyka się rozmiar rzędu 16 kb. Ich
zawartość informacyjna jest bardzo zbliżona - posiadają 13 genów kodujących białka: trzy
podjednostki
oksydazy
cytochromowej,
apocytochrom
b,
siedem
podjednostek
dehydrogenazy NADH i dwie podjednostki ATP-azy. Jedynie u nicieni nie stwierdzono
jednego z genów ATP-azy (atp8). Poza tym występują dwa geny rRNA i zestaw tRNA.
Wyjątkiem jest tu genom mitochondrialny ukwiała Metridium senile, w którym stwierdzono
tylko 2 geny tRNA. W genomie tym stwierdzono też, jedyne u Metazoa, introny (w genach
cytb i nd5), należące do grupy I. U wszystkich pozostałych zbadanych Metazoa nie
stwierdzono intronów, a sekwencje międzygenowe są zasadniczo bardzo krótkie. Genomy
mitochondrialne zwierząt charakteryzują się więc bardzo silnym upakowaniem, w tej grupie
ewolucja doprowadziła do maksymalnej redukcji rozmiaru, przy pozostawieniu niezbędnych
sekwencji kodujących. W mtDNA Metazoa stwierdza się stosunkowo szybkie tempo mutacji
(głównie podstawień). Związane jest to z faktem, że ze względu na czysto matczyny sposób
dziedziczenia oraz brak rekombinacji na genomy te bardzo silnie działa mechanizm zapadki
Mullera. Kod genetyczny funkcjonujący w mitochondriach Metazoa różni się od
standardowego i dostosowany jest do maksymalnie zredukowanego zestawu tRNA (22).
Uproszczony jest mechanizm transkrypcji - z jednego dwukierunkowego promotora powstają
dwa główne transkrypty, które następnie podlegają złożonej i słabo poznanej obróbce
posttranskrypcyjnej, stanowiącej zapewne główny poziom regulacyjny.
Na drugim biegunie znajdują się genomy mitochondrialne roślin lądowych,
osiągające najwyższe rozmiary (do 2400 kb u Cucumis melo) (Hanson i Folkerts, 1992).
Rozdział 1. Wstęp
12
Rozpiętość rozmiarów mtDNA roślin jest ogromna od ponad 2000 kb do 184 kb (mszak
Marchantia polymorpha). Za różnice te odpowiadają przeważnie sekwencje międzygenowe,
w mniejszym stopniu introny i sekwencje pochodzące z DNA jądrowego i chloroplastowego.
Cechą charakterystyczną mtDNA roślin jest bardzo wysoka częstość rekombinacji,
prowadząca do powstania sytuacji "płynności genetycznej". mtDNA
większości roślin
zawiera liczne sekwencje powtórzone, które powodują różnego rodzaju rearanżacje,
prowadzące do wytworzenia się całej populacji subgenomowych kolistych DNA w stanie
dynamicznej równowagi. Częsta jest też, zwłaszcza u okrytonasiennych dwukierunkowa
wymiana genetyczna miedzy mitochondriami (i chloroplastami) a jądrem (Schuster i
Brennicke, 1994). Bardziej różnorodne są też u roślin zestawy kodowanych w mtDNA
genów. W większości ich genomy zawierają podstawowe geny kodujące białka
(podjednostki oksydazy cytochromowej, apocytochrom b, podjednostki ATP-azy) a także
kilkanaście genów kodujących białka mitorybosomu (u innych eukariontów wszystkie, lub
nieomal wszystkie białka mitorybosomalne są kodowane w jądrze). Poza typowymi dla
wszystkich eukariontów genami rRNA SSU i LSU u roślin (oraz niektórych glonów)
stwierdzono występowanie genu 5S rRNA. Poza linią fotosyntetyzujących Eukaryota (roślin
i zielenic) gen ten stwierdzono jedynie w prymitywnym mtDNA pierwotniaka Reclinomonas
americana, zawierającym wszystkie znane geny mitochondrialne. Geny mitochondrialne,
niespotykane u innych Eukaryota odpowiedzialne są u roślin za szereg nietypowych
fenotypów, np. męską niepłodność, wrażliwość na pewne toksyny grzybowe czy zaburzenia
wybarwienia liści (Hanson i Folkerts, 1992). Rośliny wykorzystują w mitochondriach
uniwersalny kod genetyczny, a cześć ich mitochondrialnych tRNA kodowana jest w genomie
jądrowym i chloroplastowym. Nietypowym elementem ekspresji genów mitochondrialnych
roślin jest redagowanie (editing), polegające przeważnie na posttranskrypcyjnej zamianie C>U (Hanson i Folkerts, 1992). U roślin często występują tez introny, spotyka się nietypowe
warianty mechanizmu składania RNA (tzw. trans-splicing, czyli składanie RNA z oddzielnie
transkrybowanych prekursorów).
Genomy mitochondrialne grzybów wykazują cechy pośrednie w stosunku do
systemów zwierząt i roślin. Wykazują stosunkowo wysoką zmienność rozmiarów (17 do 180
kb) i zawartości genetycznej (Clark-Walker, 1992). Większość z nich koduje podobny
zestaw białek, jak mitochondria zwierząt, u niektórych grzybów (np. S. cerevisiae) mtDNA
nie zawiera jednak genów dehydrogenazy NADH, wiele natomiast zawiera trzy geny ATPazy. U grzybów powszechnie występują introny, stanowiące główny czynnik zmienności
międzygatunkowej. Również obszary niekodujące mogą zajmować istotna część genomu, nie
Rozdział 1. Wstęp
13
osiągając jednak takich rozmiarów, jak w przypadku mtDNA roślin. DNA mitochondrialny
grzybów jest zdolny do rekombinacji, co spowalnia degenerację wywołaną działaniem
zapadki Mullera. U wielu grzybów stwierdzono w mitochondriach odstępstwa od
uniwersalnego kodu genetycznego, brak jednak doniesień o redagowaniu RNA.
Dane dotyczące pozostałych niższych Eukaryota, określanych wspólną nazwa
Protista są dosyć fragmentaryczne. Jest to zresztą grupa niejednorodna filogenetycznie, stąd
stwierdza się w niej bardzo różne warianty organizacji genomów mitochondrialnych. mtDNA
orzęsków (a także Chlamydomonas i Plasmodium) jest liniowy. Dla orzęsków
charakterystyczny jest też niekompletny zestaw kodowanych w mtDNA tRNA, musi zatem
zachodzić u nich import tRNA kodowanych w genomie jądrowym (Cummings, 1992).
Najbardziej niezwykłą organizację genomu mitochondrialnego stwierdzono u
wiciowców z rzędu Kinetoplastida (Stuart i Feagin, 1992). Ich mitochondria, zwane
kinetoplastami, zawierają dwa rodzaje kolistych DNA – maksichromosomy (maxicircles) i
minichromosomy (minicircles). Są one połączone na zasadzie ogniw łańcucha w jedną sieć,
składająca się z kilkudziesięciu maksichromosomów i kilku tysięcy minichromosomów.
Wszystkie geny kodujące białka zawarte są w maksichromosomach. Podlegają one
zachodzącemu na niespotykaną nigdzie indziej skalę redagowaniu, wszystkie transkrypty
zmieniane są w wielu miejscach, liczne nukleotydy wstawiane są posttranskrypcyjnie.
Redagowaniem kierują specjalne RNA, tzw. gRNA (guide RNA), kodowane w
minichromosomach. Znaczenie tak niezwykłego mechanizmu nie jest do tej pory znane,
wiadomo jednak, że zachodzą na tym poziomie procesy regulacyjne.
Rozdział 1. Wstęp
14
1.3. Genetyka mitochondrialna drożdży
1.3.1. Drożdże jako organizm modelowy
Drożdże z rodzaju Saccharomyces, a szczególnie S. cerevisiae stanowią podstawowy
organizm modelowy dla badania procesów związanych z biogenezą i funkcjonowaniem
mitochondriów, zwłaszcza w odniesieniu do roli genomu mitochondrialnego i jego interakcji
z genomem jądrowym. Istnieje ku temu wiele powodów. Po pierwsze, drożdże są najlepiej
pod względem genetycznym poznanym organizmem eukariotycznym, zarówno z punktu
widzenia genetyki klasycznej, jak i molekularnej. Znana jest obecnie pełna sekwencja DNA
genomu drożdży (The Yeast Genome Directory, 1997), trwają prace nad systematyczną
analizą funkcjonalną odkrytych genów. Żaden organizm eukariotyczny nie może też równać
się z S. cerevisiae pod względem różnorodnych możliwości manipulacji genetycznych.
Znane są od dawna proste i skuteczne techniki wydajnej transformacji, ukierunkowanej
inaktywacji genów – szczególnie łatwej ze względu na wysoką częstość rekombinacji
homologicznej (Orr-Weaver i wsp., 1983), izolacji kwasów nukleinowych i białek i wiele
innych. Opracowano szereg dogodnych wektorów bifunkcjonalnych, replikujących się
autonomicznie w komórkach drożdży i bakterii, łatwych do izolacji i pozwalających na
regulowanie w pewnym zakresie liczby kopii w komórce. Podobnie z punktu widzenia
genetyki klasycznej drożdże stanowią idealny organizm badawczy – dają się łatwo hodować
w dużych ilościach na rozmaitych podłożach, w tym syntetycznych o ściśle określonym
składzie, łatwo poddają się mutagenezie, bez trudu prowadzi się krzyżówki oraz analizę
potomstwa mejotycznego metodą mikromanipulacji.
Powyższe zalety wystarczyły do uczynienie z drożdży podstawowego organizmu
modelowego Eukaryota. Istnieją jednak dodatkowe powody, dla których ich rola w genetyce
mitochondrialnej jest nieporównywalna z jakimkolwiek innym organizmem. Do powodów
tych zaliczyć należy przede wszystkim ich fakultatywnie tlenowy metabolizm. Drożdże są w
stanie uzyskiwać energię zarówno w procesach tlenowych (oddychanie), jak i beztlenowych
(fermentacja) zależnie od warunków, dostępności tlenu i źródła węgla. Niektóre źródła węgla
pozwalają na uzyskiwanie energii w obu tych procesach (np. glukoza, galaktoza) inne zaś,
zwane niefermentowalnymi, mogą być wykorzystywane jedynie w procesach oddechowych
(np. glicerol, etanol, mleczan). Komórki S. cerevisiae u których zaburzona zostanie
oddechowa funkcja mitochondriów są w stanie przeżyć i dzielić się, pod warunkiem
dostępności fermentowalnego źródła węgla. Możliwe jest zatem hodowanie na takim
podłożu drożdży, u których zaburzone jest funkcjonowanie łańcucha oddechowego na
Rozdział 1. Wstęp
15
skutek, między innymi, utraty funkcjonalności mitochondrialnego aparatu genetycznego.
Szczepy drożdży całkowicie pozbawione mtDNA (0) są w stanie rosnąć na podłożu
fermentowalnym, jedynie na podłożu niefermentowalnym ich wzrost będzie zahamowany.
Stanowi to podstawę dla konstrukcji bardzo prostych testów wzrostowych umożliwiających
zastosowanie metod genetyki klasycznej i molekularnej do badania funkcjonowania genomu
mitochondrialnego i jego oddziaływań z genomem jądrowym.
Ponadto genom mitochondrialny drożdży wykazuje zdolność do rekombinacji, ze
stosunkowo wysoką częstością, co umożliwia zastosowanie metod genetyki klasycznej do
analizy mutantów w mtDNA, co nie jest możliwe w przypadku mitochondriów zwierzęcych.
Ponieważ mutacje w genach jądrowych zaburzające funkcje mitochondrialną będą w
większości miały podobny fenotyp, jak mutacje w DNA mitochondrialnym, ta sama strategia
badawcza może być zastosowana do analizy oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych. W
połączeniu z możliwościami oferowanymi przez analizę funkcjonalną genomu drożdżowego
otwiera się więc po raz pierwszy możliwość systematycznego zbadania zależności jądrowomitochondrialnych, w tym określenia zestawu genów jądrowych niezbędnych do utrzymania
funkcji mitochondrialnej. Aktualne zbiorcze dane dotychczasowych prac tego typu można
znaleźć dzięki projektowi bazy danych sekwencji mitochondrialnych (MitBASE)
(Attimonelli i wsp., 1999), którego część stanowi baza genów jądrowych zaangażowanych w
biogenezę mitochondrium (patrz też rozdział 4). Na podstawie zawartych tam danych można
oszacować, że w proces ten zaangażowanych jest około 500 genów, z czego dla ponad 300
potwierdzono, lub sugeruje się mitochondrialną lokalizację ich produktu. Liczba ta, zgodna z
wcześniejszymi oszacowaniami (Tzagoloff i Dieckmann, 1990), może być nieco zaniżona,
gdyż niektóre geny zaangażowane w biogenezę mitochondrium nie mają wyraźnej sekwencji
kierującej do tego organellum, wiele z nich jest niezbędnych do funkcjonowania komórki (a
przez to mutacje w nich są letalne) a znacząca cześć genomu drożdży nie została jeszcze
objęta analizą funkcjonalną. Można jednak przypuszczać, że dalsze postępy badań pozwolą
na pełne określenie zestawu genów jądrowych zaangażowanych w funkcje mitochondrialne i
przez to dadzą po raz pierwszy pełny obraz oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych.
Różnorodność organizacji i ekspresji genomów mitochondrialnych, zarysowana w
poprzednim rozdziale, skłania do postawienia pytania, na ile informacje uzyskane w wyniku
badań nad drożdżami mogą być przydatne w poszukiwaniach odpowiedzi na problemy
dotyczące funkcjonowania mitochondriów innych organizmów, a zwłaszcza człowieka. Na
pełną odpowiedź na to pytanie jest jeszcze stanowczo za wcześnie, zwłaszcza że wiedza na
temat funkcjonowania mitochondriów ludzkich, a zwłaszcza zależności jądrowo-
Rozdział 1. Wstęp
16
mitochondrialnych jest wciąż bardzo fragmentaryczna. Dotychczasowe wyniki wykazują
jednak, że drożdże są zadziwiająco dobrym modelem podstawowych funkcji komórki
eukariotycznej, również w odniesieniu do komórek ludzkich. Porównanie sekwencji genów
drożdżowych ze znanymi dotychczas genami człowieka (Botstein i wsp., 1997) wykazuje, że
co najmniej 30% z nich wykazuje znaczącą homologię z genami ssaków. Podstawowe
mechanizmy funkcjonowania komórki są na tyle podobne, że doświadczenia na drożdżach
przyczyniły się nie tylko ich poznania na najprostszym poziomie, lecz również dostarczyły
modeli pozwalających na badanie problemów tak szczególnych, jak niektóre wady
genetyczne u ludzi (Botstein i wsp., 1997). Najbardziej spektakularnym przykładem może tu
być pełniący podobne funkcje u drożdży i u człowieka gen SGS1 (WRN), kodujący helikazę
DNA, którego mutacje powodują u ludzi występowanie zespołu Wernera, choroby o
charakterze progerii (Watt i wsp., 1996; Gray i wsp., 1997). W przypadku będących tematem
tej pracy oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych brak jest, jak na razie, podobnie
spektakularnych przykładów użyteczności modelu drożdżowego. Badania nad drożdżami
przyczyniły się jednak do ogólnego poznania mechanizmów funkcjonowania genów
mitochondrialnych, z których większość ma swoje odpowiedniki w mtDNA ludzkim.
Badania nad mtDNA drożdży doprowadziły do dokładnego poznania genów kodujących na
przykład apocytochrom b (cytb), czy podjednostki oksydazy cytochromowej (cox1, cox2 i
cox3). Produkty tych genów z mitochondriów ludzkich mają strukturę na tyle wyraźnie
zachowaną, że możliwe jest, po odpowiednim uliniowaniu, ekstrapolowanie wyników
analizy mutacyjnej genów drożdżowych na geny ludzkie, co może przyczynić się do
zbadania mechanizmów prowadzących do powstania patologii związanych z mutacjami
mtDNA u człowieka.
Mimo znacznych różnic w strukturze i ekspresji mtDNA między drożdżami i
człowiekiem, wiele podstawowych mechanizmów funkcjonuje podobnie, co zgodne jest z
koncepcją monofiletycznego pochodzenia mitochondriów, nawet u odległych ewolucyjnie
eukariontów. Przykładowo, funkcję podstawowego czynnika transkrypcyjnego u drożdży i u
człowieka spełniają ortologiczne białka mTF1 (Clayton, 1992). Można oczekiwać, że wiele
poznanych u drożdży mechanizmów ekspresji genomu mitochondrialnego znajdzie swe
odpowiedniki w układzie komórek człowieka, co potwierdzi rolę, jaką ten organizm
modelowy spełnia w badaniach nad funkcjonowaniem komórek eukariotycznych.
Rozdział 1. Wstęp
17
1.3.2. Klasyczna analiza genomu mitochondrialnego drożdży i oddziaływań
jądrowo-mitochondrialnych
Jak wspomniano powyżej, droga do poznania mitochondrialnego systemu
genetycznego u drożdży rozpoczęła się od izolacji i analizy mutantów, których fenotyp
sugeruje zmiany w funkcjonowaniu mitochondriów. Podstawowe typy takich mutantów
zostaną podsumowane poniżej.
– (rho-) – zwane również „petitami cytoplazmatycznymi” (“cytoplasmic petites”). Są to
najdłużej znane mutacje mitochondrialne (Ephrussi i wsp., 1949a;b; Dujon, 1983).
Mutanty – charakteryzują się niewydolnością oddechową – na fermentowalnym źródle
węgla takim, jak glukoza rosną wolniej niż dzikie szczepy i tworzą mniejsze kolonie –
stąd nazwa petite; nie są natomiast w stanie wykorzystywać niefermentowalnych źródeł
węgla takich, jak glicerol, etanol czy mleczan. Na podstawie analizy mtDNA tych
mutantów stwierdzono, że wykazują one bardzo znaczne delecje dużych fragmentów
DNA mitochondrialnego (Mounolou i wsp., 1966), powstałe spontanicznie bądź
indukowane działaniem czynników interkalujących takich, jak bromek etydyny i
akryflawiny (Slonimski i wsp., 1968). Delecje kompensowane są przez reiterację
(powtórzenie) pozostającego fragmentu; tak zmieniony mtDNA jest replikowany, mimo
iż nie zawsze zawiera normalne miejsce startu replikacji (Faye i wsp., 1973; Fukuhara i
wsp., 1974; Michaelis i wsp., 1976). W mitochondriach – nie zachodzi oddychanie ani
synteza białek mitochondrialnych (Slonimski i Ephrussi, 1949; Slonimski, 1953).
0 (rho0) – to skrajny przypadek zmian typu – odpowiadający całkowitej utracie
mtDNA. Efekt fenotypowy jest taki sam, jak w przypadku – . Podobnie jak w
poprzednim przypadku, mutacje 0 powstają spontanicznie lub w wyniku działania
czynników interkalujących. Inaktywacja niektórych genów jądrowych może też
prowadzić do powstawania komórek 0 (Myers i wsp., 1985).
mit– – są to punktowe mutacje (lub niewielkie delecje) w mtDNA, powodujące utratę
aktywności produktów konkretnych genów mitochondrialnych. Liczne mutacje tego typu
powodujące niewydolność oddechową zlokalizowano m. in. w genach mitochondrialnych
kodujących elementy łańcucha oddechowego (Tzagoloff i wsp., 1975a,b,c; Slonimski i
Tzagoloff, 1976; Kotylak i Slonimski, 1976, 1977). W mitochondriach mit– zachodzi
normalna synteza białek. Mutacje mit– stanowią źródło informacji o funkcjonowaniu
konkretnych genów mitochondrialnych (np. di Rago i wsp., 1990a,b,c), posłużyły
Rozdział 1. Wstęp
18
również przy konstrukcji mapy genetycznej genomu mitochondrialnego (Dujon i wsp.,
1977).
syn– – są to mutacje punktowe, zlokalizowane w genomie mitochondrialnym, których
efektem jest zaburzenie syntezy białka w mitochondriach (Bolotin-Fukuhara i wsp.,
1977). Dotyczą najczęściej genów tRNA, niektóre zlokalizowane są w genach rRNA.
antR – te punktowe mutacje mitochondrialne nadają komórkom oporność na pewne
antybiotyki hamujące funkcjonowanie mitochondriów (Dujon, 1981). Służą jako
wygodne markery przy analizach genetycznych genomu mitochondrialnego.
mim – są to mutacje mitochondrialne będące supresorami defektów typu mit– (Dujardin i
wsp., 1980; Dujardin i wsp., 1982).
pet– — zwane „petitami jądrowymi” (“nuclear petites”). Są to jądrowe mutacje
powodujące
niewydolność
oddechową
poprzez
zaburzenie
funkcjonowania
mitochondriów. Od momentu ich odkrycia (Chen i wsp., 1950) otrzymano bardzo wiele
tego typu mutantów należących do kilkuset grup komplementacji (Tzagoloff i
Dieckmann, 1990). Defekty pet– dotyczą zarówno struktury i metabolizmu
mitochondriów, jak i ekspresji genów mitochondrialnych.
jądrowe supresory defektów mitochondrialnych — jest to bardzo zróżnicowana grupa
mutacji, będących supresorami defektów typu mit– lub syn–. Mutacje takie nazwane
zostały przez odkrywców NAM (Nuclear Accomodation of Mitochondria) (Dujardin i
wsp., 1980), od tego czasu poznano bardzo wiele takich mutacji, których odkrywcy nie
trzymają się jednolitej terminologii. Osobną grupę stanowią supresory wielokopiowe –
nadekspresja tych genów (poprzez wprowadzenie na plazmidzie wielokopiowym)
prowadzi do supresji defektów mitochondrialnych (mit–, syn–) lub jądrowych pet– (Koll i
wsp., 1987; Linder i Slonimski, 1989; Ben Asher i wsp., 1989).
Dziedziczenie mutacji jądrowych opisanych powyżej nie różni się niczym od
dziedziczenia innych genów drożdżowych i podlega prawom klasycznej genetyki.
Dziedziczenie cech mitochondrialnych podlega natomiast odrębnym, specyficznym regułom
(Bolotin i wsp., 1971).
Diploid powstały w wyniku krzyżówki mitochondrialnej (np. antR x antS) posiada w
cytoplazmie mieszaninę mitochondriów pochodzących od obu komórek rodzicielskich.
Podziały mitotyczne takiej komórki będą, przez znaczną (niekiedy do kilkunastu) liczbę
pokoleń dawały populacje mieszane. W trakcie tych podziałów zachodzi też rekombinacja
między cząsteczkami DNA mitochondrialnego. Segregacja mitotyczna w fazie diploidalnej
stanowi pierwszą zasadę dziedziczenia mitochondrialnego.
Rozdział 1. Wstęp
19
W wyniku licznych pasaży możliwe jest otrzymanie klonów jednorodnych pod
względem genotypu mitochondrialnego. Mejoza w takim szczepie nigdy nie prowadzi do
segregacji markerów mitochondrialnych – genotyp mitochondrialny wszystkich spor jest taki
sam jak wyjściowego diploida. Brak segregacji mejotycznej stanowi drugą zasadę
dziedziczenia mitochondrialnego.
Powyższe
zasady
stanowią
o
niemendlowskim
charakterze
dziedziczenia
mitochondrialnego i odróżniają je od dziedziczenia jądrowego (Bolotin i wsp., 1971).
Innym zjawiskiem typowym dla dziedziczenia pewnych cech mitochondrialnych jest
polarność. W przypadku polarnej transmisji, zamiast normalnego, statystycznego (1:1)
rozdziału cech rodzicielskich między potomstwo obserwuje się bardzo znaczną (do 95%)
przewagę jednego z genotypów nad drugim. Zjawisko to zaobserwowano dla niektórych
markerów antR (CR i ER), czynnik odpowiadający za polarność ich przekazywania nazwano
1 (Bolotin i wsp., 1971). Krzyżówka 1+ x 1- daje w wyniku prawie wyłącznie potomstwo 1+
wraz z kotransmisją markerów C i E. Późniejsze badania wykazały (Dujon, 1980), że ów
czynnik 1 tożsamy jest z intronem w genie kodującym 21S rRNA. Transpozycja tego
intronu, przebiegająca za pośrednictwem kodowanego przezeń białka i pociągająca za sobą
konwersję flankujących sekwencji stanowi podstawę molekularną zjawiska polarności
(Colleaux i wsp., 1986; Macreadie i wsp., 1985).
1.3.3. Struktura i funkcjonowanie mtDNA S. cerevisiae – zarys
Genom mitochondrialny Saccharomyces cerevisiae jest dwuniciową, kolistą
cząsteczką DNA o długości wynoszącej, zależnie od szczepu 74 do 85kb. Różnice między
szczepami związane są głównie z fakultatywnym charakterem intronów, w mniejszym
stopniu również z polimorfizmem obszarów międzygenowych. Genom mitochondrialny S.
cerevisiae zawiera kilkadziesiąt genów, opisanych w skrócie poniżej.
1.3.3.1. Geny kodujące produkty białkowe
W mtDNA S. cerevisiae znajduje się 8 (w niektórych szczepach 9) genów
kodujących białka. Nie wliczono tu produktów wewnątrzintronowych ramek odczytu, które
omówione zostaną osobno. Geny te to:
cytb – koduje apocytochrom b, gen ten znajduje się w mtDNA wszystkich eukariontów,
kodowane przezeń białko jest stosunkowo silnie konserwowane ewolucyjnie. U S.,
cerevisiae gen ten zawiera introny: dwa w szczepie „krótkim”, pięć w szczepie „długim”
(Lazowska i wsp., 1980; Nobrega i Tzagoloff, 1980; Bonitz i wsp., 1982).
Rozdział 1. Wstęp
20
cox1 – koduje pierwszą podjednostkę oksydazy cytochromowej (cały enzym ma 9
podjednostek, patrz Hatefi, 1985). Również ten gen u wszystkich znanych eukariontów
znajduje się w mtDNA. U S. cerevisiae gen ten posiada od 5 do 7 intronów (Bonitz i
wsp., 1980; Hensgens i wsp., 1983).
cox2 – koduje drugą podjednostkę oksydazy cytochromowej (Coruzzi i wsp., 1981). U
większości eukariontów jest to gen mitochondrialny, znane wyjątki to Chlamydomonas
reinhardtii i Plasmodium falciparum (Leblanc i wsp., 1997).
cox3 – koduje trzecią podjednostkę oksydazy cytochromowej (Thalenfeld i Tzagoloff,
1980). U większości eukariontów jest to gen mitochondrialny, znane wyjątki to
Chlamydomonas reinhardtii i Paramecium aurelia (Leblanc i wsp., 1997).
atp6
–
koduje
szóstą
podjednostkę
kompleksu
ATPazy
(ATP
syntetazy)
mitochondrialnej o masie 20 kD (Hensgens i wsp., 1979). Gen ten występuje w mtDNA
zwierząt, roślin i grzybów, poza genomem mitochondrialnym znajduje się u niektórych
Protista (Leblanc i wsp., 1997).
atp8
–
koduje
ósmą
podjednostkę
kompleksu
ATPazy
(ATP
syntetazy)
mitochondrialnej o masie 10 kD (Macreadie i wsp., 1983). Gen ten występuje w mtDNA
zwierząt (z wyjątkiem nicieni) i grzybów, poza genomem mitochondrialnym znajduje się
u roślin, glonów i niektórych Protista (Leblanc i wsp., 1997).
atp9 – koduje podjednostkę 9 ATPazy mitochondrialnej o masie 7.6 kD (Macino i
Tzagoloff, 1979). Występowanie genu atp9 w mtDNA jest typowe dla grzybów, roślin i
wielu Protista, poza mtDNA występuje on natomiast u zwierząt.
var1 – Bardzo nietypowy gen, kodujący białko wchodzące w skład mitorybosomu
(Terpstra i Butow, 1979). Występuje w nim szereg nieintronowych elementów
opcjonalnych, co powoduje znaczną zmienność kodowanego produktu (Hudspeth i wsp.,
1984). Białko var1 nie ma odpowiednika wśród innych białek rybosomalnych, a jego
występowanie ograniczone jest do mitochondriów niektórych grzybów.
ens2 – gen, kodujący podjednostkę heterodimerycznej endonukleazy mitochondrialnej
Endo-SceI uczestniczącej w rekombinacji mtDNA (Nakagawa i wsp., 1991, 1992).
Druga podjednostka Endo-SceI (ENS1) jest kodowana przez genom jądrowy i należy do
rodziny białek szoku cieplnego o masie około 70 kD (Morishima i wsp., 1990). W
niektórych szczepach ta opcjonalna ramka odczytu jest nieaktywna w wyniku
nagromadzenia mutacji. Stanowi to ewidentny przykład działania zapadki Mullera (patrz
poprzednie rozdziały), prowadzącej do degeneracji genów mitochondrialnych, nie
będących niezbędnymi do życia. Warto zauważyć, że jest to sytuacja analogiczna z
Rozdział 1. Wstęp
21
opisaną przez (Andersson i wsp., 1998) dla genu metK Rickettsia prowazekii. W mtDNA
S. cerevisiae występują dwa inne nieaktywne już geny tego typu, oznaczane jako RF1 i
RF2, stanowiące efekt działania tego samego procesu ewolucji reduktywnej.
1.3.3.2. Geny kodujące mitochondrialne RNA
W mitochondriach S. cerevisiae znajduje się 25 genów tRNA, wystarczających dla
zapewnienia translacji wszystkich genów mitochondrialnych. Oprócz tego, podobnie jak u
wszystkich Eukaryota, w mtDNA drożdży znajdują się dwa geny rRNA (LSU i SSU rRNA).
gen LSU-rRNA zawiera jeden intron (Dujon, 1980), co jest typową cechą tego genu u
grzybów. Dodatkowo w mtDNA S. cerevisiae znajduje się gen kodujący rybozym RNazy P,
enzymu odpowiadającego za obróbkę tRNA (Guerrier-Takada i wsp., 1983). Gen taki
występuje w mitochondriach bardzo rzadko, poza drożdżami z rodzaju Saccharomyces i
niektórymi innymi grzybami (np. Aspergillus nidulans) został stwierdzony jedynie w
najbardziej pierwotnym znanym genomie mitochondrialnym pierwotniaka Reclinomonas
americana (Lang i wsp., 1997).
1.3.3.3. Introny i geny intronowe
Występowanie intronów stwierdzono w mtDNA wszystkich praktycznie grup
Eukaryota. U Metazoa występowanie intronów ograniczone jest do jedynego znanego
przypadku (ukwiał M. senile), we wszystkich pozostałych liniach ewolucyjnych geny
mitochondrialne zawierają różne ilości intronów. Zawartość intronów może podlegać dużym
wahaniom, nawet pomiędzy blisko ze sobą spokrewnionymi gatunkami (por. rozdział 2.3), co
sugeruje, że są one w ewolucji elementami ruchomymi, z możliwością poziomego transferu
międzygatunkowego.
Biologia intronów mitochondrialnych została najlepiej zbadana u drożdży, zwłaszcza
u S. cerevisiae. Różne szczepy tego gatunku zawierają do 13 intronów w trzech genach
mitochondrialnych. Introny mitochondrialne różnią się strukturą i mechanizmem obróbki od
intronów spotykanych w genach jądrowych Eukaryota. Na podstawie struktury i
mechanizmu obróbki wyróżniono (Michel i wsp., 1982) dwie główne grupy grupę I i II. U S.
cerevisiae stwierdzono w mitochondriach 9 intronów grupy I i 4 grupy II. Niektóre spośród
intronów mitochondrialnych (obu grup) wykazują zdolność do samowycinania in vitro,
wydaje się jednak, że in vivo w procesie tym biorą udział różne białka.
Niezwykłą cechą niektórych intronów mitochondrialnych jest występowanie w nich
otwartych ramek odczytu, których produkty pełnią istotne funkcje w biologii tych intronów.
Rozdział 1. Wstęp
22
Produkty genów wewnątrzintronowych u S. cerevisiae można zaliczyć do następujących
grup:
maturazy – są to białka niezbędne do prawidłowego wycinania odpowiednich intronów.
Ramki odczytu maturaz są połączone w fazie z poprzedzającymi je egzonami,
powstające białko odpowiada za wycięcie intronu, co umożliwia translację kolejnego
egzonu. Dojrzewanie mRNA zawierającego takie introny ma zatem charakter
kaskadowy, aktywność każdej maturazy jest niezbędna dla zapewnienia prawidłowej
obróbki leżących poniżej, w kierunku 3’ intronów. Typowymi maturazami są produkty
ORF intronów cytb bi2 (Jacq i wsp., 1980; Lazowska i wsp., 1980), bi3 (Lazowska i
wsp., 1989) i bi4 (De La Salle i wsp., 1982; Labouesse i wsp., 1984). Maturaza bi4
zapewnia również wycinanie intronu ai4 w genie cox1 (Labouesse i wsp., 1984). Produkt
ORF ai4 nie posiada aktywności maturazy, może ją jednak odzyskać w wyniku
pojedynczej mutacji (Dujardin i wsp., 1982). Aktywność maturazy wykazują również
produkty ORF intronów cox1 ai1 i ai2 (Carignani i wsp., 1983, 1986), różnią się one
jednak od typowych maturaz intronów cytb tym, że posiadają oprócz tego aktywność
odwrotnej transkryptazy (Kennell i wsp., 1993) nadającej im mobilność (Lazowska i
wsp., 1994).
endonukleazy – są to białka wykazujące aktywność specyficznych względem sekwencji
endonukleaz DNA. Ich aktywność promuje rekombinację, nadająca intronom mobilność,
czyli zdolność do aktywnej konwersji allelu pozbawionego intronu (Dujon i wsp., 1986).
Aktywność taką mają produkty intronów: w genie LSU rRNA (Macreadie i wsp.,
1985; Colleaux i wsp., 1986), oraz ai3 (Perea i wsp., 1993; Sargueil i wsp., 1991), ai4
(Delahodde i wsp., 1989; Wenzlau i wsp., 1989) i ai5 (Moran i wsp., 1992) w genie
cox1. U blisko spokrewnionego z S. cerevisiae gatunku S. capensis produkt ORF intronu
bi2 cytb posiada zarówno aktywność maturazy (podobnie jak jego odpowiednik z S.
cerevisiae) jak i endonukleazy (Szczepanek i Lazowska, 1996; Szczepanek i wsp., 1994).
Zamiana zaledwie dwóch kodonów wystarczy, aby produkt ORF bi2 S. cerevisiae
odzyskał aktywność endonukleazy (Szczepanek i Lazowska, 1996).
Przedstawiony powyżej podział nie uwzględnia faktu, że niektóre białka intronowe mogą
łączyć dwie aktywności. Poza intronami ai1 i ai2 (maturaza/odwrotna transkryptaza)
przykładem może być też intron bi2 S. capensis (maturaza/endonukleaza).
W biologii genów intronowych rodzaju Saccharomyces, podobnie jak w przypadku
omówionego powyżej genu ens2, widać wyraźnie efekty działania degeneracyjnej ewolucji
wywołanej przez mechanizm zapadki Mullera. Produkt ORF intronu ai4 utracił aktywność
Rozdział 1. Wstęp
23
maturazy, do przywrócenia której wystarczy pojedyncza mutacja (Dujardin i wsp., 1982).
Produkt ORF intronu bi2 utracił z kolei aktywność endonukleazy, zachowaną u S. capensis.
Do przywrócenia tej aktywności wystarczą dwie mutacje (Szczepanek i Lazowska, 1996). W
tym ostatnim przypadku znamienne jest to, że zachowana została niezbędna dla prawidłowej
ekspresji genu aktywność maturazy, utracona została natomiast aktywność endonukleazy,
zapewniająca intronowi zdolność aktywnego utrzymywania się w genomie. Jest to typowy
przykład degeneracji pasożytów (introny można traktować jako pasożytnicze „samolubne
geny”) wywołanej presją mutacyjną zapadki Mullera. Można spekulować, że tego typu
mechanizmy doprowadziły do znacznej redukcji liczby intronów w mtDNA wyższych
eukariontów.
1.3.4. Oddziaływania jądrowo-mitochondrialne u S. cerevisiae- zarys
Oczywiste jest, że informacja zawarta w mitochondriach nie jest wystarczająca do
zapewnienia
funkcji
organellum.
Ogromna
większość
białkowych
składników
mitochondrium kodowana jest przez genom jądrowy. Pochodzą one przeważnie od genów
endosymbionta, które w toku ewolucji przeszły do genomu jądrowego (Gray, 1993). U
drożdży szacuje się (patrz rozdział 1.3.1), że w biogenezę mitochondrium zaangażowane są
produkty ponad 500 genów jądrowych, z czego dla ponad 300 istnieją przesłanki, że produkt
lokalizuje się w mitochondriach. Znaczna ich część koduje oczywiście składniki strukturalne
i enzymatyczne mitochondrium. Bardzo interesującą grupę stanowią geny, których produkty
zaangażowane są w ekspresję informacji genetycznej zawartej w mtDNA. Mutacje w takich
genach zaburzają ekspresję genów mitochondrialnych na różnych etapach, co w połączeniu z
możliwościami stwarzanymi przez genetykę drożdży otwiera drogę do ich badania. Genom
tym poświęcono wiele prac przeglądowych, na przykład (Bolotin-Fukuhara i Grivell, 1992;
Costanzo i Fox, 1990; Grivell, 1995; Tzagoloff i Dieckmann, 1990). Wyczerpująca listę
takich genów oraz zaawansowany system wyszukiwania informacji o nich zawarto w bazie
danych MitBASE (Attimonelli i wsp., 1999), dostępne są pod adresem URL
http://www3.ebi.ac.uk/Research/Mitbase/mitbiog.pl.
W tabeli 1.1 w skróconej formie przedstawione zostaną, na przykładzie drożdży –
jedynego organizmu u którego uzyskano dostateczną ilość wyników doświadczalnych –
podstawowe etapy ekspresji genów mitochondrialnych i przykładowe biorące w nich udział
geny jądrowe.
Proces
Replikacja mtDNA
Transkrypcja
Geny jądrowe
MIP1
RPO41, MTF1
Literatura
(Foury, 1989)
(Schinkel i Tabak, 1989; Jang i
Jaehning, 1991)
Rozdział 1. Wstęp
Obróbka RNA, regulacja stabilności
Wycinanie intronów
Translacja1
Składanie kompleksów białkowych
1
24
SUV3, DSS1, PET127, CBT1, rozdział 2, (Rieger i wsp., 1997;
PET309, CBP1, AEP1
Dieckmann i wsp., 1984a,b;
Dieckmann i Mittelmeier, 1987;
Manthey i McEwen, 1995; Payne i
wsp., 1991)
CBP2, MSS18, MRS1, MRS2, (Bousquet i wsp., 1990; Costanzo i
MRS3, MRS4
Fox, 1990; Grivell, 1995; McGraw i
Tzagoloff, 1983; Séraphin i wsp.,
1988; Tzagoloff i Dieckmann,
1990; Wiesenberger i wsp., 1991;
Wiesenberger i wsp., 1992)
MRP21, MRP51, PET111, (Brown i wsp., 1994; Mulero i wsp.,
PET112, PET54, PET122, 1994; Fox, 1996; Green-Willms i
PET494, CBS1, CBS2, CBP6, wsp.,
1998;
Rodel,
1986;
TUF1,
Dieckmann i Tzagoloff, 1985;
Nagata i wsp., 1983)
ABC1, CBP3, ATP10, ATP11, (Bousquet i wsp., 1991; Wu i
ATP12, COX10, COX11
Tzagoloff, 1989; Nobrega i wsp.,
1990; Tzagoloff i wsp., 1990;
Ackerman i Tzagoloff, 1990)
Nie uwzględniono genów kodujących białka mitorybosomu
Tabela 1.1. Niektóre spośród znanych genów jądrowych zaangażowanych w różne etapy ekspresji genomu
mitochondrialnego.
Przedstawione w tabeli 1.1 geny nie wyczerpują oczywiście wszystkich znanych
genów tego typu, wystarczają jednak jako przykłady dla zilustrowania ogólnej zasady, że w
każdym z procesów związanych z ekspresją genomu mitochondrialnego bierze udział wiele
kodowanych przez geny jądrowe białek, tworzących nierzadko wielopodjednostkowe
kompleksy. Szczegółową analizę jednego z takich kompleksów przedstawiono w rozdziale 2.
Mniej jak na razie wiadomo o wpływie mitochondriów i ich genomu na ekspresję
genów jądrowych. Istnieją przesłanki doświadczalne, że stan metaboliczny mitochondrium
wpływa na regulację genów jądrowych (Parikh i wsp., 1987; Liao i Butow, 1993), i że
istotną rolę odgrywa w tym zjawisku mtDNA. Prowadzone obecnie przy wykorzystaniu
technik globalnej analizy transkryptów drożdżowych badania (R.A. Butow, wyniki
niepublikowane) mogą przyczynić się do dalszego pogłębienie wiedzy na temat regulacji
genomu jądrowego przez mitochondria.
Rozdział 1. Wstęp
25
1.4. Podsumowanie
Mitochondria powstały w wyniku endosymbiozy przodka eukariontów z bakterią
zbliżoną do dzisiejszych -proteobakterii. W wyniku zacieśnienia symbiozy metabolicznej
doszło do wzajemnego uzależnienia się symbionta i gospodarza. Na skutek działającej na
populacje endosymbionta presji mutacyjnej (zapadka Mullera) jego genom uległ
postępującej redukcji, a większość niezbędnych do jego utrzymania genów znalazła się w
genomie jądrowym. Genomy mitochondrialne dzisiejszych eukariontów są silnie
zredukowane, a ich zawartość informacyjna nie przekracza kilkudziesięciu genów. W
wyniku tego procesu wykształciło się też szereg nietypowych mechanizmów ekspresji
informacji genetycznej (odstępstwa od uniwersalnego kodu, redagowanie).
Przejście większości genów odpowiedzialnych za biogenezę mitochondrium do jądra
spowodowało wytworzenie szeregu współzależności, w których za procesy mitochondrialne
odpowiadają produkty zarówno genów jądrowych, jak i mitochondrialnych. Współzależności
te określane są nazwą oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych.
Idealnym modelem do badania genetyki mitochondrialnej i oddziaływań jądrowomitochondrialnych są drożdże, a zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae. Rozwinięte metody
doświadczalne i nagromadzona dotychczas wiedza na temat genetyki tego organizmu
pozwalają
na
szczegółowe
badanie
różnych
aspektów
oddziaływań
jądrowo-
mitochondrialnych.
W dalszej części pracy przedstawiono wyniki kilku projektów badawczych, mających
na celu zbadanie różnych aspektów oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych u drożdży. W
rozdziale 2 przedstawiono wyniki prac nad genami jądrowymi uczestniczącymi w regulacji
stabilności RNA w mitochondriach drożdży S. cerevisiae i S. douglasii. W rozdziale 3
przedstawiono metody pozwalające na konstrukcję nowych, nie występujących w naturze
genomów mitochondrialnych. Metody te wykorzystano do przeniesienia do mitochondrium
genu jądrowego kodującego jeden ze składników łańcucha oddechowego. W rozdziale 4
przedstawiono prace przyczyniające się do stworzenia pierwszej kompletnej i zintegrowanej
bazy danych sekwencji mitochondrialnych.
Część II.
Badania nad funkcją i ewolucją genu SUV3
Rozdział 2.1. Wprowadzenie. Fenotypy genu SUV3
27
2.1. Wprowadzenie. Porównawcza analiza sekwencji białka suv3p
2.1.1. Rola oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych w regulacji stabilności
mitochondrialnych RNA
Regulację ekspresji genów przez kontrolę stabilności RNA spotyka się we
wszystkich znanych układach genetycznych. Idea, że degradacja mRNA jest niezbędna, by w
ogóle mogła zachodzić jakakolwiek regulacja ekspresji kodowanego przezeń białka pojawiła
się już w pierwszych modelach regulacji genu (Jacob i Monod, 1961). We wszystkich
komórkach, począwszy od bakteryjnych a skończywszy na ludzkich, spotyka się
wyspecjalizowane
systemy
degradujące
RNA.
U
Escherichia
coli
stwierdzono
występowanie wyspecjalizowanego kompleksu, zwanego degradosomem (Py i wsp., 1994),
złożonego z kilku białek o różnych funkcjach. Poprzez regulowaną aktywnośc
egzonukleolityczną 3’-5’ determinuje on powstawanie prawidłowo uformowanego końca 3’
mRNA, regulując jego trwałość.
Podobnie jak u bakterii, w komórkach eukariotycznych istnieją systemy regulujące
stabilność RNA przez działającą na koniec 3’ aktywność egzonukleolityczną. (Mitchell i
wsp., 1997) opisali tego typu kompleks w komórkach drożdżowych, nazwany egzosomem.
W jego skład wchodzi szereg różnych białek o aktywności egzonukleazy 3’-5’.
Stabilność RNA, wraz z innymi posttranskrypcyjnymi mechanizmami regulacyjnymi
odgrywa szczególną rolę w ekspresji genomu mitochondrialnego. W przeciwieństwie do
systemów kontroli ekspresji genów jądrowych, transkrypcja odgrywa stosunkowo niewielką
rolę w regulacji genów mitochondrialnych. Promotory genów mitochondrialnych u drożdży
mają stosunkowo prostą strukturę, za transkrypcję odpowiada jedna, bardzo prosta
polimeraza RNA, z która oddziałuje bardzo niewielka ilość białek (Schinkel i wsp., 1988;
Schinkel i Tabak, 1989; Ticho i Getz, 1988; Jang i Jaehning, 1991). Dodatkowo, większość
genów znajduje się w policistronowych jednostkach transkrypcyjnych. Ciężar zróżnicowania
i kontroli ekspresji genów mitochondrialnych został zatem przeniesiony na procesy
posttranskrypcyjne, w tym kontrolowaną degradację RNA. W przypadku ludzkich
mitochondriów zjawisko to jest jeszcze wyraźniejsze: polimeraza RNA oddziaływuje tam z
zaledwie jednym czynnikiem transkrypcyjnym, z jednego dwukierunkowego promotora
powstają zaledwie dwa transkrypty, z których jeden zawiera większość kodowanych przez
mtDNA genów (Clayton, 1992). Cała praktycznie regulacja ekspresji ludzkich genów
mitochondrialnych musi się zatem odbywać na poziomie posttranskrypcyjnym, przy czym
wiedza o tych procesach jest na razie bardzo fragmentaryczna.
Rozdział 2.1. Wprowadzenie. Fenotypy genu SUV3
28
Wiadomo, że żaden ze znanych genów mitochondrialnych nie koduje białka o
aktywności egzonukleazy. Za regulację stabilności mitochondrialnych RNA odpowiadają
zatem produkty genów jądrowych, mamy więc do czynienia z kolejnym elementem złożonej
sieci oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych. Jedynym jak na razie systemem modelowym
dającym pełne możliwości badań tych oddziaływań są drożdże Saccharomyces cerevisiae.
U drożdży opisano jedyny dotychczas zidentyfikowany mitochondrialny system
regulujący stabilność RNA. Min i wsp. (1992) wykryli w mitochondriach drożdżowych
kompleks kilku (co najmniej trzech) białek o aktywności egzonukleazy 3’-5’ zależnej od
NTP (mtEXO). Margossian i wsp. (1996) wykazali, że jednym z jego składników jest
produkt sklonowanego wcześniej (Stepien i wsp., 1992) genu SUV3. Produkt genu SUV3
posiada w sekwencji motywy sugerujące jego przynależność do dużej i różnorodnej rodziny
zależnych od ATP helikaz RNA.
Badania nad genem SUV3 prowadzone w Zakładzie Genetyki UW doprowadziły do
sklonowania genu DSS1 kodującego drugi element kompleksu mtEXO (Dmochowska i wsp.,
1995) i wykazały, że jego produkt jest niezbędny dla funkcjonowania kompleksu
(Dziembowski i wsp., 1998). Badania dotyczące roli tych genów wykazały ich
zaangażowanie w cały szereg procesów związanych z metabolizmem mitochondrialnych
RNA (Stepien i wsp., 1995; Golik i wsp., 1995). Kompleks ten jest zatem jednym z
głównych czynników regulujących ekspresję genów mitochondrialnych i stanowi
odpowiednik bakteryjnego degradosomu.
Analiza in silico z wykorzystaniem powszechnie dostępnych banków sekwencji
wykazała, że ortologi genu SUV3 obecne są we wszystkich liniach ewolucyjnych Eukaryota,
w tym u człowieka. Można więc przypuszczać, że znaczenie opisywanych systemów
wykracza poza badania nad drożdżami i może przyczynić się, między innymi, do poznania
procesów regulujących ekspresję genów mitochondrialnych człowieka. Ich poznanie
mogłoby z kolei wyjaśnić mechanizm powstawania niektórych wrodzonych defektów
mitochondrialnych, których nie daje się wytłumaczyć mutacjami w mtDNA.
W dalszej części tego rozdziału podsumowany zostanie dotychczasowy stan wiedzy
na temat genu SUV3. Przedstawione zostaną też wyniki analizy porównawczej sekwencji
białka suv3p przy użyciu metod bioinformatycznych. Kolejne dwa rozdziały poświęcone
będą dotyczącym genu SUV3 projektom eksperymentalnym, których wyniki mogą poszerzyć
stan naszej wiedzy o funkcjonowaniu degradosomu mitochondrialnego.
Rozdział 2.1. Wprowadzenie. Fenotypy genu SUV3
29
2.1.2. Klonowanie i wstępna analiza fenotypowa różnych alleli genu SUV3
Badania prowadzone na drożdżach, a przede wszystkim Saccharomyces cerevisiae,
dostarczyły
przeważającej
większości
dostępnych
obecnie
danych
dotyczących
mechanizmów oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych. Wczesne prace genetyczne
prowadzone na tym właśnie organizmie wykazały po raz pierwszy współdziałanie genomu
jądrowego i mitochondrialnego w biogenezie mitochondriów (Chen i wsp., 1950; Sherman,
1963; Sherman i Slonimski, 1964). Obecnie zidentyfikowano ponad 300 genów jądrowych
zaangażowanych w biogenezę tego organellum. Badania nad oddziaływaniami jądrowomitochondrialnymi u innych organizmów często odwołują się do modeli drożdżowych (np.
(Glab i wsp., 1993)
Postęp w badaniach nad oddziaływaniami jądrowo-mitochondrialnymi u drożdży
dokonał się w zasadniczej części za sprawą zastosowania technik genetycznych związanych z
izolacją i analizą mutantów wykazujących zaburzenia w funkcjonowaniu mitochondriów.
Dopiero od niedawna, w związku z dostępnością pełnej sekwencji genomu S. cerevisiae
podejmowane są projekty systematycznej analizy funkcjonalnej zmierzające do identyfikacji
nowych genów przez strategię tzw. „odwrotnej genetyki”, czyli analizy funkcji genów
wychodzącej od zidentyfikowanych przez analizę genomu otwartych ramek odczytu (Dujon,
1998). Nie zmienia to jednak faktu, że ogromną większość posiadanych obecnie informacji
dotyczących genetycznych mechanizmów biogenezy mitochondriów zawdzięczamy
zastosowaniu klasycznych metod analizy mutantów i klonowania odpowiednich genów.
Pierwszymi
mutantami
zastosowanymi
do
badania
oddziaływań
jądrowo-
mitochondrialnych były mutanty klasy pet odkryte jeszcze w latach 50. (Chen i wsp., 1950).
Są to mutacje w genach jądrowych prowadzące do zaburzenia lub pełnej utraty funkcji
mitochondrialnych. Od dawna znane są również mutacje w DNA mitochondrialnym
wpływające na funkcje organellum. Najwcześniej poznano indukowane przez czynniki
mutagenne o działaniu interkalującym (np. akryflawiny) mutacje typu – i 0 (Ephrussi i
wsp., 1949a,b) polegające odpowiednio na częściowej lub całkowitej delecji mtDNA
(Mounolou i wsp., 1966; Slonimski i wsp., 1968). Najbardziej jednak interesujące z punktu
widzenia badania oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych są niewielkie (punktowe lub
ograniczone delecje czy insercje) mutacje w mtDNA określane jako mit–. Umożliwiają one
bowiem opracowanie strategii poszukiwania genów jądrowych zaangażowanych w ekspresję
genomu mitochondrialnego, polegających na izolowaniu jądrowych supresorów takich
mutacji. Strategia taka jest drugą, po izolacji mutantów typu pet, główną drogą poznawania
genów jądrowych zaangażowanych w biogenezę mitochondriów. Mutacje w genach
Rozdział 2.1. Wprowadzenie. Fenotypy genu SUV3
30
jądrowych suprymujące efekt mutacji mitochondrialnych typu mit– mogą powstawać
spontanicznie lub w wyniku mutagenezy. Tak uzyskane supresory określa się ogólną nazwą
NAM (od Nuclear Accomodation of Mitochondria, (Dujardin i wsp., 1980)).
Tego typu strategia doprowadziła do poznania genu SUV3, który okazał się potem
kluczowym elementem w posttranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów mitochondrialnych.
Punktem wyjściowym był tu mutant mitochondrialny klasy mit– nazwany PZ206 (Zhu i
wsp., 1989) cechujący się całkowitą utratą zdolności oddechowej połączoną z obniżeniem
stabilności mtDNA. Przyczyną tych zaburzeń u mutanta PZ206 jest delecja około 190 par
zasad sekwencji niekodującej po stronie 3’ mitochondrialnego genu var1, kodującego
niezbędne dla translacji białko rybosomalne (Terpstra i Butow, 1979). W obrębie tej
sekwencji
znajduje
się
tzw.
dodekamer:
dwunastonukleotydowa
sekwencja
AATAATATTCTT niezbędna dla prawidłowego uformowania 3’ końca transkryptu.
Sekwencja dodekameru wyznacza miejsce endonukleolitycznego cięcia w procesie
formowania dojrzałych transkryptów genów mitochondrialnych kodujących białka (Osinga i
wsp., 1984; Hofmann i wsp., 1993).
Poszukiwanie jądrowych supresorów defektu mitochondrialnego w mutancie PZ206
doprowadziło do wyizolowania mutanta SUV3-1 (Butow i wsp., 1989). Mutacja SUV3-1
przywraca zdolność oddechową mutantowi PZ206, umożliwia zatem prawidłową ekspresję
pozbawionego dodekameru allelu genu var1. Efekt supresorowy tej mutacji jest dominujący.
Dalsza analiza fenotypowa mutanta SUV3-1 (Butow i wsp., 1989; Conrad-Webb i
wsp., 1990) wykazała szereg interesujących ubocznych efektów fenotypowych związanych z
zaburzeniami w obróbce mitochondrialnych RNA. Mutacja ta powoduje zaburzenia w
obróbce dodekameru genu fit1 (otwartej ramki odczytu intronu genu LSU-rRNA), nie ma
jednak wpływu na pozostałe dodekamery. Dodatkowo obserwuje się obniżenie poziomu
dojrzałych mRNA genów cytb i cox1 oraz akumulację ich form prekursorowych
zawierających introny bi3 oraz ai5. Ponadto w szczepie SUV3-1 wykrywa się wyraźną
akumulację RNA intronów grupy I (z wyjątkiem bi5), szczególnie wyraźną w przypadku
intronu , którego poziom jest około stukrotnie wyższy niż w szczepie dzikim. Efekt ten
wykazuje częściową dominację, heterozygotyczne szczepy haploidalne wykazują poziom
intronu niższy niż homozygoty pod względem mutacji SUV3-1, wciąż jednak nieco
wyższy, niż w szczepie dzikim (Stepien i wsp., 1992). Mimo tych zmian szczep SUV3-1 nie
wykazuje obniżonej zdolności oddechowej.
Wpływ mutacji SUV3-1 na poziom RNA intronu wykorzystano do sklonowania
dzikiego allelu genu SUV3 (Stepien i wsp., 1992) posługując się w tym celu nowo
Rozdział 2.1. Wprowadzenie. Fenotypy genu SUV3
31
opracowaną metodą kolonijnej hybrydyzacji Northern (Stepien i Butow, 1990). Z banku
DNA drożdży gen częściowo przywracający normalny poziom intronu mutantowi SUV3-1.
Ostatecznie jako gen SUV3 zidentyfikowana została otwarta ramka odczytu o długości 2211
par zasad leżąca na chromosomie XVI, w systematycznej nomenklaturze genomowej
oznaczana jako YPL029W. Przewidywany produkt białkowy genu SUV3 ma długość 737
aminokwasów, dokładna analiza jego sekwencji przedstawiona zostanie w następnym
rozdziale. Zsekwencjonowano również zmutowany allel SUV3-1 (Stepien i wsp., 1992) i
stwierdzono, że za fenotyp mutacji odpowiada pojedyncza zamiana G na T w pozycji 814
ramki odczytu zmieniająca walinę w pozycji 272 białka na leucynę.
W celu dalszej analizy funkcjonalnej genu skonstruowano (Stepien i wsp., 1992)
szczepy, w których dokonano dysrupcji ramki odczytu SUV3 kasetą zawierającą marker
URA3. Stwierdzono, że utrata około 20% sekwencji we fragmencie położonym w pobliżu Ckońca białka powoduje całkowitą utratę funkcji, podobnie jak rozleglejsza (około 80%)
delecja. Szczepy niosące delecję genu SUV3 są całkowicie niewydolne oddechowo, można
zatem gen ten zaliczyć do grupy genów pet (podobnie jak i, ze względu na własności
supresorowe allelu SUV3-1, do grupy NAM). Utrata zdolności oddechowej w szczepach
niosących delecję SUV3 jest dodatkowo połączona z utratą stabilności mitochondrialnego
DNA, co objawia się konwersją takich szczepów do formy – /0, co zdecydowanie utrudnia
dokładniejsze badania.
Wprowadzenie
do
szczepu
niosącego
dysrupcję
genu
SUV3
genomu
mitochondrialnego pozbawionego intronów (Séraphin i wsp., 1987) nie przywraca zdolności
oddechowej, co sugeruje, że przynajmniej część funkcji produktu genu SUV3 nie jest
związana z procesami wycinania intronów. Szczep taki wykazuje jednak, w porównaniu ze
szczepem niosącym dziki, zawierający introny mtDNA poprawioną stabilność genomu
mitochondrialnego (Dmochowska i wsp., 1995).
Analiza fenotypowa szczepów niosących dysrupcję genu SUV3 stanowiła część
projektu badawczego składającego się na przedstawioną pracę, badania te omówiono
dokładnie w rozdziale 2.2 oraz opublikowano (Golik i wsp., 1995).
Poprawa stabilności mtDNA w szczepie SUV i pozwoliła na przeprowadzenie
szeregu
istotnych
doświadczeń,
w
tym
opartych
na
poszukiwaniu
supresorów
przywracających takiemu szczepowi zdolność oddechową. Wyizolowano (Stepien i wsp.,
1995) spontaniczną mutację jądrową, nazwaną suB9, która przywraca szczepowi SUV i
funkcję mitochondrialną w stopniu wystarczającym do uzyskania wzrostu na podłożu
zawierającym niefermentowalne źródło węgla. Na podstawie wstępnej analizy genetycznej
Rozdział 2.1. Wprowadzenie. Fenotypy genu SUV3
32
(wyniki niepublikowane) można stwierdzić, że suB9 jest to mutacja jądrowa, jednogenowa i
recesywna. Recesywny charakter mutacji praktycznie uniemożliwia sklonowanie genu przy
użyciu tradycyjnych strategii. Trwające w tej chwili doświadczenia koncentrują się na
stworzeniu testu genetycznego umożliwiającego sklonowanie genu suB9.
Mutacja ta nie jest w stanie przywrócić zdolności oddechowej szczepowi
zawierającemu komplet intronów w mtDNA, dokładna analiza wpływu poszczególnych
intronów na ekspresję genów mitochondrialnych w tym szczepie była przedmiotem badań
opisanych w rozdziale 2.2. Posługując się mutacją suB9 w szczepie zawierającym w mtDNA
wyłącznie intron (Stepien i wsp., 1995) stwierdzili, że gen SUV3 jest niezbędny dla
prawidłowej obróbki zawierającego ten intron transkryptu genu LSU-rRNA. Dysrupcja genu
SUV3 powoduje akumulację wyciętego intronu oraz drastyczny spadek poziomu dojrzałego
rRNA, co prowadzi do utraty zdolności oddechowej.
Dotychczas zebrane dane dotyczące fenotypów różnych alleli genu SUV3
przedstawiono w tabeli 2.1.
++
>90%
+
+
–
0%
n.d.
n.d.
–
~20–50%
n.d.
n.d.
∆SUV suB9
[i+]
[i]
1
–( )
+
0–5%
>60%
+
n.d.
1
–( )
n.d.
+
n.d.
n.d.
n.d.
SUV3-1
[i+]
zdolność oddechowa
stabilność mtDNA
akumulacja
akumulacja intronów
grupy I (poza )
supresja PZ206
∆SUV
[i]
n.d.
(1) Patrz rozdział 2.2 przedstawionej pracy
Tabela 2.1. Podsumowanie dotychczasowej wiedzy o fenotypach szczepów niosących różne allele genu SUV3 (na
podstawie Zhu i wsp., 1989; Conrad-Webb i wsp., 1990; Stepien i wsp., 1992; Stepien i wsp., 1995; Dmochowska i
wsp., 1995; Golik i wsp., 1995). n.d. oznacza „nie dotyczy”, ze względu na brak odpowiedniego intronu,
niestabilność mtDNA lub niewydolność oddechową szczepu. Stabilność mtDNA podana jest jako procent komórek +
po nocnej hodowli. W nawiasach kwadratowych oznaczenia genomów mitochondrialnych: bezintronowego (i) oraz
zawierającego komplet intronów (i+).
W rozdziale 2.2 tej pracy przedstawiono wpływ dysrupcji genu SUV3 na ekspresję
zawierających introny allelu genów cytb i cox1.
Rozdział 2.1. Porównawcza analiza sekwencji białka suv3p
33
2.1.3. Analiza sekwencji produktu genu SUV3
2.1.2.1. Motywy charakterystyczne dla helikaz RNA w sekwencji białka suv3p
Analiza sekwencji białkowej produktu genu SUV3 (Stepien i wsp., 1992, rozszerzona
na użytek niniejszej pracy) wykazała obecność pewnych motywów sekwencyjnych
charakterystycznych dla białek z rodziny ATP-zależnych helikaz RNA (Linder i wsp., 1989;
Gorbalenya i wsp., 1988, 1989; Hodgman, 1988; Luking i wsp., 1998). Białka te tworzą
dużą rodzinę uczestniczącą w różnych procesach związanych z metabolizmem RNA. Różni
autorzy stosują nieco odmienną nomenklaturę i definicję sekwencji najwyższej zgodności w
tych motywach. Gorbalenya i wsp. (1988, 1989) wyróżniają siedem motywów (patrz też
Stepien i wsp., 1992), natomiast Linder i wsp. (1989) wyróżniają osiem motywów,
częściowo pokrywających się z podawanymi przez poprzedników. Na potrzeby
przedstawionej tu analizy zastosowano nomenklaturę według Luking i wsp. (1998)
podawaną za Linderem i wsp., (1989).
Analiza porównawcza rosnącej liczby poznanych ATP-zależnych helikaz RNA
(Fuller-Pace, 1994) wykazała, że jest to rodzina bardzo heterogenna, i można w niej
wyróżnić kilka wyraźnych podrodzin. Za przykładem nazwy całej rodziny: helikazy DEADbox wziętej od sekwencji najwyższej zgodności jednego z motywów (Linder i wsp., 1989)
nazwy podrodzin utworzono od sekwencji tego właśnie motywu. Białko SUV3 należy do
podrodziny DExH, charakteryzującej się stosunkowo dużą zmiennością. Porównanie
rdzeniowych sekwencji najwyższej zgodności dla charakterystycznych dla całej rodziny
białkowej motywów sekwencyjnych przedstawiono na rysunku 2.1.
Rysunek 2.1. Porównanie sekwencji najwyższej zgodności dla ATP-zależnych helikaz RNA z klasycznej, będącej
pierwowzorem całej rodziny podgrupy DEAD oraz podgrupy DExH z sekwencjami odnalezionymi w białku suv3p.
Obszary homologii mogą być szersze niż przedstawione na rysunku motywy rdzeniowe. Wyróżniono zachowane
aminokwasy.
Domena I (Ia w nomenklaturze wg Gorbalenya i wsp., 1988, 1989) odpowiada tzw.
motywowi A charakterystycznemu dla ATP-az (Walker i wsp., 1982). Obszar najwyższej
zgodności jest w tym bloku szerszy, lecz poza przedstawionym obszarem może wyglądać
odmiennie w różnych podrodzinach helikaz. Motyw ten przypuszczalnie odpowiada za
wiązanie ATP (Fry i wsp., 1986; Luking i wsp., 1998).
Rozdział 2.1. Porównawcza analiza sekwencji białka suv3p
34
Domena II (Ia w alternatywnej nomenklaturze) jest silnie konserwowana wśród
znanych białek z różnych podgrup helikaz RNA, jej funkcja biochemiczna nie jest znana.
Dwie glicyny wyznaczające domenę III są silnie konserwowane w podgrupie
kanonicznych helikaz DEAD-box, nie występują jednak w innych podrodzinach i nie zostały
znalezione w sekwencji białka suv3p.
Domena IV opisywana jest jako charakterystyczna dla wszystkich podrodzin (FullerPace, 1994), nie była jednak wyróżniona przez Gorbalenya i wsp. (1988, 1989). Nie jest
znana jej funkcja biochemiczna stąd trudno wnioskować o znaczeniu braku tej domeny w
sekwencji białka suv3p.
Domena V (II w alternatywnej nomenklaturze) jest najważniejszym blokiem
homologii stanowiącym wyznacznik całej rodzin (Linder i wsp., 1989). Stanowi ona
specyficzną dla helikaz RNA formę motywu B ATP-az (Walker i wsp., 1982). Kluczowe dla
funkcji tej domeny są aminokwasy DE, zachowane bez wyjątku we wszystkich białkach tej
grupy. Postuluje się dla nich rolę w wiązaniu kationu Mg2+ skompleksowanego z cząsteczką
ATP (Fry i wsp., 1986). Klasyczne helikazy RNA mają w tej domenie sekwencję DEAD, od
której pochodzi nazwa całej rodziny. Pozostałe podrodziny wykazują pewną zmienność w
dwóch ostatnich pozycjach motywu (DExH, DEAH), warto jednak wspomnieć, że wariant
DEIQ został do tej pory odkryty jedynie w białku suv3p i jego ortologach (patrz poniżej).
Można zatem przypuszczać, że białko suv3p jest prototypem nowej podrodziny helikaz
RNA, zbliżonych do grupy DExH, lecz stanowiących odrębną grupę.
Najważniejszą różnica pomiędzy białkiem suv3p a pozostałymi helikazami RNA jest
brak domeny VI (domeny III w alternatywnej nomenklaturze). Mutacje w tym obszarze w
białku eIF4A znoszą aktywność helikazową in vitro, nie wpływają jednak na zdolność do
wiązania RNA i hydrolizy ATP (Pause i wsp., 1993; Pause i Sonenberg, 1992). Brak tego
motywu stawia pod znakiem zapytania aktywność helikazową białka suv3p, aczkolwiek
warto zauważyć, że w analogicznym obszarze znajduje się sekwencja silnie konserwowana
we wszystkich ortologach białka suv3p (oznaczona VI* na rysunku 2.2).
Domena VII jest częścią bardziej rozległego silnie konserwowanego obszaru,
określanego też (Gorbalenya i wsp., 1988, 1989) jako domena V. Mimo, że białko suv3p nie
posiada charakterystycznych aminokwasów w minimalnej sekwencji najwyższej zgodności
tego obszaru, to ogólne podobieństwo do innych białek z rodziny helikaz RNA jest w tym
obszarze wysokie (Stepien i wsp., 1992), patrz też rysunek 2.2.
Domena VIII jest charakteryzowana przez występowanie dwóch lub trzech reszt
argininowych (R), i jest stosunkowo dobrze zachowana wśród różnych helikaz RNA. Dane
Rozdział 2.1. Porównawcza analiza sekwencji białka suv3p
35
biochemiczne (Pause i wsp., 1993; Luking i wsp., 1998) sugerują, że obszar ten jest
krytyczny dla wiązania RNA i zależnej od RNA hydrolizy ATP.
Obecność opisanych
motywów
sugeruje,
że
białko suv3p jest
zbliżone
właściwościami do ATP-zależnych helikaz RNA z rodziny DEAD, podgrupy DExH, może
jednak stanowić prototyp odrębnej podrodziny białek. Analiza występujących w sekwencji
białka suv3p motywów pozwala przypuszczać, że wiąże się ono z RNA i wykazuje zależną
od RNA aktywność ATP-azową. Nie jest jednak do końca pewne, czy idzie za tym
aktywność helikazowa, sugerowana dla białek z tej rodziny.
2.1.2.2. Geny SUV3 innych organizmów – nowa rodzina mitochondrialnych białek
zachowana we wszystkich liniach ewolucyjnych Eukaryota
Systematyczne sekwencjonowanie genomów różnych organizmów stanowi jeden z
głównych kierunków rozwoju biologii molekularnej drugiej połowy lat 90. Jednym z
najszybciej zauważalnych wymiernych efektów tych projektów jest możliwość identyfikacji
nowych genów przez porównywanie uzyskiwanych w toku systematycznego badania
genomów sekwencji ze znanymi już dotychczas genami. Wykorzystanie tej możliwości w
przypadku genu SUV3, oryginalnie poznanego u drożdży S. cerevisiae pozwoliło na
odnalezienie serii ortologicznych sekwencji u przedstawicieli różnych gałęzi ewolucyjnych
Eukaryota.
W celu odnalezienia sekwencji wykazujących homologię z sekwencją SUV3
przeszukano dostępne banki danych posługując się programem BLAST wersja 2.0 (Altschul
i wsp., 1997) uruchamianym na serwerze NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
jako wzorzec wykorzystując przewidywaną sekwencję białkową produktu genu SUV3. Użyto
zarówno algorytmu BLASTP (przeszukującego bank sekwencji białkowych) jak i
TBLASTN, który przeszukuje bank sekwencji nukleotydowych dokonując ich dynamicznej
translacji we wszystkich możliwych ramkach odczytu. Ta ostatnia opcja umożliwia wykrycie
tych sekwencji, które nie zostały w banku danych opisane jako sekwencje kodujące białko.
Przeszukanie banku danych sekwencji EST (Adams i wsp., 1995) stanowiących,
uzyskane przez systematyczne sekwencjonowanie losowych cDNA, etykiety ulegających
ekspresji genów wykazało obecność genów wykazujących homologię do drożdżowego
SUV3 u różnych organizmów w tym, co najbardziej interesujące, człowieka. W tabeli 2.2
podsumowano odnalezione do tej pory etykiety EST i STS odpowiadające sekwencji SUV3,
według stanu z końca 1998 roku.
Gatunek
Nr dostępu źródło
typ
długość
Rozdział 2.1. Porównawcza analiza sekwencji białka suv3p
36
Rysunek 2.2. Uliniowanie sekwencji aminokwasowych produktów ortologów genu SUV3 z różnych organizmów
eukariotycznych. Kolorem czerwonym wyróżniono aminokwasy należące do rdzeniowych sekwencji motywów
typowych dla rodziny helikaz RNA DEAD/DExH. Numeracja domen według systemu użytego w tekście. Oznaczenie VI*
odnosi się do obszaru silnie konserwowanego w białkach z omawianej rodziny, nie odpowiadającego jednak
sekwencji najwyższej zgodności typowej domeny VI białek z rodziny DEAD/DExH
Homo sapiens
AA600836
rak piersi
EST
600 bp
Rozdział 2.1. Porównawcza analiza sekwencji białka suv3p
Mus musculus
Rattus sp.
Drosophila melanogaster
Zea mays
37
AA116572
AA726682
AA269371
W63890
grasica
skóra
płód
zarodek
EST
EST
EST
EST
657 bp
535 bp
526 bp
449 bp
AA986335
AA989832
AA763608
AA175743
W91752
C80184
AA119015
AA799741
nerka
nerka
gruczoł mleczny
śledziona
grasica
blastocysta
grasica
serce
EST
EST
EST
EST
EST
EST
EST
EST
646 bp
430 bp
268 bp
352 bp
292 bp
511 bp
684 bp
553 bp
H32333
AA696188
AA941012
AA698735
X15406
komórki PC12
jajnik
zarodek
głowa
DNA genomowy
EST
EST
EST
EST
pseudogen
272 bp
761 bp
674 bp
418 bp
Tabela 2.2. Etykiety sekwencji cDNA (EST) lub genomowe (STS) wykazujące homologię do sekwencji genu SUV3
odnalezione w publicznych bankach danych programem BLAST
Odnalezienie sekwencji EST z genomu człowieka o znaczącym podobieństwie do
genu SUV3 pozwoliło na sklonowanie i zsekwencjonowanie pełnej długości cDNA
ludzkiego kodującego białko homologiczne do suv3p (Dmochowska i wsp. w
przygotowaniu). Ludzki ortolog genu SUV3, nazwany SUPV3L1, zmapowano przy użyciu
metody hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH) w prążku 10q22.1 chromosomu 10
(Dmochowska i wsp., 1999). Uzyskaną sekwencję zdeponowano w banku danych pod
numerem dostępu 2801555.
Przeszukiwanie banków danych ujawniło również istnienie homologicznych do
sekwencji białka suv3p sekwencji u C. elegans (nr dostępu 1321758) oraz dwóch sekwencji
z Arabidopsis thaliana (nr dostępu 2244836 i AB010077). Dostępne sekwencje białek suv3
z różnych organizmów uliniowano przy użyciu programu Clustal W (Thompson i wsp.,
1994), wynik przedstawiono na rysunku 2.2.
Sekwencje H. sapiens i C. elegans wykazują bardzo duże podobieństwo, gen C.
elegans,
zlokalizowany
na
chromosomie
IV
zidentyfikowany
został
w
trakcie
sekwencjonowania genomu tego organizmu na podstawie podobieństwa do sekwencji
drożdżowej (Wilson i wsp., 1994). Bardzo interesująco wygląda sytuacja stwierdzona u
Arabidopsis thaliana, gdzie zidentyfikowano dwie sekwencje wykazujące homologię z
drożdżowym i ludzkim SUV3, obie znalazły się w banku danych w wyniku systematycznego
sekwencjonowania genomu tej rośliny. Pierwsza sekwencja, kodowana przez gen z
chromosomu IV (nr dost. 2244836) została oznaczona na rys. 2.2 jako A-thaliana_1.
Sekwencja tego białka ma długość zaledwie 442 aminokwasów i zdaje się, w porównaniu z
Rozdział 2.1. Porównawcza analiza sekwencji białka suv3p
38
pozostałymi, być pozbawiona fragmentu C-końcowego. Analiza sekwencji poniżej tego genu
wyklucza jednak możliwość niewłaściwego przewidzenia długości sekwencji na skutek
błędu
sekwencjonowania lub opisu,
gdyż
w obszarze poprzedzającym kolejny
zidentyfikowany w tym klonie gen nie ma żadnej sekwencji potencjalnie kodującej dalszy
fragment białka homologicznego do suv3p. Druga sekwencja z A. thaliana została
zidentyfikowana programem TBLASTN w klonie P1 MYH19 z chromosomu V (nr dost.
AB010077). Ramka odczytu kodująca homolog suv3p zaczyna się z pierwszym
nukleotydem sekwencji i jest z pewnością niepełna, brakuje bowiem kodonu ATG i dużej
części z końca 5’. Porównanie z innymi sekwencjami (oznaczenie A_thaliana_2 na rys. 2.2)
również sugeruje, że brakuje N-końcowej części białka. Autorzy analizy sekwencji klonu
MYH19 (Sato i wsp., 1998) nie zauważyli obecności ramki kodującej homolog genu SUV3
prawdopodobnie ze względu na niekompletny charakter sekwencji (brak końca 5’ z kodonem
ATG). Istniejący fragment sekwencji koduje 553 aminokwasy o sekwencji wykazującej
wyraźną homologię do innych białek suv3. W istocie podobieństwo jest tu większe niż w
przypadku pierwszej sekwencji A. thaliana.
Warto też zauważyć, że sekwencja ta, w przeciwieństwie do pierwszej, zawiera
obszar homologiczny z innymi białkami suv3 w obszarze C-końca i pozbawiona jest
rzucających się w oczy w pierwszej sekwencji insercji w bardzo silnie konserwowanym
obszarze domeny V (rys 2.2.). Wydaje się więc, że to druga, nie w pełni zsekwencjonowana
ramka odczytu A. thaliana koduje produkt o większym podobieństwie do białek suv3 innych
organizmów. Należy tu jednak też zauważyć, że w przeciwieństwie do w pełni opisanej
sekwencji z chromosomu IV, w obszarze kodującym hipotetyczne białko ortologiczne do
suv3 nie występuje ani jeden intron, co jest sytuacją u A. thaliana dosyć nietypową. Nie
można więc wykluczyć tu możliwości, że sekwencja z chromosomu V jest w istocie
pseudogenem.
Wysokie podobieństwo sekwencji białek suv3 z różnych organizmów jest wyraźnie
widoczne (rys. 2.2), zwłaszcza w środkowym obszarze sekwencji (dywergencja na końcach
sekwencji u tak odległych ewolucyjnie organizmów nie stanowi zaskoczenia). Silnie
zachowywane są obszary odpowiadające domenom charakterystycznym dla rodziny helikaz
RNA (rys 2.1), obszary homologii są jednak dużo szersze i wyraźniejsze, niż wskazywałaby
na to jedynie przynależność do rodziny helikaz typu DExH i znajdowane są także poza
rejonami wyznaczającymi charakterystyczne dla tej rodziny motywy. Wydaje się zatem, że
przedstawione na rys. 2.2 sekwencje stanowią rzeczywiste ortologi, co wskazuje na
powszechne występowanie białka suv3 u Eukaryota. W celu potwierdzenia znaczenia
uzyskanych homologii posłużono się wskaźnikiem znanym jako wartość Z (Z-score lub Z-
Rozdział 2.1. Porównawcza analiza sekwencji białka suv3p
39
value) (Landes i wsp., 1992). Analizowane sekwencje porównano parami przy użyciu
programu BESTFIT z pakietu GCG (Wisconsin Package Version 9.1, Genetics Computer
Group (GCG), Madison, Wisc) i obliczono wartości Z metodą opisaną w pracy Landes i wsp.
(1992). Najwyższą wartość, około 78, uzyskano dla sekwencji ludzkiej i C. elegans.
Sekwencja drożdżowa wykazuje zbliżoną wartość Z przy porównaniu do wszystkich
pozostałych, wynosi ona od 29 do 35. Sekwencje A. thaliana są nieco podobniejsze do
ludzkiej i C. elegans (Z ok. 45) niż do drożdżowej (Z =34). Wszystkie te wartości są jednak
stosunkowo wysokie i wskazują na silną konserwację badanych sekwencji. Dla porównania
obliczono wartość Z dla najbliższej sekwencjom suv3 innej helikazy RNA, którą jest
drożdżowa helikaza SKI2. Podobieństwo białek ski2p i suv3p ogranicza się do stosunkowo
krótkich bloków homologii w motywach domen typowych dla rodziny helikaz RNA (rys
2.1), więc zgodnie z przewidywaniami wartość Z przy porównaniu całych sekwencji była
bardzo niska, bliska 0. Wyraźnie widać więc, że podobieństwo białek suv3 między sobą
przekracza znacznie ich podobieństwo do innych białek z rodziny helikaz RNA, są więc one
bona fide ortologami i stanowią wyraźną, odrębną grupę białek.
Za odrębnością białek suv3 przemawia też to, że u wszystkich analizowanych
ortologów podobnie wyglądają bloki charakterystyczne dla helikaz RNA, także tam, gdzie
odstępują one od sekwencji najwyższej zgodności. Przede wszystkim, silnie zachowana jest
nietypowa, spotykana tylko u tych białek, wersja domeny V – DEIQ wraz z obszarem
otaczającym (wyjątkiem jest jedna z sekwencji A. thaliana mająca tu dwie insercje). Tuż za
obszarem domeny V znajduje się kolejny wysoce konserwowany obszar, w miejscu, gdzie w
innych białkach z rodziny DExH i DEAD znajduje się nieobecny w białkach suv3 motyw
SAT. Ogólnie, cały obszar między domeną V a VIII jest tutaj silnie konserwowany,
odbiegając przy tym od sekwencji najwyższej zgodności typowych dla innych podrodzin
helikaz RNA. Sekwencje w obszarach domeny I i VIII również bardzo wyraźnie zachowują
swój, dosyć nietypowy w porównaniu z innymi helikazami, wariant. Wszystkie te
obserwacje wskazują na to, że mamy w przypadku białek suv3 do czynienia z nową, odrębną
od innych, podgrupą nadrodziny DEAD/DExH. Białka te wykazują, jak przedstawiono to w
poprzednim rozdziale, cechy zbliżające je do podrodziny DExH, wydają się jednak tworzyć
odrębną grupę. Można przypuszczać, że podstawowe funkcje tych białek również są
zachowane, przy czym, jak wynika to z przedstawionej w poprzednim rozdziale analizy,
posiadają one przypuszczalnie aktywność ATP-azową i wiążącą RNA, ich aktywność
helikazowa nie jest jednak do końca oczywista.
Ortologi genu SUV3 odnaleziono we wszystkich gałęziach ewolucyjnych Eukaryota
–u jednokomórkowych grzybów (drożdże), roślin (A. thaliana i kukurydza) a także zwierząt
Rozdział 2.1. Porównawcza analiza sekwencji białka suv3p
40
(ssaki, nicienie, owady). Dostępność pełnych sekwencji licznych genomów prokariotycznych
pozwoliła sprawdzić, czy geny takie znajdują się też w tej grupie organizmów.
Przeszukiwanie pełnych sekwencji genomowych takich bakterii jak E. coli, H. influenzae, B.
subtilis i innych nie wykazało obecności jakiejkolwiek sekwencji odpowiadającej genowi
SUV3 . Oczywiście znajdywane są sekwencje helikaz RNA z rodziny DEAD, lecz
podobieństwo jest tu ograniczone do bardzo krótkich motywów i nie daje znaczącego wyniku
(mierzonego wartością Z lub wartością P programu BLAST). Odnaleziono tylko jedną
sekwencję prokariotyczną wykazująca znaczące podobieństwo do SUV3. Jest to sekwencja
białka mgpS Rhodobacter sphaeroides, bakterii purpurowej z grupy tzw. -proteobakterii.
Gen mgpS koduje białko zaangażowane w regulację posttranskrypcyjną dwóch
operonów (Sabaty i Kaplan, 1996). Obszar homologii między tymi białkami rozciąga się na
odcinku około 180 aminokwasów (rysunek 2.3), co stanowi zaledwie część długości obu
białek (737 aa dla suv3p i 930 aa dla mgpS). Jest ona jednak wystarczająca aby przy
porównywaniu całych sekwencji uzyskać wartość Z około 7, a więc wyraźnie większą, niż
dla innych białek z rodziny helikaz RNA. W obszarze zachowanym pomiędzy suv3p S.
cerevisiae i mgpS R. sphaeroides znajdują się domeny II, V, VII i VIII (rys 2.1)
charakterystyczne dla helikaz RNA. Znowu jednak ich sekwencja, silnie konserwowana
pomiędzy R. sphaeroides a S. cerevisiae odbiega od kanonicznej formy tych motywów.
Warianty bloków II, III, V, VII i VIII są tutaj identyczne we wszystkich białkach z rodziny
suv3, do której zdaje się należeć też mgpS, włącznie z najbardziej charakterystycznym
wariantem domeny V – DEIQ, który może posłużyć jako wyznacznik tej podrodziny. Warto
zauważyć, że białko mgpS jest w obszarze N-końcowym znacznie krótsze od suv3p (za to
wyraźnie dłuższe na C-końcu). W szczególności brak w nim domeny I, czyli motywu A
białek z rodziny ATP-az. Funkcja biochemiczna białka mgpS może zatem odbiegać od tej,
którą pełnią eukariotyczne białka z rodziny suv3. Możliwe, że składa się ono z dwóch domen
– części N-końcowej wykazującej homologie z suv3p i dodatkowo części C-końcowej o
odmiennej funkcji i pochodzeniu ewolucyjnym. Wiadomo, że C-końcowa część tego białka
może ulegać ekspresji niezależnie od homologicznego z suv3p N-końca (Sabaty i Kaplan,
1996). Warto jednak zauważyć, że podobnie jak suv3p, zaangażowane jest ono w
posttranskrypcyjną regulację genów na poziomie interakcji z RNA.
Interesujący jest też fakt, że spośród wszystkich poznanych to tej pory prokariontów,
jedynym gatunkiem, w którym odnaleziono białko wykazujące homologie do białek z
rodziny suv3 jest R. sphaeroides należący do grupy -proteobakterii, uważanych za
ewolucyjnych przodków mitochondriów (Yang i wsp., 1985; Gray, 1992; Andersson i wsp.,
Rozdział 2.1. Porównawcza analiza sekwencji białka suv3p
41
Rysunek 2.3. Porównanie sekwencji aminokwasowych białka suv3p S. cerevisiae i białka mgpS R. sphaeroides.
Kolorem czerwonym wyróżniono aminokwasy należące do rdzeniowych sekwencji domen charakterystycznych dla
helikaz RNA rodziny DEAD (podrodziny DExH) (patrz też rys. 2.1 i 2.2)
1998). Grupa ta jest stosunkowo mało zbadana na poziomie sekwencji, trudno więc na razie
wnioskować o ogólności tego spostrzeżenia.
Jedynym genomem -proteobakterii poznanym w pełni jest obecnie genom
Rickettsia
prowazekii
(Andersson
i
wsp.,
1998).
Bakteria
ta
jest
pasożytem
wewnątrzkomórkowym o daleko posuniętej redukcji genomu. Analiza sekwencji wykazuje,
że jest ona bardzo blisko spokrewniona ze współczesnymi mitochondriami i stanowi
przypuszczalnie analog któregoś z wcześniejszych etapów endosymbiozy prowadzącej do
wykształcenia tych organelli. Należy jednak podkreślić, że nie stanowi ona bezpośredniego
przodka mitochondriów, a raczej przykład analogicznego, równolegle przebiegającego
procesu uwsteczniania autonomii endopasożytów (patrz też rozdział 1). W sekwencji
genomu R. prowazekii nie odnajduje się żadnej sekwencji wykazującej homologię do rodziny
suv3, nie wyklucza to jednak istnienia takiej sekwencji u wspólnego przodka dzisiejszych proteobakterii i mitochondriów, o czym świadczyłaby obecność takiej sekwencji u R.
sphaeroides. Sekwencja taka mogła u R. prowazekii zaniknąć w trakcie ewolucji gdyż jej
systemy regulacyjne nie wymagają tego typu funkcji. Warto zauważyć, że R. prowazekii
pasożytuje wewnątrz komórek posiadających już mitochondria, presja selekcyjna na jej
genom musiała więc działać inaczej niż w procesie endosymbiontycznego powstawania
mitochondriów.
Podsumowując wyniki analiz sekwencji białka suv3p i jego ortologów można
stwierdzić, że:
sekwencje o wysokim podobieństwie do białka suv3 znajdowane są u różnych
organizmów eukariotycznych: grzybów, roślin i zwierząt, a także u przedstawiciela
bakterii purpurowych (-proteobakterii) –R. sphaeroides, nie występują jednak u
pozostałych Prokaryota.
motywy obecne w sekwencji białek suv3 wskazują na podobieństwo do rodziny helikaz
RNA typu DEAD, a szczególnie podrodziny DExH
Rozdział 2.1. Porównawcza analiza sekwencji białka suv3p
42
białka suv3 wydają się jednak tworzyć odrębną podrodzinę, charakteryzująca się
występowaniem
silnie
konserwowanych
unikatowych,
szczególnych
wariantów
motywów typowych dla rodziny helikaz RNA (np. motywu DEIQ w domenie V) a także
dodatkowych obszarów homologii poza regionami klasycznych motywów helikazowych.
Rozdział 2.1. Wprowadzenie. Degradosom mitochondrialny S. cerevisiae
43
2.1.4. Białka współdziałające z suv3p – hipotetyczny kompleks białkowy
degradosomu mitochondrialnego
Większość procesów życiowych w komórkach przebiega pod kontrolą układów
złożonych z większej liczby białek tworzących wysoce zorganizowane kompleksy (Alberts,
1998; Staley i Guthrie, 1998). Klasyczna i molekularna genetyka drożdży pozwala na
projektowanie dogodnych strategii poszukiwania kolejnych elementów takich systemów. Do
podstawowych metod należy tu poszukiwanie spontanicznych mutacji supresorowych oraz
Rysunek 2.4. Schemat rozmieszczenia domen konserwowanych wśród białek wykazujących homologię do białka
dss1p oraz uliniowanie sekwencji aminokwasowych w domenach homologii. Domeny I, i III występują we wszystkich
przedstawionych białkach, domeny II brak w ssd1p, zaś IV jest wspólna tylko dla dss1p i cyt4. Sekwencje genów
kodujących przedstawione białka dostępne są w bazach danych pod numerami U15461 (DSS1), M80735 (cyt4),
X67913 (RNaza II t2), D11024 (vacB), M74094 (dis3) oraz M60318 (SSD1). Schemat rozmieszczenia domen uzyskano
przy użyciu programu MACAW (Schuler i wsp., 1991), rysunek według Dmochowska i wsp. (1995), zmodyfikowany.
Rozdział 2.1. Wprowadzenie. Degradosom mitochondrialny S. cerevisiae
44
supresorów wielokopiowych. W przypadku genu SUV3 wyizolowano spontaniczny supresor
suB9 opisany powyżej, nie powiodły się jednak dotychczas próby jego sklonowania. Z
powodzeniem natomiast zastosowano strategię poszukiwania supresorów wielokopiowych.
Strategia taka zakłada, że wprowadzenie na plazmidzie wielokopiowym (wyposażonym w
miejsce startu replikacji pochodzące z plazmidu 2) dzikiego allelu genu współdziałającego
z badanym może znieść efekt jego inaktywacji. Mechanizmy molekularne takiej supresji
mogą być różne i nie zawsze oczywiste, metoda ta jest jednak z powodzeniem stosowana
jako jedno z głównych narzędzi w arsenale genetyki drożdży.
Zastosowanie tej metody dla szczepów niosących dysrupcje genu SUV3 przyniosło
szereg interesujących wyników. W układzie SUV i defekt mitochondrialny jest
kompensowany przez nadekspresję genu MSS116 (Dmochowska i wsp., wyniki
niepublikowane), kodującego typową helikazę RNA (Séraphin i wsp., 1989a), genu PET127
(Wiesenberger i Fox, 1997; Wegierski i wsp., 1998) a także nieznanych wcześniej genów,
nazwanych DSS1 (Dmochowska i wsp., 1995) i ADZ1 (Dziembowski i wsp., wyniki
nieopublikowane).
Supresja przez gen MSS116 wydaje się być typowym przykładem zastąpienia funkcji
zinaktywowanego genu przez gen którego produkt posiada podobną aktywność
biochemiczną i należy do tej samej rodziny białek. Nie musi to świadczyć o rzeczywistym
współdziałaniu białek mss116p i suv3p in vivo. Produkt genu MSS116 jest zaangażowany w
obróbkę zawierających introny transkryptów mitochondrialnych (Séraphin i wsp., 1989a) i
jest typową RNA helikazą typu DEAD, może więc przy silnej nadekspresji, kompensować
brak białka suv3p.
Znacznie bardziej interesującym przypadkiem jest interakcja genetyczna pomiędzy
genem SUV3 a nieznanym wcześniej genem nazwanym DSS1 (Dmochowska i wsp., 1995).
Nadekspresja genu DSS1 znosi defekt wywołany delecją genu SUV3 przy braku intronów w
mtDNA. Gen DSS1 koduje białko o przewidywanej masie 110 kDa (970 aminokwasów) i
zlokalizowany jest na chromosomie XIII. Porównawcza analiza sekwencji przeprowadzona
przy użyciu programu BLAST wykazuje znaczące podobieństwo sekwencji białka dss1p do
czterech znanych genów innych organizmów: genu CYT4 Neurospora crassa (Turcq i wsp.,
1992), vacB Shigella flexneri (Tobe i wsp., 1992), RNazy II E. coli (Guarneros i Portier,
1990; McLaren i wsp., 1991; Zilhao i wsp., 1993) oraz dis3 Schizosaccharomyces pombe
(Kinoshita i wsp., 1991). Schematyczne uliniowanie sekwencji tych pięciu białek oraz
porównanie konserwowanych ewolucyjnie domen przedstawiono na rysunku 2.4.
Dodatkowo, w sekwencji genu SSD1 S. cerevisiae (Uesono i wsp., 1997) można znaleźć
Rozdział 2.1. Wprowadzenie. Degradosom mitochondrialny S. cerevisiae
45
obszar wykazujący silną homologię do domeny III białek z rysunku 2.4, a także słabiej
zachowany obszar homologii z domeną I.
Wszystkim białkom wykazującym homologię do produktu genu DSS1 przypisuje się
funkcje związane z posttranskrypcyjną regulacją ekspresji genów na poziomie obróbki RNA.
Co prawda białku dis3 S. pombe przypisuje się także niezwiązane z metabolizmem RNA
funkcje w regulacji cyklu komórkowego (Kinoshita i wsp., 1991), lecz dla jego ortologa z S.
cerevisiae —Dis3p/Rrp44p — co ciekawe, wykazującego mniej wyraźne podobieństwo do
dss1p, stwierdzono udział w cytoplazmatycznym kompleksie egzonukleolitycznym
(egzosomie) wymaganym do prawidłowej ekspresji genów rRNA (Mitchell i wsp., 1997).
Produkt genu cyt4 N. crassa jest czynnikiem wymaganym w różnorodnych procesach
posttranskrypcyjnej obróbki i składania RNA mitochondrialnych (Garriga i wsp., 1984;
Turcq i wsp., 1992). Dla białka vacB S. flexneri sugeruje się funkcję niezbędną dla
prawidłowej translacji mRNA genów vir (Tobe i wsp., 1992). RNaza II z E. coli ma
aktywność 3’-5’ egzorybonukleazy, silnie działającą zwłaszcza na końce 3’ cząsteczek RNA
pozbawione wyraźnych strukur drugorzędowych (Kushner, 1996). Istnieją przesłanki, że
może ona chronić prawidłowo uformowany koniec 3’ RNA bakteryjnych przed atakiem
innych, mniej specyficznych nukleaz (Coburn i Mackie, 1996). Dla produktu genu SSD1 S.
cerevisiae wykazano (Uesono i wsp., 1997) zdolność wiązania się z RNA.
Porównawcza analiza sekwencji sugeruje zatem, że produkt genu DSS1 uczestniczy
w procesach obróbki RNA, najprawdopodobniej przez aktywnośc egzorybonukleolityczną.
Dalsze potwierdzenie tych przypuszczeń stało się możliwe dzięki badaniom biochemicznym.
W mitochondriach drożdży stwierdzono (Min i wsp., 1992) obecność kompleksu białkowego
o aktywności egzorybonukleazy 3’-5’ zależnej od ATP. Rdzeń tego kompleksu stanowią trzy
białka o masach cząsteczkowych 110 kDa, 90 kDa i 75 kDa (wyznaczonych na podstawie
mobilności w żelu SDS-PAGE). Badania z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko
białku suv3p (Margossian i wsp., 1996) wykazały, że składnikiem o masie 90 kDa jest
produkt genu SUV3. Nasuwa się konkluzja, że składnikiem o masie 110 kDa jest produkt
genu DSS1. Poza zgodnością przewidywanej masy cząsteczkowej z obserwowaną na żelu
dodatkowym argumentem jest fakt, że w szczepach pozbawionych genu DSS1 zanika
aktywność zależnej od ATP egzorybonukleazy (Dziembowski i wsp., 1998). Fenotyp
szczepu pozbawionego genu DSS1 przypomina obserwowany dla dysruptanta w genie SUV3
(Dziembowski i wsp., 1998) zarówno na poziomie testów wzrostowych, stabilności mtDNA,
jak i zaburzeń w obróbce RNA mitochondrialnych. Dane te sugerują, że produkty genów
SUV3 i DSS1 wchodzą w skład kompleksu białkowego o aktywności zależnej od ATP
egzorybonukleazy. Na podstawie obecności motywów w sekwencjach białkowych można
Rozdział 2.1. Wprowadzenie. Degradosom mitochondrialny S. cerevisiae
46
przypuszczać, że produkt genu SUV3 posiada aktywność zależnej od RNA ATP-azy,
prawdopodobnie w połączeniu z aktywnością helikazy, zaś produkt genu DSS1 odpowiada za
właściwą aktywność RNazy. Trzecia podjednostka, o masie 75 kDa, nie jest dotychczas
poznana.
Podobny kompleks białkowy został odkryty u bakterii E. coli i nazwany
degradosomem (Py i wsp., 1994). W skład degradosomu E. coli wchodzą co najmniej cztery
białka: dwie RNazy, enolaza i helikaza RNA z rodziny DEAD (Py i wsp., 1996). Helikaza
RNA może w takim kompleksie pełnić kluczową rolę regulacyjną, gdyż aktywność RNaz
jest silnie zależna od struktury drugorzędowych RNA. Stwierdzono, że nadekspresja helikaz
RNA u E. coli może stabilizować nadeksprymowane RNA (Iost i Dreyfus, 1994).
Degradosom może zatem, przez kontrolowaną i zależną od konkretnych stuktur aktywność
egzorybonukleolityczną przyczyniać się do uformowania prawidłowego końca 3’ mRNA,
chroniąc go tym samym przed niespecyficzną degradacją przez inne RNazy.
Rysunek 2.5. Schemat hipotetycznego kompleksu białkowego odpowiedzialnego za obróbkę końców 3’ RNA
mitochondrialnych. Na schemacie przedstawiono kompleks degradosomu oraz dodekamerazy oddziałujące z mRNA.
Degradosom, lecz nie dodekameraza oddziałuje też z innymi RNA. Według Malewicz i Stepien (1997).
Wszystkie zgromadzone do tej pory przesłanki sugerują, że produkty genów SUV3 i
DSS1 są składnikami mitochondrialnego degradosomu w komórkach drożdży. Schemat
takiego kompleksu przedstawiono na rysunku 2.5. Z końcem 3’ niektórych RNA
mitochondrialnych (kodujących białka) oddziaływuje też kompleks innych trzech białek
wiażących się z sekwencją dodekameru (patrz rozdział 2.1.1)(Min i Zassenhaus, 1993).
Kompleks ten odpowiada za cięcie 2 nukleotydy poniżej dodekameru i uformowanie
prawidłowego końca 3’ tych RNA. Fenotypy mutantów w genie SUV3 sugerują, że jego
aktywność jest w jakiś sposób zależna od aktywności degradosomu. Należy jednak pamiętać,
Rozdział 2.1. Wprowadzenie. Degradosom mitochondrialny S. cerevisiae
47
że funkcja degradosomu jest bardziej ogólna, dotyczy bowiem również RNA pozbawionych
dodekameru, np. LSU-rRNA i RNA intronowych (Stepien i wsp., 1995, patrz też rozdział
2.2).
Kolejnym dosyć niespodziewanym odkryciem było stwierdzenie, że defekt związany
z delecją genu SUV3 lub DSS1 jest znoszony przez nawet umiarkowaną nadekspresję genu
PET127 (Wegierski i wsp., 1998). Gen PET127 jest wymagany dla prawidłowej obróbki
niektórych mRNA mitochondrialnych na końcu 5’ (Wiesenberger i Fox, 1997). Genetyczna
interakcja pomiędzy PET127 a genami kodującymi podjednostki oddziałującego z końcem 3’
degradosomu może być przykładem interakcji pomiędzy końcami 5’ i 3’ RNA,
obserwowanych wcześniej dla niektórych RNA cytoplazmatycznych (Tarun i Sachs, 1995,
1996; Wells i wsp., 1998).
Gen ADZ1 koduje białko wykazujące pewne podobieństwa do białek szoku
cieplnego. Nadekspresja tego genu kompensuje delecję genów SUV3 lub DSS1. W sekwencji
białka adz1p brak jednak presekwencji sugerującej lokalizację mitochondrialną. Również
badania biochemiczne (A. Dziembowski, wyniki nieopublikowane) sugerują raczej, że białko
to lokalizuje się w jadrze komórkowym lub w cytoplaźmie. Mechanizm oddziaływania
między genem ADZ1 a kodującymi podjednostki mitochondrialnego kompleksu mtEXO
genami SUV3 i ADZ1 jest do tej pory niewyjaśniony.
W podsumowaniu stwierdzić można, że produkt genu SUV3 jest elementem
kompleksu białkowego niezbędnego dla prawidłowej obróbki 3’ końców RNA
mitochondrialnych. W skład tego kompleksu wchodzi też produkt genu DSS1 oraz co
najmniej jedno nieznane jeszcze białko. Kompleks ten wykazuje analogię do bakteryjnych
degradosomów. Degradosom mitochondrialny współdziała też z kompleksem dodekamerazy,
którego funkcja polega na formowaniu końca 3’ mitochondrialnych mRNA. Poprzez
interakcję z produktem genu PET127 degradosom mitochondrialny uczestniczy też w
procesach obróbki końca 5’ RNA.
Rozdział 2.1. Wprowadzenie. Cel pracy
48
2.1.5. Cele badań
Zbadanie funkcji genu SUV3 jest niezwykle istotne dla poznania mechanizmu
funkcjonowania kompleksu degradosomu mitochondrialnego, niezbędnego dla prawidłowej
ekspresji genów mitochondrialnych. Znaczenie tego mechanizmu wykracza poza badania nad
genetyką drożdzy, gdyż obecność silnie konserwowanych ortologów genu SUV3 we
wszystkich liniach Eukaryota sugeruje, że kompleksy tego typu są powszechnym sytemem
regulacyjnym o kluczowym dla ekspresji mtDNA znaczeniu.
W ramach częsci I przedstawionej postanowiono podjąć następujące problemy:
przeprowadzić analizę in silico sekwencji białek suv3p i dss1p (wyniki omówione
powyżej)
zbadać wpływ delecji genu SUV3 na metabolizm RNA w mitochondriach drożdży
szczepu pozbawionego intronów w mtDNA
zbadać wpływ białka suv3p na ekspresję zawierających introny alleli mitochondrialnych
genów cytb i cox1 i wykazano, że jego aktywność jest niezbędna dla zapewnienia im
stabilności
sprawdzić, czy produkt genu SUV3 jest specyficznym czynnikiem odpowiedzialnym za
wycinanie któregokolwiek z intronów w genie cox1 i cytb
określić jak silna jest dywergencja sekwencji genu SUV3 pomiędzy S. cerevisiae i S.
douglasii w porównaniu z innymi poznanymi u obu gatunków genami
zbadać, czy istnieją różnice funkcjonalne dla genu SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii, w
szczególności w odniesieniu do intronu ?
Rozdział 2.2. Gen SUV3 a stabilnośćć RNA mitochondrialnych
2.2.
Analiza
fenotypowa
szczepów
niosących
49
delecję
genu
SUV3
Saccharomyces cerevisiae – gen SUV3 jest konieczny dla utrzymania
stabilności transkryptów mitochondrialnych zawierających introny
2.2.1. Wprowadzenie
Zgromadzone dotychczas dane dotyczące funkcji genu SUV3, podsumowane we
wstępie (rozdział 2.1) wskazują na zaangażowanie jego produktu w procesach ekspresji
genów mitochondrialnych na poziomie posttranskrypcyjnym. Do najważniejszych przesłanek
zaliczyć tu należy: obecność w sekwencji motywów charakterystycznych dla ATP-zależnych
helikaz RNA, fenotyp związany z dysrupcją genu – niewydolność oddechowa połączona z
destabilizacją mtDNA, a także plejotropowy fenotyp związany z omawianą wcześniej
punktową mutacją SUV3-1. W mutancie SUV3-1 możliwa jest translacja zmutowanego allelu
genu var1 pozbawionego leżących na 3’ końcu w obszarze nie podlegającym translacji
sekwencji niezbędnych do jego ekspresji (Zhu i wsp., 1989). Dodatkowo obserwuje się
akumulację licznych RNA intronowych grupy I, a także zaburzenia poziomu mRNA genów
cytb i cox1 oraz ich prekursorów. Pomimo tych zmian mutant SUV3-1 nie wykazuje jednak
zauważalnego obniżenia zdolności do wzrostu na podłożach niefermentowalnych, czyli jego
wydolność oddechowa nie jest znacząco obniżona.
Przesłanki
te
silnie
sugerują
związek
funkcji
genu
SUV3
z
obróbką
mitochondrialnych mRNA zawierających introny. Z pewnością nie jest to jednak jedyna jego
funkcja, gdyż przy braku wszystkich intronów mitochondrialnych szczep z dysrupcją genu
SUV3 nadal wykazuje niewydolność oddechową, w porównaniu ze analogicznym szczepem
zawierającym introny cechuje się zaś jedynie znacznie podwyższoną stabilnością mtDNA
(Dmochowska i wsp., 1995).
Przedstawione powyżej dane jednoznacznie sugerują konieczność bliższego zbadania
zaburzeń w metabolizmie transkryptów genów mitochondrialnych w szczepach z dysrupcją
genu SUV3. Ze względu jednak na bardzo szybko zachodzącą w takich szczepach konwersję
zawierającego introny mtDNA do form 0/– doświadczenia takie możliwe są do
przeprowadzenia jedynie w szczepie posiadającym pozbawiony intronów genom
mitochondrialny. Nie można zatem w ten sposób uzyskać odpowiedzi na pytanie o rolę genu
SUV3 w procesach związanych z obróbką transkryptów zawierających introny.
Rozdział 2.2. Gen SUV3 a stabilnośćć RNA mitochondrialnych
50
Aby obejść ten problem posłużono się szczepami, które wraz z dysrupcją genu SUV3
niosą dodatkowo mutację suB9 opisaną w poprzednim rozdziale. Mutacja ta w połączeniu z
pozbawionym intronów mtDNA przywraca zdolność oddechową szczepowi z dysrupcją genu
SUV3. Efektu tego nie obserwuje się jednak w przypadku dzikiego, zawierającego komplet
intronów genomu mitochondrialnego.
Posługując się tą mutacją Stepien i wsp. (1995) wykazali, że produkt genu SUV3 jest
wymagany dla prawidłowej obróbki zawierającego intron transkryptu LSU-rRNA.
Inaktywacja genu SUV3 przy obecności intronu jako jedynego w genomie
mitochondrialnym powoduje zaburzenia objawiające się drastycznym spadkiem poziomu
dojrzałego produktu rRNA spowodowanym degradacją nieprawidłowo złożonych egzonów
oraz akumulacją RNA intronowego. Zaburzenia te prowadzą oczywiście do utraty zdolności
oddechowej oraz do zauważalnego, aczkolwiek nie kompletnego, spadku stabilności
mtDNA.
W przedstawionych poniżej badaniach postanowiono wykorzystać możliwości
wynikające z właściwości mutacji suB9 w połączeniu z dysrupcją genu SUV3 dla zbadania
roli białka suv3p w ekspresji zawierających introny mitochondrialnych genów cytb i cox1. W
tym celu wykorzystano i rozwinięto strategię zastosowaną po raz pierwszy przez Séraphina i
wsp. (1987) a następnie, między innymi, przez Séraphina i wsp. (1989a), Bousquet i wsp.
(1990) i Groudinsky i wsp. (1993), która pozwala na stwierdzenie, czy dany gen jądrowy ma
wpływ na wycinanie intronów genów mitochondrialnych, i czy jest to jedyna jego funkcja.
Strategia ta zasadza się na użyciu szczepu posiadającego pozbawiony intronów genom
mitochondrialny (Séraphin i wsp., 1987). W przypadku, gdy jedyną funkcją badanego genu
jest obróbka mitochondrialnych intronów, w szczepie takim nie powinien być obserwowany
efekt inaktywacji tego genu.
W celu zbadania znacznie bardziej skomplikowanego układu związanego z
inaktywacją genu SUV3 strategię tę rozwinięto dla potrzeb przedstawionej pracy,
wykorzystując serię szczepów, zawierających w genach cytb i cox1 różne konfiguracje
intronów. Wprowadzenie takich genomów mitochondrialnych do kontekstu jądrowego
szczepu z dysrupcją genu SUV3 oraz mutacją suB9 otwiera możliwości analizy fenotypowej
na poziomie fizjologicznym (testy wzrostowe) oraz molekularnym (analiza RNA oraz
spektroskopia).
Poniżej opisano serię doświadczeń mających odpowiedzieć na następujące pytania:
jakie jest molekularne podłoże defektu uniemożliwiającego prawidłowe funkcjonowanie
mitochondriów w szczepie z dysrupcją genu SUV3 pozbawionym intronów w genomie
mitochondrialnym?
Rozdział 2.2. Gen SUV3 a stabilnośćć RNA mitochondrialnych
51
czy dysrupcja genu SUV3 wpływa na obróbkę zawierających introny transkryptów
genów cytb i cox1 w obecności mutacji suB9?
czy gen SUV3 może być zaliczony do grupy czynników odpowiadających za wycinanie
konkretnych intronów lub ich określonej grupy?
Szczegóły dotyczące metod doświadczalnych a także zbiorcza lista szczepów i konstrukcji
DNA użytych w tych doświadczeniach znajduje się w rozdziale „Materiały i metody”
Rozdział 2.2. Gen SUV3 a stabilnośćć RNA mitochondrialnych
52
2.2.2. Wpływ inaktywacji genu SUV3 na ekspresję bezintronowych alleli genów
cytb oraz cox1
W celu zbadania molekularnego podłoża obserwowanych fenotypów i bliższego
określenia
wpływu
inaktywacji
genu
SUV3
na
ekspresję
wybranych
genów
mitochondrialnych przeprowadzono analizę transkryptów mitochondrialnych w wybranych
szczepach.
Pierwszym zbadanym szczepem był SUV3 i, niosący dysrupcję genu SUV3
(Stepien i wsp., 1992) oraz pozbawiony intronów w mtDNA. Szczep taki jest niewydolny
oddechowo, a stabilność mtDNA wynosi w nim około 40% (Dmochowska i wsp., 1995).
Dwa niezależne preparaty mtRNA tego szczepu a także szczepów SDB9 i oraz dzikiego
szczepu KM91 poddano elektroforezie w żelu denaturującym a następnie hybrydyzowano
(Northern) z sondami egzonowymi cytb i cox1. Wyniki hybrydyzacji przedstawiono na
rysunku 2.6. KM91 jest diploidalnym szczepem dzikim, którego obraz hybrydyzacji, jak
wykazano później nie odbiega od otrzymywanego dla izogenicznej dzikiej kontroli
sonda cytb
∆SUV ∆i
∆SUV ∆i
SDB∆i
KM91
∆SUV ∆i
∆SUV ∆i
SDB∆i
KM91
BWG/PG1.
sonda cox1
Rysunek 2.6. Obraz autoradiogramu uzyskanego po przeniesieniu rozdzielonych w żelu denaturującym
mitochondrialnych RNA szczepów KM91 (dziki), SDB9 i oraz SUV i (dwa niezależne preparaty) na filtr
nitrocelulozowy i hybrydyzacji z sondami odpowiadającymi sekwencjom egzonów cytb oraz cox1. Strzałkami
zaznaczono położenie prążków mRNA oraz prekursorów.
Najistotniejszą zmianą obserwowaną w szczepie z inaktywacją SUV3 jest praktycznie
całkowity zanik mRNA cytb, którego prążek jest ledwie widoczny na wyraźnym
rozmazanym tle. Świadczy to prawdopodobnie o zachodzącej degradacji prekursora i/lub
Rozdział 2.2. Gen SUV3 a stabilnośćć RNA mitochondrialnych
53
Rysunek 2.7. Schemat struktury genów podzielonych cytb i cox1 szczepów użytych w doświadzceniu i fenotyp ich
wzrostu na podłożu stałym zawierającym glicerol (A). + oznacza wzrost, - brak wzrostu. Krzywe wzrostu badanych
szczepów w płynnym podłożu zawierającym 2% glicerol/1% etanol jako Ÿródła węgla (B). Analiza spektroskopowa w
świetle widzialnym całych komórek badanych szczepów w temperaturze ciekłego azotu (C).
mRNA cytb. Poziom mRNA cox1 jest normalny. Normalny obraz hybrydyzacji sond
egzonowych w szczepie SDB9 i wykazuje, że mutacja suB9 w kontekście genomu
Rozdział 2.2. Gen SUV3 a stabilnośćć RNA mitochondrialnych
54
bezintronowego przywraca ekspresję genów cytb i cox1 w szczepie z inaktywacją SUV3, co
koreluje z przywróceniem zdolności oddechowej obserwowanym w tym szczepie.
Na podstawie powyższego doświadczenia można stwierdzić, że za defekt w
funkcjonowaniu pozbawionego intronów genom mitochondrialnego w szczepie dysruptanta
SUV3 i odpowiada między innymi, degradacja mRNA genu cytb. Późniejsze badania
przeprowadzone w Zakładzie Genetyki UW (Dziembowski i wsp., 1998) wykazały, że
podobny efekt obserwuje się w przypadku rRNA kodowanego przez gen SSU-rRNA (15S
rRNA). Inaktywacja genu SUV3 nie wpływa natomiast na poziom mRNA bezintronowego
allelu genu cox1. Wyraźnie widoczne jest też to, że mutacja supresorowa suB9 przywraca
normalny poziom mRNA bezintronowego allelu genu cytb, co przyczynia się do odzyskania
przez szczep SDB9 i wydolności oddechowej.
2.2.3. Obróbka transkryptów genów cytb i cox1 zawierających różne kombinacje
intronów w szczepie z inaktywacją genu SUV3 w kontekście mutacji suB9
2.2.3.1. Konstrukcje szczepów użytych w doświadczeniach
W celu zbadania roli pełnionej przez produkt genu SUV3 w obróbce zawierających
introny transkryptów postanowiono zbadać, jak w kontekście delecji genu SUV3 zawartość
intronów wpływa na ekspresję genów cox1 i cytb.
Pierwszym niezbędnym dla realizacji doświadczenia etapem było wprowadzenie do
kontekstu jądrowego szczepu dysruptanta SUV3 niosącego również mutację suB9 genomów
mitochondrialnych o różnej zawartości intronów. Posłużono się tutaj serią szczepów z
kolekcji laboratorium w Gif-sur-Yvette. Pełne genotypy używanych szczepów podano w
rozdziale „Materiały i metody”.
Konstrukcja szczepów przebiegała dwustopniowo. W pierwszej fazie przeniesiono
badane genomy mitochondrialne do szczepu dawcy KxNO41 przy użyciu opisanej w
„Materiałach i Metodach” techniki cytodukcji. Przeprowadzone krzyżówki podsumowano w
tabeli 2.3.
Dawca
C51110
CK5112/1
ST9/7-1
ST13-13
ST3-2
ST6/1-1
YL15/5-3
Biorca
KxNO41
KxNO41
KxNO41
KxNO41
KxNO41
KxNO41
KxNO41
Wynik
CKPG1
CKPG2
CKPG3
CKPG4
CKPG5
CKPG6
CKPG7
Introny w mtDNA
ai1
ai2,3,51
bi1,21
bi1,2,31
bi1,2
bi4,5
ai, bi3
Rozdział 2.2. Gen SUV3 a stabilnośćć RNA mitochondrialnych
55
1
introny S. capensis, w opisywanych doświadczeniach równoważne z odpowiednimi intronami S. cerevisiae
2
komplet 5 intronów w genie cytb
komplet 5 intronów w genie cytb i 7 intronów w genie cox1 brak tylko intronu
3
Tabela 2.3. Konstrukcja przez cytodukcję szczepów mających stanowić dawców w ostatecznej fazie konstrukcji. Użyty
szczep KxNO41 jest pozbawiony mtDNA (0), jego genotyp jądrowy to MAT , Kar1-1, trp5, his4, ade6.
Charakterystykę szczepów dawców przedstawiono w „Materiałach i Metodach” i opublikowano w pracy (Golik i
wsp., 1995). W ostatniej kolumnie podano introny znajdujące się w mtDNA danego szczepu, pozostałych intronów
brak.
Następnie, posługując się również techniką cytodukcji przeniesiono mtDNA
szczepów
CKPG1..CKPG7
do
kontekstu
jądrowego
szczepu
SDB9
0
(MATa, his1, ade1, leu2, suv3::URA3, suB9) uzyskując serię szczepów nazwanych
odpowiednio SDB9/PG1..SDB9/PG7. Dodatkowo skonstruowano izogeniczny szczep
kontrolny BWG/PG1, gdzie do jądra szczepu BWG (wyjściowego dla szczepu SDB9)
wprowadzono techniką cytodukcji mitochondria pochodzące ze szczepu 777-3A (Kotylak i
Slonimski, 1977) wykorzystując jako dawcę szczep CK 50-A/1. Szczepy te zostały następnie
poddane serii badań fenotypowych opisanych poniżej.
2.2.3.2. Analiza fenotypowa uzyskanych szczepów
W celu zbadania funkcjonowania mitochondriów w uzyskanych szczepach
przeprowadzono szereg standardowych testów fenotypowych. W pierwszej kolejności
zbadano ich zdolność do wzrostu na niefermentowalnych źródłach węgla – glicerolu oraz
etanolu. Na rysunku 2.7 A przedstawiono jakościową ocenę uzyskanego wzrostu wraz ze
schematycznym przedstawieniem kombinacji intronów w mtDNA każdego badanego
szczepu. W celu dokładniejszego określenia zdolności do wzrostu na niefermentowalnych
źródłach węgla przeprowadzono również pomiary krzywych wzrostowych w hodowli
płynnej w podłoży pełnym z glicerolem i etanolem jako źródłami węgla. Pomiary
przeprowadzono przy użyciu fotokolorymetru Kletta tak, jak opisano to w rozdziale
„Materiały i Metody”.
W celu potwierdzenia i dokładniejszego określenia obserwowanych efektów
fenotypowych wyznaczono dla każdego z badanych szczepów widmo absorbcyjne
zredukowanych cytochromów w niskiej temperaturze (Claisse i wsp., 1970). Uzyskane
widma przedstawiono na rysunku 2.7 C.
Wyniki wszystkich przedstawionych na rysunku 2.7 badań są zgodne i wykazują, że
obecność którychkolwiek dwóch lub trzech spośród zbadanych intronów nie powoduje utraty
zdolności oddechowej w szczepie dysruptanta SUV3 niosącym mutację suB9. W szczepach
takich obserwuje się co prawda spowolnienie wzrostu w stosunku do szczepu dzikiego, a
także spadek poziomu obserwowanego w widmie cytochromu b i/lub aa3 o około 50%
Rozdział 2.2. Gen SUV3 a stabilnośćć RNA mitochondrialnych
56
(oszacowanie ilościowe według Claisse i wsp., 1970 i di Rago i wsp., 1990b metodą
macierzową opisaną w rozdziale „Materiały i metody”), nie ma jednak całkowitej utraty
zdolności oddechowej, połączonej z zanikiem odpowiednich maksimów widmowych, jaką
obserwuje się w zawierających większe ilości intronów szczepach SDB9/PG5 i SDB9/PG7.
Rysunek 2.8. Analiza hybrydyzacyjna (Northern) rozdzielonych w żelu denaturującym mitochondrialnych RNA
szczepów wykazujących związaną z obecnością intronów w genach cytb i cox1 niewydolność oddechową. Strzałki
wskazują pozycje poszczególnych RNA. Opisy użytych do hybrydyzacji sond zawarto w "Materiałach i metodach".
Szczególnie jasno zostało to udokumentowane na przykładzie intronów w genie cytb. W
szczepach zawierających pierwsze dwa (SDB9/PG3) lub trzy (SDB9/PG4) introny tego
genu, a także w szczepie zawierającym ostatnie dwa introny (SDB9/PG6) nie obserwuje się
utraty zdolności oddechowej, a jedynie pewne jej zmniejszenie. Wprowadzenie wszystkich
Rozdział 2.2. Gen SUV3 a stabilnośćć RNA mitochondrialnych
57
pięciu intronów w tym genie (szczep SDB9/PG5) powoduje już zupełną utratę zdolności
oddechowej połączoną z zanikiem maksimum cytochromu b w widmie. Co ciekawe, w
szczepie tym drastycznie spada również poziom cytochromów aa3 (kompleks oksydazy
cytochromowej), nie jest to jednak zjawisko niespotykane, należy bowiem pamiętać, że
szczep ten nie oddycha, zaś pomiary poziomu cytochromów aa3 są zwykle obciążone
znacznym błędem.
Wyniki uzyskane dla intronów genu cox1 nie są tak jednoznaczne, gdyż nie
dysponowano szczepami zawierającymi wszystkie konieczne kombinacje intronów.
Dodatkowo szczep SDB9/PG7 zawierający komplet intronów cox1 zawierał również komplet
intronów cytb, co jak pokazały przeprowadzone doświadczenia wystarczy dla zablokowania
funkcji oddechowej w takim szczepie. Tym niemniej widać, że obecność któregokolwiek z
czterech zbadanych dla genu cox1 intronów pojedynczo (intron ai1, szczep SDB9/PG1) lub
trzech intronów (introny ai2, ai3 ai5, szczep SDB9/PG2) nie powoduje utraty zdolności
oddechowej.
Uzyskane wyniki wykluczają krytyczny udział genu SUV3 w wycinaniu
któregokolwiek konkretnego intronu w genach cytb i cox1. Istnieje jednak bardzo wyraźna
zależność natury bardziej ilościowej, czyli kumulatywnej. Obecność jednego, dwóch lub
trzech intronów nie powoduje utraty zdolności oddechowej związanej z inaktywacją SUV3
(warunkiem jest cały czas obecność supresorowej mutacji suB9), natomiast już obecność
pięciu intronów w genie cytb powoduje całkowitą utratę funkcji tego genu. Zależność ma
więc charakter kumulatywny i progowy, różnice pomiędzy szczepami zawierającymi jeden,
dwa czy też trzy introny nie są znaczące, obecność pięciu lub więcej intronów daje natomiast
bardzo wyraźny efekt w postaci całkowitej utraty funkcji mitochondrialnych.
2.2.3.3. Zaburzenia w metabolizmie zawierających introny mRNA genów cytb i cox1 w
szczepach SDB9/PG5 oraz SDB9/PG7
Opisane powyżej wyniki sugerują, iż w pozbawionych funkcji genu SUV3 szczepach
zawierających większą ilość (powyżej trzech) intronów w genach cytb i cox1 dochodzi do
zaburzeń uniemożliwiających prawidłową ekspresję tych genów. Dane uzyskane na
podstawie testów fenotypowych pozwalają też stwierdzić, że zaburzenia te nie są związane z
obecnością któregokolwiek konkretnego intronu, lecz raczej w sposób kumulatywny z ich
liczbą. Nie można jednak, na podstawie samych testów fizjologicznych wnioskować na temat
mechanizmów zaobserwowanej zależności.
Rozdział 2.2. Gen SUV3 a stabilnośćć RNA mitochondrialnych
58
W celu zbadania molekularnego mechanizmu zależności ekspresji zawierających
introny genów cytb oraz cox1 dokładniejszej analizie poddano RNA mitochondrialne z
niewydolnych oddechowo szczepów SDB9/PG5 (komplet intronów cytb) oraz SDB9/PG7
(komplet intronów cytb i cox1) przy użyciu techniki Northern. Jako kontroli użyto szczepu
BWG/PG1 posiadającego komplet (13) intronów mitochondrialnych oraz dziki allel genu
SUV3. Z wymienionych szczepów wyizolowano całkowity mitochondrialny RNA, poddano
elektroforezie w agarozowym żelu denaturującym zawierającym formaldehyd, a następnie
hybrydyzowano z sondami odpowiadającymi sekwencjom egzonów lub intronów w
badanych genach. Dodatkowo przeprowadzono hybrydyzację z sondą SSU-rRNA (rys. 2.8
C) w celu sprawdzenia ilości mtRNA w analizowanych preparatach.
Wyniki przedstawiono na rysunku 2.8. Hybrydyzacja z sondami egzonowymi cytb
(A) oraz cox1 (B) wykazuje, że utrata zdolności oddechowej związana z obecnością intronów
spowodowana jest drastycznym spadkiem poziomu dojrzałego mRNA zawierającego introny
genu. Obecność pięciu intronów w genie cytb w szczepie SDB9/PG5 powoduje bardzo
znaczny spadek poziomu mRNA cytb (rys. 2.8 A) przy niezmienionym poziomie mRNA
cox1 (rys. 2.8 B). W szczepie SDB9/PG7 zawierającym dodatkowo komplet 7 intronów w
genie cox1 obserwuje się całkowity brak mRNA zarówno cytb jak i cox1 (rys. 2.8 A,B). W
preparatach mtRNA nieoddychających szczepów SDB9/PG5 i SDB9/PG7 nie obserwuje się
żadnych prążków prekursorów hybrydyzujących z sondami egzonowymi, podczas gdy
prekursory takie wykrywane są w zawierającym introny dzikim szczepie BWG/PG1. W
szczepach pozbawionych genu SUV3 nie obserwuje się zatem akumulacji zablokowanych w
procesie wycinania intronów prekursorów mRNA genów cytb i cox1.
Hybrydyzacja z sondami odpowiadającymi intronom grupy I obecnym w tych
szczepach nie wykazała wykrywalnego poziomu intronowych RNA w którymkolwiek ze
szczepów, włącznie z dziką kontrolą. W badanych szczepach nie dochodzi zatem do
akumulacji wyciętych intronów grupy I z genów cytb i cox1. Wyniki te potwierdzają
wysunięta na podstawie opisanych powyżej testów fizjologicznych hipotezę, że dysrupcja
genu SUV3 nie powoduje bloku w wycinaniu któregokolwiek konkretnego intronu w genie
cytb i cox1.
Wycięte introny grupy II, w odróżnieniu od intronów grupy I (z wyjątkiem intronu
), akumulują się w szczepach dzikich na poziomie wykrywalnym analizą typu Northern
(Groudinsky i wsp., 1993). Analiza poziomu intronów bi1 (rys. 2.8 D), ai1 (rys 2.8 E) oraz
ai5 (rys 2.8 F) nie wykazała podwyższonego poziomu któregokolwiek z tych intronów w
badanych szczepach. Introny bi1 oraz ai5 (rys 2.8 D i F) są w szczepach z dysrupcją genu
SUV3 obecne na niezmienionym poziomie (w szczepie SDB9/PG5 nie ma oczywiście
Rozdział 2.2. Gen SUV3 a stabilnośćć RNA mitochondrialnych
59
żadnych intronów w genie cox1), podczas gdy intron ai1 w szczepie SDB9/PG7 jest
niewykrywalny (rys. 2.8 E). Wynik hybrydyzacji z sondami bi1 i ai5 sugeruje, że w
szczepach niosących dysrupcję genu SUV3 transkrypcja genów cytb i cox1 zachodzi
prawidłowo i syntetyzowane są transkrypty pełnej długości (intron ai5 jest ostatnim
intronem w genie cox1), nie dochodzi jednak do akumulacji dojrzałych transkryptów. W
połączeniu z brakiem wykrywalnych RNA prekursorowych prowadzi to do wniosku, że
przyczyną odpowiadającą za obserwowany drastyczny spadek poziomu dojrzałych mRNA
genów cytb i cox1 jest szybka degradacja powstających transkryptów zawierających introny,
zaś produkt genu SUV3 jest niezbędny dla zapewnienia tym transkryptom stabilności.
Rozdział 2.2. Gen SUV3 a stabilnośćć RNA mitochondrialnych
60
2.2.3. Dyskusja
Wśród licznych produktów genów jądrowych zaangażowanych w biogenezę
mitochondriów (patrz Costanzo i Fox, 1990; Tzagoloff i Dieckmann, 1990; Grivell, 1995) są
zarówno takie, które uczestniczą w jednym konkretnym procesie, jak i takie, które wykazują
plejotropowy wpływ na różne aspekty ekspresji genów mitochondrialnych. SUV3 z
pewnością należy do tej drugiej grupy, gdyż wykazano jego uczestnictwo w ekspresji
genomu mitochondrialnego w kilku różnych procesach.
Prowadzone w Zakładzie Genetyki UW a także w innych laboratoriach badania nad
wpływem dysrupcji genu SUV3 na metabolizm mitochondrialnych RNA dostarczyły
pewnych wskazówek odnośnie funkcji białka suv3p. Wykazano między innymi, że produkt
genu SUV3 jest niezbędny dla prawidłowego składania zawierającego intron prekursora
LSU-rRNA (Stepien i wsp., 1995). Przedstawione w niniejszej pracy wyniki sugerują, że
produkt genu SUV3 jest niezbędny dla utrzymania stabilności zawierających introny
transkryptów genów cytb i cox1.
Pozbawione genu SUV3 szczepy zawierające którekolwiek dwa lub trzy introny cytb są
zdolne do oddychania i wykazują w widmie absorbcyjnym obecność pasma cytochromu b,
podczas gdy szczep SDB9/PG5 zawierający w genie cytb komplet 5 intronów jest
niewydolny oddechowo i nie posiada wykrywalnego spektroskopowo cytochromu b. Można
na tej podstawie dowieść, że za efekt dysrupcji genu SUV3 na ekspresję cytb nie odpowiada
żaden konkretny intron, efekt ten zależy raczej od liczby obecnych intronów. Podobne
wnioski wysnuć można dla czterech przebadanych spośród siedmiu intronów w genie cox1,
gdyż szczepy niosące kombinację jednego do trzech spośród tych intronów są zdolne do
oddychania i wykazują w widmie absorbcyjnym obecność pasma cytochromu a/a3
(kompleksu oksydazy cytochromowej), podczas gdy szczep SDB9/PG7 zawierający komplet
intronów cox1 (oraz cytb) jest niewydolny oddechowo i nie posiada wykrywalnego
spektroskopowo cytochromu a/a3.
Wyniki te wykazują, że w przeciwieństwie do genów, których produkty uważane są
za czynniki bezpośrednio zaangażowane w wycinanie konkretnego intronu lub kilku
intronów (np. Kreike i wsp., 1986; Bousquet i wsp., 1990; Labouesse, 1990; Wiesenberger i
wsp., 1992), wpływ inaktywacji genu SUV3 na ekspresję zawierających introny genów cytb i
cox1 nie jest związany z obecnością któregokolwiek konkretnie intronu, lecz jest raczej
funkcją ilości intronów zawartych w danym genie mitochondrialnym. Sugeruje to, że mimo
oczywistego związku z procesami wycinania intronów produkt genu SUV3 nie jest
czynnikiem odpowiadającym za wycinanie któregokolwiek intronu genów cytb i cox1.
Rozdział 2.2. Gen SUV3 a stabilnośćć RNA mitochondrialnych
61
Analiza hybrydyzacyjna mitochondrialnego RNA niewydolnych oddechowo
szczepów zawierających komplet intronów w genie cytb i/lub cox1 nie wykazuje akumulacji
prekursorów ani tez wyciętych intronów. Obecność większej niż dwa lub trzy liczby
intronów w genie cytb lub cox1 daje w efekcie drastyczny spadek poziomu mRNA
odpowiedniego genu. Akumulację zawierających introny prekursorów opisano w licznych
przypadkach dysrupcji genów jądrowych zaangażowanych w wycinanie intronów w genach
cytb i cox1 (McGraw i Tzagoloff, 1983; Séraphin i wsp., 1988, 1989a; Bousquet i wsp.,
1990; Labouesse, 1990; Pel i wsp., 1992; Valencik i McEwen, 1991; Wiesenberger i wsp.,
1992). Brak takiej akumulacji w szczepach z dysrupcją genu SUV3 potwierdza nasze
wcześniejsze sugestie, że produkt genu SUV3 nie pełni roli czynnika odpowiedzialnego za
wycinanie któregokolwiek intronu w genie cytb i cox1.
Wyniki hybrydyzacji z sondami intronowymi bi1 i ai5 wykazują jednak, że
transkrypcja zarówno genu cytb jak i cox1 nie jest zaburzona, gdyż introny te akumulują się
na poziomie odpowiadającym obserwowanemu w szczepie dzikim. Wynik ten prowadzi do
wniosku, że za obserwowany brak dojrzałych mRNA oraz prekursorów genów cytb i cox1 w
szczepach
pozbawionych
genu
SUV3
odpowiada
najprawdopodobniej
degradacja
transkrybowanych RNA.
W szczepie SDB9/PG7 obserwuje się także zanik RNA intronu ai1, wykrywanego w
szczepie dzikim. Za odmienny od obserwowanego dla intronu ai5 obraz może odpowiadać
fakt, że w przeciwieństwie do niego intron ai1 posiada kodującą białko o aktywności
maturazy i odwrotnej transkryptazy otwartą ramkę odczytu (Carignani i wsp., 1983, 1986),
obróbka jego RNA może zatem przebiegać w bardziej złożony sposób, zależąc również od
produktu genu SUV3.
Wpływ dysrupcji genu SUV3 na poziom różnych mitochondrialnych RNA
przypomina efekty uzyskane dla genu NAM1 (Groudinsky i wsp., 1993). Brak zarówno
dojrzałego mRNA jak i prekursorów stwierdzono też w mutancie cbp1 (Dieckmann i wsp.,
1984a,b; Dieckmann i Mittelmeier, 1987). Wykazano, że produkt genu CBP1 zaangażowany
jest w utrzymywanie stabilności transkryptów cytb związane z obróbką na końcu 5’
transkryptu. Dla genu NAM1 również proponowano funkcję związaną z utrzymywaniem
stabilności zawierających introny transkryptów cytb i cox1.
W podsumowaniu można zatem stwierdzić, że produkt genu SUV3 jest niezbędny dla
utrzymania stabilności zawierających introny transkryptów genów cytb i cox1 w sposób
niezależny od obecności konkretnych intronów lecz związany z ilością intronów zawartych w
danym genie. Posiadane dane nie pozwalają na wyjaśnienie, w jaki dokładnie sposób
realizowana jest na poziomie molekularnym ta funkcja białka suv3p, można jednak pokusić
Rozdział 2.2. Gen SUV3 a stabilnośćć RNA mitochondrialnych
62
się o przedstawienie ogólnej hipotezy. Możliwe jest, że przy braku produktu genu SUV3
dochodzi do utraty części pre-mRNA na każdym z etapów wycinania intronów i składania
transkryptów cytb i cox1. Utrata ta może być spowodowana niespecyficzną degradacją
nukleolityczną, przed którą chroni kompleks białek, którego składnikiem jest suv3p. Przy
obecności najwyżej trzech intronów efekt ten nie jest wystarczający dla spowodowania utraty
zdolności oddechowej, obecność kompletu intronów powoduje jednak gwałtowny spadek
poziomu mRNA i związaną z tym utratę funkcji. Różne introny mogą niejednakowo
przyczyniać się do tego efektu ze względu na wielką różnorodność ich struktur i
mechanizmów obróbki. Stąd też nie zaobserwowano znaczących różnic dla szczepów
niosących dwa lub trzy introny. Dopiero obecność kompletu intronów daje obserwowalny,
drastyczny efekt.
Wyniki te, na tle wcześniejszych prac dotyczących funkcji genu SUV3 sugerują, że
zawierający
białko
suv3p
kompleks
jest
niezbędny
dla
prawidłowej
obróbki
mitochondrialnych RNA na poziomie posttranskrypcyjnym. Utrata jego aktywności
powoduje ogólne i rozległe zaburzenia w przebiegu tych procesów, tym wyraźniej
zaznaczone, im bardziej dany proces jest złożony.
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
63
2.3. Porównanie genów SUV3 S. cerevisiae i S. douglasii – wpływ zależnej od
zmian DNA mitochondrialnego specjacji na ewolucję oddziaływań jądrowomitochondrialnych
2.3.1. Wprowadzenie
Saccharomyces douglasii jest najbliżej spokrewnionym z S. cerevisiae znanym
gatunkiem drożdży. Czas, który upłynął od ich dywergencji został oszacowany na podstawie
analiz sekwencji DNA na około 50 – 80 milionów lat (Herbert i wsp., 1988a). Mimo tak
niedawnej w ewolucyjnej skali czasu dywergencji drożdże te stanowią niewątpliwie
oddzielne gatunki, gdyż powstałe w wyniku ich krzyżówek hybrydowe diploidy są niepłodne
na skutek zaburzeń w mejozie (Hawthorne i Philippsen, 1994). Kolejną istotną barierą
między tymi gatunkami jest niezgodność jądrowo-mitochondrialna (Kotylak i wsp., 1985).
DNA mitochondrialny S. douglasii nie funkcjonuje w kontekście jądrowym S.
cerevisiae.Przyczyna tej niezgodności jest obecność w genomie mitochondrialnym S.
douglasii nie występującego w S. cerevisiae intronu ai1 (niekiedy oznaczanego też ai4) w
genie cox1. Intron ten wymaga do prawidłowego wycinania aktywności produktu genu
jądrowego MRS1, podczas gdy homologiczny gen z S. cerevisiae, mimo znacznego
podobieństwa sekwencji, aktywności tej nie posiada (Herbert i wsp., 1992).
S. cerevisiae i S. douglasii stanowią niezwykle interesujący układ dla badania
ewolucji oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych. Jest to jedyny znany układ, w którym tak
niedawna dywergencja związana jest z tak wyraźnymi zmianami w organizacji genomu
mitochondrialnego i w funkcjonowaniu genów jądrowych zaangażowanych w jego ekspresję.
Badania porównawcze genomów mitochondrialnych obu gatunków (Tian i wsp., 1991a,b;
Ragnini i wsp., 1991; Tian i wsp., 1993) wykazały istotne różnice dzielące oba gatunki, a
przejawiające się głownie zmieniona kolejnością genów na mapie genomu oraz ilościowymi
i jakościowymi różnicami w składzie intronów. Zmienioną kolejność genów najłatwiej
wytłumaczyć zajściem w ewolucji mtDNA S. douglasii translokacji obejmującej obszar 15
kb zawierający geny cox3 i SSU-rRNA (Tian i wsp., 1991a). Translokacja ta nie zaburza
ciągłości żadnej ze znanych w S. cerevisiae jednostek transkrypcyjnych i wydaje się nie mieć
istotnego wpływu na ekspresję genów mitochondrialnych. Porównanie kolejności genów w
genomach mitochondrialnych różnych grzybów (Tian i wsp., 1991a) nie wskazuje na
konserwację kolejności genów. Fakt, że między S. cerevisiae i S. douglasii zaszła wyłącznie
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
64
jedna duża translokacja, zaś układ pozostałych genów jest niezmieniony, jest kolejną
przesłanką wskazującą na niedawną dywergencję tych gatunków.
Bardzo istotne dla funkcjonowania genomu mitochondrialnego i zaangażowanych w
jego ekspresję genów jądrowych są natomiast zmiany w strukturze genów podzielonych
obserwowane pomiędzy tymi gatunkami. Zmiany te podsumowano na rysunku 2.9.
Rysunek 2.9. Porównanie struktury genów podzielonych Saccharomyces cerevisiae i Saccharomyces douglasii.
Gen cox1 S. douglasii posiada dwa nowe introny, pozbawiony jest natomiast pięciu z
siedmiu intronów znanych w S. cerevisiae. W genie cytb stwierdzono jeden nowy intron,
brak jest natomiast dwóch z pięciu intronów znanych u S. cerevisiae. Jedyny intron genu
LSU-rRNA (intron , czyli r1) jest u obu gatunków wstawiony w tej samej pozycji genu,
jego struktura jest natomiast odmienna. Intron S. douglasii należy, podobnie jak jego
odpowiednik z S. cerevisiae, do grupy I, a sekwencje styku intron/egzon są podobne. Intron
S. douglasii jest jednak znacznie krótszy niż w S. cerevisiae i pozbawiony otwartej ramki
odczytu, a przez to mobilności.
Zmiany te doprowadziły do wytworzenia się różnic funkcjonalnych w niektórych
genach jądrowych, których produkty zaangażowane są w procesy związane z obróbka
intronów mitochondrialnych. Porównanie funkcji genów jądrowych zaangażowanych w
ekspresje genomu mitochondrialnego poznanych do tej pory o obu gatunków zestawiono w
tabeli 2.4. Pozostałe geny tego typu znane u S. cerevisiae nie zostały jak dotąd zbadane u S.
douglasii.
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
65
Gen
CBP2
Funkcja w S. cerevisiae
Wycinanie intronu bi5
Funkcja w S. douglasii
Wycinanie intronu
MRS1
Wycinanie intronów bi3 i ai5
Wycinanie intronów bi3 , ai5 (ai4)1 i ai1
NAM2
Syntaza leucylo-tRNA i czynnik Syntaza leucylo-tRNA i czynnik wycinania
wycinania intronów grupy I
intronów grupy I
Tabela 2.4. Porównanie funkcji genów jądrowych zaangażowanych w ekspresje genomu mitochondrialnego
zbadanych u S. cerevisiae i S. douglasii.
Jak wynika to z przedstawionej tabeli, dla dwóch spośród zbadanych dotychczas
genów wystąpiły istotne różnice funkcjonalne. Gen MRS1 uzyskał u S. douglasii nową
funkcję w wycinaniu intronu ai1, nie występującego u S. cerevisiae. Produkt genu MRS1 S.
cerevisiae funkcji tej nie wykazuje, co stanowi źródło niezgodności jądrowomitochondrialnej obu gatunków (Herbert i wsp., 1992). Genom mitochondrialny S. douglasii
pozbawiony intronu ai1 niezgodności tej już nie wykazuje i może funkcjonować w
kontekście jądra S. cerevisiae.
Produkt genu CBP2 u S. cerevisiae jest niezbędny do wycinania ostatniego intronu w
genie cytb – bi5. S. douglasii jest tego intronu pozbawiony i gen CBP2 ma w nim inną
funkcję. Jest nią wycinanie intronu z genu LSU-rRNA, co wykazano zarówno in vitro
(Shaw i Lewin, 1997) jak i in vivo (Tian i wsp., 1998). Badania in vivo wykazują, że u S.
cerevisiae wycinanie intronu nie zależy od genu CBP2.
Z przedstawionych poniżej danych wyłania się obraz skoordynowanej ewolucji DNA
mitochondrialnego i związanych z jego funkcjonowaniem genów jądrowych. Jest to ewolucja
obserwowana w stadium początkowym (incipient evolution (Herbert i wsp., 1988a)), co
stwarza wyjątkowe możliwości badania procesu specjacji. Układ ten jest szczególnie
interesujący z punktu widzenia badania oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych, gdyż na
podstawie przedstawionych powyżej danych można wysnuć hipotezę, iż to właśnie zmiany
w genomie mitochondrialnym są tutaj siłą napędową ewolucji, pociągając za sobą
dywergencję genów jądrowych.
Badanie sekwencji i funkcji genów S. douglasii będących homologami znanych u S.
cerevisiae jądrowych czynników ekspresji genów mitochondrialnych przyczynia się zatem
do lepszego poznanie mechanizmów ewolucji drożdży, a także lepszego zrozumienia natury
oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych. Wydało więc się interesującym zbadanie funkcji
1
W tabeli zastosowano dla obu gatunków numerację intronów ustaloną dla S. cerevisiae dla podkreślenia
homologii niektórych intronów. W rzeczywistości ai5 jest u S. douglasii czwartym intronem w genie cox1 i
jest oznaczany prawidłowo ai4. Intron ai1 S. douglasii nie ma odpowiednika w S. cerevisiae.
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
66
będącego przedmiotem przedstawionych w poprzednim rozdziale rozważań genu SUV3 u S.
douglasii. Gen SUV3 jest w kontekście tych badań szczególnie interesujący, ponieważ jedną
z jego postulowanych funkcji jest udział w procesach związanych z metabolizmem
zawierających introny transkryptów mitochondrialnych. Szczególnie wyraźna jest rola
produktu genu SUV3 w prawidłowym wycinaniu intronu (Stepien i wsp., 1995;
Margossian i wsp., 1996). Postanowiono więc przeprowadzić serię doświadczeń mających
odpowiedzieć na następujące pytania:
jak silna jest dywergencja sekwencji genu SUV3 pomiędzy S. cerevisiae i S. douglasii w
porównaniu z innymi poznanymi u obu gatunków genami?
czy istnieją różnice funkcjonalne dla genu SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii, w
szczególności w odniesieniu do intronu ?
czy badanie sekwencji i działania genu SUV3 S. douglasii potwierdza hipotezę o
ogólnym i podstawowym charakterze jego funkcji?
Wyniki tych badań przedstawione są w dalszej części pracy. Szczegóły dotyczące metod
doświadczalnych a także zbiorcza lista szczepów i konstrukcji DNA użytych w tych
doświadczeniach znajduje się w rozdziale „Materiały i metody”
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
67
2.3.2. Klonowanie i sekwencjonowanie genu SUV3 Saccharomyces douglasii
Obecność w genomie S. douglasii sekwencji odpowiadającej genowi SUV3
potwierdzono za pomocą hybrydyzacji do przeniesionych na filtr metodą Southerna
całkowitych DNA S. cerevisiae i S. douglasii trawionych różnymi kombinacjami enzymów
restrykcyjnych z wyznakowanym fragmentem NsiI-NsiI genu SUV3 S. cerevisiae. Wynik
hybrydyzacji przedstawiono na rysunku 2.10.
Rysunek 2.10. Obraz autoradiogramu uzyskanego w wyniku hybrydyzacji całkowitego DNA S. cerevisiae (S. c) i S.
douglasii (S.d) z sondą odpowiadająca fragmentowi NsiI-NsiI genu SUV3 S. cerevisiae. Na rysunku zaznaczono użyte
do trawienia DNA enzymy restrykcyjne. Strzałki oznaczają przybliżoną wielkość fragmentów DNA.
Hybrydyzację prowadzono w stosunkowo ostrych warunkach (60 C, 5x SSC),
uzyskany wynik sugeruje zatem, że w genomie S. douglasii znajduje się sekwencja o
wysokiej homologii z sekwencją genu SUV3 S. cerevisiae, mimo pewnych różnic
obserwowanych w rozmieszczeniu niektórych miejsc restrykcyjnych.
Schemat klonowania pełnej sekwencji genu SUV3 S. douglasii przedstawiono na
rysunku 2.11.
Na podstawie sekwencji genu SUV3 S. cerevisiae (numer dostępu EMBL M91167)
zaprojektowano parę starterów PCR oznaczonych L1 i R (sekwencje wszystkich używanych
starterów umieszczono w rozdziale „Materiały i Metody”). Przy ich użyciu namnożono,
stosując jako matrycę całkowity DNA S. douglasii, fragment o długości około 400 pz,
zgodnej z przewidywaną na podstawie sekwencji S. cerevisiae (rys. 2.11 I, II).
Namnożony fragment wyznakowano i użyto jako sondy do przeszukania banku DNA
S. douglasii (otrzymanego od dra Erica Petrochilo z CGM, Gif sur Yvette) metodą
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
68
hybrydyzacji kolonijnej. Wyizolowano osiem pozytywnych klonów, które po wstępnej
analizie restrykcyjnej okazały się zawierać ten sam plazmid o wielkości około 20 kb. Dalsze
subklonowanie i analiza hybrydyzacyjna pozwoliły na zawężenie sekwencji zawierającej gen
SUV3 do fragmentu BamHI-PstI o długości około 3 kb. Fragment ten sklonowano w
wektorze pBlueScriptKS+, uzyskując plazmid pSSD2 (rysunek 2.11 III). Sekwencja obu
Rysunek 2.11. Schemat strategii klonowania pełnej sekwencji genu SUV3 Saccharomyces douglasii . Dokładny opis
w tekście.
100%
80%
% ident.
60%
Ks
40%
Ka
ARG4
SUV3
NAM2
CBP2
0%
MRS1
20%
Rysunek 2.13. Porównanie wartości identyczności aminokwasowej, Ks i Ka (dane z tablicy 2.5) dla różnych
zbadanych genów S. cerevisiae i S. douglasii
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
69
końców wstawki pSSD2 wykazała, że zawiera ona niekompletną sekwencję genu SUV3,
pozbawioną fragmentu z końca 5’ powyżej miejsca BamHI (nie występującego w genie S.
cerevisiae), natomiast od strony 3’ obejmuje obszar aż do leżącego poniżej genu SUV3 genu
ERG10 (YPL028W), kodującego acetylo-CoA tiolazę. Kolejność genów w genomie S.
douglasii okazała się więc w tym przypadku identyczna z mapą opracowaną dla S. cerevisiae
(podobnie jak we wszystkich zbadanych do tej pory przypadkach), przedstawioną na rysunku
2.11 I.
Wykorzystując te informacje oraz znaną (dzięki dostępności pełnej sekwencji
genomu S. cerevisiae) sekwencję leżącej powyżej genu SUV3 otwartej ramki odczytu
YPL30W (o nieznanej dotychczas funkcji), zaprojektowano parę starterów DL i DR (rysunek
2.11 I, II). PCR z użyciem tych starterów na matrycy całkowitego DNA S. douglasii
pozwolił na sklonowanie w plazmidzie pSSD3 (rysunek 2.11 III) brakującego fragmentu
genu SUV3. W reakcji PCR zastosowano polimerazę Pfu posiadającą aktywność korekcji
błędów, w celu uniknięcia wprowadzanych przez PCR artefaktów.
Kompletną sekwencję genu SUV3 S. douglasii odtworzono łącząc oba fragmenty w
plazmidzie pYPG14 (rysunek 2.11 IV).
Sekwencję 2429 pz obejmującą kompletną otwartą ramkę odczytu genu SUV3 S.
douglasii uzyskano sekwencjonując metodą Sangera plazmidy pSSD2, pSSD3, pYPG14 i
wycięte z nich mniejsze fragmenty (przy użyciu enzymów zaznaczonych na rysunku 2.11
IV) przy zastosowaniu zarówno starterów uniwersalnych jak i zaprojektowanych specjalnie
do tego celu oligonukleodytów oznaczonych SUV3DOU1..SUV3DOU8 (kompletna lista
starterów zamieszczona jest w części „Materiały i Metody”). Uzyskaną sekwencję złożono w
bazie danych EMBL, gdzie uzyskała numer dostępu AJ011586.
2.3.3. Analiza sekwencji genu SUV3 S. douglasii
Uzyskana sekwencja zawiera otwartą ramkę odczytu mogącą kodować białko o
długości 737 aminokwasów, co odpowiada dokładnie przewidywanej długości produktu
genu SUV3 S. cerevisiae. Hipotetyczne sekwencje białkowe uzyskane na podstawie
sekwencji DNA mogą być dokładnie uliniowane bez żadnych luk (rysunek 2.12). Wśród 737
aminokwasów występuje zaledwie 57 podstawień aminokwasowych (identyczność 92%), z
których 20 można uznać za podstawienia zachowawcze (co daje 95% podobieństwa).
Sekwencje nukleotydowe otwartych ramek odczytu SUV3 obu gatunków porównano
przy użyciu programu DIVERGE z pakietu GCG oraz napisanego na potrzeby tej pracy
programu w języku Pascal (kod źródłowy programu umieszczono jako Dodatek A). Podobną
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
70
Rysunek 2.12. Porównanie sekwencji aminokwasowych genu SUV3 S. cerevisiae (S. c) i S. douglasii (S. d).
Aminokwasy identyczne w obu sekwencjach wyróżniono czarnym tłem, szare tło oznacza podstawienia uznane za
zachowawcze. Do przygotowania rysunku użyto programu BOXSHADE.
analizę przeprowadzono dla innych znanych genów S. douglasii i ich odpowiedników z S.
cerevisiae.
Porównanie sekwencji nukleotydowych otwartych ramek odczytu SUV3 ukazuje
bardzo wysoki poziom zachowania sekwencji. Stwierdzono zaledwie 241 podstawień
nukleotydowych (89% identyczności na poziomie DNA), z czego 196 to tranzycje a 45
transwersje. Tak wysoki stosunek tranzycji do transwersji jest rzadko spotykany i świadczy o
niedawnej dywergencji obu sekwencji (Fitch, 1986; Herbert i wsp., 1988a). 179 podstawień
można sklasyfikować jako nieznaczące dla kodowanej sekwencji białkowej, 62 to mutacje
znaczące (typu zmiany sensu).
Rysunek 2.14. Strategia konstrukcji szczepu S. douglasii SPG1 ze zinaktywowanym genem SUV3 metodą dysrupcji.
Szczegółowy opis w tekście.
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
71
Obliczono za pomocą programu DIVERGE skorygowane nasycenie
mutacjami miejsc synonimicznych i niesynonimicznych (odpowiednio Ks i Ka) według
metody Li (Li i wsp., 1985) z późniejszymi modyfikacjami (Li, 1993, 1997; Pamilo i
Bianchi, 1993). Uzyskane wartości (odpowiednio 0,337 i 0,041) oraz wartości pozostałych
badanych parametrów dywergencji w porównaniu z wynikami dla innych znanych genów S.
douglasii i ich odpowiedników z S. cerevisiae zawarto w tabeli 2.5.
Uzyskane dla genu SUV3 wyniki nie odbiegają znacząco od parametrów obliczonych
dla znanych wcześniej genów zbadanych u obu gatunków: we wszystkich przypadkach
mamy do czynienia z ciągłym uliniowaniem bez przerw w sekwencjach białkowych i
sekwencjach DNA otwartych ramek odczytu, bardzo znacznym stopniem zachowania
sekwencji DNA, tranzycjami ponad dwukrotnie częstszymi od transwersji (co świadczy o
niedawnej dywergencji, Fitch, 1986), również w miejscach czterokrotnie zdegenerowanych
oraz małym wysyceniem mutacjami synonimicznymi.
Parametr
Gen
SUV3
CBP2
MRS1 NAM2 ARG4
Kodony
737
630
363
894
463
zmiany aminokwasowe
identyczność aminokwasowa
razem zmiany nukleotydowe
tranzycje
transwersje
tranzycje/transwersje
57
92%
241
196
45
4.36
80
87%
273
201
72
2.79
52
86%
137
98
39
2.51
76
91%
279
219
60
3.65
13
97%
112
89
23
3.87
mutacje ciche
mutacje zmiany sensu
miejsca czterokrotnie zdegenerowane
zmiany w tych miejscach
tranzycje
transwersje
tranzycje/transwersje
179
62
254
68
51
17
3.00
173
100
178
58
41
17
2.41
79
58
132
29
16
13
1.23
196
83
308
83
57
26
2.19
98
14
181
44
31
13
2.38
Ks
Ka
0.337
0.041
0.432
0.075
0.312
0.079
0.325
0.045
0.286
0.014
Tabela 2.5. Dywergencja znanych par genów S. cerevisiae i S. douglasii. Miejsca czterokrotnie zdegenerowane są to
takie pozycje, zachowane na poziomie sekwencji białka, w których dowolne podstawienie nukleotydowe jest
nieznaczące (trzeci nukleotyd kodonów A, G, P, T, V, R (CGN), L (CTN) i S (TCN)). Ks i Ka są to odpowiednio
skorygowane wysycenia miejsc synonimicznych mutacjami synonimicznymi i miejsc niesynonimicznych mutacjami
niesynonimicznymi. Wcześniejsze analizy tego typu znalazły się w pracach (Li i wsp., 1996) i (Adjiri i wsp., 1994).
Parametry Ks i Ka obliczono przy użyciu programu DIVERGE (pakiet GCG 9.1), pozostałe przy użyciu napisanego w
tym celu programu ORFS (kod w języku Pascal zawarty w Dodatku A rozdziału „Materiały i metody”).
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
72
Interesujące wydaje się porównanie wartości Ka, Ks oraz identyczności
aminokwasowej dla różnych genów, dla większej jasności przedstawione w postaci wykresu
słupkowego na rysunku 2.13.
Z przedstawionego porównania widać, że o ile wartość Ks nie wydaje się wykazywać
jakichkolwiek prawidłowości (mutacje synonimiczne z reguły nie podlegają doborowi
naturalnemu, ich rozkład jest zatem zwykle losowy), o tyle wartości Ka i identyczności zdają
się mieć związek z funkcją genu. Najwyższą konserwację wykazuje gen ARG4, którego
funkcja nie jest związana z ekspresją genów mitochondrialnych. Najmniej konserwowane
(stosunkowo wysoka wartość Ka i niska identyczność) są geny MRS1 i CBP2 których
funkcje (por. tabela 2.4) związane są z obróbką intronów mitochondrialnych, wykazujących
istotne różnice pomiędzy badanymi gatunkami Saccharomyces. Geny SUV3 i NAM2
wykazują wartości pośrednie, ich funkcja zaś, mimo iż związana z ekspresją genów
mitochondrialnych, realizuje się zapewne zasadniczo na poziomie ogólnym, nie związanym z
konkretnym intronem. Oczywiście wobec niewielkiej liczby przebadanych dotychczas w tym
kontekście genów powyższe rozważania należy traktować bardziej w kategoriach intuicji niż
analizy ugruntowanej statystycznie. Przytoczono je jednak gdyż potwierdzają wcześniejsze
hipotezy dotyczące ogólnego charakteru funkcji genu SUV3.
2.3.4. Gen SUV3 jest niezbędny do funkcjonowania mitochondrialnego aparatu
genetycznego S. douglasii
W celu porównania funkcji genu SUV3 S. cerevisiae i S. douglasii konieczne było
skonstruowanie szczepu S. douglasii niosącego zinaktywowany gen SUV3 i porównanie jego
fenotypu z analogicznym szczepem S. cerevisiae (Stepien i wsp., 1992). Szczep taki
uzyskano metodą dysrupcji (Orr-Weaver i wsp., 1983), strategię postępowania
przedstawiono na rysunku 2.14.
Fragment BamHI-KpnI
z plazmidu pYPG14 subklonowano do wektora
pBlueScriptKS+, uzyskując plazmid pYPG15. Następnie wycięto z tego plazmidu fragment
NsiI-Bst1107I i zastąpiono go fragmentem NsiI-PvuI z plazmidu pJJ244 (Jones i Prakash,
1990) niosącym kasetę URA3. uzyskany konstrukt nazwano pDIS8. Wstawkę pDIS8 wycięto
następnie przy użyciu enzymów BamHI i KpnI i transformowano szczep S. douglasii 470722D.
Transformanty selekcjonowano wstępnie na podłożu pozbawionym uracylu,
wyizolowano w ten sposób 70 transformantów, które następnie poddano testom na podłożu
kompletnym, z glicerolem jako źródłem węgla. Wszystkie transformanty nie były zdolne na
podłożu z glicerolem, rosły natomiast na podłożu z glukozą jako źródłem węgla, co sugeruje
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
73
niewydolność oddechową, związaną z reguły z zaburzeniem funkcjonowania mitochondriów.
Pięć spośród tych transformantów poddano analizie metodą PCR i wykazano, że zawierają
oczekiwaną dysrupcję genu SUV3 zgodnie z mapą na rysunku 2.14. Tak uzyskany szczep
dysruptanta nazwano SPG1. Z wcześniejszych prac na S. cerevisiae (Stepien i wsp., 1992)
wiadomo, że takie, a nawet mniej rozległe delecje całkowicie inaktywują gen SUV3.
Niezdolność szczepu SPG1 do wzrostu na glicerolu odpowiada fenotypowi
obserwowanemu w analogicznych, pozbawionych funkcjonalnego genu SUV3, szczepach S.
cerevisiae (Stepien i wsp., 1992). U S. cerevisiae zaobserwowano dodatkowo bardzo znaczne
obniżenie stabilności DNA mitochondrialnego, objawiające się szybkim i nieodwracalnym
przekształcaniem mtDNA do form 0/–. W celu określenia stabilności mtDNA w szczepie
SPG1 skrzyżowano wyprowadzone z pojedynczych kolonii subklony tego szczepu ze
szczepem 4795-3B’/50, pochodną typu 0 dzikiego szczepu S. douglasii 4795-3B’ (Herbert i
wsp., 1988a) i badano zdolność utworzonych diploidów do wzrostu na podłożu
zawierającym glicerol jako jedyne źródło węgla. Spośród 50 przebadanych w ten sposób
Rysunek 2.16. Komplementacja fenotypu niezdolności do wzrostu na podłożu z niefermentowalnym Ÿródłem węgla
związanego z inaktywacją genu SUV3 przez wprowadzenie plazmidów z dziką kopią genu S. cerevisiae i S. douglasii/
w układach homologicznych i heterologicznych.
subklonów żaden nie dał w tym teście wyniku pozytywnego, co sugeruje, że w szczepie tym
zachodzi całkowita konwersja mtDNA do form 0/–.
Wprowadzenie do szczepu S. cerevisiae z dysrupcją genu SUV3 genomu
mitochondrialnego pozbawionego intronów nie przywraca zdolności oddechowej, ale do
pewnego stopnia poprawia stabilność mtDNA (Dmochowska i wsp., 1995). W celu zbadania
ewentualnego wpływu intronów na spowodowaną dysrupcją genu SUV3 utratę zdolności
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
74
oddechowej u S. douglasii skrzyżowaliśmy szczep SPG1/50 – pochodną 0 szczepu SPG1 –
ze szczepem 4795-3B’/ niosącym bezintronowy mtDNA. Uzyskany szczep diploidalny
poddano sporulacji a następnie analizowano jego potomstwo mejotyczne pod katem
zdolności do wzrostu na podłożu niefermentowalnym, zawierającym glicerol jako jedyne
źródło węgla. Spory zawierające w swym genomie uszkodzony gen SUV3 nie były zdolne do
wzrostu na glicerolu (rysunek 2.15), a zawartość genomów mitochondrialnych + wynosiła w
nich około 20%.
Rysunek 2.15. Wzrost szczepów uzyskanych w wyniku krzyżówki szczepu SPG1/50 ze szczepem 4795-3B’/ na
podłożu z niefermentowalnym Ÿródłem węgla (glicerol). Na rysunku przedstawiono szczepy wyprowadzone z
pojedynczej, pełnej tetrady.
Usunięcie intronów mitochondrialnych nie przywraca zatem szczepom S. douglasii
pozbawionym genu SUV3 prawidłowej funkcji mitochondrialnej, podnosi jedynie stabilność
DNA mitochondrialnego w takich szczepach. Jest to fenotyp całkowicie zgodny z
obserwowanym wcześniej (Stepien i wsp., 1992; Dmochowska i wsp., 1995) fenotypem
analogicznych szczepów S. cerevisiae.
Interesująca różnica jest natomiast fakt, że uzyskane w opisany powyżej sposób
pozbawione genu SUV3 szczepy S. douglasii nie wytwarzają spontanicznych supresorów
zdolnych do wzrostu na glicerolu, co zachodzi z dosyć wysoką częstością w analogicznych
szczepach S. cerevisiae (patrz rozdziały 2.1 i 2.2). Nie udało się zatem u S. douglasii uzyskać
spontanicznego supresora typu suB9, opisanego u S. cerevisiae (Stepien i wsp., 1995; Golik i
wsp., 1995) i rozdział 2.1 i 2.2 tej pracy).
Opisane dotychczas wyniki wykazują, że gen SUV3 zaangażowany jest u S. douglasii
w podstawowe i niezbędne dla funkcjonowania mitochondriów mechanizmy ekspresji
genów, podobnie jak jego ortolog z S. cerevisiae.
2.3.5. Geny SUV3 S. cerevisiae i S. douglasii są w pełni wymienialnymi
odpowiednikami funkcjonalnymi
W celu dalszego zbadania kwestii homologii funkcjonalnej genów SUV3 obu
gatunków drożdży przeprowadzono serię doświadczeń w których fenotyp różnych alleli genu
SUV3 komplementowano wprowadzoną na plazmidzie dziką kopią genu z jednego bądź
drugiego gatunku. Użyto w tym celu plazmidów: pYPG18, zawierającego gen SUV3 S.
cerevisiae we fragmencie BamHI o długości około 5 kb oraz pYPG19 zawierającego gen
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
75
Rysunek 2.17. Gen SUV3 S. douglasii na plazmidzie niskokopiowym komplementuje defekty w obróbce transkryptów
LSU-rRNA S. cerevisiae związane z mutacją lub inaktywacją genu SUV3 w genomie. Obraz autoradiogramu
uzyskanego po przeniesieniu mitochondrialnych RNA opisanych na rysunku szczepów na filtr nylonowy i hybrydyzacji
z sondami odpowiadającymi intronowi oraz egzonom LSU-rRNA.
SUV3 S. douglasii we fragmencie odpowiadającym wstawce plazmidu pYPG14 wyciętej
enzymami SstI i PstI. Wektorem dla obu konstrukcji był drożdzowo–bakteryjny
niskokopiowy plazmid YCplac111 (Gietz i Sugino, 1988) zawierający sekwencje ARS-CEN
oraz marker LEU2. Wybrano plazmid niskokopiowy aby uniknąć zakłóceń wywołanych
nadekspresją wprowadzanego genu a także ze względu na to, że S. douglasii nie utrzymuje
stabilnie plazmidów opartych na sekwencji 2 (Herbert i wsp., 1988a).
W pierwszym doświadczeniu do szczepów niosących dysrupcję genu SUV3 obu
gatunków wprowadzono plazmidy pYPG18 i pYPG19. W doświadczeniu wykorzystano
szczepy SPG1 (S. douglasii), SUV3 (S. cerevisiae) oraz SUV3 i (S. cerevisiae,
bezintronowy mtDNA).
W przypadku szczepu SUV3 i, który zachowuje wystarczającą ilość mtDNA typu
+ wystarczyło wprowadzić oba plazmidy przez transformację i badać fenotyp
transformantów. Szczepy obu gatunków niosące dzikie mtDNA ulegają jednak w całości
konwersji do form 0/–, co wymusza zastosowanie bardziej złożonej strategii. W przypadku
szczepu S. cerevisiae SUV3 do transformacji użyto więc jego pochodnej 0, a następnie
wprowadzono do uzyskanych transformantów mtDNA typu bezintronowego metodą
cytodukcji używając jako dawcy szczepu CK50-A/1.
Sytuacja jest jeszcze bardziej złożona w przypadku S. douglasii ze względu na brak
odpowiednich do cytodukcji dawców z mutacją Kar1-1 (krzyżówki międzygatunkowe ze
szczepami S. cerevisiae zachodzą z bardzo małą wydajnością). Posłużono się zatem
trójetapową strategią opisaną przez Herberta i wsp. (1988a). W pierwszym etapie do
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
76
dzikiego szczepu S. douglasii wprowadzono odpowiedni plazmid (pYPG18 lub pYPG19)
przez transformację i selekcję na podłożu pozbawionym leucyny. W drugim etapie
transformowano uzyskane w pierwszym etapie szczepy zlinearyzowanym plazmidem pDIS8
w celu uzyskania dysrupcji genu SUV3, selekcję prowadzono na podłożu pozbawionym
uracylu. W trzecim etapie odrzucono te klony u których dysrupcji uległa plazmidowa, nie
zaś genomowa kopia genu SUV3 przez „zgubienie” metodą wielokrotnych pasaży w podłożu
kompletnym plazmidu i sprawdzenie fenotypu tak uzyskanego szczepu. Oczekiwany szczep
po „zgubieniu” plazmidu dawał fenotyp taki, jak szczep SPG1, niosący dysrupcję SUV3 w
genomie.
Uzyskane w wyniku powyższych manipulacji szczepy testowano badając ich
zdolność do wzrostu na podłożu niefermentowalnym (glicerol) w porównaniu ze szczepem
dzikim oraz niestransformowanymi szczepami niosącymi dysrupcje SUV3.
Wyniki przedstawiono na rysunku 2.16. Wyraźnie widać, że wprowadzenie
dzikiej kopii genu SUV3 S. cerevisiae całkowicie komplementuje fenotyp dysrupcji S.
douglasii, równie skutecznie jak u S. cerevisiae. Podobnie, heterologiczna komplementacja
genem SUV3 S. douglasii całkowicie przywraca wydolność oddechową szczepom S.
cerevisiae pozbawionym genu SUV3 niezależnie od zawartości intronów w mtDNA. We
wszystkich przypadkach zarówno homologiczna, jak i heterologiczna komplementacja
przywraca w pełni dziki fenotyp wzrostowy.
Wyniki te pokazują, że geny SUV3 S. cerevisiae i S. douglasii są w pełni
równoważne funkcjonalnie i mogą zastępować siebie nawzajem bez obserwowalnych
zakłóceń funkcji. Szczególnie wart podkreślenia jest fakt, że zachodzi to niezależnie od
zawartości intronów w mtDNA, mimo omówionych wcześniej istotnych różnic dzielących
pod tym względem oba badane gatunki.
W kolejnym doświadczeniu zbadano zdolność genu SUV3 S. douglasii do
komplementacji defektów w metabolizmie transkryptów genu LSU-rRNA S. cerevisiae
obserwowanych w szczepach niosących mutację typu zmiany sensu lub całkowicie
pozbawionych funkcji genu SUV3. Wcześniejsze badania wykazały, że gen SUV3 jest u S.
cerevisiae zaangażowany w metabolizm RNA, a wiele z obserwowanych efektów
fenotypowych dotyczy obróbki transkryptów mitochondrialnych zawierających introny
(Conrad-Webb i wsp., 1990; Stepien i wsp., 1995; Golik i wsp., 1995; Margossian i wsp.,
1996, oraz rozdział 2.2 tej pracy). W szczególności silny efekt zaobserwowano w procesach
obróbki transkryptu genu LSU-rRNA zawierającego intron . Efekt ten jest obserwowany
zarówno w mutancie SUV3-1 typu zmiany sensu (Zhu i wsp., 1989; Stepien i wsp., 1995),
jak i w szczepie z dysrupcją SUV3 (Stepien i wsp., 1995). Ponieważ intron S. douglasii
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
77
znacząco różni się od swego odpowiednika u S. cerevisiae (Ragnini i wsp., 1991) i w
przeciwieństwie do niego wymaga do obróbki aktywności produktu genu CBP2 (Shaw i
Lewin, 1997; Tian i wsp., 1998) postanowiono zbadać, czy gen SUV3 S. douglasii jest w
stanie w pełni zastąpić gen S. cerevisiae w procesach związanych z wycinaniem tego intronu.
W pierwszym doświadczeniu wykorzystano szczep niosący opisywaną wcześniej
(rozdział 2.1) mutację SUV3-1 (Conrad-Webb i wsp., 1990). Mutacja ta, zmieniająca walinę
w pozycji 272 na leucynę, mimo iż nie wpływa na obniżenie zdolności oddechowej
niosącego ją szczepu, daje w efekcie szereg zaburzeń związanych z akumulacją wyciętych i
nie zdegradowanych intronów grupy I. Szczególnie wyraźny jest jej wpływ na akumulację
RNA intronu genu LSU-rRNA (Zhu i wsp., 1989). Fenotyp ten wykazuje częściową
dominację, szczepy diploidalne heterozygotyczne pod względem mutacji SUV3-1 nadal
wykazują podwyższony poziom RNA intronu w porównaniu ze szczepem dzikim,
wyraźnie jednak niższy niż w szczepach haploidalnych lub homozygotycznych pod
względem tej mutacji (Stepien i wsp., 1992).
W celu zbadania zdolności genu SUV3 S. douglasii do komplementowania efektu
mutacji SUV3-1 do szczepu SUV3-1 i + wprowadzono plazmidy pYPG18 oraz pYPG19.
Z tak uzyskanych szczepów izolowano mitochondrialny RNA i po rozdzieleniu w żelu
denaturującym przenoszono na filtr nylonowy i hybrydyzowano z sondą rozpoznająca intron
. Wyniki przedstawiono na rysunku 2.17 A. Wyraźnie widoczna jest silna akumulacja
intronu w szczepie mutanta SUV3-1 i + w porównaniu z kontrolnym szczepem BWG i
+ posiadającym dziki allel genu SUV3. Wprowadzenie na plazmidzie dzikiej kopii genu
SUV3 powoduje wyraźne obniżenie akumulacji intronu, przy czym zarówno gen S.
cerevisiae (pYPG18) jak i S. douglasii (pYPG19) dają tu taki sam efekt. Doświadczenie to
wykazuje zatem, że gen SUV3 S. douglasii komplementuje związany z mutacją SUV3-1
defekt w obróbce intronu w takim samym stopniu, jak jego ortolog z S. cerevisiae.
W kolejnym doświadczeniu badano defekt w obróbce zawierającego intron RNA
genu LSU-rRNA w szczepie pozbawionym aktywności genu SUV3. Wykorzystano tu szczep
SDB9, który niesie dodatkowo opisywaną wcześniej mutację suB9 umożliwiającą
utrzymanie przynajmniej części zawierających intron cząsteczek mtDNA w postaci +. W
szczepie SDB9 i + (Stepien i wsp., 1995) obserwuje się defekt objawiający się
drastycznym (ponad 50-krotnym) spadkiem poziomu dojrzałego rRNA kodowanego przez
zawierający intron gen LSU-rRNA. Szczep taki jest w efekcie niezdolny do wzrostu na
niefermentowalnych źródłach węgla. W wyniku transformacji tego szczepu plazmidem
pYPG19 niosącym dziki allel genu SUV3 S. douglasii zaobserwowano pełną
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
78
komplementację fenotypową – szczep odzyskał zdolność oddechową, zaś poziom dojrzałego
RNA kodowanego przez gen LSU-rRNA powrócił całkowicie do normy (rysunek 2.17 B).
Doświadczenie to pokazuje, że gen SUV3 S. douglasii jest w stanie w pełni zastąpić gen S.
cerevisiae w procesie ekspresji genu LSU-rRNA zawierającego intron .
Cały ten cykl doświadczeń wykazuje jednoznacznie, że gen SUV3 S. douglasii jest
funkcjonalnym odpowiednikiem swego ortologa z S. cerevisiae mimo różnic dzielących te
gatunki związanych ze strukturą genomu mitochondrialnego.
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
79
2.3.6. Dyskusja
Sklonowano oraz zsekwencjonowano gen SUV3 Saccharomyces douglasii
i
wykazano, że jest on strukturalnym i funkcjonalnym odpowiednikiem ortologicznego genu
Saccharomyces cerevisiae. Fenotyp związany z inaktywacją genu SUV3 – niewydolność
oddechowa i utrata stabilności DNA mitochondrialnego – jest u obu gatunków podobny i
sugeruje, że funkcja genu SUV3 jest konieczna w procesie biogenezy mitochondriów.
Fenotyp dysrupcji genu SUV3 jest u obu gatunków w pełni odwracany przez wprowadzenie
genu jednego jak i drugiego gatunku, co sugeruje, że funkcja genu SUV3 jest w pełni
zachowana pomiędzy tymi gatunkami drożdży. Nie jest to niezwykłe biorąc pod uwagę
bliskie pokrewieństwo badanych gatunków i wysokie podobieństwo ich genów na poziomie
sekwencji aminokwasowych i nukleotydowych. Warto jednak zauważyć, że w niektórych
badanych dotychczas przypadkach, funkcja genów jądrowych, których produkty
zaangażowane są w ekspresję genów mitochondrialnych jest odmienna u S. douglasii w
porównaniu z S. cerevisiae, co spowodowane jest różnicami w organizacji genomu
mitochondrialnego u tych gatunków, zwłaszcza w odniesieniu do liczby i struktury intronów.
Tak jest w przypadku MRS1 (Herbert i wsp., 1992) oraz CBP2 (Shaw i Lewin, 1997; Tian i
wsp., 1998). Fakt, że gen SUV3, mimo iż ewidentnie uczestniczy w ekspresji genów
mitochondrialnych na etapie posttranskrypcyjnym, także w procesach związanych z
wycinaniem intronów (Stepien i wsp., 1992; Stepien i wsp., 1995; Golik i wsp., 1995;
Margossian i wsp., 1996), zachował tę sama funkcję przy dywergencji S. cerevisiae i S.
douglasii sugeruje, że jego funkcja ma charakter podstawowy. Procesy, w których bierze
udział produkt genu SUV3 związane są z funkcjonowaniem degradosomu mitochondrialnego
(Dziembowski i wsp., 1998) i w świetle przedstawionych tutaj wyników nie są zależne od
konkretnych cech organizacji genomu mitochondrialnego stanowiących o zróżnicowaniu
drożdży S. cerevisiae i S. douglasii.
Porównanie sekwencji genu SUV3 pomiędzy S. cerevisiae a S. douglasii ukazuje
wysoki stopień zachowania sekwencji zarówno na poziomie białkowym, jak i
nukleotydowym, co zgodne jest z hipotezą o niedawnej dywergencji tych gatunków, która
miała przypuszczalnie miejsce 50-80 milionów lat temu (Herbert i wsp., 1988a). Porównanie
to ujawnia właściwości zbliżone do tych, które zaobserwowano w przypadku wcześniej
zbadanych u obu gatunków genów: pozbawione luk uliniowanie sekwencji białkowych i
kodujących je ramek odczytu (luki stwierdza się w obszarach nie kodujących białka) , bardzo
silnie zaznaczone podobieństwo sekwencji białkowych i nukleotydowych, tranzycje ponad
dwukrotnie częstsze od transwersji (oznaka niedawnej dywergencji, Fitch, 1986) oraz
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
80
stosunkowo niskie wysycenie mutacjami synonimicznymi przy wysokim stosunku tranzycji
do transwersji w synonimicznych miejscach czterokrotnie zdegenerowanych.
W badanym układzie podobieństwo sekwencji ramek odczytu genów SUV3 jest
wyraźnie niższe niż w dla genów ARG4, które spośród zbadanych dotychczas genów S.
douglasii i S. cerevisiae wykazują najwyższe podobieństwo, wyższe jednak niż dla najmniej
podobnych ramek odczytu CBP2 i MRS1. W porównaniach tych SUV3 wypada najbliżej pary
genów NAM2. Warto przy tym zauważyć, że zarówno CBP2 (McGraw i Tzagoloff, 1983;
Hill i wsp., 1985; Shaw i Lewin, 1997; Tian i wsp., 1998) jak i MRS1 (Kreike i wsp., 1987;
Bousquet i wsp., 1990; Herbert i wsp., 1992) są specyficznymi czynnikami zaangażowanymi
w wycinanie konkretnych intronów mitochondrialnych, z których część stanowi o różnicach
w strukturze genomu mitochondrialnego pomiędzy S. douglasii a S. cerevisiae. Gen NAM2
koduje syntazę leucylo-tRNA (Herbert i wsp., 1988b), jest również zaangażowany w pewne
procesy związane z obróbką zawierających introny mRNA (Herbert i wsp., 1988b;
Labouesse, 1990), nie ma jednak przesłanek wiążących jego aktywność z obróbką
któregokolwiek konkretnego intronu. Podobnie, zgodnie z przedstawionymi w tej pracy
hipotezami, gen SUV3, mimo iż jego funkcja wpływa między innymi na procesy wycinania
intronów, nie jest związany z obróbką konkretnych intronów, lecz funkcjonuje na bardziej
podstawowym, ogólnym poziomie w procesach związanych z kontrolą stabilności
mitochondrialnych RNA. Gen ARG4 nie jest oczywiście związany z procesami ekspresji
genomu mitochondrialnego. Daje się zatem zauważyć korelacja pomiędzy stopniem
dywergencji sekwencji genów pomiędzy S. douglasii i S. cerevisiae a zaangażowaniem
produktów tych genów w procesy ekspresji genów mitochondrialnych. Oczywiście, ze
względu na małą ilość zbadanych dotychczas genów korelacja ta nie może mieć podbudowy
statystycznej, jest jednak intuicyjnie uzasadniona i zgodna z koncepcją, w myśl której o
specjacji S. douglasii i S. cerevisiae zadecydowały w pierwszej kolejności wydarzenia
związane ze zmianami w strukturze genomu mitochondrialnego.
Hipoteza o ogólnym charakterze funkcji genu SUV3 jest także wzmocniona
wynikami przeprowadzonych w ramach tej pracy doświadczeń nad komplementacją
międzygatunkową, w których wykazano pełną wymienność funkcjonalną genu SUV3
pomiędzy S. cerevisiae a S. douglasii niezależnie od organizacji genomu mitochondrialnego
zarówno na poziomie fizjologicznym (fenotyp wzrostu na podłożach niefermentowalnych)
jak i molekularnym (obróbka RNA mitochondrialnego genu LSU-rRNA).
Drożdże Saccharomyces cerevisiae i Saccharomyces douglasii stanowią wyjątkowy układ
badawczy, którego niezwykłość wywodzi się z bardzo niedawnej specjacji. W układzie tym
możemy obserwować ewolucję „na żywo” (ang. incipient-evolution - Herbert i wsp., 1988a;
Rozdział 2.3. Gen SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii
81
Tian i wsp., 1991a,b) badając współzależności między ewolucją genomu mitochondrialnego i
jądrowego. Ewolucja ta wydaje się być napędzana przez zmiany w genomie
mitochondrialnym, co może w nowym świetle przedstawić mechanizmy specjacji niższych
Eukaryota, choć o ogólnym charakterze obserwowanych zjawisk trudno jest, ze względu na
fragmentaryczność danych, wnioskować.
Układ ten jest również godzien uwagi gdyż, ze względu na przedstawione powyżej
korelacje, może służyć nie tylko do badania dywergencji sekwencji przez porównywanie
znanych genów, lecz także, odwracając niejako tradycyjny tok wnioskowania ewolucjonizmu
molekularnego dostarczać wskazówek co do funkcji nieznanych genów na podstawie stopnia
zachowania ich sekwencji, przynajmniej w przypadku genów zaangażowanych w
oddziaływania jądrowo mitochondrialne.
Rozdział 2.4. Podsumowanie i dyskusja ogólna
82
2.4. Podsumowanie i dyskusja ogólna
Na podstawie przedstawionych w tej pracy wyników, a także omówionych we
wstępie rezultatów innych badań prowadzonych w Zakładzie Genetyki UW oraz
laboratoriach zagranicznych, można zarysować ogólną hipotezę dotyczącą roli genu SUV3 w
biogenezie mitochondriów. Zebrano znaczna ilość informacji empirycznych dotyczących
funkcji tego genu u drożdży Saccharomyces, ekstrapolacja tych danych na ortologi genu
SUV3 odnajdywane u innych organizmów, w tym u człowieka, pozostaje na razie czysto
hipotetyczna.
Analiza porównawcza sekwencji białka kodowanego przez gen SUV3 wykazuje, że
należy ono do szerokiej i różnorodnej rodziny białek o motywach przypominających helikazy
RNA zależne od ATP. W sekwencji białka suv3p obecne są motywy świadczące o zależnej
od RNA aktywności ATP-azy i wiązaniu się z RNA. Aktywność helikazowa per se jest
trudniejsza do wykazania, biorąc jednak pod uwagę wielką różnorodność wykazujących tę
aktywność białek, pozostaje ona nadal bardzo prawdopodobna.
Charakterystyczne dla rodziny helikaz RNA typu DEAD/DExH (sensu lato) motywy obecne
są w sekwencji białka suv3p w dosyć nietypowej postaci, sam główny, wyróżniający
poszczególne podrodziny motyw B ATP-azy (domena V) ma tu postać DEIQ. Typowe dla
białka suv3p formy motywów sekwencyjnych są wyraźnie konserwowane wśród jego
ortologów z całego nadkrólestwa Eukaryota, nie występują natomiast u innych białek z tej
rodziny. Można więc stwierdzić, że białko suv3p stanowi prototyp nowej podrodziny białek z
grupy DEAD, którą przez analogię do innych należałoby nazwać „podrodziną DEIQ”. Białka
z tej podrodziny zdają się być rozpowszechnione i silnie konserwowane u wszystkich
organizmów wyposażonych w mitochondria. Dowody empiryczne na zaangażowanie w
funkcje mitochondrialne istnieją jedynie dla białek drożdżowych, w sekwencji pozostałych
znajdują się jednak obszary sugerujące lokalizację mitochondrialną. Jedyne znane białko z tej
podrodziny spoza Eukaryota znaleziono u bakterii Rhodobacter sphaeroides należącej do proteobakterii –grupy bakterii purpurowych uważanej za najbliższą ewolucyjnym przodkom
mitochondriów.
Na
podstawie
dokładnej
analizy
fenotypowej,
a
także
wyników
badań
biochemicznych można wysnuć hipotezę, że białko suv3p drożdży jest jednym z kluczowych
składników mitochondrialnego degradosomu (Dziembowski i wsp., 1998)– kompleksu o
aktywności zależnej od RNA i ATP egzorybonukleazy (Margossian i wsp., 1996), którego
aktywność niezbędna jest dla prawidłowej obróbki końców 3’ mitochondrialnych RNA.
Rozdział 2.4. Podsumowanie i dyskusja ogólna
83
Uzyskane w toku tej pracy wyniki, wraz z cytowanymi wynikami innych badań
wydają się dobrze pasować do tego modelu. Inaktywacja genu SUV3 prowadzi do rozległych
zaburzeń w metabolizmie mitochondrialnych RNA. Obserwuje się całe spektrum różnych
defektów, zależnie od genotypu mitochondrialnego, zwłaszcza odnośnie obecności w nim
intronów, a także dodatkowych mutacji jądrowych (mutacja suB9). Wszystkie te defekty dają
się jednak sprowadzić do wspólnego mianownika, którym jest zakłócenie kontroli
stabilności RNA. Najczęściej obserwowanym zjawiskiem jest destabilizacja, prowadząca do
degradacji RNA. Obserwowana jest ona na przykład w przypadku bezintronowego allelu
genu cytb (rozdział 2.2), a także innych RNA (Dziembowski i wsp., 1998).
Badany w nieco innym układzie wpływ intronów mitochondrialnych na związane z
inaktywacją SUV3 defekty (rozdział 2.2 oraz Golik i wsp., 1995) wykazuje postępującą wraz
ze wzrostem liczby intronów w genach cytb i cox1 destabilizację odpowiednich mRNA.
Efekt ten nie jest jednak zależny od obecności konkretnych intronów, co potwierdza, że
mamy tu do czynienia z mechanizmem bardziej ogólnym. Introny mitochondrialne wykazują
wielkie zróżnicowanie w strukturze i mechanizmach wycinania, wspólnym mianownikiem
tych mechanizmów jest jednak zawsze pojawianie się wolnych końców RNA. Inaktywacja
genu SUV3 znosi działanie mechanizmu chroniącego te końce przed niespecyficzną
degradacją, większa liczba wycinanych intronów, po przekroczeniu pewnej progowej
wartości krytycznej prowadzi zatem do spadku poziomu dojrzałego mRNA poniżej
wymaganego dla utrzymania kodowanej przezeń funkcji. Degradosom mitochondrialny
wymagany jest zatem dla zapewnienia w procesie wycinania intronów ochrony przed
niespecyficzną aktywnością nukleolityczną. Sprzeczność jest tylko pozorna, z badań nad
układami bakteryjnym (Hajnsdorf i wsp., 1994) wynika bowiem, że mechanizmem ochrony
końców RNA przed niespecyficzną degradacją może być odpowiednie, nadające właściwą
strukturę, przycięcie dokonywane przez analogiczny kompleks białkowy.
Innym, rzadziej obserwowanym defektem związanym z inaktywacją genu SUV3 jest
nadmierna akumulacja niektórych RNA. W układzie z allelem null genu dotyczy to przed
wszystkim RNA intronu (Stepien i wsp., 1995, patrz też rozdział 2.3). Związek z
inaktywacją funkcji degradosomu jest tu oczywisty, warto jednak zauważyć, że i wówczas
mamy też do czynienia z destabilizacją, w tym przypadku dotykającą egzony.
Tak wyznaczona rola kompleksu, w którym znajduje się produkt genu SUV3 jest
bardzo ogólna i nie powinna zależeć od konkretnego wariantu struktury genomu
mitochondrialnego. Tak jest w istocie, o czym świadczą wyniki badań nad homologią
strukturalną i funkcjonalną genu SUV3 u S. cerevisiae i S. douglasii. Mimo istotnych różnic
w strukturze zawierających introny genów pomiędzy tymi gatunkami, funkcja genu SUV3
Rozdział 2.4. Podsumowanie i dyskusja ogólna
84
jest między nimi zachowana, podobny jest obraz fenotypowy ich inaktywacji, są też w stanie
się wzajemnie zastępować. Dywergencja pomiędzy ich sekwencjami jest mniejsza niż dla
genów, których produkty są specyficznymi czynnikami obróbki konkretnych RNA i, zgodnie
z ogólna wysuwaną tu koncepcją, odpowiada ogólnemu charakterowi funkcji białka suv3.
Drugi znany składnik kompleksu degradosomu – produkt genu DSS1 (Dmochowska i
wsp., 1995; Dziembowski i wsp., 1998) odpowiada prawdopodobnie za właściwą aktywność
RNazową, podczas gdy na podstawie motywów sekwencyjnych produktowi genu SUV3
można przypisać aktywność zależnej od RNA ATP-azy i zapewne też helikazy. Trzecia
podjednostka degradosomu nie jest jeszcze znana, kusząca jest hipoteza, że jest nią produkt
nieznanego wciąż genu suB9, jest to jednak na razie czysta spekulacja.
Kompleks degradosomu oddziałuje też z innymi ważnymi elementami regulacji
ekspresji genów mitochondrialnych. W kształtowaniu końca 3’ mRNA współdziała z
dodekamerazą (Min i Zassenhaus, 1993), kompleksem trzech białek zapewniających
endonukleolityczne cięcie 2 nukleotydy za charakterystycznym dla nie podlegających
translacji obszarów 3’ mRNA mitochondrialnych. Cięcie to jest wymagane dla utworzenia
prawidłowego, stabilnego RNA. O interakcji degradosomu i dodekamerazy świadczy fakt
istnienia genetycznego oddziaływania pomiędzy genem SUV3 (allelem SUV3-1 - Zhu i wsp.,
1989) a obszarem dodekameru genu var1.
Inną interakcją genetyczną, w której bierze udział produkt genu SUV3 jest
oddziaływanie, poprzez produkt genu PET127 z białkami związanymi z obróbką i
stabilizacją końca 5’ RNA (Wegierski i wsp., 1998), niezbędną dla prawidłowego przebiegu
translacji. Białko suv3 jest zatem centralnym elementem, spinającym w jedną całość
mechanizmy obrabiające oba końce mitochondrialnych RNA.
Podsumowując, możemy stwierdzić, że kilkuletnie badania nad genem SUV3
prowadzone w kilku laboratoriach, których częścią są wyniki przedstawione w tej pracy,
doprowadziły nas od obserwacji licznych i różnorodnych efektów fenotypowych i interakcji
genetycznych aż do spójnego, choć wciąż jeszcze nie zamkniętego modelu, w którym białku
suv3 wyznaczono kluczową rolę w procesach kontroli stabilności RNA. Istotą tych procesów
jest subtelne współgranie ochrony i niszczenia, stabilizacji i degradacji, odzwierciedlające
jedną z najogólniejszych zasad funkcjonowania znanego nam świata – nierozłączne
współistnienie procesów tworzenia i niszczenia.
Część III.
Inżynieria genomu mitochondrialnego. Relokalizacja aktywnego
genu jądrowego RIP1 do mitochondriów drożdży S. cerevisiae
Rozdział 3.1. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wstęp
86
3.1. Wstęp
3.1.1. Wprowadzenie
W wyniku ewolucji prowadzącej do redukcji zawartości informacyjnej genomu
(Andersson i Kurland, 1998) genomy mitochondrialne utraciły większość kodowanej przez
siebie informacji. DNA mitochondrialny współczesnych organizmów zawiera zwykle od
kilkunastu do kilkudziesięciu genów (36 u drożdży, nie wliczając intronowych ramek
odczytu – patrz też rozdział 1), co stanowi oczywiście małą część wszystkich genów
kodujących niezbędne dla funkcjonowania organellum składniki. Większość tych genów u
współczesnych organizmów znajduje się w jądrze i ulega translacji w cytosolu a gotowe
produkty białkowe są transportowane do mitochondriów.
Skład genetyczny genomów mitochondrialnych u różnych organizmów wykazuje
znaczną zmienność, znane są liczne przypadki, gdy gen u jednej grupy organizmów
kodowany przez genom mitochondrialny jest u innych organizmów kodowany w jądrze.
Przykładem mogą tu być geny kodujące podjednostki dehydrogenazy NADH, których różna
ilość znajduje się w genomach mitochondrialnych grzybów nitkowatych, a także większości
wyższych eukariontów, w tym ssaków, które kodują w mtDNA siedem podjednostek tego
enzymu. Tymczasem u drożdży S. cerevisiae, najlepiej poznanego organizmu modelowego
dla genetyki mitochondrialnej, wszystkie podjednostki dehydrogenazy NADH kodowane są
przez genom jądrowy. Takie przykłady rodzą naturalne pytanie, dlaczego niektóre geny
pozostają w genomie mitochondrialnym, podczas gdy inne w toku ewolucji przechodzą do
genomu jądrowego.
Odpowiedź na do pytanie jest dosyć oczywista w przypadku genów, których
końcowymi produktami są RNA (np. rRNA i tRNA). Wiadomo, że poza nielicznymi
wyjątkami, dotyczącymi małych cząsteczek, takich jak tRNA (Martin i wsp., 1979; Chang i
Clayton, 1989; Vestweber i Schatz, 1989; Tarassov i Martin, 1996) kwasy nukleinowe nie są
w stanie przeniknąć przez błony otaczające mitochondria. Bariery takiej nie ma w przypadku
białek, gdyż istnieją wydajne systemy ich transportu z cytoplazmy do mitochondrium.
Badania prowadzone przede wszystkim na drożdżach S. cerevisiae doprowadziły do
dosyć dobrego poznania mechanizmów importu syntetyzowanych w cytosolu składników
mitochondrium do wnętrza organellum (Lithgow i wsp., 1995; Pfanner i wsp., 1994; Schatz,
1992; Geli i Glick, 1990). Wciąż jednak nie do końca poznane są zależności między
Rozdział 3.1. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wstęp
87
procesami importu białek do mitochondrium, składania wielopodjednostkowych kompleksów
enzymatycznych i powstawania w pełni funkcjonalnych produktów. Można tylko
przypuszczać, że to właśnie w takich zależnościach kryje się ograniczenie uniemożliwiające
migrację wszystkich genów mitochondrialnych do jądra, które uczyniłoby zbędnym cały
organellarny aparat ekspresji genów.
Jedną z możliwych strategii poszukiwania odpowiedzi na powyższe problemy jest
relokalizacja genów mitochondrialnych do jądra i vice versa – ekspresja genów jądrowych w
mitochondrialnym systemie genetycznym. Na tym jednak nie ograniczają się korzyści
płynące z takich doświadczeń. Możliwość ekspresji dowolnego genu w mitochondriach może
również pozwolić na lepsze poznanie mechanizmów rządzących regulacją ekspresji genów
mitochondrialnych. Równie ważna jest też możliwość badania dynamiki układów
heteroplazmatycznych, w których w pojedynczej komórce znajdują się różne genotypowo
cząsteczki mtDNA. Jest to szczególnie istotne, gdyż zjawisko heteroplazmii odgrywa
kluczową rolę w wielu chorobach ludzkich związanych z mutacjami w mtDNA (Bartnik
1997). Badania te, bardzo istotne dla zrozumienia mechanizmów dziedziczenia
mitochondrialnego, rekombinacji i komplementacji stają się o wiele łatwiejsze gdy pojawia
się możliwość wprowadzenia do DNA mitochondrialnego ulegającego ekspresji konstruktu
zawierającego gen normalnie w mitochondriach nie występujący, którego produkt nadaje
jednak komórkom możliwy do selekcji fenotyp. Kolejnym wreszcie możliwym
zastosowaniem relokalizacji genu jądrowego do mitochondrium jest konstrukcja nowych
genomów mitochondrialnych pozwalających modelować w układzie drożdżowym pewne
aspekty funkcjonowania mtDNA innych organizmów, np. ssaków. Przykładowo, można by
wprowadzić do mtDNA drożdży geny kodujące podjednostki dehydrogenazy NADH,
upodobniając je tym samym do układów ssaczych.
Możliwości wynikające z opracowania techniki relokalizacji genów z jądra do
mitochondrium są więc liczne, i jak zwykle to bywa w przypadku nowych metod, trudno jest
nawet a priori przewidzieć wszystkie możliwe korzyści i zastosowania.
3.1.2. Dotychczasowe doświadczenia nad relokalizacją genów mitochondrialnych i
jądrowych
Od kilkudziesięciu lat drożdże Saccharomyces cerevisiae stanowią główny model
badania genetyki mitochondrialnej. Mimo, że metodologicznie badania nad mitochondriami
są u drożdży znacznie prostsze, niż na przykład u ssaków czy roślin, także i w tym układzie
natrafiały one na poważne bariery techniczne. Jedną z nich była do niedawna niemożliwość
Rozdział 3.1. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wstęp
88
zastosowania tzw. „odwrotnej genetyki”, czyli planowego wprowadzania zmian w
konkretnych genach. Dopiero opracowanie metod transformacji mitochondrialnej (Johnston i
wsp., 1988) zmieniło tę sytuację. Wcześniej jedynym sposobem badania konsekwencji
ukierunkowanych zmian w sekwencji genu mitochondrialnego była jego relokalizacja do
genomu jądrowego.
Wprowadzenie jakiejkolwiek sekwencji do jądra S. cerevisiae czy to na plazmidzie,
czy też przez integrację do chromosomu nie przedstawia oczywiście żadnych trudności
technicznych. Poważnym problemem w przypadku genów mitochondrialnych są natomiast
różnice w ich kodzie genetycznym w porównaniu ze standardowym kodem jądrowym (Fox,
1987). Aby ekspresja genu mitochondrialnego przez mechanizmy jądrowo-cytoplazmatyczne
dała w efekcie prawidłowy produkt konieczne jest skompensowanie tych różnic przez
wprowadzenie w odpowiednich kodonach zmian metodą mutagenezy ukierunkowanej. W
przypadku krótkich sekwencji łatwiejsze może być zsyntetyzowanie genu de novo,
pozwalające dodatkowo na dostosowanie użytych kodonów do charakterystycznych dla
genomu jądrowego preferencji (Farrell i wsp., 1988). Dodatkowo należy wyposażyć taki gen
w odpowiednią presekwencję na N-końcu, umożliwiającą import do mitochondriów.
Pierwsze udane doświadczenie dotyczące relokalizacji genu z mitochondrium do
jądra dotyczyło genu maturazy kodowanego przez czwarty intron genu cytb (Banroques i
wsp., 1986). Za transport do mitochondrium odpowiadała presekwencja mitochondrialnego
genu atp9 N. crassa. Produkt ekspresji rekodowanego genu był transportowany do
mitochondriów i wykazywał w nich pełną aktywność biologiczną, komplementując różne
mutacje w mitochondrialnej kopii genu maturazy (Banroques i wsp., 1987).
Podobnie sukcesem zakończyła się relokalizacja genów atp8 i atp9, tego ostatniego w
postaci genu syntetycznego (Farrell i wsp., 1988). Relokowane geny ulegały ekspresji a ich
produkty, po imporcie do mitochondrium posiadały właściwą aktywność biologiczną (Law i
wsp., 1988; Nagley i wsp., 1988). Badania te wykazały też kluczowe znaczenie prawidłowej
obróbki proteolitycznej importowanego białka (Law i wsp., 1988) i wykazały, że możliwe
jest w przypadku genu relokowanego do jądra włączenie jego produktu do złożonego,
zakotwiczonego w błonie kompleksu.
Innym przykładem udanej relokalizacji genu z mitochondrium do jądra była ekspresja
rekodowanego genu var1 (Sanchirico i wsp., 1995). W tym przypadku miało to szczególne
znaczenie, gdyż mutacje w genie var1 prowadzą zwykle do utraty stabilności DNA
mitochondrialnego, podobnie jak i inne defekty związane z translacją (Myers i wsp., 1985).
Relokalizacja genu var1 stwarza zatem nowe możliwości badania jego funkcji.
Rozdział 3.1. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wstęp
89
Dołączenie odpowiedniej presekwencji pozwala też na uzyskanie importu do
mitochondriów drożdży białek pochodzących z innych organizmów. (Pinkham i wsp., 1994)
wykazali, że możliwy jest import do mitochondriów drożdży polimerazy faga T7, kodowanej
przez gen umieszczony na plazmidzie drożdżowym. Produkowane białko jest importowane
do mitochondriów i jest w stanie aktywować w nich transkrypcję sztucznych konstrukcji z
odpowiednim promotorem.
Doświadczenia nad relokalizacją genów w drugą stronę – z jądra do mitochondriów
natrafiają na barierę techniczną, jaką jest skuteczna transformacja mitochondriów. Dopiero
zastosowanie transformacji balistycznej (Johnston i wsp., 1988) pozwoliło na podjęcie takich
prób.
Transformacja balistyczna mitochondriów drożdży szczepu typu 0 (pozbawionego
mtDNA) DNA plazmidowym daje w efekcie stabilne transformanty, w których DNA
plazmidu jest replikowany w postaci reiterowanej, czyli zachowuje się tak samo, jak DNA
naturalnego szczepu – (Fox i wsp., 1988). Tak stworzone szczepy syntetycznych –
zachowują się w krzyżówkach podobnie do naturalnych –. Umieszczenie na wprowadzanym
plazmidzie sekwencji genu mitochondrialnego pozwala na jego ekspresję i komplementację
defektu w tym genie zarówno przez rekombinację, jak i in trans w układzie
heteroplazmatycznym (Fox i wsp., 1988). Rekombinacja możliwa jest tylko wówczas, gdy
między syntetycznym – a mtDNA biorcy istnieją obszary homologii, w przeciwnym
wypadku możliwa jest tylko komplementacja in trans, przy czym układy heteroplazmatyczne
wykazują niestabilność mitotyczną.
Doświadczenia te utworzyły drogę do badania genów mitochondrialnych metodą
mutagenezy ukierunkowanej. Badano w ten sposób między innymi biologię intronów
mitochondrialnych i kodowanych przez nie białek (Szczepanek i Lazowska, 1996; Peebles i
wsp., 1993; Henke i wsp., 1995), translację (Mulero i Fox, 1994; Folley i Fox, 1991) oraz
funkcję nie podlegających translacji odcinków 5’ transkryptu (Wiesenberger i wsp., 1995;
Costanzo i Fox, 1993; Mulero i Fox, 1993).
Utworzenie syntetycznego – z wprowadzonym do mitochondriów jądrowym genem
URA3 daje stabilne transformanty, lecz nie zachodzi, zgodnie z przewidywaniami ekspresja
wprowadzonego genu (Thorsness i Fox, 1990). Również wprowadzenie, drogą rekombinacji,
genu jądrowego (w tym przypadku TRP1) do funkcjonalnego genomu mitochondrialnego
typu + nie wystarcza dla uzyskania jego ekspresji (Thorsness i Fox, 1993). W obu układach
stwierdzono jednak zachodzącą z zaskakująco wysoką częstością (od 210-5 na komórkę i
Rozdział 3.1. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wstęp
90
pokolenie) migrację DNA z mitochondriów do jądra (Thorsness i Fox, 1990, 1993;
Thorsness i wsp., 1993). Zjawisko naturalnej migracji DNA z mitochondriów do jądra
musiało odgrywać znacząca rolę w ewolucji tych organelli. Posługując się tym układem
doświadczalnym (Thorsness i wsp., 1993; Thorsness i Fox, 1993) stwierdzili, że na częstość
migracji DNA z mitochondriów do jądra wpływać mogą mutacje w kilku genach jądrowych,
nazwanych YME (Yeast Mitochondrial Escape).
Jedynym jak dotąd układem, w którym rekodowany gen jądrowy ulega ekspresji w
mitochondriach przy udziale mitochondrialnego systemu genetycznego przedstawiony został
przez (Fox, 1996; Steele i wsp., 1996). W układzie tym rekodowana z uwzględnieniem
mitochondrialnego kodu genetycznego sekwencja genu ARG8, nazwana ARG8m
wprowadzana jest w miejsce genu cox3. Taki konstrukt ulega w mitochondriach ekspresji i
komplementuje delecję jądrowej kopii genu ARG8. Gen ARG8m został wykorzystany
zasadniczo jako gen reporterowy dla badania znaczenia nie podlegających translacji
sekwencji transkryptu i ich interakcji z regulującymi translację białkami (Steele i wsp., 1996;
He i Fox, 1997).
W żadnym z dotychczas przeprowadzonych doświadczeń nad relokalizacją genów
jądrowych do mitochondriów nie wykazano jednak możliwości ekspresji w genomie
mitochondrialnym genu, którego produkt związany byłby z podstawową funkcją tego
organellum, czyli procesami utleniania biologicznego. W procesach tych biorą udział
kompleksy białkowe, których produkty kodowane są zarówno przez genom jądrowy, jak i
mitochondrialny. Biogeneza tych kompleksów jest więc efektem subtelnego współdziałania
obu systemów genetycznych. Możliwość relokalizacji jednego z takich genów z jądra do
mitochondrium otworzyłaby nowe możliwości badania tych procesów, a także mogłaby
rzucić światło na ewolucyjną historię oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych. Taki zamiar
przyświecał doświadczeniom opisanym szczegółowo w kolejnych rozdziałach.
3.1.3. Wybór relokalizowanego genu – gen RIP1 Saccharomyces cerevisiae
Zasadniczą funkcją metaboliczną mitochondrium jest proces utleniania biologicznego
– łańcuch reakcji przenoszących elektrony z NADH i FADH2 na tlen za pośrednictwem
szeregu przenośników elektronów (patrz Hatefi, 1985). W wyniku tego procesu wytwarzany
jest gradient protonowy na wewnętrznej błonie mitochondrium i zachodzi synteza ATP.
Jednym z kompleksów białkowych wchodzących w skład łańcucha oddechowego jest
kompleks oksydoreduktazy ubichinon-cytochrom c, znany również pod nazwą kompleksu
Rozdział 3.1. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wstęp
91
cytochromów bc1. Jest to najbardziej uniwersalny ze wszystkich kompleksów przenoszących
elektrony i został wyizolowany z różnych organizmów i tkanek eukariotycznych, a także z
bakterii purpurowych i denitryfikacyjnych. Jednym z jego składników jest apocytochrom b,
kodowany u większości znanych organizmów przez gen cytb znajdujący się w DNA
mitochondrialnym. Podobny kompleks cytochromów b6f
uczestniczy w transporcie
elektronów w procesie fotosyntezy roślin i sinic. Kompleksy bc1 różnych organizmów różnią
się składem podjednostek, wszystkie jednak zawierają cztery grupy prostetyczne: dwie
cząsteczki hemu typu b, jedną typu c i jedną grupę 2Fe-2S (Hatefi, 1985). Uczestniczą one w
przenoszeniu elektronów z hydrochinonu na cytochrom c. Grupa 2Fe-2S zawarta jest w
białko znanym jako białko Rieske’go (Rieske i wsp., 1964). Białko to jest niezbędne do
przenoszenia elektronów z ubichinonu na cytochrom c (Trumpower i Edwards, 1979).
Geny kodujące białko Rieske’go i podobne białka sklonowano z wielu różnych
organizmów: Neurospora crassa (Harnisch i wsp., 1985), S. cerevisiae (Beckmann i wsp.,
1987), Schizosaccharomyces pombe (di Rago i wsp., 1996), szczura (Nishikimi i wsp.,
1989), Rhodobacter capsulatus (Gabellini i wsp., 1985), Paracoccus denitrificans
(Kurowski i Ludwig, 1987), Nostoc muscorum (Kallas i wsp., 1988) i chloroplastów
szpinaku (Steppuhn i wsp., 1987). Dodatkowo wyznaczono sekwencję aminokwasową białka
wyizolowanego z serca bydlęcego (Schagger i wsp., 1987). Porównanie sekwencji
aminokwasowych (Beckmann i wsp., 1989) wykazuje, że sekwencja tego białka jest bardzo
silnie konserwowana w ewolucji, położone w pobliżu C-końca domeny przypuszczalnie
odpowiadające za wiązanie ligandu 2Fe-2S wykazują 100% identyczności aminokwasowej.
U drożdży S. cerevisiae białko Rieske’go kodowane jest przez gen nazwany RIP1
(Beckmann i wsp., 1987) w postaci prekursora o długości 215 aminokwasów. Po odcięciu Nkońcowej sekwencji sygnałowej powstaje dojrzałe białko o długości 185 aminokwasów.
Gen RIP1 kodujący u drożdży białko Rieske’go wydaje się być idealnym
kandydatem do doświadczeń nad relokalizacją genu do mitochondrium z kilku powodów. Po
pierwsze, koduje on białko o podstawowej dla funkcjonowania łańcucha oddechowego
funkcji. Białko to wchodzi w skład kompleksu bc1, w którego skład wchodzą zarówno
produkty genów jądrowych, jak i mitochondrialnego genu cytb. Jest to zatem dobry układ do
badania
współdziałania
genomu
jądrowego
i
mitochondrialnego
w
biogenezie
mitochondrium. Białko to jest powszechnie występującym elementem łańcucha transportu
elektronów, uzyskane wyniki mają zatem charakter uniwersalny. Ponadto, sekwencja tego
białka jest bardzo silnie zachowywana w ewolucji. Gen RIP1 jest stosunkowo nieduży, co
ułatwia manipulację i konstrukcję odpowiednich systemów ekspresji. Ponadto w jego
Rozdział 3.1. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wstęp
92
sekwencji znajduje się niewiele kodonów, których znaczenie zmienione jest w wyniku różnic
pomiędzy mitochondrialnym a jądrowym kodem genetycznym. Część z tych kodonów
koduje aminokwasy, które nie są zachowane w sekwencji białek różnych organizmów, co
wobec ogólnie wysokiego stopnia zachowania całej sekwencji sugeruje, że nie są one
krytyczne dla funkcji białka. Wysiłek związany z dostosowaniem sekwencji genu RIP1 do
mitochondrialnego kodu genetycznego jest zatem stosunkowo nieduży. Funkcja białka rip1 u
drożdży objawia się w postaci łatwego do selekcji fenotypu. Szczepy pozbawione genu RIP1
przez dysrupcję (Beckmann i wsp., 1989) wykazują zupełną niewydolność oddechową
(objawiającą się brakiem wzrostu na niefermentowalnych źródłach węgla), przy czym nie
ulega w nich zaburzeniu stabilność DNA mitochondrialnego.
Wszystkie te czynniki zadecydowały o tym, że w opisanym w dalszej części
projekcie badawczym postanowiono dokonać relokalizacji genu RIP1 z jądra do
mitochondrium i zbadać, czy możliwa jest synteza funkcjonalnego białka rip1 z genu
znajdującego się w mtDNA.
Niezbędnym dla osiągnięcia tak postawionego celu elementem była możliwość
wprowadzania obcego DNA do mitochondriów drożdży. W następnym rozdziale omówiona
zostanie zatem pokrótce technika umożliwiająca takie manipulacje. Szczegóły procedur
eksperymentalnych podane są w rozdziale „Materiały i metody”.
3.1.4. Transformacja balistyczna mitochondriów drożdżowych – technika i
strategia
Transformacja komórek bakteryjnych, drożdżowych zwierzęcych i roślinnych jest od
dawna stosowaną w biologii molekularnej techniką i stanowi podstawę wielu strategii
doświadczalnych. Do końca lat osiemdziesiątych nie istniały jednak techniki pozwalające na
transformację organelli komórkowych takich, jak chloroplasty i mitochondria. Klasyczne
techniki transformacji nigdy nie doprowadziły do wprowadzenia DNA do organelli, głównie
ze względu na to, że ich otoczka jest nieprzepuszczalna dla większych cząsteczek kwasów
nukleinowych. Dopiero zastosowanie techniki balistycznej, polegającej na bombardowaniu
komórek metalowymi cząstkami o rozmiarach rzędu mikrometra, a zastosowanej po raz
pierwszy do transformacji komórek roślinnych (Klein i wsp., 1987) pozwoliło na
wprowadzenie DNA do mitochondriów S. cerevisiae (Johnston i wsp., 1988) i chloroplastów
Chlamydomonas reinhardtii (Boynton i wsp., 1988).
Skuteczna transformacja każdego badanego organizmu czy organellum wymaga
rozwiązania dwóch odrębnych problemów. Pierwszym jest dostarczenie wprowadzanego
Rozdział 3.1. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wstęp
93
DNA do wnętrza komórki lub odpowiedniego jej kompartmentu. Drugim jest oddzielenie
tych komórek które uległy transformacji od komórek niestransformowanych.
Wprowadzenie DNA do mitochondrium możliwe jest przy zastosowaniu techniki
balistycznej. Kulki złote lub wolframowe o średnicy nie przekraczającej 1 m opłaszczane są
DNA i wystrzeliwane z dużą prędkością w kierunku rosnących na podłoży stałym komórek.
W pierwszych urządzeniach służących do transformacji balistycznej (Klein i wsp., 1987)
prędkość wystrzeliwanym kulkom nadawał wybuch ładunku prochowego, podobnie jak w
typowej broni palnej. Nie dawało to jednak powtarzalnych wyników (Butow i Fox, 1990)
zapewne ze względu na zanieczyszczenia generowane przez spalanie prochu. W obecnie
stosowanych urządzeniach odpowiednia prędkość uzyskiwana jest za pomocą fali
uderzeniowej gwałtownie rozprężanego helu w warunkach obniżonego ciśnienia (Johnston,
1990). W opisanych w dalszej części pracy doświadczeniach wykorzystano dostępny w
handlu aparat tego typu wyprodukowany przez firmę BioRad. Na marginesie można dodać,
że transformacja chloroplastów Chlamydomonas, ze względu na ich większe rozmiary jest
znacznie łatwiejsza – wystarcza wytrząsanie protoplastów z kulkami szklanymi w obecności
DNA (Butow i Fox, 1990).
Strategia selekcji transformantów mitochondrialnych opiera się na fakcie, że
wprowadzane do mitochondriów plazmidy zachowują się tak, jak genomy mitochondrialne
typu –. Wykorzystuje się tu zdolność takich syntetycznych – do komplementacji (w drodze
krzyżówki genetycznej) defektu w DNA mitochondrialnym szczepu testowego (Fox i wsp.,
1988). Schemat strategii selekcji transformantów mitochondrialnych przedstawiono na
rysunku 3.1.
Rysunek 3.1. Schemat strategii transformacji balistycznej mitochondriów S. cerevisiae i selekcji transformantów przy
użyciu markera jądrowego URA3 i markera mitochondrialnego cox2. Szczegóły w tekście. MM oznacza podłoże
minimalne, CM – podłoże kompletne.
DNA przewidziany do wprowadzenia do mitochondriów umieszcza się w wektorze
pJM2 (Mulero i Fox, 1993), który został skonstruowany przez wprowadzenie do
standardowego bakteryjnego wektora pTZ18 sekwencji mitochondrialnego genu cox2. Kulki
złota opłaszcza się mieszaniną dwóch plazmidów: plazmidu mitochondrialnego stworzonego
na bazie wektora pJM2, skrótowo określanego pMIT, oraz standardowego wektora
bakteryjno-drożdżowego YEp352, zawierającego marker URA3 oraz sekwencję startu
replikacji z drożdżowego plazmidu 2.
Rozdział 3.1. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wstęp
94
Taką mieszaniną plazmidów bombarduje się szczep 0, niosący w genotypie
jądrowym delecję genu URA3. Pierwszy etap selekcji prowadzi się na podłożu minimalnym
pozbawionym uracylu. Do podłoża transformacyjnego dodaje się również sorbitol, gdyż
transformanty w pierwszej fazie wzrostu są bardzo wrażliwe osmotycznie. Selekcji w tym
etapie podlegają komórki które zostały trafione opłaszczonymi DNA kulkami (transformacja
jądrowa zachodzi wówczas ze znaczną wydajnością) i przeżyły.
W następnym etapie dokonuje się selekcji transformantów mitochondrialnych.
Kolonie wyselekcjonowane w pierwszym etapie krzyżuje się metodą repliki ze szczepem
testowym TF145 (Fox i wsp., 1988), którego genom mitochondrialny, typu +, niesie
częściową delecję genu cox2. Jeżeli w szczepie transformanta w mitochondriach znajduje się
plazmid pMIT, wówczas zawarta w wektorze pJM2 sekwencja cox2 komplementuje defekt
szczepu TF145 i uzyskany diploid odzyskuje zdolność oddechową, rozpoznawaną w teście
wzrostu na niefermentowalnym źródle węgla. W ten sposób identyfikuje się transformanta
niosącego w mitochondriach konstrukt pMIT. Tak uzyskane syntetyczne – są z reguły
stabilne mitotycznie, możliwe jest zatem ich utrzymywanie i zastosowanie w dalszych
etapach eksperymentu. Jeżeli zachodzi taka potrzeba, możliwe jest „zgubienie”
kotransformującego plazmidu YEp351 przez pasaże w podłożu zawierającym uracyl, gdyż
stabilność mitotyczna plazmidów opartych na sekwencji 2 przy braku selekcji jest
stosunkowo niska. Aby uzyskać transformanty mitochondrialne należy z reguły przeszukać
do 1000 transformantów jądrowych, ilość taką uzyskuje się zwykle z kilkunastu
transformowanych szalek szczepu biorcy.
Przedstawiona powyżej strategia jest uniwersalną metoda pozwalającą na
wprowadzanie do mitochondriów dowolnych fragmentów DNA i utrzymywanie ich w
postaci syntetycznych szczepów –. Odrębnym problemem jest późniejsze ewentualne
wprowadzenie obcego DNA do genomu typu +. Ogólnie dokonuje się tego przez
krzyżowanie, szczegółowe strategie zależą tu od planu konkretnego eksperymentu.
Rozdział 3.1. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wstęp
95
3.1.5. Założenia i cele projektu – podsumowanie
Przedstawiony w dalszej części projekt doświadczalny zakładał:
stworzenie konstruktu umożliwiającego ekspresję genu RIP1 S. cerevisiae w
mitochondriach
wprowadzenie konstruktu do mitochondriów metoda transformacji balistycznej
testy umożliwiające wykrycie, czy wprowadzony gen funkcjonuje prawidłowo i jest w
stanie komplementować delecję genu RIP1 w jądrze
uzyskanie genomu mitochondrialnego typu +, w którym konstrukt ekspresyjny byłby
wintegrowany w wybrany obszar mtDNA
Powodzenie eksperymentu oznaczałoby stworzenie pierwszego układu, w którym gen
kodujący jeden z elementów łańcucha oddechowego zostałby zrelokalizowany z jądra do
mitochondriów, odwracając niejako proces redukcyjnej ewolucji genomu mitochondrialnego.
Otworzyłoby też to drogę do konstrukcji rożnych układów doświadczalnych pozwalających
na badanie współdziałania genomu jądrowego i mitochondrialnego w biogenezie
podstawowych kompleksów enzymatycznych mitochondrium. Pozwoliłoby też wreszcie na
odtwarzanie w systemie drożdżowym specyficznego składu genowego mitochondriów
innych organizmów.
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
96
Rysunek 3.2. Konstrukcja użytych do ekspresji genu RIP1 w mitochondriach plazmidów pYPG09 i pYPG10. Szcegóły
w tekście. Sekwencje wektorów pominięto, fragmenty polilinkerów zaznaczono cienką linią. Skróty nazw enzymów: E
- EcoRI, B - BamHI, N - NdeI, X - XbaI, H - HindIII. Zaznaczono jedynie miejsca restrykcyjne istotne dla procedury. W
etapach mutagenezy ukierunkowanej wstawkę przenoszono do wektora fagowego M13mp18 lub M13mp19, co na
rysunku pominięto.
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
97
3.2. Wyniki
3.2.1. Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych dla wyrażania genu RIP1 w
mitochondriach S. cerevisiae
Relokalizacja genu z jądra do mitochondriów stawia dwa zasadnicze problemy.
Pierwszym jest zapewnienie sekwencji niezbędnych do ekspresji tego genu w systemie
mitochondrialnym. istotny jest tu nie tylko promotor, który w mitochondriach drożdży ma
dosyć prostą formę, lecz także, przede wszystkim, nie podlegające translacji obszary
transkryptu, w których znajdują się sekwencje niezbędne dla prawidłowej ekspresji. Dotyczy
to zarówno obszarów po stronie 5’ (Dunstan i wsp., 1997; Green-Willms i wsp., 1998;
Wiesenberger i wsp., 1995), jak i 3’ (Hofmann i wsp., 1993; Osinga i wsp., 1984).
Najpewniejszym sposobem zapewnienia obecności wszystkich niezbędnych sekwencji jest
otoczenie relokalizowanej jądrowej ramki odczytu kompletnymi sekwencjami otaczającymi
pochodzącymi z aktywnego genu mitochondrialnego. Istotą takiej konstrukcji jest więc
Rysunek 3.3. Uproszczony schemat konstrukcji szczepów S. cerevisiae niosących w mitochondriach syntetyczne
genomy – plazmidów pYPG09 i pYPG10. Technikę cytodukcji omówiono w rozdziale „Materiały i metody”. Genotyp
mitochondrialny każdego szczepu podano w nawiasach kwadratowych. Kolorem czerwonym wyróżniono szczepy
niosące plazmid mitochondrialny pYPG09, niebieskim – pYPG10. Selekcja przez krzyżówki (metodą replik) ze
szczepami TF145 i CKTF145 opierała się na komplementacji delecji genu cox2 w tych szczepach przez gen cox2 z
wektora pJM2, na którym oparto plazmidy pYPG09 i pYPG10.
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
98
Rysunek 3.4. Schemat strategii testowania aktywności mitochondrialnej kopii genu RIP1 (RIP1m) przez krzyżowanie
dwóch szczepów haploidalnych niosących zinaktywowany allel genu RIP1 w jądrze (rip1::LEU2). Jeden ze szczepów
niesie w mitochondriach syntetyczny genom – z konstruktem zawierającym rekodowany i relokalizowany gen RIP1,
drugi – funkcjonalny genom +. Oba haploidy są niewydolne oddechowo. Uzyskany diploid jest wydolny oddechowo
tylko wtedy, gdy ekspresji ulega mitochondrialny gen RIP1m produkując funkcjonalne białko rip1p w stopniu
wystarczającym do prawidłowego funkcjonowania ła¼cucha oddechowego. Szczep diploidalny może pozostawać
heteroplazmatyczny (jak na rysunku), lub może dojść do rekombinacji między istniejącymi w nim cząsteczkami
mtDNA.
„zamiana” ramki odczytu genu mitochondrialnego na ramkę odczytu genu jądrowego przy
zachowaniu nietkniętych sekwencji otaczających.
Drugim problemem jest skompensowanie różnic w kodzie genetycznym między
aparatem translacyjnym cytoplazmy i mitochondriów. W przypadku genów drożdżowych
problem ten dotyczy dwóch aminokwasów: izoleucyny (kodon AUA w mitochondriach
kodujący metioninę) oraz leucyny (kodony CUN w mitochondriach kodujące treoninę) oraz
kodonu stop UGA (w mitochondriach – tryptofan).
Analiza sekwencji genu RIP1 wykazuje, że problem kodu genetycznego dotyczy
pięciu spośród 216 kodonów. W pozycji 4 izoleucyna byłaby odczytana jako metionina, zaś
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
99
leucyny w pozycjach 22, 28, 65 i 156 jako treoniny. Dodatkowo kodonem stop genu RIP1
jest UAG, podczas gdy w typowych genach mitochondrialnych ramki odczytu kończą się
kodonami UAA. Leucyny L22 i L28 wchodzą jednak w skład N-końcowej presekwencji,
która jest odcinana, nie stanowiąc przy tym części sekwencji rozpoznawanej przez proteazę
(Nett i wsp., 1997). Można zatem przypuszczać, że nie są one krytyczne dla funkcji białka.
Leucyny L65 i L156 znajdują się w obszarach sekwencji białka, które nie podlegają ścisłej
konserwacji w ewolucji. W pozycji odpowiadającej L65 w białku rip1 Paracoccus
denitrificans znajduje się treonina (Beckmann i wsp., 1989), można więc przypuszczać, że
zmiana na treoninę w pozycji 65 białka drożdżowego nie wpłynie istotnie na jego funkcje.
Mniej oczywiste jest to w przypadku leucyny L156, nie jest to jednak pozycja bezwzględnie
konserwowana w ewolucji (Beckmann i wsp., 1989). Można więc założyć, że dla
prawidłowej ekspresji genu RIP1 wystarczy zamienić w czwartym kodonie ATA na ATT by
zachować izoleucynę (wstawienie tu metioniny mogłoby zaburzyć biochemiczne
właściwości presekwencji) oraz kodon stop z TAG na TAA.
Miejsca obu tych niezbędnych zmian znajdują się bezpośrednio przy końcach
sekwencji ORF genu RIP1. Na końcach ORF należy jeszcze wprowadzić dodatkowo jedną
istotną modyfikację – dodać miejsca restrykcyjne niezbędne do dokładnego wycinania i
wstawiania sekwencji podczas konstrukcji.
Wszystkie te wymagania spełnia plazmid pYGT37 (skonstruowany przez dr GuoLiang Tiana z CGM w Gif-sur-Yvette). Plazmid ten skonstruowano wstawiając w wektor
pUC13 syntetyczne oligonukleotydy odpowiadające 14 pierwszym (do miejsca Sau3A) i 32
końcowym (od miejsca EcoRI ) nukleotydom genu RIP1. W 12 pozycji zamieniono A na T
kompensując różnice w kodzie genetycznym dla izoleucyny I4. Dodatkowo na 5’ końcu
umieszczone zostało miejsce restrykcyjne NdeI, zachodzące na pierwszy kodon ramki
odczytu (CATATG). Na 3’ końcu ramki odczytu skorygowano kodon stop na TAA i
wstawiono miejsce restrykcyjne XbaI. Do tak utworzonego wektora wstawiono wycięty
enzymami Sau3A i EcoRI fragment ORF genu RIP1. Odtworzono w ten sposób pełną
sekwencję otwartej ramki odczytu genu RIP1 wstawiając na końcach stosowne miejsca
restrykcyjne i korygując czwarty i ostatni kodon zgodnie z wymogami translacji
mitochondrialnej. Uproszczoną mapę wstawki plazmidu pYGT37 przedstawiono na rysunku
3.2 w ramce.
Sekwencje otaczające otwartą ramkę odczytu w przedstawionych konstrukcjach
pochodzą z mitochondrialnego genu cox1, schemat konstrukcji przedstawiono na rysunku
3.2. Fragment 5’ genu cox1 wraz z około 970 pz sekwencji poprzedzającej, obejmującej też
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
100
promotor genu (Séraphin i wsp., 1989b) pochodził z plazmidu pYGT21, którego wstawka
pochodzi z DNA mitochondrialnego szczepu bezintronowego i obejmuje obszar od miejsca
HpaII (około 970 pz przed początkiem ramki odczytu) do miejsca EcoRI (w szóstym
egzonie). Sekwencję 3’ genu cox1 i obszaru międzygenowego, aż do genu atp8 uzyskano z
plazmidu pYGT46’. Fragment EcoRI plazmidu pYGT46’ wklonowano w miejsce EcoRI
pYGT21 uzyskując konstrukt pYPG01 zawierający zarówno fragment 5’, jak i 3’ genu cox1
wraz z sekwencjami otaczającymi.
Z plazmidu pYPG01 usunięto miejsce XbaI przez trawienie tym enzymem,
wypełnienie końców fragmentem Klenowa i ponowną recyrkularyzację przez ligację.
Uzyskany plazmid nazwano pYPG03. Wstawkę tego plazmidu podano mutagenezie przy
użyciu oligonukleotydów p169 i p170. Dokładny opis procedury mutagenezy podano w
„Materiałach i metodach”. Wprowadzone mutacje tworzą na początku ramki odczytu cox1
miejsce NdeI, zaś na końcu miejsce XbaI. Uzyskany drogą mutagenezy plazmid nazwano
pYPG04.
Fragment HindIII –XbaI z pYPG04 przeklonowano następnie do wektora pYPG02
powstałego w wyniku usunięcia opisaną powyżej metodą miejsca NdeI z plazmidu pUC13.
Uzyskany konstrukt nazwano pYPG05. Następnie zastąpiono w tym plazmidzie fragment
NdeI–XbaI fragmentem wyciętym przy użyciu tych samych enzymów z plazmidu pYGT37
zawierającym ORF genu RIP1. uzyskany plazmid nazwano pYPG06. Fragment zawierający
sekwencję flankującą ze strony 3’ genu cox1 wprowadzono do tego plazmidu wklonowując
fragment XbaI–BamHI z plazmidu pYPG04. Uzyskany plazmid zawierający gen RIP1 z
sekwencjami otaczającymi 5’ i 3’ genu cox1 nazwano pYPG07.
Następnie skorygowano zmiany wprowadzone na początku i końcu ramki odczytu
genu RIP1 w celu uzyskania miejsc restrykcyjnych NdeI i XbaI przez mutagenezę
ukierunkowaną przy użyciu oligonukleotydów p171 i p168. Uzyskano w ten sposób plazmid
pYPG08, w którym sekwencje przed kodonem start (ATG) i za kodonem stop (TAA)
powróciły do formy występującej w dzikim genie cox1.
Wstawkę z plazmidu pYPG08 przeklonowano następnie do wektora pJM2 (patrz
rozdział 3.1.4) zawierającego mitochondrialny marker cox2. Uzyskany plazmid nazwano
pYPG09. Taki plazmid może już być użyty do transformacji mitochondriów.
Konstrukcja plazmidu pYPG09 może pozwalać na ekspresję genu RIP1 w mitochondriach,
gdyż zawiera on niezbędne sekwencje sygnałowe zarówno po stronie 5’ (promotor i nie
podlegający translacji odcinek liderowy) oraz 3’ (aż do kolejnego genu atp8). Jest jednak
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
101
mało prawdopodobne, aby możliwe było uzyskanie z jego pomocą mitochondrialnego
genomu + zawierającego gen RIP1 przez rekombinację homologiczną. W celu ułatwienia
rekombinacji homologicznej konstruktu w odcinku międzygenowym pomiędzy genami cox1
i atp8 do plazmidu pYPG09 wstawiono na początku wstawki namnożony PCR fragment
ostatniego egzonu i sekwencji flankującej genu cox1 Saccharomyces douglasii. Sekwencja
egzonowa jest bardzo silnie konserwowana pomiędzy S. cerevisiae a S. douglasii, natomiast
w sekwencji flankującej występują pewne różnice (Tian i wsp., 1993). Tak przygotowana
wstawka może przez rekombinację homologiczną wintegrować się tuż za ostatnim egzonem
cox1 przez genem atp8 (patrz też rozdział 3.3.4). Uzyskany plazmid nazwano pYPG10.
3.2.2. Transformacja balistyczna i selekcja syntetycznych –
DNA plazmidów pYPG09 i pYPG10 oraz DNA używanego do kontransformacji
jądrowego plazmidu YEp352 osadzono na kulkach złota i transformowano tak
przygotowanymi mikropociskami drożdże szczepu 0 W303-1B/A/50 (Bonnefoy i wsp.,
1994). W pierwszym etapie selekcjonowano transformanty jądrowe o fenotypie URA+,
wyselekcjonowane transformanty krzyżowano następnie metodą replik ze szczepem TF145
(Fox i wsp., 1988) (patrz też rysunek 3.1 w poprzednim rozdziale). Wzrost diploida z takiej
krzyżówki świadczy o obecności w szczepie transformanta plazmidu mitochondrialnego
zawierającego marker cox2. Zidentyfikowane szczepy transformantów (– syntetycznych)
oczyszczano następnie przez subklonowanie, usuwając z nich przy tym jądrowy plazmid
Rysunek 3.5. Komplementacja delecji genu RIP1 w jądrze przez konstrukt mitochondrialny pYPG09 – szczep CKPG30
(A) oraz pYPG10 – szczep CKPG31 (B). Na zdjęciu przedstawiono wzrost na podłożu selekcyjnym (glicerol) diploidów z
krzyżówki szczepu CKPG30 (A) lub CKPG31 (B) z wymienionymi szczepami +. Krzyżówka ze szczepem TF145 jest
kontrolą obecności genomu syntetycznego -.
YEp352.
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
102
Uzyskano w ten sposób szczepy syntetycznych – zawierające w mitochondriach
plazmid pYPG09 – szczep nazwano TST19, oraz pYPG10 – szczep TST23. Następnym
krokiem było przeprowadzenie genomów mitochondrialnych uzyskanych syntetycznych –
do kontekstu jądrowego szczepu niosącego delecję jądrowego genu RIP1. Dokonano tego w
dwóch kolejnych etapach posługując się metodą cytodukcji. Schemat przeprowadzonych
krzyżówek przedstawiono na rysunku 3.3. DNA mitochondrialny szczepów TST19 i TST23
przeniesiono do jądra szczepu CK50A/1/50, o znaku MAT niosącego mutację Kar1-1.
Selekcji cytoduktantów dokonano przez krzyżówkę (metodą replik) ze szczepem CKTF145
niosącym pozbawione genu cox2 mitochondria ze szczepu TF145 w jądrze o znaku MATa
(genotypy wszystkich szczepów podano w rozdziale „Materiały i metody”).
Następnie przez analogiczną cytodukcję przeniesiono DNA mitochondrialny
(syntetyczny –) do jądra szczepu JPJ1/51, niosącego delecję genu RIP1 w jądrze. Uzyskano
w ten sposób szczepy CKPG30 i CKPG31 potrzebne do badania komplementacji delecji
genu RIP1 w jądrze przez ekspresję konstruktu mitochondrialnego niosącego zrekodowaną
kopię tego genu.
3.2.3. Komplementacja dysrupcji genu RIP1 w jądrze przez gen relokalizowany do
mitochondriów
Sprawdzenie zdolności mitochondrialnej kopii rekodowanego genu RIP1 do
komplementacji delecji kopii jądrowej jest najprostszym i najpełniejszym fizjologicznym
testem zdolności tego genu do ulegania ekspresji. Testowany szczep musi jednak, poza
konstruktem syntetycznego – zawierać w swych mitochondriach również funkcjonalny
genom mitochondrialny typu +. Najprostszą drogą do przeprowadzenia takiego testu jest
zatem skonstruowanie szczepu diploidalnego, homozygotycznego pod względem delecji
genu RIP1 w jądrze, zawierającego zarówno mtDNA syntetycznego – jak i normalny
genom + (rysunek 3.4).
Dla potrzeb tego testu skonstruowano serię szczepów niosących w genomie
jądrowym delecję genu RIP1 (wykorzystano jądro szczepu RGLT1 niosącego delecję genu
RIP1 w kontekście szczepu W303 a uzyskanego drogą krzyżowania ze szczepu JPJ1
(Beckmann i wsp., 1989) – patrz też „Materiały i metody”). Genotypy użytych szczepów
przedstawiono w tabeli 3.1. Wykorzystano różne formy DNA mitochondrialnego pochodzące
z różnych szczepów S. cerevisiae a także z S. douglasii i S. capensis.
nazwa
genotyp jądrowy
genotyp mitochondrialny
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
RGLT1
RPG1
RPG2
RPG3
RJL1
RJL2
RJL3
RJL5
RJL6
CGL101
1
MATa, ade2, ura3, his3, trp1, rip1::LEU2
MATa, ade2, ura3, his3, trp1, rip1::LEU2
MATa, ade2, ura3, his3, trp1, rip1::LEU2
MATa, ade2, ura3, his3, trp1, rip1::LEU2
MATa, ade2, ura3, his3, trp1, rip1::LEU2
MATa, ade2, ura3, his3, trp1, rip1::LEU2
MATa, ade2, ura3, his3, trp1, rip1::LEU2
MATa, ade2, ura3, his3, trp1, rip1::LEU2
MATa, ade2, ura3, his3, trp1, rip1::LEU2
MATa, ade2, ura3, his3, trp1, rip1::LEU2
103
+ , (13i), 777-3A
+ (8i), D273-10B
+, S. capensis
+, (13i), 777-3A
+ (ai1)1
+ (ai2)1
+ (5bi)2
+, S. douglasii, KS158
+, (13i), KL14-4A
+ (i)
genom bezintronowy posiadający wyłącznie intron podany w nawiasie
Rysunek 3.6. Pojawianie się kolonii wydolnych oddechowo diploidów DR3 po skrzyżowaniu szczepu CKPG30
(konstrukt pYPG09) ze szczepem RGLT1 (mitochondria 777-3A) bezpośrednio na podłożu selekcyjnym N3
zawierającym glicerol jako Ÿródło węgla. Ta sama kropla krzyżówki sfotografowana po 3 i 5 dniach inkubacji.
2
genom zawierający 5 intronów cytb i bezintronowe allele cox1 i LSU-rRNA
Tabela 3.1. Szczepy + niosące delecję genu RIP1 w jądrze użyte w doświadczeniu. W nawiasach podano liczbę
intronów, w przypadku szczepów o małej liczbie intronów, wymieniono introny obecne. Podano również nazwę
szczepu, od którego wywodzi się dany genom mitochondrialny. Mitochondria S. douglasii KS158 nie zawierają
pierwszego intronu genu cox1, nie podlegającego prawidłowej obróbce u S. cerevisiae (Herbert i wsp., 1992).
Szczepy RGLT1 i RPG3 są niezależnymi konstrukcjami szczepu o takim samym genotypie, w dalszych badaniach
okazały się równoważne.
Wymienione w tabeli 3.1 szczepy krzyżowano na podłożu zawierającym glukozę
jako źródło węgla ze szczepami syntetycznych – CKPG30 i CKPG31. Po dwóch dniach
przenoszono krzyżowane drożdże na podłoże selekcyjne zawierające glicerol jako jedyne
źródło węgla i obserwowano wzrost. Wyniki przedstawiono na rysunku 3.5.
W przypadku – CKPG30 dla dwóch spośród dziewięciu zbadanych szczepów z
różnymi genomami + uzyskano wzrost diploidów z krzyżówki na podłożu selekcyjnym
(rysunek 3.5 A). Były to szczepy RGLT1 (mitochondria szczepu 777-3A zawierające 13
intronów) oraz RPG1 (mitochondria szczepu D273-10B zawierające 8 intronów), szczep
RPG3, genotypowo identyczny ze szczepem RGLT1 zachowywał się identycznie jak on i w
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
104
dalszych testach był pominięty. Oznacza to, że w obecności tych dwóch genomów + gen
RIP1 relokalizowany do mitochondriów ulega ekspresji w stopniu wystarczającym do
zapewnienia dostatecznej ilości białka rip1p do funkcjonowania kompleksu oksydoreduktazy
ubichinon-cytochrom c. Relokalizowany gen RIP1 może więc w mitochondriach podlegać
prawidłowej ekspresji i dawać funkcjonalny produkt. Ekspresja relokowanego genu zależy
jednak bardzo silnie od kontekstu genomu +. Zależność ta nie wydaje się być związana z
ilością intronów, gdyż w przypadku dwóch dzikich genomów mitochondrialnych S.
cerevisiae – 777-3A (szczep RGLT1) i KL14-4A (szczep RJL6) zawartość intronów jest
identyczna, zaś możliwość ekspresji konstruktu z relokalizowanym genem RIP1 daje jedynie
pierwszy z nich.
Podobny efekt zaobserwowano dla szczepu syntetycznego – CKPG31 niosącego
konstrukt pYPG10. W przypadku tego konstruktu wzrost uzyskanych diploidów na podłożu
z niefermentowalnym źródłem węgla jest nieco szybszy (rysunek 3.5 B), poza tym
komplementację obserwuje się również, chociaż z bardzo małą częstością (pojedyncze
kolonie) dla genomów + S. capensis (szczep RPG2) oraz sporadycznie genomów
zawierających wyłącznie intron ai2 (szczep RJL2) i introny cytb (RJL3). Nadal nie
obserwuje się jakiejkolwiek komplementacji delecji genu RIP1 w jądrze przy obecności
genomów + KL14-4A (RJL6), S. douglasii (RJL5), bezintronowym (CGL101) i
zawierającym jedynie intron ai1 (RJL1). Podobnie jak w przypadku CKPG30 najsilniejszy
efekt komplementacji obserwuje się dla genomu + 777-3A (RGLT1), wydolnych
oddechowo diploidów jest stosunkowo dużo i są widoczne już po około 3 dniach inkubacji.
W przypadku szczepu RPG1 wydolnych oddechowo diploidów jest nieco mniej i pojawiają
się później. W przypadku szczepu RPG2 (+ S. capensis) wzrost diploidów na podłożu
selekcyjnym widoczny jest dopiero po 5-6 dniach inkubacji. Nie jest to jednak efekt
spowolnionego wzrostu, gdyż wyselekcjonowane w ten sposób diploidy w następnym pasażu
na podłożu selekcyjnym rosną już szybciej i są widoczne po 3-4 dniach inkubacji. Można
zatem stwierdzić, że opóźnienie wzrostu w przypadku genomu + S. capensis związane jest
raczej z późniejszym startem, niż ze znacznym spowolnieniem podziałów. Komplementacja
w przypadku genomów + zawierających intron ai2 (RJL2) lub introny cytb (RJL3) zachodzi
sporadycznie (1-2 kolonie w krzyżówce) i widoczna jest jeszcze później, niż w przypadku +
S. capensis.
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
105
W podsumowaniu można stwierdzić, że przeprowadzony eksperyment wykazał, że
relokalizowany do mitochondriów gen RIP1 ulega ekspresji w stopniu wystarczającym, by
komplementować delecję tego genu w jądrze. Możliwość ta zależy jednak silnie od
kontekstu genetycznego genomu mitochondrialnego, przy czym czynnik decydujący nie jest
związany w bezpośredni sposób z obecnością intronów w genach mitochondrialnych.
Częstość i kinetyka komplementacji również zależy od użytego w doświadczeniu genomu
+. Ogólnie można też stwierdzić, że plazmid pYPG10, zawierający dodatkowy fragment z
3’ końca genu cox1 przed 5’ częścią właściwego konstruktu pozwala na silniejszą ekspresję
relokalizowanego genu, niż konstrukt pYPG09.
3.3.4. Badanie stabilności szczepów eksprymujących gen relokalizowany do
mitochondriów
Procesy prowadzące do komplementacji delecji genu RIP1 w jądrze przez kopię
relokalizowaną do mitochondriów w przedstawionym powyżej układzie doświadczalnym są
bardzo złożone. Komplementacja zachodzić może w układzie heteroplazmatycznym, przy
jednoczesnej obecności zarówno genomu – syntetycznego jak i genomu + w
mitochondriach, może też dojść do wbudowania drogą rekombinacji części konstruktu do
genomu +. W celu bliższego zbadania tych zjawisk w przedstawionym tu układzie
przeprowadzono szereg doświadczeń dotyczących kinetyki powstawania szczepów
produkujących prawidłowe białko rip1p przez ekspresję genu w mitochondriach oraz ich
stabilności. Ostatecznym celem było uzyskanie szczepu, w którym relokalizowany gen RIP1
jest stabilnie wbudowany w genom mitochondrialny typu +.
W pierwszej kolejności zbadano kinetykę powstawania i stabilność wydolnego
oddechowo diploidalnego szczepu powstającego przez skrzyżowanie szczepu CKPG30
niosącego konstrukt pYPG09 ze szczepem RGLT1 (+ 777-3A). Szczep taki nazwano DR3.
Oba szczepy rodzicielskie hodowano w podłożu płynnym zawierającym glukozę jako źródło
węgla (są one oczywiście niewydolne oddechowo). Krople tych hodowli mieszano ze sobą
bezpośrednio na stałym podłożu selekcyjnym zawierającym glicerol, jako jedyne źródło
węgla. W ten sposób resztka glukozy zawartej w pożywce płynnej wystarczała dla
podtrzymania wzrostu na tyle długo, aby mogło dojść do wytworzenia diploidów. Wyniki
przedstawiono na rysunku 3.6. Jak widać wykazujące zdolność do wzrostu respiracyjnego
diploidy, w których zachodzić musi ekspresja relokalizowanego do mitochondrium genu
RIP1 powstają stosunkowo rzadko, ich wzrost zaczyna być widoczny po trzech dniach od
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
106
umieszczenia na podłożu. Morfologia rosnących kolonii po kilku dniach jest nieregularna,
wykazują one charakterystyczne ‘postrzępione”, nierówne brzegi. Świadczy to o tym, że
układ zapewniający wzrost respiracyjny jest w nich niestabilny.
Stabilność szczepu DR3 zbadano hodując pobrane z podłoża selekcyjnego szczepy w
podłożach płynnych zawierających glukozę bądź glicerol jako źródła węgla. Następnie
wysiewano drożdże z takich hodowli na podłoże selekcyjne zawierające glicerol i resztkowe
(0,2%) stężenie glukozy. Na takim podłożu wzrastają kolonie szczepów zarówno
oddychających, jak i niewydolnych oddechowo, z tym, że wzrost tych ostatnich ulega bardzo
szybkiemu zatrzymaniu. Porównując wielkość kolonii można zatem bardzo łatwo ocenić
ilość wydolnych oddechowo klonów w badanej hodowli. Zgodnie z przypuszczeniami,
hodowla utrzymywana cały czas w podłożu selekcyjnym (niefermentowalnym) zachowuje
wysoki odsetek komórek wydolnych oddechowo. Ich kolonie mają jednak nierównomierny
kształt, świadczący o niestabilności fenotypu. Hodowla na podłożu nieselektywnym (z
glukozą) powoduje natomiast utratę większości wydolnych oddechowo komórek. Stabilność
fenotypu po pierwszym pasażu na glukozie wyniosła około 5%, pozostałe komórki utraciły
wydolność oddechową. Kolejne pasaże pozwoliły wyselekcjonować klony, w których
stabilność nieco wzrosła, nigdy jednak, mimo wielokrotnych pasaży, nie przekroczyła 30%.
W przypadku szczepu DR3 zawierającego syntetyczny genom – pYPG09 obserwuje
się zatem niestabilność i segregację mitotyczną typową dla układów heteroplazmatycznych.
Jedną z prawidłowości genetyki mitochondrialnej drożdży jest mitotyczna segregacja
mtDNA w układach heteroplazmatycznych (Bolotin i wsp., 1971), której zapobiec może
jedynie utrzymywanie presji selekcyjnej na obecność obu typów mtDNA w komórce. Można
zatem stwierdzić, że konstrukt pYPG09 umożliwia ekspresję genu RIP1 w mitochondriach S.
cerevisiae jedynie w układzie heteroplazmatycznym, gdy w komórce obecny jest mtDNA
syntetycznego – oraz normalny genom +.
W przeciwieństwie do poprzedniej, konstrukcja plazmidu pYPG10 umożliwia
teoretycznie rekombinację z genomem + w obszarze między genami cox1 a atp8. Dalsze
badania nad stabilną ekspresją genu RIP1 w mitochondriach prowadzono zatem przy użyciu
zawierającego jako syntetyczny – ten właśnie plazmid szczepu CKPG31. W pierwszej
kolejności przeprowadzono doświadczenie analogiczne do opisanego powyżej, polegające na
pasażowaniu uzyskanych w wyniku krzyżówki wydolnych oddechowo diploidów w podłożu
zawierającym glukozę i określaniu następnie odsetka pozostałych komórek, które utrzymały
zdolność oddechową. Podobnie jak poprzednio, dla osiągnięcia maksymalnej stabilności
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
107
Rysunek 3.8. Analiza restrykcyjna mtDNA szczepów RR1 I RR2. (A) Uproszczone mapy restrykcyjne wstawki pYPG10,
oraz obszarów końca genu cox1, genów atp8 i atp6 szczepów + 777-3A i S. capensis oraz rekombinantów RR1 i RR2.
Mapa 777-3A na podstawie sekwencji, pozostałe na podstawie wyników mapowania. H oznacza miejsce HaeIII, B BspHI. (B) Obraz elektroforetyczny mtDNA szczepów (1) KM91 (++ 777-3A), (2) RR1, (3) S. capensis, (4) RR2, (5)
CKPG31 ( - pYPG10) oraz wynik hybrydyzacji z sondami rozpoznającymi ORF RIP1, obszar atp8/atp6 oraz gen cox1. Po
lewej trawienie i hybrydyzacja BspHI, po prawej HaeIII. RM oznacza standard wielkości Raoul™, który hybrydyzuje z
sondami plazmidowymi.
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
Szczep
Pochodzenie
ρ+ mtDNA
108
Maks. stabilność
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
RR1
RR2
RR3
RR4
RR5
CKPG31xRGLT1
CKPG31xRPG2
CKPG31xRJL3
CKPG31xRJL2
CKPG31xRPG1
777-3A (13i)
S. capensis
5bi
ai2
D273-10B (8i)
109
75%
90%
36%
33%
<30%
Tabela 3.2. Stabilność fenotypu eksprymujących relokalizowany do mitochondriów gen RIP1 diploidalnych szczepów
w zależności od użytego genomu mitochondrialnego typu +. Podano maksymalną wartość stabilności uzyskaną po
kilku (powyżej 3) pasażach.
3.3.5. Uzyskanie genomu + zawierającego wrekombinowany gen RIP1.
Stabilność szczepów RR1 i RR2 jest zdecydowanie wyższa od pozostałych i osiąga
wartości oczekiwane dla jednorodnych pod względem mtDNA szczepów +. Dla szczepów
RR3, RR4 i RR5 nie stwierdzono wzrostu stabilności powyżej wartości osiąganych w
układzie heteroplazmatycznym. Dalszym badaniom poddano zatem szczepy RR1 i RR2,
których wysoka stabilność sugeruje, że mogła w nich zajść rekombinacja.
Pierwszym doświadczeniem było zbadanie kinetyki powstawania wydolnych
oddechowo szczepów RR1 i RR2 w sposób bardziej dokładny, niż zastosowany powyżej do
szczepu DR3 test krzyżówki en masse na podłożu selekcyjnym. Posłużono się w tym celu
Rysunek 3.7. Analiza fenotypowa wyizolowanych pojedynczych zygot szczepów RR1 i RR2. Pojedyncze zygoty RR1
(A) izolowano na podłożu zawierającym glukozę i po wykiełkowaniu przenoszono na podłoże selekcyjne. Podobnie
postępowano z zygotami RR2 (B). W wariancie (C) zygoty RR2 izolowano bezpośrednio na podłożu selekcyjnym.
metodą izolacji pojedynczych zygot z krzyżówki przez mikromanipulację. Około 10-20
świeżo utworzonych zygot z krzyżówek CKPG31xRGLT1 i CKPG31xRPG2 wyizolowano
mikromanipulatorem i umieszczono na podłożu pełnym zawierającym glukozę jako źródło
węgla. Po wykiełkowaniu diploidów przeniesiono je na podłoże selekcyjne zawierające
glicerol jako jedyne źródło węgla. Spośród 10 zygot uzyskanych z krzyżówki
CKPG31xRGLT1
(mitochondria
777-3A)
w
potomstwie
mitotycznym
siedmiu
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
110
zaobserwowano pojawianie się wydolnych oddechowo kolonii, przy czym częstość ich
pojawianie się wahała się w bardzo szerokich granicach od kilku do kilkuset z pojedynczej
zygoty (rysunek 3.7 A) . W przypadku krzyżówki CKPG31xRPG2 uzyskano czternaście
zygot, przy czym mitotyczne potomstwo wszystkich uzyskanych zygot było niewydolne
oddechowo (rysunek 3.7 B).
Powyższe doświadczenie powtórzono przenosząc drogą mikromaniplulacji zygoty
bezpośrednio na podłoże selekcyjne zawierające glicerol jako źródło węgla. W przypadku
krzyżówki CKPG31xRGLT1 nie uzyskano w takim układzie żadnej kiełkującej zygoty. W
przypadku krzyżówki CKPG31xRPG2 po 5 dniach inkubacji wykiełkowały dwie zygoty
(rysunek 3.7 C), których potomstwo mitotyczne zachowywało typową dla szczepu RR2
stosunkowo wysoką stabilność.
Wyniki tych doświadczeń dowodzą, że proces powstawania eksprymujących gen
RIP1 w mitochondriach diploidów zachodzi w sposób złożony i wieloetapowy. Pojawienie
się ekspresji genu RIP1 umożliwiającej wzrost respiracyjny zachodzi postzygotycznie, nie w
każdej zygocie i dopiero po pewnym czasie. W przypadku szczepów z mtDNA + 777-3A
(RR1) częstość tego procesu jest stosunkowo wysoka, przy czym jest ona, przy braku
selekcji w pierwszym etapie, wysoce zmienna pomiędzy poszczególnymi zygotami.
Świadczy to o tym, że jest to na tym etapie proces stochastyczny i podlegający fluktuacjom.
Zastosowanie w przypadku tego szczepu selekcji od razu po wyizolowaniu zygoty nie daje w
efekcie pozytywnych fenotypowo klonów, chociaż należy pamiętać, że w tym układzie
pozbawieni jesteśmy kontroli wykazującej, ile zygot miało w ogóle szansę wykiełkować,
wynik ten należy zatem traktować z ostrożnością. W przypadku szczepów z mtDNA S.
capensis proces prowadzący do komplementacji również zachodzi postzygotycznie, przy
czym ze znacznie mniejszą częstością, co zresztą było obserwowane już w pierwszych
testach
(rysunek
3.5).
Spośród
czternastu
zygot
wyizolowanych
w
warunkach
nieselekcyjnych w żadnej nie zaszła komplementacja. Zastosowanie selekcji bezpośrednio po
wyizolowaniu zygoty nie uniemożliwia komplementacji, i pozwala na uzyskanie
oddychających diploidów, przy czym kiełkowanie zygot jest tu zdecydowanie opóźnione.
W podsumowaniu wyniki tego doświadczenia sugerują, że do zajścia komplementacji
przez mitochondrialną kopię genu RIP1 delecji tego genu w jądrze musi zajść w zygocie
jakiś proces, którego częstość zależy od użytego genomu +. Proces ten jest częstszy w
przypadku mitochondriów 777-3A (RR1) niż S. capensis (RR2), warto jednak tu zauważyć,
że stabilność fenotypowa uzyskanego diploida jest większa dla RR2 niż RR1 (tablica 3.2).
Przy braku selekcji podczas kiełkowania zygot proces ten ma charakter stochastyczny i jego
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
111
częstość podlega wyraźnym fluktuacjom. Dane te zgodne są z hipotezą, że dla utworzenia
oddychającego rekombinanta może być wymagana rekombinacja pomiędzy cząsteczkami
mtDNA rodziców. Niezależnie od tego musi najpierw zajść zmieszanie obu typów mtDNA
w obrębie jednego kompartmentu mitochondrialnego, co tłumaczy opóźnione rozpoczęcie
wzrostu na podłożu selekcyjnym takich szczepów.
W celu ostatecznego potwierdzenia hipotezy, że w szczepach RR1 i RR2 zachodzi
rekombinacja prowadząca do wintegrowania zawierającego gen RIP1 konstruktu do mtDNA
+ przeprowadzono analizę restrykcyjną i hybrydyzacyjną DNA mitochondrialnego tych
szczepów. Przy wyborze enzymów restrykcyjnych użytych do analizy kierowano się
jednoznacznością przewidywanych wyników. W najkorzystniejszym układzie enzym taki
przecina tylko raz wstawkę konstruktu pYPG10 (ilość miejsc cięcia w wektorze pJM2 nie
jest tu istotna) a dodatkowo przecina DNA mitochondrialny w pobliżu przewidywanego
miejsca rekombinacji. Wybór utrudnia dodatkowo fakt, że dla S. capensis nie jest znana
sekwencja DNA w obszarze genów cox1, atp8 i atp6, natomiast w przypadku S. cerevisiae
częste są polimorfizmy miejsc restrykcyjnych pomiędzy różnymi szczepami. Ostatecznie w
analizie posłużono się enzymami BspHI oraz HaeIII. W przypadku szczepu RR1 uzyskana
mapa zgadzała się dokładnie z przewidywaną na podstawie sekwencji mtDNA w tym
obszarze, dla S. capensis skonstruowano przybliżoną mapę na podstawie wyników
uzyskanych w doświadczeniu. Wyniki przedstawiono na rysunku 3.8.
W przypadku szczepów KM91 (dziki szczep z mtDNA + 777-3A) oraz RR1 wyniki
hybrydyzacji zgadzają się w pełni z przewidywaniami na podstawie sekwencji mtDNA S.
cerevisiae oraz sekwencji plazmidu pYPG10. Obraz trawienia syntetycznego – CKPG31
jest taki sam, jak plazmidu pYPG10, co jest typowym zachowaniem syntetycznych –. W
szczepach RR1 i RR2 w obu trawieniach pojawiają się dwa prążki hybrydyzujące z sondą
RIP1 (plazmid pYGT37), z których jeden zawsze hybrydyzuje również z sondą cox1
(oligonukleotyd p25 lub p250) zaś drugi z sondą odpowiadającą obszarowi atp8-atp6. Przy
trawieniu HaeIII i hybrydyzacji z sondą RIP1 prążek o wielkości 3,1 kb jest stosunkowo
słaby, gdyż w tym fragmencie pozostaje tylko niewielki fragment ORF RIP1. Taki obraz
trawienia sugeruje, że konstrukt RIP1 zgodnie z przewidywaniami wrekombinował się w
obszar pomiędzy końcem genu cox1 a początkiem atp8. Wstawieniu uległ zatem obszar
pochodzący z flanki 5’ genu cox1 (zaznaczony na rys. 3.8 kolorem jasnoniebieskim) oraz
fragment flanki 3’ z S. douglasii. Poniżej ramki odczytu RIP1 aż do genu atp8 zachowana
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
112
jest sekwencja międzygenowa z S. cerevisiae. Dokładniejszą mapę restrykcyjną z
wyróżnieniem poszczególnych obszarów przedstawiono na rysunku 3.9.
Rysunek 3.9. Mapa obszaru, w którym zachodzi integracja konstruktu pYPG10 do genomu mitochondrialnego typu
777-3A. Rozmieszczenie miejsc restrykcyjnych na podstawie sekwencji dostępnych w bazie danych (patrz rozdział 4).
Mapę rekombinanta RR1 potwierdzono doświadczalnie przez analizę hybrydyzacyjną (rys. 3.8). H oznacza miejsce
HaeIII, B – BspHI.
Rysunek 3.10. Hybrydyzacja typu Northern RNA mitochondrialnych szczepów CKYS2 (WT), RR1, RR2 i CKPG31 z
sondami cox1 (pYGT21) oraz RIP1 (pYGT37).
Geny cox1, atp8 i atp6 a także ramka odczytu RF3 stanowią u drożdży S. cerevisiae
jedną jednostkę transkrypcyjną, której transkrypt pierwotny podlega skomplikowanej
obróbce (Simon i Faye, 1984). Konstrukt zawierający gen RIP1 został wstawiony w środek
tej jednostki, pomiędzy geny cox1 a atp8. Konstrukt ten posiada aktywny promotor (kopie
promotora cox1), o czym świadczy jego aktywnośc w układzie heteroplazmatycznym. W
celu zbadania ekspresji konstruktu zawierającego gen RIP1 w szczepach RR1 i RR2 na
poziomie transkrypcji i obróbki transkryptu wyizolowano z tych szczepów, a także z
dzikiego szczepu CKYS2 oraz syntetycznego – CKPG31 RNA mitochondrialny i po
Rozdział 3.2. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Wyniki
113
rozdzieleniu na żelu denaturującym przeniesiono na filtr i hybrydyzowano z sondami cox1
( pYGT21 i RIP1 (pYGT37). Wyniki hybrydyzacji przedstawiono na rysunku 3.10.
W przedstawionym na rysunku 3.10 obrazie hybrydyzacji wyraźne są dwa zjawiska.
Po pierwsze w szczepach rekombinantów RR1 i RR2 ulega zakłóceniu obraz hybrydyzacji z
genem cox1. Co prawda nie pojawiają się nowe prekursory (dodatkowy prążek powyżej
mRNA cox1 w preparacie RR1 jest obserwowany w niektórych dzikich szczepach), ale
poziom dojrzałego mRNA w porównaniu do innych form drastycznie spada. Obraz
hybrydyzacji z sondą RIP1 pokazuje natomiast, że główny prążek mRNA zawierającego
ORF RIP1 odpowiada innej, krótszej formie RNA niż ta, która hybrydyzuje z cox1. Oznacza
to najprawdopodobniej, że gen RIP1 ulega ekspresji z promotora wprowadzonego w
konstrukcie pYPG10. Nie można wykluczyć, że mRNA ten jest produktem obróbki
transkryptu zawierającego również cox1, jest to jednak mniej prawdopodobne z uwagi na
brak prekursorów hybrydyzujących z obiema sondami oraz fakt, że gen ten może również
ulegać ekspresji w układzie heteroplazmatycznym, bez rekombinacji. W preparatach RR1 i
RR2 pojawiają się dwie formy RNA o bardzo wysokiej masie cząsteczkowej, nie
hybrydyzujące z sondą cox1. Mogą to być transkrypty rozpoczęte z promotora konstruktu i
zawierające położone poniżej sekwencje genów atp8, atp6 i RF3, chociaż jest to tylko
domniemanie. Brak hybrydyzacji z sondą RIP1 w preparacie szczepu dzikiego dowodzi, że
preparaty nie są zanieczyszczone RNA cytoplazmatycznym, a ekspresja genu RIP1 zachodzi
rzeczywiście w mitochondriach.
Rozdział 3.3. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Dyskusja
114
3.3. Dyskusja
Przedstawione powyżej doświadczenia doprowadziły do stworzenia układu, w
którym w komórkach drożdży Saccharomyces cerevisiae gen RIP1 kodujący białko
Rieske’go wchodzące w skład mitochondrialnego kompleksu oksydoreduktazy ubichnoncytochrom c ulega ekspresji wyłącznie z kopii przeniesionej do DNA mitochondrialnego i
przy udziale mitochondrialnego aparaty genetycznego. Jest to pierwszy przykład
relokalizacji do genomu mitochondrialnego genu jądrowego, którego produkt wchodzi w
skład łańcucha oddechowego i zaangażowany jest w podstawowe funkcje bioenergetyczne
mitochondrium. W jedynym istniejącym dotychczas analogicznym systemie (Fox, 1996;
Steele i wsp., 1996) ekspresji ulegał gen ARG8, którego produkt nie jest bezpośrednio
związany z funkcjonowaniem łańcucha oddechowego.
Jest to różnica o tyle istotna, że wchodzące w skład łańcucha oddechowego
mitochondriów kompleksy powstają przy współudziale zarówno jądrowego, jak i
mitochondrialnego aparatu genetycznego. Białka uczestniczące w pozostałych funkcjach
metabolicznych mitochondrium kodowane są wyłącznie przez genom jądrowy. Kompleks
oksydoreduktazy ubichinon-cytochrom c, w którego skład wchodzi będące przedmiotem
przeprowadzonych doświadczeń białko rip1p, również powstaje w wyniku współdziałania
genomu jądrowego i mitochondrialnego. U wszystkich znanych organizmów posiadających
mitochondria apocytochrom b wchodzący w skład tego kompleksu kodowany jest przez
genom mitochondrialny (Saccone, 1994). Wszystkie pozostałe składniki kompleksu, w tym
białko Rieske’go
kodowane są w genomie jądrowym. Przedstawione powyżej
doświadczenia wykazały, że gen RIP1 przeniesiony do genomu mitochondrialnego jest w
stanie zapewnić produkcję wystarczających ilości aktywnego białka, które jest prawidłowo
obrabiane i włączane do kompleksu. Ponieważ, zgodnie z najpowszechniej przyjętymi
teoriami (Gray, 1993) geny takie, jak RIP1 trafiły do genomu jądrowego z genomu przodka
mitochondriów w procesie ewolucji redukcyjnej (Andersson i Kurland, 1998), przedstawione
doświadczenie można uważać za „cofnięcie” ewolucji mitochondrialnej, rzecz jasna na
bardzo małą skalę. Otwiera to jednak drogę do kolejnych badań, które mogą przyczynić się
do odpowiedzi na liczne nierozwiązane problemy dotyczące ewolucyjnej historii
mitochondriów.
Białka importowane do mitochondriów podlegają po przemieszczeniu do wnętrza
organellum licznym procesom obróbki posttranslacyjnej. Prekursor białka rip1p jest w dwóch
miejscach przecinany przez dwie kolejne proteazy matriks mitochondrialnej (Nett i wsp.,
1997), dopiero dojrzałe białko włączane jest do kompleksu. W konstruktach zastosowanych
Rozdział 3.3. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Dyskusja
115
w opisanych powyżej doświadczeniach posłużono się całą sekwencją ORF genu RIP1 wraz z
N-końcową presekwencją. Mimo to powstało białko zdolne do spełnienia fizjologicznej
funkcji
w
kompleksie
oksydoreduktazy
ubichinon-cytochrom
c,
co
świadczy
najprawdopodobniej o tym, że procesy obróbki proteolitycznej i składania kompleksów mogą
przebiegać niezależnie od translokacji białka do mitochondriów. Zastosowanie technik
biochemii białek pozwoli na bliższe zbadanie tych procesów w odniesieniu do produktu,
relokalizowanego do mitochondriów genu RIP1, już teraz można jednak stwierdzić, że
stworzenie takiego układu pozwala po raz pierwszy na rozdzielenie procesów importu i
obróbki białek mitochondrialnych stwarzając nowe możliwości badawcze.
Bardzo interesujące wnioski można wyciągnąć również z badań nad kinetyką i
mechanizmem komplementacji delecji jądrowego genu RIP1 przez jego relokalizowaną do
mitochondrium kopię. Uzyskane wyniki wykazały, że komplementacja taka, czyli ekspresja
relokalizowanej kopii genu RIP1 możliwa jest zarówno w układzie heteroplazmatycznym,
jak i w rekombinantach. W układach heteroplazmatycznych gen RIP1 pozostaje w mtDNA
skonstruowanego syntetycznego szczepu –, niezbędna jest zatem obecność drugiego typu
mtDNA formy +. Układy takie są niestabilne mitotycznie, ich utrzymanie możliwe jest
wyłącznie przy ciągłej presji selekcyjnej. Kolejne pasaże mogą jednak podnieść stabilność
fenotypową tych szczepów, nigdy nie przekracza ona jednak 30%. Zjawisko heteroplazmii
ma niesłychanie istotne znaczenie nie tylko dla genetyki drożdży, lecz przede wszystkim ze
względu na jego znaczenie w ludzkich patologiach związanych z mutacjami w mtDNA.
Wiadomo (Bartnik, 1997), że heteroplazmia odgrywa decydująca rolę w dziedziczeniu,
rozwoju i tworzeniu obrazu klinicznego wielu ludzkich schorzeń związanych z mutacjami
mitochondrialnymi. Stworzony w ramach omawianych doświadczeń układ drożdżowy może
posłużyć do dalszych badań nad mechanizmami powstawania i utrzymywania się stanu
heteroplazmii w zależności od warunków zewnętrznych i kontekstu genetycznego.
Poczynione dotychczas obserwacje nie wykraczają na razie poza poziom prostej
fenomenologii, mogą jednak stanowić podstawę do planowania dalszych eksperymentów.
Jednym z najbardziej nieoczekiwanych i najtrudniejszych do wyjaśnienia wyników
jest
bardzo
silna
zależność
funkcjonowania
użytego
konstruktu
od
kontekstu
mitochondrialnego genomu typu +. Ekspresję funkcjonalnego produktu genu RIP1 w
genomie mitochondrialnym obserwuje się tylko w kontekście mtDNA niektórych szczepów
drożdży. Inne szczepy nie dają jakiejkolwiek wykrywalnej fenotypowo ekspresji. Wszelkie
wyjaśnienia tego zjawiska pozostają na razie w sferze domysłów. Na podstawie analizy kilku
różnych szczepów można stwierdzić, ze efekt ten nie zależy od liczby intronów w mtDNA,
Rozdział 3.3. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Dyskusja
116
gdyż szczepy dzikie o takiej samej liczbie intronów mogą drastycznie się różnić: np. mtDNA
szczepu 777-3A pozwala na bardzo skuteczną ekspresję konstruktu mitochondrialnego,
podczas gdy mtDNA szczepu KL14-4A nie daje żadnego obserwowalnego efektu. Nie ma
też bezpośredniej zależności od stopnia spokrewnienia szczepów, różnice obserwuje się
między różnymi mtDNA pochodzącymi z S. cerevisiae, podczas gdy na skuteczną
komplementację pozwala mtDNA S. capensis (ale już nie S. douglasii). Jedno z możliwych
wyjaśnień obserwowanych różnic może odwoływać się do różnych alleli genów
mitochondrialnych decydujących o funkcjonowaniu aparatu translacyjnego (np. SSU-rRNA),
lub rekombinacji (ens2 Nakagawa i wsp., 1991) . Wiadomo, że szczepy drożdży
charakteryzują się wysoką zmiennością wewnątrzgatunkową sekwencji mtDNA (patrz też
rozdział 4) dotycząca zarówno sekwencji genów, struktury i liczby intronów jak i obszarów
międzygenowych. Ustalenie przyczyny obserwowanych różnic w funkcjonowaniu
mitochondrialnej wersji genu RIP1 może więc być bardzo trudne, badania takie z pewnością
przyczynią się jednak do lepszego poznania mechanizmów ekspresji genów w
mitochondriach.
Skonstruowany układ pozwolił na zbadanie kinetyki powstawania funkcjonalnych,
heteroplazmatycznych lub zrekombinowanych, diploidów przez analizę pojedynczych zygot.
Zaobserwowano, że zjawisko komplementacji fenotypowej delecji genu jądrowego przez
wprowadzoną do mitochondriów kopię zachodzi postzygotycznie, z zależną od kontekstu
genetycznego, ogólnie jednak dosyć niską częstością. W potomstwie mitotycznym
pojedynczych zygot izolowanych w warunkach nieselekcyjnych obserwuje się bardzo duże
fluktuacje częstości pojawiania się oddychających, a więc eksprymujących gen RIP1 w
mitochondriach klonów. Jest to eksperyment w pewnym sensie analogiczny do historycznego
doświadczenia Lurii i Delbrücka (Luria i Delbrück, 1943) wykazującego stochastyczny
charakter mutacji w tzw. teście fluktuacyjnym. Można zatem stwierdzić, że zjawiska
prowadzące do zajścia komplementacji w badanym układzie zachodzą postzygotycznie,
losowo, przed rozpoczęciem działania czynnika selekcyjnego.
Przy użyciu jednego ze skonstruowanych na potrzeby przedstawionego projektu
syntetycznego – udało się doprowadzić do wintegrowania zawierającego gen RIP1
konstruktu do funkcjonalnego genomu mitochondrialnego typu +. Możliwe to było jedynie
przy wykorzystaniu zjawiska rekombinacji homologicznej. Użyty konstrukt pYPG10
posiadał z obu stron sekwencje kierujące rekombinację homologiczną w obszar pomiędzy
genami cox1 a atp6 w sposób nie powodujący rozbicia sekwencji tych genów, a jedynie
wstawienie dodatkowego, zawierającego gen RIP1 i obszar promotorowy, fragmentu.
Rozdział 3.3. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Dyskusja
117
Uzyskano zgodny z oczekiwaniami zrekombinowany genom + cechujący się wysoką
stabilnością, zbliżającą się niekiedy do stabilności dzikich genomów +.
Interesujący jest fakt, że konstrukt pYPG09 nie posiadający kierujących w
odpowiednie miejsce sekwencji nie pozwolił nigdy na uzyskanie rekombinantów, mimo
wielokrotnych pasaży, czyli licznych podziałów. Oznacza to, że w mitochondriach S.
cerevisiae istnieje bardzo ścisła kontrola specyficzności rekombinacji. Jest to o tyle ciekawe,
że sekwencje międzygenowe w drożdżowych mitochondriach są wyjątkowo bogate w pary
AT i cechują się stosunkowo małą złożonością informacyjną. Wydawać by się mogło, że
ułatwi to niespecyficzną rekombinację, tymczasem zjawiska tego w skonstruowanym
systemie nie zaobserwowano. Być może ścisła kontrola specyficzności rekombinacji jest
konieczna dla utrzymania stabilności genomu mitochondrialnego w sytuacji występowania
licznych, mało złożonych, a więc wykazujących przypadkowe podobieństwo do siebie
obszarów w DNA. Stworzenie układu, w którym można śledzić rekombinację sztucznie
wprowadzonego do mtDNA markera może więc przyczynić się również do poszerzenia
wiedzy na temat procesów rekombinacyjnych w mitochondriach drożdży.
Uzyskany stabilny rekombinant stanowi nowy, nie występujący w naturze typ
genomu mitochondrialnego typu +, wzbogacony o przeniesiony z jądra aktywny gen.
Zaproponowana przez nas strategia może zatem wskazać drogę tworzenia różnych nowych
typów mitochondrialnych DNA. W szczególności możliwe będzie przy użyciu tej metody
wprowadzanie do mitochondriów genów, które u S. cerevisiae kodowane są w jądrze,
znajdowane są natomiast w mitochondriach innych organizmów, w tym człowieka.
Przykładem mogą być tu geny kodujące podjednostki dehydrogenazy NADH (siedem takich
genów występuje w mtDNA człowieka, żaden u S. cerevisiae). Otwiera to drogę do
konstrukcji drożdżowych modeli niektórych chorób ludzkich związanych z mutacjami w
mtDNA. Oczywiście droga od modelu jednokomórkowego, jakim są drożdże, do człowieka
jest bardzo daleka, lecz zastosowanie takiego modelu może pozwolić na badanie
przynajmniej podstawowych objawów na poziomie biochemicznym i komórkowym.
W podsumowaniu stwierdzić można że dokonana w przedstawionej pracy
relokalizacja genu jądrowego RIP1 do mitochondriów może na wiele różnych sposobów
poszerzyć możliwości badania oddziaływań jądrowo-mitochondrialnych. Otrzymano układ
pozwalający na „odwrócenie ewolucji” przez wprowadzenie do genomu mitochondrialnego
genów, które przeszły do jądra w procesie ewolucji redukcyjnej. System ten pozwala też na
konstruowanie
nowych,
nie
występujących
naturalnie
u
drożdży
genomów
mitochondrialnych o rożnym składzie genów, w tym być może układów modelowych dla
Rozdział 3.3. Inżynieria genomu mitochondrialnego. Dyskusja
118
badania genetyki mitochondrialnej innych organizmów, w tym człowieka. Badania nad tym i
skonstruowanymi na podobnej zasadzie układami mogą przyczynić się do lepszego poznania
mechanizmów transportu i obróbki białek mitochondrialnych, składania mitochondrialnych
kompleksów białkowych, heteroplazmii i rekombinacji mtDNA a także mechanizmów
ekspresji genów mitochondrialnych. Ponieważ skonstruowany na potrzeby tej pracy system
jest pierwszym tego typu układem wiele pytań pozostaje wciąż bez odpowiedzi.
Przeniesienie genu RIP1 z jądra do mitochondriów to dopiero początek nowej drogi badań
wykorzystujących techniki inżynierii genomu mitochondrialnego.
Część IV.
Prace nad bazą danych sekwencji mitochondrialnych (MitBASE)
Rozdział 4.1. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wstęp
ID
DE
OS
OC
RX
RN
RA
RL
DR
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
SQ
1
//
120
Identyfikator MitBASE; typ cząsteczki; długość sekwencji;
Opis tekstowy
Organizm
Przynależność taksonomiczna
Referencja do bazy Medline
Numer pozycji bibliografii
Autorzy
Referencja bibliograficzna
Referencja do pierwotnego banku danych
Key
Location/qualifiers
{tabela cech EMBL}
CDS
x..y
/gene=”nazwa_genu”
/alt_gene=”synonim”
/transl_code=”#”
/product=”nazwa białka”
/note=“dodatkowe informacje”
intron
x..y
/gene=“nazwa_genu”
/number=“#”
exon
x..y
/gene=“ nazwa_genu”
/number=“#”
seq_blocks
x..y
/note=“CSB”
lub
/note=“TAS”
lub inne
……….
acatttg…….
{sekwencja}
Rysunek 4.1. Ogólny format zbioru tekstowego MitBASE, według Attimonelli i wsp. (1999). Identyfikator
przyznawany jest automatycznie przez system MitBASE. Taksonomia oparta jest na klasyfikacji NCBI. „#” oznacza
wartość liczbową. tabele translacji dostępne są na stronie WWW MitBASE. Dodatkowo mogą pojawić się specyficzne
oznaczenia dla konkretnych grup taksonomicznych.
4.1. Wstęp
4.1.1. Banki i bazy danych. Założenia projektu MitBASE
Począwszy od lat osiemdziesiątych jednym z głównych nurtów badawczych w
biologii molekularnej jest sekwencjonowanie kwasów nukleinowych, głównie DNA. Jest to
w tej chwili podstawowa metoda poznawania struktury makrocząsteczek biologicznych. W
chwili
obecnej
sekwencjonuje
się
całe
genomy,
często
w
ramach
dużych,
międzynarodowych projektów.
Ogromna
ilość
napływających
nieustannie
danych dotyczących
sekwencji
biologicznych zrodziła potrzebę ich magazynowania i analizowania przy użyciu
odpowiednich metod z dziedziny bioinformatyki. Niezbędne są narzędzia służące do
przechowywania, opisywania (annotacji) i przeszukiwania przy użyciu różnych kryteriów
całości zgromadzonych sekwencji. Podstawowym narzędziem są tutaj powszechnie dostępne
za pośrednictwem Internetu banki danych, z których najważniejsze obecnie to bank EMBL
Rozdział 4.1. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wstęp
121
(Stoesser i wsp., 1999), GenBank (Benson i wsp., 1998) oraz DDBJ. Banki te współpracują
wymieniając między sobą dane tak, że zestaw informacji w każdym z nich jest równoważny.
Podstawową funkcją tych banków, nazywanych dalej pierwotnymi (primary
databanks) jest magazynowanie całości dostępnych sekwencji kwasów nukleinowych. Poza
sekwencją przechowywane są podstawowe informacje dotyczące jej pochodzenia (organizm,
tkanka, izolat itp.), autorów, dane bibliograficzne, oraz pewna ilość informacji dodatkowych
w postaci komentarza. Położenie istotnych biologiczne obszarów w sekwencji (np. geny,
egzony, introny, promotory itp.) opisuje się w tzw. tabeli cech (feature table), której format
różni się w zależności od konkretnego banku danych.
Banki danych zawierają w tej chwili (dane z grudnia 1998) około 3 miliony zapisów
(rekordów, ang. entries) obejmujących w sumie nieco ponad dwa miliardy zasad sekwencji.
Tak ogromna ilość danych niesie za sobą konieczność stworzenia odpowiednich systemów
wyszukiwania informacji. Systemy takie w głównych bankach danych są w tej chwili dosyć
zaawansowane i pozwalają na zastosowanie bardzo różnorodnych kryteriów analizy. Bank
EMBL dysponuje systemem SRS (Sequence Retrieval System) pozwalającym na dowolne
łączenie zapytań dotyczących różnych pól informacji zawartych w opisach danych (Etzold i
wsp., 1996). Z kolei GenBank posługuje się systemem Entrez, którego główna siła polega na
możliwości łączenia informacji dotyczących różnych zapisów i różnych banków danych (np.
sprzężenie GenBanku z bazą danych literaturowych Medline).
Końcowy użytkownik pierwotnych banków danych uzyskuje informację w postaci
zbioru tekstowego o określonym dla każdego banku formacie (tzw. flatfile), w którym są też
przeważnie rozsyłane do klientów kompletne zbiory danych. Z takiego formatu korzysta też
wiele programów operujących na danych sekwencyjnych. Wewnętrzny format każdego
banku jest jednak obecnie bardziej zbliżony do opisanego w dalszej części relacyjnego
systemu baz danych.
Pierwotne banki danych są jednymi z najważniejszych narzędzi badawczych
współczesnej biologii a ich znaczenie rośnie wraz z postępami projektów sekwencjonowania.
Z ich zaletami, z których na pierwszym miejscu wymienić należy kompletność informacji i
powszechny dostęp wiążą się też jednak wady. Zawarta w nich informacja pochodzi
bezpośrednio od badaczy sekwencjonujących dany fragment, ewentualne błędy i
niezgodności nie są niezależnie weryfikowane. Dodatkowo, różni autorzy stosują niezgodne
ze sobą konwencje opisywania danych, a nawet różne nazewnictwo tych samych genów.
Występuje też w pewnym zakresie redundancja informacji – nowsze i starsze sekwencje
tych samych fragmentów, często niezgodne, współegzystują ze sobą.
Rozdział 4.1. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wstęp
122
Istotnym ograniczeniom podlegają też systemy wyszukiwania informacji w
pierwotnych bankach danych. Mimo niekiedy znacznego zaawansowania, jak na przykład w
systemie SRS, opierają się one zawsze na przeszukiwaniu danych alfanumerycznych
zawartych w tekstowym zapisie danych (flatfile). Uniemożliwia to konstruowanie bardziej
złożonych zapytań, a także naraża na problemy z nadmiarem lub ”gubieniem” części
informacji. Sytuacje bardzo utrudnia tu brak normalizacji nazw genów, przykładowo,
użytkownik poszukujący sekwencji genów apocytochromu b musiałby konstruować
zapytania używające terminów „cytb”, „cob”, cob-box”, i kilku innych wariantów.
Zakres informacji dostępnych w pierwotnych bankach danych również ograniczony
jest do danych najbardziej podstawowych. Brakuje często np. informacji o bardziej
złożonych zjawiskach zachodzących przy ekspresji genu (np. redagowanie, zachodzenie
genów na siebie). Brak też bardziej rozbudowanej informacji o funkcji znajdujących się w
danej sekwencji genów i innych istotnych biologicznie obszarów. Ponadto, w większości
przypadków, nie są w nich przechowywane dane dotyczące zmienności genetycznej danych
obszarów (mutacji i polimorfizmów), a istniejące tego typu dane są niekompletne i
nieustandaryzowane.
Oczywiste jest, że pierwotne banki genów nie mogą, ze względu na swoje główne
zadanie, jakim jest gromadzenie i udostępnianie wszystkich poznawanych sekwencji spełnić
wszystkich wymienionych
powyżej oczekiwań. Konieczne jest zatem tworzenie
wyspecjalizowanych baz danych, mających na celu dostarczenie bardziej kompletnej i
uzupełnionej jakościowo i ilościowo informacji dotyczącej konkretnego działu badań nad
sekwencjami biologicznymi.
Wyspecjalizowane bazy danych wyróżniają się pogłębioną zawartością informacyjną
i staranną weryfikacją gromadzonych danych. Oferują też zwykle bardziej wyspecjalizowane
narzędzia służące do wyszukiwania informacji. Przykładami mogą być bazy danych
związane z projektami sekwencjonowania genomów, jak na przykład LISTA (Mosse i wsp.,
1988) – jedna z pierwszych tego typu baz, czy też obecnie SGD (Cherry i wsp., 1998)– obie
stworzone dla projektu genomu drożdży.
Od
początku
lat
osiemdziesiątych
gromadzone
były
sekwencje
DNA
mitochondrialnego z różnych organizmów eukariotycznych. Sekwencje mtDNA ssaków, w
tym człowieka (Anderson i wsp., 1981) były pierwszymi pełnymi genomami, których
sekwencje wyznaczono w całości. Sekwencje mtDNA trafiają, podobnie jak wszystkie inne,
do pierwotnych banków danych. W ich przypadku jednak, ograniczenia związane ze
strukturą informacji w tych bankach są szczególnie widoczne. Wiąże się to z ogromną
różnorodnością organizacji mtDNA (Saccone, 1994) , występowaniem wielu nietypowych
Rozdział 4.1. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wstęp
123
mechanizmów genetycznych takich, jak odstępstwa od uniwersalności kodu (Fox, 1987),
redagowanie, czy nachodzenie na siebie genów a także dużą ilością danych dotyczących
zmienności sekwencji.
Oczywista jest zatem konieczność stworzenia wyspecjalizowanej bazy danych
sekwencji mitochondrialnych. Baza taka musi uwzględniać specyfikę organizacji i ekspresji
mtDNA różnych grup taksonomicznych, dostarczyć zaawansowanych mechanizmów analizy
danych oraz zapewnić dostateczną weryfikację gromadzonej informacji. Mając to na uwadze
stworzono międzynarodowy projekt, w którym uczestniczy kilka grup z różnych krajów
europejskich, mający na celu stworzenie pełnej, zintegrowanej bazy danych sekwencji
mtDNA, z uwzględnieniem ich zmienności. Baza ta, nazwana MitBASE (Attimonelli i wsp.,
1999), jest obecnie w końcowym stadium tworzenia, wyniki dotychczasowych prac dostępne
są publicznie w Internecie pod adresem
http://www.ebi.ac.uk/htbin/Mitbase/mitbase.pl.
Najważniejszym celem projektu MitBASE jest dostarczenie społeczności naukowej
wszystkich dostępnych informacji dotyczących mtDNA zarówno jeśli chodzi o różnorodne
gatunki, jak i wewnątrzgatunkowe warianty sekwencji. Dane gromadzone w MitBASE są
starannie redagowane przez specjalistów w danej dziedzinie, co zapewnia ich dokładność,
jednorodność struktury i brak redundancji.
4.2.2. Techniczna i organizacyjna struktura projektu MitBASE
Projekt MitBASE finansowany jest w ramach programu biotechnologicznego Unii
Europejskiej, koordynatorem projektu jest prof. Cecilia Saccone z Uniwersytetu w Bari
(Włochy). W skład projektu wchodzi osiem grup, z których sześć pracuje nad sekwencjami
mtDNA danej grupy taksonomicznej (Protista, rośliny i glony, grzyby, bezkręgowce,
kręgowce, człowiek), jedna zajmuje się obsługą bioinformatyczną projektu (EBI, Hinxton,
UK) zaś ostatnia prowadzi tzw. projekt pilotowy dotyczący jądrowych genów
zaangażowanych w biogenezę mitochondriów u drożdży (N. Altamura, Bari). W ramach
przedstawionej pracy wykonano cześć projektu w grupie zajmującej się sekwencjami
grzybów, kierowanej przez Dr. J. Łazowską z Gif-sur-Yvette.
MitBASE określa się mianem zintegrowanej bazy danych, gdyż łączy ona w jednej
bioinformatycznej i organizacyjnej strukturze odrębne bazy tworzone przez każdą z
wymienionych grup.
Szczególną cechą MitBASE jest silny nacisk kładziony na obecność w niej nie tylko
sekwencji uznawanych za wzorcowe, lecz także będących wynikiem wewnątrzgatunkowej
Rozdział 4.1. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wstęp
124
zmienności wariantów (mutacji i polimorfizmów) sekwencyjnych. Warianty stanowią
główną część sekwencji ludzkich zgromadzonych w MitBASE. Mają one szczególne
ID
GN
DE
OS
OC
OC
ST
RN
RA
RL
RN
RA
RL
RN
RA
RL
RN
RA
RL
FH
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
...
SQ
...
//
SCCYTBLO
7172 bp
cytb, Scbi2, Scbi3, Scbi4
Yeast (S.cerevisiae) mitochondrial cytochrome b long gene
Saccharomyces cerevisiae
Eukaryotae; mitochondrial eukaryotes; Eumycota; Ascomycotina;
Hemiascomycetes; Saccharomycetales; Saccharomycetaceae;
777-3A
[1]
Schmelzer C., Schmidt C., May K., Schweyen R.J.
EMBO J. 11:2047-2052(1983)
[2]
De La Salle H., Jacq C., Slonimski P.P.
Cell 28:721-732(1982)
[3]
Lazowska J., Claisse M., Gargouri A., Kotylak Z., Spyridakis A., Slonimski P.P.
J. Mol. Biol. 205:275-289(1989)
[4]
Lazowska J, Jacq C, Slonimski PP
Cell 22:333-348(1980)
Key
Location/Qualifiers
gene
1..7172
/gene="cytb"
CDS
join(1..415, 1183..1196, 2603..2679, 4371..4620,
6038..6088, 6822..7172)
/gene="cytb"
/codon_start=1
/transl_table=3
/product="cytochrome b"
exon
1..415
/number=1
/alt_name="B1"
intron
416..1182
/number=1
/alt_name="bi1"
/group="II"
/mobile="no"
/self_splicing="yes"
exon
1183..1196
/number=2
/alt_name="B2"
intron
1197..2602
/number=2
/alt_name="bi2"
/group="I"
/self_splicing="no"
/mobile="no"
CDS
join(1..415, 1183..2039)
/gene="Scbi2"
/product_class="maturase"
exon
2603..2679
/number=3
/alt_name="B3"
intron
2680..4370
/number=3
/alt_name="bi3"
/self_splicing="no"
/mobile="no"
CDS
2603..3727
/gene="Scbi3"
/product_class="maturase"
/transl_table=3
7172bp
znaczenie, gdyż z wieloma zmianami w mtDNA związane są różnego rodzaju patologie, o
często bardzo złożonej etiologii (Bartnik, 1997). Ponadto zmienność mtDNA jest podstawą
wielu badań dotyczących naturalnej różnorodności populacji ludzkich i ich historii. Warianty
obecne są również wśród sekwencji kręgowców (głównie u ryb, gdzie stanowią narzędzie
badań populacyjnych stosowanych w rybołówstwie). Stanowią one też bardzo istotną cześć
danych dotyczących grzybów, a zwłaszcza drożdży Saccharomyces cerevisiae, które od
Rozdział 4.1. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wstęp
125
wielu lat stanowią modelowy układ genetyki mitochondrialnej. W przeciwieństwie do
wariantów sekwencyjnych kręgowców i człowieka, w przypadku drożdży istnieje często
jednoznacznie określona i dobrze zbadana zależność między genotypem (czyli konkretnym
wariantem sekwencji mtDNA) a fenotypem (czyli efektem fizjologicznym danej zmiany
sekwencji). Większość z danych dotyczących wariantów nie jest obecna w pierwotnych
bankach danych sekwencji, w przypadku większości wariantów genów drożdżowych
MitBASE jest pierwszym narzędziem gromadzącym je w postaci elektronicznej. Obecność
na taką skale wariantów odróżnia MitBASE od innych baz danych mitochondrialnych, np.
GOBASE (Korab-Laskowska i wsp., 1998). Integracja w jednej bazie danych informacji
dotyczących wariantów sekwencji mtDNA różnych organizmów, w tym człowieka, ma
kapitalne znaczenie dla postępu badań nad mitochondriami i może przyczynić się między
innymi do wyjaśnienia mechanizmów patologii związanych z mutacjami mtDNA człowieka.
Złożona
struktura
danych
w
projekcie
MitBASE
wymaga
zastosowania
odpowiednich narzędzi informatycznych, zarówno po stronie badaczy dostarczających
danych, jak i w węźle bioinformatycznym EBI, gdzie dane są magazynowane i udostępniane
do analizy. W odróżnieniu od pierwotnych banków danych, gdzie dane ustrukturalizowane są
wokół koncepcji zapisu tekstowego (flatfile), w MitBASE za podstawę przyjęto relacyjny
system przechowywania danych w postaci tabelarycznej. Takie rozwiązanie wymusza
jednolitą strukturę i wewnętrzną zgodność danych, ułatwia standaryzację (np. nomenklatury
genetycznej), a przede wszystkim oferuje praktycznie nieograniczone możliwości analizy
przez konstruowanie odpowiednich zapytań, np. w języku SQL. Dane projektu MitBASE
przechowywane są w EBI w systemie relacyjnej bazy danych ORACLE, program serwera
internetowego baz danych tej firmy posłużył też za podstawę do konstrukcji systemów
wyszukiwania dostępnych w sieci WWW.
Odrębnym zagadnieniem jest system gromadzenia i wprowadzania danych do
MitBASE. Większość grup, ze względu na prostotę, dostarcza dane w postaci zbiorów
tekstowych. Dane dotyczące wariantów sekwencji są natomiast z reguły gromadzone od razu
w postaci tabelarycznej. Rozwiązania zastosowane dla działu sekwencji mtDNA grzybów
przedstawione zostaną szczegółowo w dalszej części pracy.
Przechowywane w postaci tabelarycznej w relacyjnej strukturze ORACLE dane służą
do generowania zbiorów wynikowych, które ostatecznemu użytkownikowi prezentowane są
w postaci zbiorów tekstowych (flatfile). Zdefiniowano ogólny format zbioru wyjściowego
MitBASE, oparty na formacie stosowanym przez bazę EMBL, lecz dostosowany do
specyficznych wymagań projektu. Na rysunku 4.1 przedstawiono ogólny format takiego
zbioru wyjściowego.
Rozdział 4.1. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wstęp
126
Rozdział 4.1. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wstęp
127
Rysunek 4.3. Schemat relacji między tabelami bazy danych wariantów mtDNA grzybów. Bazę przygotowano w
programie MSAccess97, kierując się specyfikacjami struktury MitBASE w systemie ORACLE. Znaczenie poszczególnych
tabel i pól omówiono w tekście.
4.1.3. Cele projektu
W dalszej części pracy przedstawione zostaną pokrótce zadania, jakie wykonano w
ramach projektu MitBASE dotyczące sekwencji mtDNA grzybów. W ramach projektu:
zdefiniowano zestaw danych (dataset) określający, jakie informacje mają znaleźć się
MitBASE w sekcji dotyczącej grzybów
opracowano format przesyłania wprowadzanych sekwencji w formie tekstowej
z pierwotnych banków danych wybrano wszystkie dane dotyczące grzybów,
skontrolowano je, usunięto błędy i redundancje oraz poprawiono annotacje
opracowano jednorodną nomenklaturę genów, w tym, po raz pierwszy, genów
intronowych i stworzono tabelę synonimów
stworzono strukturę relacyjnej bazy danych dla wariantów (mutacji i polimorfizmów) w
sekwencjach mtDNA grzybów oraz program służący do wprowadzania do niej danych
wprowadzono do utworzonej bazy dane dotyczące wariantów sekwencyjnych, z których
większość po raz pierwszy została opracowana w postaci elektronicznej
zintegrowano zgromadzone dane z bazą MitBASE
Wszystkie omawiane wyniki dostępne są dostępne są publicznie w Internecie pod adresem
http://www.ebi.ac.uk/htbin/Mitbase/mitbase.pl.
Rozdział 4.2. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wyniki
128
4.2. Wyniki
4.2.1. Dane sekwencyjne mtDNA grzybów pochodzące z pierwotnych banków
danych
Dział MitBASE dotyczący grzybów składa się z dwóch zasadniczych grup, z których każda
wymagała odrębnych metod analizy i gromadzenia. Pierwszą grupą są sekwencje umownie
określane jako „dzikie”. Są to sekwencje fragmentów DNA, w tym też kompletnych
genomów mitochondrialnych, w większości dostępne w pierwotnych bankach danych
(EMBL, GenBank). Grupa ta nie zawiera praktycznie sekwencji wariantów, którym
poświęcona będzie kolejna część.
Podstawowym problemem przy opracowywaniu tych danych na użytek projektu
MitBASE było ujednolicenie formatu i konwencji używanych przy opisywaniu sekwencji,
usunięcie danych nadmiarowych oraz błędnych i zdefiniowanie dodatkowych informacji,
wprowadzanych do projektu MitBASE.
Sekwencje mtDNA grzybów charakteryzują się wielką różnorodnością. Ich genomy
mitochondrialne wahają się rozmiarami od około 10 do ponad 100 kb, występują wśród nich
genomu koliste i liniowe, różny jest skład kodowanych przez nie genów. Z tego powodu nie
można ich odnieść w prosty sposób do jednego, wzorcowego genomu, co jest możliwe np. w
przypadku sekwencji kręgowców. Ponadto, struktura genów może być bardzo złożona, ze
względu na obecność intronów, z których wiele zawiera wewnątrzintronowe ramki odczytu.
Wystarczy wspomnieć, że gen cox1 Podospora anserina ma długość ponad 24kb, czyli
półtorakrotnie większą od całego mtDNA człowieka i zawiera 16 intronów, w których
znajduje się do 15 wewnątrzintronowych ramek odczytu.
U wielu gatunków grzybów stwierdza się znaczną zmienność wewnątrzgatunkową,
dotycząca nie tylko punktowych różnic w sekwencji, lecz także cech wielkoskalowych, np.
liczby intronów, co oczywiście wpływa na długość sekwencji. Nie można zatem przyjąć
jednolitego genomu wzorcowego nawet w przypadku jednego gatunku, ze względu na
związane z polimorfizmem liczby intronów różnice w długości, a co za tym idzie
niejednoznaczną numerację pozycji.
Dodatkowo tradycyjne nazewnictwo genów jest bardzo niejednorodne i różne dla
różnych organizmów. Dla przykładu, gen kodujący I podjednostkę oksydazy cytochromowej
może nosić nazwę cox1, oxi3, COI i jeszcze kilka różnych. Jeżeli chodzi o geny
wewnątrzintronowe, to nie istnieje żaden system ich nazewnictwa.
Rozdział 4.2. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wyniki
129
Większość sekwencji grzybów wymagała zatem starannego opracowania i
modyfikacji. Wprowadzono następujące reguły:
do zestawu danych w części dotyczącej pozycji taksonomicznej wprowadzono pole
Rysunek 4.4. Główny ekran aplikacji służącej do wprowadzania danych dotyczących wariantów mtDNA grzybów do
bazy danych MitBASE. Program napisano w języku Delphi 3.0, pracuje pod kontrolą systemów Win9x/NT4.0.
zawierające nazwę szczepu
stworzono tabelę synonimicznych nazw genów, jedna z nazw uznano za standardową i
wprowadzono w dodatkowym polu, oznaczonym GN. Nazwy nadane przez autorów
sekwencji zachowano, jako synonimy aby umożliwić użytkownikom przyzwyczajonym
do tradycyjnej nomenklatury korzystanie z bazy. Przykłady zidentyfikowanych
synonimów przedstawiono w tabeli 4.1.
nazwa standardowa
cox1
cox2
cox3
cytb
nad41
atp8
atp9
atp6
TSL
ENS2
rrnL
rrnS
synonimy
coxI, oxi3, COI
coxII, oxi1, COII
coxIII, oxi2, COIII
cob, cob-box, CYB
ND4
aap1
oli1
oli2
9S RNA
RF3
lsu, LSU-rRNA, 21S rRNA, 23S rRNA, rnl
ssu, SSU-rRNA, 15S rRNA, 16S rRNA, rns
Rozdział 4.2. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wyniki
trnA
1
130
tRNA-Ala, Ala-tRNA1
Na podobnej zasadzie pozostałe geny nad i tRNA
Tabela 4.1. Przykładowe synonimy nazw genów mitochondrialnych grzybów
utworzono system nazewnictwa genów intronowych. Nazwę genu tworzą: dwie lub trzy
litery pochodzące od nazwy gatunku (np. Sc dla S. cerevisiae, Sca dla S. capensis, Pa dla
P. anserina itp.), następnie jeden lub dwa znaki definiujące gen, według ogólnie
przyjętych skrótów (np. a dla cox1, b dla cytb itd. rl i rs przypisano odpowiednio rrnL i
rrnS p6 – atp6, n genom nad, c2 i c3 to odpowiednio cox2 and cox3 itd.). Ostatnie dwa
znaki to in, gdzie n jest numerem intronu. Przykład dla ORF drugiego intronu genu cytb
S. cerevisiae przedstawiono poniżej
Scbi2
S. cerevisiae cytb
intron2
Ujednolicono sposób kodowania struktury genów, zwłaszcza pod kątem występowania
intronów. Przykład podano na rysunku 4.2 poniżej.
Rysunek 4.2. Przykład poprawionego zbioru dotyczącego genu cytb S. cerevisiae tzw. szczepu długiego. Fragmenty
opisu i sekwencje wycięto. Elementy tabeli cech dotyczące intronów (/self_splicing, /mobile, /product_class)
wprowadzono do zestawu danych na potrzeby projektu MitBASE.
Posługując się tymi regułami opracowano i wysłano do bazy danych MitBASE 498
zapisów pochodzących z 200 gatunków grzybów. Kolejne około 200 sekwencji jest w trakcie
opracowywania i wprowadzania. Należy jednak wspomnieć, że nakład pracy wymagany do
przystosowania do formatu MitBASE sekwencji nadchodzących do pierwotnych banków
danych w ostatnich latach jest mniejszy, niż dla starszych danych, gdyż obecnie przyjęto
znacznie bardziej rygorystyczne i jednorodne standardy opisywania sekwencji.
Wśród
wprowadzonych
sekwencji
znajduje
się
pięć
pełnych
genomów
mitochondrialnych: Hansenula wingei (Sekito i wsp., 1995), Podospora anserina (dwa
szczepy) (Cummings i wsp., 1990), Schizosaccharomyces pombe (Trinkl i wsp., 1989; Lang
i wsp., 1985) i Allomyces macrogynus (Paquin i Lang, 1996). W chwili pisania tej pracy nie
była jeszcze dostępna pełna sekwencja mtDNA S. cerevisiae, odrzucono bowiem sztuczną
sekwencję (de Zamaroczy i Bernardi, 1985) złożoną z fragmentów uzyskanych z różnych
szczepów.
W podsumowaniu stwierdzić można, że w porównaniu z sekwencjami dostępnymi w
bankach pierwotnych dane wprowadzone do MitBASE wykazują szereg korzystnych
Rozdział 4.2. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wyniki
131
własności. Uporządkowane zostały kwestie nazewnictwa i formatu danych, skorygowane
informacje dotyczące złożonych, zawierających introny genów, usunięte informacje
nadmiarowe i błędne. Wprowadzono również część sekwencji niedostępnych dotychczas w
bazach danych a uzyskanych bezpośrednio od badaczy.
4.2.2. Struktura i narzędzia bazy danych wariantów sekwencyjnych
Wprowadzenie do MitBASE opisanych powyżej sekwencji stanowi zdecydowany
krok naprzód w porównaniu z możliwościami oferowanymi przez pierwotne banki danych.
Ulepszenie sprowadza się jednak zasadniczo do skorygowania nieścisłości annotacyjnych i
wprowadzenia pewnej ilości danych, dostępnych wcześniej jedynie w specjalistycznej
literaturze (głównie dotyczących intronów). Tym, co wyróżnia MitBASE spośród innych baz
danych jest jednak uwzględnienie po raz pierwszy na taką skalę występujących w
sekwencjach mtDNA miejsc zmiennych.
W przypadku części bazy dotyczącej grzybów zagadnienie wariantów sekwencyjnych
dotyczy głównie drożdży S. cerevisiae. Organizm ten od wielu lat stanowi model dla badań
w dziedzinie genetyki mitochondrialnej (Bolotin-Fukuhara i Grivell, 1992). Posługując się
opisanymi w rozdziale 1 metodami genetyki opisano około 1000 mutacji w mtDNA tego
gatunku. Mniej więcej 1/3 tej liczby poddano analizie przez sekwencjonowanie, pozostałe
zostały wyłącznie zmapowane metodami klasycznymi. Dodatkowo pomiędzy wieloma
stosowanymi w laboratorium szczepami drożdży S. cerevisiae istnieje bardzo silna
zmienność na poziomie sekwencji mtDNA. Praktycznie wszystkie (z nielicznymi wyjątkami)
te, niesłychanie cenne z naukowego i praktycznego punktu widzenia informacje dostępne
były do tej pory wyłącznie w postaci informacji opublikowanych w czasopismach, większość
nie była wprowadzana do pierwotnych banków sekwencji. Wprowadzenie tych danych do
MitBASE daje więc badaczom do ręki nowe i bardzo przydatne narzędzie analizy
funkcjonowania genomu mitochondrialnego.
W przeciwieństwie do zmian w mtDNA człowieka, gdzie relacja genotyp-fenotyp
rzadko bywa jednoznacznie określona, u drożdży jesteśmy w większości przypadków w
stanie określić efekt fenotypowy konkretnej zmiany w sekwencji. Dla potrzeb związanych z
konstrukcją bazy danych wariantów sekwencji mtDNA grzybów wprowadzono więc
rozróżnienie na mutacje– mające konkretny, zbadany laboratoryjnie efekt fenotypowy, oraz
polimorfizmy
–
stanowiące
efekt
naturalnej
zmienności
między
funkcjonalnie
równoważnymi wariantami mtDNA. Zbiorczo określa się je jako zmiany (variation events) a
niosące je mtDNA nazywa wariantami (variants).
Rozdział 4.2. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wyniki
132
Podczas tworzenia bazy danych wariantów mtDNA grzybów uwzględniono również
coraz liczniejsze przypadki wprowadzania zmian do genomu mitochondrialnego metodą
mutagenezy ukierunkowanej przy użyciu techniki transformacji balistycznej (patrz rozdział
3.1).
Specyficzny charakter danych składających się na dział dotyczący wariantów
wymagał zastosowania innych środków technicznych niż w przypadku sekwencji
opisywanych poprzednio. Do bazy danych nie są wprowadzane kompletne sekwencje,
przeważnie zresztą nieokreślone, a tylko pozycje i typy zmian które zaszły w sekwencji
uznanej za wzorcową. Sekwencjami wzorcowymi są te, których wprowadzanie do MitBASE
omówiono w poprzednim rozdziale, mogą to być sekwencje genów, fragmentów genomu,
lub całych genomów.
Strukturę bazy danych wariantów zaprojektowano od razu korzystając z systemu
relacyjnej bazy danych, co ułatwia ich wprowadzanie do struktury MitBASE. Użyto systemu
MSAccess97, gotowe tabele eksportowano jako tekst, który następnie wczytywany był do
tabel ORACLE w EBI.
Strukturę relacyjnej bazy danych wariantów mtDNA grzybów przedstawiono na
rysunku 4.3.
Główną tabelą bazy jest tabela VAR_DETAILS przechowująca podstawowe dane
dotyczące wariantu sekwencyjnego. Jej pola to:
VARID – główny identyfikator i podstawowy klucz bazy
VAR_NAME – nazwa wariantu (mutanta)
SEQID – wskaźnik identyfikujący sekwencję wzorcową (reference) dla danego wariantu.
Wszystkie zmiany w wariancie odnoszą się do tej właśnie sekwencji
VAR_MASTER – pole logiczne (tak/nie) wskazujące, czy sekwencja wzorcowa, określona
przez SEQID sama jest wariantem, czy należy do sekwencji „dzikich”. Warianty wariantów
(np. supresory wewnątrzgenowe) stanowią specyfikę tego działu bazy.
STRAIN – nazwa szczepu zawierającego wariant
DB_XREF – referencja do pierwotnego banku danych
GENE – standardowa nazwa genu, którego dotyczy zmiana
PHENOTYPE i SECONDARY-PHENOTYPE – pola tekstowe opisujące fenotyp wariantu
SUPP_TARGET_VARID – jeżeli wariant jest supresorem to pole to zawiera odnośnik do
pola VARID suprymowanego wariantu
SUPP_TARGET_START i SUPP_TARGET_END – początek i koniec obszaru sekwencji,
którego dotyczy supresja
Rozdział 4.2. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wyniki
133
IN_VITRO – pole logiczne (tak/nie) określające, czy wariant został wytworzony w wyniku
mutagenezy ukierunkowanej
Poprzez klucz VARID tabela VAR_DETAILS jest związana z tabelą VARIATION
opisującą zmiany (variation events). Jej pola to:
VAR_MEANING – określa, czy zmiana jest mutacją (o wyraźnym efekcie fenotypowym),
czy polimorfizmem
VAR_START i VAR_END określają pozycję zmiany w stosunku do sekwencji wzorcowej
(zdefiniowanej przez pole SEQID tabeli VAR_DETAILS)
VAR_TYPE – określa, czy zmiana jest podstawieniem, delecją, czy insercją
ORGINAL_SEQUENCE i VAR_SEQUENCE – odpowiednio wzorcowa i zmieniona w
wariancie sekwencja (np. A->T)
ORIGINAL_AA i VAR_AA jak wyżej w odniesieniu do kodowanych aminokwasów, jeżeli
sekwencja koduje białko
REGION_ID – pole łączące z tabelą REGION opisującą obszar genu (np. intron, egzon,
promotor itp.), którego dotyczy zmiana.
Opisane powyżej trzy tabele opisują zmiany w sekwencji wariantu. Związany z nimi
jest blok dwóch tabel (JOURNAL_CITATION i CITATION_AUTHOR) opisujący
referencję bibliograficzną danego wariantu przy użyciu standardowych pól. Pole RX zawiera
referencję do bazy danych Medline. Ponieważ pomiędzy referencjami bibliograficznymi a
wariantami istnieje relacja wiele-do-wielu (jedna pozycja literatury może opisywać wiele
wariantów, a jedne wariant może być opisany w wielu referencjach) konieczne było
zdefiniowanie dodatkowej tabeli łączącej VAR_CITATION wiążącej główne indeksy bloku
wariantu (VARID) i referencji (CITID).
Tak stworzona struktura umożliwia wprowadzenie wszystkich danych niezbędnych
dla opisania wariantów sekwencyjnych mtDNA grzybów. Uwzględnia ona specyfikę tego
działu MitBASE, czyli występowanie określonej relacji genotyp-fenotyp oraz złożonych
oddziaływań genetycznych np. supresji. Taka struktura pozwala na konstruowanie (np. przy
użyciu SQL) zapytań pozwalających np. na odnalezienie wszystkich mutacji w intronach
genu cytb wpływających na aktywność maturaz, czy też wszystkich wewnątrzgenowych
supresorów mutacji egzonowych. Tabelaryczna struktura umożliwia łatwą integrację danych
ze strukturą MitBASE w systemie ORACLE.
Relacyjne bazy danych o złożonej strukturze, takie jak przedstawiona powyżej
wymagają stworzenia odpowiednich formularzy służących do wprowadzania danych.
Ponieważ dane dotyczące pojedynczego wariantu są rozproszone w sześciu tabelach, ich
wprowadzanie bezpośrednio do tabel byłoby niewygodne i mogło stanowić źródło błędów.
Rozdział 4.2. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wyniki
134
Aby ominąć ograniczenia narzędzi wprowadzania danych oferowanych przez program
MSAccess97, program służący do wprowadzania danych do bazy napisano od początku w
języku Borland Delphi 3.0 (z bazą danych komunikuje się przez sterownik BDE 4.51).
Widok głównego ekranu tego programu przedstawiono na rysunku 4.4.
Jak widać program ten prezentuje wszystkie pola dotyczące danego wariantu na
jednym ekranie, co ułatwia skoordynowane wprowadzanie informacji. W celu zapewnienia
jednorodności danych niektóre pola (np. dotyczące fenotypu) wypełniane są w postaci
rozwijanych list. Program obsługuje mechanizm schowka, co pozwala przenosić dane
tekstowe z innych aplikacji. Posługując się tym narzędziem wprawny annotator jest w stanie
wprowadzić do bazy danych kilkadziesiąt zapisów w ciągu dnia roboczego.
4.2.3. Zawartość bazy danych wariantów sekwencji mtDNA grzybów
Posługując się opisanymi powyżej narzędziami wprowadzono do bazy danych
informacje dotyczące 348 wariantów wykazujących w sumie 465 różnych zmian (variation
events). Wprowadzone dotychczas dane obejmują wyłącznie warianty mtDNA S. cerevisiae
jako mające największe znaczenie dla badań nad genetyką mitochondrialną. Szacuje się, że
do wprowadzenia pozostaje nie więcej, niż 50 wariantów. Zaledwie 9 spośród
wprowadzonych wariantów było wcześniej dostępne w pierwotnych bankach danych,
pozostałe są po raz pierwszy zebrane w postaci bazy danych, a pochodzą z 93
publikowanych artykułów oraz komunikacji ustnych.
Spośród 465 zmian 410 odpowiada mutacjom zaś 55 neutralnym fenotypowo
polimorfizmom. Warto tu jednak wspomnieć, ze przy wprowadzaniu danych większą uwagę
zwracano na zmienność w obszarach genów, wysoce polimorficzne obszary międzygenowe
pozostały częściowo poza zasięgiem analizy. W tabeli 4.2 przedstawiono ilość wariantów
opisanych dla każdego z genów.
Gen
atp6
atp8
atp9
cox1
cox2
cox3
cytb
rrnL (LSU)
rrnS (SSU)
var1
tRNA (razem)
ilość wariantów
7
5
20
76
31
28
145
12
4
6
14
Rozdział 4.2. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Wyniki
Σ
135
348
Tabela 4.2. Liczba wariantów w bazie zmienności mtDNA S. cerevisiae według genów
Opisano 34 różne fenotypy, uproszczone podsumowanie najważniejszych kategorii
zawarto w tabeli 4.3
Fenotyp
oporności na antybiotyki
niewydolność oddechowa
supresory wewnątrzgenowe
defekty wycinania intronów
zmiany mobilności intronów
zmiany translacji
termowrażliwość
ilość wariantów
48
172
102
76
13
12
23
Tabela 4.3. Liczba wariantów w bazie zmienności mtDNA S. cerevisiae według ogólnych klas fenotypów. Zakresy
niektórych klas pokrywają się, np. większość mutantów wykazujących defekty wycinania intronów jest niewydolna
oddechowo.
W kategorii mutantów opornych na antybiotyki wyróżniono oporności na 13 różnych
antybiotyków. Defekty wycinaia intronów obejmują zarówno mutacje w genach maturaz ,
jak i mutacje w sekwencjach RNA istotnych dla tego procesu. Zmiany mobilności intronów
związane są z mutacjami w genach endonukleaz intronowych.
50 spośród 348 przeanalizowanych wariantów powstało w wyniku mutagenezy in
vitro i transformacji balistycznej. Syntetyczne warianty występują w genach cytb, cox1, cox2
i cox3.
Przedstawione powyżej podsumowania to tylko niektóre przykłady zastosowania
stworzonej bazy danych do analizy wariantów mtDNA. Elastyczność struktury relacyjnej
bazy danych
pozwala na konstruowanie dowolnych
kryteriów wyszukiwania i
podsumowania odpowiadających konkretnym celom badawczym.
Rozdział 4.3. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Dyskusja
136
4.3. Dyskusja i podsumowanie
Baza danych MitBASE jest zintegrowaną bazą danych sekwencji mitochondrialnych.
W tym zakresie stanowi ona znaczny postęp względem istniejących dotychczas banków
danych sekwencji oraz baz danych takich, jak GOBASE. Dane dotyczące sekwencji są w niej
starannie zweryfikowane przez specjalistów i ujednolicone pod względem formatu i
struktury. Baza ta jest zrealizowana w postanci relacyjnej, przy wykorzystaniu systemu
ORACLE, co
stwarza
możliwości nieomal
nieograniczonego
tworzenia
zapytań
analizujących zgromadzone w niej dane. W ramach przedstawionej pracy wprowadzono do
MitBASE dane dotyczące sekwencji mtDNA grzybów, opracowując w tym celu jednolitą
strukture danych.
Dostępne wcześniej w pierwotnych bankach danych (EMBL, GenBank) sekwencje
zostały gruntownie sprawdzone i ujednolicone pod względem formatu zapisu istotnych
biologicznie informacji. Dodatkowo wprowadzono wiele dodatkowych danych dotyczących
specyficznych cech sekwencji mtDNA, np. występowania genów wewnątrzintronowych, ich
funkcji i nazewnictwa.
Ponadto MitBASE jest pierwszą dotychczas bazą danych uwzględniającą na taką
skalę sekwencje wariantów, czyli naturalną bądź indukowaną zmienność w mtDNA. Jest ona
jedyną istniejącą bazą integrującą dane dotyczące zmienności genetycznej mtDNA człowieka
i organizmów modelowych, a zwłaszcza drożdży S. cerevisiae – najważniejszego organizmu
modelowego genetyki mitochondrialnej. Stwarza to możliwości przeniesienia informacji
zdobytych w układzie modelowym na geny ludzkiego mtDNA, co niesie za sobą daleko
idące konsekwencje odnośnie badania mechanizmów patologii związanych z mutacjami w
ludzkim mtDNA. Uliniowanie sekwencji genów mitochondrialnych drożdży i człowieka,
przy zasadniczym zachowaniu w ewolucji funkcji kodowanych przez nie białek, może
pomóc odnieść dobrze ugruntowaną empirycznie wiedze dotyczącą fenotypowych efektów
zmian w genach mitochondrialnych drożdży (u których relacja genotyp-fenotyp jest
stosunkowo jasno zarysowana) do zmian w homologicznych pozycjach tych genów u
człowieka. Stworzenie takich uliniowań jest w planach dalszego rozwoju projektu MitBASE.
Już teraz zgromadzenie dostępnych informacji w postaci relacyjnej bazy danych
ogromnie ułatwia analizę wyników prowadzonych od ponad dwudziestu lat badań nad
zmiennością mtDNA u grzybów, a zwłaszcza drożdży S. cerevisiae. Gruntowna analiza
opublikowanych na przestrzeni tych lat prac pozwoliła na wprowadzenie do bazy danych
informacji o ponad 300 wariantach sekwencyjnych. Stanowi to większość danych dostepnych
w postaci sekwencji i około 1/3 wariantów opisanych metodami genetyki klasycznej.
Rozdział 4.3. Baza danych o sekwencjach mitochondrialnych. Dyskusja
137
Oczywiście pamiętać należy, że gęstość występowania opisanych zmian w sekwencji
odzwierciedla przede wszystkim mapę zainteresowań badaczy pracujących nad genami
mitochondrialnymi. Nie dziwi zatem tak duza ilość danych zgromadzonych na temat genu
cytb, będacego przedmiotem bardzo starannej analizy mutacyjnej, która doprowadziła do
stworzenia modelu strukturalnego kodowanego przezeń białka (di Rago i wsp., 1990a,b,c).
Podobnie znaczna ilość wariantów wykazujących zaburzenia w procesach wyciania intronów
jest świadectwem szcególnego zainteresowania tym szczególnym mechanizmem ekspresji
genów mitochondrialnych.
Udostępnienie danych dotyczących wariantów w sekwencjach mtDNA grzybów w
postaci relacyjnej bazy danych (wraz ze stworzeniem narzędzi informatycznych dla
wprowadzania i analizy takich danych) jest głównym, ale nie jednynym wkładem projektu
MitBASE do wiedzy na temat genetyki mitochondrialnej grzybów (osiagnięcia innych
zespołów, pracujących nad sekwencjami innych grup taksonomicznych nie będą tu
omawiane). Równie istotne jest ujednolicenie formatu informacji dostepnej w pierwotnych
bankach danych oraz ich weryfikacja.
W wyniku przeprowadzonych prac udostepniono spolecznosci naukowej narzędzie
dostępu i analizy sprawdzonych i uzupełnionych danych dotyczących genetyki
mitochondrialnej grzybów. Odniesienie tych danych do zagadnień związanych z genetyką
mitochondrialną innych, trudniejszych w badaniu organizmów, w tym człowieka jest w tym
momencie kwestią zastosowania standardowych metod bioinformatyki (uliniowania
sekwencji). Dzięki temu wieloletnie badania nad organizmami modelowymi (głównie S.
cerevisiae) będą mogły spełnić swą podstawową rolę – poszerzenia wiedzy dotyczącej
całego świata ożywionego, a zwłaszcza człowieka, ze wszystkimi wypływającymi z tego
mozliwościami zastosowań, np. w medycynie molekularnej.
138
Podsumowanie wyników
W trakcie przedstawionych w rozdziałach 2, 3 i 4 badań uzyskano następujące
zasadnicze wyniki:
Na podstawie analizy in silico sekwencji ortologów genu SUV3 różnych Eukaryota
stwierdzono, że białka suv3 tworzą odrębną, silnie konserwowaną podrodzinę helikaz
RNA powszechną u wszystkich Eukaryota. Produkt genu SUV3 drożdży wchodzi w
skład mitochondrialnego degradosomu – kompleksu regulującego stabilność RNA.
Analizując fenotypy szczepów S. cerevisiae niosących dysrupcję genu SUV3
stwierdzono, że jego aktywność jest niezbędna dla utrzymania stabilności zawierających
introny alleli genów cytb i cox1, przy czym efekt ten nie zależy od obecności
konkretnego intronu, lecz jest kumulatywnie związany z ich liczbą. Stwierdzono, że rola
genu SUV3 w ekspresji genów mitochondrialnych ma charakter ogólny i jest zachowana
między dwoma gatunkami: S. cerevisiae i S. douglasii. Koncepcję tą wspierają też
wyniki analizy porównawczeją sekwencji genów SUV3 między tymi gatunkami oraz
fakt, że są one funkcjonalnie zamienne.
Skonstruowano metodą transformacji balistycznej nowy genom mitochondrialny S.
cerevisiae, w którym ekspresji ulega gen RIP1 normalnie kodowany przez genom
jądrowy. Jest to pierwszy układ w którym jakiegokolwiek gen jądrowy kodujący element
łańcucha oddechowego został przeniesiony do mtDNA.
W ramach międzynarodowego projektu MitBASE stworzono bazę danych sekwencji
mitochondrialnych grzybów, w tym, po raz pierwszy, wariantów sekwencyjnych S.
cerevisiae.
Uzyskane wyniki weszły w skład następujących publikacji:
Attimonelli, M., Altamura, N., Benne, R., Boyen, C., Brennicke, A., Carone, A., Cooper, J.M., D'Elia, D.,
de Montalvo, A., de Pinto, B., De Robertis, M., Golik, P., Grienenberger, J.M., Knoop, V., Lanave, C.,
Lazowska, J., Lemagnen, A., Malladi, B.S., Memeo, F., Monnerot, M., Pilbout, S., Schapira, A.H.V.,
Sloof, P., Slonimski, P.P., Stevens, K., Saccone, C. (1999). MitBASE: a comprehensive and integrated
mitochondrial DNA database. Nucleic Acids Res. 27, 128-133.
Dmochowska, A., Stankiewicz, P., Golik, P., Stepien, P.P., Bocian, E., Hansmann, I., Bartnik, E. (1999).
Assignment of SUPV3L1 to human chromosome band 10q22.1 by in situ hybridization. Cytogenet.Cell
Genet. , w druku
Dmochowska, A., Golik, P., Stepien, P.P. (1995). The novel nuclear gene DSS-1 of Saccharomyces
cerevisiae is necessary for mitochondrial biogenesis. Curr.Genet. 28, 108-112.
139
Dziembowski, A., Malewicz, M., Minczuk, M., Golik, P., Dmochowska, A., Stepien, P.P. (1998). The
yeast nuclear gene DSS1, which codes for a putative RNase II, is necessary for the function of the
mitochondrial degradosome in processing and turnover of RNA. Mol.Gen.Genet. 260, 108-114.
Golik, P., Szczepanek, T., Bartnik, E., Stepien, P.P., Lazowska, J. (1995). The S. cerevisiae nuclear gene
SUV3 encoding a putative RNA helicase is necessary for the stability of mitochondrial transcripts
containing multiple introns. Curr.Genet. 28, 217-224.
Wyniki opisane w rozdziałach 2.3 i 3 są przygotowywane do publikacji w postaci
manuskryptów.
Część V.
Materiały i metody
Rozdział 5. Materiały i metody
141
5.1. Podłoża i hodowle
Bakterie Escherichia coli hodowano na standardowych podłożach pełnych (LB) i
minimalnych (M9) (Sambrook i wsp., 1989). Uzupełnienia: ampicylina do 50µg/ml. Bakterie
hodowano w temperaturze 37°C.
Do hodowli drożdży wykorzystano nastepujące podłoża:
YPGA – 1% yeast extract, 1% bactopeptone, 2% glukoza, adenina 20µg/ml.
YPGalA – jak YPGA, tylko 2% galaktoza zamiast glukozy.
YP10 – jak YPGA, ale glukoza w stężeniu 10%.
N3 – 1% yeast extract, 1% bactopeptone, 2% glicerol, fosforan sodowy 0.05M pH 6.25.
N3E – jak N3 + 1% etanol.
W0 – 0.67% yeast nitrogen base bez aminokwasów (Difco), 2% glukoza.
W0transf – jak W0 + 0,75M sorbitol + 0,75M mannitol – podłoże używane do transformacji
balistycznej
Uzupełnienia do podłóż minimalnych w stężeniu końcowym 20µg/ml, z wyjątkiem
histydyny – 10µg/ml.
SP1 – 0.25 yeast extract, 0.1%glukoza, 0.1M octan potasu bezwodny, pH 6.9
płyn Ringera: 60mM NaCl
Podłoża stałe zawierały dodatkowo 2.5% agaru (3.2% podłoże W0).
Drożdże hodowano w temperaturze 30°C lub 28°C, w sposób opisany przez Dujardin i wsp.
(1980) oraz Rose i wsp. (1990).
5.2. Szczepy
Do manipulacji związanych z klonowaniem i namnażaniem DNA w bakteriach
wykorzystywano szczepy Escherichia coli:
XL-1-Blue: F' Tn10 proA+B+ lacIq 6lacZ M15 recA1 endA1 gyrA9 (NalR) thi hsdR17 (rKmK+) supE44 relA1 lac
DH5αF' (F'/endA1 hsdR17(rk-mk-) supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacIZYA-argF)
U169 deoR (80dlac(lacZ)M15))
KC8 (hsdR, leuB600, trpC9830, pyrF::Tn5, hisB463, lacDX74, strA, galU,K)
Szczepy drożdży używane w przedstawionych doświadczeniach podsumowano w
tabeli 5.1.
Genotyp
Nazwa
jądrowy
mitochondrialny
źródło
Rozdział 5. Materiały i metody
BWG/PG1
142
S. cerevisiae MAT a, his1, ade1, leu2, ura3
+ (13i 777-3A)1
BWG i
–“–
+ i
BWG i +
–“–
+ i +
SDB9 i
SDB9 i +
S. cerevisiae MAT a, his1, ade1, leu2, ura3, suB9,
suv3::URA3
SDB9/PG1
SDB9/PG2
SDB9/PG3
SDB9/PG4
SDB9/PG5
SDB9/PG6
SDB9/PG7
KxNO41
i
+
–“–
–“–
+ i +
–“–
–“–
–“–
–“–
–“–
–“–
+i ai2,ai3,ai5
S. cerevisiae MAT Kar1-1, trp5, his4, ade6
i ai1
+
i bi1,bi2
+
+i bi1, bi2, bi3
+i bi+
+i bi4, bi5
+i ai+,bi+
0
CKPG1
–“–
+i ai1
CKPG2
–“–
–“–
–“–
–“–
–“–
–“–
+i ai2,ai3,ai5
CKPG3
CKPG4
CKPG5
CKPG6
CKPG7
i bi1,bi2
+
+i bi1, bi2, bi3
+i bi+
+i bi4, bi5
+i ai+,bi+
S. cerevisiae MAT a, his1, ade1, leu2, ura3,
suv3::URA3
ρ0/ ρ-
SUV3-1 i
S. cerevisiae MAT , ura3, trp, SUV3-1
+ i +
4707-22D
S. douglasii MAT aaa, HO, GAL, SUC, mal, MG,
his4, ura3, ade1, leu2
S. douglasii MAT aaa, HO, GAL, SUC, mal, MG,
his4, ura3, ade1, leu2, suv3::URA3
+
ΔSUV
ΔSUV i
SPG1
–“–
SPG1/50
4795-3B'
–“–
S. douglasii MAT , HO, GAL, SUC, mal, MG,
ura1, met1, ade2, leu1, aro7
+ i
ρ0/ ρ-
Stepien i
wsp., 1995
–“–
Golik i
wsp., 1995
–“–
–“–
–“–
–“–
–“–
–“–
Stepien i
wsp., 1995
Golik i
wsp., 1995
–“–
–“–
–“–
–“–
–“–
–“–
Stepien i
wsp., 1992
Dziembowski i wsp.,
1998
Stepien i
wsp., 1995
Herbert i
wsp., 1988a
rozdział 2.3
–“–
+
Herbert i
wsp., 1988a
rozdział 2.3
–“–
0
4795-3B'/
–“–
+ i
KM91
S. cerevisiae, MATa/
+ (13i 777-3A)1
C51110
S. cerevisiae, MAT a, Kar1-1, leu1
+i ai1
–“–
–“–
0
4795-3B'/50
CK5112/1
Golik i
wsp., 1995
Stepien i
wsp., 1995
+i ai2,ai3,ai5
ST9/7-1
S. cerevisiae, MAT a, leu1
+i bi1,bi2
ST13-13
S. cerevisiae, MAT a, lys2, his3
+i bi1, bi2, bi3
Herbert i
wsp., 1988a
Lazowska i
wsp., 1994
Szczepanek
i wsp. 1994
Golik i
wsp., 1995
–“–
Rozdział 5. Materiały i metody
143
ST3-2
S. cerevisiae, MAT a, leu1, his3
+i bi+
ST6/1-1
S. cerevisiae, MAT a, his3
+i bi4, bi5
YL15/5-3
S. cerevisiae, MAT a, leu
+i ai+,bi+
TF145
S. cerevisiae, MAT , ade2, ura3
+, cox2
JC8/55
S. cerevisiae, MAT a, Kar1-1, leu1
0
CKTF145
W303-1B/A/50
–“–
0
–“–
Fox i wsp.,
1988
Conde i
Fink, 1976
rozdział 3.2
TST19
–“–
– synt. pYPG09
Bonnefoy i
wsp., 1994
rozdział 3.2
TST23
–“–
– synt. pYPG10
–“–
+ (13i 777-3A)1
0
Bousquet i
wsp., 1990
rozdział 3.2
CK 50-A/1
CK 50-A/1/50
S. cerevisiae, MATa ade2, ura3, trp1, leu2, his3
+, cox2
Szczepanek
i wsp. 1994
Golik i
wsp., 1995
S. cerevisiae MAT , Kar1-1, leu2, trp1, tyr6, phe
canR
–“–
CKPG3
–“–
– synt. pYPG09
rozdział 3.2
CTST23
–“–
– synt. pYPG10
rozdział 3.2
+
JPJ1
CKPG30
–“–
– synt. pYPG09
Beckmann i
wsp., 1989
dr J.P. di
Rago
rozdział 3.2
CKPG31
–“–
– synt. pYPG10
–“–
+ (13i) 777-3A1
dr GuoLiang Tian
rozdział 3.2
JPJ1/51
RGLT1
RPG1
S. cerevisiae, MATa ade2, ura3, trp1, his3,
rip1::LEU2
–“–
S. cerevisiae, MAT, ade2, ura3, trp1, his3,
rip1::LEU2
–“–
0
+ (8i) D273-10B1
RPG2
–“–
+ S. capensis
–“–
RPG3
–“–
+ (13i 777-3A)1
–“–
RJL1
–“–
+i ai1
–“–
RLJ2
–“–
+i ai2
–“–
RJL3
–“–
+i bi+
–“–
RLJ5
–“–
+ S. douglasii2
–“–
RJL6
–“–
+ (13i KL14-4A)1
–“–
CGL101
–“–
+i
dr GuoLiang Tian
rozdział 3.2
– synt. pYPG09
++ (13i 777-3A)1,3
–“–
RR1
+ (13i 777-3A)
+cox1::RIP1m4
–“–
–“–
RR2
+ S. capensis
+cox1::RIP1m4
1
W nawiasie liczba intronów i nazwa szczepu, od którego pochodzi mtDNA
2
Genom szczepu KS158, nie zawierający pierwszego intronu cox1
3
Szczep heteroplazmatyczny
4
Szczep, w którym nastapiła integracja genu RIP1 otoczonego flankami genu cox1 pochodzącego z plazmidu
pYPG10 do genomu mitochondrialnego
DR3
S. cerevisiae, MATa/, ade2, ura3, trp1, his3,
rip1::LEU2
–“–
Rozdział 5. Materiały i metody
144
Tabela 5.1. Szczepy drożdży. Zapis i oznacza bezintronowy mtDNA (Séraphin i wsp., 1987), poza wymienionymi w
genotypach intronami pozostałych brak. Zapis ai+ i bi+ oznacza szczep zawierający komplet intronów „długiego”
allelu odpowiednio cox1 i cytb. Przy szczepach skonstruowanych na potrzeby tej pracy podano numer rozdziału,
wszystkie szczepy opisane w pracy Golik i wsp., (1995) są też wspomniane w rozdziale 2.2.
5.3. Plazmidy i oligonukleotydy
Opisy standardowych wektorów używanych do klonowania pominieto. Plazmidy
pYPG01 do pYPG10 opisano szczegółowo w rozdziale 3.2 (rysunek 3.2). Plazmidy pSSD2,
pSSD3 i pYPG14 opisano szczegółowo w rozdziale 2.3.2 na rysunku 2.11. Plazmidy
pYPG15 i pDIS8 opisano szczegółowo w rozdziale 2.3.2 na rysunku 2.14. Pozostałe
plazmidy przedstawiono w tabeli 5.2. Opisy standardowych wektorów używanych do
klonowania pominieto.
Nazwa
pYGT19
pYGT21
pYJL17
pYJL25
pYJL12
ai1
pYJL24
pYGT46’
pSCM511
pSCM641
pJM2
YCplac111
pJJ244
pYPG18
pYPG19
pYGT37
pYGT7
Opis
Sonda egzonowa cytb. Fragment ~1kb mtDNA szczepu
bezintronowego w wektorze pUC13
Sonda egzonowa cox1. Fragment ~2kb mtDNA szczepu
bezintronowego w wektorze pUC13
Sonda egzonowa cox1. Fragment mtDNA S. douglasii (drugi egzon
cytb) w wektorze pBR322.
Sonda SSU-RNA. Fragment ~2kb mtDNA 777-3A w wektorze
pUC19.
Sonda bi1.
Sonda ai1. Fragment 766 bp w wektorze pUC13.
Sonda ai5. Fragment 933 bp w wektorze pUC13.
Fragment XbaI 4,8 kb 3’ genu cox1 w wektorze pUC13.
Sonda egzonowa LSU-rRNA.
Sonda intronowa .
Gen cox2 w wektorze pTZ18u.
Wektor bifunkcjonalny ARS-CEN-LEU2.
Kaseta URA3 w wektorze pUC18.
Gen SUV3 S. cerevisiae we fragmencie BamHI o długości około 5 kb
w wektorze YCplac111
Gen SUV3 S. douglasii we fragmencie o długości około 2,4 kb w
wektorze YCplac111
ORF RIP1 w wektorze pUC13.
Sonda atp8-atp6. Fragment ~1,5 kb XbaI-AccI w wektorze pUC13
obejmujący 3’ część atp8, obszar międzygenowy i atp6.
Źródło
Szczepanek i
Łazowska, 1996
dr Guo-Liang Tian
Tian i wsp., 1991a
–“–
Lazowska i wsp., 1989
Lazowska i wsp., 1994
dr J. Łazowska
dr Guo-Liang Tian
Jacquier i Dujon, 1983
–“–
Mulero i Fox, 1993
Gietz i Sugino, 1988
Jones i Prakash, 1990
rozdział 2.3.2.
–“–
rozdział 3.2.
dr Guo-Liang Tian
Tabela 5.2. Konstrukcje plazmidowe użyte w opisanych doświadczeniach.
W tabeli 5.3. przedstawiono użyte w pracy syntetyczne oligonukleotydy. Znak „*”
przy końcu 5’ oznacza, że oligonukleotyd jest ufosforylowany.
Nazwa
L1
R
DL
DR
SUV3DOU1
SUV3DOU2
Sekwencja (5'-3')
CGTTAAGACTGCTAGCAAGG
AACGCAACGACGCAATCTCC
TTGGTTGATCACGTTGAATA
TCAAGGTTATCTCTGAATAA
ACTGGAATACATCTAATT
GTAATTTAATTTCACTGC
Rozdział 5. Materiały i metody
SUV3DOU3
SUV3DOU4
SUV3DOU5
SUV3DOU6
SUV3DOU7
SUV3DOU8
p168
p169
p170
p171
p172
p25
p250
145
TCAGGTGCAATTTGCTGA
TTGTGGTGAGAAGAGTGT
GGTGAAGAACTAATGGAA
AGATTGCGTCGTTGCGTT
CTGACAACCTGTTCACGT
CTGGCTCAGTAACAGGTA
*TGTTGGTTAAGTTTTAAAATTTAATTATTTAC
*GTAAATAATTAAATCTAGAAACTTAAGATTG
*CTTTGTACCATATGTACTTTTTTTTTATA
*TAAAAAAAAAGTAAAAATGTTAGGAA
TAATAGGATTATATTAGTA
GGCGTTAGCTAAGGCAACACC
GCGTCGACTATGTATTATCAATGGGT
Tabela 5.3. Syntetyczne oligonukleotydy uzyte w opisanych doświadczeniach.
Oprócz tego wykorzystywano uniwersalne startery do sekwencjonowania z zestawów
Sequenase 2.0 i ThermoSequenase (Amersham) opisane w materiałach producenta.
5.4. Metody
5.4.1. Techniki genetyki klasycznej
Podstawowe manipulacje genetyczne opisano w pracach Dujardin i wsp. (1980) oraz
Rose i wsp. (1990). Krzyżówki prowadzono nakraplając krople płynnych hodowli
krzyżowanych szczepów na podłoże stałe a następnie replikując na odpowiednie podłoże
selekcyjne lub izolując zygoty metodą mikromanipulacji.
Izolację zygot i analizę tetrad przeprowadzano przy użyciu mikromanipulatora Singer
MSM System, zgodnie ze wskazówkami producenta.
Kontrolę obecności mtDNA + przeprowadzano krzyżując badany szczep z testerem
0 o dzikim genotypie jądrowym i analizując fenotyp uzyskanych diploidów na podłozu z
niefermentowalnym źródłem węgla.
Krzywe wzrostowe badanych szczepów wyznaczano nastepująco: 10 jednostek Kletta
hodowli w fazie stacjonarnej danego szczepu dodawano do 10 ml podłoża płynnego N3E w
odpowiednim naczyniu. Hodowlę prowadzono w temp. 28 C z wytrząsaniem odcztując
gęstość przy uzyciu fotokolorymetru Klett-Summerson z filtrem czerwonym KS66 wobec
ślepej próby (podłoże N3E).
Dla wartości mniejszych niż 45 jednostek Kletta wynik ostateczny równy jest
zmierzonemu, dla wyższych wartości należy uwzględnić poprawkę według wzoru:
Rozdział 5. Materiały i metody
146
vr vo 0.00265vo 0.8834
gdzie vr to wartość rzeczywista a vo wartość zmierzona.
Po uwzględnieniu poprawki wartość wyrażona w jednoskach Kletta jest liniowo
zależna od gęstości hodowli.
Konwersję szczepów do formy 0 uzyskiwano hodując je przez dwa dni w podłożu
płynnym YP10 zawierającym 0,1M bufor fosforanowy o pH 6,25 i 40 g/ml bromku
etydyny (hodowla chroniona przed światłem). Po dwóch dniach 0,2 ml takiej hodowli
ponownie zaszczepiano i hodowano w podłożu jak wyżej. Po 3-4 pasażach hodowla zawiera
100% komórek 0.
Metoda cytodukcji umożliwia przeprowadzenie danego genomu mitochondrialnego
ze szczepu dawcy w kontekst jądrowy szczepu biorcy. W metodzie tej wykorzystywana jest
mutacja Kar1-1 (Conde i Fink, 1976), której efektem jest opóźnienie i częściowe
zablokowanie kariogamii w procesie płciowym drożdży. Umożliwia to otrzymanie, poprzez
krzyżówkę dwóch szczepów heterokarionu, w którym zachodzi fuzja komórek i wymieszanie
zawartości cytoplazmy bez kariogamii i powstania diploida. Podział takiego heterokarionu
daje w efekcie wyjściowe szczepy haploidalne, w których zaszła wymiana zawartości
cytoplazmy, a więc i mitochondriów wraz z ich DNA.
Aby w praktyce przeprowadzić cytodukcję mtDNA szczepu dawcy do szczepu biorcy
należy spełnić następujące warunki:
1
Co najmniej jeden ze szczepów powinien mieć mutację Kar1-1.
1
Szczep biorcy powinien być pozbawiony mtDNA (10) aby uniknąć rekombinacji z
mtDNA dawcy.
1
Szczep dawcy powinien w genotypie jądrowym zawierać co najmniej jeden marker
auksotroficzny, którego nie ma w genotypie biorcy – pozwala to na wyeliminowanie po
krzyżówce komórek szczepu dawcy. Jeżeli warunku tego nie można spełnić należy wówczas
przeprowadzać pełne testy auksotroficzne potomstwa krzyżówki, szczepy dawcy i biorcy
muszą jednak różnić się pod względem jakichś markerów.
Jeżeli warunki te są spełnione typowa cytodukcja przebiega następująco: krzyżuje się
szczepy dawcy i biorcy, następnie eliminuje z potomstwa komórki dawcy (przez selekcję
auksotroficzną) i (poprzez repliki na odpowiednie podłoża selekcyjne) wyróżnia w
potomstwie klasę diploidów (poprzez komplementację markerów dawcy i biorcy), komórek
biorcy (10) i właściwych cytoduktantów — komórek biorcy (1+). Jeżeli genom (1+) nie
funkcjonuje w kontekście biorcy (niewydolność oddechowa) należy jego obecność wykryć
poprzez krzyżówkę z odpowiednim testerem (10), jak opisano powyżej.
Rozdział 5. Materiały i metody
147
5.4.2. Transformacja
Bakterie transformowano przy użyciu metody wapniowej według Sambrook i wsp.
(1989), lub przez elektroporację. Rutynową transformację S. cerevisiae prowadzono metodą
jednoetapową według Chen’a i wsp. (1992). S. douglasii transformowano wysokowydajną
metodą Gietz’a i Schiestl’a (1995).
Transformację balistyczną mitochondriów drożdży prowadzono metodą opisaną przez
Szczepanka i Łazowską (1996) w sposób następujący:
30 g plazmidu i 5 g kotransformującego wektora YEp352 stracano etanolem, płukano
70% etanolem i zawieszano w 10 l wody
dodawano 50 l zawiesiny 60 mg/ml kulek złota (1.0 m, BioRad) i mieszano
(worteks) przez 1 minutę
następnie dodawano 50 l 2,5M CaCl2, miejszano jak wyżej, dodawano 10 l 0,1M
spermidyny i mieszano j.w.
przepłukiwano kulki absolutnym etanolem i zawieszano w 50 l abs. etanolu
10 l zawiesiny używano w pojedynczej transformacji przy użyciu aparatu PDS-1000/He
System (BioRad) według wskazówek producenta
transformanty hodowano na podłozu WO transf z odpowiednimi uzupełnieniami
pozbawionym uracylu przez 6 dni w 28 C, po czym replikowano transformanty i
poddawano dalszym testow, opisanym w rozdziale 3.1.4.
5.4.3. Techniki molekularne
Standardowe techniki klonowania molekularnego, izolacji i analizy DNA stosowano
według Sambrook i wsp. (1989), Rose i wsp. (1990) oraz wskazówek producentów
uzywanych enzymów (New England Biolabs, Boehringer-Mannheim, Fermentas, Gibco
BRL).
Sekwencjonowanie prowadzono metodą Sangera przy użyciu zestawów Sequenase
2.0 i ThermoSequenase (Amersham) według wskazówek producenta.
PCR prowadzono w termocyklerach PerkinElmer GenAmp 9600 lub MJ Research
PTC200 przy użyciu polimerazy Taq (Promega, Appligene), Vent (New England Biolabs)
lub Pfu (Amersham). Polimerazę Pfu stosowanow celu uzyskania wysokiej wierności
amplifikacji, np. przy klonowaniu. Skład mieszaniny reakcyjnej według wskazań
producentów enzymów.
Rozdział 5. Materiały i metody
148
Izolację RNA i hybrydyzację typu Northern prowadzono przy użyciu metod
opisanych przez Labouesse i wsp. (1984), Szczepanka i Łazowską (1996) oraz Sambrook i
wsp. (1989). Do izolacji RNA stosowano odczynnik TriReagent (MRC) według wskazań
producenta.
W celu przeprowadzenia mutagenezy ukierunkowanej przy użyciu syntetycznych
oligonukleotydów
mutagenizowaną
wstawkę
przeklonowywano
przy
zastosowaniu
standardowych technik do wektora fagowego M13mp18 lub M13mp19. Tak uzyskane
konstrukty mutagenizowano przy użyciu zestawu Mut-a-Gene firmy BioRad według
instrukcji producenta. Uzyskaną mutacje potwierdzano przez sekwencjonowanie, po czym
wstawke przeklonowywano do odpowiedniego wektora.
Widma cytochromowe badanych szczepów uzyskiwano metodą opisaną przez
Claisse’a i wsp., (1970). Badane szczepy hodowano 3-4 dni na podłożu stałym YPGalA.
Wysuszoną pastę komórek redukowano podsiarczynem sodu i umieszczano w szczelinie
kiuwety pomiarowej, która następnie zanurzano w ciekłym azocie. W trakcie pomiaru
kiuweta umieszczona była w naczyniu Dewara z kilkoma ml ciekłego azotu na dnie.
Widmo rejestrowano przy pomocy spektrofotometru Cary 219 (Varian) w zakresie
630-490nm. Aby zrównoważyć układ optyczny konieczne było umieszczenie w wiązce
odniesienia filtru neutralnego o gęstości 3 jednostki absorbancji (D=3.0).
W widmie identyifkowano maksima cytochromów i wyznaczano ich wysokość
według wzorca przedstawionego na ryunku 5.1.
Na podstawie wyznaczonych maksimów (oznaczonych A1, A2, A3 i A4 na rysunku
5.1) szacowano stosunki ilościowe cytochromów metodą opisaną przez di Rago i wsp.
(1990b). Dla porównania względnych zawartości poszczególnych cytochromów wyznaczano
następujące współczynniki:
b/c = A3/A1 - F,
aa3/c = A4/A1,
gdzie F jest poprawką wynoszącą 0.126
Druga metoda ilościowego opracowania widm wykorzystuje układ równań w
postaci macierzy: (J.P. di Rago – informacja nieopublikowana)
i11 X 1
i12 X 2
i13 X 3
A1
i 21 X 1
i22 X 2
i23 X 3
A2
i 31 X 1
i32 X 2
i33 X 3
A3
Gdzie X1, X2, X3 to odpowiednio zawartości cytochromu c, c1 i b. Współczynniki inm są
empirycznymi wartościami wyznaczjącymi wpływ absorbcji m-tego maksimum na
Rozdział 5. Materiały i metody
149
absorbancję n-tego maksimum. Macierz wartości tych współczynników wyznaczona w
CGM, Gif-sur-Yvette jest następująca:
i11 1
i12 0. 52 i13 0.15
i 21 0 . 07 i22 1
i 31 0
i23 0. 34
i32 0. 12 i33 1
Powyższy ukłąd równań rozwiązano (przy użyciu programu Derive 2.06) w postaci
symbolicznej a następnie podstawiono wartości z macierzy współczynników otrzymując
następujące formuły:
X 1 1. 03802 A1 0 . 543254 A 2 0. 0290024 A 3
X 2 0 . 0757526 A 1 1. 08218 A 2 . 356578 A 3
X 3 0 . 00909031A 1 0.129861 A 2 1. 04278 A 3
Do porównań użyto następujących wskaźników:
c1/b = X2/X3,
b/c = X3/X1.
Rysunek 5.1. Wyznaczanie maksimów absorbcji cytochromów w widmie, na przykładzie widma szczepu dzikiego.
5.4.4. Metody bioinformatyczne
Podstawowe manipulacje danymi prowadzono przy zastosowaniu pakietu GCG
wersja 8.0 i 9.1 (Wisconsin Package Version 9.1, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc) pracującego pod kontrolą systemu Digital Unix lub Irix 5.2. Do uliniowania sekwencji wykorzystywano program ClustalW (Thompson i wsp., 1994), do prezentacji
wyników używano programu BOXSHADE. Do uliniowania domen homologii białek podobnuch do dss1p (rozdział 2.1.4, rysunek 2.4) użyto programu MACAW (Schuler i wsp.,
1991).
Jako wskaźnika podobieństwa sekwencji używano wartości Z (Z-score, Z-value)
obliczanego metodą opisaną przez Landes’a i wsp. (1992).
W analizach porównawczych wykorzystywano powszechnie dostepne banki danych
EMBL (Stoesser i wsp., 1998) i GenBank (Benson i wsp., 1998), stosując programy SRS
(Etzold i wsp., 1996) i Entrez (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/).
Do wyszukiwania sekwencji homologicznych w banku danych stosowano algorytm
BLAST
(Altschul
i
wsp.,
1997)
uruchamiany
zdalnie
na
serwersze
NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Przy porównywaniu sekwencji ORF genów S. cerevisiae i S. douglasii stosowano
program DIVERGE z pakietu GCG według metody Li (Li i wsp., 1985) z późniejszymi
modyfikacjami (Li, 1993, 1997; Pamilo i Bianchi, 1993). W celu porównywania sekwencji
ORF (obliczanie liczby tranzycji i transwersji, analiza kodonów cztrerokrotnie
zdegenerowanych) napisano program w języku Pascal (Hoare i Wirth, 1973) skompilowany
na komputerze PC (system MS-DOS) kompilatorem TurboPascal 6.0 (Borland Inc.). Kod
programu zamieszczono w dodatku A).
Przy konstrukcji relacyjnej bazy danych wariantów sekwencyjnych mtDNA grzybów
wykorzystano program MSAccess97 (Microsoft Corporation) w systemie Windows NT 4.0.
Aplikację służącą do wprowadzania danych do bazy napisano w języku Delphi 3.0 z
systemem obsługi baz danych BDE 4.51 (Borland Inc.).
Rozdział 5. Materiały i metody. Dodatek A
Dodatek A
Kod programu ORFS. Język TurboPascal 6.0. Program dostępny na życzenie u autora.
program orfs; {P. Golik 1998, Turbo Pascal 6.0}
type
triplet = array[1..3] of char;
const
maxlen = 10000;
nucleotides = ['A', 'C', 'G', 'T'];
purines = ['A','G'];
pyrimidines = ['C','T'];
var
orf1, orf2
file1, file2
name1, name2
length, i, r
codon_number
c
s, v, dif
aa_dif
s_m, r_m
f_s, f_v, f
codon1, codon2
codon3
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
array[1..maxlen] of char;
text;
string;
integer;
integer;
char;
integer;
integer;
integer;
integer;
triplet;
triplet;
function class(nuc:char):char; {purine/pyrimidine}
begin
if nuc in purines then class:='r' else class:='y';
end; {class}
function translate(codon:triplet):char; {translate codon to aa}
var
aa : char;
begin
if ((codon[1]='G') and (codon[2]='C')) then aa:='A';
if (((codon[1]='C') and (codon[2]='G')) or ((codon='AGA') or
(codon='AGG')))
then aa:='R';
if ((codon='AAC') or (codon='AAT')) then aa:='N';
if ((codon='GAC') or (codon='GAT')) then aa:='D';
if ((codon='TGC') or (codon='TGT')) then aa:='C';
if ((codon='CAA') or (codon='CAG')) then aa:='Q';
if ((codon='GAA') or (codon='GAG')) then aa:='E';
if ((codon[1]='G') and (codon[2]='G')) then aa:='G';
if ((codon='CAC') or (codon='CAT')) then aa:='H';
if ((codon='ATA') or (codon='ATC') or (codon='ATT')) then aa:='I';
if (((codon[1]='C') and (codon[2]='T')) or ((codon='TTA') or
(codon='TTG')))
then aa:='L';
if ((codon='AAA') or (codon ='AAG')) then aa:='K';
if codon='ATG' then aa:='M';
if ((codon='TTC') or (codon='TTT')) then aa:='F';
if ((codon[1]='C') and (codon[2]='C')) then aa:='P';
if (((codon[1]='T') and (codon[2]='C')) or ((codon='AGC') or
(codon='AGT')))
then aa:='S';
151
Rozdział 5. Materiały i metody. Dodatek A
if ((codon[1]='A') and (codon[2]='C')) then aa:='T';
if codon='TGG' then aa:='W';
if ((codon='TAC') or (codon='TAT')) then aa:='Y';
if ((codon[1]='G') and (codon[2]='T')) then aa:='V';
if ((codon='TAA') or (codon='TAG') or (codon='TGA')) then aa:='*';
translate:=aa;
end; {translate}
function family(codon:triplet):boolean; {is codon 4-fold degenerate}
begin
family:=false;
if ((codon[1]='G') and (codon[2]='C')) then family:=true; {A}
if ((codon[1]='G') and (codon[2]='G')) then family:=true; {G}
if ((codon[1]='C') and (codon[2]='C')) then family:=true; {P}
if ((codon[1]='A') and (codon[2]='C')) then family:=true; {T}
if ((codon[1]='G') and (codon[2]='T')) then family:=true; {V}
if ((codon[1]='C') and (codon[2]='G')) then family:=true; {R}
if ((codon[1]='C') and (codon[2]='T')) then family:=true; {L}
if ((codon[1]='T') and (codon[2]='C')) then family:=true; {S}
end; {family}
begin {main routine}
repeat
write('First sequence (plain ASCII): '); readln(name1);
assign(file1, name1);
{$I-} reset(file1) {$I+};
r:= ioresult;
if r <>0 then writeln('File ',name1,' not found!');
until r=0; {read the first sequence from ASCII input file}
i:=1;
while not eof(file1) do
{purge non-nucleotide characters}
begin
read(file1,c);
c:=upcase(c);
if c in nucleotides then begin orf1[i]:=c; i:=i+1; end;
end; {while}
length := i-1;
close(file1);
repeat
write('Second sequence (plain ASCII): '); readln(name2);
assign(file2, name2);
{$I-} reset(file2) {$I+};
r:=ioresult;
if r <>0 then writeln('File ',name2,' not found!');
until r=0; {read the 2nd sequence from ASCII input file}
i:=1;
while not eof(file2) do
{purge non-nucleotide characters}
begin
read(file2,c);
c:=upcase(c);
if c in nucleotides then begin orf2[i]:=c; i:=i+1 end;
end; {while}
close(file2);
s:=0;v:=0; dif:=0;
for i:=1 to length do
begin
if orf1[i]<>orf2[i] then {if mutation}
begin
dif:=dif+1; {transition (s) or transversion (v)}
if (class(orf1[i])=class(orf2[i])) then s:=s+1 else v:=v+1;
end; {count a change}
152
Rozdział 5. Materiały i metody. Dodatek A
end; {for loop}
codon_number:=length div 3;
writeln('Sequences ',name1, ' and ',name2,' ',length,' residues');
writeln(dif,' total substitutions');
writeln(s, ' transitions');
writeln(v, ' transversions');
i:=1; aa_dif:=0;
s_m:=0; r_m:=0;
f_s:=0; f_v:=0;f:=0;
repeat
for r:=0 to 2 do
begin
{read the codons from both ORFs}
codon1[r+1]:=orf1[r+i];
codon2[r+1]:=orf2[r+i];
end;
if ((family(codon1)) and (translate(codon1)=translate(codon2))) then
begin
{codon is 4-fold degenerate}
f:=f+1;
if codon1[3]<>codon2[3] then {mutation at 4-fold degenerate site}
begin
if (class(codon1[3])=class(codon2[3]))
then f_s:=f_s+1
{transition at 4-fold degenerate site}
else f_v:=f_v+1; {transversion at 4-fold degenerate site}
end;
end; {4-fold degenerate count}
if codon1<>codon2 then
{codons differ}
begin
if codon1[1]<>codon2[1] then {first position change}
begin
codon3[1]:=codon2[1];codon3[2]:=codon1[2];codon3[3]:=codon1[3];
if translate(codon1)<>translate(codon3) {is the change silent}
then r_m:=r_m+1 else s_m:=s_m+1;
end; {if}
if codon1[2]<>codon2[2] then
begin
codon3[1]:=codon1[1];codon3[2]:=codon2[2];codon3[3]:=codon1[3];
if translate(codon1)<>translate(codon3)
then r_m:=r_m+1 else s_m:=s_m+1;
end;
if codon1[3]<>codon2[3] then {third position change}
begin
codon3[1]:=codon1[1];codon3[2]:=codon1[2];codon3[3]:=codon2[3];
if translate(codon1)<>translate(codon3)
then r_m:=r_m+1 else s_m:=s_m+1;
end;
end;{codons changed}
i:=i+3;
if translate(codon1)<>translate(codon2) then aa_dif:=aa_dif+1;
until i>=length;
writeln('In ',f, ' family boxes ',f_s,' transitions and ',f_v,
' transversions');
writeln(codon_number,' codons, ',aa_dif, ' aa substitutions');
writeln(s_m,' silent mutations, ',r_m,' replacement mutations');
end.
153
Bibliografia
154
VI. Bibliografia
(1997). The yeast genome directory. Nature 387, 5
Ackerman, S.H., Tzagoloff, A. (1990). Identification of two nuclear genes (ATP11, ATP12) required for
assembly of the yeast F1-ATPase. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 4986-4990.
Adams, M.D., Kerlavage, A.R., Fleischmann, R.D., Fuldner, R.A., Bult, C.J., Lee, N.H., Kirkness, E.F.,
Weinstock, K.G., Gocayne, J.D., White, O. (1995). Initial assessment of human gene diversity and
expression patterns based upon 83 million nucleotides of cDNA sequence. Nature 377, 3-174.
Adjiri, A., Chanet, R., Mezard, C., Fabre, F. (1994). Sequence comparison of the ARG4 chromosomal regions
from the two related yeasts, Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces douglasii. Yeast 10, 309317.
Alberts, B. (1998). The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular
biologists. Cell 92, 291-294.
Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D.J. (1997). Gapped
BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res.
25, 3389-3402.
Anderson, S., Bankier, A.T., Barrell, B.G., de Bruijn, M.H., Coulson, A.R., Drouin, J., Eperon, I.C., Nierlich,
D.P., Roe, B.A., Sanger, F., Schreier, P.H., Smith, A.J., Staden, R., Young, I.G. (1981). Sequence and
organization of the human mitochondrial genome. Nature 290, 457-465.
Andersson, S.G., Kurland, C.G. (1998). Reductive evolution of resident genomes. Trends.Microbiol. 6, 263268.
Andersson, S.G., Zomorodipour, A., Andersson, J.O., Sicheritz-Ponten, T., Alsmark, U.C., Podowski, R.M.,
Naslund, A.K., Eriksson, A.S., Winkler, H.H., Kurland, C.G. (1998). The genome sequence of
Rickettsia prowazekii and the origin of mitochondria. Nature 396, 133-140.
Attimonelli, M., Altamura, N., Benne, R., Boyen, C., Brennicke, A., Carone, A., Cooper, J.M., D'Elia, D., de
Montalvo, A., de Pinto, B., De Robertis, M., Golik, P., Grienenberger, J.M., Knoop, V., Lanave, C.,
Lazowska, J., Lemagnen, A., Malladi, B.S., Memeo, F., Monnerot, M., Pilbout, S., Schapira, A.H.V.,
Sloof, P., Slonimski, P.P., Stevens, K., Saccone, C. (1999). MitBASE: a comprehensive and integrated
mitochondrial DNA database. Nucleic Acids Res. 27, 128-133.
Banroques, J., Delahodde, A., Jacq, C. (1986). A mitochondrial RNA maturase gene transferred to the yeast
nucleus can control mitochondrial mRNA splicing. Cell 46, 837-844.
Bibliografia
155
Banroques, J., Perea, J., Jacq, C. (1987). Efficient splicing of two yeast mitochondrial introns controlled by a
nuclear-encoded maturase. EMBO J. 6, 1085-1091.
Bartnik, E. (1997). Ludzki genom mitochondrialny - mutacje polimorfizmy i choroby. Post.Biologii Komórki
24, 69-75.
Beckmann, J.D., Ljungdahl, P.O., Lopez, J.L., Trumpower, B.L. (1987). Isolation and characterization of the
nuclear gene encoding the Rieske iron-sulfur protein (RIP1) from Saccharomyces cerevisiae.
J.Biol.Chem. 262, 8901-8909.
Beckmann, J.D., Ljungdahl, P.O., Trumpower, B.L. (1989). Mutational analysis of the mitochondrial Rieske
iron-sulfur protein of Saccharomyces cerevisiae. I. Construction of a RIP1 deletion strain and isolation
of temperature-sensitive mutants. J.Biol.Chem. 264, 3713-3722.
Ben Asher, E., Groudinsky, O., Altamura, N., Kermorgant, M., Slonimski, P.P. (1989). Novel class of nuclear
genes involved in both mRNA splicing and protein synthesis in S. cerevisiae mitochondria.
Mol.Gen.Genet. 215, 517-528.
Benson, D.A., Boguski, M.S., Lipman, D.J., Ostell, J., Ouellette, B.F. (1998). GenBank. Nucleic Acids Res.
26, 1-7.
Bergstrom, C.T., Pritchard, J. (1998). Germline bottlenecks and the evolutionary maintenance of mitochondrial
genomes. Genetics 149, 2135-2146.
Bolotin-Fukuhara, M., Faye, G., Fukuhara, H. (1977). Localization of some mitochondrial mutations in relation
to transfer and ribosomal RNA genes in Saccharomyces cerevisiae. W: The genetic function of
mitochondrial DNA. Saccone, C. and Kroon, A. M. (red.) :243-250. North-Holland., Amsterdam
Bolotin-Fukuhara, M., Grivell, L.A. (1992). Genetic approaches to the study of mitochondrial biogenesis in
yeast. Antonie Van Leeuwenhoek 62, 131-153.
Bolotin, M., Coen, D., Deutsch, J., Dujon, B., Netter, P., Petrochilo, E., Slonimski, P.P. (1971). La
recombinaison des mitochondries chez Saccharomyces cerevisiae. Bull.de l'Institut Pasteur 69, 215239.
Bonitz, S.G., Coruzzi, G., Thalenfeld, B.E., Tzagoloff, A., Macino, G. (1980). Assembly of the mitochondrial
membrane system. Structure and nucleotide sequence of the gene coding for subunit 1 of yeast
cytochrme oxidase. J.Biol.Chem. 255, 11927-11941.
Bonitz, S.G., Homison, G., Thalenfeld, B.E., Tzagoloff, A., Nobrega, F.G. (1982). Assembly of the
mitochondrial membrane system. Processing of the apocytochrome b precursor RNAs in
Saccharomyces cerevisiae D273-10B. J.Biol.Chem. 257, 6268-6274.
Bibliografia
156
Bonnefoy, N., Chalvet, F., Hamel, P., Slonimski, P.P., Dujardin, G. (1994). OXA1, a Saccharomyces cerevisiae
nuclear gene whose sequence is conserved from prokaryotes to eukaryotes controls cytochrome
oxidase biogenesis. J.Mol.Biol. 239, 201-212.
Botstein, D., Chervitz, S.A., Cherry, J.M. (1997). Yeast as a model organism. Science 277, 1259-1260.
Bousquet, I., Dujardin, G., Poyton, R.O., Slonimski, P.P. (1990). Two group I mitochondrial introns in the cobbox and coxI genes require the same MRS1/PET157 nuclear gene product for splicing. Curr.Genet.
18, 117-124.
Bousquet, I., Dujardin, G., Slonimski, P.P. (1991). ABC1, a novel yeast nuclear gene has a dual function in
mitochondria: it suppresses a cytochrome b mRNA translation defect and is essential for the electron
transfer in the bc 1 complex. EMBO J. 10, 2023-2031.
Boynton, J.E., Gillham, N.W., Harris, E.H., Hosler, J.P., Johnson, A.M., Jones, A.R., Randolph-Anderson, B.L.,
Robertson, D., Klein, T.M., Shark, K.B. (1988). Chloroplast transformation in Chlamydomonas with
high velocity microprojectiles. Science 240, 1534-1538.
Brown, N.G., Costanzo, M.C., Fox, T.D. (1994). Interactions among three proteins that specifically activate
translation of the mitochondrial COX3 mRNA in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Cell Biol. 14, 10451053.
Butow, R.A., Fox, T.D. (1990). Organelle transformation: shoot first, ask questions later. Trends Biochem.Sci.
15, 465-468.
Butow, R.A., Zhu, H., Perlman, P., Conrad-Webb, H. (1989). The role of a conserved dodecamer sequence in
yeast mitochondrial gene expression. Genome 31, 757-760.
Carignani, G., Groudinsky, O., Frezza, D., Schiavon, E., Bergantino, E., Slonimski, P.P. (1983). An mRNA
maturase is encoded by the first intron of the mitochondrial gene for the subunit I of cytochrome
oxidase in S. cerevisiae. Cell 35, 733-742.
Carignani, G., Netter, P., Bergantino, E., Robineau, S. (1986). Expression of the mitochondrial split gene
coding for cytochrome oxidase subunit I in S. cerevisiae: RNA splicing pathway. Curr.Genet. 11, 5563.
Chang, D.D., Clayton, D.A. (1989). Mouse RNAase MRP RNA is encoded by a nuclear gene and contains a
decamer sequence complementary to a conserved region of mitochondrial RNA substrate. Cell 56,
131-139.
Chao, L. (1990). Fitness of RNA virus decreased by Muller's ratchet. Nature 348, 454-455.
Chao, L. (1997). Evolution of sex and the molecular clock in RNA viruses. Gene 205, 301-308.
Chao, L., Tran, T.T. (1997). The advantage of sex in the RNA virus phi6. Genetics 147, 953-959.
Bibliografia
157
Chen, S.Y., Ephrussi, B., Hottinger, H. (1950). Nature génétique des mutants a déficience respiratoire de la
souche B-11 de la levure de boulangerie. Heredity (Edinburgh.) 4, 337-351.
Chen D-C., Yang B-C., Kuo T-T. (1992). One-step transformation of yeast in stationary phase. Curr. Genet.
21:83-84.
Cherry, J.M., Adler, C., Ball, C., Chervitz, S.A., Dwight, S.S., Hester, E.T., Jia, Y., Juvik, G., Roe, T.,
Schroeder, M., Weng, S., Botstein, D. (1998). SGD: Saccharomyces Genome Database. Nucleic
Acids Res. 26, 73-79.
Claisse, M.L., Pere-Aubert, G.A., Clavilier, L.P., Slonimski, P.P. (1970). Methode d'estimation de la
concentration des cytochromes dans les cellules entieres de levure. Eur.J.Biochem. 16, 430-438.
Clark-Walker, G.D. (1992). Evolution of mitochondrial genomes in Fungi. W: Mitochondrial Genomes ,
Wolstenholme, D. R. and Jeon, K. W. (red.) :89-127. Academic Press Inc.,
Clayton, D.A. (1992). Transcription and replication of animal mitochondrial DNAs. W: Mitochondrial
Genomes , Wolstenholme, D. R. and Jeon, K. W. (red.) :217-232. Academic Press Inc.,
Coburn, G.A., Mackie, G.A. (1996). Overexpression, purification, and properties of Escherichia coli
ribonuclease II. J.Biol.Chem. 271, 1048-1053.
Colleaux, L., d'Auriol, L., Betermier, M., Cottarel, G., Jacquier, A., Galibert, F., Dujon, B. (1986). Universal
code equivalent of a yeast mitochondrial intron reading frame is expressed into E. coli as a specific
double strand endonuclease. Cell 44, 521-533.
Conde J., Fink G.R. (1976). A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 73:3651-3655.
Conrad-Webb, H., Perlman, P.S., Zhu, H., Butow, R.A. (1990). The nuclear SUV3-1 mutation affects a variety
of post-transcriptional processes in yeast mitochondria. Nucleic Acids Res. 18, 1369-1376.
Coruzzi, G., Bonitz, S.G., Thalenfeld, B.E., Tzagoloff, A. (1981). Assembly of the mitochondrial membrane
system. Analysis of the nucleotide sequence and transcripts in the oxi1 region of yeast mitochondrial
DNA. J.Biol.Chem. 256, 12780-12787.
Costanzo, M.C., Fox, T.D. (1990). Control of mitochondrial gene expression in Saccharomyces cerevisiae.
Annu.Rev.Genet. 24:91-113, 91-113.
Costanzo, M.C., Fox, T.D. (1993). Suppression of a defect in the 5' untranslated leader of mitochondrial COX3
mRNA by a mutation affecting an mRNA-specific translational activator protein. Mol.Cell Biol. 13,
4806-4813.
Cummings, D.J. (1992). Mitochondrial genomes of the Ciliates. W: Mitochondrial Genomes , Wolstenholme,
D. R. and Jeon, K. W. (red.) :1-64. Academic Press Inc.,
Bibliografia
158
Cummings, D.J., McNally, K.L., Domenico, J.M., Matsuura, E.T. (1990). The complete DNA sequence of the
mitochondrial genome of Podospora anserina. Curr.Genet. 17, 375-402.
De La Salle, H., Jacq, C., Slonimski, P.P. (1982). Critical sequences within mitochondrial introns: pleiotropic
mRNA maturase and cis-dominant signals of the box intron controlling reductase and oxidase. Cell
28, 721-732.
de Zamaroczy, M., Bernardi, G. (1985). Sequence organization of the mitochondrial genome of yeast--a review.
Gene 37, 1-17.
Delahodde, A., Goguel, V., Becam, A.M., Creusot, F., Perea, J., Banroques, J., Jacq, C. (1989). Site-specific
DNA endonuclease and RNA maturase activities of two homologous intron-encoded proteins from
yeast mitochondria. Cell 56, 431-441.
di Rago, J.P., Bruel, C., Graham, L.A., Slonimski, P.P., Trumpower, B.L. (1996). Heterologous
complementation of a Rieske iron-sulfur protein-deficient Saccharomyces cerevisiae by the Rip1 gene
of Schizosaccharomyces pombe. J.Biol.Chem. 271, 15341-15345.
di Rago, J.P., Netter, P., Slonimski, P.P. (1990a). Intragenic suppressors reveal long distance interactions
between inactivating and reactivating amino acid replacements generating three- dimensional
constraints in the structure of mitochondrial cytochrome b. J.Biol.Chem. 265, 15750-15757.
di Rago, J.P., Netter, P., Slonimski, P.P. (1990b). Pseudo-wild type revertants from inactive apocytochrome b
mutants as a tool for the analysis of the structure/function relationships of the mitochondrial
ubiquinol-cytochrome c reductase of Saccharomyces cerevisiae. J.Biol.Chem. 265 , 3332-3339.
di Rago, J.P., Perea, J., Colson, A.M. (1990c). Isolation and RNA sequence analysis of cytochrome b mutants
resistant to funiculosin, a center i inhibitor of the mitochondrial ubiquinol- cytochrome c reductase in
Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 263, 93-98.
Dieckmann, C.L., Koerner, T.J., Tzagoloff, A. (1984a). Assembly of the mitochondrial membrane system.
CBP1, a yeast nuclear gene involved in 5' end processing of cytochrome b pre-mRNA. J.Biol.Chem.
259, 4722-4731.
Dieckmann, C.L., Homison, G., Tzagoloff, A. (1984b). Assembly of the mitochondrial membrane system.
Nucleotide sequence of a yeast nuclear gene (CBP1) involved in 5' end processing of cytochrome b
pre-mRNA. J.Biol.Chem. 259, 4732-4738.
Dieckmann, C.L., Mittelmeier, T.M. (1987). Nuclearly-encoded CBP1 interacts with the 5' end of
mitochondrial cytochrome b pre-mRNA. Curr.Genet. 12, 391-397.
Dieckmann, C.L., Tzagoloff, A. (1985). Assembly of the mitochondrial membrane system. CBP6, a yeast
nuclear gene necessary for synthesis of cytochrome b. J.Biol.Chem. 260, 1513-1520.
Bibliografia
159
Dmochowska, A., Golik, P., Stepien, P.P. (1995). The novel nuclear gene DSS-1 of Saccharomyces cerevisiae
is necessary for mitochondrial biogenesis. Curr.Genet. 28, 108-112.
Dmochowska, A., Stankiewicz, P., Golik, P., Stepien, P.P., Bocian, E., Hansmann, I., Bartnik, E. (1999).
Assignment of SUPV3L1 to human chromosome band 10q22.1 by in situ hybridization.
Cytogenet.Cell Genet., w druku
Dujardin, G., Jacq, C., Slonimski, P.P. (1982). Single base substitution in an intron of oxidase gene
compensates splicing defects of the cytochrome b gene. Nature 298, 628-632.
Dujardin, G., Pajot, P., Groudinsky, O., Slonimski, P.P. (1980). Long range control circuits within
mitochondria and between nucleus and mitochondria. I. Methodology and phenomenology of
suppressors. Mol.Gen.Genet. 179, 469-482.
Dujon, B. (1980). Sequence of the intron and flanking exons of the mitochondrial 21S rRNA gene of yeast
strains having different alleles at the omega and rib-1 loci. Cell 20, 185-197.
Dujon, B. (1981). Mitochondrial genetics and function. W: Molecular biology of the yeast Saccharomyces: life
cycle and inheritance. Strathern, J. N., Broach, J, and Jones, E (red.) :503-635. Cold Spring Harbor
Monograph, Cold Spring Harbor NY
Dujon, B. (1983). Mitochondrial genes; mutants and maps: a review. W: Mitochondria 1983: Nucleomitochondrial interactions. Schweyen, R. J., Wolf, K., and Kaudewitz, F. (red.) :390-403. W. de
Gruyter, Berlin
Dujon, B. (1998). European Functional Analysis Network (EUROFAN) and the functional analysis of the
Saccharomyces cerevisiae genome. Electrophoresis 19, 617-624.
Dujon, B., Colleaux, L., Jacquier, A., Michel, F., Monteilhet, C. (1986). Mitochondrial introns as mobile
genetic elements: the role of intron- encoded proteins. Basic.Life Sci. 40:5-27, 5-27.
Dujon, B., Colson, A.M., Slonimski, P.P. (1977). W: Mitochondria :579-669. W. de Gruyter & Co., Berlin,
New York.
Dunstan, H.M., Green-Willms, N.S., Fox, T.D. (1997). In vivo analysis of Saccharomyces cerevisiae COX2
mRNA 5'-untranslated leader functions in mitochondrial translation initiation and translational
activation. Genetics 147, 87-100.
Dziembowski, A., Malewicz, M., Minczuk, M., Golik, P., Dmochowska, A., Stepien, P.P. (1998). The yeast
nuclear gene DSS1, which codes for a putative RNase II, is necessary for the function of the
mitochondrial degradosome in processing and turnover of RNA. Mol.Gen.Genet. 260, 108-114.
Eigen, M., Schuster, P. (1977). The hypercycle. A principle of natural self-organization. Part A: Emergence of
the hypercycle. Naturwissenschaften. 64, 541-565.
Bibliografia
160
Ephrussi, B., Hottinger H, Chimenes A.H. (1949a). Action de l'acryflavine sur les levures. I. La mutation
"petite colonie". Ann.Inst.Pasteur 76, 419-450.
Ephrussi, B., Hottinger H, Tavlitzki J. (1949b). Action de l'acryflavine sur les levures. II. Etude génétique du
mutant "petite colonie". Ann.Inst.Pasteur 76, 419-450.
Etzold, T., Ulyanov, A., Argos, P. (1996). SRS: information retrieval system for molecular biology data banks.
Methods Enzymol. 266:114-28, 114-128.
Farrell, L.B., Gearing, D.P., Nagley, P. (1988). Reprogrammed expression of subunit 9 of the mitochondrial
ATPase complex of Saccharomyces cerevisiae. Expression in vitro from a chemically synthesized
gene and import into isolated mitochondria. Eur.J.Biochem. 173, 131-137.
Faye, G., Fukuhara, H., Grandchamp, C., Lazowska, J., Michel, F., Casey, J., Getz, G.S., Locker, J.,
Rabinowitz, M., Bolotin-Fukuhara, M., Coen, D., Deutsch, J., Dujon, B., Netter, P., Slonimski, P.P.
(1973). Mitochondrial nucleic acids in the petite colonie mutants: deletions and repetition of genes.
Biochimie 55, 779-792.
Feagin, J.E. (1992). The 6-kb element of Plasmodium falciparum encodes mitochondrial cytochrome genes.
Mol.Biochem.Parasitol. 52, 145-148.
Felsenstein, J. (1974). The evolutionary advantage of recombination. Genetics 78, 737-756.
Fitch, W.M. (1986). The estimate of total nucleotide substitutions from pairwise differences is biased.
Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci. 312, 317-324.
Folley, L.S., Fox, T.D. (1991). Site-directed mutagenesis of a Saccharomyces cerevisiae mitochondrial
translation initiation codon. Genetics 129, 659-668.
Foury, F. (1989). Cloning and sequencing of the nuclear gene MIP1 encoding the catalytic subunit of the yeast
mitochondrial DNA polymerase. J.Biol.Chem. 264, 20552-20560.
Fox, T.D. (1987). Natural variation in the genetic code. Annu.Rev.Genet. 21:67-91, 67-91.
Fox, T.D. (1996). Translational control of endogenous and recoded nuclear genes in yeast mitochondria:
regulation and membrane targeting. Experientia 52, 1130-1135.
Fox, T.D., Sanford, J.C., McMullin, T.W. (1988). Plasmids can stably transform yeast mitochondria lacking
endogenous mtDNA. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85, 7288-7292.
Fry, D.C., Kuby, S.A., Mildvan, A.S. (1986). ATP-binding site of adenylate kinase: mechanistic implications of
its homology with ras-encoded p21, F1-ATPase, and other nucleotide-binding proteins.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 83, 907-911.
Bibliografia
161
Fukuhara, H., Faye, G., Michel, F., Lazowska, J., Deutsch, J., Bolotin-Fukuhara, M., Slonimski, P.P. (1974).
Physical and genetic organization of petite and grande yeast mitochondrial DNA.I. Studies by RNADNA hybridization. Mol.Gen.Genet. 130, 215-238.
Fuller-Pace, F.V. (1994). RNA helicases: modulators of RNA structure. Trends Cell Biol. 4, 271-274.
Gabellini, N., Harnisch, U., McCarthy, J.E., Hauska, G., Sebald, W. (1985). Cloning and expression of the fbc
operon encoding the FeS protein, cytochrome b and cytochrome c1 from the Rhodopseudomonas
sphaeroides b/c1 complex. EMBO J. 4, 549-553.
Garriga, G., Bertrand, H., Lambowitz, A.M. (1984). RNA splicing in Neurospora mitochondria: nuclear
mutants defective in both splicing and 3' end synthesis of the large rRNA. Cell 36, 623-634.
Geli, V., Glick, B. (1990). Mitochondrial protein import. J.Bioenerg.Biomembr. 22, 725-751.
Germot, A., Philippe, H., Le Guyader, H. (1996). Presence of a mitochondrial-type 70-kDa heat shock protein
in Trichomonas vaginalis suggests a very early mitochondrial endosymbiosis in eukaryotes.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93, 14614-14617.
Gietz, R.D., Schiestl, R.H. (1995). Transforming Yeast with DNA. Methods in Molecular and Cellular
Biology. 5:255-269.
Gietz, R.D., Sugino, A. (1988). New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro
mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites. Gene 74, 527-534.
Glab, N., Petit, P.X., Slonimski, P.P. (1993). Mitochondrial dysfunction in yeast expressing the cytoplasmic
male sterility T-urf13 gene from maize: analysis at the population and individual cell level.
Mol.Gen.Genet. 236, 299-308.
Golik, P., Szczepanek, T., Bartnik, E., Stepien, P.P., Lazowska, J. (1995). The S. cerevisiae nuclear gene SUV3
encoding a putative RNA helicase is necessary for the stability of mitochondrial transcripts containing
multiple introns. Curr.Genet. 28, 217-224.
Gorbalenya, A.E., Koonin, E.V. (1988). One more conserved sequence motif in helicases. Nucleic Acids Res.
16, 7734
Gorbalenya, A.E., Koonin, E.V., Donchenko, A.P., Blinov, V.M. (1988). A conserved NTP-motif in putative
helicases. Nature 333, 22
Gorbalenya, A.E., Koonin, E.V., Donchenko, A.P., Blinov, V.M. (1989). Two related superfamilies of putative
helicases involved in replication, recombination, repair and expression of DNA and RNA genomes.
Nucleic Acids Res. 17, 4713-4730.
Gray, M.D., Shen, J.C., Kamath-Loeb, A.S., Blank, A., Sopher, B.L., Martin, G.M., Oshima, J., Loeb, L.A.
(1997). The Werner syndrome protein is a DNA helicase. Nat.Genet. 17, 100-103.
Bibliografia
162
Gray, M.W. (1992). The endosymbiont hypothesis revisited. W: Mitochondrial Genomes , Wolstenholme, D. R.
and Jeon, K. W. (red.) :233-358. Academic Press Inc.,
Gray, M.W. (1993). Origin and evolution of organelle genomes. Curr.Opin.Genet.Dev. 3, 884-890.
Green-Willms, N.S., Fox, T.D., Costanzo, M.C. (1998). Functional interactions between yeast mitochondrial
ribosomes and mRNA 5' untranslated leaders. Mol.Cell Biol. 18, 1826-1834.
Grivell,
L.A.
(1995).
Nucleo-mitochondrial
interactions
in
mitochondrial
gene
expression.
Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol 30, 121-164.
Groudinsky, O., Bousquet, I., Wallis, M.G., Slonimski, P.P., Dujardin, G. (1993). The NAM1/MTF2 nuclear
gene product is selectively required for the stability and/or processing of mitochondrial transcripts of
the atp6 and of the mosaic, cox1 and cytb genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Gen.Genet. 240,
419-427.
Guarneros, G., Portier, C. (1990). Different specificities of ribonuclease II and polynucleotide phosphorylase in
3'mRNA decay. Biochimie 72, 771-777.
Guerrier-Takada, C., Gardiner, K., Marsh, T., Pace, N., Altman, S. (1983). The RNA moiety of ribonuclease P
is the catalytic subunit of the enzyme. Cell 35, 849-857.
Gupta, R.S., Golding, G.B. (1996). The origin of the eukaryotic cell [see comments]. Trends Biochem.Sci. 21,
166-171.
Hajnsdorf, E., Steier, O., Coscoy, L., Teysset, L., Regnier, P. (1994). Roles of RNase E, RNase II and PNPase
in the degradation of the rpsO transcripts of Escherichia coli: stabilizing function of RNase II and
evidence for efficient degradation in an ams pnp rnb mutant. EMBO J. 13, 3368-3377.
Hanson, M.R., Folkerts, O. (1992). Structure and function of the higher plant mitochondrial genome. W:
Mitochondrial Genomes , Wolstenholme, D. R. and Jeon, K. W. (red.) :129-172. Academic Press Inc.,
Harnisch, U., Weiss, H., Sebald, W. (1985). The primary structure of the iron-sulfur subunit of ubiquinolcytochrome c reductase from Neurospora, determined by cDNA and gene sequencing. Eur.J.Biochem.
149, 95-99.
Hatefi, Y. (1985). The mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation system.
Annu.Rev.Biochem. 54, 1015-1069.
Hawthorne, D., Philippsen, P. (1994). Genetic and molecular analysis of hybrids in the genus Saccharomyces
involving S. cerevisiae, S. uvarum and a new species, S. douglasii. Yeast 10, 1285-1296.
He, S., Fox, T.D. (1997). Membrane translocation of mitochondrially coded Cox2p: distinct requirements for
export of N and C termini and dependence on the conserved protein Oxa1p. Mol.Biol.Cell 8, 14491460.
Bibliografia
163
Henke, R.M., Butow, R.A., Perlman, P.S. (1995). Maturase and endonuclease functions depend on separate
conserved domains of the bifunctional protein encoded by the group I intron aI4 alpha of yeast
mitochondrial DNA. EMBO J. 14, 5094-5099.
Hensgens, L.A., Bonen, L., de Haan, M., Van der Horst, G., Grivell, L.A. (1983). Two intron sequences in yeast
mitochondrial COX1 gene: homology among URF-containing introns and strain-dependent variation
in flanking exons. Cell 32, 379-389.
Hensgens, L.A., Grivell, L.A., Borst, P., Bos, J.L. (1979). Nucleotide sequence of the mitochondrial structural
gene for subunit 9 of yeast ATPase complex. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 76, 1663-1667.
Henze, K., Badr, A., Wettern, M., Cerff, R., Martin, W. (1995). A nuclear gene of eubacterial origin in Euglena
gracilis reflects cryptic endosymbioses during protist evolution. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 92, 91229126.
Herbert, C.J., Dujardin, G., Labouesse, M., Slonimski, P.P. (1988a). Divergence of the mitochondrial leucyl
tRNA synthetase genes in two closely related yeasts Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces
douglasii: a paradigm of incipient evolution. Mol.Gen.Genet. 213, 297-309.
Herbert, C.J., Labouesse, M., Dujardin, G., Slonimski, P.P. (1988b). The NAM2 proteins from S. cerevisiae and
S. douglasii are mitochondrial leucyl-tRNA synthetases, and are involved in mRNA splicing. EMBO
J. 7, 473-483.
Herbert, C.J., Macadre, C., Becam, A.M., Lazowska, J., Slonimski, P.P. (1992). The MRS1 gene of S.
douglasii: co-evolution of mitochondrial introns and specific splicing proteins encoded by nuclear
genes. Gene Expr. 2, 203-214.
Hill, J., McGraw, P., Tzagoloff, A. (1985). A mutation in yeast mitochondrial DNA results in a precise excision
of the terminal intron of the cytochrome b gene. J.Biol.Chem. 260, 3235-3238.
Hoare, C.A.R, Wirth, N. (1973). An axiomatic definition of the programming language PASCAL. Acta
Informatica 2:335-355.
Hodgman, T.C. (1988). A new superfamily of replicative proteins. Nature 333, 22-23.
Hofmann, T.J., Min, J., Zassenhaus, H.P. (1993). Formation of the 3' end of yeast mitochondrial mRNAs occurs
by site- specific cleavage two bases downstream of a conserved dodecamer sequence. Yeast 9, 13191330.
Horner, D.S., Hirt, R.P., Kilvington, S., Lloyd, D., Embley, T.M. (1996). Molecular data suggest an early
acquisition of the mitochondrion endosymbiont. Proc.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci. 263, 1053-1059.
Hudspeth, M.E., Vincent, R.D., Perlman, P.S., Shumard, D.S., Treisman, L.O., Grossman, L.I. (1984).
Expandable var1 gene of yeast mitochondrial DNA: in-frame insertions can explain the strain-specific
protein size polymorphisms. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 81, 3148-3152.
Bibliografia
164
Iost, I., Dreyfus, M. (1994). mRNAs can be stabilized by DEAD-box proteins. Nature 372, 193-196.
Jacob, F., Monod, J. (1961). Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J.Mol.Biol. 3, 318356.
Jacq, C., Lazowska, J., Slonimski, P.P. (1980). [New mechanism for regulation of genetic expression].
C.R.Seances.Acad.Sci.D. 290, 89-92.
Jacquier, A., Dujon, B. (1983). The intron of the mitochondrial 21S rRNA gene: distribution in different yeast
species and sequence comparison between Kluyveromyces thermotolerans and Saccharomyces
cerevisiae. Mol. Gen. Genet. 192:487-499.
Jang, S.H., Jaehning, J.A. (1991). The yeast mitochondrial RNA polymerase specificity factor, MTF1, is similar
to bacterial sigma factors. J.Biol.Chem. 266, 22671-22677.
Johnston, S.A. (1990). Biolistic transformation: microbes to mice. Nature 346, 776-777.
Johnston, S.A., Anziano, P.Q., Shark, K., Sanford, J.C., Butow, R.A. (1988). Mitochondrial transformation in
yeast by bombardment with microprojectiles. Science 240, 1538-1541.
Jones, J.S., Prakash, L. (1990). Yeast Saccharomyces cerevisiae selectable markers in pUC18 polylinkers.
Yeast 6, 363-366.
Kallas, T., Spiller, S., Malkin, R. (1988). Primary structure of cotranscribed genes encoding the Rieske Fe-S
and cytochrome f proteins of the cyanobacterium Nostoc PCC 7906. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85 ,
5794-5798.
Kennell, J.C., Moran, J.V., Perlman, P.S., Butow, R.A., Lambowitz, A.M. (1993). Reverse transcriptase activity
associated with maturase-encoding group II introns in yeast mitochondria. Cell 73, 133-146.
Kinoshita, N., Goebl, M., Yanagida, M. (1991). The fission yeast dis3+ gene encodes a 110-kDa essential
protein implicated in mitotic control. Mol.Cell Biol. 11, 5839-5847.
Klein, T.M., Wolf, E.D., Wu, R., Sanford, J.C. (1987). High-velocity microprojectiles for delivering nucleic
acids into living cells. Nature 327, 70-73.
Koll, H., Schmidt, C., Wiesenberger, G., Schmelzer, C. (1987). Three nuclear genes suppress a yeast
mitochondrial splice defect when present in high copy number. Curr.Genet. 12, 503-509.
Korab-Laskowska, M., Rioux, P., Brossard, N., Littlejohn, T.G., Gray, M.W., Lang, B.F., Burger, G. (1998).
The Organelle Genome Database Project (GOBASE). Nucleic Acids Res. 26, 138-144.
Kotylak, Z., Lazowska, J., Slonimski, P.P. (1985). Intron encoded proteins of mitochondria: key elements of
gene expression and genomic evolution. W: Achievments and perspectives in mitochondrial
research :1-20. Elsevier Science Publishers, Amsterdam
Bibliografia
165
Kotylak, Z., Slonimski, P.P. (1976). Joint control for cytochrome A and B by a unique mitochondrial DNA
region comprising four genetic loci. W: The genetic function of mitochondrial DNA. Saccone, C. and
Kroon, A. M. (red.) :143-154. Elsevier Science Publishers, Amsterdam
Kotylak, Z., Slonimski, P.P. (1977). Mitochondrial mutants isolated by a new screening method based upon the
use of the nuclear mutation op1. W: Mitochondria :83-89. W. d. Gruyter, Berlin
Kreike, J., Schulze, M., Ahne, F., Lang, B.F. (1987). A yeast nuclear gene, MRS1, involved in mitochondrial
RNA splicing: nucleotide sequence and mutational analysis of two overlapping open reading frames
on opposite strands. EMBO J. 6, 2123-2129.
Kreike, J., Schulze, M., Pillar, T., Korte, A., Rodel, G. (1986). Cloning of a nuclear gene MRS1 involved in the
excision of a single group I intron (bI3) from the mitochondrial COB transcript in S. cerevisiae.
Curr.Genet. 11, 185-191.
Kurowski, B., Ludwig, B. (1987). The genes of the Paracoccus denitrificans bc1 complex. Nucleotide sequence
and homologies between bacterial and mitochondrial subunits. J.Biol.Chem. 262, 13805-13811.
Kushner, S. (1996). mRNA decay. W: Escherichia coli and Salmonella: Cellular and molecular biology ,
Neidhardt F.C. (red.) :849-860.
Labouesse, M. (1990). The yeast mitochondrial leucyl-tRNA synthetase is a splicing factor for the excision of
several group I introns. Mol.Gen.Genet. 224, 209-221.
Labouesse, M., Netter, P., Schroeder, R. (1984). Molecular basis of the 'box effect', A maturase deficiency
leading to the absence of splicing of two introns located in two split genes of yeast mitochondrial
DNA. Eur.J.Biochem. 144, 85-93.
Landes, C., Henaut, A., Risler, J.L. (1992). A comparison of several similarity indices used in the classification
of protein sequences: a multivariate analysis. Nucleic Acids Res. 20, 3631-3637.
Lang, B.F., Ahne, F., Bonen, L. (1985). The mitochondrial genome of the fission yeast Schizosaccharomyces
pombe. The cytochrome b gene has an intron closely related to the first two introns in the
Saccharomyces cerevisiae cox1 gene. J.Mol.Biol. 184, 353-366.
Lang, B.F., Burger, G., O'Kelly, C.J., Cedergren, R., Golding, G.B., Lemieux, C., Sankoff, D., Turmel, M.,
Gray, M.W. (1997). An ancestral mitochondrial DNA resembling a eubacterial genome in miniature.
Nature 387, 493-497.
Law, R.H., Farrell, L.B., Nero, D., Devenish, R.J., Nagley, P. (1988). Studies on the import into mitochondria
of yeast ATP synthase subunits 8 and 9 encoded by artificial nuclear genes. FEBS Lett. 236, 501-505.
Rozdział 5. Materiały i metody. Dodatek A
166
Lazowska, J., Claisse, M., Gargouri, A., Kotylak, Z., Spyridakis, A., Slonimski, P.P. (1989). Protein encoded
by the third intron of cytochrome b gene in Saccharomyces cerevisiae is an mRNA maturase. Analysis
of mitochondrial mutants, RNA transcripts proteins and evolutionary relationships. J.Mol.Biol. 205,
275-289.
Lazowska, J., Jacq, C., Slonimski, P.P. (1980). Sequence of introns and flanking exons in wild-type and box3
mutants of cytochrome b reveals an interlaced splicing protein coded by an intron. Cell 22, 333-348.
Lazowska, J., Meunier, B., Macadre, C. (1994). Homing of a group II intron in yeast mitochondrial DNA is
accompanied by unidirectional co-conversion of upstream-located markers. EMBO J. 13, 4963-4972.
Leblanc, C., Richard, O., Kloareg, B., Viehmann, S., Zetsche, K., Boyen, C. (1997). Origin and evolution of
mitochondria: what have we learnt from red algae? Curr.Genet. 31, 193-207.
Li, G.Y., Tian, G.L., Slonimski, P.P., Herbert, C.J. (1996). The CBP2 gene from Saccharomyces douglasii is a
functional homologue of the Saccharomyces cerevisiae gene and is essential for respiratory growth in
the presence of a wild-type (intron-containing) mitochondrial genome. Mol.Gen.Genet. 250, 316322.
Li, W.H. (1993). Unbiased estimation of the rates of synonymous and nonsynonymous substitution [letter].
J.Mol.Evol. 36, 96-99.
Li, W.H. (1997). Molecular Evolution. Sinauer Associates Inc.,
Li, W.H., Wu, C.I., Luo, C.C. (1985). A new method for estimating synonymous and nonsynonymous rates of
nucleotide substitution considering the relative likelihood of nucleotide and codon changes.
Mol.Biol.Evol. 2, 150-174.
Liao, X., Butow, R.A. (1993). RTG1 and RTG2: two yeast genes required for a novel path of communication
from mitochondria to the nucleus. Cell 72, 61-71.
Lindahl, K.F., Hermel, E., Loveland, B.E., Wang, C.R. (1991). Maternally transmited antigen of mice: a model
transplantation antigen. Annu.Rev.Immunol. 9, 351-372.
Linder, P., Lasko, P.F., Ashburner, M., Leroy, P., Nielsen, P.J., Nishi, K., Schnier, J., Slonimski, P.P. (1989).
Birth of the D-E-A-D box. Nature 337, 121-122.
Linder, P., Slonimski, P.P. (1989). An essential yeast protein, encoded by duplicated genes TIF1 and TIF2 and
homologous to the mammalian translation initiation factor eIF-4A, can suppress a mitochondrial
missense mutation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 86, 2286-2290.
Lithgow, T., Horst, M., Rospert, S., Matouschek, A., Haucke, V., Schatz, G. (1995). Import and folding of
proteins by mitochondria. Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 60:609-17, 609-617.
Rozdział 5. Materiały i metody. Dodatek A
167
Luking, A., Stahl, U., Schmidt, U. (1998). The protein family of RNA helicases. Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol
33, 259-296.
Luria, S.E., Delbrück, M. (1943). Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics 28,
491-511.
Macino, G., Tzagoloff, A. (1979). Assembly of the mitochondrial membrane system. The DNA sequence of a
mitochondrial ATPase gene in Saccharomyces cerevisiae. J.Biol.Chem. 254, 4617-4623.
Macreadie, I.G., Novitski, C.E., Maxwell, R.J., John, U., Ooi, B.G., McMullen, G.L., Lukins, H.B., Linnane,
A.W., Nagley, P. (1983). Biogenesis of mitochondria: the mitochondrial gene (aap1) coding for
mitochondrial ATPase subunit 8 in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 11 , 4435-4451.
Macreadie, I.G., Scott, R.M., Zinn, A.R., Butow, R.A. (1985). Transposition of an intron in yeast mitochondria
requires a protein encoded by that intron. Cell 41, 395-402.
Manthey, G.M., McEwen, J.E. (1995). The product of the nuclear gene PET309 is required for translation of
mature mRNA and stability or production of intron-containing RNAs derived from the mitochondrial
COX1 locus of Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 14, 4031-4043.
Margossian, S.P., Li, H., Zassenhaus, H.P., Butow, R.A. (1996). The DExH box protein Suv3p is a component
of a yeast mitochondrial 3'- to-5' exoribonuclease that suppresses group I intron toxicity. Cell 84, 199209.
Margulis, L. (1970). Origin of eukariotic cells. Yale University Press, New Haven
Martin, R.P., Schneller, J.M., Stahl, A.J., Dirheimer, G. (1979). Import of nuclear deoxyribonucleic acid coded
lysine-accepting transfer ribonucleic acid (anticodon C-U-U) into yeast mitochondria. Biochemistry
18, 4600-4605.
Martin, W., Muller, M. (1998). The hydrogen hypothesis for the first eukaryote. Nature 392, 37-41.
McGraw, P., Tzagoloff, A. (1983). Assembly of the mitochondrial membrane system. Characterization of a
yeast nuclear gene involved in the processing of the cytochrome b pre- mRNA. J.Biol.Chem. 258,
9459-9468.
McLaren, R.S., Newbury, S.F., Dance, G.S., Causton, H.C., Higgins, C.F. (1991). mRNA degradation by
processive 3'-5' exoribonucleases in vitro and the implications for prokaryotic mRNA decay in vivo.
J.Mol.Biol. 221, 81-95.
Michaelis, G., Michel, F., Lazowska, J., Slonimski, P.P. (1976). Recombined molecules of mitochondrial DNA
obtained from crosses between cytoplasmic petite mutants of Saccharomyces cerevisiae: the
stoichiometry of parental DNA repeats within the recombined molecule. Mol.Gen.Genet. 149, 125130.
Rozdział 5. Materiały i metody. Dodatek A
168
Michel, F., Jacquier, A., Dujon, B. (1982). Comparison of fungal mitochondrial introns reveals extensive
homologies in RNA secondary structure. Biochimie 64, 867-881.
Min, J., Heuretz, R.M., Zassenhaus, H.P. (1992). Isolation and characterization of an NTP-dependent 3'-5'
exoribonuclease from mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. J.Biol.Chem. 268, 7350-7357.
Min, J., Zassenhaus, H.P. (1993). Identification of a protein complex that binds to a dodecamer sequence found
at the 3' ends of yeast mitochondrial mRNAs. Mol.Cell Biol. 13, 4167-4173.
Mitchell, P., Petfalski, E., Shevchenko, A., Mann, M., Tollervey, D. (1997). The exosome: a conserved
eukaryotic RNA processing complex containing multiple 3'-->5' exoribonucleases. Cell 91, 457-466.
Moran, J.V., Wernette, C.M., Mecklenburg, K.L., Butow, R.A., Perlman, P.S. (1992). Intron 5 alpha of the
COXI gene of yeast mitochondrial DNA is a mobile group I intron. Nucleic Acids Res. 20, 40694076.
Morishima, N., Nakagawa, K., Yamamoto, E., Shibata, T. (1990). A subunit of yeast site-specific endonuclease
SceI is a mitochondrial version of the 70-kDa heat shock protein. J.Biol.Chem. 265, 15189-15197.
Mosse, M.O., Brouillet, S., Risler, J.L., Lazowska, J., Slonimski, P.P. (1988). A comprehensive compilation of
400 nucleotide sequences coding for proteins from the yeast Saccharomyces cerevisiae = LISTA1.
Curr.Genet. 14, 529-535.
Mounolou, J.C., Jakob, H., Slonimski, P.P. (1966). Mitochondrial DNA from yeast "petite" mutants: specific
changes
in
buoyant
density
corresponding
to
different
cytoplasmic
mutations.
Biochem.Biophys.Res.Commun. 24, 218-224.
Mulero, J.J., Fox, T.D. (1993). Alteration of the Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA 5'-untranslated leader
by mitochondrial gene replacement and functional interaction with the translational activator protein
PET111. Mol.Biol.Cell 4, 1327-1335.
Mulero, J.J., Fox, T.D. (1994). Reduced but accurate translation from a mutant AUA initiation codon in the
mitochondrial COX2 mRNA of Saccharomyces cerevisiae. Mol.Gen.Genet. 242, 383-390.
Mulero, J.J., Rosenthal, J.K., Fox, T.D. (1994). PET112, a Saccharomyces cerevisiae nuclear gene required to
maintain rho+ mitochondrial DNA. Curr.Genet. 25, 299-304.
Muller, H.J. (1964). The relation of recombination to mutational advance. Mut.Res. 1, 2-9.
Myers, A.M., Pape, L.K., Tzagoloff, A. (1985). Mitochondrial protein synthesis is required for maintenance of
intact mitochondrial genomes in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 4, 2087-2092.
Nagata, S., Tsunetsugu-Yokota, Y., Naito, A., Kaziro, Y. (1983). Molecular cloning and sequence
determination of the nuclear gene coding for mitochondrial elongation factor Tu of Saccharomyces
cerevisiae. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 80, 6192-6196.
Rozdział 5. Materiały i metody. Dodatek A
169
Nagley, P., Farrell, L.B., Gearing, D.P., Nero, D., Meltzer, S., Devenish, R.J. (1988). Assembly of functional
proton-translocating ATPase complex in yeast mitochondria with cytoplasmically synthesized subunit
8, a polypeptide normally encoded within the organelle. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85, 2091-2095.
Nakagawa, K., Morishima, N., Shibata, T. (1991). A maturase-like subunit of the sequence-specific
endonuclease endo.SceI from yeast mitochondria. J.Biol.Chem. 266, 1977-1984.
Nakagawa, K., Morishima, N., Shibata, T. (1992). An endonuclease with multiple cutting sites, Endo.SceI,
initiates genetic recombination at its cutting site in yeast mitochondria. EMBO J. 11, 2707-2715.
Nett, J.H., Denke, E., Trumpower, B.L. (1997). Two-step processing is not essential for the import and
assembly of functionally active iron-sulfur protein into the cytochrome bc1 complex in
Saccharomyces cerevisiae. J.Biol.Chem. 272, 2212-2217.
Nishikimi, M., Hosokawa, Y., Toda, H., Suzuki, H., Ozawa, T. (1989). Cloning and sequence analysis of a
cDNA encoding the Rieske iron-sulfur protein of rat mitochondrial cytochrome bc1 complex.
Biochem.Biophys.Res.Commun. 159, 19-25.
Nobrega, F.G., Tzagoloff, A. (1980). Assembly of the mitochondrial membrane system. DNA sequence and
organization of the cytochrome b gene in Saccharomyces cerevisiae D273- 10B. J.Biol.Chem. 255,
9828-9837.
Nobrega, M.P., Nobrega, F.G., Tzagoloff, A. (1990). COX10 codes for a protein homologous to the ORF1
product of Paracoccus denitrificans and is required for the synthesis of yeast cytochrome oxidase.
J.Biol.Chem. 265, 14220-14226.
Orr-Weaver, T.L., Szostak, J.W., Rothstein, R.J. (1983). Genetic applications of yeast transformation with
linear and gapped plasmids. Methods Enzymol. 101:228-45, 228-245.
Osinga, K.A., De Vries, E., Van der Horst, G., Tabak, H.F. (1984). Processing of yeast mitochondrial
messenger RNAs at a conserved dodecamer sequence. EMBO J. 3, 829-834.
Palmer, J.D. (1997). Organelle genomes: going, going, gone! Science 275, 790-791.
Pamilo, P., Bianchi, N.O. (1993). Evolution of the Zfx and Zfy genes: rates and interdependence between the
genes. Mol.Biol.Evol. 10, 271-281.
Paquin, B., Lang, B.F. (1996). The mitochondrial DNA of Allomyces macrogynus: the complete genomic
sequence from an ancestral fungus. J.Mol.Biol. 255, 688-701.
Parikh, V.S., Morgan, M.M., Scott, R., Clements, L.S., Butow, R.A. (1987). The mitochondrial genotype can
influence nuclear gene expression in yeast. Science 235, 576-580.
Rozdział 5. Materiały i metody. Dodatek A
170
Pause, A., Methot, N., Sonenberg, N. (1993). The HRIGRXXR region of the DEAD box RNA helicase
eukaryotic translation initiation factor 4A is required for RNA binding and ATP hydrolysis. Mol.Cell
Biol. 13 , 6789-6798.
Pause, A., Sonenberg, N. (1992). Mutational analysis of a DEAD box RNA helicase: the mammalian
translation initiation factor eIF-4A. EMBO J. 11, 2643-2654.
Payne, M.J., Schweizer, E., Lukins, H.B. (1991). Properties of two nuclear pet mutants affecting expression of
the mitochondrial oli1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Curr.Genet. 19, 343-351.
Peebles, C.L., Belcher, S.M., Zhang, M., Dietrich, R.C., Perlman, P.S. (1993). Mutation of the conserved first
nucleotide of a group II intron from yeast mitochondrial DNA reduces the rate but allows accurate
splicing. J.Biol.Chem. 268, 11929-11938.
Pel, H.J., Tzagoloff, A., Grivell, L.A. (1992). The identification of 18 nuclear genes required for the expression
of the yeast mitochondrial gene encoding cytochrome c oxidase subunit 1. Curr.Genet. 21, 139-146.
Perea, J., Desdouets, C., Schapira, M., Jacq, C. (1993). I-Sce III: a novel group I intron-encoded endonuclease
from the yeast mitochondria. Nucleic Acids Res. 21, 358
Pfanner, N., Craig, E.A., Meijer, M. (1994). The protein import machinery of the mitochondrial inner
membrane. Trends Biochem.Sci. 19, 368-372.
Pinkham, J.L., Dudley, A.M., Mason, T.L. (1994). T7 RNA polymerase-dependent expression of COXII in
yeast mitochondria. Mol.Cell Biol. 14, 4643-4652.
Py, B., Causton, H., Mudd, E.A., Higgins, C.F. (1994). A protein complex mediating mRNA degradation in
Escherichia coli. Mol.Microbiol. 14, 717-729.
Py, B., Higgins, C.F., Krisch, H.M., Carpousis, A.J. (1996). A DEAD-box RNA helicase in the Escherichia coli
RNA degradosome. Nature 381, 169-172.
Ragnini, A., Grisanti, P., Rinaldi, T., Frontali, L., Palleschi, C. (1991). Mitochondrial genome of
Saccharomyces douglasii: genes coding for components of the protein synthetic apparatus.
Curr.Genet. 19 , 169-174.
Rieger, K.J., Aljinovic, G., Lazowska, J., Pohl, T.M., Slonimski, P.P. (1997). A novel nuclear gene, CBT1,
essential for mitochondrial cytochrome b formation: terminal processing of mRNA and intron
dependence. Curr.Genet. 32, 163-174.
Rieske, J.S., Zaugg, W.S., Hansen, B.E. (1964). Studies on the electron transfer system. LIX. Distribution of
iron and of the component giving an electron paramagnetic resonance signal at g=1.90 in subfractions
of complex III. J.Biol.Chem. 239, 3023-3030.
Rozdział 5. Materiały i metody. Dodatek A
171
Rodel, G. (1986). Two yeast nuclear genes, CBS1 and CBS2, are required for translation of mitochondrial
transcripts bearing the 5'-untranslated COB leader. Curr.Genet. 11, 41-45.
Rose, M.D., Winston, F., Hieter, P. (1990). Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, New York.
Sabaty, M., Kaplan, S. (1996). mgpS, a complex regulatory locus involved in the transcriptional control of the
puc and puf operons in Rhodobacter sphaeroides 2.4.1. J.Bacteriol. 178, 35-45.
Saccone, C. (1994). The evolution of mitochondrial DNA. Curr.Opin.Genet.Dev. 4, 875-881.
Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed.. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Sanchirico, M., Tzellas, A., Fox, T.D., Conrad-Webb, H., Periman, P.S., Mason, T.L. (1995). Relocation of the
unusual VAR1 gene from the mitochondrion to the nucleus. Biochem.Cell Biol. 73, 987-995.
Sargueil, B., Delahodde, A., Hatat, D., Tian, G.L., Lazowska, J., Jacq, C. (1991). A new specific DNA
endonuclease activity in yeast mitochondria. Mol.Gen.Genet. 225, 340-341.
Sato, S., Kaneko, T., Kotani, H., Nakamura, Y., Asamizu, E., Miyajima, N., Tabata, S. (1998). Structural
analysis of Arabidopsis thaliana chromosome 5. IV. Sequence features of the regions of 1,456,315 bp
covered by nineteen physically assigned P1 and TAC clones. DNA Res. 5, 41-54.
Schagger, H., Borchart, U., Machleidt, W., Link, T.A., von Jagow, G. (1987). Isolation and amino acid
sequence of the 'Rieske' iron sulfur protein of beef heart ubiquinol:cytochrome c reductase. FEBS
Lett. 219, 161-168.
Schatz, G. (1992). Protein import by yeast mitochondria. Prog.Clin.Biol.Res. 375:1-8, 1-8.
Schinkel, A.H., Groot, K.M., Tabak, H.F. (1988). Mitochondrial RNA polymerase of Saccharomyces
cerevisiae: composition and mechanism of promoter recognition. EMBO J. 7, 3255-3262.
Schinkel, A.H., Tabak, H.F. (1989). Mitochondrial RNA polymerase: dual role in transcription and replication.
Trends.Genet. 5, 149-154.
Schuster, W., Brennicke, A. (1994). The plant mitochondrial genome: physical structure, information content,
RNA editing, and gene migration to the nucleus. Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol. 45, 61-78.
Sekito, T., Okamoto, K., Kitano, H., Yoshida, K. (1995). The complete mitochondrial DNA sequence of
Hansenula wingei reveals new characteristics of yeast mitochondria. Curr.Genet. 28, 39-53.
Séraphin, B., Boulet, A., Simon, M., Faye, G. (1987). Construction of a yeast strain devoid of mitochondrial
introns
and
its
use
to
screen
nuclear
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 84, 6810-6814.
genes
involved
in
mitochondrial
splicing.
Rozdział 5. Materiały i metody. Dodatek A
172
Séraphin, B., Simon, M., Faye, G. (1988). MSS18, a yeast nuclear gene involved in the splicing of intron aI5
beta of the mitochondrial cox1 transcript. EMBO J. 7, 1455-1464.
Séraphin, B., Simon, M., Boulet, A., Faye, G. (1989a). Mitochondrial splicing requires a protein from a novel
helicase family. Nature 337, 84-87.
Séraphin, B., Simon, M., Jacq, C., Faye, G. (1989b). Sequence of the yeast mitochondrial OX13/OL12
promoter region. Nucleic Acids Res. 17, 4886
Shaw, L.C., Lewin, A.S. (1997). The Cbp2 protein stimulates the splicing of the omega intron of yeast
mitochondria. Nucleic Acids Res. 25, 1597-1604.
Sherman, F. (1963). Respiration-deficient mutants of yeast. I. Genetics. Genetics 48, 375-385.
Sherman, F., Slonimski, P.P. (1964). Respiration-deficient mutants of yeast. II. Biochemistry.
Biochem.Biophys.Res.Commun. 90, 1-15.
Simon, M., Faye, G. (1984). Organization and processing of the mitochondrial oxi3/oli2 multigenic transcript in
yeast. Mol.Gen.Genet. 196, 266-274.
Slonimski, P.P. (1953). La formation des enzymes respiratoirs chez la levure. Masson, Paris
Slonimski, P.P., Ephrussi, B. (1949). Action de l'acryflavine sur les levures. V. Les systemes des cutochromes
des mutants "petite colonie". Ann.Inst.Pasteur 77, 47-63.
Slonimski, P.P., Perrodin G., Croft J. (1968). Ethidium bromide induced mutation of yeast mitochondria:
complete transformation of cells into respiratory dedeficient non chromosomal "petite".
Biochem.Biophys.Res.Commun. 30, 232-239.
Slonimski, P.P., Tzagoloff, A. (1976). Localization in yeast mitochondrial DNA of mutations expressed in a
deficiency of cytochrome oxidase and/or coenzyme QH2-cytochrome c reductase. Eur.J.Biochem. 61,
27-41.
Staley, J.P., Guthrie, C. (1998). Mechanical devices of the spliceosome: motors, clocks, springs, and things.
Cell 92, 315-326.
Steele, D.F., Butler, C.A., Fox, T.D. (1996). Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast
mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
93 , 5253-5257.
Stepien, P.P., Butow, R.A. (1990). Yeast colony northern: a fast method for detection of transcripts by colony
hybridization. Nucleic Acids Res. 18, 380
Rozdział 5. Materiały i metody. Dodatek A
173
Stepien, P.P., Kokot, L., Leski, T., Bartnik, E. (1995). The suv3 nuclear gene product is required for the in vivo
processing of the yeast mitochondrial 21s rRNA transcripts containing the r1 intron. Curr.Genet. 27,
234-238.
Stepien, P.P., Margossian, S.P., Landsman, D., Butow, R.A. (1992). The yeast nuclear gene suv3 affecting
mitochondrial post- transcriptional processes encodes a putative ATP-dependent RNA helicase.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89, 6813-6817.
Steppuhn, J., Rother, C., Hermans, J., Jansen, T., Salnikow, J., Hauska, G., Herrmann, R.G. (1987). The
complete amino-acid sequence of the Rieske FeS-precursor protein from spinach chloroplasts deduced
from cDNA analysis. Mol.Gen.Genet. 210, 171-177.
Stoesser, G., Tuli, M.A., Lopez, R., Sterk, P. (1999). The EMBL Nucleotide Sequence Database. Nucleic
Acids Res. 27, 18-24.
Stuart, K., Feagin, J.E. (1992). Mitochondrial DNA of Kinetoplastids. W: Mitochondrial Genomes ,
Wolstenholme, D. R. and Jeon, K. W. (red.) :65-88. Academic Press Inc.,
Szczepanek, T., Lazowska, J. (1996). Replacement of two non-adjacent amino acids in the S.cerevisiae bi2
intron-encoded RNA maturase is sufficient to gain a homing-endonuclease activity. EMBO J. 15,
3758-3767.
Szczepanek, T., Macadre, C., Meunier, B., Lazowska, J. (1994). Two homologous introns from related
Saccharomyces species differ in their mobility. Gene 139, 1-7.
Tarassov, I.A., Martin, R.P. (1996). Mechanisms of tRNA import into yeast mitochondria: an overview.
Biochimie 78, 502-510.
Tarun, S.Z.J., Sachs, A.B. (1995). A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in
yeast. Genes Dev. 9, 2997-3007.
Tarun, S.Z.J., Sachs, A.B. (1996). Association of the yeast poly(A) tail binding protein with translation
initiation factor eIF-4G. EMBO J. 15, 7168-7177.
Terpstra, P., Butow, R.A. (1979). The role of var1 in the assembly of yeast mitochondrial ribosomes.
J.Biol.Chem. 254, 12662-12669.
Thalenfeld, B.E., Tzagoloff, A. (1980). Assembly of the mitochondrial membrane system. Sequence of the oxi
2 gene of yeast mitochondrial DNA. J.Biol.Chem. 255, 6173-6180.
Thompson, J.D., Higgins, D.G., Gibson, T.J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive
multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight
matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680.
Rozdział 5. Materiały i metody. Dodatek A
174
Thorsness, P.E., Fox, T.D. (1990). Escape of DNA from mitochondria to the nucleus in Saccharomyces
cerevisiae. Nature 346, 376-379.
Thorsness, P.E., Fox, T.D. (1993). Nuclear mutations in Saccharomyces cerevisiae that affect the escape of
DNA from mitochondria to the nucleus. Genetics 134, 21-28.
Thorsness, P.E., White, K.H., Fox, T.D. (1993). Inactivation of YME1, a member of the ftsH-SEC18-PAS1CDC48 family of putative ATPase-encoding genes, causes increased escape of DNA from
mitochondria in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Cell Biol. 13, 5418-5426.
Tian, G.L., Li, G.Y., Slonimski, P.P., Lazowska, J. (1998). The novel function of the Saccharomyces cerevisiae
CBP2 gene as a splicing factor essential to excision of the Saccharomyces douglasii LSU intron in
vivo. Mol.Gen.Genet. 258, 60-68.
Tian, G.L., Macadre, C., Kruszewska, A., Szczesniak, B., Ragnini, A., Grisanti, P., Rinaldi, T., Palleschi, C.,
Frontali, L., Slonimski, P.P. (1991a). Incipient mitochondrial evolution in yeasts. I. The physical map
and gene order of Saccharomyces douglasii mitochondrial DNA discloses a translocation of a segment
of 15,000 base-pairs and the presence of new introns in comparison with Saccharomyces cerevisiae.
J.Mol.Biol. 218, 735-746.
Tian, G.L., Michel, F., Macadre, C., Slonimski, P.P., Lazowska, J. (1991b). Incipient mitochondrial evolution
in yeasts. II. The complete sequence of the gene coding for cytochrome b in Saccharomyces douglasii
reveals the presence of both new and conserved introns and discloses major differences in the fixation
of mutations in evolution. J.Mol.Biol. 218, 747-760.
Tian, G.L., Michel, F., Macadre, C., Lazowska, J. (1993). Sequence of the mitochondrial gene encoding subunit
I of cytochrome oxidase in Saccharomyces douglasii. Gene 124, 153-163.
Ticho, B.S., Getz, G.S. (1988). The characterization of yeast mitochondrial RNA polymerase. A monomer of
150,000 daltons with a transcription factor of 70,000 daltons. J.Biol.Chem. 263, 10096-10103.
Tobe, T., Sasakawa, C., Okada, N., Honma, Y., Yoshikawa, M. (1992). vacB, a novel chromosomal gene
required for expression of virulence genes on the large plasmid of Shigella flexneri. J.Bacteriol. 174,
6359-6367.
Trinkl, H., Lang, B.F., Wolf, K. (1989). Nucleotide sequence of the gene encoding the small ribosomal RNA in
the mitochondrial genome of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nucleic Acids Res. 17 ,
6730
Trumpower, B.L., Edwards, C.A. (1979). Identification of oxidation factor as a reconstitutively active form of
the iron-sulfur protein of the cytochrome b-c1 segment of the respiratory chain. FEBS Lett. 100, 1316.
Rozdział 5. Materiały i metody. Dodatek A
175
Turcq, B., Dobinson, K.F., Serizawa, N., Lambowitz, A.M. (1992). A protein required for RNA processing and
splicing in Neurospora mitochondria is related to gene products involved in cell cycle protein
phosphatase functions. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89, 1676-1680.
Tzagoloff, A., Akai, A., Needleman, R.B. (1975a). Assembly of the mitochondrial membrane system: isolation
of nuclear and cytoplasmic mutants of Saccharomyces cerevisiae with specific defects in
mitochondrial functions. J.Bacteriol. 122, 826-831.
Tzagoloff, A., Akai, A., Needleman, R.B. (1975b). Properties of cytoplasmic mutants of Saccharomyces
cerevisiae with specific lesions in cytochrome oxidase. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 72, 2054-2057.
Tzagoloff, A., Akai, A., Needleman, R.B., Zulch, G. (1975c). Assembly of the mitochondrial membrane
system. Cytoplasmic mutants of Saccharomyces cerevisiae with lesions in enzymes of the respiratory
chain and in the mitochondrial ATPase. J.Biol.Chem. 250, 8236-8242.
Tzagoloff, A., Capitanio, N., Nobrega, M.P., Gatti, D. (1990). Cytochrome oxidase assembly in yeast requires
the product of COX11, a homolog of the P. denitrificans protein encoded by ORF3. EMBO J. 9,
2759-2764.
Tzagoloff, A., Dieckmann, C.L. (1990). PET genes of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol.Rev. 54, 211-225.
Uesono, Y., Toh, Kikuchi, Y. (1997). Ssd1p of Saccharomyces cerevisiae associates with RNA. J.Biol.Chem.
272, 16103-16109.
Valencik, M.L., McEwen, J.E. (1991). Genetic evidence that different functional domains of the PET54 gene
product facilitate expression of the mitochondrial genes COX1 and COX3 in Saccharomyces
cerevisiae. Mol.Cell Biol. 11, 2399-2405.
Vestweber, D., Schatz, G. (1989). DNA-protein conjugates can enter mitochondria via the protein import
pathway. Nature 338, 170-172.
Walker, J.E., Saraste, M., Runswick, M.J., Gay, N.J. (1982). Distantly related sequence in the a- and b- subunits
of ATP synthase, myosin kinase and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding
fold. EMBO J. 1, 945-951.
Watt, P.M., Hickson, I.D., Borts, R.H., Louis, E.J. (1996). SGS1, a homologue of the Bloom's and Werner's
syndrome genes, is required for maintenance of genome stability in Saccharomyces cerevisiae.
Genetics 144, 935-945.
Wegierski, T., Dmochowska, A., Jablonowska, A., Dziembowski, A., Bartnik, E., Stepien, P.P. (1998). Yeast
nuclar PET127 gene can suppress deletions of the SUV3 or DSS1 genes: An indication of a functional
interaction between 3' and 5' ends of mitochondrial mRNAs. Acta Microbiol.Pol. 45, 935-940.
Wells, S.E., Hillner, P.E., Vale, R.D., Sachs, A.B. (1998). Circularization of mRNA by eukaryotic translation
initiation factors. Mol.Cell 2, 135-140.
Rozdział 5. Materiały i metody. Dodatek A
176
Wenzlau, J.M., Saldanha, R.J., Butow, R.A., Perlman, P.S. (1989). A latent intron-encoded maturase is also an
endonuclease needed for intron mobility. Cell 56, 421-430.
Wiesenberger, G., Costanzo, M.C., Fox, T.D. (1995). Analysis of the Saccharomyces cerevisiae mitochondrial
COX3 mRNA 5' untranslated leader: translational activation and mRNA processing. Mol.Cell Biol.
15, 3291-3300.
Wiesenberger, G., Fox, T.D. (1997). Pet127p, a membrane-associated protein involved in stability and
processing of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial RNAs. Mol.Cell Biol. 17, 2816-2824.
Wiesenberger, G., Link, T.A., von Ahsen, U., Waldherr, M., Schweyen, R.J. (1991). MRS3 and MRS4, two
suppressors of mtRNA splicing defects in yeast, are new members of the mitochondrial carrier family.
J.Mol.Biol. 217, 23-37.
Wiesenberger, G., Waldherr, M., Schweyen, R.J. (1992). The nuclear gene MRS2 is essential for the excision of
group II introns from yeast mitochondrial transcripts in vivo. J.Biol.Chem. 267, 6963-6969.
Wilson, R., Ainscough, R., Anderson, K., Baynes, C., Berks, M., Bonfield, J., Burton, J., Connell, M., Copsey,
T., Cooper, J. (1994). 2.2 Mb of contiguous nucleotide sequence from chromosome III of C. elegans.
Nature 368, 32-38.
Woese, C.R., Kandler, O., Wheelis, M.L. (1990). Towards a natural system of organisms: proposal for the
domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 4576-4579.
Wolstenholme, D.R. (1992). Animal mitochondrial DNA: structure and evolution. W: Mitochondrial Genomes ,
Wolstenholme, D. R. and Jeon, K. W. (red.) :173-216. Academic Press Inc.,
Wu, M., Tzagoloff, A. (1989). Identification and characterization of a new gene (CBP3) required for the
expression of yeast coenzyme QH2-cytochrome c reductase. J.Biol.Chem. 264, 11122-11130.
Yang, D., Oyaizu, Y., Oyaizu, H., Olsen, G.J., Woese, C.R. (1985). Mitochondrial origins.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 82, 4443-4447.
Zhu, H., Conrad-Webb, H., Liao, X.S., Perlman, P.S., Butow, R.A. (1989). Functional expression of a yeast
mitochondrial intron-encoded protein requires RNA processing at a conserved dodecamer sequence at
the 3' end of the gene. Mol.Cell Biol. 9, 1507-1512.
Zilhao, R., Camelo, L., Arraiano, C.M. (1993). DNA sequencing and expression of the gene rnb encoding
Escherichia coli ribonuclease II. Mol.Microbiol. 8, 43-51.
