InŜynieria genetyczna

InŜynieria
genetyczna
Udział w badaniach w celu walki z miaŜdŜycą
Warsztaty doświadczalne
PROTOKÓŁ
InŜynieria genetyczna
Poszukiwanie miejsca docelowego dla leku na miaŜdŜycę
Wprowadzenie
Badania biomedyczne dotyczą procesów fizycznych i chemicznych, które
przebiegają we wnętrzu organizmów Ŝywych, a takŜe procesów wywołujących
choroby. Jednym z głównych celów tej dziedziny badań jest określenie miejsc
docelowych działania leków, czyli np. części ciała, w które moŜna skierować nowe
leki, czego wynikiem będzie uzyskanie odpowiedzi i pomoc w walce z chorobą.
Ten protokół jest zgodny z wytycznymi naukowych badań biomedycznych
dotyczącymi badania potencjalnego miejsca docelowego, które mogłoby zostać
rozpoznane przez lek na miaŜdŜycę.
Co powoduje miaŜdŜycę?
MiaŜdŜyca jest chorobą naczyń spowodowaną nagromadzeniem się tłuszczy na ścianach naczyń
krwionośnych. Istnieje wiele róŜnych oznak i stopni cięŜkości choroby zaleŜnie od tego, gdzie znajdują
się chore naczynia i jak bardzo choroba się rozwinęła. SpoŜywanie pokarmów bogatych w tłuszcze
nasycone doprowadziło w naszym społeczeństwie do znacznego wzrostu ryzyka rozwoju chorób
układu sercowo-naczyniowego. Ten nadmiar tłuszczu w naszym organizmie moŜe się odłoŜyć i
zgromadzić
w
niektórych
miejscach
ścian
tętnic
w
postaci
blaszek
miaŜdŜycowymi, które następnie powodują zahamowanie przepływu krwi.
----- Tętnica prawidłowa
-----
MiaŜdŜyca umiarkowana
----- MiaŜdŜyca cięŜka
InŜynieria genetyczna - 2 -
zwanych
blaszkami
Cholesterol i makrofagi
Cholesterol jest jednym z wielu lipidów wchodzących w skład blaszek miaŜdŜycowych. Aby nie
dopuścić do odkładania się cholesterolu na ścianach naczyń, nasz organizm jest wyposaŜony w układ
„oczyszczający”, czyli makrofagi, które są komórkami krąŜącymi we krwi i wychwytującymi cząsteczki
złego cholesterolu znanego jako LDL (lipoproteiny o niskiej gęstości).
Makrofagi rozpoznają te cząsteczki dzięki
znajdującym się na ich błonach receptorom. Układ
oczyszczający jest wydajny, jeŜeli stęŜenie
LDL
cholesterolu nie jest nadmiernie podwyŜszone.
Utleniony LDL
Utlenianie LDL
JeŜeli stęŜenie cholesterolu jest zbyt wysokie,
makrofagi nadal będą wychwytywać LDL, ale gdy
Proliferacja
komórek
śródbłonka
pochłoną zbyt duŜe ich ilości, przekształcą się w tak
zwane komórki „piankowe”. Takie komórki wytwarzają
substancje indukujące stan zapalny i proliferację
komórek w ścianach tętnic (komórek śródbłonka),
Aktywacja
układu
immunologicznego
czego wynikiem jest powstanie blaszek
miaŜdŜycowych blokujących przepływ krwi.
Komórka
piankowa
LDL
Obecnie grupy naukowców na całym świecie, w tym
takŜe grupa zajmująca się badaniem receptorów
jądrowych na uniwersytecie w Barcelonie, starają się
lepiej zrozumieć mechanizm, za pośrednictwem
którego makrofagi są zaangaŜowane w regulację
stęŜenia cholesterolu i rozwój miaŜdŜycy.
Naukowcy badają w szczególności rolę znajdującego
Utlenianie LDL
się w makrofagach białka, noszącego nazwę MYLIP.
Główną funkcją tego białka jest rozkładanie receptora błonowego makrofagów odpowiedzialnego za
rozpoznawanie LDL. Naukowcy zaobserwowali, Ŝe jeŜeli to białko jest wytwarzane w duŜych ilościach,
InŜynieria genetyczna - 3 -
makrofagi wchłaniają mniej cholesterolu. Niemniej jednak jego rola w kontekście miaŜdŜycy nadal nie
jest w pełni poznana.
Makrofag
PoniewaŜ zaobserwowano, Ŝe białko MYLIP jest
związane z regulacją stęŜenia złego cholesterolu,
naukowcy uwaŜają, Ŝe moŜe to być nowe w
procesie regulacji miejsce docelowe dla leków na
miaŜdŜycę.
Utleniony LDL
Utlenianie LDL
W jaki sposób moŜemy badać białko MYLIP zaangaŜowane w regulację stęŜenia cholesterolu?
Aby naukowcy mogli zbadać to potencjalne miejsce docelowe, muszą wytworzyć w laboratorium
znaczne ilości tego białka. W tym celu wykorzystują metodę inŜynierii genetycznej, tak zwaną
transformację bakteryjną, za pomocą której przenoszą DNA z organizmu do bakterii, dzięki czemu
bakterie będą wytwarzać duŜe ilości DNA, które następnie moŜna wprowadzić do innych komórek,
aby produkowały one białko docelowe dla celów badania.
Naukowcy zaczynają od oczyszczonej postaci genu produkującego białko MYLIP. Następnie łączą je
z kolistym fragmentem DNA zwanym plazmidem i wprowadzają go do bakterii, aby mogły one
produkować repliki materiału genetycznego.
W ramach tego protokołu zapraszamy Was do pracy w roli biotechników i przeprowadzenia
transformacji bakteryjnej!
InŜynieria genetyczna - 4 -
Organizacja warsztatów:
1. Rozpoczniemy od przeprowadzenia transformacji bakteryjnej obejmującej wprowadzenie DNA
odpowiedzialnego za wytwarzanie białka MYLIP, aby bakterie mogły pełnić funkcję bioreaktorów
i wytwarzać materiał genetyczny w znacznych ilościach.
2. Następnie umoŜliwimy hodowlę bakterii na odpowiedniej poŜywce i wybierzemy te bakterie,
które wbudowały gen.
3. Oczyścimy materiał genetyczny odpowiedzialny za wytwarzanie białka MYLIP tak, aby moŜna
go było wprowadzić do innych typów komórek, które następnie będą wytwarzać białko (*).
(*) PoniewaŜ wzrost bakterii trwa półtora dnia, oczyszczanie zostanie przeprowadzone z wykorzystaniem hodowli bakteryjnej
przygotowanej wcześniej przez monitorów
InŜynieria genetyczna - 5 -
Sprzęt i materiały wymagane dla kaŜdej grupy/tabela
2 probówki z
1 probówka na lodzie
1 probówka z poŜywką
Mikropipety o
bakteriami na lodzie,
z kolistym DNA,
„LB” do hodowli bakterii
pojemności 20 µl i
oznaczone nr 1 i 2.
plazmid
(C)
200 µl
(A) pudełko
pCR2.1-MYLIP.
polistyrenowe +
(B)
Ezy plastikowe
lód
Końcówki do
Końcówki do
2 szalki Petriego z
mikropipet o
mikropipet o
agarem i
pojemności 20 µl i
pojemności 20 µl i
antybiotykiem:
200 µl
200 µl
(D) ampicyliną
Łaźnia wodna z wodą
Pływak na probówki
Zlewka na odpady
Zlewki na odpady
destylowaną
stoper
stałe
płynne
Plaster
1 probówka z 1 ml
1 probówka z
1 probówka z
Trwały marker
hodowli bakteryjnej
„roztworem 1” Mini-
„roztworem 2” Mini-
(E)
prep (F)
prep (G)
1 probówka z
1 probówka z
1 probówka z
1 probówka z wodą
„roztworem 3” Mini-
„chloropanem” (I)
„etanolem”
ultraczystą (milliQ).
prep (H)
InŜynieria genetyczna - 6 -
(A) Bakterie, do których moŜna wprowadzić DNA (zwane komórkami kompetentnymi XL1-blue)
(B) Koliste DNA zwane plazmidem (pCR2.1)
(C) PoŜywka hodowlana LB (Luria-Bertani): ekstrakt z droŜdŜy 5 g/l, Trypton 10 g/l, NaCl 5 g/l.
Sterylizować w autoklawie. Przechowywać w chłodnym miejscu.
(D) Płytki z poŜywką LB/ampicyliną: PoŜywka hodowlana LB, agar 1,6%, ampicylina 100 µg/ml.
(E) Bakterie hodowane w poŜywce 2XYT, przez noc (16 h)
(F) Roztwór 1: 50 mM glukozy/25 mM Tris-HCl pH 8,0/10 mM EDTA/Rozcieńczyć wodą destylowaną.
(G) Roztwór 2: 20 µl detergentu SDS (siarczan dodecylosodowy) 10%/4 µl NaOH 10N/176 µl H2O
mQ/dla kaŜdej próbki. Sporządzić duplikat w dniu warsztatów.
(H) Roztwór 3 Mini-prep: 73,60 g octanu potasu/28,75 ml kwasu octowego/Rozcieńczyć w H2O mQ do
końcowej objętości 250 ml.
(I) Chloropan: 25 ml zrównowaŜonego fenolu/24 ml chloroformu/1 ml alkoholu izoamylowego.
Wirować przez 10 min przy 3000 obr./min.
InŜynieria genetyczna - 7 -
Procedury
1- TRANSFORMACJA BAKTERYJNA
Transformacja bakteryjna jest procesem biotechnologicznym, w trakcie którego naukowcy
wprowadzają materiał genetyczny odpowiedzialny za wytwarzanie danego białka do komórki
bakteryjnej. Taka komórka będzie następnie pełnić funkcję bioreaktora i wytwarzać kopie tego
materiału genetycznego, które w dalszej kolejności będzie moŜna wprowadzić do innego typu
komórek, aby mogły one wytwarzać białko docelowe. (*)
W trakcie tych warsztatów rozpoczniemy od wytworzenia oczyszczonego genu białka „MYLIP”, który
następnie wprowadzimy do plazmidu, czyli kolistej cząsteczki DNA.
Korzystając z tego materiału genetycznego, przeprowadzimy transformację bakteryjną, czyli
wprowadzimy do bakterii gen odpowiedzialny za wytwarzanie naszego białka, stosując metodę szoku
cieplnego – poddając próbkę działaniu róŜnych temperatur.
(*)W przypadkach gdy białko docelowe nie jest tak złoŜone, bakterie po transformacji same mogą pełnić rolę bioreaktorów i
wytwarzać to białko.
InŜynieria genetyczna - 8 -
Protokół transformacji bakteryjnej
1. Mamy na lodzie dwie probówki zawierające bakterie. KaŜda probówka zawiera roztwór buforu,
2+
który wspomoŜe transformację dzięki obecności kationów Ca
pochodzących z soli CaCl2
znajdującej się w buforze.
Co się dzieje? W zimnej temperaturze kationy Ca
2+
wpływają
na błony komórek tak, Ŝe stają się one przepuszczalne dla
2+
DNA. Jony Ca
wiąŜą się z fosfolipidami błony komórkowej,
chroniąc ich ujemny ładunek i tworząc niewielkie pory w błonie
bakterii.
2. Dodanie DNA w formie plazmidu do bakterii: za pomocą mikropipety 20 µl, odpipetować
10 µl plazmidu (probówka P) i dodać do probówki 2 zawierającej bakterie. Zamknąć probówkę i
delikatnie wymieszać, ostukując probówkę palcem. Probówka 1 będzie probówką kontrolną,
poniewaŜ zawiera bakterie bez plazmidu.
InŜynieria genetyczna - 9 -
2+
Co się dzieje? Jony Ca
wchodzą w reakcje z ujemnie naładowanymi grupami
fosforanowymi DNA, dzięki czemu mogą się znaleźć blisko błon bakteryjnych, ale
nie zostają od nich odepchnięte ze względu na ich ładunek elektryczny.
3. Pozostawić probówki na 15 minut w celu inkubacji
* W międzyczasie przeprowadzić pierwszy etap protokołu „Hodowla transformowanych bakterii” (page 12).
4. Po 15 minutach włoŜyć probówkę 1 i 2 do łaźni wodnej o temperaturze 42ºC na dokładnie 1
minutę i 30 sekund.
Co się dzieje? Kolista cząsteczka DNA lub plazmid
przechodzi przez pory niektórych bakterii. W jaki sposób? W
temperaturze 42ºC elastyczność błony bakteryjnej rośnie,
dzięki czemu plazmid moŜe łatwiej przejść przez pory.
InŜynieria genetyczna - 10 -
5. WłoŜyć probówki 1 i 2 z powrotem do lodu na 2 minuty.
Co się dzieje? Gdy temperatura spada, błony się
stabilizują i plazmid, który przeszedł przez pory,
pozostaje wewnątrz bakterii.
InŜynieria genetyczna - 11 -
2- HODOWLA TRANSFORMOWANYCH BAKTERII
Po wprowadzeniu plazmidu do bakterii naleŜy doprowadzić do namnaŜania się bakterii, zapewniając
im odpowiednią poŜywkę i właściwą temperaturę. PoniewaŜ w wyniku transformacji bakteryjnej
powstaje zwykle niewiele komórek, w których zaszła transformacja, i wiele komórek bez transformacji,
potrzebna jest metoda do rozpoznania komórek, które wbudowały plazmid.
NaleŜy dopilnować, aby namnaŜać tylko bakterie stransformowane, co moŜna wykonać, prowadząc
hodowlę na płytkach hodowlanych zawierających antybiotyk. PoniewaŜ plazmid zawiera gen
odpowiedzialny za oporność bakterii na ten lek, jedynie stransformowane bakterie będą tworzyć
kolonie. Następnie pobierając bakterie z tych kolonii, będziemy mogli prowadzić hodowlę tylko tych
bakterii, które wytwarzają gen docelowy.
Gen
MYLIP
Gen oporności
na ampicylinę
Ampicylina
Ampicylina
InŜynieria genetyczna - 12 -
Protokół hodowli transformowanych bakterii
1. Oznaczyć płytki, na których będą hodowane bakterie. Jedna z nich będzie płytką kontrolną do
hodowli bakterii bez plazmidu, a druga będzie przeznaczona do hodowli bakterii z plazmidem.
2. Za pomocą mikropipety 200 µl dodać 500 µl poŜywki hodowlanej „LB” zawierającej składniki
odŜywcze do probówki 1 i 2. Zamknąć probówki i delikatnie wymieszać, ostukując probówki
palcem.
3. Inkubować mieszaninę w łaźni wodnej w temperaturze 37ºC przez 30 minut.
Co się dzieje? W tym okresie bakterie mają czas, aby się
namnaŜać, czyli podwajają swoje DNA i tworzą takŜe kopię
plazmidowego DNA zawierającego docelowy gen.
*Czekając na wzrost bakterii, moŜna przeprowadzić trzeci etap warsztatów obejmujący izolację materiału genetycznego z
bakterii (page 16).
InŜynieria genetyczna - 13 -
4. Za pomocą mikropipety 200 µl (za kaŜdym razem naleŜy korzystać z nowej końcówki) dodać
bakterie (100-200 µl) z probówki 1 i 2 na płytki agarowe zawierające takŜe antybiotyk,
ampicylinę.
5. Rozmieścić bakterie na powierzchni kaŜdej płytki agarowej, za kaŜdym razem stosując nową,
sterylną plastikową ezę. Obracać płytkę w trakcie przesuwania ezy tam i z powrotem. Zakleić
płytki taśmą i napisać na niej swoje inicjały oraz datę i typ bakterii.
InŜynieria genetyczna - 14 -
6. Odwrócić płytki i inkubować w temperaturze 37ºC i następnego dnia sprawdzić wyniki. JeŜeli
inkubator nie jest dostępny, wystarczy po prostu pozostawić bakterie do wzrostu przez kilka dni
w temperaturze pokojowej.
InŜynieria genetyczna - 15 -
3- IZOLACJA UZYSKANEGO MATERIAŁU GENETYCZNEGO
Aby uzyskać duŜe ilości materiału, naukowcy pobierają próbkę transformowanych bakterii, które
utworzyły kolonie, i wprowadzają ją do innej poŜywki hodowlanej zawierającej składniki odŜywcze.
Materiał genetyczny wytworzony przez bakterie musi zostać wyizolowany, czyli naleŜy go oddzielić od
pozostałych części bakterii, takich jak RNA, DNA bakterii i białka. Aby wyizolować plazmid, naukowcy
przeprowadzają protokół o nazwie Mini-prep. Ta procedura pozwala na separację DNA w postaci
plazmidu dzięki wykorzystaniu róŜnych rozpuszczalników i cykli wirowania, w trakcie których
stopniowo są odrzucane róŜne składniki komórkowe.
Oczyszczone DNA jest bardzo przydatne dla naukowców, którzy mogą prowadzić dalsze
eksperymenty nad jego rolą w regulacji stęŜenia cholesterolu i w miaŜdŜycy oraz badania dotyczące
nowych leków.
PoniewaŜ proces hodowli większej ilości bakterii zajmuje około półtora dnia, w trakcie tych warsztatów
będzie wykorzystywana hodowla przygotowana wcześniej przez monitorów.
ROZTWÓR 2
ROZTWÓR 3
CHLOROPAN
InŜynieria genetyczna - 16 -
ETANOL
gen
MYLIP
Gen oporności
na ampicylinę
Protokół oczyszczania plazmidowego DNA z hodowli bakteryjnej (Miniprep)
1. Zwirować probówkę z hodowlą bakterii przy maksymalnej prędkości przez 30 sekund. Następnie
odrzucić supernatant.
Co się dzieje? Komórki zostają oddzielone od
poŜywki hodowlanej, w której wzrastały, zwykle
zawierającej odpady komórek i inne cząsteczki,
których się chcemy pozbyć.
2. Następnie naleŜy odrzucić supernatant i za pomocą mikropipety 200 µl zawiesić osad w 100 µl
roztworu 1 i wymieszać pipetą.
Co się dzieje? Bakterie zostają zawieszone w roztworze, dzięki czemu proces oczyszczania
moŜe postępować dalej, ale tym razem stęŜenie bakterii jest wyŜsze, poniewaŜ znajdują się w
mniejszej objętości. Roztwór 1 jest buforem zapobiegającym denaturacji kolistego DNA w
postaci plazmidu, która by nastąpiła, gdyby pH wzrosło powyŜej 12,6.
3. Dodać 200 µl roztworu 2 i delikatnie wymieszać, odwracając.
Co się dzieje? Roztwór 2 zawierający
detergent niszczy błony fosfolipidowe bakterii,
ROZTWÓR 2
uwalniając całą zawartość komórek do poŜywki
w trakcie procesu zwanego lizą bakteryjną. Ten
roztwór zawiera takŜe silną zasadę
(wodorotlenek sodu, NaOH) denaturującą
białka podtrzymujące strukturę błony
komórkowej i własne DNA bakterii. Niemniej
jednak plazmidowe DNA pozostaje
nienaruszone, poniewaŜ pH wynosi poniŜej
12,6.
InŜynieria genetyczna - 17 -
4. Dodać 150 µl roztworu 3 i wymieszać, odwracając.
Co się dzieje? Roztwór 3 jest kwaśnym roztworem
octanu sodu, który neutralizuje pH roztworu i
ROZTWÓR 3
zatrzymuje proces lizy. Na tym etapie większość
zawartości komórek – białka, fosfolipidy błon i własne
DNA bakterii – wytrąca się, tworząc białą zawiesinę.
Własne DNA bakterii, teraz zdenaturowane, tworzy
nierozpuszczalny kompleks, który się wytrąca,
+
poniewaŜ jony K wiąŜą się z grupami fosforanowymi DNA i w ten sposób neutralizują ich ujemny
ładunek.
5. Dodać 300 µl chloropanu, dobrze wymieszać, odwracając i wirować przez 3 minuty przy
maksymalnej prędkości, aby oddzielić plazmid zawarty w genie od MYLIP.
Co się dzieje? W tym etapie plazmidowe DNA zostaje
oddzielone od pozostałości komórkowych – białek,
lipidów i innych kwasów nukleinowych. Chloropan jest
CHLOROPAN
mieszaniną rozpuszczalników organicznych
zawierającą fenol i chloroform. Te rozpuszczalniki
rozpuszczają cząsteczki hydrofilne, takie jak błony
lipidowe, i denaturują białka, w wyniku czego stają się
one nierozpuszczalne w wodzie. Dzięki wirowaniu
mieszanina zostaje podzielona na dwie fazy: fosfolipidy i białka komórkowe pozostają w roztworze w
dolnej fazie z chloropanem lub znajdują się na powierzchni między fazami w postaci białej, wytrąconej
zawiesiny. Plazmidowe DNA będzie się znajdować się w górnej fazie wodnej, poniewaŜ jego ładunki
elektryczne nie zostały zneutralizowane i tym samym jest rozpuszczalne w wodzie.
6. Za pomocą pipety 200 µl naleŜy przenieść górną, przezroczystą fazę wodną do nowej
probówki.
InŜynieria genetyczna - 18 -
7. Za pomocą pipety 200 µl dodać 900 µl 100% etanolu i dobrze wymieszać. Po dodaniu etanolu
plazmidowe DNA wytrąca się z roztworu wodnego.
gen oporności
na ampicylinę
8. Wirować przez 5 minut przy maksymalnej prędkości. Widoczny wytrącony osad będzie
zawierać DNA w postaci plazmidu.
9. Pipetą 200 µl odciągnąć CAŁY etanol.
10. Zawiesić osad z plazmidowym DNA w 20 µl oczyszczonej H2O.
InŜynieria genetyczna - 19 -
Wyniki i omówienie
1. Wykonaj diagram procesu transformacji bakteryjnej i objaśnij, jaką pełni rolę w badaniach nad
poszukiwaniem nowych leków w celu walki z miaŜdŜycą.
2. Korzystając z diagramu, objaśnij, czym jest szok cieplny.
3. W celu prowadzenia hodowli bakterii korzystałeś z płytki hodowlanej zawierającej antybiotyk.
Dlaczego?
4. Czym jest kolonia bakteryjna?
5. Na której z dwóch płytek z naniesionymi bakteriami będą widoczne kolonie – na płytce kontrolnej
czy na płytce zawierającej stransformowane bakterie? Dlaczego?
InŜynieria genetyczna - 20 -
6. W jaki sposób otrzymywanych jest wiele kopii docelowego genu z wykorzystaniem powstałych
kolonii?
7. W jaki sposób wytrąca się bakteryjne DNA i docelowe DNA? Objaśnienie naleŜy podeprzeć
diagramem.
8. Stosując metodę separacji o nazwie Mini-prep, wyizolowałeś wiele kopii docelowego DNA. Co
naukowcy robią, gdy otrzymają takie DNA?
Badacze, którzy pracowali nad przygotowaniem tego protokołu: Theresa León, Jonathan
Matalonga, Uniwersytet w Barcelonie
AUTOR:
FINANSOWANIE
PARTNERZY PROJEKTU:
Niniejszy produkt jest udostępniany na licencji Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs
3.0 Unported. Kopię licencji przedstawiono na stronie http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/
InŜynieria genetyczna - 21 -