Odróżnianie izolatów bakterii rizosferowych techniką rep

Analizy molekularne
Metodyka:
Odróżnianie izolatów bakterii rizosferowych techniką rep-PCR
Technika rep-PCR umożliwia odróżnienie izolatów bakterii rizosferowych pozyskanych
z gleby i kultywowanych na podłożach. Podstawą tej techniki jest amplifikacja fragmentów
DNA przy użyciu starterów komplementarnych do sekwencji powtarzalnych. W genomie
bakterii występują powtarzalne sekwencje DNA, których rozmieszczenie, unikalne dla
każdego szczepu, jest podstawą techniki pozwalającej na odróżnienie izolatów bakterii
(DNA fingerprint). Dotychczas zidentyfikowano kilka sekwencji powtarzalnych
określanych jako REP (repetitive extragenic palindromic sequence), ERIC (enterobacterial
repetitive intergenic consensus) oraz BOXA, podjednostkę elementu BOX. Wynik analizy,
w którym uzyskuje się taki sam profil DNA dla kilku izolatów, pozwala określić ich
przynależność do tego samego szczepu bakterii.
Wykrywanie oraz odróżnianie gatunków grzybów mikoryzowych zasiedlających
korzenie roślin technikami zagnieżdżonego PCR i RFLP
Techniki molekularne umożliwiają wykrycie, odróżnienie oraz identyfikację
arbuskularnych grzybów mikoryzowych zasiedlających korzenie roślin. Materiał do testów
stanowi DNA pozyskany z korzeni roślin. Reakcja zagnieżdżonego PCR jest
przeprowadzana z użyciem starterów umożliwiających amplifikację fragmentów dużej
podjednostki genu rybosomalnego (LSU rDNA). Produkty reakcji są klonowane
i transformowane do bakterii Escherichia coli. Uzyskane produkty reakcji są poddawane
trawieniu enzymami restrykcyjnymi, a następnie sekwencjonowane.
Identyfikacja gatunków bakterii PGPR oraz grzybów mikoryzowych na podstawie
analizy sekwencji fragmentów DNA
Techniki molekularne umożliwiają identyfikację gatunków bakterii PGPR oraz grzybów
zasiedlających glebę i korzenie roślin, w tym arbuskularnych grzybów mikoryzowych.
W celu identyfikacji wykonuje się amplifikację fragmentów rybosomalnego genu 16S
rDNA dla bakterii lub 18S rDNA dla grzybów. Uzyskane produkty reakcji są poddawane
sekwencjonowaniu. Na podstawie analizy uzyskanych sekwencji DNA jest określana
przynależność bakterii i grzybów do gatunku.