218636 pl 21863 6 b1 - Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12)
OPIS PATENTOWY
(19)
(21) Numer zgłoszenia: 396985
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(54)
PL
218636
(13) B1
(11)
(51) Int.Cl.
C12N 1/20 (2006.01)
C12R 1/01 (2006.01)
(22) Data zgłoszenia: 15.11.2011
Sposób hodowli bakterii Legionella lytica na sztucznym podłożu
(73) Uprawniony z patentu:
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
UNIWERSYTET MARII
CURIE-SKŁODOWSKIEJ, Lublin, PL
27.05.2013 BUP 11/13
(72) Twórca(y) wynalazku:
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
PL 218636 B1
30.01.2015 WUP 01/15
MARTA PALUSIŃSKA-SZYSZ, Lublin, PL
TERESA URBANIK, Lublin, PL
ELŻBIETA WIŚNIEWSKA, Rudka, PL
2
PL 218 636 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób hodowli bakterii z gatunku Legionella lytica na sztucznym
podłożu, a zwłaszcza chorobotwórczego szczepu LT2 PCM 2298, celem wykorzystania ich dla opracowania testów szybkiej diagnostyki nietypowego zapalenia płuc.
Bakterie szczepu Legionella lytica podobnie jak inne bakterie należące do rodziny Legionellaceae prowadzą pasożytniczy tryb życia wewnątrz określonych gatunków pierwotniaków oraz w komórkach żernych ssaków. W organizmie człowieka, bakterie te zachowują się jak oportunistyczne patogeny zdolne do proliferacji wewnątrz monocytów i makrofagów alweolarnych oraz w komórkach nabłonkowych pęcherzyków płucnych, stając się ważnym czynnikiem odpowiedzialnym za zapalenie płuc.
Badania etiologii zapalenia płuc wykazują że pałeczki Legionella są odpowiedzialne za 2% - 16%
przypadków zachorowań (Bohte R. i wsp. Thorax 50, 1995) od 14% do 37% zachorowań o ciężkim
przebiegu, w których śmiertelność przekracza 25% (Hubbard R. i wsp. Quart J. Med. 86, 1993). Do
infekcji ludzi dochodzi zarówno w miejscu zamieszkania (community acquired pneumonia - CAP),
a także podczas pobytu w szpitalu (nosocomical pneumonia).
Pałeczki Legionella występują głównie w środowisku wodnym naturalnych zbiorników jak stawy
i jeziora oraz sztucznych systemach dystrybucji wody jak klimatyzatory czy urządzenia wytwarzające
wodno-powietrzny aerozol, gdzie żyją również określone gatunki pierwotniaków pozwalające na ich
namnażanie. W cyklu życiowym Legionella występuje faza troficzna, która odbywa się w parazytosomach pierwotniaków oraz faza infekcyjna, przebiegająca w warunkach abiotycznych i charakteryzująca się dużą przeżywalnością postaci infekcyjnych bakterii. Dojrzałe postacie infekcyjne, po uwolnieniu
się z komórki gospodarza do wody, zdolne są do przeżycia długiego czasu uśpienia, zachowując wysoką inwazyjność i wirulencję in vitro względem pierwotniaków i komórek żernych ssaków. Patogenność form infekcyjnych opisano na modelu świnek morskich, reagujących na bakterie tak jak osoby
z obniżoną odpornością (Cirillo i wsp. Infect. Immun., 62,1994; Fields i wsp. Infect. Immun. 58, 1990).
Postaci infekcyjne, mimo, iż są żywe poza komórką gospodarza, nie są niezdolne do tworzenia
kolonii na sztucznym podłożu BCYE, tzw. formy VBNC - viable but nonculturable, jak opisano w literaturze Fields i wsp. Clin. Microbiol. Rev. 15, 2002. Hodowla takich form bakterii możliwa jest tylko
w komórkach naturalnego gospodarza jak pierwotniaki lub zarodki kurze.
Jak widomo z powszechnych eksperymentów, a także z publikacji Rowbotham, J. Clin. Pathol.
33, 1980, hodowla bakterii Legionella w komórkach naturalnego gospodarza przebiega z udziałem
zarówno bakterii pochodzących z naturalnego środowiska jak i z kolekcji szczepów. Z kolei hodowla
bakterii Legionella na sztucznym podłożu BCYE przebiega pod warunkiem, że bakterie pochodzą
z kolekcji szczepów (Ristroph i wsp., J. Clin. Microbiol. 13, 1981).
Uzyskanie wzrostu na sztucznym podłożu, niektórych Legionella, a zwłaszcza Legionella
pneumophila, jak podaje Steinert i wsp. Appl. Environ. Microbiol., 63, 1997, możliwe jest dopiero po
ich przepasażowaniu przez komórki Acanthamoeba castellanii jako naturalnego gospodarza.
Wyżej wspomniany sposób przepasażowania nie jest skuteczny w przypadku wzrostu na
sztucznym podłożu Legionella lytica.
Znane dotychczas sposoby hodowli bakterii szczepu LT2 PCM 2298 Legionella lytica przebiegają w komórkach naturalnego gospodarza np. Acanthamoeba castellanii, Acanthamoeba polyphaga,
czy też liniach komórkowych makrofagów U937 (Springer i wsp. FEMS Microbiol. Lett., 15,1992).
Inne znane sposoby hodowli szczepu LT2 PCM 2298 Legionella lytica (Palusińska-Szysz i wsp.
FEMS Mirobiol. Lett., 283, 2008), wprawdzie przebiegają z użyciem sztucznego podłoża BCYE, ale
tylko w sytuacji gdy inokulum nie pochodzi z naturalnego środowiska lecz z kolekcji szczepów.
Celem wynalazku było więc opracowanie sposobu namnażania dużej ilości bakterii z gatunku
Legionella lytica, zwłaszcza chorobotwórczego szczepu LT2 PCM 2298, na sztucznym podłożu,
w czystej hodowli i z inokulum pochodzącym z naturalnego środowiska.
Cel ten osiągnięto nieoczekiwanie prowadząc hodowlę Legionella lytica nowym sposobem,
z użyciem jako gospodarza Acanthamoeba castellanii wolnego od wewnątrzkomórkowych endosymbiontów.
Sposób hodowli bakterii Legionella lytica na sztucznym podłożu, z użyciem naturalnego gospodarza, według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako naturalnego gospodarza wykorzystuje się
wolne od wewnątrzkomórkowych endosymbiontów komórki pierwotniaka Acanthamoeba castellanii,
6
w najbardziej żywotnej, logarytmicznej fazie wzrostu, w ilości od 3,9 do 4,1 x 10 komórek na 1 ml,
które następnie zakaża się zamrażanymi przez co najmniej 24h w temperaturze od -10 do -20°C,
PL 218 636 B1
3
bakteriami Legionella lytica, w stosunku ilościowym bakterii do ameb około 7:1, po czym dla maksymalnego pochłonięcia bakterii przez pierwotniaki, hodowlę pozostawia się jeszcze na co najmniej
1 godz. w temperaturze pokojowej, a następnie wytrząsa się, korzystnie przy 120 obrotach/min i temperaturze optymalnej dla rozwoju ameb ok. 28°C.
Po przeprowadzonej obserwacji mikroskopowej, gdy bakterie są w wakuolach, a więc nie ukończyły procesu transformacji do dojrzałych form infekcyjnych, hodowlę wiruje się dla wymuszenia uwolnienia bakterii w takim stadium, korzystnie przez ok. 15 minut przy obrotach co najmniej 6 tys./min.,
a następnie uzyskany osad wysiewa się na podłoże BCYE i po około tygodniowej inkubacji w temperaturze 33 - 35°C uzyskuje się wzrost hodowlanych bakterii.
Wynalazek przedstawiono w poniższych przykładach wykonania.
P r z y k ł a d I.
Bakterie Legionella lytica, szczep LT2 PCM 2298, pobrane z naturalnego środowiska wodnego,
zamrażano przez 24 godziny w temperaturze -20°C, a następnie wprowadzono do hodowli pochodzących z kolekcji ameb Acanthamoeba castellanii, szczep ATCC 3034 będących w logarytmicznej fazie
6
wzrostu w ilości 4,1 x 10 komórek na 1 ml, w stosunku ilościowym bakterii do ameb 7:1 i pozostawiono w temperaturze pokojowej w celu pochłonięcia bakterii przez ameby. Po godzinie hodowlę wytrząsano nieprzerwanie przez 1 dobę w temperaturze 28°C przy 120 obrotach/min. Następnie prowadzono obserwację hodowli w mikroskopie kontrastowo-fazowym przy powiększeniu 480 x, wykonując
bezpośrednie preparaty z próbki pobranej w warunkach jałowych. Preparaty przyżyciowe wykonywano
co 4 godziny przez trzy doby. Po 24 godzinach od zakażenia zaobserwowano pojawienie się pojedynczych bakterii w wakuolach komórek pierwotniaków.
Z takiej hodowli pobrano próbkę A, którą wirowano przez 15 minut przy obrotach 6 tys./min.
Uzyskany osad wysiewano na podłoże BCYE i pozostawiono do inkubacji w temperaturze 35°C. Po
tygodniu, na płytkach pojawiały się kolonie charakterystyczne dla Legionella lytica, wykazujące niebiesko-białą fluorescencję po naświetleniu promieniami UV o długości 365 nm. Tak zainicjowaną hodowlę po przesianiu na świeżą pożywkę BCYE prowadzono jeszcze przez dwa tygodnie do uzyskania
założonej masy bakterii.
Pozostałą część hodowli po oddzieleniu próbki A, oznaczoną jako próbka B, poddano dalszemu
wytrząsaniu do zakończenia cyklu infekcyjnego. Po 72 godzinach widoczne były intensywnie poruszające się pałeczki Legionella lytica, które po zniszczeniu komórki gospodarza uwolniły się do płynu
pohodowlanego. Dla porównania bakterie te również wysiano na podłoże BCYE i inkubowano w tych
samych warunkach jak bakterie pochodzące z próbki A. Bakterie te były żywe i infekcyjne w stosunku
do ameb, jednak nie tworzyły kolonii na sztucznym podłożu BCYE.
Poniższe zdjęcia mikroskopowe, określone jako figury, przedstawiają cykl rozwojowy bakterii
Legionella lytica przebiegający sposobem według wynalazku.
Fig. 1. Próbka A - Bakterie Legionella lytica w wakuolach Acanthamoeba castellanii, które nie
ukończyły procesu transformacji do dojrzałych form infekcyjnych.
4
PL 218 636 B1
Fig. 2. Próbka A - wyhodowane na podłożu BCYE kolonie bakterii Legionella lytica.
Fig. 3. Próbka B - pałeczki bakterii L. lytica, które po zniszczeniu komórki gospodarza uwolniły
się do płynu pohodowlanego, po zakończenia cyklu infekcyjnego. Widoczne żywe i infekcyjne w stosunku do ameb bakterie Legionella lytica, nie tworzą kolonii na sztucznym podłożu BCYE.
P r z y k ł a d II.
Bakterie Legionella lytica, szczep LT2 PCM 2298, pobrane z naturalnego środowiska wodnego,
zamrażano przez 24 godziny w temperaturze -10°C, a następnie wprowadzono do hodowli pochodzącej z kolekcji ameb Acanthamoeba castellanii, szczep ATCC 3034, będącej w logarytmicznej fazie
6
wzrostu w ilości 3,9 x 10 komórek na 1 ml, w stosunku ilościowym bakterii do ameb 7:1 i pozostawiono w temperaturze pokojowej w celu pochłonięcia bakterii przez ameby. Po godzinie hodowlę wytrząsano nieprzerwanie przez 1 dobę w temperaturze 28°C przy 120 obrotach/min. Następnie prowadzono obserwację hodowli w mikroskopie kontrastowo-fazowym przy powiększeniu 480 x, wykonując
bezpośrednie preparaty z próbki pobranej w warunkach jałowych. Preparaty przyżyciowe wykonywano
co 4 godziny przez trzy doby. Po 24 godzinach od zakażenia zaobserwowano pojawienie się pojedynczych bakterii w wakuolach komórek pierwotniaków.
Następnie hodowlę wirowano przez 15 minut przy obrotach 7,0 tys./min, a uzyskany osad wysiewano na podłoże BCYE i pozostawiono do inkubacji w temperaturze 33°C. Po tygodniu, na płytkach pojawiały się kolonie charakterystyczne dla Legionella lytica, wykazujące niebiesko-białą fluorescencję po naświetleniu promieniami UV o długości 365 nm. Tak zainicjowaną hodowlę po przesianiu
na świeżą pożywkę BCYE prowadzono jeszcze przez dwa tygodnie do uzyskania założonej masy
bakterii.
PL 218 636 B1
5
Zastrzeżenia patentowe
1. Sposób hodowli bakterii Legionella lytica na sztucznym podłożu, z użyciem naturalnego gospodarza, znamienny tym, że jako naturalnego gospodarza wykorzystuje się wolne od wewnątrzkomórkowych endosymbiontów komórki pierwotniaka Acanthamoeba castellanii, w najbardziej żywotnej,
6
logarytmicznej fazie wzrostu w ilości od 3,9 do 4,1 x 10 komórek na 1 ml, które następnie zakaża się
zamrożonymi przez co najmniej 24 h, w temperaturze od -10 do -20°C, bakteriami Legionella lytica,
w stosunku ilościowym bakterii do ameb około 7:1, po czym dla maksymalnego pochłonięcia bakterii
przez pierwotniaki, hodowlę pozostawia się jeszcze na co najmniej 1 godz. w temperaturze pokojowej,
a następnie wytrząsa i poddaje obserwacji mikroskopowej do momentu gdy pojawiają się bakterie
w wakuolach - fazie gdy nie ukończyły procesu transformacji do dojrzałych form infekcyjnych, dalej
hodowlę wiruje się dla wymuszenia uwolnienia bakterii w takim stadium, a następnie uzyskany osad
wysiewa się na podłoże BCYE i po około tygodniowej inkubacji w temperaturze 33 - 35°C uzyskuje się
wzrost hodowlanych bakterii.
2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że wytrząsanie po pochłonięciu bakterii Legionella lytica przez pierwotniaki odbywa się korzystnie przy 120 obrotach/min i temperaturze optymalnej dla rozwoju ameb ok. 28°C.
3. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że wirowanie bakterii Legionella lytica
w wakuolach, odbywa się korzystnie przez ok. 15 minut przy obrotach co najmniej 6 tys./min.
6
PL 218 636 B1
Departament Wydawnictw UPRP
Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)