Biopsja płynna - Chronix Biomedical

Przegląd Urologiczny
23
Urologia – nauka i praktyka
Jakub Dobruch
Biopsja płynna
Według Światowej Organizacji Zdrowia (www.globocan.iarc.fr) w 2012 roku nowotwory złośliwe wykryto
u 7 410 376 mężczyzn. W tym samym czasie z ich powodu zmarło 4 653 385 osób. Szacuje się, że w ciągu
najbliższych dwóch dekad liczba chorych na nowotwory złośliwe zwiększy się niemal dwukrotnie i choroby
nowotworowe staną się podstawowym, głównym problemem ówczesnej cywilizacji.
Nowotwory „urologiczne” stanowią prawie jedną
czwar­tą nowotworów złośliwych stwierdzanych u męż­
czyzn. Najczęstszym z nich jest rak gruczołowy ster­
cza (prostate cancer – PCa). W 2012 roku wykryto go
u 1 094 873 mężczyzn, przy czym odnotowano jedy­
nie 307 481 zgonów z jego powodu. PCa zajmuje dru­
gie miejsce pod względem częstości występowania
i piąte pod względem śmiertelności z powodu wszyst­
kich nowotworów złośliwych. Wyliczono, że w okre­
sie ostatnich 5 lat z rozpoznaniem PCa żyło 3 857 500
mężczyzn. To zjawisko tłumaczy się między innymi
powolnym rozwojem PCa. Szacuje się, że guz podwaja
swoją masę średnio po upływie 4 lat.
Wprowadzenie powszechnego oznaczania swoiste­
go antygenu sterczowego (PSA) zrewolucjonizowa­
ło rozpoznawanie PCa. Zwiększyła się liczba chorych,
u których leczenie radykalne było możliwe, liczba cho­
rych na zaawansowanego PCa zmniejszyła się. W USA
śmiertelność swoista dla PCa systematycznie zmniej­
sza się począwszy od 1995 roku. Niestety stwierdzono,
że wraz z upowszechnieniem oznaczania PSA i wcze­
śniejszym wykrywaniem zaawansowanych postaci raka
obserwuje się niepokojąco dużą nadrozpoznawalność
PCa, czyli wykrywanie nowotworów, które gdyby nie
oznaczanie PSA, nie zostałyby wykryte. O mężczyznach
z takim rozpoznaniem mówi się, że umarliby z rakiem,
a nie z jego powodu. Nie dziwi więc bardzo duża liczba
chorych, którzy przez wiele lat żyją z PCa i nierzadko
umierają z innych niż rak powodów. Nadrozpoznawal­
ność PCa stanowiła podstawowy argument użyty przez
amerykańską instytucję USPSTF (US Preventive Ser­
vices Task Force) odradzającą oznaczania PSA.
Od niedawna na „rynku medycznym” dostępne są le­
ki, które wpływają korzystnie na przeżycie chorych na
zaawansowane postaci PCa. Mechanizm działania po­
szczególnych leków jest jednak odmienny i kolejność
ich stosowania pozostaje nieznana. Abirateron i enza­
lutamid mają charakter leczenia hormonalnego. Ka­
bazytaksel jest lekiem cytostatycznym, a izotop radu
oddziałuje na komórki PCa za pośrednictwem promie­
niowania alfa. Sipuleucel jest formą leczenia immuno­
modulującego. Nie wiadomo, który z nich przyniesie
najbardziej korzystny skutek w grupie mężczyzn cho­
rujących na PCa w podobnym stanie zaawansowania.
Badania molekularne, których wyniki niedawno opu­
blikowano [Gundem G, et al.: The evolutionary histo­
ry of lethal metastatic prostate cancer. Nature 2015;
520: 353–357] dały podstawę do rozważań na temat
domniemanej skuteczności leków o różnorodnym me­
chanizmie działania w poszczególnych przypadkach.
Od osób zmarłych z powodu PCa pobrano fragmen­
ty każdego ogniska nowotworowego i określono pro­
fil genetyczny budujących je komórek. Zauważono, że
komórki tworzące różne ogniska mają swoiste mutacje
nieobecne w obrębie innych przerzutów. Nazwano je
leaf mutations (LF). Mutacje, które były wspólne dla
wszystkich przerzutów, to znaczy ich obecność wykry­
to w komórkach budujących wszystkie zidentyfikowa­
ne ogniska, nazwano trunc mutations (TM). Te zaś,
które występowały w co najmniej dwóch obszarach,
nazwano branch mutations (BM). Jest zrozumiałe,
że leki, których punkt uchwytu odpowiada zmianom
wywołanym przez TM, będą skuteczne względem każ­
dego ogniska PCa. Przeciwnie – te, których działanie
będzie odnosić się jedynie do LF bądź BM, będzie ce­
chowała mniejsza skuteczność. Przedstawiono wiele
przypadków progresji PCa dziejącej się jakoby w „tle”
rzekomo skutecznie leczonego hormonalnie mężczy­
zny. O skuteczności tego świadczyć ma niewielkie stę­
żenie PSA. Tymczasem badania obrazowe dokumen­
tują coraz większą liczbę przerzutów bądź zwiększenie
ich wielkości. Wyniki wspomnianego badania tłuma­
czą to zjawisko. W praktyce klinicznej posługujemy się
narzędziami, których celem jest wykrycie w skali ma­
kro następstw procesu biologicznego trwającego od
dłuższego czasu. Dobry przykład stanowi PSA. Wiado­
mo, że wznowa biochemiczna po prostatektomii rady­
kalnej wyprzedza progresję kliniczną o kilka lat. Nie­
stety wraz z rozwojem PCa maleje znaczenie PSA jako
markera nowotworowego. Znikome stężenie PSA po
prostatektomii radykalnej wcale nie wyklucza przy­
szłej wznowy.
Wspomniane obserwacje stanowią przykład wyzwań,
z którymi mierzy się współczesna uroonkologia.
W przypadku PCa zwiększone stężenie PSA nie ozna­
24
Przegląd Urologiczny
2016/5 (99)
Urologia – nauka i praktyka
cza, że istnieje konieczność wykonania biopsji stercza.
Prawidłowy wynik pierwszej biopsji nie znaczy, iż nie
należy wykonać kolejnej. Wycięcie lub zniszczenie ra­
dykalne stercza nie musi świadczyć o doszczętności
leczenia, mimo nieoznaczalnych wartości PSA. Po­
dobnie niskie stężenie PSA nie zawsze sugeruje brak
progresji PCa w toku leczenia hormonalnego. U cho­
rych na raka opornego na wytrzebienie (CRPC) ko­
rzystny efekt leczenia immunomodulującego lub le­
czenia polegającego na podaniu radioizotopu radu
nie koreluje ze stężeniem PSA. Poszczególne przerzu­
ty u chorego na CRPC mogą reagować odmiennie na
leczenie systemowe. Pobieranie wycinków z każdego
z nich i ocena profilu genetycznego komórek je budu­
jących nie są obecnie uzasadnione. Jedną z metod sta­
nowiącą przedmiot intensywnych badań, która mogła­
by rozwiązać niektóre ze wspomnianych dylematów,
jest biopsja płynna.
Biopsja płynna
Termin „biopsja” powstał ze złożenia dwóch wyrazów:
bios oznaczającego życie oraz opsis – obserwowanie,
patrzenie. Wprowadzono go w połowie XIX wieku,
by opisać badanie mikroskopowe tkanek pobranych
w odróżnieniu od autopsji, czyli badania pośmiertne­
go. Biopsja płynna (liquid biopsy – LB) stanowi odpo­
wiednik klasycznej biopsji, ale źródłem badanych ko­
mórek jest krew. W rzeczywistości przyjmuje się, że LB
oznacza badanie materiału genetycznego wyizolowa­
nego z krwi w poszukiwaniu określonej choroby/zja­
wiska. Jego źródłem mogą być komórki nowotworowe
krążące we krwi (circulating tumor cells – CTC), cho­
ciaż LB odnosi się także do analizy wolnego, obecnego
poza komórkami materiału genetycznego (circulating
free DNA – cfDNA). U osób zdrowych ilość cfDNA jest
bardzo mała. Znacząco wzrasta u chorych na nowo­
10 ml krwi
poddaje się obróbce
izolując osocze
Sekwencjonowanie
fragmentów DNA
twory. Komórki nowotworowe uwalniają swój materiał
genetyczny podczas apoptozy lub martwicy, ale także
w wyniku sekrecji drobnych pęcherzyków zwanych eg­
zosomami. DNA pochodzący od komórek nowotwo­
rowych nazywa się ctDNA (circulating tumor DNA).
Uważa się, że analiza ctDNA ujawnia zaburzenia ge­
netyczne obecne w każdym z ognisk nowotworowych,
chociaż udział poszczególnych zmian w ogólnej puli
ctDNA jest z pewnością różny. Oprócz cfDNA materiał
genetyczny krwi stanowi RNA, w tym także mikroRNA.
Badanie ctDNA może zatem dostarczyć wiarygodnych
informacji dotyczących stanu, w którym znajduje się
nowotwór niezależnie od charakteru i rodzaju leczenia.
Współczesne techniki biologii molekularnej pozwala­
ją względnie szybko wyizolować z krwi i zbadać ma­
teriał genetyczny komórek nowotworowych. Pierw­
sze doniesienia dotyczyły jednak nie onkologii, lecz
diagnostyki prenatalnej [Lun FM, Tsui NB, Chan KC,
Leung TY, Lau TK, Charoenkwan P, et al.: Noninvasi­
ve prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital
size selection and relativemutation dosage on DNA in
maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:
19920–19925]. Okazało się, że dzięki LB można wy­
kryć trisomie chromosomów 21., 18. i 13. u płodów
i tym samym zastąpić inwazyjną amniopunkcję biop­
sją płynną. W onkologii w 2014 roku po raz pierwszy
przedstawiono dowody na użyteczność kliniczną ozna­
czania „wolnego” materiału genetycznego (cfDNA)
we krwi, którego względna ilość korelowała z czasem
przeżycia chorych w dwuletniej obserwacji [Bettegow­
da C, Sausen M, Leary RJ, Kinde I, et al.: Detection
of circulating tumor DNA in early- and late-stage hu­
man malignancies. Sci Transl Med 2014; 6: 224ra24].
Schemat biopsji płynnej przedstawia rycina 1. cfDNA
izoluje się z osocza powstałego po odwirowaniu 10 ml
Porównanie wyników
analizy DNA z zebraną
wcześniej bazą
Wynik porównania
przedstawiony
w formie graficznej
Ryc. 1. Schemat biopsji płynnej (wg CHRONIX BIOMEDICAL; www.chronixbiomedical.com/connect/technology)
25
Przegląd Urologiczny
Urologia – nauka i praktyka
A
B
Analiza cfDNA
Identyfikacja wybranej
mutacji (np. SNPs)
Ocena częstości
zaburzeń genetycznych
całego genomu
Ryc. 2. Schemat przedstawiający rodzaje analizy cfDNA i jej inter­­
pretacje (wg CHRONIX BIOMEDICAL; www.chronixbiomedical.com/
connect/technology)
krwi, którą wcześniej pobrano od badanej osoby. Po
wyodrębnieniu materiału genetycznego następuje je­
go sekwencjonowanie i porównanie z prawidłowym
materiałem genetycznym człowieka. Dzięki temu wia­
domo, która część genomu jest niewłaściwie reprezen­
towana u badanej osoby. Analizę cfDNA można pro­
wadzić co najmniej dwukierunkowo – poszukując
znanej, wcześniej określonej mutacji (badanie jako­
ściowe) bądź analizując łącznie ilość wszystkich za­
burzeń genetycznych względem stanu prawidłowego
(ryc. 2). W tym drugim przypadku wynik LB przedsta­
wia się za pomocą wskaźnika CNI (copy number instability). CNI odzwierciedla liczbę powtórzeń danego
regionu DNA w porównaniu do próbki pobranej wcze­
śniej od tego samego chorego lub próbki pobranej od
osoby zdrowej, której wynik został wprowadzony do
bazy producenta testu. Wynik porównania stanowiący
podstawę wyliczenia CNI można przedstawić graficz­
nie (circos plot – tłum. schemat cyrkowy). Rycina 3
zawiera przykład wyniku LB u 5 zdrowych osób (3A).
Zastosowanie biopsji płynnej w urologii
W pierwszych akapitach tego opracowania wspo­
mniano o rozpoznawaniu raka gruczołu krokowe­
go. Ostatecznie PCa wykrywa się na podstawie biop­
sji stercza. Wskazania do jej wykonania, niezależnie
od liczby wcześniej przebytych biopsji, stanowią na­
dal przedmiot licznych prac. Rocznie w USA wykonu­
je się ponad milion biopsji, przy czym PCa rozpoznaje
się u około 200 tys. mężczyzn. U większości mężczyzn
po biopsji obserwuje się miernie nasilone krwawienie
z dróg moczowych bądź z dróg nasiennych. Co dwu­
dziesty wymaga jednak hospitalizacji i jej powodem
u większości z nich są powikłania septyczne. Jest zro­
zumiałe, że poszukuje się metod, które ograniczyłyby
liczbę niepotrzebnie wykonywanych biopsji. Niedaw­
no opublikowano wyniki badania, w którym oceniono
Ryc. 3. Schemat przedstawiający wynik LB u 5 „zdrowych” osób (A)
oraz u 5 chorych na PCa mężczyzn (B). Obszary genomu odmienne
od stanu prawidłowego są zaznaczone kropkami zielonymi (więcej
powtórzeń danego fragmentu DNA niż w warunkach prawidłowych
– gains) lub czerwonymi (mniej powtórzeń danego fragmentu DNA
niż w warunkach prawidłowych – losses)
znaczenie LB w grupie chorych na PCa i w grupie męż­
czyzn zdrowych. Zauważono, że współczynnik CNI był
istotnie wyższy u 204 chorych na PCa (44; 95% CI:
30–67) niż u 207 pozostałych mężczyzn (9; 95% CI:
5–12) niedotkniętych tym nowotworem. Po analizie
wyników tego badania opracowano komercyjnie do­
stępny test (Second OpinionTM Prostate Cancer Eva­
luation), który można wykorzystać w toku ustalania
wskazań do biopsji stercza. Dokładność tego badania
w rozpoznawaniu PCa przekracza 90%. To oznacza,
że Second OpinionTM może być pomocny u tych, któ­
rzy chcą upewnić się co do konieczności powtórzenia
biopsji w sytuacji, w której nadal występują klasyczne
do niej wskazania. Test ten jest od niedawna dostępny
na naszym rynku.
Plany dalszego rozwoju
Ustalanie wskazań do biopsji jest tylko jednym z wielu
możliwych zastosowań LB w odniesieniu do chorych
na PCa. Rak stercza jest przykładem spośród wielu
nowotworów, względem których biopsja płynna może
okazać się przydatna. W tabeli 1 podano potencjalne
możliwości wykorzystania LB w codziennej praktyce
uroonkologicznej. Jestem przekonany, że niedługo za­
czniemy dyskutować na ich temat.
Tab. 1. Przykłady zastosowania biopsji płynnej w onkologii
Wczesne rozpoznawanie chorób nowotworowych
Ocena heterogenności guza
Monitorowanie statusu choroby nowotworowej (progresji)
Identyfikacja zmian genetycznych sugerujących wdrożenie leczenia
celowanego
Ocena skuteczności leczenia niezależnie od stadium choroby
(leczenia radykalnego – określenie wskazań do leczenia adjuwantowego,
leczenia ratującego – określenie wskazań do wdrożenia innej formy leczenia)
Monitorowanie zmian genetycznych następujących w toku leczenia
lub obserwacji
26
Przegląd Urologiczny
2016/5 (99)
Urologia – nauka i praktyka
Podsumowanie
Biopsja płynna stanowi przykład nowego rodzaju ba­
dań, które mogą zrewolucjonizować rozpoznawanie
chorób nowotworowych i leczenie chorych nimi do­
tkniętych. Stanowi je badanie krwi, które jest pomoc­
ne w ustaleniu wskazań do biopsji stercza. Test Second
OpinionTM jest już dostępny na naszym rynku. Mam
nadzieję, że w niedalekiej przyszłości biopsja płynna
będzie wykorzystywana do rozwiązywania innych wąt­
pliwości dotyczących PCa, w tym wyboru nowego spo­
sobu leczenia i monitorowania jego skuteczności. dr hab. n. med. Jakub Dobruch
Klinika Urologii Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego
Oddział Urologii Europejskiego Centrum Zdrowia, Otwock
kierownik oddziału: dr hab. n. med. Jakub Dobruch
Do przygotowania niniejszego opracowania zostały wykorzystane materiały dostarczone przez CHRONIX
BIOMEDICAL.