Liczba plemników w polu widzenia (pow. 400x)

Katedra Andrologii i Endokrynologii
Płodności
Dr n. med. Katarzyna Marchlewska
Nasienie
 plemniki
 płyn nasienny (plazma nasienia)
- wydzielina pęcherzyków nasiennych (60-70%)
- wydzielina prostaty (ok. 30%)
- wydzielina jąder, najądrzy, gruczołów opuszkowo-cewkowych (5%)
 komórki okrągłe (leukocyty, komórki spermatogenezy)
 całkowita liczba plemników – odzwierciedla wydajność produkcji
plemników przez jądra oraz drożność dróg wyprowadzających nasienie
 całkowita objętość płynu nasiennego – odzwierciedla aktywność
wydzielniczą gruczołów
Warunki wstępne badania nasienia:
 Informacje dla pacjenta powinny być przekazane ustnie i umieszczone
w formie pisemnej w pokoju przeznaczonym do oddawania nasienia.
 Do analizy musi być dostarczony cały ejakulat.
 Wstrzemięźliwość płciowa – co najmniej 48 h, ale nie dłużej niż 7 dni.
W przypadku powtarzania badania wstrzemięźliwość płciowa powinna
być taka sama.
 Badanie powinno być powtórzone przynajmniej dwukrotne w
odstępach nie krótszych niż 7 dni i nie dłuższych niż 3 tygodnie.
Różnice w całkowitej liczebności oraz koncentracji plemników w okresie 1,5 roku
u 5 zdrowych mężczyzn
Warunki wstępne badania nasienia:
 Badanie powinno być rozpoczęte przeciągu 1 h od ejakulacji.
 Nasienie powinno być oddawane w specjalnym pomieszczeniu
niedaleko od laboratorium, drogą masturbacji do pojemnika ogrzanego
do temp. 20-37 C
 W przypadku gdy pacjent nie jest w stanie oddać nasienia drogą
masturbacji możliwe jest użycie specjalnych prezerwatyw
przeznaczonych do tego celu.
 W przypadku badania mikrobiologicznego pacjent powinien:
 oddać mocz
 umyć ręce i penis mydłem
 dokładnie wypłukać mydło
 do wytarcia użyć jednorazowego ręcznika
 oddać ejakulat do jałowego pojemnika
PODSTAWOWE BADANIE NASIENIA:
- Ocena makroskopowa nasienia
- Ocena mikroskopowa preparatów
ETAPY BADANIA NASIENIA
 Przez pierwsze 5 minut od ejakulacji:
Pojemnik z próbką nasienia umieścić w inkubatorze
(37 C) na okres potrzebny do upłynnienia.
 upłynnienie ocenić makroskopowo i mikroskopowo
 w trakcie upłynniania umieścić pojemnik na mieszadle
rotacyjnym (temp. 20-37 C)
 jeśli próbka nie upłynni się w przeciągu 30 min odczekać z
rozpoczęciem dalszych analiz kolejne 30 min.
ETAPY BADANIA NASIENIA
Po 30 nim ale przed upływem 60 minut od
ejakulacji:
- czas upłynnienia
- wygląd/kolor
- lepkość/konsystencja
- objętość
-pH
-preparat bezpośredni (ruchliwość i rozcieńczenie)
-żywotność (w przypadku niskiej ruchliwości)
-rozmaz do morfologii
-ocena liczby
ETAPY BADANIA NASIENIA
Po 30 nim ale przed upływem 60 minut od
ejakulacji:
- test MAR (mixed antiglobulin reaction)
- ocena komórek peroksydazo-pozytywnych
- immunobead test (preparat)
- odwirowanie nasienia
 Przed upływem 3 godzin od ejakulacji:
- przesłanie próbki do badania mikrobiologicznego
 Później ale tego samego dnia (lub następnego z
zamrożonej próbki):
- ocena markerów czynności gruczołów dodatkowych
- immunobead test
Upłynnianie nasienia:
Prawidłowe nasienie jest homogenne i upłynnia się w
przeciągu 60 min w temperaturze pokojowej pod wpływem
enzymów pochodzących z prostaty (PSA).
Norma: do 60 min.
(zwykle 15 min.)

upłynnienie można ocenić makroskopowo i/lub mikroskopowo

w trakcie upłynniania zaleca się umieścić pojemnik na mieszadle rotacyjnym
(temp. 20-37 C)

jeśli próbka nie upłynni się w przeciągu 30 min. odczekać z rozpoczęciem
dalszych analiz kolejne 30 min.
Obecność pasm śluzu może utrudniać procedurę liczenia
plemników i sugeruje stan zapalny lub zaburzenia upłynnienia.
Nasienie nieupłynnione:
- dodanie równej objętości PBS w wersji Dulbecco
(Dulbecco’s Posphate Buffered Saline) i wymieszanie pipetą
- mechaniczne mieszanie strzykawką z igłą o średnicy wewnętrznej
0.84 – 0.69 mm
- trawienie roztworem 10 IU/ml bromeliny w Dulbecco-PBS
UWAGA:
Należy odnotować w wyniku użycie określonej metody i
uwzględnić rozcieńczenie przy ocenie liczby plemników
Preparat o dużym stopniu nieupłynnienia
może upośledzać zdolność plemników do
zapłodnienia
Obecność ciałek żelatynowych
Lepkość:
Długość nitki nie powinna przekroczyć 2 cm
Prawidłowa lepkość
podwyższona lepkość
UWAGA
Preparat o podwyższonej lepkości może utrudniać
- ocenę ruchu
- ocenę koncentracji /całkowitej liczby plemników
- wykrycie plemników opłaszczonych przeciwciałami
- pomiary markerów biochemicznych
W celu zmniejszenia lepkości próbki stosujemy takie same metody
jak przy próbce nasienia nieupłynnionego.
Wygląd / kolor:
Prawidłowe nasienie ma wygląd homogenny, nieprzezroczysty, szaro-opalizujący
Hematospermia
Azoo/Oligozoospermia
Żółta:
żółtaczka, używanie
niektórych witamin np.
z grupy B
Objętość:
Plazma nasienia produkowana jest głównie w gruczołach dodatkowych.
Większość wydzielana jest z pęcherzyków nasiennych a jedynie od 0,5
and 1 ml pochodzi z gruczołu krokowego.
 Metoda wagowa:
Norma:
1,5 ml
 Zważyć pojemnik przed oddaniem nasienia i zapisać masę
 Zważyć pojemnik razem z nasieniem i zapisać masę
 Obliczyć masę próbki
 Obliczyć objętość próbki przy założeniu, że gęstość właściwa ejakulatu
wynosi 1 g /ml (1,043-1,102 g/ml)
 Metoda objętościowa:
 nasienie może być oddane do specjalnego cylindra
miarowego o szerokim otworze
 objętość odczytuje się ze skali z dokładnością do 0,1 ml
UWAGA
Ocena objętości nasienia poprzez aspirację próbki nasienia do skalowanej
pipety/strzykawki, lub przelanie do skalowanego cylindra/probówki
nie jest zalecane !!!
Utrata próbki rzędu 0.3 – 0.9 ml !!!
Niska objętość ejakulatu:
- utrata części próbki
- zablokowanie dróg wyprowadzających nasienie
- wrodzony obustronny brak nasieniowodów (niedorozwój
pęcherzyków nasiennych)
- częściowy wytrysk wsteczny
- niedobór androgenów
Wysoka objętość ejakulatu:
- wysięk w przypadku aktywnego zapalenia gruczołów dodatkowych
GRUCZOŁ KROKOWY
Wydzielina kwaśna
pH:
PĘCHERZYKI
NASIENNE
Wydzielina zasadowa
Ocenę należy przeprowadzić po
upłynnieniu nasienia ale nie później
niż 60 min od ejakulacji
Jeśli pH < 7,0 przy azoosprmii może to
oznaczać obustronną niedrożność
nasieniowodów
Wartość referencyjna:
7,2
Zakres papierków wskaźnikowych : 6.0 do 10.0 lub 6.5 do 10.0
Ocena mikroskopowa preparatów:
Preparat nasienia musi być bardzo dokładnie wymieszany przed
wykonaniem każdej analizy!!
Do mieszania polecana jest jednorazowa pipetka Pasteura o szerokim ujściu
(1,5 mm). Należy delikatnie zaaspirowaś próbkę około 10 razy.
Nie stosować vortexu, ponieważ powoduje uszkodzenia plemników.
 Wstępna ocena preparatu bezpośredniego (pow. 100x):
• występowanie pasm śluzu
• agregacja lub aglutynacja plemników
• obecność komórek innych niż plemniki tj. leukocytów,
niedojrzałych komórek spermatogenezy, komórek
nabłonkowych
Ocena ruchu plemników:
Kategorie ruchu:
PR - ruch postępowy (niezależnie od szybkości)
Głębokość 20µm
NP - ruch niepostępowy
IM - brak ruchu
10 µl
22 mm
Oceniamy 2 x przynajmniej 200 plemników
Wartość referencyjna:
40% PR + NP lub
32% PR
Ocena ruchliwości:
NP
200
200
PR –
30%
50%
NP -
5%
15%
IM -
65%
35%
Średnia = (65+35):2 = 50
Różnica = 65 – 35 = 30
Wynik do
powtórzenia
200
200
PR –
37%
28%
NP -
3%
6%
IM -
60%
66%
Średnia = (60+66):2 = 63
Różnica = 66 – 60 = 6
Wynik
prawidłowy
PR 32%; NP 4%; IM 63%
Żywotność plemników
Żywotność plemników – ocena integralności błony komórkowej
powinna zawsze być wykonywana w próbkach nasienia z
nieprawidłowym ruchem plemników (<40% PR), ale może być
wykonywana rutynowo dla każdej próbki nasienia
Żywotność plemników:
- Test eozyna/nigrozyna
- Test eozynowy
- Test wodny (HOS Test)
X 1000
Wartość referencyjna:
58 % plemników żywych
X 400
Ocena:
Oceniamy 2 x przynajmniej 200 plemników
Test eozyna/nigrozyna
- zmieszać po 50 µl nasienia i roztworu eozyna-nigrozyna
- wykonać rozmaz
- oceniać od razu po wyschnięciu, lub później po zatopieniu w
odpowiednim (bezwodnym) medium, pod imersją (1000x)
Plemniki żywe
- główki białe
- jasnoróżowe
Plemniki nieżywe
- główki czerwone
- ciemnoróżowe
Test eozynowy
- pobrać po 5 µl (lub po 10 µl) nasienia i roztworu eozyny na szkiełko
mikroskopowe, dokładnie wymieszać
-przykryć szkiełkiem nakrywkowym (22x22mm) (lub 24x40 mm)
- po 30 min. oceniać pod powiększeniem 200 lub 400 x (najlepiej w
mikroskopie kontrastującym fazy)
Plemniki żywe
- główki niezabarwione
- jasnoróżowe
Plemnik nieżywy
- główki czerwone
- ciemnoróżowe
Test hipoosmotyczny (HOS test)
- alternatywa do testów barwionych
- używany gdy należy uniknąć barwienia plemników (plemniki do ICSI)
- pobrać po 100 µl nasienia i roztworu hipotonicznego
- inkubować w 37ºC przez 5 min (ICSI) lub 30 min (badania nasienia)
- pobrać 10 µl na szkiełko, przykryć szkiełkiem nakrywkowym (22x22
mm) i oceniać pod powiększeniem 200x lub 400x najlepiej w
mikroskopie kontrastującym fazy
Plemnik nieżywy
-brak efektu
puchnięcia witki
Plemniki żywe
- różne typy
puchnięcia witki
komórka
Agregacja –przyleganie (na zasadzie adhezji)
nabłonkowa
nieruchomych plemników do siebie oraz
przyleganie ruchomych plemników do pasm śluzu
i innych nieruchomych elementów nasienia
ciałka
resztkowe
plemniki
Aglutynacja – tworzenie zlepów poprzez przyleganie ruchliwych
plemniki do siebie w charakterystyczny sposób: główka-główka, witka-
witka i mieszany
Stopień
Typ
1
A – główka do główki
B – witka do witki
(główki wolne)
A
B
C – koniec witki do
końca witki
1 – izolowana 2 – średnia 3 – duża
> 50
10 – 50
<10
plemników plemników
plemników
C
D – mieszana (razem
głowka-głowka i witkawitka)
D
E – plątanina (główki i
witki zaplątane; głowki
w aglutynacie witek))
E
2
3
4 – masywna,
brak wolnych
plemników
4
Ocena liczby plemników:
Badanie wstępne:
-Określenie właściwego rozcieńczenia (preparat bezpośredni)
-Pow. 400x (HPF – high power field)
50g NaHCO3+10ml 35% formaliny uzupełnić
wodą dest. do 1000ml
4 nl
22 mm
10 µl
1. Określenie właściwego rozcieńczenia
 korzystamy z preparatu bezpośredniego używanego do oceny ruchu
 oglądamy jeden z preparatów bezpośrednich
 oceniamy liczbę plemników w polu widzenia na podstawie
przynajmniej 5 pól mikroskopu (HPF – high power filed; 200x lub 400x)
 Jedno pole widzenia to zwykle
– ok. 16 nl objętości próbki nasienia przy powiekszeniu 200x
- ok. 4 nl objętości próbki nasienia przy powiększeniu 400x
4 nl
22 mm
10 µl
pow. 400x
3 mm
Kamera Neubauera
1 mm
Głębokość 100 µm
4
5
4
25 nl
20 nl
500 plemników
100 plemników
4 nl
20 nl
100 nl
4 nl
22 mm
Rozcieńczenie:
1:5 (1+4)
100 nl
100 plemników
500 plemników
2500 plemników
500 plemników
Liczba plemników
Numery pól do
w polu widzenia Rozcieńczenie
zliczania plemników
(pow. 400x)
<2
2-15
16-100
> 101
1:2
(1 + 1)
1:2
(1 + 1)
1:5
(1 + 4)
1:20
(1 + 19)
wszystkie 9 pól
pole nr 5,4,6
pole nr 5,4,6
pole nr 5,4,6
C = (N/n) x (1/20) x wsp. rozcieńczenia
C = (N/n) x (1/100) x 2
N – liczba zliczonych plemników
n - liczba rzędów
Przykład:
rozcieńczenie 1+4 (1:5)
C = (N/n) x (1/20) x 5
C = (N/n) x (1/4)
Suma: 215 + 224 = 439
Różnica: 224 – 215 = 9
215
plemników
w 6 rzędach
224
plemników
w 6 rzędach
C = (215 + 224) /(6 +6) x (1/4)
C = 9,1 x 106 /ml
Postępowanie w przypadku bardzo niskiej liczby plemników
< 1 mln/ml
Ok. 4 plemniki
4 nl
22 mm
< 0,5 mln/ml
Ok. 2 plemniki
rozcieńczenie 1+1 (1:2)
C = (N/n) x (1/100) x 2
C = (N/n) x (1/50)
Gdzie N –liczba zliczonych plemników
n – liczba zliczonych siatek (9+9=18)
2x
Postępowanie w przypadku bardzo niskiej liczby plemników
Jeśli w preparacie przyżyciowym nie znaleziono plemników należy:




próbkę odwirować przy 3000g przez 15 min.
cały osad rozprowadzić na szkiełku podstawowym
przykryć szkiełkiem nakrywkowym (zalecane 20 x 50 mm)
oglądać cały preparat w poszukiwaniu plemników.
Pow. 200x
Oceniamy ok.1200 pól widzenia
 jeśli nie znaleziono żadnego plemnika jest to azoospermia
 jeśli znaleziono plemniki jest to kryptozoospermia
Budowa morfologiczna plemników:
Norma:
4% o prawidłowej budowie
(Kruger strict criteria)
Metody barwienia:
-Papanicolaou
-Shorr
-Diff-quick
Budowa morfologiczna plemników:
Główka – regularny zarys, owalna z wyraźnie
region akrosomalny
40 – 70% powierzchni główki
zaznaczonym akrosomem zajmującym od 4070% powierzchni ; dopuszcza się obecność 2
małych wakuoli w regionie akrosomalnym,
szerokość główki
2.5 – 3.5 um
długość główki 4 – 5
um
których powierzchnia nie przekracza 20%
powierzchni główki; region postakrosomalny nie
szerokość wstawki
poniżej 1 um
może zawierać wakuoli
długość wstawki
ok. 5 – 7 um
Wstawka – smukła, regularna w zarycie o
podobnej długości jak główka; główna oś
wstawki powinna byś przedłużeniem długiej osi
główki; przywieszka cytoplazmatyczna nie
powinna przekraczać 1/3 wielkości główki
Witka – jednakowa grubość na całej długości,
cieńsza od wstawki, długość 45 m (ok. 10
długości główki); może wykazywać wygięcia,
jednak nie pod ostrym kątem sugerującym
złamanie witki
długość witki
ok. 45 um um
Prawidłowa budowa morfologiczna plemników:
Nieprawidłowości w budowie plemników:
Barwienie Papanicolaou
-
Komórka nabłonkowa
-
-
N
-
+
-
Granulocyt obojętnochłonny
-
-
-
+
+
+
-
Spermatyda
-
-
Makrofag degenerujący?
Granulocyt obojętnochłonny
Bakterie
spermatocyty
makrofag
cytoplazma
spermatyda
degenerujące
spermatydy
dzieląca się
spermatyda
degenerująca
spermatyda
spermatyda
dzielący się
spermatocyt
dzieląca się
spermatyda
cytoplazma
spermatocyt
fagocytujący
makrofag
monocyt
+
granulocyty
obojętnochłonne
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
degenerujący leukocyt
+
Ocena „komórek okrągłych”:
Komórki nabłonkowe cewki moczowej
Komórki prostaty
Komórki spermatogenezy
Leukocyty
Leukocyty:
- neutrofile – 50 – 60 %
- makrofagi – 20 – 30 %
- limfocyty – 2 – 5 %
Komórki preoksydazo-dodatnie
(granulocyty obojętnochłonne)
Immunocytochemiczne barwienie
na obecność antygenu CD45
(wszystkie leukocyty)
Wartości referencyjne w badaniu nasienia
WHO 2010
Objętość ejakulatu
1,5 ml
pH
7,2
Koncentracja plemników
15 mln/ml
20 mln/ml
Całkowita liczba plemników
39 mln/ejakulat
40 mln/ejakulat
Ruch plemników
40% kat. PR+NP lub;
50% kat. a i b lub;
Morfologia plemników
2 ml
32 % kat. PR (WHO 2010)
25 % kat. a (WHO 1999)
4 % o prawidłowej budowie (WHO 2010)
14 % o prawidłowej budowie (WHO 1999)
30 % o prawidłowej budowie (WHO 1992)
Żywotność plemników
58% żywych
50% żywych
1. WHO manual:
https://www.who.int/reproductivehealth/publications/infertility/
2. Cooper T i wsp., Human Reproductive Update, 2009
3. Asian Journal of Andrology, 2010, 12