Ćwiczenie 6

Ćwiczenie 8
T: Płyny z jam ciała (2)
Zagadnienia teoretyczne:
Wytwarzanie i wchłanianie płynu mózgowo-rdzeniowego. Schemat badania płynu mózgowordzenoiwego: cechy fizyczne (barwa, przejrzystość, tendencja do wykrzepiania), określanie
liczby erytrocytów i leukocytów, przygotowanie preparatów cytospinowych, ocena składu
odsetkowego
komórek
jądrzastych
w
preparacie
barwionym.
Wykonanie
testów
jakościowych: próby białkowej Pandy’ego, globulinowej Nonne-Appelta, globulinowej
Weichbrodta. Oznaczanie stężenia białka metodą Extona, glukozy metodą enzymatyczną,
chlorków metodą kolorymetryczną. Interpretacja wyników badania ogólnego płynu
mózgowo-rdzeniowego.
Ćwiczenie praktyczne:
Badanie płynu mózgowo-rdzeniowego – ocena cech fizycznych, badanie cytologiczne,
badania biochemiczne (oznaczenie białka, albuminy, glukozy, chlorków).
A. Ocena wyglądu płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR)

ocena barwy: wodojasna, lekko ksantochromiczna, ksantochromiczna, opalizująca
(niewielka domieszka krwi), krwista

ocena przejrzystości: zupełna, opalescencja, lekko mętny, mętny, bardzo mętny,
obecność skrzepów
B. Badania cytologiczne
 Określenie liczby komórek w 1μl PMR (cytoza, pleocytoza)
Aparatura i sprzęt laboratoryjny:

mikroskop

pipety automatyczne o pojemności 0,1 cm3, 1 cm3

komora Fuchsa-Rosenthala
Materiał badany i odczynniki:

płyn mózgowo-rdzeniowy

płyn Samsona
Wykonanie:

zmieszać w probówce 10 części wymieszanego PMR i 1 część płynu Samsona
(100 µl PMR + 10 µl płynu Samsona)

całość inkubować w temperaturze pokojowej 20 minut

przed nawarstwieniem siatki płyn dokładnie wymieszać!
1

odczekać 5 minut i liczyć na całej siatce wszystkie rodzaje komórek tzn.
limfocyty, granulocyty.
Obliczenia:
n
liczba komórek w 1µl =
3
n – suma komórek zliczonych na całej siatce
Wartości prawidłowe:
0-3-5 komórek o wyglądzie limfocytów czasem monocytów u dorosłych
30 komórek u noworodków
Liczba komórek powyżej 5 w 1 μl uważa się za patologię.
C. Badania biochemiczne
 Oznaczanie stężenia białka metodą Extona
Zasada oznaczenia:
Białko obecne w PMR zostaje wytrącone kwasem sulfosalicylowym. Intensywność
powstałego zmętnienia określa się pomiarem absorbancji.
Aparatura i sprzęt laboratoryjny:

pipety automatyczne o pojemności 0,1 cm3, 1 cm3

spektrofotometr, probówki Eppendorf
Materiał badany i odczynniki:

PMR

odczynnik Extona

0,9% NaCl
Wykonanie:
 opisać probówki, odmierzyć dokładnie odpowiednie objętości roztworów – jak podano
w poniższej tabeli:
Odczynnik
Próba
Próba
badana
ślepa
500 L
-
72 L
72 L
-
500 L
Extona
PMR
0,9% NaCl
2
Dokładnie wymieszać. Po 5 minutach odczytać absorbancję próby
badanej (AB) (=445 nm) wobec próby ślepej.
Odczytać zawartość białka w PMR z tabeli.
 Oznaczanie stężenia albuminy w surowicy krwi metodą kolorymetryczną
Zasada oznaczenia:
Albumina tworzy z zielenią bromokrezolową (BCG) w środowisku kwaśnym barwny
kompleks. Intensywność powstałego zabarwienia mierzona przy 630 nm jest proporcjonalna
do stężenia albuminy w próbie.
Aparatura i sprzęt laboratoryjny:
 spektrofotometr
 probówki Eppendorf, pipety automatyczne o pojemności 1 cm3, 0,02 cm3
Materiał badany i odczynniki:
 płyn mózgowo-rdzeniowy
 surowica
 wzorzec albuminy
 odczynnik roboczy do oznaczania stężenia białka całkowitego (zestaw BioMaxima
Albuminy)
Wykonanie:
 opisać probówki, odmierzyć dokładnie odpowiednie objętości roztworów – jak podano
w poniższej tabeli:
Próba
Próba wzorcowa
Próba
Badana (P/S)
Odczynnik roboczy
Surowica/PMR
Wzorzec
zerowej
1000 L
1000 L
1000 L
10 L
-
-
-
10 L
-
Dokładnie wymieszać. Po 2 minutach odczytać absorbancję próby badanej (AB), kontrolnej
(AK) i wzorcowej (AW) (=630 nm) wobec próby zerowej.
Obliczenia:
 obliczyć stężenie białka całkowitego ze wzoru:
P/S
stężenie albuminy [g/dL] =
W
∙ stężenie wzorca
3
Obliczyć współczynnik albuminowy QAlb
 Oznaczanie glukozy
Zasada oznaczenia:
Metoda kolorymetryczna, enzymatyczna z oksydazą glukozy (GOD-PAP)
oksydaza glukozy
glukoza + H2O + O2
glukonian + H2O2
peroksydaza
2H2O2 + 4-aminoantypiryna + fenol
4-(p-benzochinonomonoimino)-fenazon + 4H2O
(czerwone zabarwienie)
Intensywność zabarwienia jest wprost proporcjonalna do stężenia glukozy.
Aparatura i sprzęt laboratoryjny:
 spektrofotometr
 probówki Eppendorf
 pipety automatyczne o pojemności 1 cm3, 0,1 cm3
Materiał badany i odczynniki:
 płyn mózgowo-rdzeniowy
 wzorzec glukozy – 100 mg/dL
 odczynnik roboczy do oznaczania stężenia cholesterolu całkowitego (zestaw
BioMaxima Glukoza)
Wykonanie:
 opisać probówki, odmierzyć dokładnie odpowiednie objętości roztworów – jak podano
w poniższej tabeli:
Odczynnik
Próba
Próba
Próba
Badana
wzorcowa
zerowa
1000 L
1000 L
1000 L
10 L
-
-
-
10 L
-
roboczy
PMR
Wzorzec
Dokładnie wymieszać. Po 10 minutach odczytać absorbancję próby
badanej (AB) i wzorcowej (AW) (=500 nm) wobec próby zerowej.
Obliczenia:
 obliczyć stężenie glukozy ze wzoru:
B
stężenie glukozy [mg/dL] =
∙ stężenie wzorca
4
W
 Oznaczanie chlorków w płynie mózgowo-rdzeniowym za pomocą
jonoselektywnej elektrody chlorkowej
Aparatura i sprzęt laboratoryjny:

pipety automatyczne o pojemności 0,1 cm3

pH-metr

chlorkowa elektroda jonoselektywna

kolba miarowa o pojemności 100 cm3

zlewka o pojemności 150 cm3
Materiał badany i odczynniki:

płyn mózgowo-rdzeniowy

surowica
Wykonanie:

przed pomiarem zanurzyć elektrodę chlorkową na 5 minut w roztworze chlorków o
stężeniu 100 ppm

rozcieńczyć 1000-krotnie płyn mózgowo-rdzeniowy i surowicę (0,1 mL
płynu/surowicy przenieść do kolby miarowej o pojemności 100 cm3, dopełnić
wodą destylowaną do kreski i dokładnie wymieszać)

włączyć pH-metr, w razie konieczności ustawić odczyt w mV (za pomocą
przycisku „M”)

wypłukać elektrodę wodą destylowaną i delikatnie osuszyć gazikiem

wlać ok. 50 mL rozcieńczonego płynu mózgowo-rdzeniowego lub surowicy do
zlewki i zanurzyć w nim elektrodę

poczekać aż odczyt będzie stabilny – zapisać wynik w mV

odczytać zawartość z krzywej kalibracyjnej

obliczyć zawartość chlorków korzystając z obliczeń:
a – wynik w mV
(a - 208,1)
x=
59,5
Stężenie chlorków [mmol/L] = 10x ∙ 1000
5