Produkcja kwasu fumarowego na drodze mikrobiologicznej oraz

Produkcja kwasu fumarowego na drodze mikrobiologicznej oraz
potencjalne możliwości jego wykorzystania
Sylwia Kowalczyk
Katedra Biotechnologii, Żywienia Człowieka i Towaroznawstwa Żywności,
Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie
Słowa kluczowe: kwas fumarowy, fermentacja, Rhizopus
Wstęp
W 1817 roku, dwaj niezależni naukowcy, Braconnet i Vauquelin, w wyniku
przeprowadzonego procesu suchej destylacji kwasu jabłkowego, odkryli kwasy: fumarowy i
maleinowy (Goldberg, Rokem i Pines, 2006).
Kwas fumarowy (kwas trans-1,2-etylenodikarboksylowy; kwas (E)-2-butenodiowy) to
naturalnie występujący kwas organiczny, wyizolowany po raz pierwszy z rośliny Fumaria
officinalis, od której wziął swoją nazwę (Roa Engel i in., 2008).
Kwas fumarowy jest czterowęglowym, nienasyconym kwasem dikarboksylowym,
wytwarzanym przez wiele mikroorganizmów, jako produkt pośredni cyklu kwasu
cytrynowego (cyklu Krebsa). Określany często jako „fumaran”, gdyż występuje zazwyczaj w
postaci soli (fumaran wapnia, czy fumaran sodu) (Fu i in., 2010; Liao i in., 2008; Roa Engel i
in., 2008).
Kwas fumarowy charakteryzuje się niską rozpuszczalnością w wodzie (7g/kg w temperaturze
25°C; 89 g/kg w temperaturze 100°C) oraz niską wartością pKa (3,03 oraz 4,44). Powyższe
właściwości mogą być wykorzystane przy odzyskiwaniu tego kwasu (Roa Engel i in., 2008).
Kwas fumarowy został zidentyfikowany jako jedna z tzw. 12 substancji chemicznych,
produkowanych na drodze fermentacji przemysłowej. (Yu i in., 2012; Sauer i in., 2008).
Niektóre kwasy organiczne, w tym interesujący nas kwas fumarowy, wytwarzane są na skalę
przemysłową przez grzyby. Zaletą wykorzystania grzybów jest przede wszystkim łatwość
oddzielenia wytworzonej biomasy od płynu pohodowlanego, za pomocą nieskomplikowanych
i stosunkowo niedrogich metod filtracyjnych. Wytwarzanie kwasów w skali laboratoryjnej lub
przemysłowej jest wynikiem nadmiaru węglowodanów oraz pewnej „dezorganizacji
metabolizmu”, wzmacnianej przez brak pierwiastków śladowych w podłożu wzrostowym. W
wielu przypadkach, wykluczając pojedynczy pierwiastek z podłoża wzrostowego grzyba,
możemy zaindukować akumulację jakiegoś związku pośredniego, np. kwasu fumarowego.
Prawdopodobnie jest to spowodowane błędną regulacją metabolizmu i określane zjawiskiem
„metabolizmu nadmiaru” (Schlegel, 2000).
Szlaki metaboliczne
Kwas fumarowy jest związkiem pośrednim cyklu kwasu cytrynowego (TCA), nie jest to
jednak główna droga jego otrzymywania. Głównym szlakiem produkcji fumaranu jest
bowiem redukcyjna karboksylacja pirogronianu (pirogronian → szczawiooctan → maleinian
→ fumaran) (rys. 4), a enzymy biorące w niej udział, w przeciwieństwie do
mitochondrialnych enzymów cyklu Krebsa, zlokalizowane są w cytoplazmie. Alternatywny
szlak umożliwia wykorzystanie czterowęglowych związków pośrednich cyklu Krebsa do
biosyntezy, podczas fazy wzrostu w warunkach tlenowych. W momencie, gdy dostępność
azotu jest limitowana i wzrost ustaje, metabolizm źródła węgla i wiązanie CO2 są
kontynuowane i prowadzą do akumulacji kwasów C4 – czyli m. in.: kwasu fumarowego (Roa
Engel i in., 2008).
Rys. 1. Szlaki metaboliczne syntezy kwasu fumarowego (Roa Engel i in., 2008)
Biosynteza kwasu fumarowego- fizjologia i warunki wzrostu
Kwas fumarowy, podobnie jak kwas jabłkowy, nie jest syntetyzowany i akumulowany w
normalnych warunkach wzrostu. Dopiero czynnik stresowy (określone warunki stresowe, np.
nadmiar źródła węgla i/lub ograniczenie źródła azotu), skłania mikroorganizmy do
gromadzenia pośrednich produktów cyklu Krebsa (kwasu fumarowego, jabłkowego) jako
produktów końcowych (Goldberg, Rokem i Pines, 2006; Friedberg i in., 1995).
Podczas właściwego procesu fermentacji, grzyby z rodzaju Rhizopus wchodzą w fazę
ograniczonego wzrostu (ograniczenie źródła azotu w podłożu hodowlanym). Jeżeli
ograniczenie źródła azotu nie jest pożądane, wówczas można zastosować ograniczenie
źródła fosforu (Roa Engel i in., 2008; Riscaldati i in., 2000).
Produkcja kwasu fumarowego na drodze fermentacji mikrobiologicznej, w neutralnym pH,
prowadzi do uzyskania soli kwasu fumarowego (fumaranów). Kwas fumarowy jest
precypitowany z płynu pohodowlanego (np. za pomocą węglanu wapnia), a następnie
odzyskiwany przez zakwaszenie środowiska hodowlanego. Niemniej jednak proces ten
prowadzi do wysokiego zużycia zasady (kontrola pH procesu fermentacji) i kwasu
(odzyskiwanie produktu), a w konsekwencji do wytworzenia dużych ilości niepotrzebnych
soli (Roa Engel i in., 2011; Roa Engel i in., 2008). Sytuacja może ulec poprawie, gdy proces
fermentacji jest prowadzony w niższym pH, gdzie większość stanowi niezdysocjowany kwas
fumarowy i jego sole monowodorowe. Niezdysocjowany kwas fumarowy ma niską
rozpuszczalność, co umożliwia jego precypitację z płynu pofermentacyjnego poprzez
krystalizację (Roa Engel i in., 2011).
Kolejnym, równie ważnym aspektem, jest dostarczenie CO2, który jest wykorzystywany w
czasie wytwarzania kwasu fumarowego (karboksylacja pirogronianu). Zazwyczaj CO2 jest
dostarczany do podłoża w postaci soli węglanowych (np. CaCO3, Na2CO3) ale powszechnie
wiadomo, że powietrze wzbogacone dwutlenkiem węgla również przyczynia się do produkcji
kwasu fumarowego na drodze fermentacji, prowadzonej przez grzyby z rodzaju Rhizopus
(Roa Engel i in., 2011; Zhou, Du i Tsao, 2000).
Preferowaną formą morfologiczną grzybów z rodzaju Rhizopus, w procesach przemysłowej
fermentacji, są pellety. Wielkość pelletów powinna być utrzymywana poniżej pewnej
krytycznej wartości, tak by zapobiec ograniczeniom dostępu tlenu, co mogłoby przyczyniać
się do obniżenia wydajności produkcji (Roa Engel i in., 2011; Zhou, Du i Tsao, 2000).
Usunięcie biomasy komórkowej, po zakończonym procesie fermentacji, jest łatwiejsze jeśli
mamy do czynienia z formą pelletu. Poza tym, parametry hodowli takie jak pH, warunki
hydrodynamiczne (objętość robocza, szybkość wytrząsania), znacząco wpływają na formę
wzrostu grzybni, a tym samym na zdolność syntezy kwasu fumarowego (Roa Engel i in.,
2011).
Metody otrzymywania kwasu fumarowego
Produkcja kwasu fumarowego, na drodze mikrobiologicznej, funkcjonowała w Stanach
Zjednoczonych w latach 40-tych. Jednak z biegiem czasu proces ten został zastąpiony przez
syntezę chemiczną, przy wykorzystaniu surowców, pochodzących z przemysłu
petrochemicznego.
Obecnie, kwas fumarowy, produkowany jest metodą chemiczną z bezwodnika kwasu
maleinowego, a ten z kolei uzyskiwany jest z butanu. Rosnące ceny ropy naftowej powodują
wzrost cen produktów ropopochodnych, w tym wspomnianego już bezwodnika kwasu
maleinowego (Yu i in., 2012; Huang i in., 2010; Anonymous, 2007). Dlatego też wytwarzanie
kwasu fumarowego, na drodze syntezy mikrobiologicznej, ponownie zaczęła wzbudzać
zainteresowanie (Roa Engel i in., 2008; Goldberg, Rokem i Pines, 2006).
Synteza kwasu fumarowego z udziałem mikroorganizmów
Istnieje wiele aspektów determinujących wydajność produkcji kwasu fumarowego w procesie
fermentacji mikrobiologicznej. Są to m.in.: typ mikroorganizmu i jego morfologia, rodzaj
czynnika neutralizującego, czy zastosowany surowiec (Roa Engel i in., 2008).
Kwas fumarowy produkowany jest na drodze syntezy mikrobiologicznej przez grzyby
należące do Mucorales, co stanowiło i stanowi przedmiot wielu badań (Cao i in., 1997; Du i
in., 1997; Gangl, Weigand i Keller, 1990; Kenealy, Zaady i Du preez, 1986).
Zidentyfikowano następujące rodzaje mikroorganizmów, wytwarzających kwas fumarowy:
Rhizopus, Mucor, Cunnighamella i Circinella, wśród których szczepy Rhizopus (nigricans,
arrhizus, oryzae i formosa) okazały się najlepszymi producentami, zarówno w warunkach
tlenowych jak i beztlenowych (Fu i in., 2010; Roa Engel i in., 2008; Carta i in., 1999; Cao i
in., 1996). Uzyskana w tym procesie biomasa, charakteryzuje się stosunkowo dużą
zawartością chityny (10-90%). Zatem, podczas jednego procesu produkcyjnego (procesu
fermentacji), możliwa jest koprodukcja kwasu fumarowego i chityny (Liao i in., 2008).
Synteza kwasu fumarowego, prowadzona przez grzyby z rodzaju Rhizopus, jest limitowana
przez azot. Obecność azotu prowadzi do zwiększonego wzrostu grzybni kosztem produkcji
kwasu fumarowego. Dlatego większość fermentacyjnych procesów syntezy kwasu
fumarowego składa się z trzech etapów: hodowla starterowa (seed culture), hodowla biomasy
grzyba na podłożu z azotem, produkcja kwasu fumarowego z ograniczonym źródłem azotu
(Liao i in., 2008; Zhou i in., 2002; Kenealy i in., 1986).
Jednakże zastosowanie grzybów do wytwarzania kwasu fumarowego na drodze fermentacji,
niesie ze sobą pewne utrudnienia. Grzybnia Rhizopus, ma tendencję do zbijania się, porastania
ścian bioreaktora i mieszadła, utrudniając wymianę i transport tlenu oraz sprawiając, że
fermentacyjny proces produkcji kwasów organicznych nie przynosi zadowalających efektów
(Huang i in., 2010; Yin i in., 1998). Wydajność mikrobiologicznej syntezy można poprawić
poprzez dążenie do uzyskania morfologicznie korzystnej formy grzybni w formie pelletów
(Huang i in., 2010; Liao i in., 2008).
Czynniki neutralizujące
Grzyby, jako potencjalni producenci kwasów organicznych, nie są w stanie tolerować
wysokiej kwasowości środowiska hodowlanego, dlatego zarówno wzrost jak i właściwa
produkcja są znacznie większe w obecności czynników neutralizujących (Zhou, Du i Tsao,
2002). Ciągła neutralizacja pH ma kluczowe znaczenie dla uzyskania optymalnej produkcji
kwasu fumarowego na drodze fermentacji mikrobiologicznej. W warunkach tlenowych, w
środowisku zawierającym wysokie stężenia źródła węgla, przy jednoczesnym ograniczeniu
ilości azotu, Rhizopus syntetyzuje duże ilości kwasu fumarowego oraz niewielkie ilości
kwasu jabłkowego i bursztynowego. W momencie gdy kwaśne metabolity zaczynają
gromadzić się w podłożu, pH hodowli zaczyna spadać, stopniowo hamując produkcję kwasu
fumarowego. Istnieje zatem konieczność stosowania czynników neutralizujących, które
zapobiegają zjawisku autoinhibicji (nagromadzony kwas fumarowy wpływa hamująco na
dalsze jego wytwarzanie) (Roa Engel i in., 2008; Riscaldati i in., 2000).
CaCO3 jako czynnik neutralizujący
Najczęściej stosowanym środkiem neutralizującym jest CaCO3. Ma jednak zasadniczą wadę,
mianowicie rozpuszczalność fumaranu wapnia nie jest na tyle wysoka, by można było mówić
o opłacalności ekonomicznej, czyli uzyskiwaniu pożądanego stężenia tej soli. W temperaturze
30°C rozpuszczalność fumaranu wapnia wynosi 21 g/l (Zhou, Du i Tsao, 2002; Gangl,
Weigand i Keller, 1990).
Wytrącanie fumaranu wapnia w pożywce fermentacyjnej skutkuje zwiększeniem lepkości
podłoża oraz ograniczeniem dyfuzji tlenu i substratów do wnętrza komórek grzyba. W efekcie
obecność nierozpuszczalnych kryształów fumaranu wapnia zwiększa zużycie energii w
późniejszych etapach fermentacji. Proces odzyskiwania kwasu fumarowego polega na
dodaniu kwasu mineralnego (np. HCl lub HNO3), który zapewnia uzyskanie nieorganicznej
soli wapnia, oraz ogrzaniu roztworu. Kwas fumarowy krystalizuje się z pożywki
fermentacyjnej.
Stosowanie CaCO3 jako czynnika neutralizującego, dodatkowo zapewnia kontrolę pH
(węglan wapnia stabilizuje pH środowiska hodowlanego) (Zhou, Du i Tsao, 2002).
Przeanalizowano również (Zhou i in., 2002; Riscaldati i in., 2000; Gangl, Weigand i Keller,
1990) inne związki, które mogłyby zastąpić CaCO3 (np.: Na2CO3, NaHCO3, Ca(OH)2,
(NH4)2CO3) w procesie mikrobiologicznej fermentacji (Roa Engel i in., 2008).
NaHCO3/ Na2CO3 jako czynnik neutralizujący
Biosynteza kwasu fumarowego, przy zastosowaniu NaHCO3/Na2CO3 jako czynnika
neutralizującego jest znacznie niższa niż w przypadku stosowania CaCO3. Ze względu na
dobrą rozpuszczalność fumaranu sodu (fumaran sodu, ma wyższą rozpuszczalność niż
fumaran wapnia), pellety grzyba mogą być łatwo oddzielone od pożywki fermentacyjnej.
Poza tym grzybnia może być wykorzystana podczas następnej hodowli fermentacyjnej.
Pozwala to zwiększyć wydajność całego procesu oraz ilość uzyskanego kwasu fumarowego.
Ponadto, niska rozpuszczalność kwasu fumarowego (0,7% w/v) sprawia, że może być on
łatwo odzyskany z soli (fumaranu) poprzez zakwaszenie. Dlatego też stosując NaHCO3/
Na2CO3, znacznie upraszczamy proces dalszej obróbki (mniej sprzętu i brak konieczności
ogrzewania). Korzyści te rekompensują wady, wynikające ze stosowania NaHCO3/ Na2CO3,
mianowicie nieco wyższe koszta i mniejsza wydajność wytwarzania kwasu fumarowego, w
porównaniu do stosowania CaCO3 (Zhou, Du i Tsao, 2002; Gangl, Weigand i Keller, 1990).
Zatem, NaHCO3/ Na2CO3 może być używany jako alternatywny środek neutralizujący i
zastępować CaCO3 w procesie produkcji kwasu fumarowego na drodze fermentacji
mikrobiologicznej (Zhou, Du i Tsao, 2002).
Ca(OH)2 jako czynnik neutralizujący
Wydajność produkcji kwasu fumarowego jest ok. trzykrotnie niższa w porównaniu do
stosowania CaCO3, z tego względu, że w przypadku CaCO3, w pożywce znajduje się więcej
rozpuszczonego dwutlenku węgla, dostępnego dla grzyba. To z kolei potwierdza teorię, iż
stała produkcja kwasu fumarowego przez grzyby z rodzaju Rhizopus jest możliwa w
obecności CO2. Pomimo, że Ca(OH)2 jest o wiele tańszy, nie jest dobrym zamiennikiem dla
CaCO3 (Zhou, Du i Tsao, 2002).
(NH4)2CO3 jako czynnik neutralizujący
Produkcja fumaranu amonu przy zastosowaniu (NH4)2CO3, jako środka neutralizującego,
musi być prowadzona w podłożu z ograniczonym źródłem fosforu (ograniczenie fosforu
wydaje się być kluczowym czynnikiem kontrolującym wzrost grzybni podczas produkcji
fumaranu amonu) (Roa Engel i in., 2008; Riscaldati i in., 2000).
Wydajność i produktywność kwasu fumarowego, uzyskana przy stosowaniu (NH4) 2CO3 jako
czynnika neutralizującego, jest porównywalna z wartościami, uzyskanymi przy użyciu CaCO3
(Federici i in., 1993).
Ponadto większa rozpuszczalność fumaranu amonu w stosunku do fumaranu wapnia nie
powoduje autoinhibicji. Reasumując, (NH4)2CO3 jest skutecznym i wygodnym w użyciu
środkiem neutralizującym do bezpośredniej syntezy fumaranu amonu (Riscaldati i in., 2000).
Fermentacja, przebiegająca bez użycia środków neutralizujących, a jednocześnie
zapobieganie hamowaniu własnym produktem, przyczynia się do poprawy ekonomiki
omawianego procesu (Gangl, Weigand i Keller, 1990).
Zastosowanie kwasu fumarowego
Kwas fumarowy znalazł zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu. Stosowany jest w
przemyśle spożywczym jako naturalny środek konserwujący i zakwaszający (dodawany do
wyrobów piekarniczych, deserów, rozpuszczalnych, sproszkowanych herbat, gum do żucia,
napojów owocowych), oznaczony symbolem E297. Ze względu na swoją strukturę, dwie
grupy karboksylowe oraz podwójne wiązanie, jest dogodnym substratem w reakcjach
polimeryzacji czy estryfikacji. Zastosowanie kwasu fumarowego, jako surowca w produkcji
żywic poliestrowych, papierowych, czy alkilowych, zapewnia nietoksyczność i większą
twardość uzyskiwanych polimerów (Roa Engel i in., 2008; Riscaldati i in., 2000).
Kwas fumarowy wykorzystywany jest również w przemyśle chemicznym do produkcji farb,
lakierów, olei nawilżających, tuszów, odczynników karboksylujących czy kosmetyków.
W medycynie stosowany jest do leczenia łuszczycy (choroby skóry). Osoby, cierpiące na
łuszczycę nie są w stanie produkować kwasu fumarowego w swoim organizmie (co ma
miejsce w przypadku osób zdrowych), ze względu na pewne zaburzenia biochemiczne.
Dlatego też zmuszone są przyjmować doustnie kwas fumarowy w postaci estrów
monoetylowych i dimetylowych (Roa Engel i in., 2008). Estry kwasu fumarowego były
stosowane w leczeniu łuszczycy już od 1959 roku. Uznawane są za bezpieczne, skuteczne i
dobrze tolerowane przez ludzki organizm (Brewer i Rogers, 2007).
Kwas fumarowy znalazł również zastosowanie jako dodatek do pasz dla bydła (Roa Engel i
in., 2008).
Ponadto wykorzystywany jest jako surowiec do produkcji kwasu asparaginowego, przy
wykorzystaniu immobilizowanych komórek bakterii E.coli, o wysokiej aktywności enzymu
aspartazy (kwas fumarowy, pod wpływem działania aspartazy zostaje przekształcony do
kwasu L-asparaginowego). Kwas L-asparaginowy z kolei jest stosowany do otrzymywania
aspartamu (peptydowego słodzika). Jest więc wysoce prawdopodobne, iż dostępność
wytwarzanego metodami biotechnologicznymi kwasu fumarowego, spotkałaby się z
pozytywnym odbiorem przez konsumentów jako, że aspartam byłby wówczas biologicznego
pochodzenia, a to z kolei mogłoby zwiększyć jego dotychczasowe wykorzystanie (Goldberg,
Rokem i Pines, 2006; Riscaldati i in., 2002; Riscaldati i in., 2000).
Rys. 2. Kwas fumarowy - zastosowanie (za: Roa Engel C.A. i in., 2008)
Rosnące ceny surowców kopalnianych, sprawiają, że produkcja kwasu fumarowego na
drodze fermentacji mikrobiologicznej, może w niedalekiej przyszłości, stać się tańszą
alternatywą,
W oparciu o dostępną literaturę, mikroorganizmem o najwyższej produktywności
kwasu fumarowego jest Rhizopus oryzae. Mikroorganizm ten wytwarza kwas fumarowy,
dzięki połączeniu cyklu kwasu cytrynowego i redukcyjnej karboksylacji pirogronianu.
Zmniejszenie lub całkowite wyeliminowanie środków neutralizujących oraz
zoptymalizowanie morfologii tych grzybów, mogłoby wpłynąć na poprawę wydajności
produkcji kwasu fumarowego. Należy jednak pamiętać, iż zaprzestanie stosowania środka
neutralizującego będzie prowadzić do pojawiania się zjawiska autoinhbicji (hamowania
własnym produktem). Sposobem rozwiązania tego problemu może być usuwanie ”in situ”
kwasu fumarowego w trakcie trwania procesu fermentacji (Roa Engel i in., 2008).
Literatura
1. Anonymous, 2007. Product focus : Maleic anhydride. Chem Week 39.
2. Brewer L., Rogers S., 2007. Fumaric acid esters in the management of severe psoriasis.
Clinical and Experimental Dermatology 32, 246–249
3. Cao N.J.,, Du J.X.,, Gong C.S., Tsao G.T., 1996. Simultaneous production and recovery
of fumaric acid from immobilized Rhizopus oryzae with a rotary biofilm contactor and an
adsorption column. Appl. Environ. Microbiol. 62: 2926–2931.
4. Cao N., Du J., Chen C., Gong C.S., Tsao G.T., 1997. Production of fumaric acid by
immobilized Rhizopus using rotary biofilm contactor. Appl. Biochem. Biotechnol. 63(65):
387–394.
5. Carta F.S., Soccol C.R., Ramos L.P., Fontana J.D., 1999. Production of fumaric acid
by fermentation of enzymatic hydrolysates derived from cassava bagasse. Bioresource
Technol. 68: 23–28.
6. Du J., Cao N., Gong C.S., Tsao G.T., Yuan N., 1997. Fumaric acid production in airlift
loop reactor with porus sparger. Appl. Biochem. Biotechnol. 63: 541–556.
7. Federici F., Moresi M., Parente E., Petruccioli M., Piccioni P., 1993. Effect of stirring
rate and neutralising agent on fumaric acid production by Rhizopus arrhizus. Ital. J. Food
Sci. 4: 387–396.
8. Friedberg D., Peleg Y., Monsonego A., Maissi S., Battat E., Rokem J.S. , Goldberg
I., 1995. The fumR gene encoding fumarase in the filamentous fungus Rhizopus oryzae:
cloning, structure and expression. Gene 163: 139- 144.
9. FuY-Q., Xu Q., Li S., Chen Y., Huang H., 2010. Strain improvement of Rhizopus
oryzae for over-production of fumaric acid by reducing ethanol synthesis pathway.
Korean J. Chem. Eng. 27(1), 183-186.
10. Gangl I.C., Weigand W.A., Keller F.A., 1990. Economic comparison of calcium
fumarate and sodium fumarate production by Rhizopus arrhizus. Appl. Biochem.
Biotechnol. 24/25: 664–677.
11. Goldberg I., Rokem J. S., Pines O., 2006. Review Organic acids: old metabolites, new
themes. J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1601–1611.
12. Huang L., Wei P., Zang R., Xu Z., Cen P., 2010. High-throughput screening of highyield colonies of Rhizopus oryzae for enhanced production of fumaric acid. Ann.
Microbiol. 60: 287-292.
13. Kenealy W., Zaady E., Du preez J.C., 1986. Biochemical aspects of fumaric acid
accumulation by Rhizopus arrhizus. Applied and Environmental Microbiology 52, 128–
133.
14. Liao W. , Liu Y., Frear C., Chen S., 2008. Co-production of fumaric acid and chitin
from a nitrogen-rich lignocellulosic material – dairy manure – using a pelletized
filamentous fungus Rhizopus oryzae ATCC 20344. Bioresource Technology 99: 5859–
5866.
15. Riscaldati E., Moresi M., Federici F., Petruccioli M., 2000. Direct ammonium fumarate
production by Rhizopus arrhizus under phosphorous limitation. Biotechnology Letters 22:
1043–1047.
16. Riscaldati E., Moresi M., Federici F., Petruccioli M., 2002. Ammonium fumarate
production by free or immobilized Rhizopus arrhizus in bench- and laboratory-scale
bioreactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 77: 1013–1024.
17. Roa Engel C.A., Straathof A.J.J., Zijlmans T.W., van Gulik W.M., van der Wielen
L.A.M., 2008. Fumaric acid production by fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:
379–389.
18. Roa Engel C.A, van Gulik W.M., Marang L., van der Wielen L.A.M., Straathof
A.J.J., 2011. Development of a low pH fermentation strategy for fumaric acid production
by Rhizopus oryzae. Enzyme and Microbial Technology 48: 39–47.
19. Sauer M., Porro D., Mattanovich D., Branduardi P., 2008. Microbial production of
organic acids: expanding the markets. Trends Biotechnol. 26, 100-108.
20. Schlegel H.G., 2000. Mikrobiologia ogólna. PWN, Warszawa.
21. Yin P.M., Yahiro K., Ishigaki T., Park Y., Okabe M., 1998. L-(+)- lactic acid
production by repeated batch culture of Rhizopus oryzae in air-lift bioreactor. Journal of
Fermentation Bioengineering 85, 96–100.
22. Yu S., Huang D., Wen J., Li S., Chen Y., Jia X., 2012. Metabolic profiling of a
Rhizopus oryzae fumaric acid production mutant generated by femtosecond laser
irradiation. Bioresource Technology.
23. Zhou Y., Du J.X., Tsao G.T., 2000. Mycelial pellet formation by Rhizopus oryzae ATCC
20344. Appl. Biochem. Biotech. 84–86: 779–789.
24. Zhou Y., Du J., Tsao G.T., 2002. Comparison of fumaric acid production by Rhizopus
oryzae using different neutralizing agents. Bioprocess Biosyst. Eng. 25: 179–181.