Co biotechnologia moze zrobic dla pszczol [final]
advertisement
• Zakażenie pszczoły miodnej patogenem Nosema ceranae • Diagnostyka infekcji wirusowych pszczoły miodnej Plan 1. Znaczenie ekologiczne i gospodarcze pszczół 2. Choroby pszczół i ich diagnostyka 3. Podstawy technologii phage display 4. Opracowanie szybkiego testu polowego z zastosowaniem przeciwciał królowa truteń alexanderwild.com robotnica Jakie korzyści przynoszą pszczoły człowiekowi? producenci • miodu • wosku główni zapylacze Jakie korzyści przynoszą pszczoły człowiekowi? 1,5 mln ton miodu na świecie Miód jest odżywczym produktem - cukry - 28% białek - kwasy tłuszczowe - witaminy i minerały - enzymy Pszczoły w liczbach 90% drzew owocowych 30% roślin spożywczych trzecie zwierzę hodowlane 15 mld $ zysku (miód 150 mln) 1 mln kwiatów dziennie (rodzina) Choroby pszczół Zagrożenie wymarciem pszczół antybiotyki ? samobójstwa CCD pestycydy infekcje drapieżniki Infekcje grzybowe – Nosema spp Objawy zakażenia N. ceranae • problemy z powrotem do ula • krótszy czas życia • stan głodu • immunosupresja Infekcje grzybowe – Nosema spp 1 – dysk kotwiczący 2 – egzospora 3 – endospora 4 – błona cytoplazmat. 5 – polaroplast lameralny 6 – polaroplast tubularny 7 – włókno biegunowe 8 – aparat jądrowy 9 – wakuola tylna Infekcje grzybowe – Nosema spp www.zoologie.uni-halle.de/allgemeine_zoologie/staff/dino_mcmahon/ Niektóre wirusy infekujące pszczoły • kompleks ABPV-KBV-IAPV wirus ostrego paraliżu pszczół kaszmirski wirus pszczół wirus izraelskiego paraliżu pszczół • DWV, SV • BQCV • CBPV Robotnice A. mellifera zainfekowane DWV Dicistroviridae http://viralzone.expasy.org/all_by_species/36.html Diagnostyka chorób pszczół Diagnostyka Nosema spp. i wirusów pszczelich Obecna diagnostyka Nosema nie jest możliwa w warunkach polowych transmisyjna mikroskopia elektronowa multiplex PCR mikroskopia kontrastowofazowa Diagnostyka Nosema spp. - mikroskopia Nosema ceranae Nosema apis Diagnostyka Nosema spp. - PCR ekstrakcja genomowego DNA multipleks PCR analiza produktów PCR Technologia phage display Podstawy technologii phage display • selekcja in vitro • prezentacja fagowa pozwala na selekcję białek rozpoznających wybrany cel molekularny z puli miliardów wariantów • bezpośrednia zależność genotyp - fenotyp • bakteriofagi stosowane w phage display to fagi filamentowe (M13, Ff) McCafferty et al. Nature, 348(6301): 552–554, 1990. www3.nd.edu/~aseriann/CHAP5B.html/sld087.htm Generacja przeciwciał monoklonalnych w technologii phage display Podstawy technologii phage display fagmid fag pomocniczy E. coli Fragmenty przeciwciał - scFv • stabilne • tanie w produkcji • lepsze penetrowanie tkanki • obniżona immunogenność • szybciej usuwane z układu krwionośnego Clinical and Developmental Immunology, 2012, Article ID 980250 • • • • • wybór antygenu i metody immobilizacji biopanning, selekcja transdukcja E. coli namnażanie i oczyszczanie fagów kolejna runda selekcji Opracowanie szybkiego testu polowego z zastosowaniem przeciwciał Szybki test polowy koncepcja Selekcja przeciwciał skierowanych przeciw N. ceranae – strategia • Selekcja przeciwciał wobec rekombinowanego białka ściany spor • Selekcja przeciwciał wobec oczyszczonych spor N. ceranae Selekcja przeciwciał skierowanych przeciw N. ceranae – pozyskanie materiału Selekcja przeciwciał skierowanych przeciw N. ceranae – strategia C8 120 100 80 60 40 20 0 1000 A B C D E F G 100 10 1 C8 B10 F8 H Selekcja przeciwciał skierowanych przeciw sporom N. ceranae – rezultaty • Uzyskanie przeciwciał rozpoznających specyficznie białko rekombinowane • Uzyskanie przeciwciał oczyszczone spory rozpoznających • Optymalizacja przeciwciał i konstrukcja testu paskowego Selekcja przeciwciał skierowanych przeciw wirusom – cele i strategia immobilizacja antygenu (peptydy i całe wirusy) • WYZWANIE: specyficznych wirusów selekcja elucja i analiza otrzymanie przeciwciał wobec czterech różnych Selekcja przeciwciał skierowanych przeciw wirusom – cele i strategia scFv rozpoznające jedną cząsteczkę wirusa selekcja negatywna selekcja pozytywna selekcja negatywna selekcja pozytywna selekcja pozytywna poszukiwanie odpowiadających klonów bez reakcji krzyżowych Podsumowanie • Pszczoły odgrywają ogromną rolę w ekosystemie i gospodarce masowo giną • Potrzebna jest metoda diagnostyczna, która umożliwi szybkie wykrycie infekcji w warunkach polowych • W Pure Biologics pozyskujemy metodą prezentacji fagowej • Obiecujące wyniki opracowywanego polowego do diagnostyki przeciwciała testu Dziękuję za uwagę
