Zastosowanie metody real-time PCR do wykrywania RNA

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 245 - 253
Katarzyna Leś2, Maciej Przybylski1,2, Tomasz Dzieciątkowski1,2, Grażyna Młynarczyk1,2
Zastosowanie metody real-time PCR do wykrywania RNA enterowirusów
człowieka
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny
Kierownik: prof. dr hab. G. Młynarczyk
2
Zakład Mikrobiologii, Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny
Kierownik: prof. dr hab. G. Młynarczyk
1
Celem pracy było zaprojektowanie i optymalizacja warunków reakcji w metodzie real-time PCR z wykorzystaniem sondy typu TaqMan do wykrywania
enterowirusów człowieka. Użyto starterów oraz sondy komplementarnych
dla konserwatywnych sekwencji w obrębie regionu niekodującego genomu
enterowirusów (5’UTR). Sprawdzono swoistość metody wobec 19 taksonów
enterowirusów z grup Coxsackie A, Coxsackie B, echowirusów i enterowirusów 68/71, a także innych wirusów zakażających człowieka. Określono
zakres czułości metody względem szeregu dziesiętnych rozcieńczeń zawiesiny
wzorcowych szczepów enterowirusów.
Wprowadzenie w 1957 roku określenia „enterowirusy” pozwoliło zakwalifikować do
jednej grupy poliowirusy, wirusy Coxsackie z grupy A i B oraz echowirusy (1, 14). Dzisiaj
znanych jest ponad 60 przedstawicieli tego rodzaju. Są to małe, bezotoczkowe wirusy
zawierające RNA jako materiał genetyczny, należące do rodziny Picornaviridae (8, 14),
powodujące różnego rodzaju zakażenia u dzieci i osób dorosłych.
Zwykle objawy zakażenia enterowirusami są niespecyficzne np. gorączka lub bóle głowy, ale zdarzają się także postacie objawowe stanowiące zagrożenie życia (15). Najczęściej
do zakażeń enterowirusami dochodzi drogą fekalno-oralną lub oddechową w okresie lata
i wczesnej jesieni (13, 14). Enterowirusy wywołują wiele chorób, z których najgroźniejszą
jest nagminne porażenie dziecięce (poliomyelitis), powodowane przez poliowirusy typu 1-3.
Szczepy te w wyniku wtórnej wiremii atakują ośrodkowy układ nerwowy przez zakończenia
obwodowych włókien nerwowych. W postaciach poronnych choroby i w postaci nieporażennej powrót do zdrowia jest całkowity. Postać porażenna poliomyelitis w 25% przypadków
prowadzi do poważnego kalectwa, w 25% do inwalidztwa niewielkiego stopnia, natomiast
pozostali pacjenci wracają do pełnego zdrowia bez śladów porażeń. Śmiertelność wynosi
od 1-4 % u dzieci, lecz wśród dorosłych może dochodzić nawet do 10% (1, 14, 15). Enterowirusy niepoliomielityczne wywołują szereg chorób, które wprawdzie nie są tak groźne dla
życia człowieka jak poliomyelitis, ale również mogą wymagać hospitalizacji. Zaliczamy do
nich: aseptyczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, herpanginę, chorobę bornholmską
czy zapalenie wsierdzia (1, 14).
246
K. Leś i inni
Nr 3
Przez wiele lat za „złoty standard’’ w diagnozowaniu zakażeń enterowirusowych uważano izolację szczepów wraz z późniejszą identyfikacją typu wirusa testem neutralizacji
z wzorcowymi surowicami. W obecnej chwili do izolacji enterowirusów w hodowlach
komórkowych stosuje się co najmniej dwie różne linie komórek w celu zapewnienia
jak największej wydajności tej metody (10). Testy neutralizacji, wykorzystujące różnice
w budowie antygenowej enterowirusów, polegają na inkubacji wyizolowanego szczepu
wirusowego z surowicami odpornościowymi dla konkretnych serotypów enterowirusów,
a następnie zakażeniu wrażliwych hodowli komórkowych (11). Podstawą identyfikacji jest
reaktywność surowic wzorcowych z odpowiednim serotypem wirusa.
Ze względu na różnorakie ograniczenia w badaniach serologicznych lub izolacji wirusa
w hodowlach komórkowych, konieczne stało się opracowanie nowych technik diagnostycznych, które umożliwiają wykrywanie obecności enterowirusów w organizmie pacjenta już
w początkowych etapach zakażenia.
Reakcja łańcuchowej polimeryzacji (PCR) jest jedną z technik biologii molekularnej,
która umożliwia powielanie fragmentów DNA in vitro. W celu wykrycia wirusowego RNA
konieczna jest jednak uprzednia transkrypcja RNA do komplementarnego DNA (cDNA) za
pomocą odwrotnej transkryptazy. Na matrycy powstałego cDNA przeprowadza się reakcję
PCR (RT-PCR). Metoda ta połączona z elektroforezą żelową pozwala wykryć enterowirusowe RNA nawet w niewielkiej ilości materiału badanego; charakteryzuje się także dużą
swoistością (2, 7, 10).
Jedną z odmian PCR jest reakcja łańcuchowej polimeryzacji w czasie rzeczywistym
(qPCR), która umożliwia szybkie powielanie, wykrywanie i identyfikację nawet znikomych
ilości materiału genetycznego. Technika real-time PCR charakteryzuje się wyższą czułością
niż tradycyjna reakcja łańcuchowej polimeryzacji (6, 12); można ją także z powodzeniem
stosować w przypadku dłużej przechowywanego wrażliwego materiału biologicznego, np.
próbek krwi pełnej lub surowicy krwi (9). Dodatkowo na korzyść qPCR przemawia możliwość zautomatyzowania procedury i znacznego obniżenia kosztów analizy (16).
Celem pracy było opracowanie i optymalizacja testu PCR z detekcją w czasie rzeczywistym do wykrywania RNA ludzkich enterowirusów w różnych materiałach klinicznych,
ze szczególnym uwzględnieniem surowicy krwi oraz płynu mózgowo-rdzeniowego.
MATERIAŁ I METODY
Do badań użyto 19 szczepów enterowirusów, należących do grup Coxackie A, Coxackie
B, ECHO oraz enterowirus 68/71 (Tabela I). Szczepy namnażane były w komórkach linii
MK2 (ATCC: CCL-7) utrzymywanych w podłożu Eagle’a (WSiS Lublin) z dodatkiem 10%
płodowej surowicy bydlęcej (Invitrogen). Zakażone hodowle komórkowe inkubowano do
wystąpienia efektu cytopatycznego obejmującego 75-80% komórek.
Izolację wirusowego RNA przeprowadzono, zgodnie z procedurą dostarczoną przez
producenta, przy użyciu odczynnika TRIzol (Invitrogen), używając jako materiału zawiesin
wirusa zebranych znad hodowli komórkowych. Wyizolowane RNA zawieszano w końcowej
objętości 50 µl wody destylowanej wolnej od kwasów nukleinowych oraz nukleaz. Wyizolowane RNA w objętości 8 µl używano do syntezy cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji
z użyciem losowych heksametrów i odwrotnej transkryptazy M-MLV (Invitrogen) (Tabela II).
Nr 3
Wykrywanie RNA enterowirusów metodą real- time PCR
247
Produkt reakcji, czyli cDNA stanowiło materiał do wykrywania enterowirusów w łańcuchowej reakcji polimerazy, zarówno z detekcją w czasie rzeczywistym, jak i w wariancie
klasycznym.
Tabela I. Nazwy i numery szczepów enterowirusów wykorzystywanych w badaniach
Nazwa i numer szczepu
Coxsackie A 9 (1971)
Echo 5 (0552)
Coxsackie A 16(354PT)
Echo 6 (1846)
Coxsackie B2
Echo 9 (2121)
Coxsackie B2(2082)
Echo 9 (2165)
Coxsackie B3
Echo 9 (2325)
Coxsackie B3(97PT)
Echo 11 (1843)
Coxsackie B4
Echo 18 (20290)
Coxsackie B4
Echo 30 (2110)
Coxsackie B5
Entero 71
Coxsackie B5(1957)
Tabela II. Skład mieszaniny reakcyjnej do odwrotnej transkrypcji
Odczynnik
Objętość
H2O
20 µl
5x bufor FS
8 µl
0,1 DTT
5 µl
10 mM dNTP
5 µl
Inhibitor RNAz
1,5 µl
BSA
1 µl
Do wykrywania genetycznego materiału enterowirusów metodą qPCR stosowano
swoiste startery, zaprojektowane do amplifikacji fragmentu genomu o długości 96 par zasad w obrębie regionu 5’UTR. W celu zwiększenia specyficzności reakcji zaprojektowano
sondę znakowaną na końcu 5’ fluoroforem JOE a na końcu 3’ wygaszaczem DABCYL
(Oligo) (Tabela III).
Tabela III. Sekwencje użytych starterów i sondy
Nazwa
Sekwencja (5’ – 3’)
Ent_1
TCC GGC CCC TGA ATG C
Ent_2
CAC CGG ATG GCC AAT CCA
Ent_JOE
JOE – GCG GAA CCG ACT ACT TTG GG – DABCYL
Badania techniką real-time PCR wykonywano w aparacie LightCycler 2.0 z użyciem
zestawu amplifikacyjnego LightCycler® TaqMan® Master (Roche Diagnostics). Mieszanina
reakcyjna zawierała 5 µl cDNA, po 1 µM obu starterów oraz 200 nM sondy w końcowej
objętości 20 µl. PCR rozpoczynał się etapem aktywacji (hot-start) termostabilnej DNA
polimerazy przez 10 min w temp. 95°C, po którym następowało 40 cykli składających się
z denaturacji 10 s w temp. 95°C, przyłączania starterów przez 30 s w temp. 55°C oraz wydłużania nici w temperaturze temp. 72°C przez 18 s. Reakcję kończyło schłodzenie próbek
248
K. Leś i inni
Nr 3
do temp. 40°C na 30 sekund. Odczyt fluorescencji odbywał się przy długości fali 560 nm,
typowej dla fluoroforu JOE.
Do określenia swoistości zaprojektowanej reakcji real-time PCR użyto RNA wyizolowanego z zakażonych enterowirusami komórek linii MK2 (Tabela I). Jako kontrolę ujemną
wykorzystano DNA wyekstrahowane z niezakażonej linii A549, zaś za kontrole swoistości
reakcji posłużyło DNA izolowane z ludzkich herpeswirusów (HSV-1, HSV-2, EBV, HHV-7)
oraz adenowirusów typu 4 i 12.
Poprzez dodanie namnożonego wirusa Echo 18 do materiałów klinicznych (surowica,
osocze, krew pełna, popłuczyny z drzewa oskrzelowego, płyn mózgowo-rdzeniowy) i izolację
RNA oraz odwrotną transkrypcję sposób opisany powyżej, badano potencjalną inhibicję
reakcji real-time PCR w danym materiale.
Do określenia czułości metody PCR wykonano seryjne 10-krotne rozcieńczenia supernatantu hodowli komórkowej zakażonej wirusem Coxackie A9. RNA wyekstrahowano z 200
µl kolejnych rozcieńczeń supernatantu w podłożu Eagle’a w zakresie od 100 do 10-8. Dla
porównania wykonano standardowy RT-PCR służący do wykrywania enterowirusów wg.
Hyypia (7) w końcowej objętości 50 µl z użyciem 5 µl wyizolowanego cDNA. Produkty
amplifikacji poddawano 60-cio minutowej elektroforezie w 1,5% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (Serva) w buforze TAE (Invitrogen), przy napięciu 10 V/cm żelu.
Wizualizację przeprowadzano w świetle ultrafioletowym za pomocą transiluminatora UV.
Wszystkie opisane powyżej badania prowadzono w dwukrotnych, niezależnych powtórzeniach.
WYNIKI
Przy użyciu jakościowej metody real-time PCR wynik dodatni, wyrażony wykładniczym przyrostem fluorescencji mieszaniny reakcyjnej, osiągnięto wyłącznie dla próbek
zawierających cDNA enterowirusów człowieka. W pozostałych próbkach, zawierających
kontrolne DNA uzyskane z niezakażonej linii A549, wirusa opryszczki typu 1 i 2, wirusa
ospy wietrznej/półpaśca, herpeswirusa typu 7, wirusa Epsteina-Barr oraz ludzkich adenowirusów typu 4 i 12, nie zaobserwowano fluorescencji przy długości fali świetlnej 560 nm,
co oznacza, że nie zaszła w nich swoista amplifikacja kwasu nukleinowego. Obserwacja
taka poczyniona dla próbek zawierających materiał genetyczny innych wirusów świadczy
o wysokiej swoistości zaprojektowanej reakcji (Ryc.1). Dodatkowo w próbach z użyciem
różnych materiałów klinicznych nie zaobserwowano w żadnym z nich zmian w progu czułości wykrywania wirusowego cDNA.
Podczas określania zakresu czułości metody, technika real-time PCR umożliwiała wykrycie wszystkich użytych rozcieńczeń cDNA wirusa Coxackie A9. Wynik dodatni w postaci
obserwowanego wzrostu fluorescencji wystąpił we wszystkich próbkach zawierających
rozcieńczenia cDNA w zakresie od 100 do 10-8 (Ryc.2).
W użytej do porównania metodzie RT- PCR połączonej z elektroforetycznym rozdziałem produktów (7) uzyskano także specyficzną amplifikację sekwencji docelowych wirusa
Coxackie A9. Jednak rozcieńczenia cDNA zastosowane przy określaniu czułości techniką
real-time PCR, amplifikowane konwencjonalną metodą RT-PCR, dawały wynik dodatni
w postaci widocznych prążków na żelu agarozowym wyłącznie w zakresie rozcieńczeń od
100 do 10-4 (Ryc.3).
Nr 3
Wykrywanie RNA enterowirusów metodą real- time PCR
249
Ryc.1. Badanie swoistości reakcji real-time PCR w kierunku wykrywania enterowirusów człowieka. Wynik dodatni (eksponencjalny przyrost poziomu fluorescencji) wystąpił w przypadku
próbki zawierającej cDNA wirusa Echo18. Pozostałe próbki zawierające DNA izolowane
z niezakażonej linii komórkowej A549 oraz DNA HSV-1, HSV-2, EBV, VZV, HHV-7,
HAdV-4 i HAdV-12 dały wynik ujemny.
Ryc.2. Badanie czułości metody real-time PCR w kierunku wykrywania enterowirusów człowieka. Poszczególne krzywe oznaczają amplifikację cDNA seryjnych rozcieńczeń wirusa
Coxackie A9 w zakresie od 10-2 do 10-8. K (-) to kontrola ujemna reakcji - DNA izolowane
z niezakażonej linii komórkowej A549.
250
Ryc.3. K. Leś i inni
Nr 3
Badanie czułości tradycyjnej metody PCR w kierunku wykrywania enterowirusów człowieka. Poszczególne ścieżki elektroforegramu oznaczają cDNA pochodzące z seryjnych
rozcieńczeń wirusa Coxackie A9 w zakresie od 100 do 10-4; K (-) to kontrola ujemna reakcji
- DNA izolowane z niezakażonej linii komórkowej A549; marker - wzorzec masowy DNA
100 bp (Invitrogen).
DYSKUSJA
Z powodu swego rozpowszechnienia, enterowirusy w dalszym ciągu pozostają jednym
z najważniejszych czynników odpowiedzialnych za objawowe zakażenia człowieka. Diagnostyka zakażeń enterowirusami jest skomplikowana i czasochłonna ze względu na liczbę
typów wirusów występujących w obrębie rodzaju (1, 14). Wykrycie przeciwciał swoistych
w klasie IgG lub wykrycie swoistych przeciwciał wszystkich klas w przebiegu ostrego zakażenia objawowego rzadko prowadzi do jednoznacznego określenia enterowirusowej etiologii
bieżącego zakażenia. Także uznana metoda serologiczna, jaką jest wykrywanie swoistych
przeciwciał w klasie IgM może dawać niejednoznaczne wyniki, zwłaszcza w zakażeniach
przewlekłych, zakażeniach o przebiegu subklinicznym lub podczas zwiększonej stymulacji
immunologicznej populacji w sezonie epidemicznym (10).
Uważana do niedawna za „złoty standard” w diagnostyce zakażeń o etiologii enterowirusowej metoda izolacji wirusów w hodowlach komórkowych charakteryzuje się niską
czułością. Potwierdzenie etiologii aseptycznego enterowirusowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych poprzez wyizolowanie wirusa z próbki płynu mózgowo-rdzeniowego ma
miejsce tylko w mniej niż 75% przypadków (15). Należy również zwrócić uwagę na brak
możliwości namnażania niektórych szczepów enterowirusów w hodowlach komórkowych,
co poważnie utrudnia diagnozowanie zakażeń (3, 10). W latach 1995-2000 w Państwowym
Zakładzie Higieny przeprowadzono badania 2 719 próbek materiału klinicznego pobranych
Nr 3
Wykrywanie RNA enterowirusów metodą real- time PCR
251
od osób z objawami wskazującymi na wirusowe zakażenie ośrodkowego układu nerwowego. Spośród tej grupy analizie poddano 1946 przypadków pacjentów ze schorzeniami
ośrodkowego układu nerwowego. Dodatni wynik izolacji uzyskano u 31,11 % i 28,27%,
odpowiednio w 1995 i 1996 roku. W 2000 roku na 268 próbek poddanych izolacji wynik
ujemny izolacji miał miejsce w przypadku 264 próbek, co oznacza tylko 1,5 % wyników
dodatnich. Powyższe fakty wskazują na wyjątkowo niską częstość izolacji enterowirusów
w Polsce (3). Pomimo, że coraz częściej technika ta jest zastępowana przez nowoczesne
metody molekularne, izolacja enterowirusów w hodowlach komórkowych nadal pozostaje
metodą niezbędną w prowadzeniu prac badawczych. Dostarcza ona szeregu istotnych informacji m. in. o krążeniu szczepów należących do poszczególnych typów, jak i dominacji
określonych typów enterowirusów w sezonach epidemicznych. Kolejny etap diagnostyki,
test seroneutralizacji, uważany jest za metodę wysoce czasochłonną i skomplikowaną.
W ujęciu praktycznym niemożliwe jest badanie materiału klinicznego przy użyciu surowic,
w których znajdowałyby się przeciwciała dla szczepów z całego rodzaju. Z tego też powodu
stosuje się surowice pulowane, dobrane tak, by po reakcji dawały charakterystyczne wyniki
dla konkretnych szczepów (10, 11). Jednakże nawet dostępność wielu zestawów surowic
nie umożliwia serotypowania wszystkich szczepów, gdyż izoluje się szczepy niepoddające
się identyfikacji w testach neutralizacji (10). Ograniczeniem metody jest również fakt, iż
wynik testu zależy od doświadczenia osoby wykonującej badanie. W warunkach szpitalnego
laboratorium mikrobiologicznego utrudnia to znacząco stosowanie tej metody w rutynowej
diagnostyce. Próby standaryzacji testów seroneutralizacji zakończyły się niepowodzeniem,
z tego też powodu serotypowaniem enterowirusów zajmują się tylko referencyjne i wyspecjalizowane laboratoria naukowe (10).
W praktyce uzyskanie wyniku potwierdzającego zakażenie ludzkimi enterowirusami
pozwala lekarzowi na szybkie postawienie diagnozy. Najważniejszym zadaniem dla klinicysty jest odróżnienie stanu zagrażającego życiu dziecka od bardziej łagodnych przyczyn
podwyższonej temperatury ciała szczególnie, gdy istnieje podejrzenie o zakażenia OUN.
Infekcje o podłożu bakteryjnym mogą rozwijać się bardzo gwałtownie, bez możliwości
różnicowania z aseptycznym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych na etapie przedmiotowego badania dziecka (5). Czułość i swoistość testów PCR zaprojektowanych do
wykrywania enterowirusów została określona na poziomie >95 % i jest znacząco wyższa
od czułości hodowli komórkowych (65-75%) (4). Dzieci z podejrzeniem aseptycznego
zapalenia opon mózgowo rdzeniowych poddawane są zbędnej antybiotykoterapii oraz
wielu badaniom, w tym bardzo kosztownym, jak rezonans magnetyczny czy tomografia
komputerowa. Wykrywając materiał genetyczny enterowirusów w próbkach materiału pobranych od pacjenta już w pierwszym dniu hospitalizacji można doprowadzić do znaczącego
obniżenia kosztów procedur medycznych w następstwie skrócenia czasu hospitalizacji oraz
racjonalizacji terapii (16).
Reakcja łańcuchowa polimeryzacji z detekcją produktu w czasie rzeczywistym stała
się niezbędnym narzędziem diagnostycznym ze względu na swą wysoką czułość i swoistość. Większość metod RT-PCR oraz qPCR służących do diagnostyki zakażeń enterowirusowych polega na wykrywaniu sekwencji w obrębie regionu 5’UTR, co spowodowane
jest jego konserwatywnością w obrębie całego rodzaju Enterovirus (5, 7, 12). Czułość
izolacji wirusa z PMR jest niewystarczająca, i jak wynika z danych Państwowego Zakłady
Higieny spada ona w naszym kraju niepokojąco z roku na rok (3). Może okazać się więc,
252
K. Leś i inni
Nr 3
że reakcja łańcuchowa polimeryzacji w wariancie real-time będzie szczególnie przydatna
w diagnozowaniu aseptycznego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Dodatkową zaletą
opracowanej metody jest jej wszechstronność w odniesieniu do różnych rodzajów materiału
klinicznego, w których w przebiegu zakażenia można poszukiwać materiału genetycznego
enterowirusów. Wykorzystując w badaniach szereg materiałów klinicznych o różnej zawartości składników organicznych oraz elementów komórkowych nie zaobserwowano spadku
poziomu wykrywalności cDNA enterowirusów w odniesieniu do materiału wzorcowego,
którym był supernatant zakażonej hodowli komórkowej.
Zalety diagnozowania enterowirusowego zapalenia opon mózgowo rdzeniowych przy
użyciu metody qPCR zaobserwowano już w krajach, w których z powodzeniem korzysta
się z tej metody. Dodatkowo, skrócenie czasu oczekiwania na wynik do jednego dnia, w porównaniu np. z metodą izolacji (5-8 dni), może przyczynić się do uniknięcia niepotrzebnej
antybiotykoterapii oraz obniżenia kosztów procedur medycznych.
WNIOSKI
1. Zaprojektowana metoda real-time PCR z zastosowaniem sondy TaqMan® pozwala na
swoiste wykrywanie cDNA różnych gatunków enterowirusów.
2. Zastosowanie metody real-time PCR w rutynowej diagnostyce zakażeń enterowirusami człowieka mogłoby pozwolić na znaczące skrócenie czasu oczekiwania na wynik
badania.
Podziękowania
Autorzy dziękują Fundacji na Rzecz Chorych z Chorobami Krwi za pomoc podczas
wykonywania części badań molekularnych w niniejszej pracy.
K. Le ś , M . P r z y byl ski , T. Dz i e c i ą t kowski , G. M łynarczyk
Detection of human enteroviruses with real-time PCR assay using TaqMan fluorescent
probe
SUMMARY
Infections with human enteroviruses are common worldwide and cause a wide range of signs
and symptoms. Nowadays in current diagnostics procedures older virological methods, such virus
isolation in a cell cultures and seroneutralisation assay, are replaced with molecular biology tests. The
aim of the study was development of real-time PCR assay for detection of human adenoviruses. DNA
isolated from MK2 cell line infected with nineteen different enterovirus strains was used for development of a qualitative real-time PCR assay using primers targeting a conserved region of the 5’UTR
region and a specific TaqMan® probe. The analytical sensitivity of real-time PCR assay was tested
using serial dilutions of Coxackie A9 cDNA in range between 100 and 10-8. For comparison typical
end-point detected RT-PCR for enterovirus detection with the same cDNA dilutions was made. The
Nr 3
Wykrywanie RNA enterowirusów metodą real- time PCR
253
sensitivity of novel method was about ten thousand-fold higher than older one. The conclusion is that
real-time PCR is very advisable in diagnostics of diseases caused with enteroviruses. The high level
of sensitivity, specificity, accuracy, and rapidity provided by this assay are favorable for the use in the
detection of enteroviral RNA in clinical specimens, especially from neuroinfections.
PIŚMIENNICTWO
1. Abzug MJ: The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the
really speculative. Adv Exp Med Biol; 2008; 609: 1-15.
2. Binduga-Gajewska I, Gut W, Wielkopolska A, Jarząbek Z: Zastosowanie metody RT-PCR i
nested-PCR do wykrywania zakażeń enterowi rusami. Med Dosw Mikrobiol; 1999; 51: 375-81.
3. Binduga-Gajewska I, Gut W, Jarząbek Z: Badanie wirusologiczne udziału enterowirusów niepoliomielitycznych w zakażeniach ośrodkowego układu nerwowego w Polsce w latach 1995-2000.
Przegl Epidemiol; 2003; 57: 631-7.
4. DeBiasi R, Tyler K: Molecular methods for diagnosis of viral encephalitis. Clin Microbiol Rev;
2004; 10: 903-25.
5. Gunkey C, Ozkaya E, Yapar M i inni: Laboratory diagnosis of enteroviral infections of the central
nervous system by using a nested RT-polymerase chain reaction (PCR) assay. Diagn Microbiol
Infect Dis; 2003; 47: 557-62.
6. Gunson RN, Collins TC, Carman WF: Practical experience of high throughput real time PCR in
the routine diagnostic virology setting. J Clin Virol; 2006; 35: 335-67.
7. Hyypiä T, Auvinen P, Maaronen M: Polymerase chain reaction for human picornaviruses, J Gen
Virol; 1989; 70: 3261-8.
8. Hyypiä T, Hovi T, Knowles NJ i inni: Classification of enteroviruses based on molecular and
biological properties. J Gen Virol; 1997; 78: 1-11.
9. Mackay IM, Arden KE, Nitsche A: Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res; 2002; 30:
1292-305.
10. Muir P, Kammerer U, Korn K i inni: Molecular typing of enteroviruses: current status and future
requirements. Clin Microbiol Rev; 1998; 11: 202-27.
11. Oberste MS, Maher K, Kilpatrick DR i inni: Molecular evolution of the human enteroviruses:
correlation of serotype with VP1 sequence and application to picornavirus classification. J Virol;
1999; 73: 1941-8.
12. Petitjean J, Vabret A, Dina J: Development and evaluation of a real-time RT-PCR assay on the
LightCycler for the rapid detection of enterovirus in cerebrospinal fluid specimens. J Clin Virol;
2006; 35: 278-84.
13. Rotbart HA, Hayden FG: Picornavirus infections: a primer for the practitioner. Arch Fam Med;
2000; 9: 913-20 .
14. Rotbart HA: Enteroviruses. W: Clinical virology. Red. DD Richman, RJ Whitley, FG Hayden,
ASM Press, Washington 2002, 971-94.
15. Sawyer MH: Enterovirus infections: diagnosis and treatment. Semin Pediatr Infect Dis; 2002;
13: 40-7.
16. Yang S, Rothman R: PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations, and future
applications in acute-care settings. Lancet Infect Dis; 2004; 4: 337-48.
Otrzymano: 22 VI 2010 r.
Adres Autora: 02-004 Warszawa, ul. Chałubińskiego 5,
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny
e-mail: [email protected]