535 nm/617 nm, nie przepuszczalny dla błon żywych komórek
advertisement
Fakultet: Cytometria – zastosowanie w badaniach biologicznych Wprowadzenie do cytometrii przepływowej: metody znakowania komórek Nadzieja Drela Zakład Immunologii WB UW [email protected] Przygotowanie komórek do znakowania 1. Zawiesina komórek (bez fragmentów tkanek, błon komórkowych, zlepionych komórek). Komórki z hodowli nieadherentnych i krwi obwodowej stwarzają najmniej problemów 2. Komórki z hodowli adherentnych (trawienie enzymatyczne). Trawienie receptorów, zmniejszenie ich ekspresji, zmniejszenie dostępności do epitopów 3. Izolowanie komórek z narządów metodami mechanicznymi, enzymatycznymi lub obiema jednocześnie 1. Próbki kliniczne – zwykle krew obwodowa, wymaga lizy erytrocytów (wodą, chlorkiem amonu, detergentem) 2. Antygeny powierzchniowe znakowane są na komórkach nieutrwalonych – standardowe procedury 3. Znakowanie wewnątrzkomórkowe wymaga utrwalania i permeabilizacji komórek. Brak jest standardowej procedury: a/ utrwalanie 70% etanolem w 4 st. C; b/ utrwalanie absolutnym metanolem w -80 st.C; c/ 1% formaldehyd w 4 st.C, następnie metanol w -20 st.C; d/ 1% formaldehyd w obecności detergentu (saponina) w 0-4 st.C, następnie metanol w -20 st.C (lub bez tego etapu) Zasady barwienia komórek Barwienie z użyciem przeciwciał sprzężonych z fluorochromami Barwienie z użyciem cząsteczek innych niż przeciwciała sprzężonych z fluorochromami Barwienie wolnymi barwnikami fluorescencyjnymi Zastosowanie przeciwciał w cytometrii przepływowej Schematyczna budowa przeciwciał Odpowiedź pierwotna i wtórna Zastosowanie przeciwciał wykorzystuje ich zdolność do wiązania antygenów: Podstawą jest reakcja Ag:Ab Antygeny występują w organizmach żywych powszechnie i służą do specyficznej identyfikacji komórek Przeciwciała poliklonalne Przeciwciała monoklonalne Porównanie surowicy poliklonalnej i przeciwciał monoklonalnych Surowica poliklonalna Ag Ag Przeciwciała monoklonalne Ag Rysunek :Ewa Kozłowska Porównanie surowicy poliklonalnej i przeciwciał monoklonalnych Przeciwciała poliklonalne są specyficzne dla wielu epitopów tego samego antygenu, zatem są heterogenne i utrudniają standaryzację znakowania i analizy Przeciwciała monoklonalne wiążą takie same epitopy, zatem można uzyskać powtarzalność znakowania Określanie fenotypu komórek immunofenotypowanie Identyfikacja komórek na podstawie znaczników/markerów powierzchniowych Do tego celu używamy Ab monoklonalnych przeciwko markerom różnicującym komórki analiza Znakowanie/inkubacja Znakowanie bezpośrednie Znakowanie pośrednie http://flowbook.denovosoftware.com/Flow_Book/Chapter_5%3A_Immunofluorescence_and_Colour_Compensation Który sygnał jest silniejszy? Jak wybieramy przeciwciała http://flowbook.denovosoftware.com/Flow_Book/Chapter_5%3A_Immunofluorescence_and_Colour_Compensation Która metoda jest lepsza? Znakowanie markerów powierzchniowych CD8 CD4 CD8 CD4 CD4 Która metoda jest lepsza? Fałszywe pozytywne wyniki Czy można stosować obie metody jednocześnie? 1. Inkubacja z nieznakowanym I rz. przeciwciałem. Płukanie 2. Inkubacja ze znakowanym II rz. Ab. Płukanie 3. Inkubacja z surowicą myszy (blokuje niewysycone miejsca II rz. przeciwciała) 4. Inkubacja ze znakowanym I rz. Ab. Płukanie 5. Analiza Przeciwciało/biotyna/awidyna 1. Biotyna, wit. H, wit. B7 2. Awidyna, białko obecne w jajach, wykazuje powinowactwo do biotyny, 1 cz. awidyny wiąże 4 cz. biotyny 3. Streptoawidyna, białko bakteryjne (Streptomyces avidinii), wiąże niekowalencyjnie biotynę Reakcja biotyna-awidyna; biotyna-streptoawidyna – specyficzna, nieodwracalna 1. Nieznakowane Ab I-rzędowe + Ab II-rzędowe sprzężone z fluorochromem 2. Ab I rz. + Ab II rz. Biotyna + streptawidyna/fluorochrom 3. Amplifikacja systemu 2 Wybór odpowiedniego stężenia przeciwciała http://flowbook.denovosoftware.com/Flow_Book/Chapter_5%3A_Immunofluorescence_and_Colour_Compensation 1. Zwykle rozcieńczamy Ab: szereg dwukrotnych rozcieńczeń np. 1:50, 1:100, 1:200 itd. 2. Inkubujemy komórki z takimi samymi rozcieńczeniami kontroli izotypowej 3. Chcemy oceniać ekspresję badanego markera – używamy stężenie saturujące 4. Chcemy ocenić obecność pozytywnych i negatywnych komórek – używamy mniejszego stężenia (przeważają względy finansowe) Kontrola izotypowa Rodzaj kontroli negatywnej wykluczający niespecyficzne wiązanie przeciwcial wynikające głównie z wiązania z receptorami Fc. Przykład: mysie przeciwciała IgG2a silnie wiązane są przez leukocyty człowieka. Znakowanie komórek z zastosowaniem cząsteczek innych niż Ab sprzężonych z fluorochromami Aneksyna V Białko komórkowe o słabo poznanej funkcji. Wykazuje powinowactwo do fosfatydyloseryny. http://www.google.pl/imgres?imgurl=http://www.biomol.de/dateien/infos_nr647.gif&imgrefurl=http://www.biomol. Oznaczanie komórek apoptotycznych Znakowanie wolnymi barwnikami fluorescencyjnymi Oznaczanie zawartości DNA DAPI, PI, 7-AAD bezpośrednio łączą się z DNA DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol) – UV, przenika przez błony żywych i utrwalonych komórek, 358 nm/461 nm PI – 535 nm/617 nm, nie przepuszczalny dla błon żywych komórek (w komórkach roślinnych znakuje ścianę komórkową) 7-AAD, (7-aminoactinomycin D), duże powinowactwo do regionów GC, nie przenika przez błony żywych komórek, 546 nm/647 nm Hoechst – bis-benzimidazole, przenika przez nienaruszone błony komórek, UV, 345 nm/ 485 nm Analiza cyklu komórkowego Analiza potencjału błonowego JC-1 (5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’ tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide) Ctrl ASM A R2 R2 R3 R3 R4 R4 -Hc R2 - 88.30% R3 - 7.51% R4 - 0.06% R2 - 77.65% * R3 - 17.60% * R4 - 0.07% B R2 R2 R3 R3 R4 R4 +Hc R2 - 76.16% # R3 - 13.81% # R4 - 6.21% # R2 - 60.27% * # ^ R3 - 29.18% * # ^ R4 - 7.19% # ^ Analiza potencjału błonowego Zastosowanie CFDA-SE do znakowania komórek Analiza proliferacji Analiza proliferacji G3 G3 G3 G3 G3 G2 G2 G1G1G2 G3 G3 G2 G1 G3 G2 G3 G2 G3 G3 G3 Ewa Kozłowska Jeszcze raz zastosowanie przeciwciał…..ale na nośniku Oznaczanie stężenia cytokin Wybór fluorochromów 1. Typ i liczba laserów i detektorów 2. Zestaw filtrów optycznych (filtry pasmowe zwiększają czułość detekcji fluorochromu, ale zwiększają ryzyko „spillover”) Wirtualne testowanie: Bdbiosciences.com.spectra Źródła światła i fluorochromy (Aria) Laser Fluorochromes Wavelength (nm) Min. Power Commonly Used (mW) Coherent® Sapphire™ Solid State 488 nm (blue) 13 FITC, PE, PE-TxRed, PE-Cy7, PerCP, PerCPCy5.5, PI JDS Uniphase™ HeNe Air Cooled 633 nm (red) 11 APC, APC-Cy7 Point Source 407 nm (violet) Violet Solid State (optional) http://www.bdbiosciences.com 10 Alexa Fluor®, Cascade blue, Pacific blue, DAPI, Hoeschst, AmCyan Układ optyczny: laser niebieski http://www.bdbiosciences.com Układ optyczny: czerwony i fioletowy http://www.bdbiosciences.com Wybór fluorochromu “Bright” = zapewniają dobrą czułość http://www.bdbiosciences.com http://www.bdbiosciences.com BD Biosciences Application Note “Bright” ale…minimalizacja „spillover” (spectral overlap, nakładanie spektrum emisji) Te dwie zasady często się wykluczają BD Biosciences Application Note http://www.bdbiosciences.com BD Biosciences Application Note http://www.bdbiosciences.com Przykład: CD8 bright/CD62L dim – CD62L PE/CD8 FITC FITC-PE PE-FITC Jeszcze jedna zasada doboru fluorochromów: Stosuj „bright” fluorochrom dla „dim” Ab Stosuj „dim” fluorochrom dla „bright” Ab ale……. Unikaj „spillover” silnie świecącej populacji do detektora wykrywającego słabo świecącą populację, czyli do detektora wykrywającego z dużą czułością. Fluorochromy tandemowe: APC-Cy7 PE-Cy7 Degradują pod wpływem światła, utrwalania (formaldehydem) i ogrzewania. Wówczas emitują fluorescencję w zakresie barwnika głównego (APC, PE), co skutkuje fałszywym wynikiem pozytywnym. Zatem: stosuj stabilne pochodne, używaj zalecanych buforów do utrwalania, przechowuj próby w ciemności i odpowiedniej temperaturze, zwykle 4 st. C. Zasady doboru fluorochromów do analizy wielokolorowej: 1. Wybieraj najsilniej świecące fluorochromy 2. Minimalizuj „spillover” 3. Stosuj silne fluorochromy do słabych przeciwciał i odwrotnie: słabe fluorochromy do silnych przeciwciał 4. Unikaj spillover silnie świecącej populacji do detektorów wykrywających słabo świecące populacje 5. Stosuj procedury zapobiegające degradacji fluorochromów tandemowych Spektra emisji fluorochromów: spillover http://www.bdbiosciences.com Spillover Najczęściej używane zestawy barwników BD Biosciences Application Note http://www.bdbiosciences.com Kompensacja A. Zła kompensacja B. Prawidłowa kompensacja C. Niedokompensowane D. Przekompensowane http://flowbook.denovosoftware.com/Flow_Book/Chapter_5%3A_Immunofluorescence_and_Colour_Compensation Kompensacja – kiedy jest nieprawidłowa? A. Zła kompensacja – spektra emisji fluorochromów na siebie zachodzą B. Prawidłowa kompensacja C. Niedokompensowane – za mało sygnału FITC odjęto z kanału PE D. Przekompensowane – za dużo sygnału FITC odjęto z kanału PE Spillover http://flowbook.denovosoftware.com/Flow_Book/Chapter_5%3A_Immunofluorescence_and_Colour_Compensation Kompensacja w praktyce Przykłady prawidłowej kompensacji Correct Compensation http://www.bdbiosciences.com Under Compensation Over Compensation Jakich markerów używamy do kompensacji? Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C). Use bright markers to setup proper compensation. http://www.bdbiosciences.com Barwniki tandemowe CD8 PE-Cy7 CD3 PE-Cy5 Time Sample Left in Light 0 hours PE (FL2) 2 hours 22.5 hours http://www.bdbiosciences.com Kompensacja konjugatów tandemowych jest charakterystyczna dla serii http://www.bdbiosciences.com Obraz zależny od kompensacji i rodzaju skali A. Zła kompensacja – spektra emisji fluorochromów na siebie zachodzą B. Prawidłowa kompensacja off-line C. Prawidłowa kompensacja – jak B, ale inna skala osi D. Prawidłowa kompensacja na skali bieksponencjalnej http://flowbook.denovosoftware.com/Flow_Book/Chapter_5%3A_Immunofluorescence_and_Colour_Compensation Kompensacja przy użyciu kulek kalibracyjnych http://www.bdbiosciences.com http://www.bdbiosciences.com/research/m ulticolor/spectrum_viewer/index.jsp Dziękuję za uwagę
