Sposób przygotowania podłoża do hodowli komórek limfocytów

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)159984
(13) B1
(21) Numer zgłoszenia:
280747
5( 1) IntCl5:
C12N 5/02
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(22)
Data zgłoszeniu:
24.07.1989
)Sposób przygotowania podłoża do hodowli komórek limfocytów ludzkich
4
(5
(73)
(43)
Zgłoszenie ogłoszono:
22.01.1 990 BUP 02/90
Uprawniony z patentu:
Wytwórnia Surowic i Szczepionek,
Lublin, PL
(72) Twórca wynalazku:
(45)
O udzieleniu patentu ogłoszono:
Henryk Lachowski, Lublin, PL
29.01.1993 WUP 01/93
PL 159984 B1
(57)
Sposób przygotowania podłoża do hodowli komórek limfocytów ludzkich, polegający na połączeniu
roztworów soli nieorganicznych, glukozy, czerwieni fenolowej oraz wodnych roztworów aminokwasów i
witamin, znamienny tym, że rozpuszcza się kolejno w wodzie najpierw chlorek sodu a następnie dodaje się
roztwór sporządzony z L-Tyrozyny, L-Cystyny i kwasu solnego, po czym w otrzymanym roztworze rozpuszcza
się chlorek potasu, siarczan magnezu, roztwór fosforanu sodu, glukozę 1 czerwień fenolową, następnie obniża
się pH otrzymanego roztworu poniżej wartości 5,8, po czym dodaje się roztwór azotanu wapnia oraz roztwór
witamin rozpuszczonych w wodzie o składzie: amid kwasu nikotynowego, pirydoksyna HCl, tiamna HCl,
pantotenian wapnia, chlorek choliny, i-Inozytol, kwas p-aminobenzoesowy, witamina B12, a następnie dodaje
się d-biotynę i kwas foliowy, po czym przygotowuje się oddzielnie roztwór ryboflawiny rozpuszczając ją w
0,01 mol. roztworze wodorotlenku sodu i dodaje się do roztworu podstawowego, następnie przygotowuje się
roztwór aminokwasów rozpuszczając oddzielnie kwas L-glutaminowy oraz L-asparaginowy w wodzie o
temperaturze 60°-70°C a potem studzi się do temperatury pokojowej i łączy się z roztworami wodnymi
aminokwasów o składzie: L-Arginina, L-Asparagina, L-Histydyna, L-Lizyna HCl, L- Tryptofan, L-Fenyloalanina, L-Metionina, L-Seryna, L-Treonina, L- Leucyna, L-Izoleucyna, L-Walina, L-Prolina, L-Hydroksyprolina,
glicyna, po czym otrzymany roztwór aminokwasów dodaje się do roztworu podstawowego, który następnie
rozcieńcza się wodą destylowaną i dodaje L-Glutaminę, glutation 1 wodorowęglan sodu.
Sposób przygotowania podłoża do hodowli
komórek limfocytów ludzkich
Zastrzeżenie
patentowe
Sposób przygotowania podłoża do hodowli komórek limfocytów ludzkich, polegający na
połączeniu roztworów soli nieorganicznych, glukozy, czerwieni fenolowej oraz wodnych roztworów aminokwasów i witamin, znamienny tym, że rozpuszcza się kolejno w wodzie najpierw
chlorek sodu a następnie dodaje się roztwór sporządzony z L-Tyrozyny, L-Cystyny i kwasu
solnego, po czym w otrzymanym roztworze rozpuszcza się chlorek potasu, siarczan magnezu,
roztwór fosforanu sodu, glukozę i czerwień fenolową, następnie obniża się pH otrzymanego
roztworu poniżej wartości 5,8, po czym dodaje się roztwór azotanu wapnia oraz roztwór witamin
rozpuszczonych w wodzie o składzie: amid kwasu nikotynowego, pirydoksyna HCl, tianina HCl,
pantotenian wapnia, chlorek choliny, i-Inozytol, kwas p-aminobenzoesowy, witamina B 12, a
następnie dodaje się d-biotynę i kwas foliowy, po czym przygotowuje się oddzielnie roztwór
ryboflawiny rozpuszczając ją w 0,01 mol. roztworze wodorotlenku sodu i dodaje się do roztworu
podstawowego, następnie przygotowuje się roztwór aminokwasów rozpuszczając oddzielnie
kwas L-glutaminowy oraz L-asparaginowy w wodzie o temperaturze 60°-70°C a potem studzi
się do temperatury pokojowej i łączy się z roztworami wodnymi aminokwasów o składzie:
L-Arginina, L-Asparagina, L-Histydyna, L-Lizyna HCl, L- Tryptofan, L-Fenyloalanina, L-Metionina, L-Seryna, L-Treonina, L- Leucyna, L-Izoleucyna, L-Walina, L-Prolina, L-Hydroksyprolina, glicyna, po czym otrzymany roztwór aminokwasów dodaje się do roztworu
podstawowego, który następnie rozcieńcza się wodą destylowaną i dodaje L-Glutaminę, glutation i wodorowęglan sodu.
*
*
*
Przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowania podłoża do hodowli komórek limfocytów ludzkich tj. podłoża R P M I 1640.
Znany jest z opisu patentu amerykańskiego nr 4 533 637 podłoże do hodowli składające
się z kwasów tłuszczowych i witamin lipofilicznych połączonych z cyklodekstryną. Znany jest
również sposób przygotowania podłoży do hodowli komórek polegający na łączeniu roztworów
soli nieorganicznych, glukozy, czerwieni fenolowej oraz wodnych roztworów aminokwasów i
witamin. Jednak znanym sposobem nie można przygotować podłoża do hodowli komórek
limfocytów ludzkich gdyż w momencie dodania do roztworu podstawowego azotanu wapnia
wytrąca się nierozpuszczalny osad, co prowadzi do dyskwalifikacji skoncentrowanego roztworu
RPMI 1640. Wadą tego sposobu jest również trudna rozpuszczalność ryboflawiny w wodzie co
prowadzi do otrzymania podłoża uboższego, nie posiadającego pełnej, wymaganej ilości tej
witaminy w podłożu.
Nieoczekiwanie okazało się, że połączenie roztworów zawierających sole nieorganiczne,
glukozę i sól dwusodową czerwieni fenolowej przy obniżeniu wartości pH tego roztworu poniżej
5,8 pozwala na dodanie do niego azotanu wapnia, który w tych warunkach nie powoduje
wytrącania się osadu, dyskwalifikującego otrzymanie podłoża do hodowli komórek limfocytów
ludzkich.
Istotą sposobu przygotowania podłoża do hodowli komórek limfocytów ludzkich według
wynalazku jest to, że rozpuszcza się kolejno w wodzie najpierw chlorek sodu, następnie roztwór
sporządzony z L-Tyrazyny, L-Cystyny, i kwasu solnego , po czym w otrzymanym roztworze
rozpuszcza się chlorek potasu, siarczan magnezu, roztwór fosforanu sodu, glukozę i czerwień
fenolową a następnie obniża się pH otrzymanego roztworu poniżej wartości 5,8.
159 984
3
Do otrzymanego roztworu dodaje się następnie roztwór azotanu wapnia oraz roztwór
witamin rozpuszczonych w wodzie o składzie: amid kwasu nikotynowego, pirydoksyna HCl,
tianina HCl, pantotenian wapnia, chlorek choliny, i-Inozytol, kwas p- aminobenzoesowy,
witaminaB12, po czym dodaje się d-biotynę i kwas foliowy. Oddzielnie przygotowuje się roztwór
ryboflawiny rozpuszczając ją w 0,01 mol. roztworze wodorotlenku sodu i dodając do roztworu
podstawowego. Oddzielnie również przygotowuje się roztwór wodny aminokwasów rozpuszczając najpierw kwas L- glutaminowy oraz oddzielnie kwas asparaginowy w wodzie o temperaturze 60°-70°C a potem studzi się do temperatury pokojowej i łączy się z roztworami wodnymi
aminokwasów o składzie: D- Arginina, L-Asparagina, L-Histydyna, L-Lizyna HCl, L-Tryptofan,
L-Fenyloalanina, L-Metionina, L-Seryna, L-Tresnina, L-Leucyna, L- Izoleucyna, L-Walina,
L-Prolina, L-Hydroksyprolina i glicyna. Otrzymany roztwór aminokwasów dodaje do roztworu
podstawowego, który następnie rozcieńcza się wodą destylowaną i dodaje L- Glutaminę,
glutation i wodorowęglan sodu.
Zaletą tego sposobu jest możliwość przygotowania podłoża do hodowli komórek limfocytów ludzkich nie dopuszczając do wytworzenia się nierozpuszczalnego osadu dyskwalifikującego skoncentrowanie podłoża R PM I 1640. Zaletą jest również otrzymanie sposobem według
wynalazku bogatszego i lepszego jakościowo podłoża posiadającego pełną, wymaganą ilość
witamin.
Przedmiot wynalazku przedstawiony jest w przykładzie wykonania.
P r z y k ł a d . W 11. wody rozpuszcza się 600g chlorku sodu a następnie roztwór otrzymany
z 2 g L-Tyrozyny oraz 5,9 g L-Cystyny w 1 mol. kwasie solnym. Do otrzymanego roztworu
dodaje się 40 g chlorku potasu oraz 10 g siarczanu magnezu, 202 g fosforanu 2- sodowego oraz
200 g glukozy i 0,5 g czerwieni fenolowej. Następnie dodaje się do roztworu kwas solny do
otrzymania pH poniżej 5,8 oraz 10 g azotanu wapnia. Po czym do roztworu podstawowego
dodaje się roztwór wodny witamin o następującym składzie:
Amid kwasu nikotynowego - 0,1 g,
Pirydoksyna HCl
- 0,1 g,
Tianina HCl
- 0,1 g,
Pantotenian wapnia
- 0,025 g,
Chlorek choliny
- 0,3 g,
i-Inozytol
- 3,5 g,
Kwas p-aminobenzoesowy - 0 , 1 g,
Witamina B 12
- 0,0005 g.
Następnie do roztworu dodaje się 0,02 g d-Biotyny oraz 0,1 g kwasu foliowego. Po czym
przygotowuje się oddzielnie roztwór ryboflawiny - 0,02 g rozpuszczając ją w 0,01 mol. roztworze
wodorotlenku i dodaje do roztworu podstawowego. Roztwór aminokwasów przygotowuje się
rozpuszczając oddzielnie 2 g L- glutaminowego oraz 2 g kwasu L-asparaginowego w wodzie o
temperaturze 65°C a potem studzi do temperatury pokojowej i łączy się z roztworami wodnymi
aminokwasów o składzie:
L-Arginina
- 20 g
L-Asparagina
-5 g
L-Histydyna
L-Lizyna HCl
- 1,5 g
-4g
L-Triptofan
- 0,5 g
L-Fenyloalanina
- 1,5 g
L-Metionina
L-Seryna
- 1,5 g
- 3,0 g
L-Treonina
- 2,0 g
L-Leucyna
- 5,0 g
L-Izoleucyna
- 5,0 g
L-Walina
- 2,0 g
Kwas L-glutaminowy - 2,0 g
Kwas L-asparaginowy - 2,0 g
L-Prolina
L-Hydroksyprolina
- 2,0 g
- 2,0 g
Glicyna
- 1,0 g.
Otrzymany roztwór aminokwasów dodaje się do roztworu podstawowego i rozcieńcza
wodą destylowaną a następnie dodaje 30 g L-glutaminy oraz 0,1 g glutationu i 200 g wodorowęglanu sodu. W powyższy sposób otrzymano 101. podłoża o 10-krotnym stężeniu.
159 984
Zakład Wydawnictw UPRP. Nakład 90 egz.
Cena 10 000 zł