TEST
advertisement
ĆWICZENIE 3 CHARAKTERYSTYKA BAKTERII – MORFOLOGIA I BARWIENIE GRAMA. ZASADY DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ Uwaga: Ze względu na laboratoryjny charakter zajęć oraz kontakt z materiałem biologicznym, studenci zobowiązani są używać fartuchów i rękawiczek jednorazowych. Diagnostykę mikrobiologiczną określamy jako zespół czynności mających na celu identyfikację drobnoustrojów (ustalenie przynależności gatunkowej), występujących w badanym materiale mikrobiologicznym. Badania te obejmują czynności wstępne oraz badania właściwe. Do czynności wstępnych zaliczamy m.in. obserwację preparatu mikroskopowego (przeżyciowego lub utrwalonego). Badania właściwie obejmują: wyosobnienie interesujących nas drobnoustrojów z badanego materiału; uzyskanie hodowli czystych tych drobnoustrojów; określenie ich cech morfologicznych (morfologia makro- i mikroskopowa); zbadanie właściwości fizjologicznych i biochemicznych wyizolowanych drobnoustrojów; badanie właściwości hemolitycznych i biologicznych, testy serologiczne, typowanie fagowe, oznaczanie wrażliwości na antybiotyki zidentyfikowanych drobnoustrojów; IDENTYFIKACJA BAKTERII Klasyfikacja bakterii w celach diagnostycznych polega na ustaleniu szeregu fenotypowych właściwości wyizolowanego szczepu i porównaniu ich z cechami szczepu wzorcowego. Dla charakterystyki szczepu wzorcowego dokonuje się zwykle oceny od 100 do 150 różnych cech, ustalanych na podstawie wyników wystandaryzowanych testów. Ponieważ szczepy mogą tracić pewne cechy w warunkach sztucznej hodowli i podczas ich przechowywania, do testów identyfikacyjnych należy wykorzystywać tylko świeżo wyizolowane klony. Proces identyfikacji bakterii rozpoczyna się od stwierdzenia ich wzrostu na podłożu hodowlanym. W badaniach diagnostycznych wymagane jest zastosowanie metod umożliwiających uzyskanie czystych hodowli wyprowadzanych z pojedynczych kolonii. Pojawiające się na płytkach kolonie można poddać następnie różnorodnym testom. Do wstępnych badań bakterii należy barwienie Grama oraz poznanie ich morfologii. MORFOLOGIA KOLONII Kolonie bakteryjne badamy po ich posiewie i hodowli na podłożu agarowym. Sprawdza się: wielkość kolonii – duże, średnie, małe, drobne lub podaje się średnic w mm; typ wzrostu kolonii na podłożu – powierzchniowy, podpowierzchniowy; wgłębny; kształt kolonii – okrągła, okrągła z pomarszczonym brzegiem, okrągła wałem brzeżnym, rozgałęziona, soczewkowata, nitkowata, strzępiasta, amebowata, korzonkowata, pofałdowana, nieregularna, koncentryczna, złożona; powierzchnię kolonii – gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona, pofałdowana, krzaczkowata; brzeg kolonii – gładki, falisty, ząbkowany, z wyżłobieniami, rozgałęziony, nitkowaty; szczyt kolonii (wzniesienie kolonii) – kolonia płaska, lekko wypukła, wzniesiona; przejrzystość kolonii i jej otoczenia – przejrzysta, półprzejrzysta, opalizująca, nieprzejrzysta, występowanie lub brak fluorescencji; barwa kolonii i jej otoczenia – podaje się rodzaj zabarwienia lub jego brak, ewentualnie stwierdza się, czy barwnik dyfunduje do podłoża; konsystencję kolonii – sprawdza się za pomocą ezy – sucha, krucha, ziarnista, skórzasta, ciągnąca się, mazista, śluzowata; TECHNIKA SPORZĄDZANIA PREPARATÓW MIKROSKOPOWYCH Wstępnych obserwacji mikroskopowych i badań nad morfologią bakterii dokonujemy używając zwykłego mikroskopu świetlnego. Wobec bardzo małych rozmiarów bakterii stosujemy obiektywy imersyjne o dużych powiększeniach (40-100) i wysokiej zdolności rozdzielczej. Preparat sporządzamy na szkiełku podstawowym w postaci tak zwanego rozmazu, nanosząc na powierzchnię czystego i odtłuszczonego szkiełka kroplę badanego płynu lub zawiesiny badanych drobnoustrojów i rozprowadzając płyn po powierzchni. Preparat następnie suszy się i utrwala. Utrwalanie polega na ogrzaniu wysuszonego rozmazu nad płomieniem gazowym (palnikiem spirytusowym). Przy dokładniejszych badaniach cytologicznych stosuje się utrwalanie metanolem, etanolem albo utrwalaczami stosowanymi w cytologii roślin i zwierząt. Niekiedy pożądana jest obserwacja żywych bakterii. Daje to możliwość oglądania ruchu, wzrostu i podziału bakterii oraz umożliwia obserwację komórek nie zmienionych przez zabiegi utrwalania i barwienia. W takim przypadku posługujemy się preparatem przeżyciowym (wilgotnym) zwykłym otrzymanym przez przykrycie kropli zawierającego bakterie płynu cienkim szkiełkiem przykrywkowym. Można przygotować również preparat przeżyciowy w postaci kropli wiszącej. BARWNIKI I TEORIA BARWIENIA Celem barwienia jest uwidacznianie całej komórki i (lub) szczegółów jej budowy oraz rozpoznanie w celach diagnostycznych. Bakterie, poza nielicznymi wyjątkami, są bezbarwne a gęstość optyczna ich cytoplazmy różni się tylko nieznacznie od gęstości optycznej wody, dlatego też przed obserwacją bakterie barwimy. Do barwienia drobnoustrojów stosuje się barwniki zasadowe (błękit metylenowy, fuksyna zasadowa, fiolet krystaliczny), gdyż bakterie zawierają wiele kwasów nukleinowych i struktur powierzchniowych bogatych w grupy kwasowe, które nie barwią się barwnikami kwaśnymi. Rodzaje barwień: pozytywne (barwimy komórkę) negatywne (barwimy tło) o proste (stosujemy jeden barwnik) o złożone (stosuje się więcej rodzajów barwników, bejce, odbarwiacze) - bejce (zaprawy) – substancje ułatwiające barwienie przez wzmocnienie działania barwników, bądź przez pokrycie barwionej struktury warstwą wrażliwą na działanie barwnika, np. tanina w barwieniu ściany komórkowej i rzęsek, płyn Lugola w barwieniu Grama; - odbarwiacze – substancje pozwalające na uwidocznienie pewnych bakterii lub pewnych szczegółów ich budowy dzięki odbawieniu innych bakterii lub ich części, np. alkohol etylowy w metodzie Grama, etanol z domieszką kwasu solnego w metodzie Ziel-Neelsena. METODA BARWIENIA GRAMA Metoda Grama barwienia bakterii została opracowana w 1884 roku przez duńczyka, Hansa Christiana Grama. Pozwala ona zróżnicować te organizmy na dwie duże grupy: gram-dodatnie i gram ujemne ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej oraz, co za tym idzie, także pewne różnice w fizjologii. Bakterie są barwione fioletem krystalicznym a następnie utrwalane stabilizowanym płynem Lugola, który powoduje związanie barwnika w bakteriach gram-dodatnich. Odbarwiające działanie alkoholu etylowego usuwa fiolet z komórek bakterii gram-ujemnych. Roztwór fuksyny zasadowej (lub safraniny) użyty jako barwnik kontrastowy zabarwia bakterie gram-ujemne na kolor różowy, natomiast bakterie gram-dodatnie pozostają fioletowe. NAJCZĘŚCIEJ STOSOWANE BIOCHEMICZNE TESTY IDENTYFIKACYJNE Fermentacja glukozy i laktozy - podłoże Kliglera Zawiera pepton, laktozę, glukozę, siarczan żelazawy oraz wskaźnik – czerwień fenolową. Podłoże to służy do badania zdolności fermentowania laktozy lub glukozy, z wytwarzaniem lub nie, gazu oraz wydzielania siarkowodoru. Podłoże to (skosy agarowe) jest uformowane tak, że dolna jego część stanowi słupek, górna zaś skos. Obydwie części posiewa się, a po 24 godzinach inkubacji obserwować można następujące zmiany: - zażółcenie całego podłoża – rozkład glukozy i laktozy, - brak zmiany barwy podłoża – brak rozkładu cukrów, - czerwony skos, żółty słupek – rozkład glukozy, brak fermentacji laktozy, - zaczernienie podłoża - wytwarzanie H2S, - porozrywanie podłoża przez pęcherzyki gazu – gazowanie, Drobnoustroje wykorzystujące glukozę zakwaszają podłoże w pierwszych godzinach hodowli. Jeżeli mogą fermentować laktozę, wykorzystują ja w drugiej kolejności – podłoże przyjmuje barwę żółtą. Jeżeli bakterie nie mogą korzystać z laktozy, rozkładają aminokwasy zawarte w peptonie alkalizując środowisko – podłoże przyjmuje barwę czerwoną. Powstały w hodowli siarkowodór reaguje z jonami Fe2+ dając siarczek żelaza, który zaczernia podłoże. Rys.1. Podłoże Kliglera. Próbówki: [1] podłoże bez inokulacji, [2,3] fermentacja glukozy i laktozy, [4,5] fermentacja glukozy i obecność H2S Test na indol – bulion tryptofanowy Bakterie syntezujące enzym tryptofanazę rozkładają tryptofan z wytworzeniem indolu. Obecnośc indolu sprawdzamy w hodowli bakterii na podłożu z DL-tryptofanem, posługując się metodą Ehrlicha. W tej metodzie do hodowli szczepu dodaje się eteru etylowego i wytrząsa. Obecny w hodowli indol zostaje wyekstrahowany przez eter, który tworzy warstwę na powierzchni hodowli. Po dodaniu odczynnika Ehrlicha (zawierający alkoholowy roztwór pdwumetyloaminobenzaldehydu i stężony kwas solny), powstaje intensywnie czerwony pierścień na granicy warstwy eterowej i hodowli. Rys.2. Test na indol Test na obecność dekarboksylaz Produkowane przez bakterie enzymy powodujące dekarboksylacje aminokwasów: argininy, lizyny, ornityny powodują powstanie zasadowych amin (agmatyny, kadaweryny, putrescyny). Wzrost pH powoduje zmianę barwy wskaźnika czerwieni fenolowej z żółtej na czerwoną. Test na wykrywanie ureazy – podłoże Christensena Mocznik jest wykrywany przez bakterie syntezujące ureazę. Produktami końcowymi tego rozkładu są NH3 i CO2. Podłoże Christensena (barwa wyjściowa podłoża jest jasnożółta) zawiera mocznik jako jedyne źródło azotu i indykator – czerwień krezolową. Amoniak uwalniany podczas wzrostu bakterii silnie alkalizuje pożywkę, powodując zmianę jej barwy na fioletową. Rys.3. Test na mocznik Test cytrynianowy – podłoże Simmonsa Podłoże to służy do różnicowania bakterii wg ich zdolności do asymilowania cytrynianu jako jedynego źródła węgla w podłożu. Podłoże przygotowuje się w postaci skosów agarowych. Jego wykorzystanie powoduje zmianę pH sygnalizowaną zmianą zabarwienia indykatora (błękitu bromotymolowego) z zielonej na niebieską. Rys.4. Test cytrynianowy TEST API Testy API są wystandaryzowanymi zestawami, które stosuje się do identyfikacji różnych grup, rodzajów i gatunków bakterii (paciorkowców – Streptococcus sp. , gronkowców – Staphylococcus sp., bakterii z rodziny Enterobacteriaceae oraz innych najbardziej powszechnych drobnoustrojów). Metoda ta stanowi jedną z najbardziej uniwersalnych metod identyfikacji bakterii. W skład zestawu do identyfikacji wchodzą: pasek API – składający się z 20 mikroprobówek zawierających odwodnione substraty. Mikroprobówki te napełniane są zawiesiną bakteryjną. Procesy metaboliczne podczas zachodzące inkubacji powodują zmianę koloru mikroprobówek, które są albo spontaniczne lub wywołane przez dodanie odczynników komora inkubacyjna karta wyniku książka kodów Do testów API należy używać tylko czyste, pojedyncze, dobrze wyizolowane kolonie, namnożone wcześniej na odpowiednich dla danego drobnoustroju podłożach (zaleca się używanie młodych hodowli 18-24-godzinnych. Odczyt: Zmiany barwy zawartości probówek umożliwiają określenie, jakie substraty są rozkładane, czy też, jaki rodzaj aktywności enzymatycznej występuje. Określenie grupy lub gatunku dokonuje się na podstawie załączonego przez producenta klucza diagnostycznego (tabela nr 2). Interpretacje wyników otrzymuje się z profilu numerycznego. Na karcie wyników testu podzielone są na grupy po 3, każdy odpowiednio o wartości 1,2 lub 4. Przez dodanie do siebie wartości odpowiadających pozytywnym reakcjom w obrębie każdej grupy otrzymuje się 7 cyfrowy profil numeryczny dla dwudziestu testów występujących na pasku API 20E (służy do identyfikacji Enterobacteriaceceae i innych pałeczek Gram-ujemnych). Identyfikację otrzymuje się używając bazy danych z Książki Kodów. Rys.5. Test API 20E dla szczepów: 8030, 8068, 8P14 Tab.1. Tabela odczytów testu API 20E TEST ONPG AKTYWNE SKŁADNIKI 2-nitrofenylo-ßdgalaktopiranozyd STĘŻENIE (mg/probówka) REAKCJE/ENZYMY 0,223 ß-galaktozydaza ADH L-arginina 1,9 Dihydrolaza argininy LDC L-lizyna 1,9 Dekarboksylaza lizany ODC L-ornityna 1,9 Dekarboksylaza ornityny 0,756 Wykorzystanie cytrynianu 0,075 Wytwarzanie H2S CIT H 2S cytrynian trisodowy tiosiarczan sodowy URE mocznik 0,76 Ureaza TDA IND L-tryptofan L-tryptofan pirogroniam sodu 0,38 0,19 Dezaminaza tryptofanu Wytwarzanie indolu 1,9 Wytwarzanie acetoiny GEL Żelatyna 0,6 Żelatynaza GLU G-glukoza 1,9 Fermentacja glukozy MAN D-mannitol 1,9 Fermentacja mannitolu INO inozytol 1,9 Fermentacja inozytolu SOR D-sorbitol 1,9 Fermentacja sorbitolu RHA L-ramnoza 1,9 Fermentacja ramnozy SAC D-sacharoza 1,9 Fermentacja sacharozy MEL D-melibioza 1,9 Fermentacja melibiozy AMY amigdalina 0,57 Fermentacja amigdaliny ARA L-arabinoza 1,9 Fermentacja arabinozy VP OX Test na oksydazę Oksydaza cytochromowa WYNIKI NEGATYWNY bezbarwny żółty żółty żółty jasno szary/żółty bezbarwny/szary żółty żółty bezbarwny bezbarwny brak dyfuzji niebieski/ niebieskozielony niebieski/ niebieskozielony niebieski/ niebieskozielony niebieski/ niebieskozielony niebieski/ niebieskozielony niebieski/ niebieskozielony niebieski/ niebieskozielony niebieski/ niebieskozielony niebieski/ niebieskozielony POZYTYWNY żółty czerwony/ pomarańczowy czerwony/ pomarańczowy czerwony/ pomarańczowy niebieski/ niebiesko-zielony czarny osad czerwony/ pomarańczowy czerwono-brązowy różowy różowo-czerwony dyfuzja czarnego pigmentu żółty żółty żółty żółty żółty żółty żółty żółty żółty CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Wykonujemy i barwimy metodą Grama po jednym preparacie ze wskazanych przez prowadzącego czystych hodowli. Oglądamy WSZYSTKIE dostępne na ćwiczeniach preparaty. Oglądanie i porównywanie gotowych hodowli bakteryjnych. Escherichia coli, Klebsiella sp., Proteus sp., Salmonella sp., Enterococcus sp., Staphylococcus aureus, Pseudomonas sp., Micrococcus sp. – na różnych podłożach stałych i na szeregach oraz odczyt testów API. Barwienie metodą Grama Skład zestawu COLOR GRAM 2 – F R1 – roztwór szczawianu fioletu krystalicznego (jest szkodliwy!) w alkoholu etylowym; R2 – stabilizowany płyn Lugola (PVP) R3 – odbarwiacz (alkohol etylowy/aceton, 1:1) R4 – roztwór safraniny w alkoholu etylowym SPOSÓB WYKONANIA OZNACZENIA Przygotowanie i utrwalenie preparatu: Nanieść bakterie na szkiełko podstawowe. W przypadku wykonywania preparatu z hodowli płynnej wystarczy nanieść na szkiełko kroplę hodowli lub pobrać odrobinę bakterii jałową ezą, (czyli wyżarzoną w płomieniu palnika) i rozprowadzić zawiesinę na powierzchni szkiełka. W przypadku wykonywania preparatu z bakterii wyrosłych na podłożach stałych należy materiał pobrać jałową ezą, następnie zawiesić bakterie w kropli soli fizjologicznej naniesionej na szkiełko podstawowe. Zbiegi te mają na celu przygotowanie bakterii w postaci niezbyt gęstej zawiesiny. Po wysuszeniu utrwalić preparat przez przeciągnięcie szkiełka podstawowego nad płomieniem palnika. Należy uważać, żeby nie trwało to zbyt długo i żeby bakterii nie przypalić! Barwienie: Na utrwalone bakterie nakropić fiolet krystaliczny w ten sposób by pokrył on powierzchnię, na którą naniesiono bakterie. Barwnik pozostawić na 2 minuty. Po tym czasie zmyć fiolet wodą ` Nanieść płyn Lugola na 2 minuty. Po tym czasie zmyć fiolet wodą Spłukać obficie najpierw alkoholem etylowym, a później wodą Nanieść na preparat roztwór fuksyny zasadowej (lub safraniny) na 1 minutę. Po tym czasie spłukać szkiełko wodą i wysuszyć preparat. Przed umieszczeniem na stoliku mikroskopu nanieść na szkiełko kroplę olejku imersyjnego. Oglądać używając obiektywu dającego stukrotne powiększenie. Odczyt i interpretacja: Bakterie określane jako: Gram (+) barwią się na kolor niebiesko-fioletowy, Gram (-) barwią się na czerwono-różowy. GRAM + Actinomyces Bacillus * GRAM Acinetobacter Bifidobacterium Branhamella Clostridium * Brucella Corynebacterium * Campylobacter Enterobacter Citrobacter Enterococcus Escherichia Gaffkya Flavobacterium Lactobacillus Francisella Lactococcus Gardnerella * Listeria Haemophilus Micrococcus Helicobacter Nocardia Klebsiella Propionibacterium * Legionella Sarcina Moraxella Staphylococcus Neisseria Streptococcus Pasteurella Streptomyces Photobacterium Bordetella Proteus * Gram-zmienne Pseudomonas Mycobacterium Rhodospirillum Salmonella Serratia Shigella Vibrio Yersinia Borrelia Coxiella Rickettsia Treponema PODZIAŁ BAKTERII Ziarniaki Gram-dodatnie Staphylococcus sp. Kuliste ziarniaki, które w preparatach mikroskopowych układają się w postaci nieregularnych skupień przypominających winne grona (z jęz. greckiego staphyle – grono). Nie mają rzęsek, są niezdolne do ruchu i nie wytwarzają zarodników. Podłożem wybiórczo-różnicującym służącym do izolacji gronkowców jest podłoże Chapmana (rys.6). Czynnikiem selekcji halofilnych szczepów gronkowców jest dodatek NaCl. Charakterystyczna dla Staphylococcus aureus zdolność do wykorzystania mannitolu zawartego w podłożu jest sygnalizowana zmianą barwy indykatora (czerwień fenolowa) na kolor żółty. Rys.6. Podłoże Chapmana Gronkowce występują powszechnie w środowisku naturalnym: w glebie, w wodzie i w ściekach. Bytują na skórze i błonach śluzowych człowieka i zwierząt. Wśród szczepów kolonizujących organizm człowieka można zauważyć pewne tendencje do wyboru określonego jego części, np. S.capitis i S.aurcicularis występują w rejonie głowy i uszu, podczas gdy S.aureus bytuje głównie w jamie nosa, a S.epidermidis (zwykle niechorobotwórczy szczep z flory naturalnej organizmu lub z jego bezpośredniego otoczenia, który może przedostać się do wnętrza organizmu w trakcie różnorodnych zabiegów medycznych (implantacja bioprotez) i S.homminis w okolicach pach i pachwin. Spośród wielu gatunków zdolnych do kolonizacji ludzkiego organizmu Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty, rys.7) skupia większość chorobotwórczych dla człowieka szczepów. Do najważniejszych czynników zjadliwości gronkowca złocistego należą: Alfa-hemolizyna silna egzotoksyna białkowa powodująca lizę erytrocytów, niszczenie leukocytów i uszkodzenia płytek krwi. Toksyna zespołu wstrząsu toksycznego egzotoksyna o szerokim spektrum biologicznej aktywności. Indukuje wytwarzanie przez makrofagi interleukiny 1 (IL1), oraz czynnika nekrotyzującego nowotwory (TNF). Typowe dla skażeń S.aureus są choroby skórne (ropnie, czyraki, trądzik, zakażenia przyranne), zakażenia dróg oddechowych (nieżyty i zapalenia gardła, zatok nosa, ucha środowego, oskrzeli i płuc), zakażenia narządów wewnętrznych (zapalenie jelit, dróg moczowych, szpiku), toksemie i zapalenia pokarmowe. Głównym rezerwuarem i źródłem zakażenia gronkowcami jest bezobjawowy nosiciel i człowiek już chory. Na przynależność wyizolowanych szczepów wskazują następujące cechy: hemoliza typu beta, synteza pigmentu i zdolność do fermentacji mannitolu. Rys.7. Staphylococcus aureus Streptococcus Kuliste lub owalne ziarniaki, których komórki wykazują tendencje do układania się w krótsze lub dłuższe łańcuszki – stąd nazwa polska „paciorkowce”. Streptococcus wchodzą w skład fizjologicznej mikroflory ludzi i zwierząt, u których zasiedlają głównie błony śluzowe układu oddechowego w pewnym stopniu też przewodu pokarmowego. Wśród gatunków komensalnych mogą też występować chorobotwórcze dla człowieka, jak S.pyogenes, S.agalactiae i S.pneumoniae. Do namnożenia wyizolowanych szczepów i wykazania ich zdolności do hemolizy (alfa lub beta) stosuje się agar odżywczy zawierający odwłóknioną owczą krew. Staphylococcus pyogenes jest silnie chorobotwórczą bakterią beta - hemolityczną (rys.8) (wzrost na podłożu agarowym z krwią powoduje całkowity rozkład erytrocytów w postaci strefy wyraźnego przejaśnienia wokół kolonii, brak erytrocytów w obrębie strefy hemolizy). Rys.8. Beta - hemoliza Wśród chorób wywoływanych przez tą bakterie można wymienić: różę (wrotami zakażenia jest skóra lub błony śluzowe, a charakterystycznym objawem zakażenia jest powstanie czerwono zabarwionego nacieku), paciorkowego zapalenia gardła (angina), płonicę (dawniej szkarlatynę), zapalenie dróg moczowych. Streptococcus agalactiae tworzy na agarze z krwią słabiej widoczną strefę betahemolizy, która w przypadku niektórych szczepów może w ogóle nie występować. Paciorkowce te mogą być przyczyną zapalenia płuc u dzieci w pierwszych dwóch miesiącach życia, mogą powodować nieżyty gardła u dzieci i dorosłych, ropne zakażenia u kobiet, na przykład w wyniku zabiegów ginekologicznych, a także gorączkę połogową, występującą w postaci groźnej dla życia posocznicy w wyniku zakażenia w trakcie porodu. Nazwa gatunkowa „agalactiae” wskazuje, że może też być przyczyną zapalenia wymion u bydła, pasteryzacja mleka wyeliminowała możliwość przekazu tych bakterii na ludzi. Staphylococcus pneumoniae należy do grupy alfa-hemolitycznych (rys.9), (dawniej określane jako grupa paciorkowców zieleniejących) pneumokoków, tworzących dwoinki otoczone grubą polisacharydową otoczką. Cechą charakterystyczną w trakcie diagnostycznej identyfikacji gatunku jest wzrost na agarze z krwią w postaci drobnych otoczonych strefą alfa hemolizy koloni (niecałkowity rozkład erytrocytów, strefa hemolizy mało przejrzysta i słabo odgraniczona, w obrębie strefy hemolizy pod mikroskopem widoczne są erytrocyty, charakterystyczne zazielenienie podłoża) Rys.9. Alfa - hemoliza S. pneumoniae (rys.10) są odpowiedzialne za prawie 80% wszystkich bakteryjnych zapaleń płuc. W normalnej populacji 40-70% ludzi to przejściowi nosiciele. Zjawisko to w zestawieniu z częstością występowania choroby świadczy o istnieniu jednak znacznej naturalnej odporności przeciwko pneumokokom. Szczepy S.pneumoniae są odpowiedzialne za prawie 50% stwierdzanych u dzieci bakteryjnych zapaleń zatok i uszu, a ze względu na właściwości inwazyjne powodowane przez nie zakażenia mogą prowadzić do rozwoju bakteremii, przechodzącej często w groźne dla życia zakażenie opon mózgowo rdzeniowych. Rys.10. Streptococcus pneumoniae Enterococcus sp. Te gram-dodatnie paciorkowce fekalne stanowią naturalną florę przewodu pokarmowego człowieka i zwierząt, mogą jednak kolonizować nosogardziel, pochwę i okolice krocza. Najczęściej izolowanym gatunkiem jest Enterococcus faecalis. Może on być przyczyną zakażeń dróg moczowych, zapalenia otrzewnej. Micrococcus sp. Gram-dodatnie ziarniaki (rys.11) o komórkach zwykle większych od komórek gronkowców i często układających się w regularne skupienia w preparatach mikroskopowych. Mogą być przyczyną zakażeń u osób z obniżoną odpornością. Rys.11. Micrococcus sp. Pałeczki Gram-dodatnie Clostridium sp. To Gram-dodatnie ściśle beztlenowe, endosporotwórcze pałeczki (rys.12). W postaci przetrwalnikowej bytują powszechnie w glebie, rezerwuarem niektórych gatunków jest przewód pokarmowy kręgowców. Są ważną przyczyną psucia się produktów spożywczych – mięsa, jarzyn i serów. Chorobotwórcze dla człowieka gatunki to: C. perfringens przyczyna zgorzeli gazowej (gangrena). Za większość zakażeń u człowieka odpowiedzialny jest typ A, który występuje najczęściej w jelitach i glebie. Najważniejszą z produkowanych toksyn jest alfa-toksyna –fosfolipaza C, która hydrolizuje lecytynę i sfingomielinę, a ponadto powoduje uszkodzenia błony komórkowej różnych komórek np. erytrocytów, leukocytów i miocytów. C. tetani przyczyna tężca. Bytują w formie wegetatywnej w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt zwłaszcza koni. Rezerwuarem endospor jest nawożona gleba. Endospory powstają w biegunowej części komórki, co określa się mianem „pałeczki dobosza”. Syntetyzuje tetanospazminę, czyli neurotoksynę egzotoksyczną. Bytujące w przewodzie pokarmowym laseczki tężca nie powodują żadnych zmian chorobowych, ponieważ toksyna jest łatwo rozkładana przez proteazy jelitowe. Do rozwoju choroby najczęściej dochodzi po wprowadzeniu zarodników do wnętrza rany. Wytwarzana przez nie toksyna przedostaje się do centralnego układu oddechowego. Objawy choroby stają się widoczne w okresie od 4 dni do kilkunastu nawet tygodni od zarażenia. Nazwa choroby pochodzi od jej objawów, którymi są skurcze i porażenia różnych zespołów mięśni, do zgonu dochodzi w wyniku wyczerpania i uduszenia po skurczu mięśni oddechowych. Efektywne leczenie polega na zneutralizowaniu niezwiązanej toksyny przez podanie dużej dawki surowicy antytoksycznej. C. botulinum powodujący zatrucia jadem kiełbasianym (botulizm). Wytwarza silne neurotoksyny co uwarunkowane jest obecnością profaga w genomie bakterii. Te białkowe neurotoskyny nie są wrażliwe na enzymy trawienne układu pokarmowego stanowiącego miejsce ich apsorbcji. Toksyna działa na synapsy nerwowo – mięśniowe, hamując uwalnianie acetylocholiny, co prowadzi do paraliżu mięsni. Zatrucie jadem kiełbasianym rozwija się po spożyciu pokarmu zawierającego toksynę. Rys.12. Clostridium sp. Corynebacterium sp. Bakterie potocznie nazywane maczugowcami (z jęz. greckiego koryne – maczuga) w preparatach mikroskopowych widoczne są w układach przypominających pismo klinowe (formy Y i V) (rys.13). Wytwarzają silne ekotoksyny, które przenikają do krwiobiegu. Dla człowieka chorobotwórczym gatunkiem jest C. diphtheriae, przyczyna bardzo groźnej kiedyś choroby zwanej błonicą (dyfteryt). Choroba ta to typowa antroponoza, która szerzy się tylko drogą kropelkową w wyniku bezpośredniego kontaktu z osobą chorą. Po przebyciu choroby występuje trwała odporność. Rys.13. Corynebacterium sp. Ziarniaki Gram-ujemne Neisseria sp. dwoinka Rodzaj Neisseria (rys.14) to małe ruchliwe względne beztlenowce, Gram-ujemne dwoinki. N. gonorrhoeae jest przyczyna występującej tylko u ludzi choroby wenerycznej zwanej rzeżączką. Rys.14 Neisseria gonorrhoeae Pałeczki Gram-ujemne Pseudomonas sp. Pseudomonas aeruginosa (pałeczka ropy błękitnej, rys.15) to tlenowe ruchliwe Gram-ujemne pałeczki wytwarzające rozpuszczalne w wodzie barwniki (niebieski piocyjanina, fluoryzujący żółty pigment piowerdyna i piorubryna). Powszechną właściwością tych pałeczek jest zdolność do produkcji trójmetylamin nadającym hodowlą bardzo charakterystyczny zapach, kredek woskowych. Do rozwoju infekcji powodowanych przez P. aeruginosa dochodzi u osób z osłabionymi mechanizmami odpornościowymi, np. u cierpiących na ciężkie przewlekłe choroby, czy silnie poparzonych. Te oportunistyczne bakterie mogą być przyczyną groźnych chorób, np. zapalenia płuc, zapalenia ucha, współuczestniczą w rozwoju większości ropnych, przyrannych zakażeń, są też przyczyna zakażeń okołoporodowych, a śmiertelność w wyniku zapalenia opon mózgowo rdzeniowych wywołanego przez te bakterie dochodzi do 80%. W leczeniu utrudniony jest fakt, że bakterie te są często odporne na stosowane antybiotyki. Ze względu na małe wymagania odżywcze ulegają szybkiemu namnażaniu także w wodzie i miejscach wilgotnych. Rys.15. Pseudomonas aeruginosa ENTEROBACTERIACEAE Jest to duża i bardzo zróżnicowana rodzina bakterii, której przedstawiciele mogą bytować w wodzie, w glebie i w organizmach zwierząt (poczynając od owadów a na człowieku kończąc). Wiele gatunków wchodzi w skład fizjologicznej flory zwierząt i ludzi, niektóre są potencjalnymi patogenami, które mogą być przyczyną zakażeń jelitowych. Są to Gram-ujemne pałeczki niewytwarzające form przetrwalnikowych, wiele z nich zdolnych do ruchu ma perytrichalne ułożenie rzęsek. Identyfikacja i zróżnicowanie tych pałeczek uzyskuje się w wyniku posiewu na podłoże MacConkeya (rys.16). Jest podłożem wybiórczo-różnicującym, które uwidacznia zdolność szczepu do fermentacji laktozy służącym do izolacji i różnicowanie pałeczek Gram-ujemnych zwłaszcza Enterobacteriaceae i Pseudomona sp. Czynniki selektywne to sole żółciowe i fiolet krystaliczny który hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich. Laktoza stanowi składnik różnicujący, zaś czerwień obojętna jest wskaźnikiem zmiany pH. Wśród pałeczek rosnących na tym podłożu wyróżnia się dwie grupy: gatunki fermentujące laktozę, które zakwaszają środowisko tworząc czerwono zabarwione kolonie (Escherichia coli), i gatunki niefermentujące laktozy nie zmieniające zabarwienia koloni (Salmonella sp., Proteus sp.) Rys.16. Podłoże MacConkeya Do rodziny Enterobacteriaceae należą następujące pałeczki: Salmonella sp., Shigella sp., Escherichia sp., Serratia sp., Proteus sp., Citrobacter sp., Enterobacter sp., Klebsiella sp. - Rodzaj Salmonella - są to pałeczki chorobotwórcze dla ludzi i zwierząt. U ludzi wywołują dur brzuszny i dur rzekomy oraz zatrucia pokarmowe. Zarażenie produktów spożywczych tą pałeczką następuje za pośrednictwem: much, za pośrednictwem skażonej wody, przez nosicieli. Pałeczka Salmonelli, rozwija się w przewodzie pokarmowym człowieka lub zwierząt. Nosicielami są też ludzie, którzy zwykle po przebyciu choroby wydzielają z odchodami bakterie chorobotwórcze, przez kilka lat a nawet do końca życia. - Rodzaj Shigella - pałeczka czerwonki. Większość pałeczek z rodzaju Shigella jest chorobotwórcza dla człowieka i wywołuje chorobę czerwonkę lub ostry nieżyt żołądkowo-jelitowy. Głównym źródłem zakażenia tymi bakteriami jest chory człowiek. Rozprzestrzenianiu się pałeczek sprzyja ostra krwawa biegunka, pałeczki te mogą być przenoszone również przez muchy na produkty spożywcze. Zdarza się nosicielstwo tych bakterii. - Rodzaj Escherichia - pałeczka okrężnicy (rys.17) bakterie te stanowią typową pożyteczną mikroflorę jelita grubego ludzi dorosłych i zwierząt. Jest bardzo pożyteczna, bierze udział w procesie trawienia i przemianie materii. Dlatego pałeczki okrężnicy znajdujące się w przewodzie pokarmowym nie stanowią zagrożenia dla organizmu. Są jednak szczepy tego gatunku, które poza układem pokarmowym mogą wywołać: zapalenie dróg moczowych, zapalenie dróg żółciowych, zapalenie otrzewnej, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych Obecność pałeczki okrężnicy w produktach spożywczych świadczy o zakażeniu tych produktów fekaliami. Rys.17. Escherichia coli - Rodzaj Serratia są to pałeczki saprofityczne. Wytwarzają różowy lub czerwony barwnik (prodigiozyna). Serratia marcesces nazywana pałeczką cudowną może być przyczyną różnych infekcji oportunistycznych. Ze względu na odporność także na działanie różnych czynników zewnętrznych są przyczyną poważnych zakażeń szpitalnych. Bakterie te są także przyczyną psucia się pieczywa. - Rodzaj Proteus jest bardzo rozpowszechniony w przyrodzie. Są to urzęsione i ruchliwe pałeczki wykazujące duży polimorfizm kształtu komórki, co uwzględnia rzadko już używana polska nazwa „odmieniec. Najpospolitszym gatunkiem jest Proteus vulgaris, którego wzrost na płytce określa się „mgławicowy”. Bakterie te występują często w produktach spożywczych powodują zmianę zapachu smaku i barwy, są chorobotwórcze dla człowieka powodują zapalenie ropne dróg moczowych, zapalenie opon mózgowych, zapalenie ucha środkowego, zatrucia pokarmowe. Vibrio cholerae Przecinkowce Gram-ujemne pałeczki, bardzo ruchliwe dzięki obecności polarnej rzęski. Środowisko życia większości gatunków przecinkowców to woda zarówno morska jak i słodka. Oprócz saprofitycznych gatunków są też endosymbiotyczne jak i chorobotwórcze dla człowieka i zwierząt Vibrio cholerae (rys.18). Rys.18. Vibrio cholerae
