wewnątrzkomórkowy transport p cherzykowy

WEWNĄTRZKOMÓRKOWY
TRANSPORT
P CHERZYKOWY
Dr Łukasz Baranowski
Wydział Rolnictwa i Biologii
Katedra Botaniki
Warszawa, 31.05.2016
SYSTEMY BŁON WEWN TRZNYCH
• Błony kom. wyst pują we wszystkich układach
biologicznych zdolnych do samodzielnego życia.
• Tworzą mniejsze systemy (organelle błonowe).
• Komunikacja: wymiana sygnałów, transport
p cherzykowy i niezwiązany z p cherzykami.
TRANSPORT
Wewnątrzkomórkowy
Mi dzykomórkowy
(plasmodesmy)
EUCARYOTA
Szlak sekrecyjny
Szlak endocytotyczny
Organelle: ER, aparat Golgiego, endosomy, wakuole.
Transport pomi dzy tymi organellami wymaga mechanizmów
sortujących, transportujących oraz rozpoznających błon docelową.
Transport wydzielniczy:
p cherzyki transportowane są
z ER, pow. cis, środkową,
trans AG, aż do wakuoli
lub błony docelowej
(transport anterogradowy).
Transport retrogradowy utrzymuje
lokalizacj białek ER i AG oraz białek z rodziny SNARE.
RETIKULUM
ENDOPLAZMATYCZNE
• Pierwsze organellum szlaku wydzielniczego.
• Najbardziej plastyczne (system spłaszczonych cystern,
rozgał zionych rurek i p cherzyków otoczonych błoną).
• Wi cej białek i fosfolipidów, mniej steroli. Dużo kwasów
nienasyconych (płynność).
• Wn trze: liczne enzymy (synteza, modyfikacja, sekrecja).
• Funkcje: u roślin: synteza, modyfikacja, sortowanie białek,
glikoprotein i lipidów, regulacja zawartości wapnia w cytozolu
oraz tworzenie struktur błoniastych (ciała ER).
DOMENY ER I ICH FUNKCJE:
• Gładkie – enzymy biosyntezy glicerolipidów, terpenów,
fenylopropanoidów, flawonoidów i wosków.
• Szorstkie – synteza nowych białek i transport do innych typów ER,
AG, wakuoli i błony komórkowej.
• Tranzytowe – formowanie p cherzyków transportujących.
• Cztery typy domen ER związane są z jądrem komórkowym:
domena receptorowa lamin, porów jądrowych, ER bramkowe i
domena nukleacji mikrotubul. Domena receptorowa lamin jest
miejscem organizacji lamin jądrowych i przyczepu chromosomów
interfazowych.
• ER bramkowe bierze udział w regulacji wymiany białek mi dzy
błoną ER a otoczką jądrową.
Domeny: nukleacji mikrotubul, formowania ciał olejowych,
białkowych, plasmodesm czy wakuoli są charakterystyczne dla
roślin wyższych a ich obecność i forma jest zależna od konkretnych
funkcji komórki i procesów w niej zachodzących.
Domeny wiążące wakuol , mitochondria i filamenty aktynowe oraz
kotwiczenia błony komórkowej, formujące wakuol i recyklingujące
lipidy.
POCHODNE ER
• Struktury KDEL (np. u fasoli)
• Rycynosomy (Ricinus communis)
procesy hydrolityczne
• P cherzyki PAC (Ricinus communis, Cucurbita maxima)
Transport prekursorów białek zapasowych (np. albuminy 2S,
globuliny 11S) z ER do wakuoli magazynującej omijając aparat
Golgiego.
APARAT GOLGIEGO
• Roślinny aparat Golgiego składa si z diktiosomu, czyli
polarnego stosu dyskowatych cystern otoczonych pojedynczą
błoną wraz z towarzyszącymi im p cherzykami.
• Liczba cystern budująca pojedynczy diktiosom waha si od
5 do 7 w komórkach czapeczki korzenia do 30 w komórce
klejnotki.
• Liczba diktiosomów w komórce jest zmienna. W zależności
od typu komórki, czynników fizjologicznych, etapu
różnicowania i pełnionych funkcji, komórki mogą zawierać
od jednego diktiosomu u zawłotni do kilkuset w komórkach
czapeczki korzenia kukurydzy, a nawet kilku tysi cy w
komórkach włosków łupiny nasiennej bawełny.
• W obr bie diktiosomu wyróżnia si trzy domeny/obszary/strefy: cis,
środkową i trans. Strefa cis nazywana jest strefą „formowania” lub
„wejścia”, a strefa środkowa i trans „dojrzewania” lub „wyjścia”.
Polarność diktiosomów wyraża si także różną średnicą cystern, jak i
nierównomiernym rozmieszczeniem p cherzyków.
• Typy p cherzyków:
1. Okryte białkami opłaszczającymi typu I (COPI) (strefa cis).
2. „Kolczaste” okryte klatryną (strefa trans).
3. „Gładkopowierzchniowe” produkujące śluz.
4. G ste (DV) o średnicy do 300 nm – charakterystyczne dla komórek bielma
rącznika pospolitego oraz liścieni dyni olbrzymiej i wielu roślin z rodziny
Fabaceae.
TRANS GOLGI NETWORK
• Z diktiosomami związane są nie tylko p cherzyki, ale i TGN
(PGN). TGN – kompleks dynamicznych przedziałów
błonowych zlokalizowanych po stronie trans AG. Cz ść
autorów twierdzi, że TGN jest cz ścią diktiosomu, podczas
gdy inni uważają, że jest ono organellum autonomicznym.
TRANS GOLGI NETWORK
• W niektórych komórkach TGN zbudowana jest z szerokich
cystern i wyst puj w pewnej odległości od AG. W innych
przypadkach TGN jest ledwo widoczna i połączona z
biegunem trans AG.
• Funkcje:
TGN uczestniczy w transporcie makromolekuł
nowosyntetyzowanych przez AG, jak również jest
zaangażowana w endocytoz .
FUNKCJE APARATU GOLGIEGO:
• Modyfikacja łańcuchów oligosacharydowych glikoprotein
i proteoglikanów.
• Biosynteza składników błony komórkowej (lipidów i
glikolipidów) oraz ściany komórkowej (hemiceluloz,
pektyn i śluzów).
• AG formuje, wydziela i przyjmuje liczne p cherzyki przez
co bierze udział również w przepływie błon w komórce
(szlaki sekrecyjne i endocytotyczne).
WAKUOLA
• Typowa wakuola jest najwi kszym organellum klasycznej komórki
roślinnej. Otoczona jest pojedynczą błoną – tonoplastem.
• Funkcje:
1. Gromadzi białka zapasowe i produkty przemiany materii.
2. Bierze udział w procesach litycznych i programowanej śmierci
komórki.
3. Reguluje: obj tość komórki, turgor, pH, koncentracj jonów
nieorganicznych w cytozolu.
4. Uczestniczy w transdukcji sygnałów.
5. W jednej komórce roślinnej mogą znajdować si wakuole pełniące
różne funkcje np. gromadzące białka zapasowe (PSV) i biorące udział
w procesach litycznych (LV) odpowiednik zwierz cych lizosomów.
TONOPLASTOWE BIAŁKA INTźGRALNź (TIP)
• Białka TIP należą do bardzo licznej grupy białek regulujących transport wody
(akwaporyny).
• Masa ok. 27 kDa a ich cząsteczka składa si z sześciu transmembranowych
domen, połączonych krótkimi p tlami, i dwóch hydrofilowych końców (C i N)
zakotwiczonych w cytoplazmie.
TONOPLASTOWE BIAŁKA INTźGRALNź (TIP)
• W tonoplaście wakuol magazynujących znajdują si izoformy
α-TIP i δ-TIP, natomiast tonoplast wakuol litycznych zawiera
izoform γ-TIP.
• Analizy immunocytochemiczne komórek stożka wzrostu
korzenia j czmienia potwierdziły wyst powanie dwóch
funkcjonalnie oddzielnych typów wakuol. Wakuole
magazynujące oprócz odpowiedniej dla siebie izoformy TIP
zawierały także j czmienne lektyny, a lityczne – aleurain
(j czmienną proteinaz cysteinową).
ANALIZY IMMUNOCYTOCHEMICZNE
ANALIZY IMMUNOCYTOCHEMICZNE
INNź BIAŁKA TONOPLASTU
•
W korzeniu palowym rzodkwi, białka TIP
stanowią od 30 do 50% wszystkich białek
tonoplastowych.
•
Inne znaczniki molekularne wakuol
(pirofosfataza, V-ATPaza) to tylko 10%
białek.
•
V- PPiaza i V-ATPaza należą do pomp
protonowych i zapewniają tonoplastowi
odpowiedni gradient pH i potencjał błonowy.
•
Cząsteczka V-ATPazy (700 kDa) zbudowana
jest z 14 różnych podjednostek białkowych
złożonych w cz ść transmembranową i
katalityczny region cytozolowy.
•
Białko to może uczestniczyć w szlaku
sekrecyjnym w komórkach eukariotycznych.
ANALIZY IMMUNOCYTOCHEMICZNE
ANALIZY IMMUNOCYTOCHEMICZNE
KOMUNIKACJA POMI ŹZY SYSTźMAMI BŁON
WźWN TRZNYCH
• Wi kszość nowo zsyntetyzowanych wielkocząsteczkowych
związków chemicznych musi być przetransportowana z miejsca
ich produkcji do miejsca ich funkcjonowania.
• Transport ten odbywa si także dzi ki p cherzykom
transportującym.
• P cherzyki transportujące to niewielkie struktury otoczone
pojedynczą błoną.
• Transport p cherzykowy pomi dzy systemami błon
wewn trznych wymaga mechanizmów sortujących ładunek,
transportujących oraz rozpoznających błon docelową.
• Wyróżnia si wydzielnicze (szlak wczesny i pó ny) i
endocytotyczne drogi transportu.
WCZESNY SZLAK WYDZIELNICZY
• Oragnelle zaangażowane we wczesny szlak wydzielniczy (ang. early
secretory pathway) to źR i AG. Transportowane makrocząsteczki są
syntetyzowane i/lub modyfikowane w ER i diktiosomach. Przykładami
modyfikacji posttranslacyjnych zachodzących w źR są np. pierwotna
glikolizacja białek, czy formowanie wiązań disiarczkowych. W AG znajdują
si liczne glikotransferazy i glikozydazy uczestniczące w wydłużaniu,
skracaniu, przyłączaniu lub odłączaniu łańcuchów glikozylowych. W AG
mogą także zachodzić modyfikacje proteolityczne niektórych białek.
• Po obróbce chemicznej związki wielkocząsteczkowe pakowane są do
odpowiednich p cherzyków i transportowane do kolejnych przedziałów
błonowych w obr bie komórki lub przez fuzj z błoną komórkową wydzielają
swoją zawartość do ściany komórkowej (egzocytoza).
TRANSPORT Z ER DO AG
• Transport - p cherzyki okryte białkami opłaszczającymi COPII.
Komponentami tych białek są Sar1p i kompleksy białkowe Sec13/23.
1. Sar1p (24 kŹa) należy do małych białek
wiążących GTP.
2. Kompleks Sec13 (700 kŹa) składa si z
białek Sec13p i Sec31p zawierających
liczne motywy WD (Trp-Asp).
3. Sec23 (400 kŹa) to kompleks białek Sec23p
i Sec24.
TRANSPORT Z ER DO AG
Transport z źR do AG w komórkach eukariotycznych zapewniany jest też
przez białka SNARź [(ang. soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor (NSF)
attachment protein receptors, SNAP receptors)].
Każdy typ p cherzyka transportującego ma na swojej powierzchni znacznik
molekularny. Marker ten musi być rozpoznany przez odpowiednie receptory
błony docelowej. Rozpoznanie i fuzja p cherzyka z błoną odbywa si przy
udziale białek SNARź.
SNARź to dwie odr bne rodziny integralnych białek błonowych. v-SNARE
to białka wyst pujące w błonach p cherzyków transportujących, a bardziej
stabilne t-SNARź znajdują si w cytozolowych cz ściach błon organelli
docelowych.
TRANSPORT W OBR BIź AG I Z AG ŹO źR
• Charakterystyczną cechą
p cherzyków
transportujących jest
opłaszczanie białkami
COPI.
• Komponentami tych
białek jest ARF1 i
kompleks białkowy
zwany z koatomerem.
TRANSPORT W OBR BIź AG I Z AG ŹO źR
• ARF1 to białko wiążące GTP o masie około 20 kDa, które zostało odkryte w cytozolu
w postaci monomerycznej formy związanej z GŹP. Forma ta podlega N-mirystylacji
(N-MYR) pozwalającej na jej kotwiczenie w błonie bez udziału koatomerów.
• W porównaniu do innych ARF-ów, wiązanie ARF1 wymaga czynnika wymiany
nukleotydów guaninowych (GTP/GDP exchange factor, GEF).
• GEF-y mogą być wrażliwe na działanie brefeldyny A (BFA), która może zakłócać
transport białek przez AG.
• U Arabidopsis osiem czynników ARF-GźF zaklasyfikowano do dwóch rodzin: klasy
GNOM/Geal1/2p/GBF i klasy BIG/sec7p.
BREFELDYNA A (BFA)
• Brefeldyna A to makrocykliczny hydrofobowy lakton pochodzenia grzybowego.
• W komórkach roślinnych BFA jest inhibitorem szlaku sekrecyjnego (sekrecji
konstytutywnej) i tworzenia si p cherzyków nieklatrynowych (COPI). Bierze
także udział w modyfikacjach szlaków syntezy lipidów i O- i N-glikanów oraz
kształtu, lokalizacji i funkcjonowania wszystkich organelli zaangażowanych w
ścieżki egzocytotyczne i endocytotyczne.
BREFELDYNA A (BFA)
• Traktowanie roślin BFA prowadzi do wielu zmian, nie tylko na poziomie
molekularnym, ale i ultrastrukturalnym. Wysokie st żenie BFA
powoduje przede wszystkim, rearanżacj struktur AG. Stosy cystern
diktiosomu ulegają deformacjom bąd zanikają) lub przeciwnie,
powstają rozbudowane kompleksy diktiosomów w wyniku łączenia si
cystern dwu różnych stosów.
• Mogą powstawać także struktury hybrydowe, np. źR-diktiosom, co
prowadzi do redystrybucji białek z AG do ER.
• Mimo tych wszystkich zmian wiele cystern pozostaje metabolicznie
aktywne o czym świadczy ich zdolność do formowania i odłączania
p cherzyków.
• Strukturami powstającymi na skutek działania BFA są także tzw.
przedziały indukowane BFA (ang. BFA-induced compartments).
Powstają one najprawdopodobniej przez horyzontalny podział
diktiosomów.
PÓ NY SZLAK WYDZIELNICZY
• Pierwszym organellum pó nego szlaku wydzielniczego w
komórkach zwierz cych i roślinnych jest TGN.
• Białka transportowane są przez p cherzyki z TGN do wakuol
(magazynujących i litycznych) lub błony komórkowej.
• W przeciwieństwie do ładunku dostarczanego do wakuol, ten
przeznaczony dla błony komórkowej nie posiada specyficznej
sygnatury kierującej.
• Wszystkie poznane białka wakuolarne mają wakuolarny sygnał
sortujący (ang. vacuolar sorting signal, VSS).
TRANSPORT Z TGN DO PVC
• W komórkach drożdży,
zwierząt i roślin od TGN
odpączkowują p cherzyki
okryte klatryną (ang. clathrincoated vesicles, CCV.
• P cherzyki te są
odpowiedzialne, przede
wszystkim, za transport
lizosomalnych kwaśnych
hydrolaz pochodzących z AG.
• Ich okrywa składa si z
klatrynowego triskelionu,
kompleksu adaptorowego i
receptora transbłonowego.
TRANSPORT Z TGN DO PVC
• Triskeliony to
heksamery zbudowane
z trzech łańcuchów
polipeptydowych
ci żkich (ang. clathrin
heavy-chain, CHC) i
trzech lekkich (ang.
clathrin light-chain,
CLC) ułożonych w
struktur „trójnożną.”
TRANSPORT Z TGN DO PVC
• W komórkach ssaków
każda „noga” ma długość
45 nm i składa si z trzech
morfologicznie różnych
regionów: „kolana”
wrażliwego na proteazy,
domeny proksymalnej o
długości 17 nm i 25 nm
domeny dystalnej.
Triskeliony drożdży i roślin
zbudowane są z takich
samych regionów, ale ich
„nogi” są dłuższe (61 nm).
U wszystkich eukariotów
białka CHC kodowane są
przez pojedynczy gen.
TRANSPORT DO PVC
• Pierwszym etapem transportu do przedziału przedwakuolarnego (ang. prevacuolar
compartment, PVC) jest utworzenie p cherzyka i załadowanie go odpowiednim
ładunkiem. W literaturze PVC nazywane jest także ciałem wielop cherzykowym (ang.
multivesicular body, MVB) lub endosomem pó nym.
• Proces powstawania p cherzyka okrytego klatryną (CCV).
TRANSPORT Z TGN DO WAKUOL
• Niektóre białka transportowane są do wakuol przez p cherzyki
zależne od AP-3 (ang. AP-3-dependent vesicles). Kompleks AP3 został zlokalizowany w komórkach ssaków i drożdży i nie jest
powiązany z klatryną, ale tylko z białkami SNARź.
• W tym mechanizmie transportującym odkryto wakuolarne białko
t-SNARE (Vam3p).
• W komórkach roślinnych mogą wyst pować dwa, funkcjonalnie
różne, typy wakuol. Białka przeznaczone do wakuol litycznych
np. hydrolazy posiadają swoisty sekwencyjnie, wakuolarny
sygnał sortujący (ang. sequence specific VSS, ssVSS) np.
motyw czteroaminokwasowy – NPIR (Asn-Pro-Ile-Arg) dwóch
niespokrewnionych białek: aleurainy i sporaminy.
TRANSPORT Z TGN DO WAKUOL
• Białka zapasowe transportowane są do PSV przede wszystkim
przez DV, co zaobserwowano w liścieniach grochu i dyni.
• DV pączkują z aparatów Golgiego, a nast pnie są uwalniane
dalej przez TGN.
• DV opłaszczone są białkami lecz nie poznano struktury i
właściwości molekularnych.
• DV zawierają globuliny 11S (legumina) i 7S (wicylina), dojrzałe
dodatkowo glikoproteiny, natomiast nie stwierdzono obecności
w nich albuminy 2S i BP-80.
• Brak BP-80 wskazuje na inny mechanizm sortowania białek. W
tym przypadku może być on oparty na p cherzykach.
TRANSPORT Z TGN DO BŁONY
KOMÓRKOWEJ
• Transport z TGN do błony komórkowej ma duże
znaczenie w komórkach roślinnych. Wiąże si to z
dostarczaniem prekursorów (hemiceluloz i pektyn) ściany
komórkowej.
• Diktiosomy mogą syntetyzować glikoproteiny i
polisacharydy, które muszą być przetransportowane do
ściany komórkowej.
• Cząsteczki te pakowane są w różne p cherzyki, lecz
wszystkie typy p cherzyków związane są z białkami
SNARE.
ENDOCYTOZA I ENDOSOMY
• Endocytoza i endosomy w roślinach uczestniczą m. in. w
różnicowaniu zarodka i epidermy, grawitropizmie, ruchu
komórek przyszparkowych, przebudowie ściany komórkowej,
regulacji transportu auksyn i odpowiedzi na atak patogenów.
• Pierwszym etapem endocytozy jest wgł bienie błony
komórkowej, czyli tzw. dołek okryty klatryną, z którego tworzy
si p cherzyk okryty klatryną. P cherzyki odpączkowują, łączą
si ze sobą i tworzą endosom wczesny, u roślin nazywany też
cz ściowo okrytym retikulum (ang. partially coated reticulum,
PCR). Kolejne struktury tego szlaku to endosom pó ny i
wakuole lityczne.
WORTMANINA
• Wortmanina specyficznie blokuje aktywność kinazy-3fosfatydylinozytolu (ang. phosphatidylinositol-3-kinase, PI3kinase), która bierze udział w syntezie fosforanu-3fosfatydylinozytolu (ang. phosphatidylinositol-3-phosphate,
PI3P).
• Związek ten obecny jest w endosomach późnych komórek
drożdży i ssaków.
• W roślinach PI3P zlokalizowano w endosomach ARA7/RabFb2.
• Traktowanie wortmaniną komórek kallusowych tytoniu
(Nicotiana tabacum) BY-2 i korzeni Arabidopsis thaliana
potwierdziło wyst powanie zniekształconych MVB.
DZI KUJ ZA UWAG !!!
AŻ STRACH SI BAĆ EGZAMINU