TPA Ruch komórek - Zakład Biologii Komórki

Praktikum z biologii komórki dla biologów
http://www.uj.edu.pl/web/zbk/dydaktyka/kursy/wbt-231
Charakterystyka kursu:
• 90 godzin laboratoryjnych
Zasady zaliczenia:
• uczestniczenie w zajęciach
Koordynator: dr Marta Michalik (p. C118)
Prowadzący:
nauczyciele akademiccy i doktoranci ZBK
oraz Pracowni Biofizyki Komórki
(dopuszczana 1 nieobecność usprawiedliwiona)
• przygotowywanie się na ćwiczenia
(sprawdzanie wiadomości - oceny cząstkowe)
• przygotowanie i wygłoszenie referatu (obligatoryjne)
• kolokwium zaliczeniowe
Ocena z kursu jest średnią ważoną:
• ocen cząstkowych otrzymanych przez studenta w trakcie ćwiczeń praktycznych (oceny
od każdego prowadzącego zajęcia) wraz z oceną z referatu (50%)
• oceny z kolokwium zaliczeniowego (50%)
Praktikum z biologii komórki (BT 226)
ĆWICZENIA ORGANIZACYJNE
• Zasady zaliczenia kursu
• Podstawowe zasady przestrzegania przepisów BHP:
- zasady pracy w laboratorium o poziomie zagrożenia biologicznego BL- 1
- zasady BHP w pracowni chemicznej
• Plan wszystkich zajęć laboratoryjnych
ZAKŁADANIE HODOWLI PIERWOTNYCH
FIBROBLASTÓW ZARODKA KURCZĘCIA
Ćwiczenie ma na celu
zapoznanie się z podstawowymi technikami bezpośredniej izolacji komórek z tkanek i ich
przygotowania do hodowli w układach in vitro
7-dzień
Etapy procedury:
1.
Pozyskanie tkanki z organizmu
2.
Dysocjacja tkanki
3.
Oczyszczanie uzyskanej populacji
z niepożądanych typów komórek
Zagadnienia do przygotowania:
1.
Hodowle komórkowe in vitro
Zalecana literatura:
Instrukcje do ćwiczeń
1.
D. F. Huelser „Mammalian Cell Culture Methods”
20-dzień
TRÓJWYMIAROWE HODOWLE KOMÓREK
MIĘŚNIA SERCOWEGO
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się
z techniką zakładania hodowli agregatów
komórek serca zarodka kurczęcia.
Omówione zostaną zagadnienia dotyczące
badań nad macierzystymi komórkami serca.
Tematy referatów:
1. Mechanizm skurczu mięśni poprzecznie
prążkowanych i mięśni gładkich
2. Porównanie morfologii i funkcji komórek mięśni
poprzecznie prążkowanych, mięśni gładkich i
komórek mięśnia serca
Materiał obowiązujący do ćwiczeń:
Budowa serca – mechanizm skurczu
METODY IMMUNOCYTOCHEMICZNE
BARWIENIA FLUORESCENCYJNE KOMÓREK
PRAWIDŁOWYCH I NOWOTWOROWYCH
Ćwiczenie ma na celu
wykazanie obecności i kolokalizacji
rożnych struktur w komórkach
zwierzęcych poprzez równoczesne
wybarwienie ich kilkoma barwnikami
fluorescencyjnymi
(cytoimmunofluorescencja pośrednia)
Temat referatu:
Metody immunocytochemiczne w badaniach biologii komórki
Zagadnienia do przygotowania:
1. Organizacja, funkcje i metody badania
cytoszkieletu w komórkach zwierzęcych
(prawidłowych i nowotworowych).
2. Metody immunocytochemiczne i ich
znaczenie w badaniach biologii komórki.
3. Zastosowanie barwników fluorescencyjnych
w badaniach struktury i funkcji komórek.
Zalecana literatura:
B. Alberts i inni – Podstawy Biologii Komórki, PWN 2005;
rozdz.17.
Red. J. Kawiak i M. Zabel – Seminaria z cytofizjologii, WMed
2002, rozdz.7 i 14
Red. M. Jakóbisiak – Immunologia, PWN 1996, rozdz. 5 i 7
Red. M. Zabel – Immunocytochemia, PWN 1999, rozdz.1, 2 i 4
Kursy: „Podstawy biologii komórki” i „Biologia komórki” –
Budowa i funkcje cytoszkieletu
ZASTOSOWANIE METOD
IMMUNOCYTOCHEMICZNYCH
W DIAGNOSTYCE NOWOTWORÓW
Cel ćwiczenia:
wykorzystanie metody
immunocytofluorescencji pośredniej do
identyfikacji komórek prawidłowych i
nowotworowych w hodowlach in vitro
Temat referatu:
Wykorzystanie metod
immunocytochemicznych w diagnostyce
medycznej
Zagadnienia do przygotowania:
1. Cechy komórek nowotworowych
2. Metody immunocytochemiczne w
diagnostyce nowotworów
3. Zastosowanie barwników
fluorescencyjnych w badaniach struktury i
funkcji komórek.
Zalecana literatura:
Red. J. Kawiak i M. Zabel – Seminaria z cytofizjologii, WMed 2002,
rozdz..7 i 14.
Red. M. Jakóbisiak – Immunologia, PWN 1996, rozdz. 5 i 7.
Red. M. Zabel – Immunocytochemia, PWN 1999, rozdz..1, 2 i 4
Red. I. Kątnik Prastowska – Immunochemia w biologii medycznej,
PWN 2009, rozdz. 1, 2.1
ZASTOSOWANIE METOD
IMMUNOCYTOCHEMICZNYCH
W DIAGNOSTYCE NOWOTWORÓW
Cel ćwiczenia:
wykorzystanie metody
immunocytofluorescencji pośredniej do
identyfikacji komórek prawidłowych i
nowotworowych w hodowlach in vitro
Temat referatu:
Wykorzystanie metod
immunocytochemicznych w diagnostyce
medycznej
Zagadnienia do przygotowania:
1. Cechy komórek nowotworowych
2. Metody immunocytochemiczne w
diagnostyce nowotworów
3. Zastosowanie barwników
fluorescencyjnych w badaniach struktury i
funkcji komórek.
Zalecana literatura:
Red. J. Kawiak i M. Zabel – Seminaria z cytofizjologii, WMed 2002,
rozdz..7 i 14.
Red. M. Jakóbisiak – Immunologia, PWN 1996, rozdz. 5 i 7.
Red. M. Zabel – Immunocytochemia, PWN 1999, rozdz..1, 2 i 4
Red. I. Kątnik Prastowska – Immunochemia w biologii medycznej,
PWN 2009, rozdz. 1, 2.1
ZASTOSOWANIE CYFROWYCH, CHŁODZONYCHCH
KAMER CCD
W MIKROSKOPII FLUORESCENCYJNEJ
Jednym ze sposobów zapisu obrazu z mikroskopii fluorescencyjnej jest
zastosowanie cyfrowych kamer CCD. Celem ćwiczeń jest poznanie
podstawowych zasad użycia tego rodzaju sprzętu
współdziałającego
ze zautomatyzowanym mikroskopem fluorescencyjnym
Ćwiczenie ma na celu:
1. Praktyczne poznanie podstawowych zasad działania cyfrowych kamer
CCD.
2. Poznanie zasad obsługi automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego.
Zagadnienia do przygotowania:
1. Zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego
2. Podstawowe pojęcia dotyczące komputerowej analizy obrazu
3. Zasada działania kamer CCD
Zalecana literatura:
1. Podstawy biologii komórki, Wprowadzenie do biologii molekularnej pod
redakcją B. Alberts`a.
2. http://www.microscopyu.com/articles/digitalimaging/index.html
ZASTOSOWANIE ZAUTOMATYZOWANYCH SYSTEMÓW
MIKROSKOPOWYCH DO POKLATKOWEJ REJESTRACJI
PROCESÓW BIOLOGICZNYCH
We współczesnej biologii komórki szczególne zainteresowanie budzą
możliwości poklatkowej rejestracji różnych procesów
obserwowanych pod mikroskopem. Dostępne obecnie techniki
mikroskopii cyfrowej umożliwiają stosunkowo proste
przeprowadzanie takich doświadczeń
Ćwiczenie ma na celu:
1. Poznanie zasad obsługi automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego
2. Przeprowadzenie doświadczenia polegającego na wykorzystaniu
systemu mikroskopowego do rejestracji migracji komórek w zadanym
okresie czasu, przy określonym kroku czasowym oraz wybraniu kilku
różnych miejsc analizowanego preparatu
Zagadnienia do przygotowania:
1. Zasada działania mikroskopu
fluorescencyjnego
2. Podstawowe pojęcia dotyczące
komputerowej analizy obrazu
3. Zasada działania kamer CCD
4. Metody określania aktywności
ruchowej komórek
Zalecana literatura:
1. Podstawy biologii komórki, Wprowadzenie do
biologii molekularnej pod redakcją
B. Alberts`a.
2.http://www.microscopyu.com/articles/digitalima
ging/index.html
3. Z. Madeja. Wpływ homo- i heterotypowych
oddziaływań komórka-komórka na
aktywność ruchową komórek
nowotworowych. Seria Wydawnicza
Instytutu Biologii Molekularnej
i Biotechnologii UJ. Kraków 2002. str. 20-26
REJESTRACJA I ANALIZA MIGRACJI KOMÓREK
ZWIERZĘCYCH. ROLA KINAZY BIAŁKOWEJ C
W REGULACJI AKTYWNOŚCI RUCHOWEJ KOMÓREK
KONTROLA
Ruch komórek towarzyszy wielu procesom zachodzącym w żywych
organizmach, takim jak embriogeneza, regeneracja i gojenie się ran czy
reakcje obronne układu odpornościowego
Ćwiczenie ma na celu:
1. Zapoznanie się z wybranymi mechanizmami regulacji ruchu komórek
zwierzęcych
2. Zapoznanie się z metodami rejestracji i analizy ruchów komórek
TPA
Temat referatu:
Rola kinazy białkowej C w regulacji ruchów komórek
Zagadnienia do przygotowania:
1. Aktywność ruchowa komórek niemięśniowych
2. Udział kinazy białkowej C w przekazywaniu sygnału w komórce
3. Wpływ estrów forbolu na aktywność ruchową komórek
Zalecana literatura:
1. Podstawy biologii komórki, Wprowadzenie do biologii molekularnej pod redakcją B. Alberts`a.
2. Klein A. (2002) Molekularne podstawy regulacji hormonalnej. Sygnalizacja międzykomórkowa i wewnątrzkomórkowa.
(str 103-109)
3. Sroka J.(2009) Wpływ organicznych pochodnych cyny i ołowiu na migrację komórek zwierzęcych oraz
międzykomórkową komunikację za pośrednictwem złącz szczelinowych (str. 14-20)
4. Wiadomości z ćwiczeń z biologii komórki dotyczące mechanizmów ruchów komórkowych
ZASTOSOWANIE SYSTEMU MIKROSKOPII TIRF
W BADANIACH ORGANIZACJI CYTOSZKIELETU
W KOMÓRKACH ZWIERZĘCYCH
Ćwiczenie ma na celu:
1. Zapoznanie się z metodą
całkowitego odbicia wewnętrznego
fluorescencji (TIRF)
2. Wizualizację białek cytoszkieletu
komórek
Zagadnienia do przygotowania:
1. Mikroskopia fluorescencyjna
2. TIRF
Zalecana literatura:
1.http://www.microscopyu.com/articles/fluor
escence/tirf/tirfintro.html
Zakład Biologii Komórki, WBBiB UJ
„The Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology of the Jagiellonian University is a beneficient of the structural funds from
the European Union (grant No: POIG.02.01.00-12-064/08 — “Molecular biotechnology for health”)
KOMUNIKACJA MIĘDZYKOMÓRKOWA
Złącza szczelinowe zbudowane są z kompleksów białkowych
tworzących międzykomórkowe kanały, które łączą przedziały
cytoplazmatyczne sąsiednich komórek. Kanały złącz
zbudowane są z dwóch koneksonów, heksamerów białek z
rodziny koneksyn
Funkcja złącz szczelinowych…
NH3+
1
E1
- tworzenie kanałów łączących przedziały
cytoplazmatyczne sąsiednich komórek
2
- międzykomórkowa bierna wymiana
dobnocząsteczkowych metabolitów o
3
E2
4
COO
_
masie poniżej 1.5 kDa
Ćwiczenie ma na celu
zapoznanie się z ilościową techniką wizualizacji komunikacji
międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych.
Temat referatu:
Budowa i funkcje koneksyn.
Konekson
(Eckert &Huelser, zmienione)
189
Kanały łączące przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek
Zagadnienia do przygotowania:
1. Zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego
2. Analizy
intensywności
międzykomórkowego
metabolitów techniką scrape-loading
3. Test żywotności komórek z wykorzystaniem
fluoresceiny
Zalecana literatura:
1. Instrukcje do ćwiczeń
2. Alberts, Biologia komórki
transferu
dwuoctanu
PODSTAWY REKONSTRUKCJI OBRAZÓW
MIKROSKOPOWYCH W PRZESTRZENI TRÓJWYMIAROWEJ
Acquisition of Optical Sections
Cel ćwiczenia:
Zaznajomienie się z
podstawowymi funkcjami
mikroskopu fluorescencyjnego
umożliwiającymi trójwymiarową
rekonstrukcję obrazów
mikroskopowych
Image Plane
Microscope
Objective
Focal Change
(Δz)
z axis
Focal Plane
Pinaki Sarder and Arye Nehorai
Obowiązujący materiał:
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Podstawy akwizycji obrazów mikroskopowych
IZOLACJA KOMÓREK SZPIKU KOSTNEGO
W CELU IDENTYFIKACJI WYBRANYCH
POPULACJI KOMÓREK MACIERZYSTYCH
TECHNIKAMI CYTOMETRYCZNYMI
Ćwiczenie ma na celu:
zapoznanie się z metodami izolacji komórek szpiku
kostnego (SzK) oraz identyfikacji wybranych populacji
komórek macierzystych z zastosowaniem technik
cytometrycznych, w tym cytometrii przepływowej oraz
obrazowej.
Cytometria obrazowa
Klasyczna cytometria przepływowa
Temat referatu:
1. Populacje komórek macierzystych obecnych w SzK.
2. Zasady analizy komórek w cytometrii przepływowej.
Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń:
1.
2.
3.
Zasada działania cytometru przepływowego.
Immunobarwienie komórek w celu ich analizy w mikroskopii
fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.
Cechy charakterystyczne komórek macierzystych.
Zalecana literatura:
1. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Analysis/Flow-Cytometry/Flow-CytometryTechnical-Resources.html?icid=fr-flow-4
2. Lin KK, Goodell MA. Detection of hematopoietic stem cells by flow cytometry. Methods Cell Biol. 2011;103:21-30.
3. Ratajczak MZ, Zuba-Surma EK, Machalinski B, Kucia M. Bone-marrow-derived stem cells--our key to longevity? J Appl Genet.
2007;48(4):307-19.
4. Zuba-Surma EK, Ratajczak MZ. Analytical capabilities of the ImageStream cytometer. Methods Cell Biol. 2011;102:207-30.
TRÓJWYMIAROWE OBRAZOWANIE KOMÓREK
METODĄ MIKROSKOPII KONFOKALNEJ
Ćwiczenie ma na celu:
wykonanie trójwymiarowego obrazowania komórek metodą mikroskopii konfokalnej
- porównanie z możliwościami mikroskopu fluorescecnyjnego szerokiego pola
Tytuły referatów:
1. Sposób tworzenia obrazu w mikroskopie konfokalnym
2. Barwniki wykorzystywane w mikroskopii fluorescencyjnej.
Zagadnienia do przygotowania:
Podstawy mikroskopii optycznej, fluorescencyjnej i konfokalnej
Zalecana literatura:
Dobrucki J. Skaningowa, fluorescencyjna mikroskopia konfokalna. Mikrobiologia Medycyna
1996, 1(6) 34-38
BADANIE DYNAMIKI BIAŁEK JĄDROWYCH W ŻYWYCH
KOMÓRKACH METODĄ MIKROSKOPII KONFOKALNEJ
Ćwiczenie ma na celu:
Zbadanie dynamiki histonów wyznakowanych GFP w żywych komórkach
metodą FRAP (Fluorescecne Recovery After Photobleaching)
Tytuły referatów:
1. Rola białek histonowych w organizacji wysokorzędowych struktur
chromatyny
2. Metoda FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)
Zagadnienia do przygotowania: Podstawy mikroskopii konfokalnej,
białka fluorescencyjne, struktura chromatyny
Zalecana literatura:
1. FRAP analysis of binding: proper and fitting. Brian L. Sprague and James G.
McNally, Trends in Cell Biology, Volume 15, Issue 2, 84-91, 1 February 2005
2. Dynamic binding of histone H1 to chromatin in living cells. Misteli T, Gunjan A,
Hock R, Bustin M, Brown DT. Nature. 2000 Dec 14;408(6814):877-81.
KOLOKWIUM ZALICZENIOWE
TEST WIELOKROTNEGO WYBORU: