Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych

advertisement
Nr kat. EM03
Wersja zestawu: 1.2012
Zestaw do oczyszczania DNA
po reakcjach enzymatycznych
Nr kat. EM03
I.
PRZEZNACZENIE ZESTAWU
Zestaw EXTRACTME DNA CLEAN-UP przeznaczony jest do szybkiego i wydajnego
oczyszczania fragmentów DNA po reakcjach enzymatycznych. Oczyszczone DNA
wolne jest od nukleaz, inhibitorów enzymów, detergentów, enzymów restrykcyjnych,
polimeraz, kationów dwuwartościowych, soli itp., gwarantując wysoką użyteczność
w technikach biologii molekularnej. Zestaw umożliwia oczyszczanie fragmentów
DNA o wielkościach od 50 pz do 30 kpz, a także genomowego i plazmidowego
DNA. Ekstrakcja cząsteczek DNA mniejszych od 100 pz oraz większych od 10 kpz
zachodzi jednak z obniżoną wydajnością.
Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia
zarówno wysokiego odzysku, jak i czystości oczyszczanego DNA .
Produkt przeznaczony jest wyłącznie do zastosowań badawczo-rozwojowych.
II.
SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU
50
150
250
3 izolacje
izolacji
izolacji
izolacji
(DEMO)
Nr katalogowy
EM07-050
EM07-150
EM07-250
EM07-D
CB Buffer (Binding Buffer)
25 ml
75 ml
125 ml
1,5 ml
CW Buffer (conc.)* (Wash Buffer) 11 ml
33 ml
55 ml
3 ml**
Elution Buffer
10 ml
3 x 10 ml
5 x 10 ml
0,6 ml
DNA Purification Columns
50 szt.
3 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
Collection Tubes (2 ml)
50 szt.
3 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
Liczba izolacji
*Przed pierwszym użyciem do roztworu CW Buffer należy dodać odpowiednią ilość 96–100%
etanolu (informacja na etykietach oraz w poniższej tabeli). Po dodaniu etanolu zalecane jest
oznaczenie butelki.
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM03
50
150
250
izolacji
izolacji
izolacji
(pH 7,0–9,0) i gotowe jest do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii
molekularnej (takich jak PCR, QPCR, Southern blotting, sekwencjonowanie
DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi, ligacja DNA itp.) lub może być
Nr katalogowy
EM07-050
EM07-150
EM07-250
przechowywane do późniejszego użycia.
CW Buffer
11 ml
33 ml
55 ml
Etanol 96-100%
44 ml
132 ml
220 ml
Całkowita objętość
55 ml
165 ml
275 ml
Liczba izolacji
**Uwaga: w zestawie DEMO (EM07-D) CW Buffer zawiera już etanol.
Wszystkie składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15–25°C).
Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby
uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania.
Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność przez okres minimum
12 miesięcy.
V.
KONTROLA JAKOŚCI
Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA CLEAN-UP testowana
jest według wewnętrznych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność
wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi
oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego
DNA sprawdzana jest w reakcji PCR, QPCR oraz reakcji trawienia
enzymami restrykcyjnymi.
VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU
III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
etanol 96–100% cz.d.a.
jałowe próbówki wirownicze typu Eppendorf (1,5–2 ml)
pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet
rękawiczki jednorazowe
mikrowirówka z rotorem na probówki o poj. 1,5–2 ml (> 10 tys. rpm)
termoblok lub łaźnia wodna (do 70°C)
3 M octan sodu, pH 5,2 (w nielicznych przypadkach)
Materiał wyjściowy
pp
Próbka DNA o objętości do 100 µl
Odzysk
pp
90–99% w zależności od wielkości fragmentu DNA (w zakresie 100 pz–10 kpz)
Wielkość izolowanych fragmentów DNA
pp
100 pz – 10 kpz
pp
Możliwe jest również oczyszczanie fragmentów DNA w zakresach 50–100 pz
i 10–30 kpz, a także genomowego i plazmidowego DNA , lecz z obniżoną
IV. ZASADA IZOLACJI
Procedura oczyszczania DNA przeprowadzana jest z wykorzystaniem minikolumn
wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże wydajnie i selektywnie
wiążące kwasy nukleinowe. Do próbki DNA dodawany jest CB Buffer, który
powoduje denaturację białek oraz umożliwia efektywne wiązanie DNA do złoża.
Dodatkowo bufor ten zawiera barwnik, który pozwala na kontrolowanie pH
roztworu odpowiedniego dla efektywnego wiązania DNA do złoża. Dwuetapowe
przemywanie minikolumny ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń
i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest
ze złoża minikolumny buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą
www.dnagdansk.com
wydajnością.
Pojemność złoża
pp
ok. 25 µg DNA
Czas izolacji
pp
5–10 minut
Czystość DNA
A 260/A280 = 1,7-2,0
Nr kat. EM03
VII. środki ostrożności
pp
pp
Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić
Przenieść odpowiednią objętość próbki DNA (nie więcej niż 100 µl) do jałowej
śladów DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami.
Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne
związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania
buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem.
probówki 1,5–2ml typu Eppendorf. Próbki DNA przed oczyszczaniem można
przechowywać w warunkach wolnych od deoksyrybonukleaz (DNaz) w temp. +4°C
przez krótki okres czasu, lub w postaci zamrożonej (preferowana temp. -80°C)
przez dłuższy okres czasu. Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania
próbek DNA .W przypadku wytrącenia się osadu w buforach, butelkę z roztworem
należy ogrzać do temp. 50–60°C i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia
osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej.
VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI
Elucja DNA ze złoża
Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności
od ilości DNA zawartego w próbce oraz od wymaganego poziomu stężenia DNA
w eluacie. Zaleca się stosowanie 30–100 μl Elution Buffer.
Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu
elucyjnego można zmniejszyć do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że może
to obniżyć wydajność odzysku DNA . Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu
elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża.
W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA , bufor elucyjny należy
podgrzać do temp. 80°C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut.
Maksymalny odzysk DNA można uzyskać poprzez przeprowadzenie elucji
w objętości 200 µl lub dwóch kolejnych etapów elucji po 100 µl (do różnych
probówek Eppendorfa).
Elution Buffer nie zawiera EDTA , którego obecność może przeszkadzać
w niektórych reakcjach enzymatycznych.
Kontrolowanie poziomu pH
CB Buffer zawiera wskaźnik pH, pozwalający na sprawdzenie czy pH mieszaniny
jest mniejsze niż 7,5 (kolor żółty), co gwarantuje wydajną adsorpcję DNA do
złoża minikolumny. Gdy pH jest wyższe niż 7,5, roztwór zmieni barwę na różową.
Może się tak zdarzyć w nielicznych przypadkach, np. gdy wartość pH próbki DNA
bardzo odbiega od standardowych warunków wykorzystywanych przy operacjach
z DNA (pH > 9,0). Konieczne jest wtedy dodanie 10 µl 3 M octanu sodu (pH 5,2),
który obniżając pH próbki zapewni wydajne wiązanie DNA do złoża. Wzrost pH
CB Buffer powyżej wartości 7,5 powoduje diametralny spadek adsorpcji DNA
do złoża w minikolumnie.
www.dnagdansk.com
IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
X.
PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI
1.
2.
Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać.
Należy upewnić się czy do CW Buffer został dodany etanol. Jeśli nie, należy
dodać odpowiednią ilość 96–100% etanolu (ilości podane są na etykietach
oraz w tabeli w sekcji II).
W przypadku wytrącenia osadu w buforach CB lub CW, butelkę z roztworem
należy ogrzać do temp. 37°C i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia
osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej.
Ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70°C.
Należy pamiętać, żeby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp.
pokojowej.
Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem
mikrowirówki Eppendorf 5417C. Prędkości wirowania podane
w jednostkach rpm odnoszą się do tej mikrowirówki.
3.
4.
5.
6.
Nr kat. EM03
XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI
1. Do 1 obj. próbki DNA dodać 5 obj. CB Buffer (np. do 50
µl mieszaniny po reakcji PCR dodać 250 µl CB Buffer),
worteksować 3 s.
Sposób przygotowania próbki opisano w sekcji IX. Przygotowanie próbki.
Kolor mieszaniny powinien być żółty. Jeżeli po roztwór zmienił barwę na
purpurową, należy dodać 10 µl 3 M roztworu octanu sodu o pH 5,2 i wymieszać
(patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi).
2. Krótko odwirować próbkę w celu odzyskania resztek roztworu
z wieczka probówki, a następnie przenieść całą objętość
mieszaniny na złoże minikolumny umieszczonej w probówce
odbierającej i wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
3. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml).
4. Dodać do minikolumny 600 μl CW Buffer i wirować 30 s przy
10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
5. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej
z powrotem minikolumnę.
6. Dodać do minikolumny 400 μl CW Buffer i wirować 2 min
przy 12–14 tys. rpm (15–21 tys. x g).
www.dnagdansk.com
7. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej
i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf.
Bufory płuczące zawierają alkohol, który może powodować inhibicję
niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji,
dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. W tym
celu po drugim etapie płukania można dodać etap „wirowania na sucho”. Po
opróżnieniu probówki odbierającej, należy wirować suchą kolumnę przez
1 min przy 12–14 tys. rpm (15–21 tys. x g).
8. Nanieść 50 –100 μl Elution Buffer podgrzanego do
temp. 70°C centralnie na złoże w minikolumnie.
Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie 20–200
µl. Więcej wskazówek na temat elucji znajduje się w sekcji IX. Szczególne
zalecenia i uwagi.
9. Inkubować minikolumnę z buforem przez 2 min.
10. Wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
11. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać
w temp. +4°C lub –20°C do czasu dalszych analiz.
Nr kat. EM03
XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE
Problem
Prawdopodobna
przyczyna
Rozwiązanie
Niska wydajność
izolacji DNA.
Nieefektywne wiązanie
DNA do złoża.
Upewnić się, że po dodaniu CB Buffer mieszanina posiada
żółte zabarwienie. W przypadku zmiany barwy na różową,
należy dodać 10 µl 3 M octanu sodu o pH 5,2.
Niedodany etanol
do buforu płuczącego.
Upewnić się, że 96–100% etanol został dodany
w odpowiedniej ilości do CW Buffer.
Niecałkowita
elucja DNA.
Podgrzać Elution Buffer do temp. 80°C. Nanieść centralnie
na powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji z Elution
Buffer (do 10 minut). Przeprowadzić powtórną elucję.
Niewłaściwe pH buforu
elucyjnego lub wody
(pH <7,0).
Do elucji użyć Elution Buffer.
Inhibicja
enzymatycznej
obróbki
wyizolowanego
DNA.
Obecność etanolu
w próbce.
Po każdym etapie płukania usuwać przesącz z probówki
odbierającej. Po drugim etapie płukania przeprowadzić
etap „wirowania na sucho”.
Obecność soli
w próbce.
Wszystkie etapy wirowania przeprowadzać w temp.
pokojowej. Upewnić się, że w CW Buffer nie wytrącił
się osad.
Nieostre prążki
w obrazie
elektroforetycznym.
Obecność nukleaz
w buforze elucyjnym.
Wymienić zanieczyszczony bufor elucyjny na nowy.
Gdy do elucji zamiast Elution Buffer używa się wody,
upewnić się, że jest ona wolna od DNaz.
DNA wypływa
ze studzienek
w żelu agarozowym.
Obecność etanolu
w próbce.
Po każdym etapie płukania usuwać przesącz z probówki
odbierającej. Po drugim etapie płukania przeprowadzić
etap „wirowania na sucho”.
www.dnagdansk.com
XIII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM
CB BUFFER
Niebezpieczeństwo
H302, H315, H318, H319, H411,
P273, P280, P305+P351+P338
CW BUFFER
Niebezpieczeństwo
H315, H319, H334, H335,
P261, P305+P351+P338, P342+P311
H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu.
H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu.
H319 Działa drażniąco na oczy. H336 Może wywoływać uczucie senności lub
zawroty głowy. H411 Działa toksycznie na organizmy wodne, powodując
długotrwałe skutki. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/
otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P261 Unikać
wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P273 Unikać
uwolnienia do środowiska. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież
ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU
DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć
soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać.
www.dnagdansk.com
BLIRT S.A ., ul. Trzy Lipy 3/1.38, 80–172 Gdańsk, www.dnagdansk.com
T: +48 58 739 61 50 F: +48 58 739 61 51 E: [email protected]
Download